CN117447561A - 人乳头病毒16型e7蛋白的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人乳头病毒16型E7蛋白的制备及其应用，涉及生物领域。本发明联合GST标签和6×His标签作为人乳头病毒16型E7蛋白的纯化标签，提高了可溶性目的蛋白的纯化效率，通过GST纯化和镍柱纯化的方法对目的蛋白进行提纯，采用远超于正常洗脱体积的低浓度咪唑进行洗杂，避免或减少了GST标签非特异性结合镍柱较强难以去除的问题，使其目的蛋白的纯度达到90％以上，为检测血浆中的抗HPV 16 E7的抗体奠定了基础，节约了实验成本。

Description

人乳头病毒16型E7蛋白的制备及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体而言，涉及人乳头病毒16型E7蛋白的制备及其应用。
背景技术
目前，基于分子生物学手段的病毒DNA检测是人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染的主要诊断方式，然而这种方法只能检测到组织中的现存感染，在组织取样困难或取样过程不规范的情况下难以进行。而既往研究已证实HPV的血清学指标可有效预测HPV感染的转归，其中HPV E7特异性抗体水平的变化特征更是与HPV相关癌症的发生发展及HPV疫苗免疫后的机体反应密切相关(Frazer，2010；Parker et al.,2018)。因而，更加准确和精细化地检测E7特异性抗体水平具有重要的临床转化意义。
HPV E7蛋白具有较强的抗原性，其在HPV相关肿瘤中持续表达并刺激机体产生多种类型的抗体，包括IgM、IgG和IgA等。IgG在体内广泛分布，是最主要的免疫球蛋白，病毒再次刺激时IgG为主要抗体，具有亲和力高的特点，是全身性体液免疫最主要的效应分子之一，根据重链恒定区的结构可以分为4种亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgA在血清中的含量仅次于IgG，其可以保护黏膜组织免受微生物侵袭，并通过微生物菌群维持免疫稳定；IgM主要存在于血液中，提示新近发生的感染(Schroeder and Cavacini,2010)。因而，全面检测E7特异性抗体各亚型的表达水平对HPV感染及其相关肿瘤的诊断及预后预测具有重要价值。目前E7血清特异性抗体的检测主要采用间接ELISA法，首先将E7抗原蛋白结合到ELISA板上，随后分两步进行检测：首先加入待测血清样品与E7抗原蛋白抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。然而目前国内外基于间接ELISA法系统性检测E7特异性抗体各亚型表达水平的报道较少，商品化的试剂盒仅能针对E7特异性总IgG抗体进行检测，而缺乏对IgA、IgM和IgG各亚型抗体的检测能力，且其敏感性不高(赖娟et al.,2013；Simonidesova etal.,2019)。
因为E7蛋白无法从哺乳动物的病变组织或重组细胞中分离获得，E7特异性抗体水平的检测主要依赖于E7蛋白的体外制备和纯化，其所得E7蛋白的表达量和纯度是决定检测准确性的关键因素之一。目前主要采用基因工程技术从大肠杆菌原核系统进行E7重组蛋白的表达，并通过添加相应蛋白纯化标签以提升所制备蛋白的纯度。E7重组蛋白现有常用的纯化标签存在一定的缺点，比如无法提高重组蛋白的可溶性，纯化纯度不高，影响重组蛋白的功能等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供人乳头病毒16型E7蛋白的制备及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法，其包括：对含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体进行诱导表达，获得表达产物；
对所述表达产物进行GST纯化、GST标签切除和镍柱纯化，以获得融合有His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白；
其中，所述镍柱纯化包括：平衡、洗杂和洗脱；所述洗杂采用的洗杂液包括10mM～80mM的咪唑，洗杂液的洗杂体积≥柱体积的100倍。
第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法在制备抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测试剂盒中的应用。
第三方面，本发明实施例提供了一种抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测方法，其包括：
采用前述实施例所述的人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法进行人乳头病毒16型E7重组蛋白的制备；
将以所述人乳头病毒16型E7重组蛋白作为抗原，进行抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第四方面，本发明实施例提供了一种生物材料，其包括：核酸分子、含所述核酸分子的载体、含所述载体的宿主细胞中的任意一种；所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明具有以下有益效果：
本发明联合GST标签和6×His标签作为纯化标签，提高了可溶性人乳头病毒16型E7蛋白的纯化效率，通过GST纯化和镍柱纯化的方法对目的蛋白进行提纯，采用远超于正常洗脱体积的低浓度咪唑进行洗杂，避免或减少了GST标签非特异性结合镍柱较强难以去除的问题，使其目的蛋白的纯度达到90％以上，为检测血浆中的抗HPV 16E7的抗体奠定了基础，节约了实验成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为重组菌株E.coli BL21/pGEX-2T-Hpv 16E7-His IPTG诱导融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳图；其中，M:蛋白marker；泳道1，induced total cell lysate(诱导的总细胞裂解物)；泳道2，soluble cell lysate fraction(可溶性细胞裂解物部分)；泳道3，insoluble inclusion bodies(不溶性包涵体)；NC：uninduced total cell lysate(未诱导的总细胞裂解物)；
图2为实施例1中重组蛋白经GST纯化和Ni-NTA纯化的SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白marker；泳道1,2,protein mixture of 20mM,50mM imidazole elution(20mM、50mM咪唑洗脱的蛋白质混合物)；泳道3，the purified HPV16 E7-His protein(the purifiedHPV16 E7-His protein纯化的HPV16 E7-His蛋白)；
图3为实施例3中重组蛋白经GST纯化和Ni-NTA纯化的SDS-PAGE电泳图；M：蛋白marker；泳道1，GST-Hpv 16 E7-His protein after GSTSep Glutathione Agarose Resin(GSTSep谷胱甘肽琼脂糖树脂后的GST Hpv 16 E7-His蛋白)；泳道2，mixture afterenzyme digestion(酶消化后的混合物)；泳道3,4,5,6,7,8，protein mixture of 20mM,50mM,100mM,150mM,200mM,250mM imidazole elution(20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM咪唑洗脱的蛋白质混合物)；
图4为实施例4中基于检测HPV16 E7特异性IgG抗体的间接ELISA方法的标准曲线；
图5为实施例4中基于检测HPV16 E7特异性IgG抗体的间接ELISA方法的特异性分析。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
采用单一的纯化标签应用于人乳头病毒16型E7重组蛋白的表达和纯化存在一定的缺陷。比如，采用单一的His-Tag(组氨酸标签，His标签)：His-Tag分子量较小，其本身对目的蛋白没有影响且免疫原性较低，纯化获得的蛋白不需进行此标签的切除也可直接进行下游应用。且His-Tag的纯化条件较温和，对蛋白的影响较小。然而采用His标签作为纯化标签时，其对蛋白的可溶性表达影响有限；并且宿主天然蛋白表面也具有和金属离子相互作用的基团，或存在连续组氨酸残基，可与固定化金属亲和层析(IMAC)产生非特异性结合，因此，His标签的纯化纯度不高。采用单一的GST-Tag(谷胱甘肽巯基转移酶标签，GST标签)的情况：GST-Tag不仅可提高蛋白的表达量，也可提高其可溶性。基于GST-Tag的蛋白纯化方法特异性高，能得到更高纯度的目标蛋白。然而GST-Tag相对分子质量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，因而在纯化完成后可能需要进行标签的切除。本申请通过联合HIS-Tag和GST-Tag的使用，以进一步提高可溶性E7蛋白的纯化效率。
但基于双标签进行人乳头病毒16型E7蛋白的表达和纯化也存在技术障碍，对于含双标签的重组工程菌表达的重组蛋白，通常会考虑先通过GST纯化，以获得较纯的42kDa左右大小的N端融合GST标签、C端融合His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白，然后利用Thrombin切除GST标签，在确保GST标签基本完全切除后停止反应，此时混合体系中主要含有37kDa左右大小的Thrombin、26kDa左右大小的GST标签以及16kDa左右大小的融合His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白。针对如何去除Thrombin、GST标签这两种主要的杂蛋白，存在以下方式：(1)可通过HiTrap Benzamidine FF可以去除Thrombin；但HiTrapBenzamidine FF存在价格昂贵的情况；(2)采用分子筛的方法去除GST标签。但GST标签和融合His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白的蛋白分子大小相差值小于2倍，不适用分子筛的方法去除GST标签；(3)选择GST纯化柱去除GST标签。但该方式只能去除一部分，收集的流穿依然含有一部分的GST标签以及Thrombin，虽然反复进行GST纯化可以去除大部分的GST标签，但是收集的流穿仍需要采用镍柱进一步纯化去除Thrombin，从而可能获得较纯的融合His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白，这蛋白纯化过程步骤繁杂，目的蛋白损失较大，得率较低。基于此，本发明通过引入6×His标签，构建融合有GST标签和6×His标签的重组蛋白，采用GST亲和层析和镍柱亲和层析相结合的纯化方式，进行目的蛋白的纯化；GST标签因非特异性结合镍柱难以去除，而本申请通过使用远超于正常洗脱体积的低浓度咪唑进行洗杂，能够使目的蛋白的纯度达到90％以上。
具体的技术方案
一方面，本发明实施例提供了一种人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法，其包括：对含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体进行诱导表达，获得表达产物；
对所述表达产物进行GST纯化、GST标签切除和镍柱纯化，以获得融合有His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白；
其中，所述镍柱纯化包括：平衡、洗杂和洗脱；所述洗杂采用的洗杂液包括10mM～80mM的咪唑，洗杂液的洗杂体积≥柱体积的100倍。
在一些实施方式中，所述洗杂液包括洗杂液1和洗杂液2，所述洗杂液1包括10mM～50mM的咪唑，所述洗杂液1的洗杂体积≥柱体积的100倍，洗杂液2包括30～80mM的咪唑，所述洗杂液3的洗杂体积≥柱体积的100倍。洗杂液1和洗杂液2对于表达产物中的杂蛋白的洗杂效果优于单独采用洗杂液1或洗杂液2的洗杂效果。
所述洗杂液1的咪唑的浓度具体可以为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述洗杂液1和/或洗杂液2的洗杂体积具体可以为≥柱体积的100、120、140、160、180、200倍中的任意一种以上。
在一些实施方式中，所述洗杂液1和/或洗杂液2的洗杂体积为柱体积的100～200倍。具体可以为100、120、140、160、180、200倍中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述洗杂液1和/或洗杂液2的洗杂体积为柱体积的100～150倍。
所述洗杂液2的咪唑的浓度(终浓度)具体可以为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述洗杂液2包括40～60mM的咪唑。
镍柱纯化基本原理为固定介质中的镍离子与含有His标签的重组蛋白结合，结合在介质上的His标签的重组蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到较高纯度的His标签蛋白。镍柱纯化特异性较低，杂蛋白也能结合在介质中，对于与介质结合较强的杂蛋白，不含咪唑的缓冲液即使大量冲洗纯化柱也难以去杂，往往会增加咪唑的浓度，以此来去除杂蛋白，本申请的发明人经验证后发现，20mM咪唑溶液可以去除部分的GST标签，50mM左右的咪唑溶液不仅可以去除部分的GST标签，还可以去除其他的杂蛋白，然而，当溶液中咪唑浓度增加至100mM时，虽然可以去除包括GST标签在内的杂蛋白，但是同时也会损失部分的目的蛋白，而本申请限定浓度范围内的咪唑溶液作为洗杂液更为有利。
在一些实施方式中，所述洗脱液包括200～300mM的咪唑，咪唑的终浓度具体可以为200mM、210mM、220mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述人乳头病毒16型E7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP。
在一些实施方式中，所述人乳头病毒16型E7蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：
5’-ATGCACGGTGACACCCCGACCCTGCACGAATACATGCTGGACCTGCAGCCGGAAACCACCGACCTGTACTGCTACGAACAGCTGAACGACTCTTCTGAAGAAGAAGACGAAATCGACGGTCCGGCTGGTCAGGCTGAACCGGACCGTGCTCACTACAACATCGTTACCTTCTGCTGCAAATGCGACTCTACCCTGCGTCTGTGCGTTCAGTCTACCCACGTTGACATCCGTACCCTGGAAGACCTGCTGATGGGTACCCTGGGTATCGTTTGCCCGATCTGCTCTCAGAAACCGTAA-3’。
根据文献报道，未优化密码子的HPV16型E7原始序列在大肠杆菌中表达量较低(Fernando,et al.,1999)，本发明通过优化密码子(SEQ ID NO:2)，将目的基因克隆到带有融合标签的pGEX-2T表达载体上，不仅提高了表达量，还使上清中目的蛋白表达量占全菌的比例显著提高至96％，大部分表现为可溶性蛋白，避免了目的蛋白以包涵体形式进行表达且需要重新变性溶解复性才可以得到活性蛋白，从而显著提高了E7蛋白的制备效率。
在一些实施方式中，在所述含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体中，所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列位于GST标签和His标签之间。
在一些实施方式中，在所述含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体中，所述GST标签位于所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列的5’端，所述His标签位于所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列的3’端。该表达载体表达后获得的表达产物包括：N端融合GST标签、C端融合His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白。
在一些实施方式中，所述融合有His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白中，His标签位于人乳头病毒16型E7重组蛋白的C端。
在一些实施方式中，所述制备方法还包括所述表达载体的制备：
将所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列克隆至含GST标签和His标签的表达载体中，以获得含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体；或，将所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列克隆至含GST标签的表达载体中，以含有GST标签和人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列的表达载体为模板，基于全质粒PCR技术引入His标签，以获得含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体。
在一些实施方式中，所述含GST标签的表达载体包括pGEX-2T。
在一些实施方式中，所述GST标签切除包括采用凝血酶对GST纯化后的产物进行酶切，以切除GST标签。
另一方面，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法在制备抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测试剂盒中的应用。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测方法，其包括：
采用前述任意实施例所述的人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法进行人乳头病毒16型E7重组蛋白的制备；
将以所述人乳头病毒16型E7重组蛋白作为抗原，进行抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
在一些实施方式中，以所述人乳头病毒16型E7重组蛋白作为抗原，进行抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测的步骤包括：
在足以发生结合反应的条件下，将所述抗原与来自受试者的样品接触，以进行结合反应，检测结合反应产生的免疫复合物。
在一些实施方式中，所述检测方法为ELISA检测方法，包括将所述抗原包被于固相载体上，以测定样品中的特异性抗体。
利用间接ELISA法，通过包被抗原的方式，能够满足检测血浆中的所有HPV16 E7蛋白特异性抗体，包括IgG、IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgA、IgM等抗体。本发明还对其特异性、灵敏度以及重复性等指标进行了检测，达到了商品化ELISA试剂盒的标准。
在一些实施方式中，所述抗体包括：抗人乳头病毒16型E7重组蛋白的IgM、IgG和IgA中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，所述IgG包括IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3中的任意一种或多种。
此外，本发明实施例还提供了一种生物材料，其包括：核酸分子、含所述核酸分子的载体、含所述载体的宿主细胞中的任意一种；所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方式中，所述载体可以为表达载体。
在一些实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中的任意一种。
本发明使用生物工程手段高效表达HPV16型E7蛋白，利用蛋白纯化技术获得目的蛋白，并利用间接ELISA法检测血浆中HPV16型E7蛋白特异性抗体的相对含量，包括IgG(IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3)、IgA、IgM等抗体。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种人乳头瘤病毒16型E7蛋白的制备方法，其包括以下步骤。
(1)构建重组质粒
本实施例从NCBI数据库查找人乳头瘤病毒16型E7蛋白(HPV 16型E7蛋白)的原始编码基因序列，对其进行密码子优化，委托成都康博锐生物科技有限公司合成优化后的基因序列(SEQ ID NO：2)，并将密码子优化后的核苷酸序列为SEQ ID No.2的基因片段定向克隆到pGEX-2T表达载体(该表达载体自带GST标签)中，以构建获得重组表达质粒pGEX-2T-HPV 16E7。然后将重组表达质粒pGEX-2T-HPV 16E7转化到大肠杆菌DH5α中大量复制质粒；为了引入6×His融合标签，以重组表达质粒pGEX-2T-HPV 16E7为模板，设计引物，通过全质粒PCR得到含有6×His标签的重组表达质粒pGEX-2T-HPV 16E7-His，并将其转化到大肠杆菌DH5α中大量复制质粒。
(2)BL21(DE3)诱导表达重组蛋白
将获得的重组表达质粒pGEX-2T-HPV 16E7-His转化至利用大肠杆菌BL21(DE3)中，包括：将重组表达质粒pGEX-2T-HPV 16E7-His和感受态细胞BL21(DE3)在冰上轻轻均匀，冰上静置30min，42℃热激90s转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，复苏后涂布于LB固体培养基(含100μg·mL-1氨苄青霉素)上37℃生长10h后挑取转化子。转化子送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序正确后，构建成功的重组菌株放置-80℃保存备用。重组菌株经0.1mM IPTG 28℃诱导6h表达N端融合GST标签、C端融合6×His标签的重组蛋白。上清表达量占全菌的96％(见图1)，N端融合GST标签、C端融合6×His标签的重组蛋白分子量约为42kDa。
(3)重组蛋白的纯化
将表达后的重组蛋白分离纯化，以制得重组蛋白。分离纯化采用GST纯化和镍柱纯化相结合的方法，具体包括以下步骤：
GST纯化：将GST标签蛋白纯化树脂(GSTSep Glutathione Agarose Resin，谷胱甘肽高速纯化树脂)装入重力柱中，用5倍体积的去离子水冲洗柱子，用5倍体积的结合Buffer(1×PBS缓冲液，PBS(140mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4)，pH 7.4)平衡柱子，将重力柱中的Resin(树脂)转移至含有蛋白上清液的50mL离心管中，4℃、50rpm慢摇孵育1h，使蛋白与Resin充分接触，孵育结束后将Resin重新转移至重力柱中，同时收集流穿液，用15倍柱体积的结合Buffer进行清洗，使用100％的洗脱液(Elution Buffer，50mMTris-HCl,10mM还原型谷胱甘肽,pH 8.0)进行洗脱，收集洗脱液，即为N端融合GST标签、C端融合6×His标签的重组蛋白溶液；
为切除GST标签，通过超滤置换含有重组蛋白的洗脱液成PBS溶液，加入终浓度为80U/mL的凝血酶，4℃、50rpm慢摇孵育过夜，SDS-PAGE验证重组蛋白的GST标签完全切除后进行镍柱纯化；
镍柱纯化：将HisSep Ni-NTA Agarose Resin装入重力柱中，用5倍体积的去离子水冲洗柱子，用5倍体积的Lysis Buffer(裂解缓冲液，50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mMimidazole，0.5mMTCEP，2％ TritonTMX-100)平衡柱子，将重力柱中的Resin(树脂)转移至含有Thrombin酶切后的蛋白液的50mL离心管中，进行4℃、50rpm慢摇孵育1h，使蛋白与Resin充分接触，孵育结束后将Resin重新转移至重力柱中，同时收集流穿液，用100倍柱体积的Wash Buffer 1(20mM咪唑)进行洗杂，收集洗杂液，采用125倍的Wash Buffer2(50mM咪唑)进行洗杂，用考马斯亮蓝法实时检测，直至无杂蛋白检出，用250mM咪唑浓度的ElutionBuffer进行洗脱，收集洗脱液，即为融合有6×His标签的重组蛋白溶液，纯度达到90％以上(附图2)。本实施例提供可溶性重组蛋白，溶剂为1×PBS(pH7.4)。
实施例2
一种抗人乳头病毒16型E7蛋白的特异性抗体(包括但不局限于IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3亚型在内的抗体)的检测方法，包括以下步骤。利用碳酸盐溶液(3.03g Na2CO3、6.0g NaHCO3、1000ml蒸馏水、pH 9.6)将抗原(实施例1制备获得的重组蛋白)稀释成2μg/mL的浓度4℃过夜包被，PBST洗涤5次，3％BSA室温封闭2h，PBST洗涤5次，加入待测血浆37℃孵育1h，PBST洗涤5次，加入酶标二抗室温孵育1h，PBST洗涤5次，加入单组分TMB显色液显色20min，最后加入1M HCL终止反应，在酶标仪上测定OD450值。
实施例3
验证实施例1的制备方法中洗杂液的洗杂体积对于制备目的蛋白的影响。
基于实施例1提供了人乳头瘤病毒16型E7蛋白的制备方法，设置了一组实验组，实验组的制备方法大致同实施例1，区别在于步骤(3)重组蛋白的纯化中的镍柱纯化存在差异，区别部分如下：
镍柱纯化：将HisSep Ni-NTA Agarose Resin装入重力柱中，用5倍体积的去离子水冲洗柱子，用5倍体积的Lysis Buffer平衡柱子，将重力柱中的Resin(树脂)转移至含有Thrombin酶切后的蛋白液的50mL离心管中，进行4℃、50rpm慢摇孵育1h，使蛋白与Resin充分接触，孵育结束后将Resin重新转移至重力柱中，同时收集流穿液，用15倍柱体积的WashBuffer(20mM咪唑)进行洗杂，收集洗杂液，Elution Buffer梯度法进行洗脱，分别设置50mM、100mM、150mM、200mM、250mM咪唑浓度的Elution Buffer，每个梯度的Elution Buffer体积为柱体积的15倍，用1.5mL EP管收集所有的洗脱液，用考马斯亮蓝法检测每管样本的蛋白含量，每个梯度的洗脱液选择1管进行SDS-PAGE检测。
由SDS-PAGE结果(图3)可知，GST标签非特异性结合镍柱较强难以去除，每个梯度咪唑下的洗脱液均含有较多的GST标签。
实施例4
验证实施例2提供给的检测方法的准确性、重复性、灵敏度和特异性。
本实施例以检测血浆中HPV16 E7蛋白特异性的抗体IgG水平为例。
(1)用本发明(如实施例2的检测方法)检测一部分正常C57BL/6小鼠的血浆，检测数据如下。
表1检测正常C57BL/6小鼠的血浆数据结果
样本标号 OD450值
正常小鼠1号 0.071
正常小鼠2号 0.116
正常小鼠3号 0.188
正常小鼠4号 0.161
正常小鼠5号 0.063
正常小鼠6号 0.211
正常小鼠7号 0.052
正常小鼠8号 0.165
正常小鼠9号 0.14
正常小鼠10号 0.064
正常小鼠11号 0.135
正常小鼠12号 0.207
正常小鼠13号 0.183
正常小鼠14号 0.05
根据表1的正常小鼠检测值，计算出平均值为0.129，SD标准方差为0.0595，本发明的检测方法在确定Cutoff值时选择正常小鼠平均值加上两倍的标准方差作为HPV16 E7蛋白特异性的抗体IgG表达阴阳性的判断标准，计算公式如下：
Cutoff＝平均值+2*SD标准方差；
Cutoff值为0.248，即OD450值大于0.248时认为是阳性，认为表达了HPV16 E7蛋白特异性的抗体IgG。
(2)标准曲线制作
本发明将HPV16 E7蛋白特异性的抗体校准品(1mg/mL)依次稀释成78.125、156.25、312.5、625、1250、2500、5000、10000ng/mL。用本发明建立的检测方法(间接ELISA方法)进行检测，制作标准曲线。
标准曲线图见图4，根据标准曲线回归方程以及Cutoff值计算得出，建立的间接ELISA方法对HPV16 E7特异性IgG抗体检出限可达121.77ng/mL。本发明将HPV16 E7特异性抗体浓度与OD450nm值之间进行非线性四参数拟合，R2＝0.9996，表明建立的标准曲线准确度较高。
(3)重复性分析
用本实施例的同批次包被的ELISA板分别检测6份阳性样本和1份阴性样本，并设置3个重复计算批内变异系数。用不同批次包被的ELISA板同时检测6份阳性样本和1份阴性样本，计算批间变异系数，评价该方法的重复性。
变异系数CV(％)＝标准偏差/平均值×100。
表2基于检测HPV16 E7特异性IgG抗体的间接ELISA方法的重复性分析
样本编号 板内变异系数(％) 板间变异系数(％)
1 1.17 5.64
2 1.78 4.93
3 4.01 3.51
4 0.91 3.42
5 2.16 0.87
6 3.49 5.13
由表2可知，板内变异系数为0.91％-4.01％，板间变异系数为0.87％-5.64％，均小于15％，说明建立的间接ELISA方法具有一定的重复性。
(4)特异性分析
用本发明(实施例2的检测方法)分别检测HPV疫苗治疗后的C57BL/6小鼠的血浆和非HPV疫苗治疗后的C57BL/6小鼠的血浆各12例，观察有无交叉反应。
结果见图5，从图5可知，用本发明实施例建立的间接ELISA方法分别检测HPV疫苗治疗后的C57BL/6小鼠的血浆和非HPV疫苗治疗后的C57BL/6小鼠的血浆，结果显示，非HPV疫苗治疗后的C57BL/6小鼠的血浆的信号值较低，接近于阴性值。表明建立的间接ELISA方法具有良好的特异性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法，其特征在于，其包括：对含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体进行诱导表达，获得表达产物；
对所述表达产物进行GST柱纯化、GST标签切除和镍柱纯化，以获得融合有His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白；
其中，所述镍柱纯化包括：平衡、洗杂和洗脱；所述洗杂采用的洗杂液包括10mM～80mM的咪唑，洗杂液的洗杂体积≥柱体积的100倍。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗杂采用的洗杂液包括洗杂液1和洗杂液2，所述洗杂液1包括10mM～50mM的咪唑，所述洗杂液1的洗杂体积≥柱体积的100倍，所述洗杂液2包括30～80mM的咪唑，所述洗杂液2的洗杂体积≥柱体积的100倍；
可选地，所述洗杂液1包括10～30mM的咪唑；
可选地，所述洗杂液1的洗杂体积为柱体积的100～200倍；
可选地，所述洗杂液1的洗杂体积为柱体积的100～150倍。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗杂液2包括40～60mM的咪唑；
可选地，所述洗杂液2的洗杂体积为柱体积的100～200倍；
可选地，所述洗杂液2的洗杂体积为柱体积的100～150倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱液包括200～300mM的咪唑。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人乳头病毒16型E7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
可选地，所述人乳头病毒16型E7蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体中，所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列位于GST标签和His标签之间；
可选地，在所述含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体中，所述GST标签位于所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列的5’端，所述His标签位于所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列的3’端；
可选地，所述融合有His标签的人乳头病毒16型E7重组蛋白中，His标签位于人乳头病毒16型E7重组蛋白的C端。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括所述表达载体的制备：
将所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列克隆至含GST标签和His标签的表达载体中，以获得含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体；或，将所述人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列克隆至含GST标签的表达载体中，以含有GST标签和人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列的表达载体为模板，基于全质粒PCR技术引入His标签，以获得含有GST标签、人乳头病毒16型E7重组蛋白的核苷酸序列和His标签的表达载体；
可选地，所述含GST标签的表达载体包括pGEX-2T。
8.如权利要求1～7任一项所述的人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法在制备抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测试剂盒中的应用。
9.一种抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测方法，其特征在于，其包括：
采用权利要求1～7任一项所述的人乳头病毒16型E7蛋白的制备方法进行人乳头病毒16型E7重组蛋白的制备；
将以所述人乳头病毒16型E7重组蛋白作为抗原，进行抗人乳头病毒16型E7蛋白的抗体的检测；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
10.一种生物材料，其特征在于，其包括：核酸分子、含所述核酸分子的载体、含所述载体的宿主细胞中的任意一种；所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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