CN113151324B

CN113151324B - 突变的Benzonase核酸内切酶及其应用

Info

Publication number: CN113151324B
Application number: CN202110410264.4A
Authority: CN
Inventors: 朱香; 梁雅丽; 卢宁; 牛林茹; 杨凌; 郭芳; 李文慧
Original assignee: Shanxi Jichuang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanxi Jichuang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2041-04-15
Also published as: CN113151324A

Abstract

本发明公开了突变的Benzonase核酸内切酶及其应用。本发明的突变的Benzonase核酸内切酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原可用于制备抗Benzonase核酸内切酶抗体以及用于制备用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒。使用本发明的ELISA检测试剂盒可以定量检测多种不同的Benzonase核酸内切酶产品。

Description

突变的Benzonase核酸内切酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及突变的Benzonase核酸内切酶及其应用。

背景技术

Benzonase核酸内切酶来自于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的对核酸具有非特异性偏好的细菌非特异核酸内切酶。早在1998年《FEMS Microbiology Letters》上一篇综序(Serratia marcescens and its extracellular nuclease)对其做了详细介绍，Benzonase核酸内切酶能降解包括单链、双链、线性、环状DNA和RNA以及基因组DNA在内的各种形式的核酸，对核酸序列没有偏好性，且不具备蛋白酶活性。并且，这篇综述有明确提到Benzonase核酸内切酶对宿主细胞具备毒性。成熟Benzonase核酸内切酶由信号肽分泌到胞外成熟，至2021年已知有三种具有相似生化特性的胞外亚型:Sm1、Sm2和Sm3。Sm2是没有信号肽序列的成熟Benzonase核酸酶(26.7KD)。相比Sm2，Sm1(26.4KD)缺乏前三个氨基酸,Sm3(26.6KD)缺乏前一个氨基酸。

生物制品在生产过程中产生的核酸，需要专业的核酸去除剂。核酸酶能降解核酸，而非特异性核酸内切酶能非特异性地降解几乎所有形式的核酸，完全去除核酸，解决生物制品核酸残留危害问题。《生物技术药物研究开发和质量控制》王志军主编，第三版中，腺病毒纯化生产实例中列举了Canji公司、Bioreliance公司、Introgen公司以及Puresyn公司在腺病毒生产过程中应用了Benzonase核酸酶，并在非复制型病毒载体类基因治疗药物篇章中提到在重组腺病毒产品生产工艺中涉及核酸酶消化，且在重组人p53腺病毒注射液暂行质量标准中规定残留Benzonase，检测方法为ELISA法，规定标准应不高于1ng/支。在溶瘤腺病毒产品质量控制中，SG600-P53产品质量标准中规定残留Benzonase含量不高于1ng/支。2012年，Bandeira V等在纯化慢病毒颗粒载体的工艺过程中使用了Benzonase核酸酶，结果能去除99％的DNA残留。美国FDA网(www.fda.gov)公开了病毒载体的生产工艺流程，其中就涉及Benzonase核酸酶处理，37℃消化1小时，能有效去除细胞及质粒DNA。在宫颈癌疫苗GARDASIL的工艺流程中使用Benzonase核酸酶，4℃过夜处理病毒颗粒，降低宿主残留DNA，降低终产品中宿主DNA的残留量。可见该酶在未来几年内会广泛应用于医药产品，而该酶是外源性蛋白，具备生物活性，其残留可能引发机体过敏反应，导致临床不测事件发生，且已有部份病毒产品要求检其残留。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变的Benzonase核酸内切酶，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

所述突变的Benzonase核酸内切酶可以作为抗原用于制备抗Benzonase核酸内切酶的抗体以及用于制备用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒，所述试剂盒包含已包被捕获抗体的固相载体，所述捕获抗体为用所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原制备的抗体。

所述捕获抗体为用所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原免疫兔获得的多克隆抗体。

所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的用所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原制备的抗体。

本发明的突变的Benzonase核酸内切酶具有低毒性和高免疫活性，可以作为抗原制备单克隆和多克隆抗体，从而制备用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒。使用本发明的ELISA检测试剂盒可以定量检测多种不同的Benzonase核酸内切酶产品。

附图说明

图1示出了pET-20b(+)载体的图谱。

图2示出了SDS-PAGE电泳分析结果，其中Mark由上到下分别为：190KD，140KD,95KD,65KD,50KD,40KD,30KD,23KD；1:对照样品，Benzonase核酸内切酶；2：Be-P-1。

图3示出了Western Blot结果，其中Mark由上到下分别为：50KD,40KD,30KD,23KD；1:对照样品，Benzonase核酸内切酶；2和3：Be-P-1。

图4示出了突变的Benzonase核酸内切酶的活性测定结果，其中Mark：100bp；1、2和3分别为：突变的Benzonase核酸内切酶(250ng)处理过的1.2μl DNA；0.6μl DNA和0.3μlDNA；4、5和6分别为:1.2μlDNA，0.6μl DNA，0.3μl DNA；7：Benzonase核酸内切酶(250ng,1KU)处理过的1.2μl DNA；DNA原浓度为10mg/ml。

图5示出了ELISA检测中建立的标准曲线(r＝1)。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明作进步说明，其仅用于阐述本发明而非限制本发明范围。

实施例1.突变的Benzonase核酸内切酶

构建Be-P-1菌株

根据文献报道(GenBank:M19495.1，UniProtKB/Swiss-Prot:P13717)的粘质沙雷菌(S.marcescens)核酸酶(Benzonase核酸内切酶或Benzonase核酸酶)基因序列及氨基酸序列，设计突变的Benzonase核酸内切酶，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。送武汉擎科生物科技有限公司合成突变的Benzonase核酸内切酶基因。

构建表达突变的Benzonase核酸内切酶的重组表达载体。选择pET-20b(+)作为表达载体，如图1所示。选择BL21(DE3)pLysS作为表达菌株。设计一对引物：引物1和引物2。引物1和引物2分别如序列表中序列3和序列4所示，基因5’端引物带有NcoI酶切位点和6×His，3’端引物带有HindⅢ酶切位点和基因终止密码子。

在0.2ml PCR微量离心管中配制25μl反应体系：

Q5 High-Fidelity 2×Master Mix	12.5μl
		10μM引物1	1.25μl
10μM引物2	1.25μl
		模板	稀释至14.9ng/ml加2μl
无核酸酶水	8μl

PCR反应程序：98℃预变性30秒；98℃10秒，57℃30秒，72℃1min，共30个循环；最后72℃2min。PCR反应结束后取5μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小与设计的大小777bp一致。

用NcoI、HindⅢ双酶切pET-20b(+)质粒与PCR反应后的突变的Benzonase核酸内切酶基因片段的回收产物，回收双酶切后的载体大片段和基因片段，然后用T4DNA连接酶在16℃将其连接，取20μL连接产物直接转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜。20μL连接反应体系包含T4 DNA连接酶1μl、T4 DNA连接酶缓冲液(10×)2μl、无核酸酶水9μl和比例为1∶3的基因片段与载体大片段。氨苄青霉素抗性筛选得到阳性克隆。

阳性转化子用通用引物进行序列分析，提取测序结果与设计序列完全一致的阳性克隆质粒。保存测序结果一致的阳性克隆菌株和对应的质粒。

用阳性克隆质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，涂布于氨苄青霉素与氯霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得工程菌Be-P-1。用1.0mmol/L的IPTG诱导突变的Benzonase核酸内切酶表达。

突变的Benzonase核酸内切酶的分离纯化

Be-P-1单菌落于20ml含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH7.0)中于37℃，210rpm摇床培养过夜。培养过夜的种子培养物按1:100接种量转接于100ml含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中于37℃，210rpm培养3-4小时，培养液的OD600为约1.0-1.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L于25℃培养16h，离心收集上清(10000×g×10min)。

Ni-NTA亲和层析重力柱(柱体积2ml)用蒸馏水冲洗10柱体积(CV)，再用平衡液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)平衡5CV。上样，用洗脱液I(25mM Tris-HCl，150mMNaCl，15mM咪唑，pH8.0)进行洗脱，直到Brankford检测不变蓝，收集过柱洗脱液。用洗脱液II(25mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH8.0)进行洗脱，直到Brankford检测不变蓝，收集过柱洗脱液。亲和纯化结束后，用20％乙醇保存柱内填料。

SDS-PAGE电泳分析样品纯度，如图2所示，样品纯度达到95％以上。分光光度计分析样品浓度，样品浓度达到2mg/100ml。Western Blot结果如图3所示。样品质谱鉴定结果确认为突变的Benzonase核酸内切酶。

突变的Benzonase核酸内切酶的活性分析

Benzonase核酸内切酶能够将DNA消化分解为3～8b的寡核苷酸链。

采用分光光度法进行突变的Benzonase核酸内切酶的酶活性测定。配制以下活性测定试剂，分析液：50mM Tris-Hcl,5mM MgCl₂，pH 8.0。用分析液将鲑鱼精DNA稀释至不同浓度，加入纯化的带6×His标签的突变的Benzonase核酸内切酶，然后置于37℃水浴中，保温30分钟后分别取样进行琼脂糖凝胶电泳。

活性单位定义为37℃，30分钟，鲑鱼精DNA吸光值A₂₆₀变化了1.0所需的酶量为一个活性单位(相当于完全消化37μg鲑鱼精DNA的酶量)。

如图4所示，突变的Benzonase核酸内切酶几乎没有酶活性。实施例2.用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒

用突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原制备多克隆抗体。

抗体制备委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行。使用健康的新西兰兔，在免疫前四天进行预采血。第一次免疫时将200ug的佛氏完全佐剂与200ug抗原充分混匀接种兔子；第二次免疫为第14天，将200ug的佛氏不完全佐剂与200ug抗原充分混匀接种兔子，在第21天时进行第一次采血检测，第三次免疫为第35天，将200ug的佛氏不完全佐剂与200ug抗原充分混匀接种兔子。在第42天时进行第二次采血检测。采用抗原亲和树脂层析法纯化多克隆抗体，使用免疫印迹法对纯化的抗体蛋白进行检测。采用间接ELISA法测定纯化后抗体效价，效价达到1：500000以上为合格抗体。

上述获得的多克隆抗体作为ELISA试剂盒的捕获抗体，用辣根过氧化物酶标记的上述获得的多克隆抗体作为ELISA试剂盒的检测抗体。抗体标记试剂盒购自同仁化学。

制备ELISA试剂盒。捕获抗体用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至终浓度为2μg/mL，酶标板每孔加100μL，放置于4℃包被过夜。次日倒掉样品孔中的包被液，用洗涤缓冲液(PBS，0.15M，0.05％Tween-20，pH7.4)洗涤3次(250μL/孔)，每次洗涤后在滤纸上扣干样品孔中的残留液体。然后每孔加入200μL封闭液(PBS,0.15M,0.05％Tween-20，pH7.4，0.5％酪蛋白)进行封闭，于室温放置1.5h。倒掉封闭液，用洗涤缓冲液洗涤样品孔3次。用稀释液将Benzonase核酸内切酶稀释成20、8、3.2、1.28、0.512、0.2048、0ng/ml，每孔分别加100μL，然后于37℃保温0.5h。倒掉样品孔中的反应液，用洗涤缓冲液洗涤样品孔每孔250μL，洗板3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体。用稀释液将上述制备的检测抗体稀释40000倍，每孔加入100μL，然后于37℃反应0.5h。倒掉未结合的酶标抗体，每孔加入250μL洗涤液洗涤共3次。然后加入显色液置于37℃，15min。每孔加入100μL终止液终止反应。将96孔板放入酶标仪中，进行读数，结果如表1所示。

每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以Benzonase核酸内切酶标准品的OD_450nm值为因变量Y，以标准品浓度为自变量X做曲线。使用四参数Logisitic数学模型拟合方程：Y＝((A-D)/(1+(X/C)^B))+D，以样品OD_450nm吸光度值代入公式计算样品中核酸酶的含量，标准曲线如图5所示。

表1

Benzonase核酸内切酶(ng/ml)	OD450平均值(两个重复)
		20	2.1862
8	1.0437
		3.2	0.4331
1.28	0.1763
		0.512	0.0837
0.2048	0.0539
		0	0.0432

用本发明的ELISA检测试剂盒检测溶瘤腺病毒产品中Benzonase核酸内切酶残留量，结果为0.24ng/ml。

使用本发明的ELISA试剂盒(试剂盒2)和北京义翘神州科技有限公司的重组Benzonase核酸内切酶定量检测试剂盒(试剂盒1，商品名：SuperNuclease ELISA KIT，货号：KIT-SSNP01)分别检测MercK的核酸酶产品(商品名：

endonuclease，货号：1.01697.0010)、翌圣生物科技(上海)有限公司的核酸酶产品(商品名：BenzonaseNuclease全能核酸酶，货号：20156ES25)以及杭州俊丰生物工程有限公司的核酸酶产品(商品名：重组核酸酶，批号：20190920)。

MercK、翌圣生物科技(上海)有限公司以及杭州俊丰生物工程有限公司的核酸酶产品分别命名为：ME、YS、HJ。

上述结果表明，使用本发明的ELISA检测试剂盒可以定量检测多种不同的Benzonase核酸内切酶产品。

序列表

<110> 山西集创生物科技有限公司

<120> 突变的Benzonase核酸内切酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 801

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgcttta acaacaagat gttggccttg gccgccctgc tgttcgccgc gcaggcgtcg 60

gccgacacgc tcgaatccat cgacaactgc gcggtcggct gcccgaccgg cggcagcagc 120

aacgtgtcta tcgtgcgcca tgcttatacg ttgaacaaca acagcaccac caagttcgcc 180

aactgggtgg cctatcacat caccaaagac acgccggcca gcggcaagac gcgcaactgg 240

aaaaccgatc cggctctcaa tccggcggac actctggcgc ccgccgatta caccggtgcc 300

aacgccgcgc tgaaggtcga tcgcggtcat caggcgccgc tggcctcgct ggcgggcgtt 360

tccgactggg aatcgttgaa ctacctgtcc aacatcacgc cgcaaaagtc cgatctgaac 420

cagggcgcct gggctcggct ggaagatcag gaacgcaagc tgatcgatcg cgccgatatc 480

tcctcggtct ataccgtgac cgggccgctg tatgagcgcg atatgggcaa actgccgggc 540

acccagaaag cgcacaccat ccccagcgcc tactggaagg taattttcat caacaacagc 600

ccggcggtga accactatgc cgccttcctg ttcgaccaga acacgccgaa gggcgccgat 660

ttctgccaat tccgcgtgac ggtggacgag atcgagaaac gcaccggcct gatcatctgg 720

gccggtctgc cggacgacgt gcaggcttcg ctgaagagca aaccgggcgt tctgccggag 780

ttgatgggct gcaaaaactg a 801

<210> 2

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Phe Asn Asn Lys Met Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Phe Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ser Ala Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala Val

20 25 30

Gly Cys Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His Ala

35 40 45

Tyr Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val Ala

50 55 60

Tyr His Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn Trp

65 70 75 80

Lys Thr Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp

85 90 95

Tyr Thr Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly Ala Gln Ala

100 105 110

Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr

115 120 125

Leu Ser Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp

130 135 140

Ala Arg Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ser Ser Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly

165 170 175

Lys Leu Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp

180 185 190

Lys Val Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala

195 200 205

Phe Leu Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe

210 215 220

Arg Val Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp

225 230 235 240

Ala Gly Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly

245 250 255

Val Leu Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn

260 265

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg atcatcacca tcaccatcac gacacgctcg aatccatcga c 51

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttt cagtttttgc agcccatcaa ct 32

Claims

1.突变的Benzonase核酸内切酶在制备用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒中的用途，其特征在于，

所述突变的Benzonase核酸内切酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示且所述突变的Benzonase核酸内切酶没有酶活性；

所述ELISA试剂盒包含已包被捕获抗体的固相载体，所述捕获抗体为用所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原免疫兔获得的多克隆抗体；以及检测抗体，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的用所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原免疫兔获得的多克隆抗体。