CN110878123B - 一种抗tk1原核重组单链抗体及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了单链抗体、单克隆抗体及其制备方法和应用。其中，该单链抗体含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该抗TK1单链抗体的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。

Description

一种抗TK1原核重组单链抗体及制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及单链抗体、单克隆抗体及其制备方法和应用，更具体地，涉及单克隆抗体、分离的核酸、载体、重组细胞、制备单克隆抗体的方法、免疫偶联物、检测条或检测试剂盒，以及单克隆抗体、免疫偶联物和检测条或检测试剂盒在检测细胞异常增殖的用途。
背景技术
人胸苷激酶1(Human Thymidine Kinase,hTK1)是人细胞增殖过程中DNA合成过程中的一种关键酶，与细胞异常增值速率相关。其蛋白单体分子由234个氨基酸组成，活性型式为由4个单体组成的四聚体。目前已经有大量研究指出，检测人血清hTK1含量可以预测发生早期肿瘤的发生风险，为肿瘤早发现早治疗提供有效辅助手段。
目前抗TK1单克隆抗体大多特异性差，而特异性和灵敏度较好的鸡抗TK1多克隆抗体因为制备周期长，纯化困难，一直限制着hTK1在人群中大量检测应用。
由此，抗TK1单克隆抗体有待研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种单克隆抗体，该单克隆抗体为抗TK1单克隆抗体，该单克隆抗体的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
发明人通过其之前研究筛选得到的一株鸡源抗TK1重组单链抗体基因序列(具有SEQ ID NO：3所示序列)，进行密码子优化以及加入SBP-tag后，得到了SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，并通过构建重组pET22b表达载体，在BL21(DE3)在细胞周质间隙表达可溶性的单链抗体蛋白，并通过TK1-31aa偶联多肽抗原的琼脂糖凝胶柱亲和层析提取纯化，制备得到高纯度的、高活性的、高特异性的重组抗TK1单链抗体蛋白。其中，SEQ ID NO：3所示序列如下：
GCAGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAACGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGCGATTATGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTTCGTCGCTGGTATTGAGAATGATGGTAGTAGCACATGGTACGCGACGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCGCCAAAGATTTTAGTAGTGGTTATGGTGGTTGGAGTGCTTCTGGTGGCATCGACGCATGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCTGGTGGAGGATCAGGTGGAGGAGGATCCGGAGGTGGTGGTTCTGGAGGTGGTTCTGCGCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCGGGAGAAACCGTCAAGATCACCTGCTCCGGGGATCGGAGCAGCTACTATGGTTACTATGGCTGGTATCAGCAGAAGGCACCTGGCAGTGCCCCTCTCACTGTGATCTATTACAGCAGCAACAGACCCACGAACATCCCTTCACGATTCTCTGGTTCCAAATCCGGCTCCACAGCCACATTAACCATCACTGGGGTCCGAGCCGAGGACGAGGCTGTCTATTACTGTGGGAGTGCAGAAGACAGCAGCTATGCTGCTATATTTGGGGCCGGGACAACCCTG
(SEQ ID NO：3)
因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种单链抗体。根据本发明的实施例，该链克隆抗体含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列如下：
AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKASGFTFSDYGMNWVRQAPGKGLEFVAGIENDGSSTWYATAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCAKDFSSGYGGWSASGGIDAWGHGTEVIVSSGGGSGGGGSGGGGSGGGSALTQPSSVSANPGETVKITCSGDRSSYYGYYGWYQQKAPGSAPLTVIYYSSNRPTNIPSRFSGSKSGSTATLTITGVRAEDEAVYYCGSAEDSSYAAIFGAGTTL(SEQ ID NO：1)
发明人惊奇地发现，该抗TK1单链抗体的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种单克隆抗体。根据本发明的实施例，该单克隆抗体含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，该抗TK1单克隆抗体的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种分离的核酸。所述核酸编码前述的单克隆抗体。根据本发明实施例的核酸编码的单克隆抗体，具有免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化等优点。
根据本发明的实施例，该核酸含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其中，SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列如下：
ATCCATGGATGCTGTTACCCTGGACGAATCTGGTGGTGGTCTGCAGACCCCGGGTGGTACCCTGTCTCTGGTTTGCAAAGCTTCTGGTTTCACCTTCTCTGACTACGGTATGAACTGGGTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGGTCTGGAATTCGTTGCTGGTATCGAAAACGACGGTTCTTCTACCTGGTACGCTACCGCTGTTAAAGGTCGTGCTACCATCTCTCGTGACAACGGTCAGTCTACCGTTCGTCTGCAGCTGAACAACCTGCGTGCTGAAGACACCGCTACCTACTTCTGCGCTAAAGACTTCTCTTCTGGTTACGGTGGTTGGTCTGCTTCTGGTGGTATCGACGCTTGGGGTCACGGTACCGAAGTTATCGTTTCTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGCTCTGACCCAGCCGTCTTCTGTTTCTGCTAACCCGGGTGAAACCGTTAAAATCACCTGCTCTGGTGACCGTTCTTCTTACTACGGTTACTACGGTTGGTACCAGCAGAAAGCTCCGGGTTCTGCTCCGCTGACCGTTATCTACTACTCTTCTAACCGTCCGACCAACATCCCGTCTCGTTTCTCTGGTTCTAAATCTGGTTCTACCGCTACCCTGACCATCACCGGTGTTCGTGCTGAAGACGAAGCTGTTTACTACTGCGGTTCTGCTGAAGACTCTTCTTACGCTGCTATCTTCGGTGCTGGTACCACCCTGGCTGCTGCTGCTGCTATGGACGAAAAAACCACCGGTTGGCGTGGTGGTCACGTTGTTGAAGGTCTGGCTGGTGAACTGGAACAGCTGCGTGCTCGTCTGGAACACCACCCGCAGGGTCAGCGTGAACCGGCGGCCGCAT(SEQ IDNO：2)
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体含有前述的核酸。根据本发明实施例的载体导入受体细胞后，能分泌产生抗TK1单克隆抗体，该单抗的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
根据本发明的实施例，所述载体为原核表达载体。由此，便于将该载体转化到原核细胞中，在原核细胞中制备抗TK1单克隆抗体。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有前述的载体。根据本发明实施例的重组细胞能分泌产生抗TK1单克隆抗体，该单抗的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种制备前述的单克隆抗体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前述的重组细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述单克隆抗体。由此，利用该方法制备的单克隆抗体免疫反应性好、特异性和灵敏性高，易于分离纯化。并且，该方法具有表达量高、易于扩大再生产、成本低廉等优点。
根据本发明的第七方面，本发明提供了一种免疫偶联物。根据本发明的实施例，该免疫偶联物含有前述的单克隆抗体，以及选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。根据本发明实施例的免疫偶联物，通过偶联单克隆抗体，能有效提高偶联部分的药物效果，对细胞异常疾病，例如组织增生和肿瘤等的疗效更佳。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种检测条或检测试剂盒。根据本发明的实施例，该检测条和检测试剂盒含有前述的单克隆抗体、前述的免疫偶联物、或它们与可检测标记物的结合物。由此，该检测条或检测试剂盒能用于检测TK1，进而判断细胞的异常增殖情况。并且该检测条或检测试剂盒的检测灵敏度高、特异性好。
根据本发明的第九方面，本发明提供了前述的单克隆抗体、前述的免疫偶联物和前述的检测条或检测试剂盒在检测细胞异常增殖的用途。由此，利用前述的单克隆抗体、前述的免疫偶联物和前述的检测条或检测试剂盒通过检测TK1，进而判断细胞的异常增殖情况，检测灵敏度高、特异性好。
根据本发明的实施例，所述细胞异常增殖包括怀孕、组织增生和肿瘤。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的双酶切电泳结果示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的SDS-PAGE电泳结果示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的ELISA检测结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明人经长期而深入的研究，对编码抗TK1单抗的编码基因进行了修饰，并以此构建了特异性表达抗TK1单抗的原核表达系统，并利用该表达系统所产生的抗TK1单抗检测TK1，进而判断细胞的异常增殖情况，并以此作为判断怀孕、组织增生和肿瘤的指标之一。在此基础上，发明人完成了本发明。
具体而言，本领域中已知原核表达系统存在目的蛋白纯化困难、以及原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低的缺陷。因此，本领域在TK1抗体制备时，采用的是真核表达系统。然而，采用真核表达系统制备工艺繁琐，筛选出特异性抗体的难度极大，成本也较高。
本申请的发明人通过研究意外地发现，通过构建抗TK1单克隆抗体的原核表达系统，不仅可获得易于纯化抗TK1单克隆抗体，且该抗TK1单克隆抗体对TK1的亲和力、特异性和灵敏性均较高。并且，该单克隆抗体特异性针对TK1，可以用于临床细胞异常增殖的早期检测。
单链抗体、单克隆抗体及其表达和制备
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种单链抗体。根据本发明的实施例，该单链抗体含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，该抗TK1单链抗体的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
本文所用术语“单链抗体”是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽(linker)连接而成的抗体。具体地，相对于单克隆抗体，单链抗体没有恒定区，但本发明实施例的单链抗体和单克隆抗体的功能和免疫效果是相同和相近的。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种单克隆抗体。根据本发明的实施例，该单克隆抗体含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，该抗TK1单克隆抗体的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即，组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种分离的核酸。该核酸编码前述的单克隆抗体。根据本发明实施例的核酸编码的单克隆抗体，具有免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化等优点。
发明人对编码前述的单克隆抗体的核苷酸序列加入SBP-tag并进行密码子优化，其中，SBP-tag的序列如下：
ATGGACGAAAAAACCACCGGTTGGCGTGGTGGTCACGTTGTTGAAGGTCTGGCTGGTGAACTGGAACAGCTGCGTGCTCGTCTGGAACACCACCCGCAGGGTCAGCGTGAACCG(SEQ ID NO：4)
基于上述优化，根据本发明的实施例，该核酸含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，该核苷酸序列为前述的抗TK1单克隆抗体的编码序列。该序列依据密码子偏嗜性，更适合抗体基因在大肠杆菌中的翻译和表达。
其中，需要说明的是，DNA转录成mRNA，mRNA经剪接等加工后翻译出蛋白质，所谓编码序列就是与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列，不考虑mRNA加工等过程中的序列变化，总之，编码序列就是与蛋白质的密码子完全对应，换句话说，编码序列就是编码一段蛋白产物的序列。
在本发明中，该核酸还包括对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。
在本发明中，该核酸还包括对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列相同或相似的抗TK1单克隆抗体功能。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体含有前述的核酸。根据本发明实施例的载体导入受体细胞后，能分泌产生抗TK1单克隆抗体，该单抗的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
根据本发明的实施例，该载体为原核表达载体，例如pET类表达载体。由此，便于将该载体转化到原核细胞中，在原核细胞中制备抗TK1单克隆抗体。
该载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。例如，该载体可以为大肠杆菌载体和病毒载体。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞含有前述的载体。根据本发明实施例的重组细胞能分泌产生抗TK1单克隆抗体，该单抗的免疫反应性好、特异性和灵敏性高，并且易于分离纯化。
根据本发明的一些实施例，该重组细胞可以通过将前述载体转化至宿主细胞而得到。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种制备前述的单克隆抗体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前述的重组细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，获得所述单克隆抗体。由此，利用该方法制备的单克隆抗体具有免疫反应性好、特异性和灵敏性高，以及易于分离纯化等优点。
根据本发明的一些实施例，该方法还包括对该单克隆抗体进行纯化处理，该纯化处理可以通过TK1-31氨基酸偶联多肽抗原的琼脂糖凝胶柱亲和层析进行。由此，该纯化处理得到的单克隆抗体纯度和活性高。
免疫偶联物、检测条或检测试剂盒及其用途
根据本发明的第七方面，本发明提供了一种免疫偶联物。根据本发明的实施例，该免疫偶联物含有前述的单克隆抗体，以及选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。根据本发明实施例的免疫偶联物，通过偶联单克隆抗体，能有效提高偶联部分的药物效果，对细胞异常疾病，例如组织增生和肿瘤等的疗效更佳。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种检测条或检测试剂盒。根据本发明的实施例，该检测条和检测试剂盒含有前述的单克隆抗体、前述的免疫偶联物、或它们与可检测标记物的结合物。由此，该检测条或检测试剂盒能用于检测TK1，进而判断细胞的异常增殖情况。并且该检测条或检测试剂盒的检测灵敏度高、特异性好。
根据本发明的一个优选实施例中，该可检测标记物选自：胶体金标记、荧光标记、同位素标记、酶标记，优选该酶标记为HRP酶标。
根据本发明的第九方面，本发明提供了前述的单克隆抗体、前述的免疫偶联物和前述的检测条或检测试剂盒在检测细胞异常增殖的用途。由此，利用前述的单克隆抗体、前述的免疫偶联物和前述的检测条或检测试剂盒通过检测TK1，进而判断细胞的异常增殖情况，检测灵敏度高、特异性好。
其中，细胞异常增殖的情况有多种，针对本发明实施例的抗TK1单克隆抗体，该细胞异常增殖可以包括怀孕、组织增生和肿瘤，检测的灵敏度和准确率高。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1
本发明实施例的抗TK1单克隆抗体的表达方法如下：
1、材料与方法
1.1材料
pET22b质粒赠自首都医科大学基础医学院；
菌株BL21(DE3)购自华越洋生物技术有限公司；
培养基(蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖，购自上海阿拉丁生化科技有限公司，氯化钾、氯化镁、氯化钠，购自国药公司)；
琼脂糖、4Sgreen核酸染色剂、IPTG、氨苄青霉素购自上海生工生物股份有限公司；
DNA胶回收试剂盒购自Qiagen生物技术公司；
甘氨酸购自Sigma公司；
抗体基因由金斯瑞生物科技有限公司合成；
NcoI与NotI限制性内切酶购自NEB生物科技公司；
PCR试剂盒购自Takara生物技术公司；
T4连接酶购自Takara生物技术公司；
生物素化抗TK1-IgY抗体为自制；
单组份TMB显色液购自湖州英创生物科技有限公司；
超滤离心管购自赛多利斯；
1.2仪器
Bio-rad电泳仪，Bio-Rad Gel-XR+，凝胶成像系统恒温振荡培养箱(上海智城)，水平电泳槽(北京六一)，T100电泳槽(购自Bio-Rad)，MicroPulser电穿孔仪(购自Bio-Rad)，H2050R型高速冷冻离心机(购自湘仪)，MULTCSKAN Fc型酶标仪(购自Thermo)，
1.3试剂
SOC培养基：2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，0.05％(W/V)NaCl，2.5mMKCl，10mMMgCl2，20mM glucose；
SOB培养基：2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，0.05％(W/V)NaCl，2.5mMKCl，10mMMgCl2，1.5％琼脂粉，100ug/ml氨苄青霉素；
LB培养基：Tryptone)10g/L，Yeast extract)5g/L，NaCl 10g/L，含100ug/ml氨苄青霉素；
TAE buffer(50*)：称量Tris 242g，EDTA 18.612g于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀，加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解，用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存；
TE buffer(1*)：10mMTris-HCl1mM EDTA PH＝8.0；
蛋白抽提液：36％蔗糖，20mM pH7.4PBS buffer2.5mM EDTA；
PBS buffer：称取2.758gNa2HPO4.2H2O、0.232gNaH2PO4.H2O、8.5gNaCl，溶解定容至1L，并调pH至7.4；
甘氨酸洗脱液：称取7.5g甘氨酸、8.775gNaCl溶解定容于1L，用1M NaOH调pH至2.5；
PBST：按0.1％加入Tween-20至PBS buffer，过滤即可；
硫酸终止液：准确量取56ml弄硫酸小心溶解于944ml去离子水中，待冷却后即可。
2方法
2.1双酶切目的片段与pET22b质粒载体
分别取目的单链抗体基因(SEQ ID NO：2所示基因)与载体pET1ug，加入50ulPCR管中，加入NEB Buffer3.1溶液5ul以及1ulNcoI与NotI限制性内切酶，定容至50ul，37℃反应1h，产物琼脂糖凝胶电泳回收。
2.2酶联反应
回收的双酶切产物按插入目的基因片段：质粒载体＝3:1摩尔量混合加入PCR管中，按TakaraT4连接酶说明书加入2*buffer与1ul T4连接酶，16℃连接过夜，产物乙醇/醋酸钠沉淀纯化。
2.3电转感受态细胞制备
BL21(DE3)接种至5ml LB培养基中，37℃过夜震荡培养，再取出，按1:100接种至500ml LB培养基中，37℃培养至OD＝0.5，5000r/min离心10min，除去培养基，再加入1/5菌液体积的预冷灭菌的去离子水悬浮细胞，5000r/min离心20min，弃上清，加入1/10菌液体积的10％的预冷灭菌甘油，5000r/min离心20min，弃上清，再用1/50体积的预冷灭菌10％甘油漂洗，5000r/min离心20min，弃上清，菌体用2ml10％甘油悬浮分装50ul/管。
2.4电转化
40ul BL21(DE3)电转感受态细胞，冰上融化，加入1ul酶连回收产物，冰上放置混匀2min，加入1mm电击杯，1.8Kv电击5ms，立即加入1mlSOC培养基中，37℃震荡培养1h，取出将菌液均匀涂布在含100ug/ml氨苄青霉素的SOB固体培养基上，37℃孵育培养过夜。
2.5诱导表达
挑取单菌落，37℃培养4h，按1:100加入含氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养至OD600＝0.6，加入至终浓度为0.5mm的IPTG，25℃诱导过夜。
2.6表达提取
5000r/min，离心10min收集菌体，加入等量的蛋白提取液，室温下充分混匀悬浮细胞，约10min，再迅速加入5倍体积的预冷灭菌去离子水，平衡20min，4℃离心8000r/min离心15min，上清即为目的单链抗体提取物，加入PMSF蛋白保护剂。
2.7亲和层析纯化
用0.01M tris base平衡柱子3次，加入要纯化的经0.45um滤膜过滤的“步骤2.6”得到的单链抗体提取物，置于摇床上在室温反应2到4小时.用0.01M tris base洗涤柱子三次以上，洗掉未结合的杂质，用9ml 0.1M PH 2.5甘氨酸洗脱结合在柱子上的抗体，将1ml1M pH8.0的Tris-HCl溶液加入EP管中，中和洗脱的抗体，于0.01M PBS中透析4次，间隔时间为8小时换液一次，将抗体溶液装入孔径10kDa的超滤离心管离心浓缩至约2ml后得到纯化后的抗TK1单克隆抗体。
2.8ELISA对比检测
将纯化并测量浓度的单克隆抗体与生物素化抗TK1-IgY抗体用PBS配置成相同的0.1ug/ml，分别稀释6、36、216、2196、7776、46656倍，具体浓度详见下表，以100ul/孔，加入1ug/ml TK1抗原包被的微孔反应板37℃反应1h，PBST洗涤3次，再加入1:10000稀释的SA-HRP37℃反应1h，PBST洗涤3次，再加入单组份TMB显色液，37℃反应10min，加入硫酸终止液终止反应，酶标仪读取OD450。
Figure BDA0001789460300000081
Figure BDA0001789460300000091
3结果
实验结果如图1-3所示，
3.1双酶切电泳结果
图1所示为重组单链抗体表达质粒与原始空Pet22b+质粒Not I与Nco I限制性内切酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果，Lane 1为重组scfv-pET22b+质粒；Lane2为重组scfv-pET22b+质粒Not I与Nco I酶切产物；Lane 3为DNA Lader；Lane 4为pET22b+空质粒；Lane5为pET22b+空质粒Not I与Nco I酶切产物，表明重组质粒中含有目的基因。
3.2表达纯化蛋白SDS-PAGE电泳结果
SDS-PAGE电泳结果如图2所示，Lane1为蛋白Marker，Lane 2为重组单链抗体表达菌未诱导对照，Lane3为重组单链抗体表达菌诱导后菌体破碎液，Lane 4为过Ni-NTA亲和层析柱100mM洗脱液，Lane 5为过Ni-NTA亲和层析柱200mM洗脱液，表明纯化得到的蛋白为单链抗体。
3.3 ELISA检测对比结果
ELISA检测结果如图3所示，单链抗体在抗体效价上与生物素化抗TK1抗体比较接近，但其耐稀释能力更好。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司
<120> 一种抗TK1原核重组单链抗体及制备方法
<130> PIDC4180128
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体
<400> 1
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Glu Asn Asp Gly Ser Ser Thr Trp Tyr Ala Thr Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Phe Ser Ser Gly Tyr Gly Gly Trp Ser Ala Ser Gly Gly
100 105 110
Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
145 150 155 160
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Leu Thr Val Ile Tyr
180 185 190
Tyr Ser Ser Asn Arg Pro Thr Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Lys Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ser Ala Glu Asp Ser Ser Tyr Ala
225 230 235 240
Ala Ile Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu
245
<210> 2
<211> 896
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 核酸
<400> 2
atccatggat gctgttaccc tggacgaatc tggtggtggt ctgcagaccc cgggtggtac 60
cctgtctctg gtttgcaaag cttctggttt caccttctct gactacggta tgaactgggt 120
tcgtcaggct ccgggtaaag gtctggaatt cgttgctggt atcgaaaacg acggttcttc 180
tacctggtac gctaccgctg ttaaaggtcg tgctaccatc tctcgtgaca acggtcagtc 240
taccgttcgt ctgcagctga acaacctgcg tgctgaagac accgctacct acttctgcgc 300
taaagacttc tcttctggtt acggtggttg gtctgcttct ggtggtatcg acgcttgggg 360
tcacggtacc gaagttatcg tttcttctgg tggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg 420
tggtggttct ggtggtggtt ctgctctgac ccagccgtct tctgtttctg ctaacccggg 480
tgaaaccgtt aaaatcacct gctctggtga ccgttcttct tactacggtt actacggttg 540
gtaccagcag aaagctccgg gttctgctcc gctgaccgtt atctactact cttctaaccg 600
tccgaccaac atcccgtctc gtttctctgg ttctaaatct ggttctaccg ctaccctgac 660
catcaccggt gttcgtgctg aagacgaagc tgtttactac tgcggttctg ctgaagactc 720
ttcttacgct gctatcttcg gtgctggtac caccctggct gctgctgctg ctatggacga 780
aaaaaccacc ggttggcgtg gtggtcacgt tgttgaaggt ctggctggtg aactggaaca 840
gctgcgtgct cgtctggaac accacccgca gggtcagcgt gaaccggcgg ccgcat 896
<210> 3
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体
<400> 3
gcagtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggaac gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc gattatggca tgaactgggt gcgacaggcg 120
cccggcaagg ggctggagtt cgtcgctggt attgagaatg atggtagtag cacatggtac 180
gcgacggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accgccacct acttctgcgc caaagatttt 300
agtagtggtt atggtggttg gagtgcttct ggtggcatcg acgcatgggg ccacgggacc 360
gaagtcatcg tctcctctgg tggaggatca ggtggaggag gatccggagg tggtggttct 420
ggaggtggtt ctgcgctgac tcagccgtcc tcggtgtcag caaacccggg agaaaccgtc 480
aagatcacct gctccgggga tcggagcagc tactatggtt actatggctg gtatcagcag 540
aaggcacctg gcagtgcccc tctcactgtg atctattaca gcagcaacag acccacgaac 600
atcccttcac gattctctgg ttccaaatcc ggctccacag ccacattaac catcactggg 660
gtccgagccg aggacgaggc tgtctattac tgtgggagtg cagaagacag cagctatgct 720
gctatatttg gggccgggac aaccctg 747
<210> 4
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SBP-tag
<400> 4
atggacgaaa aaaccaccgg ttggcgtggt ggtcacgttg ttgaaggtct ggctggtgaa 60
ctggaacagc tgcgtgctcg tctggaacac cacccgcagg gtcagcgtga accg 114

Claims (11)

1.一种单链抗体，其特征在于，所述单链抗体含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的单链抗体。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2或3所述的核酸。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为原核表达载体。
6.一种表达权利要求1所述的单链抗体的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求4或5所述的载体。
7.一种制备权利要求1所述的单链抗体的方法，其特征在于，包括：
将权利要求6所述的重组细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述单链抗体。
8.一种免疫偶联物，其特征在于，包括，该免疫偶联物含有权利要求 1所述的单链抗体；以及
选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。
9.一种检测条或检测试剂盒，其特征在于，所述检测条和检测试剂盒含有权利要求 1所述的单链抗体、权利要求8所述的免疫偶联物、或它们与可检测标记物的结合物。
10.权利要求 1所述的单链抗体、权利要求8所述的免疫偶联物在制备检测细胞异常增殖的试剂盒中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述细胞异常增殖包括组织增生和肿瘤。
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