CN111499734B - 一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用，涉及生物工程技术领域。本发明提供了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体，其氨基酸序列为Seq ID NO.1或Seq ID NO.3；本发明提供了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体的编码基因，其核苷酸序列为Seq ID NO.2或Seq ID NO.4。本发明采用噬菌体抗体库技术筛选了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体ScFv‑DuCV，并进一步对其进行了抗体结构改造，获得了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体ScFv‑mDuCV，上述两种抗体都可以用于鸭圆环病毒的检测和诊断；其中，抗鸭圆环病毒的单链抗体ScFv‑mDuCV与鸭圆环病毒具有良好的病毒识别特异性，同时，对鸭圆环病毒有良好的阻断效果，为治疗和抑制鸭圆环病毒的新型药物研究打下了基础。

Description

一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用。
背景技术
为了检测鸭圆环病毒疫病和防治其对养鸭业的危害，抗体技术在养鸭业疫病方面发挥了重要的作用。但是，常用的单克隆抗体技术存在抗体基因易丢失、制备周期长、抗体基因不易改造等缺点，人们将目光逐渐转向基因工程的方法制备抗体。
噬菌体抗体库原理是将抗体可变区基因与丝状噬菌体衣壳蛋白基因连接，并表达在噬菌体表面，通过抗原对抗体库进行多轮亲和吸附，从中淘筛选出所需的特异性抗体。噬菌体抗体库制备周期短、抗体改造简单，且可短期制备大量抗体；同时，开发的单链抗体(single chain antibody fragment，ScFv)为完整抗体的1/6，既具有常规抗体的特异性又减少了抗体的免疫原性，成为基因工程抗体开发的重要工具。
目前，尚未有研究利用噬菌体抗体库技术，来研制抗鸭圆环病毒的单链抗体，并用于检测和诊断鸭圆环病毒。如何解决上述技术问题，是目前生物工程技术领域需要解决的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用。
本发明所采用的技术方案为：
本发明提供了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体，其氨基酸序列为Seq ID NO.1。
本发明提供了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体的编码基因，其核苷酸序列为Seq IDNO.2。
本发明提供了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体，其氨基酸序列为Seq ID NO.3。
本发明提供了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体的编码基因，其核苷酸序列为Seq IDNO.4。
本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体由表达载体和如上所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体的编码基因重组而成。
本发明提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌是向宿主菌中转化如上所述的重组表达载体而成。
本发明提供了一种如上所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体的制备方法，具体步骤如下：
(1)将如上所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体核苷酸序列克隆到表达载体中，得到重组表达载体；
(2)将步骤1得到的重组表达载体转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组工程菌；
(3)利用重组工程菌诱导表达抗鸭圆环病毒的单链抗体；
(4)提取纯化步骤3得到的抗鸭圆环病毒的单链抗体。
具体的，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌TG1感受态细胞，也可以为大肠杆菌BL21，也可以为大肠杆菌Top10、大肠杆菌JM109或大肠杆菌Rosseta等。
具体的，所述抗鸭圆环病毒的单链抗体用于检测和诊断鸭圆环病毒。
本发明提供了一种检测试剂盒，包括上述抗鸭圆环病毒的单链抗体。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识，利用上述抗鸭圆环病毒的单链抗体制备检测试剂盒，用于检测鸭圆环病毒、或用于鉴定和防控由鸭圆环病毒侵染导致的疾病。
本发明的有益效果是：本发明采用噬菌体抗体库技术筛选了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体ScFv-DuCV，并进一步对其进行了抗体结构改造，获得了一种抗鸭圆环病毒的单链抗体ScFv-mDuCV，上述两种抗体都可以用于鸭圆环病毒的检测和诊断；其中，抗鸭圆环病毒的单链抗体ScFv-mDuCV与鸭圆环病毒具有良好的病毒识别特异性，同时，对鸭圆环病毒有良好的阻断效果，为治疗和抑制鸭圆环病毒的新型药物研究打下了基础。
附图说明
图1为噬菌体单链抗体的基因PCR扩增结果图，
其中，M是标准DNA分子量标记物；N是空白对照；1是ScFv片段；
图2为单链抗体ScFv-mDuCV与鸭圆环病毒特异性反应的SDS-PAGE结果图；
图3为单链抗体ScFv-DuCV与鸭圆环病毒特异性反应的的SDS-PAGE结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1抗鸭圆环病毒的噬菌体单链抗体库的构建
1、将感染鸭圆环病毒的樱桃谷鸭肝脏与脾脏捣碎后加入适量PBS，蔗糖密度梯度超速离心制备纯化病毒液。获得的纯化鸭圆环病毒液用甲醛灭活后与弗氏佐剂1:1乳化后免疫BALB/c小鼠，三次免疫，免疫间隔14d。当鸭圆环病毒通过ELISA抗体检测，效价达1:100000以上后，剖杀小鼠，取50mg脾脏，通过Trizol试剂盒提取总RNA。
2、基因组DNA的去除和反转录合成cDNA
需要说明的是，在本实验中，优选天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒，进行基因组DNA的去除和反转录合成cDNA。
2.1基因组DNA的去除反应体系配制如下：
5×gDNA Buffer 2μl
RNA模板 1μg
RNase-Free ddH2O 补足到10μl
混匀后42℃孵育3min，然后置于冰上放置。
2.2cDNA的合成按下述体系配制混合液，充分混匀。
Figure GDA0002509641210000041
将上述基因组DNA的去除体系和反转录体系混合，充分混匀，42℃孵育15min。95℃孵育3min后放于冰上，既得扩增用cDNA模板。
3、小鼠抗体轻、重链可变区扩增引物如下：
扩增单链抗体重链VH的引物：
VH上：5-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3；
VH下：5-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。
扩增单链抗体轻链VL的引物：
VL上：5-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATYGAGCTCACYCAGTCTCC-3；
VL下：5-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。
备注：B＝T、C、G；K＝T、G；M＝A、C；R＝A、G；S＝G、C；W＝A、T；Y＝C、T。
以上述步骤2.2中获得的cDNA作为模板，用上述引物扩增小鼠抗体轻、重链可变区基因并进行胶回收。
4、将胶回收的VH和VL基因等量混合作为模板进行重叠延伸PCR(SOE-PCR)以装配单链抗体ScFv片断，条件为94℃1min变性、55℃1min退火、72℃1min延伸，共30个循环，扩增获得的PCR产物即为单链抗体基因，大小为705bp，实验结果见图1。
5、将胶回收的ScFv基因和pCANTAB5E载体分别用Sfi I和Not I双酶切后连接，将连接产物转化到100μl TG1感受态细胞，然后加入900μl 37℃预热的2×YT培养基，37℃振荡培养1h。
需要说明的是，2×YT培养基配方为1.6％的胰蛋白胨，1％的酵母提取物，0.5％的氯化钠，调至PH值7.0，高温高压处理配制而成。
取上步转化后培养的菌液100μl，用2×YT培养液做梯度倍比稀释，涂布SOB-AG平板，30℃培养过夜。计数平板上的单菌落数，推算抗体库库容量为1×109。剩余的转化后培养的菌液，加入10ml 2×YT(含2％葡萄糖，100μg/ml的氨苄青霉素)，37℃培养至对数生长期，加入2×1010噬菌体M13K07，37℃培养1h，4000g/min离心10min，重悬沉淀于200ml 2×YT(含100μg/ml的氨苄青霉素，50μg/mlAmp的卡那霉素)，37℃振荡培养过夜。4000g/min离心10min后，加入1/5体积量的PEG/NaCl(20％的PEG8000，2.5mol/L的NaCl)于4℃沉淀噬菌体30min，9000g/min离心20min，将沉淀噬菌体重悬于2ml含10g/L BSA的PBS中，12000g/min离心5min，上清经0.45μm滤膜过滤，即获得噬菌体单链抗体库。
实施例2单链抗体多样性的分析
随机挑取20个克隆，摇菌扩增后提取质粒，用Sfi I和Not I双酶切，初步鉴定阳性克隆。以S1(5-CAACGTGAAAAAATTATTATT-3)、S6(5-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3)为引物进行测序分析，结果20个克隆的基因序列均与小鼠免疫球蛋白可变区序列一致，符合小鼠轻重链可变区基因结构，排列方式为VH-Linker-VL。其中VH部分为357-367bp左右，VL为320-330bp左右，重链和轻链之间的linker碱基序列全部正确。序列比对表明其同源性达80％以上。
实施例3抗鸭圆环病毒单链抗体库的富集
1、将纯化的鸭圆环病毒液按1∶10(体积比)稀释，用碳酸盐包被缓冲液包被到免疫管，2ml/管，4℃过夜。
2、包被完毕，用PBS洗免疫管3次，封闭液(2％脱脂乳PBS，MPBS)封闭免疫管，37℃封闭2h。
3、倾去封闭液，用PBS洗免疫管3次。
4、将上述已获得的初级噬菌体单链抗体库上清，按照MPBS:上清＝2:3的体积比将MPBS和噬菌体上清进行混匀，在室温下进行去干扰化处理20min。
5、将步骤4中处理好的混匀液体加入封闭好的免疫管，2ml/管，轻摇温育30min后，再静置温育1.5小时。
6、弃免疫管内噬菌体上清，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次。
7、加入甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱液，2ml/管，37℃作用6min后，迅速加入Tris缓冲液(2mol/L pH 7.4)，200μl/管中和洗脱下来的噬菌体溶液，再加入2ml新鲜的TG1菌液(OD600值约为0.5)，37℃作用1h。完成了第一轮淘筛，获得了一级抗体库。
8、取部分菌液做10倍梯度稀释后，涂布SOB-AG板，计算输出的噬菌体淘筛量，剩余菌液加入终浓度为100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖，同时加入约4×1010M13K07噬菌体，静置温育30min后，再250r/min振荡培养30min；1000r/min离心10min，去上清，用100ml 2×YT-AK轻悬细胞，37℃振荡培养过夜，开始下一轮淘筛。
9、经过3轮淘筛，获得的菌液用2×YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOB-AG平板，30℃培养过夜；
选取大约有100-200个左右菌落的平板，计算菌落数目，乘以稀释倍数，即得相应库容。经过3轮特异性富集淘筛，获得了滴度约为4.6×107pfu/ml的噬菌体重组抗体库。剩余菌液加入无菌甘油至终浓度20％，混匀后，-70℃冻存，标记为三级抗体库。
实施例4单链抗体的检测及强阳性株的筛选
取72个1.5ml离心管，400μl/管加入2×YT-AG培养基。挑取上述SOB-AG平板上长出的单个菌落，接种至上面各管中，标记为Master Plate；将Master Plate置于摇床，30℃振荡培养过夜。第二天另取72个1.5ml离心管，400μl/管加入含2.5×1010pfu/ml M13K07的2×YT-AG，标为P1 Plate。将过夜培养的Master Plate培养基以40μl/管加入P1 Plate，置于摇床，37℃振荡培养2h。1500r/min离心20min，小心弃上清，每管加入400μl 2×YT-AK培养液，37℃，振荡培养过夜，1500r/min离心20min，小心取上清待用。
将纯化的鸭圆环病毒包被酶标板，MPBS封闭，洗涤后以上面获得噬菌体液为一抗，37℃孵育2h，HRP标记的抗M13单抗为二抗，37℃反应1h，洗涤后加入TMB显色液，37℃反应30min，加入2M硫酸终止显色，酶标仪测OD450值，设M13K07包被对照孔(阳性对照)和空白包被对照孔，找出阳性克隆(OD值≥0.3且OD值/OD空白孔≥3可以确定为阳性克隆)。ELISA测定各孔上清与鸭圆环病毒的结合情况，结果发现15株克隆与鸭圆环病毒有阳性反应，其中一株噬菌体抗体为强阳性，命名为ScFv-DuCV株。
提取ScFv-DuCV株克隆的重组质粒，以S1、S6为引物做PCR鉴定，目的片段用胶回收试剂盒回收后送公司测序，结果表明ScFv-DuCV基因排列方式为VH-Linker-VL，序列符合小鼠轻重链可变区基因结构。在GenBank中进行Blast同源性比较，发现最大同源性只为91％，是一个新的鼠单链抗体ScFv，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，核苷酸序列为SEQID NO:2。
为了提高抗体的亲和力，利用生物软件对ScFv-DuCV进行蛋白结构预测，将ScFv-DuCV株的21位精氨酸(R)换成赖氨酸(K)、35位谷氨酸(E)换成色氨酸(W)、53位异亮氨酸(I)换成苯丙氨酸(F)、105位亮氨酸(L)换成精氨酸(R)、150位脯氨酸(P)换成缬氨酸(V)、213位丝氨酸(S)换成精氨酸(R)和214位亮氨酸(L)换成甲硫氨酸(M)，获得一种改造的单链抗体，命名为单链抗体ScFv-mDuCV，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，核苷酸序列为SEQID NO:4。
实施例5单链抗体ScFv-DuCV与ScFv-mDuCV的原核表达
1、单链抗体ScFv-DuCV与ScFv-mDuCV表达载体的构建
根据核苷酸序列SEQ ID NO:2，设计一对引物扩增ScFv-DuCV基因，同时两端分别加上BamHI和Hind III内切酶：
DuCV-P1：5-CCAGGATCCATGGCCCAGGTGAAG-3
DuCV-P2：5-CCG AAGCTTTTACTTCAGTTCGAG-3
加入下列试剂进行扩增：
Figure GDA0002509641210000091
纯化PCR产物，与表达载体pET-28a分别BamHI和Hind III双酶切后连接，并转入DH5α菌株接种到含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡过夜，提取重组质粒酶切鉴定。
根据核苷酸序列SEQ ID NO:4，合成ScFv-mDuCV基因，两端分别加上BamHI和HindIII内切酶，与表达载体pET-28a分别双酶切后连接，并转入DH5α菌株接种到含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡过夜，提取重组质粒酶切鉴定。
将鉴定好的pET28a-ScFv-DuCV、pET28a-ScFv-mDuCV送公司测序，结果正确无误。
2、单链抗体ScFv-DuCV、ScFv-mDuCV的原核表达及纯化
将鉴定好的重组质粒pET28a-ScFv-DuCV、pET28a-ScFv-mDuCV分别转入BL21(DE3)大肠杆菌中，在37℃培养至菌液OD600值约0.6时，加IPTG诱导表达目的蛋白，30℃诱导6h。诱导表达后菌液8000r/min离心15min，菌体沉淀以1:10比例加入Wash Buffer(20mM Tris，500mM NaCl，pH7.5)，冰上超声破碎细菌，10000r/min离心10min。收集超声破碎上清，常规方法进行镍柱纯化，将重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后即得单链抗体ScFv-DuCV、ScFv-mDuCV。考马斯亮蓝法分别测定单链抗体的蛋白浓度，用PBS液调整为1mg/ml，-20℃保存备用。SDS-PAGE检测表明制备的单链抗体分子量均为28kD左右，符合预期。Wesern-blot检测结果见图2和图3，检测结果表明单链抗体ScFv-DuCV、ScFv-mDuCV均可以与鸭圆环病毒发生阳性信号，具有特异性反应。
实施例6间接ELISA法检测重组单链抗体的活性
按照最佳包被条件，将纯化的鸭圆环病毒包被酶标板，洗涤后加入MPBS封闭，洗涤后分别加上不同稀释度的重组单链抗体ScFv-DuCV、ScFv-mDuCV，同时设立PBS液作为阴性对照，37℃反应1h。弃重组抗体液，用PBST洗涤3次，加入HRP标记抗His的抗体(1:4000稀释)，100μl/孔，37℃反应1h。弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，加入TMB显色液，100μl/孔，37℃孵育显色15min。加入终止液，100μl/孔，酶标仪读取OD450值，结果见表1。
结果表明，单链抗体ScFv-DuCV、ScFv-mDuCV均与鸭圆环病毒具有较强的结合能力，其中ScFv-mDuCV与鸭圆环病毒的结合能力优于ScFv-DuCV。
表1间接ELISA检测改造前后重组单链抗体的活性
Figure GDA0002509641210000101
Figure GDA0002509641210000111
实施例7阻断ELISA法检测重组单链抗体ScFv-mDuCV的活性
按照最佳包被条件，将纯化的鸭圆环病毒包被96孔板，4℃包被过夜后用MPBS封闭。将鸭圆环病毒液按8倍、4倍、2倍浓度设置3个梯度，每个梯度病毒与重组单链抗体ScFv-mDuCV液各50μl在孔外室温反应30min，移至阻断孔。同时取PBS液与重组单链抗体ScFv-mDuCV液同样反应后移至未阻断孔。37℃反应1h，弃反应液，用PBST洗涤3次，加入HRP标记抗His的抗体(1:4000稀释)，100μl/孔，37℃反应1h。弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，加入TMB显色液，100μl/孔，37℃孵育显色15min。加入终止液，100μl/孔，酶标仪读取OD450值，试验结果见表2。
结果表明鸭圆环病毒浓度越高，与酶标板上鸭圆环病毒反应的单链抗体ScFv-mDuCV越少，重组单链抗体ScFv-mDuCV对鸭圆环病毒有良好的阻断效果。
表2阻断ELISA法检测重组单链抗体ScFv-mDuCV的活性
Figure GDA0002509641210000112
实施例8重组单链抗体ScFv-mDuCV的特异性试验
将纯化的鸭圆环病毒(DuCV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎I型病毒(DHV-I)、鸭肝炎III型病毒(DHV-III)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)等分别包被96孔酶标板，4℃包被过夜。MPBS 37℃封闭2h，洗涤后加入重组单链抗体ScFv-mDuCV作为一抗，37℃反应1h，洗涤。将HRP标记抗His的抗体用PBS做1:4000稀释，100μl/孔，37℃孵育反应1h。弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，加入TMB显色液，100μl/孔，37℃孵育显色15min。加入终止液，100μl/孔，酶标仪读取OD450值，试验结果见表3。
结果表明重组单链抗体ScFv-mDuCV仅能够与鸭圆环病毒发生反应，具有良好的病毒识别特异性。
表3重组单链抗体ScFv-mDuCV的特异性
Figure GDA0002509641210000121
实施例9基于单链抗体ScFv-mDuCV的双抗夹心ELISA法检测鸭圆环病毒
将常规方法纯化的抗鸭圆环病毒兔多抗按100ng/孔包被96孔酶标板，4℃包被过夜。MPBS封闭，洗涤后加入适当稀释的鸭圆环病毒样品，各做三个重复，37℃反应1h，洗涤后加入单链抗体ScFv-mDuCV(1:5000稀释)，37℃反应1h，洗涤后加入HRP标记抗His抗体，37℃反应1h，同上显色及测定OD450值，同时设立不含鸭圆环病毒的PBS液作为阴性对照，试验结果见表4。
试验结果表明建立的双抗夹心ELISA法可以用于检测鸭圆环病毒抗原。
表4双抗夹心ELISA法检测鸭圆环病毒
Figure GDA0002509641210000122
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东新希望六和集团有限公司
新希望六和股份有限公司
青岛嘉智生物技术有限公司
<120> 一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 抗鸭圆环病毒的单链抗体(ScFv-DuCV)
<400> 1
Met Ala Gly Val Leu Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Ala Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Ala Met Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro Thr
20 25 30
Ser Thr Gly Met His Thr Ile Leu Gly Ala Pro Gly Gly Gly Leu Gly
35 40 45
Thr Ile Gly Thr Ile Ala Pro Ser Thr Gly Thr Thr Ala Thr Ala Gly
50 55 60
Leu Pro Leu Ala Leu Ala Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Thr Met Gly Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Ala Ser Ala Val Thr
85 90 95
Thr Thr Cys Ala Ala Ser Gly Gly Leu Gly Pro Ala Thr Thr Gly Gly
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gly Leu Thr Gly Ser Pro Ala
130 135 140
Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Leu Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
145 150 155 160
Ser Gly Ala Ile Thr Ser Ala Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly
165 170 175
Leu Ser Pro Gly Leu Leu Val Thr Ala Ala Thr Ser Ala Met His Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Leu Leu Ile Ala Ser Leu Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Thr Thr Cys
210 215 220
Gly Gly Ala Ser Ser Ala Pro Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly
225 230 235 240
Leu Leu
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> 抗鸭圆环病毒的单链抗体(ScFv-DuCV)
<400> 2
atggctcagg ttaaactgca gcagtctggt gctgaagttg ctaaaccggg tgcttctgtt 60
cgtatgtctt gcaaagctag tggttacacc ttcacctctt acgaaatgca ctggatcaaa 120
cagcgtccgg gtcagggtct ggaatggatc ggttacatca acccgtctac cggttacacc 180
gcttacaacc agaaattcaa agacaaagct accctgaccg ctgacaaatc ttcttctacc 240
gcttacatgc agctgtcttc tctgacctct gaagactctg ctgtttacta ctactgcgct 300
cgttctggtg gtctgggttt cgactactgg ggtcagggta ccaccgttac cgtttcttct 360
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctgacat cgaactgacc 420
cagtctccgg cttctctgtc tgtttctccg ggtgaaaaag ttaccatcac ctgctctgct 480
tctgaaaaca tctactctaa cctggcttgg taccagcaga aaccgggtaa atctccgcag 540
ctgctggttt acgctgctac ctctaacatg cactctggtg ttccgtctcg tttctctggt 600
tctggttctg gtacctctta ctctctgaaa atcaactctc tgcagtctga agacttcggt 660
tcttactact gccagcagcg ttcttctaac ccgaccttcg gtggtggtac caaactggaa 720
ctgaaa 726
<210> 3
<211> 242
<212> PRT
<213> 抗鸭圆环病毒的单链抗体(ScFv-mDuCV)
<400> 3
Met Ala Gly Val Leu Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Ala Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Leu Met Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro Thr
20 25 30
Ser Thr Thr Met His Thr Ile Leu Gly Ala Pro Gly Gly Gly Leu Gly
35 40 45
Thr Ile Gly Thr Pro Ala Pro Ser Thr Gly Thr Thr Ala Thr Ala Gly
50 55 60
Leu Pro Leu Ala Leu Ala Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Thr Met Gly Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Ala Ser Ala Val Thr
85 90 95
Thr Thr Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ala Gly Pro Ala Thr Thr Gly Gly
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gly Leu Thr Gly Ser Pro Ala
130 135 140
Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Gly Leu Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
145 150 155 160
Ser Gly Ala Ile Thr Ser Ala Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly
165 170 175
Leu Ser Pro Gly Leu Leu Val Thr Ala Ala Thr Ser Ala Met His Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Leu Leu Ile Ala Ala Met Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Thr Thr Cys
210 215 220
Gly Gly Ala Ser Ser Ala Pro Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly
225 230 235 240
Leu Leu
<210> 4
<211> 726
<212> DNA
<213> 抗鸭圆环病毒的单链抗体(ScFv-mDuCV)
<400> 4
atggctcagg ttaaactgca gcagtctggt gctgaagttg ctaaaccggg tgcttctgtt 60
aaaatgtctt gcaaagctag tggttacacc ttcacctctt actggatgca ctggatcaaa 120
cagcgtccgg gtcagggtct ggaatggatc ggttacttca acccgtctac cggttacacc 180
gcttacaacc agaaattcaa agacaaagct accctgaccg ctgacaaatc ttcttctacc 240
gcttacatgc agctgtcttc tctgacctct gaagactctg ctgtttacta ctactgcgct 300
cgttctggtg gtcgtggttt cgactactgg ggtcagggta ccaccgttac cgtttcttct 360
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctgacat cgaactgacc 420
cagtctccgg cttctctgtc tgtttctgtt ggtgaaaaag ttaccatcac ctgctctgct 480
tctgaaaaca tctactctaa cctggcttgg taccagcaga aaccgggtaa atctccgcag 540
ctgctggttt acgctgctac ctctaacatg cactctggtg ttccgtctcg tttctctggt 600
tctggttctg gtacctctta ctctctgaaa atcaaccgta tgcagtctga agacttcggt 660
tcttactact gccagcagcg ttcttctaac ccgaccttcg gtggtggtac caaactggaa 720
ctgaaa 726

Claims (9)

1.一种抗鸭圆环病毒的单链抗体，其特征是：其氨基酸序列为Seq ID NO.1。
2.一种根据权利要求1所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体的编码基因，其特征是：其核苷酸序列为Seq ID NO.2。
3.一种抗鸭圆环病毒的单链抗体，其特征是：其氨基酸序列为Seq ID NO.3。
4.一种根据权利要求3所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体的编码基因，其特征是：其核苷酸序列为Seq ID NO.4。
5.一种重组表达载体，其特征是，所述重组表达载体由表达载体和根据权利要求2或4所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体的编码基因重组而成。
6.一种重组工程菌，其特征是，所述重组工程菌是向宿主菌中转化根据权利要求5所述的重组表达载体而成。
7.一种权利要求1或3所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体的制备方法，具体步骤如下：
（1）将抗鸭圆环病毒的单链抗体核苷酸序列克隆到表达载体中，得到重组表达载体，其中，所述抗鸭圆环病毒的单链抗体核苷酸序列为Seq ID NO.2或Seq ID NO.4；
（2）将步骤1得到的重组表达载体转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组工程菌；
（3）利用重组工程菌诱导表达抗鸭圆环病毒的单链抗体；
（4）提取纯化步骤3得到的抗鸭圆环病毒的单链抗体。
8.一种权利要求1或3所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体用于制备检测试剂盒的应用，其特征是：所述检测试剂盒用于检测鸭圆环病毒。
9.一种检测试剂盒，其特征是：包括根据权利要求1或3所述的抗鸭圆环病毒的单链抗体。
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