CN116987194B - 人st2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及一种人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用,所述人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明避免了传统抗独特型抗体制备所需的动物免疫及复杂的二次抗体制备过程,筛选得到的纳米抗体具有与天然ST2抗原相似的免疫反应特性,可作为天然ST2抗原的替代物应用于ST2的免疫学检测。此外,本发明无需基于天然ST2抗原的氨基酸序列进行设计及优化,且获得的抗独特型纳米抗体具有可在大肠杆菌中实现大量制备、制造成本低的优点,同时与传统的重组蛋白相比,具有更耐酸碱、高温以及检测灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别是涉及一种人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用。
背景技术
人可溶性生长刺激表达基因2蛋白(Growth Stimulation Expressed Gene 2,ST2),是IL-1(白细胞介素1)受体家族成员之一。研究发现,ST2可由心脏成纤维细胞和心肌细胞表达,是生物机械应力诱导产生的一种心肌蛋白,其基因表达于肥大细胞、激活的辅助性T细胞2(Th2)、巨噬细胞和心肌细胞。人血液中的ST2能够竞争性结合IL-33,使心肌受累,心脏结构与功能受影响,增加了疾病的发展率。因此,当心力衰竭发生时,ST2水平明显升高,进而增加对心脏的损伤作用,ST2作为新一代心衰标志物,在心衰患者的诊断、治疗及风险预测中发挥着重要作用。
基于抗原抗体特异性识别与结合的免疫分析技术在ST2的准确、快速检测领域中发挥着重要的作用,比如常规的ELISA、荧光免疫层析试纸、胶乳免疫比浊等方法。对于免疫分析方法而言,除了特异性的抗体之外,抗原作为质控、标准品也是必不可少的关键原料。目前ST2抗原主要通过基因工程的方法,根据天然的人源ST2蛋白基因,构建表达载体,以生物合成的方式进行ST2重组蛋白的制备。现有的ST2重组蛋白由于其复杂的结构与组成,因此主要基于哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞表达系统进行制备,尚存在步骤复杂、流程长、成本高等不足。
抗独特型抗体(Anti-idiotype antibody)是针对抗体可变区的抗原决定簇(独特型)产生的特异性抗体,它们均具有抗原性,因此抗独特型抗体具备了模拟天然抗原与对应抗体结合的分子基础,可阻断天然抗原与抗体的结合,具有模拟表位肽的特性,可作为天然抗原的替代物应用于免疫分析。然而,传统的抗独特型抗体主要以单克隆抗体为主,通过二次制备抗体的方法进行制备,存在制备难度大,流程长等不足。
发明内容
本发明提供一种人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用,以解决现有技术制备难度大、流程长等问题。
本发明的一方面以鼠源抗人ST2单克隆抗体为靶分子,将靶分子固相包被于酶标板上,投入羊驼源天然噬菌体展示纳米抗体库进行亲和淘选,获得了一种人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体,其氨基酸序列为:QLQLVESGGVVQPGGSLRLSCAHSGSTSGYYGIGWWRQAPGKEREWVSCISTNDGSTTYTYSVKGRFTISRDKTKKTLYLQMNNLTAEDTAVYYCVADPWAMCIKSDLLATDNFVWGKGTLVTVSS(SEQ ID NO .1)。
需要指出的是,纳米抗体(Nanobody),是仅含有VHH(Variable domain of heavychain antibody)区域片段的重链单域抗体,直径2.5 nm,分子量约为12-15KD,具有分子量小,亲水性强,可在大肠杆菌大量表达等优点,同时纳米抗体还具有较高的热稳定性和抗蛋白酶性,可以在不同的温度和酸碱条件下保持其结构和功能的完整性。
上述氨基酸序列的IMGT编号和结构域划分如图1所示。
本发明所提及的人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体包括四个框架区(Framework region , FR)和 三个互补决定区(Complementarity-determining region ,CDR)。
其中,框架区(FR1、FR2、FR3、FR4)分别选自以下序列:
QLQLVESGGVVQPGGSLRLSCAHS(SEQ ID NO .2);
IGWWRQAPGKEREWVSC(SEQ ID NO .4);
TYTYSVKGRFTISRDKTKKTLYLQMNNLTAEDTAVYYC(SEQ ID NO .6);
WGKGTLVTVSS(SEQ ID NO .8)。
互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)分别选自以下序列:
GSTSGYYG(SEQ ID NO .3);
ISTNDGST(SEQ ID NO .5);
VADPWAMCIKSDLLATDNFV(SEQ ID NO .7)。
框架区结构相对保守,主要起着维持蛋白质结构的作用;互补决定区结构相对多样化,主要负责抗体的识别。
本发明提供一种蛋白质或多肽,包含如SEQ ID NO .2,SEQ ID NO .4,SEQ ID NO.6和SEQ ID NO .8中的一个或两个及以上的氨基酸序列,且至少与其中一个的氨基酸序列有90%同源性。
本发明提供一种蛋白质或多肽,包含如SEQ ID NO .3,SEQ ID NO .5和SEQ ID NO.7中的一个或两个及以上的氨基酸序列,且至少与其中一个的氨基酸序列有80%同源性。
本发明的另一方面涉及编码人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体的核苷酸,其序列为:cagttgcagctcgtggagtctggtggcgtggtgcaacctggggggtctctgagactctcctgtgcacactctggatccacttcgggttattatggcataggctggtggcgccaggccccagggaaggagcgtgaatgggtctcatgtattagtacaaatgatggtagtacaacgtacacgtactccgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaagaccaagaagactttatatttacaaatgaataacctgacggccgaggacacagccgtttattattgtgtggcggacccctgggctatgtgtattaagtccgacctcctggccaccgacaacttcgtttggggcaaagggaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO .9)。
本发明提及的人ST2抗原的模拟表位肽可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有抗独特型纳米抗体的噬菌体,通过生物扩增的方式,大量繁殖生产展示有人ST2抗原的模拟表位肽的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码抗独特型纳米的基因,通过克隆至原核、真核或昆虫细胞表达载体,以可溶纳米抗体的形式进行大量制备。
本发明还涉及所述抗独特型纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、免疫层析、免疫斑点杂交、胶乳免疫比浊等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
本发明的抗独特型纳米抗体在应用时,可以通过噬菌体扩增获得的展示有抗独特型纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测,也可以将抗独特型纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以可溶纳米抗体的形式进行免疫学检测分析。
本发明还涉及所述抗独特型纳米抗体在免疫学检测分析中的应用,具体将抗独特型纳米抗体作为人ST2抗原的替代物,以竞争抗原或包被抗原或质控品或标准品的形式在免疫分析检测中进行应用。
本发明所述的氨基酸序列可以作为前体,通过随机或定点突变技术进行改造,能够获得性质(亲和力、稳定性等)更好的突变体。
本发明所述的纳米抗体可以化学偶联或生物偶联的方式与各类信号材料如荧光蛋白、荧光素、酶等进行连接,作为检测抗原应用于免疫分析。
本发明中所叙述的一些术语具有如下含义 :
同源性:描述两个或多个氨基酸序列的相似程度,第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间的同源性百分比可以通过(A/B)×100%来计算,其中,A表示第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量,B表示第一个氨基酸序列中氨基酸总数,其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与第一氨基酸相比)被认为是有差别。另外,同源性百分比也可以利用已知的用于序列比对的计算机运算程序(如:NCBI Blast)获得。
结构域:蛋白质三级结构的基本结构单位,通常具有一定的功能。
IMGT编号:IMGT数据库(The International ImMunoGeneTics Database)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。
密码子(Codon):亦称三联体密码(Triplet code),指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
本发明的有益效果是:本发明通过噬菌体展示技术,构建羊驼源天然噬菌体展示纳米抗体库,通过优化的亲和淘选条件,筛选可特异性结合抗ST2单克隆抗体的抗独特型纳米抗体,以抗独特型纳米抗体作为人ST2抗原的模拟表位肽(替代抗原)应用于免疫分析检测领域,本发明提出的人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体,其避免了传统抗独特型抗体制备所需的动物免疫及复杂的二次抗体制备过程,筛选得到的纳米抗体具有与天然ST2抗原相似的免疫反应特性,可作为天然ST2抗原的替代物应用于ST2的免疫学检测。人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体,相比于传统的基于基因重组技术获得的ST2重组蛋白,技术路线显著不同,本发明无需基于天然ST2抗原的氨基酸序列进行设计及优化,且获得的ST2替代抗原(纳米抗体)具有可在大肠杆菌中实现大量制备、制造成本低的优点,同时与传统的重组蛋白相比,具有更耐酸碱、高温以及检测灵敏度高等优点。
附图说明
图1为人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体的氨基酸序列及结构域示意图;
图2为间接ELISA鉴定人ST2抗原的模拟表位的结合特性的结果示意图;
图3为基于人ST2抗原模拟表位的间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
实施例1羊驼源天然噬菌体展示纳米抗体库的构建
1)总RNA的提取:收集羊驼外周血50 -150 mL,采用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞,采用RNA提取试剂RNAiso Plus提取总RNA,采用紫外分光光度计ND-1000对总RNA定量。
2)cDNA的合成:
步骤1:按表1准备反转录体系,混匀后,65℃ 保温5 min,迅速冰浴。
表1
步骤2:按表2准备各组分,混匀后,按如下条件反转录:25℃,5 min;42℃,60 min;70℃,5 min。
表2
3)VHH基因扩增(巢式PCR)
采用巢式PCR扩增VHH基因,方法如下:
步骤1:
准备表3的反应体系:
表3
然后执行30个反应循环,每个循环的反应条件为:98℃,10 s;50℃,15 s;72℃,1min。
PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化浓缩后,再采用DNA产物凝胶回收试剂盒回收约750bp条带,紫外分光光度计定量。
步骤2:
准备表4的反应体系:
表4
然后执行25个反应循环,每个循环的反应条件为:98℃,10 s;55℃,15 s;72℃,30s。
PCR产物采用DNA产物凝胶回收试剂盒回收,紫外分光光度计定量。
4)文库的转化
将目的基因VHH和载体pComb3xss采用SfiI酶切,将酶切后的VHH和pComb3xss采用T4 DNA连接酶连接后,转化至TG1电穿孔感受态细胞中,构建VHH基因文库。共转化10次,混合后均匀涂布于6块Ф150 mm的培养皿中。
5)文库救援
从VHH基因文库中取10-100倍库容量的活细胞进行接种培养,培养至对数期后采用M13K07噬菌体进行救援,救援培养后,离心收集噬菌体,采用PEG-NaCl纯化噬菌体,即得噬菌体展示纳米抗体库。
实施例2 人ST2抗原的模拟表位肽的亲和淘选及其鉴定
1)亲和淘选与抗人ST2单克隆抗体特异性结合的噬菌体展示纳米抗体
取10 μg鼠源抗人ST2单克隆抗体,包被于酶标板孔(200 μL/孔),25℃孵育12小时。 取出酶标板,用PBST洗涤10次后,加入300 μL封闭液(3% 明胶)37℃孵育2小时,用PBST洗涤10次。
取300 μL封闭液(3% 明胶)包被新的酶标板,37℃孵育2小时后,用PBST (10 mMPBS pH 7.4包含1.0 % Tween-20 (v/v) ) 洗涤15次,加入100 μL噬菌体展示纳米抗体库,用PBS 10倍稀释噬菌体原液,约2.0×1011pfu,37℃振荡孵育30min。随后轻柔吸出板孔中孵育的噬菌体上清液,投入到包被有抗人ST2单克隆抗体的板孔中,25℃振荡反应120 min。用PBST洗涤15次,去除未结合的噬菌体,随后加入洗脱液(Gly-HCL,pH2.2)100μL,37℃下轻摇震荡10 min以洗脱与单克隆抗体结合的噬菌体。吸出洗脱液,加入15μL 、1M Tris-HCl(pH9.1)中和缓冲液。取10 μL中和液进行噬菌体滴度测定,其余的用于感染20 mL生长至对数前期的E. coliER2738菌株进行扩增。第二天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体,并测定扩增后噬菌体的滴度。
然后依次进行第2轮和第3轮淘选,淘选步骤与第一轮大体相同,每次加入的噬菌体量均为2×1011pfu,不同之处在于:第2轮的洗脱液为含有富集有ST2抗原的血清溶液,第3轮的洗脱液为(Gly-HCL, pH2.2);第2轮的板孔封闭液更换为BSA蛋白,第3轮的板孔封闭液更换为5%的脱脂牛奶。
2)阳性噬菌体克隆的鉴定
从第3轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取50个噬菌体斑,进行噬菌体的扩增,采用间接ELISA检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定,具体方法为:首先,用10 mMPBS (pH 7.4) 稀释抗人ST2单克隆抗体,200 ng/mL包被96孔酶标板,4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS,0.05% Tween-20 (v/v) )洗涤3次后,用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育1小时;投入100 µL噬菌体斑扩增液(1.0×1012pfu),以原始噬菌体展示纳米抗体库作为阴性对照,37 ℃孵育1小时;加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 µL,37 ℃孵育1小时;加入100 µL TMB底物液,避光显色5min,酶标仪读取450 nm处的吸收值。选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
3)人ST2抗原的模拟表位肽的鉴定
采用间接竞争ELISA鉴定人ST2抗原的模拟表位肽,具体方法为:用10 mM PBS (pH7.4) 分别包被抗人ST2单克隆抗体(100µL/孔,1µg/mL)、牛血清白蛋白(100µL/孔,1µg/mL)、正常人血清(100µL/孔)、鼠抗人IgG(100µL/孔,1µg/mL)于酶标板,4℃孵育过夜;第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后,用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育1小时;加入50 µL经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆(1.0×1011pfu)和50 µL 人ST2抗原标准品(浓度范围为0-50 ng/mL),37℃孵育1小时,随后洗板,加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 µL,37 ℃孵育1小时;加入100 µL TMB底物液,避光显色5min,酶标仪读取450 nm处的吸收值。
请参阅图2和图3,图2是分别将抗人ST2单克隆抗体、BSA、正常人血清、鼠抗人IgG(1µg/mL)包被于酶标板孔,投入噬菌体展示纳米抗体后进行检测;图3是在包被抗人ST2单克隆抗体(1µg/ml),加入50 µL噬菌体展示纳米抗体(1.0×1011pfu)和50 µL不同浓度的人ST2抗原标准品混合液,进行间接竞争ELISA检测。实验结果显示:加入阳性克隆噬菌体后,仅包被有抗人ST2单克隆抗体的酶标板孔OD450数值显示有结合活性,且其OD值随着投入的人ST2抗原的浓度的增加呈现梯度性降低,表明该噬菌体克隆上展示的纳米抗体具有阻断天然ST2抗原与对应抗体结合的性能,具备抗独特型纳米抗体的特征。
采用双抗夹心ELISA方法鉴定人ST2抗原的模拟表位肽,具体方法为:包被抗人ST2抗体1(捕获抗体)于酶标板,4℃孵育过夜;第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20(v/v)) 洗涤3次后,用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育1小时;加入100 µL 可作为人ST2抗原的模拟表位肽(替代抗原)的可溶抗独特型纳米抗体(浓度范围为1-100 ng/mL),37℃孵育1小时,洗板后加入抗人ST2抗体2(检测抗体);洗板后加入1:3000稀释HRP标记的羊抗鼠二抗,37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色,读取OD450。
上述实验结果显示:随着投入的抗独特型纳米抗体的浓度增加,板孔的OD450值呈现梯度性上升,表明所获抗独特型抗体具备模拟人ST2抗原的免疫反应属性,结果见表5。
表5
实施例3 噬菌体展示抗独特型纳米抗体的测序及其氨基酸序列的确定
将经过间接竞争ELISA鉴定展示有人ST2抗原的模拟表位肽的噬菌体克隆进行DNA测序,根据 DNA测序结果及密码子表可获得抗独特型纳米抗体的氨基酸序列。得到本发明的人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体,序列为:QLQLVESGGVVQPGGSLRLSCAHSGSTSGYYGIGWWRQAPGKEREWVSCISTNDGSTTYTYSVKGRFTISRDKTKKTLYLQMNNLTAEDTAVYYCVADPWAMCIKSDLLATDNFVWGKGTLVTVSS(SEQ ID NO .1)。
实施例4 人ST2抗原的模拟表位肽(替代抗原)的大量制备
1)以噬菌体扩增的方式
将展示有模拟表位肽的噬菌体加入至20 mL接种有E .coliTG1的培养物中,37℃、220 rpm振荡培养6 h。将培养物转入另一离心管中,4 ℃、 10000 rpm离心10 min,将上清的上部80 %转入新的离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,4 ℃静置120 min后,4℃ 10000rpm离心10min,弃上清;再加入少量PBS清洗噬菌体。4℃ ,10000 rpm离心10min,弃上清,加入1mL PBS进行重悬,即为噬菌体扩增液。
2)以可溶性抗独特型纳米抗体的形式
分别采用Nco I和Not I 酶对外源编码VHH基因和表达载体(pET-25b)进行双酶切,将VHH编码基因克隆至表达载体pET-25b,经PCR和酶切验证后,将重组表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)。从转化平板上挑一单菌落接种于5 mL LB液体培养基中,37℃,220r/min振荡培养过夜,将过夜培养物按1 %接种量(v/v)接种于50 mL的含氨苄西林(AMP)抗生素的LB(溶菌肉汤,Luria-Bertani)培养基,2 %葡萄糖培养基中,37℃,220 r/min振荡培养;当培养物菌体浓度OD600达到0.5时,向培养物中加入0.1mM的IPTG,30℃,220 r/min振荡培养8-12h;将培养物于4℃,8000rpm,离心20 min收集菌体沉淀。重悬细胞于5mL 预冷的PBS溶液,超声破碎10min后,8000rpm离心20min取上清, 将上清进行亲和层析纯化,即得可人ST2抗原的模拟表位肽(替代抗原)的可溶性抗独特型纳米抗体。
实施例5 人ST2抗原的模拟表位肽耐酸碱实验
1)包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4)将抗人ST2单克隆抗体稀释至2 µg/mL,100µL包被于酶标板,4℃孵育过夜。第二天用PBST洗板孔后,用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育2小时后,用PBST洗板6次待用。
2)活性检测
将本发明的人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体分别用pH 5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的PBS稀释至100 ng/mL,取100µL加入步骤1)处理好的板条中,37℃孵育2小时。加入1:3000稀释HRP标记的抗 His二抗(HRP酶标记的抗组氨酸抗体),37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色,读取OD450。比较不同pH条件下的吸光度值,结果显示抗独特型纳米抗体置于在pH=5.0-9.0的溶液中,其OD值分别为1.52,1.60,1.65,1.55,1.56,未见显著区别,显示出较好的耐酸碱性能。
实施例6 人ST2抗原的模拟表位肽耐热实验
1)包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4) 将抗人ST2单克隆抗体稀释至2 µg/mL,100µL包被于酶标板,4℃孵育过夜。第二天用PBST洗板后,用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育2小时后,用PBST洗板6次待用。
2)活性检测
用10 mM PBS (pH 7.4) 将本发明的人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体稀释至100 ng/mL,分别置于37℃,50℃,60℃,70℃,80℃和90℃水浴5min,恢复到室温后,再分别取100µL加入步骤1)处理好的板条中,37℃ 孵育1小时。加入1:3000稀释HRP标记的抗His二抗,37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色,读取OD450。比较不同温度处理条件下的吸光度值,结果显示抗独特型纳米抗体置于37-90℃水浴5min后,其免疫检测性能(OD值)未见区别,其OD值分别为1.68,1.61,1.59,1.62,1.60,1.57,显示出较好的耐热性能。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.一种人ST2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体,其特征在于,氨基酸序列如SEQID NO .1所示。
2.编码权利要求1所述的抗独特型纳米抗体的核酸,所述的核酸的序列如SEQ ID NO.9所示。
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