CN111518210B - 一种特异性识别faim3受体的全人源单抗 - Google Patents
一种特异性识别faim3受体的全人源单抗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种特异性识别并结合FAIM3的全人源抗体，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构形式为scFv‑Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，Fc指的是恒定区。特异性识别FAIM3的全人源抗体的序列为SEQ ID NO：3。该抗体能够特异性地识别并结合人FAIM3受体。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗FAIM3受体的单克隆抗体及其制备方法。具体而言本发明公开了一种能够特异识别FAIM3受体的单克隆抗体。
背景技术
Fas apoptotic inhibitory molecule 3(FAIM3)是IgM的特异性受体(FcμR)，在人B,T,NK细胞中广泛表达[1]。FAIM3是由390个氨基酸组成的I型跨膜唾液酸糖蛋白,分子质量为60kD。FAIM3(FcμR)特异性地结合IgM,参与维护IgM的内环境稳定[2,3,4,5]。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的在于提供一种能特异性识别FAIM3(FcμR)的单克隆抗体或抗体片段及其制备方法，该抗体或抗体片段可以识别结合FAIM3。
为了达到上述目的，本发明提供了一种特异性识别FAIM3的全人源单克隆抗体，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv-Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，Fc指的是恒定区。特异性识别FAIM3的全人源抗体的序列为SEQ ID NO：3。
所述的重链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2中的氨基酸至少有80％同源性的氨基酸序列。
所述的轻链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1中的氨基酸至少有80％同源性的氨基酸序列。
所述的基因工程抗体包含Fab片段，F(ab’)2片段，F(ab)’片段，Fv片段和scFv片段中的一种，上述各片段中两种以上的组合，或上述各片段中的至少一种与其它蛋白或肽链形成的衍生物。
所述的基因工程抗体的重链CDR1区序列为GGTLSGY，重链CDR2区序列为IPTFEE，重链CDR3区序列为STILDDWYAMDV，轻链CDR1区序列为RSSQSLLNSNGYNFLD，轻链CDR2区序列为LGSNRAS，轻链CDR3区序列为MQPLQTPTT。
所述的基因工程抗体的重链和轻链的CDR1,CDR2,CDR3序列内一个或少数几个氨基酸突变的序列。少数几个氨基酸突变一般指抗体CDR区3个以内的氨基酸随机突变。
本发明提供的单克隆抗体是一种单链抗体，通过筛选全人源单链抗体噬菌体库得到，命名为Anti-FAIM3-Fc，经过检测该单链抗体对FAIM3选择性结合。单独使用该抗体的免疫印迹即可特异性检测出人源FAIM3胞外片段。
附图说明
图1.FAIM3抗原表达纯化SDS-PAGE结果图；
图2.FAIM3抗体ELISA结果图；
图3.FAIM3抗体表达纯化SDS-PAGE结果图；
图4.FAIM3抗体免疫印记结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1、FAIM3胞外段抗原的表达纯化
1、所用材料：
(1)人FAIM3基因ORF全长cDNA(购自北京义翘神州科技有限公司，货号HG13556-G)。(2)真核表达载体pTT5-6xHis为公司自备。(3)BamH1和XbaI限制性内切酶购自NEB公司。(4)FreeStyle培养基购自赛默飞公司。(5)质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司。(6)Ni-NTA-Agarose购自Qiagen公司。(7)293Fectin转染试剂(Invitrogen公司，货号12347500)。(8)Nanodrop(赛默飞公司，型号Nano200)。
2、实验方法：
1)以人源FAIM3基因cDNA为模板进行PCR扩增FAIM3胞外段序列(1-124aa)。扩增出的基因片段经限制性内切酶BamH1和XbaI酶切后连接至pTT5-6xHis载体。通过测序验证载体构建正确。
2)将293Fectin转染试剂与上述获得的真核抗原表达载体质粒按照体积质量比30微升：15微克的比例混合后加入30毫升的293F悬浮细胞后，37℃，200rpm摇96小时后，离心并收集上清，采用Ni-NTA-Agarose beads亲和纯化，在蛋白纯化仪上对FAIM3-Ecto抗原进行凝胶层析纯化，最后用紫外吸光法检测抗原浓度，经SDS-PAGE检测其纯度(如图1所示)。
实施例2、全人源单链抗体库构建及筛选
1、所用材料：
(1)高吸附酶联免疫反应微孔板购自康宁公司。(2)Nanodrop(赛默飞公司，型号Nano200)。(3)Ni-Charged Magbeads的磁珠购自南京金斯瑞公司,货号L00295。(4)GelRed核酸染料购自赛默飞公司。(5)Anti-M13 HRP抗体购自赛默飞公司。(6)M13辅助噬菌体购自Life Technologies，货号18311019。(7)XL1-Blue细菌购自Agilent Technologies，货号200228。(8)显影液ABTS溶液购自赛默飞公司，货号002024。(9)质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司。(10)SfiI限制性内切酶购自NEB公司。(11)pFUSE-IgG1表达载体购自Invivogen公司。(12)pComb3载体购自Addgene(Plasmid#63888)。(13)SOC培养基购自生工公司。
2、实验方法：
1)全人源单链抗体库构建：设计引物扩增抗体的重链可变区和轻链可变区，通过重叠延伸PCR的方式用Linker将重链可变区和轻链可变区连接起来，得到全长的PCR产物，用SfiI限制性内切酶切PCR产物和pComb3噬菌粒载体，将连接转化产物电转化入XL1-blue感受态细胞，然后向感受态细胞中加入3mL的SOC培养基，30℃培养1h后，加入终细胞培养条件浓度为50μg/mL的氨苄青霉素，10μg/mL的四环素溶液20mL，37℃振荡培养2h。然后加入浓度为1013/mL的M13辅助噬菌体50μL，室温孵育1h，中间每隔10min轻摇一次。37℃振荡培养2h，再加入终浓度为70μg/mL的卡纳霉素，30℃过夜培养。离心收集上清，入浓度为10％的PEG-8000/氯化钠溶液(PEG即聚乙二醇)，置于冰浴1h，8000rpm，4℃离心，弃上清液，用2mL浓度为1％的BSA(Albumin from bovine serum，牛血清白蛋白)的PBS溶液(PhosphateBuffer Solution，磷酸缓冲液)充分溶解沉淀，离心收集上清液，即为全人源单链抗体库。
2)单链抗体筛选：取表达全人源单链抗体的噬菌体抗体库200μL(含有噬菌体1×1012个/mL)与5μgFAIM3-Ecto抗原混合，室温孵育30min后加入50μL的镍亲和磁珠，与抗原结合的噬菌体被镍亲和磁珠捕获，未结合的噬菌体经含有0.05％Tween-20的PBS溶液漂洗后被去除，用甘氨酸(pH 2.2)溶液将与磁珠稳定结合的噬菌体洗脱待用。
接种XL1-Blue细菌(大肠杆菌菌株)200mL，待OD(吸收值)达到0.6后，加入上述洗脱的噬菌体，与XL1-Blue细菌在37℃静置30min，菌液涂在氨苄青霉素抗性平板上，第二天洗脱收集氨苄抗性平板上的菌体，再侵染1×1012pfu/mL(噬菌斑形成单位)的M13辅助噬菌体，扩增后进行下一轮筛选，重复上述筛选步骤3轮。
将第3轮侵染噬菌体的XL1-Blue菌液做几个不同浓度梯度的稀释，然后将这些菌液分别涂布于直径为15cm抗性为氨苄青霉素的LB固体培养基平板，每个平板上有100-500个克隆，挑取单克隆抗体，通过噬菌体酶联免疫反应对淘选后的最后一轮噬菌体库进行验证。
3)噬菌体酶联免疫反应：将转染噬菌体的XL1-Blue单克隆菌接种到2mL的96孔细菌深孔培养板(购自Corning公司)中，加入500μL含有氨苄青霉素与四环素抗性的SB(SuperBroth，生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A507026)培养基，200rpm转速下37℃摇床4-6h，检测OD600(600nm波长处的吸光值)值接近0.6后，加入1μL的辅助噬菌体，在30℃下摇床过夜，第二天3000g离心取上清待用。
取酶联免疫微孔板，包被抗原(包括对照抗原BSA)4℃过夜，第二天，PBST洗脱之后用含有5％脱脂奶粉的PBST(0.05％加入Tween-20的PBS)封闭，然后加入上一步制备好的噬菌体上清，室温孵育2h，再加入Anti-M13 HRP抗体孵育30min，后用PBST洗3次，加入50μLABTS显影液。
3)实验结果:从第3轮筛选后得到的噬菌体库中挑取96个单克隆进行酶联免疫反应验证，最后确定酶联免疫反应读值是对照抗原两倍以上的单克隆作为阳性单克隆，阳性克隆测序分析，经过比对分析，确定3个不同的抗体序列有富集。如图2所示，其中得到的Ab3序列为本专利申请保护的抗体氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
实施例3、单链抗体Anti-FAIM3-Fc蛋白表达纯化及免疫印迹验证
1、所用材料：
(1)pFUSE表达载体pFUSE-hIGg1-Fc2购自Invivogen公司，货号pfuse-hg1fc2。(2)HiTrapProtein AHP columns购自GE公司。(3)蛋白纯化仪购自GE公司。(4)质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司。(5)SfiI限制性内切酶购自NEB公司。(6)PVDF膜购自上海碧云天公司。(7)Nanodrop(赛默飞公司，型号Nano200)。(7)ECL显影剂购自赛默飞公司。(8)Rabbit Anti-Human(Fc)HRP二抗购自洛阳佰奥通实验材料中心。
2、实验方法：
1)将实施例2得到的Ab3阳性序列(即SEQ ID NO：1)从phagemid上酶切后插入pFUSE-hIGg1-FC2表达载体(Invivogen公司，操作步骤请参照说明书)，将获得具有Fc段的单链抗体Anti-FAIM3-Fc的真核抗体表达质粒。利用293Fectin转染试剂(Invitrogen公司，货号12347500)与上述获得的真核抗体表达载体质粒按照体积质量比30微升：15微克的比例混合后加入30毫升的293F悬浮细胞后，37℃，200rpm摇72小时后，离心并收集上清，采用HiTrap Protein A HP columns在蛋白纯化仪上进行抗体蛋白纯化(Anti-FAIM3-Fc)。最后用Nanodrop测定抗体浓度。
2)取2ug抗原FAIM4-Ecto及2ug阴性对照蛋白BSA跑SDS-PAGE,转膜后用含有5％脱脂奶粉的PBST(0.05％加入Tween-20的PBS)封闭，PBST洗3次后加入10ng/ul Anti-FAIM3-Fc抗体孵育1小时，经PBST洗3次后加入1：2000的Rabbit Anti-Human(Fc)HRP二抗孵育一小时，PBST洗3次后加入ECL显影液并拍照保存。
3)实验结果：单链抗体Anti-FAIM3-Fc经SDS-PAGE检测单链抗体纯度较高，如图3所示。免疫印迹结果如图4所示，本专利申请保护的抗体Anti-FAIM3-Fc(SEQ ID NO：3)可特异性的识别FAIM3蛋白的胞外片段。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海米地生物医药有限公司
<120> 一种特异性识别FAIM3受体的全人源单抗
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人源抗体轻链可变区氨基酸序列
<400> 1
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Pro
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 人源抗体重链可变区氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Gly Tyr Ala His Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Gly Gly Ile Ile Pro Thr Phe Glu Glu Thr Asn Tyr Ala Gln
50 55 60
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Thr Ser Thr Ile Leu Asp Asp Trp Tyr Ala Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 490
<212> PRT
<213> Anti-FAIM3-Fc抗体全序列
<400> 3
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Gly Tyr Ala His Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Gly Gly Ile Ile Pro Thr Phe Glu Glu Thr Asn Tyr Ala Gln
50 55 60
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Thr Ser Thr Ile Leu Asp Asp Trp Tyr Ala Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Tyr Asn Phe Leu
165 170 175
Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp
210 215 220
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Pro Leu Gln Thr Pro Thr Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Leu Gly Gly Leu
245 250 255
Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
275 280 285
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
290 295 300
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
305 310 315 320
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
325 330 335
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
355 360 365
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
370 375 380
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
385 390 395 400
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
405 410 415
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
420 425 430
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
435 440 445
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
450 455 460
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
465 470 475 480
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490
Claims (6)
1.一种特异性识别并结合FAIM3受体的全人源单抗，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv-Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，Fc指的是恒定区。
2.如权利要求1所述的特异性结合FAIM3受体的全人源单抗，其特征在于，其序列为SEQID NO：3。
3.一种特异性识别FAIM3的基因工程抗体，其特征在于，所述的基因工程抗体的重链CDR1区序列为GGTLSGY，重链CDR2区序列为IPTFEE，重链CDR3区序列为STILDDWYAMDV，轻链CDR1区序列为RSSQSLLNSNGYNFLD，轻链CDR2区序列为LGSNRAS，轻链CDR3区序列为MQPLQTPTT。
4.如权利要求3所述的特异性识别FAIM3的基因工程抗体，其特征在于，所述的基因工程抗体包含Fab片段，F(ab’)2片段，F(ab)’片段，Fv片段和scFv片段中的一种，上述各片段中两种以上的组合，或上述各片段中的至少一种与其它蛋白或肽链形成的衍生物。
5.权利要求1-2中任一项所述的特异性结合FAIM3受体的全人源单抗或权利要求3-4中任一项所述的基因工程抗体在制备用于检测与FAIM3相关的免疫印迹试剂中的应用。
6.一种用于检测与FAIM3相关的免疫印迹试剂，其包含权利要求1-2中任一项所述的特异性结合FAIM3受体的全人源单抗或权利要求3-4中任一项所述的基因工程抗体作为活性成份。
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| EP3009841A1 (en) * | 2014-10-14 | 2016-04-20 | Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin | Detection of IgM Antibodies using an immune complex (IC) ELISA |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 人Fcα/μR和Poly Immunoglobulin Receptor多克隆抗体的制备及鉴定;杨丽君;《中国免疫学杂志》;20091231;第25卷(第01期);第76-79页 * |
Also Published As
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