CN103261220A - 用于生成多特异性和多价抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对于免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体，和用于产生对于免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体的方法。该抗体由单一重链和两条不同轻链组成，一条含有κ恒定结构域和另一条具有λ恒定结构域。本发明提供了用于分离具有不同特异性但共享共同重链的抗体的方法。本发明还提供了用于两条轻链和单一重链的控制共表达的方法，所述控制共表达导致单特异性和双特异性抗体的装配。本发明提供了产生完全人双特异性和二价抗体以及两种单特异性抗体和一种双特异性抗体的抗体混合物的方法，所述完全人双特异性和二价抗体在序列中是未改变的并且不涉及接头或其他非人序列的使用。本发明还提供了有效纯化所述双特异性抗体的方法。

Description

用于生成多特异性和多价抗体的方法
相关申请
本申请要求于2010年8月16日提交的美国临时申请号61/374,159、于2011年2月15日提交的美国临时申请号61/443,008、于2011年7月19日提交的美国临时申请号61/509,260的利益，其中每个申请的内容在此整体通过引用并入。
发明领域
本发明涉及对于免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体的生成。本发明的抗体由单条一重链和两条不同轻链组成，一条含有κ恒定结构域和另一条具有λ恒定结构域。本发明特别涉及具有不同特异性但共享共同重链的抗体分离。本发明进一步涉及两条轻链和单一重链的控制的共表达，导致单特异性和双特异性抗体的装配。本发明提供了产生全人双特异性和二价抗体(其在序列中是未改变的并且不涉及接头或其他非人序列的使用)以及两种单特异性抗体和一种双特异性抗体的抗体混合物的方法。本发明还提供了有效纯化双特异性抗体的方法。
发明背景
抗体由四条多肽组成：两条重链和两条轻链。抗体的抗原结合部分由轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)形成。在这些结构域的一个末端，六个环形成抗原结合位点且还称为互补决定区(CDR)。这些CDRs位于VH结构域(H1、H2和H3)上，并且三个其他的位于VL结构域(L1、L2和L3)上。在B细胞发育过程中，独特的免疫球蛋白区通过称为V(D)J重组的体细胞重组形成。免疫球蛋白重或轻链的可变区由不同基因区段编码。重链由称为可变(V)、多样性(D)和连接(J)区段的三个区段编码，而轻链可变通过仅两个区段V和J的重组形成。大量抗体对位(paratopes)可以通过存在于基因组中的V、D和J区段的多个拷贝之一之间的重组生成。V区段编码CDR1和CDR2，而CDR3通过重组事件生成。在免疫应答过程期间，进一步多样性通过称为体细胞高度突变(SHM)的过程引入抗原结合位点内。在这个过程期间，将点突变引入重和轻链的可变基因中且特别引入编码CDRs的区域内。这个另外的变异性允许选择和扩增表达对于其同源抗原具有改善亲和力的抗体变体的B细胞。
绝大多数免疫球蛋白是在两个臂上具有相同特异性的二价和多特异性分子，因为它们由两条相同重链多肽和两条相同轻链多肽组成。然而，在杂交瘤技术开发过程中非常早期认识到，杂种杂交瘤可以通过在两个杂交瘤之间的融合事件产生(Suresh MR等人，Methods Enzymol 1986；121：210–228)。这些‘四源杂交瘤(quadromas)’表达两条不同重和两条不同轻链，并且因此产生起因于重和轻链的随机配对的多个不同抗体种类。在这些不同种类中，生成在每个臂上具有不同特异性的双特异性抗体(bsAbs)。另一个天然发生的例外是IgG4同种型的免疫球蛋白，由于通过那个同种型的铰链区介导的更不稳定的二聚化，其能够经历重链交换(van der Neut Kolfschoten M等人， Science. 2007 317(5844):1554-7)。尽管这个交换看起来在体内发生，但其生物学意义仍不清楚。
单克隆抗体已作为用于在人疾病的几个领域中治疗干预的分子的成功和有吸引力的类别出现。然而，靶向或中和单一蛋白并不总是足以达到特定疾病中的功效，其限制单克隆抗体的治疗用途。越来越明确的是，在许多适应症中，中和生物系统的一个组分不足以达到功效。这个问题的一个解决方案是几种单克隆抗体的共施用。然而，如果待组合的抗体先前仍未个别批准，那么这个方法由于管理方面而复杂化。此外，组合方法从制造角度来看也是昂贵的。相应地，存在关于使用单一分子靶向多个抗原成为可能的抗体和治疗的需要。
发明概述
本发明允许双特异性抗体的鉴定、生产和纯化，所述双特异性抗体在序列中与标准抗体无法区别。本发明还允许都具有相同重链的三种或更多种抗体的简单抗体混合物的产生和纯化。本发明的抗体的未修饰的性质为其提供了类似于标准单克隆抗体的有利制造特征。
本发明的双特异性抗体使用下述步骤生成：
- 分离了具有不同特异性且共享相同可变重链结构域但不同可变轻链结构域的两种抗体。这个步骤通过使用具有固定重链的抗体文库或含有单一VH基因的转基因动物得到促进。
- 可变重链结构域融合至重链的恒定区，一个轻链可变结构域融合至κ恒定结构域，并且另一个可变轻链结构域融合至λ恒定结构域。优选地，融合至κ恒定结构域的轻链可变结构域是κ类型的，并且融合至λ恒定结构域的轻链可变结构域是λ类型的。然而，本发明还使杂合轻链的生成成为可能，从而使得相同类型的两个可变轻链结构域可以用于生成本发明的双特异性抗体。
- 三条链在哺乳动物细胞中共表达，导致在三种抗体混合物的上清液中的装配和分泌：两种单特异性抗体和一种具有两条不同轻链的双特异性抗体。不同抗体的比例取决于链的相对表达及其装配成IgG。本发明提供了微调这些比例且使双特异性抗体生产达到最大的方法。
- 抗体混合物使用用于抗体纯化的标准层析技术进行纯化。抗体混合物可以进行表征且用作多重靶向试剂。
- 双特异性抗体使用以连续方式的亲和层析介质进行纯化，所述介质与人κ和人λ恒定区特异性结合。这个纯化过程不依赖于轻链可变结构域的序列，并且因此对于本发明的所有双特异性抗体是通用的。
- 具有含有κ恒定结构域的轻链和含有λ恒定结构域的轻链的分离双特异性抗体使用不同生物化学和免疫学方法进行表征。
- 本发明的双特异性抗体可以用于治疗干预或用作研究或诊断试剂。
本发明提供了在每个组合位点中具有不同特异性且包括两个拷贝的单一重链多肽的以及第一条轻链和第二条轻链的单克隆抗体，其中第一条和第二条轻链是不同的。
在一些抗体中，第一条轻链的至少第一个部分是κ类型的，并且第二条轻链的至少部分是λ类型的。在一些抗体中，第一条轻链包括至少κ恒定区。在一些抗体中，第一条轻链进一步包括κ可变区。在一些抗体中，第一条轻链进一步包括λ可变区。在一些抗体中，第二条轻链包括至少λ恒定区。在一些抗体中，第二条轻链进一步包括λ可变区。在一些抗体中，第二条轻链进一步包括κ可变区。在一些抗体中，第一条轻链包括κ恒定区和κ可变区，并且第二条轻链包括λ恒定区和λ可变区。
在一些实施方案中，恒定和可变构架区序列是人的。
本发明还提供了通过下述产生且生成双特异性抗体的方法：a)分离具有特异性的抗体或抗体片段区，所述特异性由与第一个轻链可变结构域组合的重链可变结构域决定；b)分离具有不同特异性的抗体或抗体片段区，所述不同特异性由与第二个轻链可变结构域组合的与步骤a)的抗体相同的重链可变结构域决定；c)在细胞中共表达下列：(i)融合至免疫球蛋白重链恒定区的共同重链可变结构域；(ii)融合至κ类型的轻链恒定结构域或融合至λ类型的轻链恒定结构域的第一个轻链可变结构域；和(iii)融合至与第一个可变恒定结构域不同类型的轻链恒定结构域的第二个轻链可变结构域。
一些方法还包括另外步骤d)：从产生的单特异性抗体分离产生的双特异性抗体。例如，在一些方法中，分离通过使用亲和层析纯化步骤完成。在一些方法中，纯化步骤使用κ恒定结构域特异性、λ恒定结构域或κ恒定结构域特异性和λ恒定结构域特异性亲和层析介质进行。
在一些方法中，κ轻链可变结构域融合至κ类型的恒定区。在一些方法中，κ轻链可变结构域融合至λ类型的恒定区。在一些方法中，λ轻链可变结构域融合至κ类型的恒定区。在一些方法中，λ轻链可变结构域融合至λ类型的恒定区。
在一些方法中，步骤a)和b)通过使用具有共同重链和多样性局限于轻链可变结构域的抗体文库得到促进。在此类文库之一中固定(foxed)的可变重链结构域可以基于不同可变种系基因且具有在CDR和构架区中的不同序列。在一些方法中，此类文库使用不同类型的可变重链结构域进行设计且可以用于生成本发明的抗体。
在一些方法中，抗体文库展示在丝状噬菌体上，在酵母、细菌或哺乳动物细胞的表面，或用于核糖体或其他类型的体外展示。
本发明还提供了制备与第一种抗原和第二种抗原特异性结合的双特异性抗体的方法，其中第一种抗原和第二种抗原是不同的，所述方法包括：a)提供编码第一种多肽的第一种核酸分子，所述第一种多肽包含偶联至免疫球蛋白恒定区且结合所述第一种抗原的免疫球蛋白多肽的重可变链区或其片段，所述免疫球蛋白多肽或其片段；b)提供编码第二种多肽的第二种核酸分子，所述第二种多肽包含偶联至第一个κ类型或λ类型轻链可变区且结合所述第一种抗原的免疫球蛋白多肽的轻链可变区或其片段；c)提供编码第三种多肽的第三种核酸分子，所述第三种多肽包含偶联至第二个κ类型或λ类型轻链可变区且结合所述第二种抗原的免疫球蛋白多肽的轻链可变区或其片段，其中所述第一个和第二个轻链恒定结构域是不同类型的；和d)在允许所述第一种、第二种和第三种多肽表达的条件下，培养包含所述第一种、第二种和第三种核酸分子的宿主细胞。
一些方法还包括进一步步骤e)：回收双特异性抗体。例如，在一些方法中，在步骤e)中，双特异性抗体使用亲和层析纯化步骤回收。在一些方法中，纯化步骤使用κ恒定结构域特异性、λ恒定结构域或κ恒定结构域特异性和λ恒定结构域特异性亲和层析介质进行。
在一些方法中，第二种核酸编码κ类型轻链可变结构域。在一些方法中，第二种核酸编码κ类型恒定区。在一些方法中，第二种核酸编码λ类型恒定区。在一些方法中，第二种核酸编码λ类型轻链可变结构域。在一些方法中，第二种核酸编码κ类型恒定区。在一些方法中，第二种核酸编码λ类型恒定区。在一些方法中，第三种核酸编码κ类型轻链可变结构域。在一些方法中，第三种核酸编码κ类型恒定区。在一些方法中，第三种核酸编码λ类型恒定区。在一些方法中，第三种核酸编码λ类型轻链可变结构域。在一些方法中，第三种核酸编码κ类型恒定区。在一些方法中，第三种核酸编码λ类型恒定区。
本发明还提供了抗体混合物，所述抗体混合物包括两种单特异性抗体和一种双特异性抗体，其中所有抗体都具有共同重链。例如，双特异性抗体是本文描述的双特异性抗体中的任何或是使用本文描述的方法进行制备的。本发明还提供了通过下述生成此类抗体混合物的方法：a)分离具有特异性的抗体或抗体片段区，所述特异性由与第一个轻链可变结构域组合的重链可变结构域决定；b)分离具有不同特异性的抗体或抗体片段区，所述不同特异性由与第二个轻链可变结构域组合的与步骤a)的抗体相同的重链可变结构域决定；c)在细胞中共表达下列：(i)融合至免疫球蛋白重链恒定区的共同重链可变结构域；(ii)融合至κ类型的轻链恒定结构域或融合至λ类型的轻链恒定结构域的第一个轻链可变结构域；和(iii)融合至κ类型的轻链恒定结构域或融合至λ类型的轻链恒定结构域的第二个轻链可变结构域。一些方法还包括另外步骤d)：从细胞培养上清液中分离步骤c)中产生的抗体混合物。
本发明还提供了通过下述用于在单一重组宿主细胞中产生两种或更多种、例如三种或更多种非相同抗体的方法：a)在单一重组宿主细胞中表达一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列编码共同免疫球蛋白重链和至少两条例如至少三条不同免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链能够与共同免疫球蛋白重链配对，以形成功能性抗原结合结构域，以产生包含共同重链的两种或更多种例如三种或更多种非相同抗体。一些方法还包括从重组宿主细胞或从宿主细胞的培养物中收获或以其他方式纯化所述两种或更多种例如三种或更多种非相同抗体的步骤。宿主细胞是例如哺乳动物细胞。在一些方法中，非相同抗体包括单特异性和双特异性抗体。
在一些方法中，非相同抗体靶向相同靶抗原的不同表位。在一些方法中，非相同抗体对于相同靶表位具有不同亲和力。在一些方法中，非相同抗体与不同抗原结合。
在一些方法中，两种或更多种例如三种或更多种非相同抗体独立地选自：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM。
在一些方法中，两种或更多种例如三种或更多种非相同抗体含有修饰的Fc区，其修饰抗体的效应子功能，例如抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗原依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或其药物代谢动力学性质，所述修饰通过改变其结合新生Fc受体实现。
在一些方法中，两种或更多种例如三种或更多种不同免疫球蛋白以F(ab’)2形式。
在一些方法中，一种或多种核酸序列在宿主细胞中稳定表达。
在一些方法中，两种或更多种例如三种或更多种非相同抗体通过宿主细胞在体外产生。
一些方法还包括通过下述选择至少一种宿主细胞的另外步骤：就其结合靶抗原的能力测定通过重组宿主细胞产生的两种或更多种例如三种或更多种非相同抗体；培养重组宿主细胞；且分离三种或更多种非相同抗体。抗体可以使用本文描述的任何技术或任何其他合适的领域公认的方法进行分离。
在一些方法中，不同免疫球蛋白轻链具有相同恒定区。在一些方法中，不同免疫球蛋白轻链具有不同恒定区。
附图简述
图1是不同双特异性抗体形式的图示。A. 基于抗体片段的形式：X联Fab，交联的Fab片段；tascFv/BiTE，串联scFv/双特异性T细胞衔接子(engager)；Db，双抗体；taDb，串联双抗体。B. 基于Fc-融合物的形式：Db-Fc，双抗体-Fc融合物；taDb-Fc融合物，串联双抗体-Fc融合物；taDb-CH3，串联双抗体-CH3融合物；(scFv)4-Fc ，四scFv-Fc融合物；DVD-Ig，双重可变结构域免疫球蛋白。C. IgG形式：把手-孔(knob-hole)和SEED，链交换工程改造的结构域；CrossMab，与重和轻链结构域交换组合的把手-孔；bsAb，四源杂交瘤衍生的双特异性抗体；sdAb，基于单结构域的抗体。
图2是通过双特异性抗体成为可能的可能作用方式的图示。2A. 两种抗原的靶向。2B. 毒性部分或活性对于靶细胞的重靶向。2C. 增加通过亲合力介导的选择性。
图3A-3C是本发明的不同双特异性抗体结构的图示，所述双特异性抗体由两个拷贝的独特的重链多肽的和两个不同轻链多肽组成。在这些图中显示的κ轻链和λ轻链(或其部分)的定位和/或排列不预期是限制性的。本领域普通技术人员应当理解κ轻链和λ轻链(或其部分)还可以这样排列，以便产生图3A-3C中所示的双特异性抗体的镜像。本领域普通技术人员还应当理解在图3A-3C中以完全IgG形式表示的双特异性抗体也可以使用其他免疫球蛋白同种型或以其他免疫球蛋白形式例如F(ab’)2生成。3A. 融合至κ恒定结构域的κ可变结构域和融合至λ恒定结构域的λ可变结构域。3B. 融合至κ恒定结构域和λ恒定结构域的κ可变结构域。3 C融合至κ恒定结构域和λ恒定结构域的λ可变结构域。
图4是ELISA测定的举例说明，所述ELISA测定测试对于hCXCL10-NusA或hIL6RC特异性且具有相同可变重链结构域的克隆。每个克隆针对两种靶进行测试，以证实特异性。
图5A-C是描述在实施例中使用的三类文库的一系列举例说明，对于每个文库类型，Vκ和Vλ文库保持分离。图5A和C：含有固定VH3-23可变结构域的两组文库，其仅相差其在H3下指示的CDR H3序列(根据IMGT的CDR定义)。通过将随机化序列插入所选轻链可变基因的CDRL3内(图5A和5C)，或通过捕获从可以包括所有人可变基因且在所有3个CDRs中含有多样性的人供体中分离的天然重排的轻链可变结构域，使轻链储库多样化(图5B)。不同多样性策略通过在轻链储库的多样性区域下的水平线举例说明。
图6A-6B是描述ELISA结果的图，所述ELISA使用分别针对hIFNγ和IL6RC选择且具有共同重链的单特异性IgGλ和IgGκ。ELISA形式紧靠每个图示意性表示。在图6A中，将IFNγ固定在板上，与抗INFγ IgGλ或抗IL6RC(即IL-6R受体/IL-6可溶性复合物)IgGκ一起孵育，并且两者都用与辣根过氧化物酶偶联的抗人Cκ或抗人Cλ抗体检测。信号通过比色法揭示且使用微量滴定板阅读器定量。
图7是用于在哺乳动物细胞中共表达一条重链和两条轻链的载体的图示。两种载体都含有三种启动子，以驱动基因表达，谷氨酰胺合成酶基因用于稳定细胞系选择。在第二种载体pNovI κHλκ中，另外κ轻的表达通过内部核糖体进入位点(IRES)驱动。指示了不同基因和遗传控制元件。hCMV，人巨细胞病毒启动子；SV40，V40启动子；pA，多腺苷酸化信号；VH，重链可变结构域；VK，轻链可变κ结构域；CK，轻链恒定κ结构域；VL，轻链可变λ结构域；CL2，轻链恒定λ结构域2；GS cDNA，谷氨酰胺合成酶cDNA；AmpR，用于氨苄青霉素抗性的可选标记。指示了所选数目的限制位点。
图8A是用于本发明的双特异性抗体的纯化过程的图示。图8B是描述了本发明的双特异性抗体的共表达、纯化和SDS-PAGE分析的举例说明。凝胶仅使用蓝色进行染色。PA：蛋白A；K：κ选择；λ：λ选择的；FT：柱流出物；E：洗脱部分。
图9是从载体转染的哺乳动物细胞中纯化的总IgG的SDS-PAGE分析的举例说明(泳道1-5)，所述载体使用pNovI κHλκ载体内的不同IRES元件使不同水平的κ轻链表达成为可能，且与pNovI κHλ载体相比较。κ和λ轻链的相对强度指示可以调节表达水平。
图10A是描述了纯化的单特异性IgG(κκ和λλ)和双特异性IgG(κλ)的IEF凝胶分析的举例说明。图10B是单特异性和双特异性抗体的IEX-HPLC分析的举例说明。独立地注射三种抗体，并且其洗脱特征在图中覆盖。显示了在实验中使用的梯度。
图11描述了用于测定双特异性抗体结合两种靶的能力以及分子中κ和λ轻链的存在的ELISA测定。图11A是ELISA形式的图示。图11B是描述了用固定在板上的IFNγ的ELISA结果的图。图11C是描述了用固定在板上的IL-6RC的ELISA结果的图。IgGκ，抗IL6RC单特异性抗体；IgGλ，抗INFγ单特异性抗体；IgGκλ，抗IL6RC/抗INFγ双特异性抗体。指示了二级检测抗体抗人λHRP和抗人κHRP。
图12是IgGκλ双特异性抗体的SPR分析的举例说明。在图12A中，将IFNγ固定在Biacore芯片的表面，并且将抗IL6RC单特异性抗体(IgGκ)、抗INFγ单特异性抗体(IgGλ)和抗IL6RC/抗INFγ双特异性抗体(IgGκλ)注射到表面上，随后注射IL6RC。在图12B中，将抗IL6RC/抗INFγ双特异性抗体(IgGκλ)固定在芯片表面上，并且以相同浓度注射抗人κ和抗人λ抗体。颠倒抗体注射的次序重复实验，具有相等结果。
图13是在CHO中生成本文描述的双特异性和多特异性抗体的一种方法的概述的图示。
图14A是描述了在锥形瓶(Erlenmeyer flask)中以小规模生产水平CHO细胞合并物的生长和抗体生产特征的图。抗体生产水平通过蛋白A-HPLC分析进行测定。VCC代表活细胞浓度，并且Ab代表抗体。图14B是描述了在小规模和中等规模发酵之间的生长和抗体生产特征比较的图。抗体生产水平通过蛋白A-HPLC分析进行测定。VCC代表活细胞浓度，并且Ab代表抗体。
图15A和15 B是描述了在两个独立实验中转染后五周，在单κ(KK)、单λ(LL)和双特异性κλ(KL)抗体表达细胞系的96孔板(96wpl)中的抗体生产率的一系列图。抗体生产水平通过ELISA进行测定。mAb代表单克隆抗体。图15C和15D是描述了在单κ(KK)、单λ(LL)和双特异性κ的振荡24孔板(24wpl)过度生长分批培养物中的抗体生产率的一系列图。
图16A是描述了通过上文所述纯化步骤的单特异性κ IgG分子(即，具有κ轻链的单特异性分子，在本文中也称为“单κ”分子)、单特异性λ IgG分子(即，具有λ轻链的单特异性分子，在本文中也称为“单λ”分子)、和κλ抗体(即具有κ和λ轻链的抗体)的还原SDS-PAGE分析的结果。图16B是描述了在上文所述洗脱步骤后获得的单κ、单λ和κλ抗体的还原SDS-PAGE分析的结果的举例说明。在图16A和16B中，凝胶仅使用蓝色进行染色，并且E代表洗脱部分，FT代表柱流出物，并且MM代表分子量标记。图16C是描述了纯化的单特异性IgG分子(κκ和λλ)和双特异性IgG分子(κλ)的等电点聚焦(IEF)凝胶分析的举例说明。
图17A-D是描述了生成本发明的双特异性抗体的方法产生抗体且纯化的抗体显示出双特异性的一系列图和举例说明，所述抗体包括κ轻链和λ轻链。该图描述了使用针对hIFNγ和IL6RC的纯化的κλ体的ELISA结果。ELISA使用如所示的抗κ或抗λ检测抗体进行。图17A-D举例说明λ轻链与hIFNγ结合，而κ轻链与IL6RC结合。NI-0501是对照抗hIFNγλ轻链抗体，并且NI-1201是对照抗IL6RCκ轻链抗体。
图18是不同单特异性和双特异性抗体的IEF凝胶的举例说明，指示在pI中的差异可以取决于抗体轻可变序列而改变。泳道1，抗NusA IgGκ；泳道2，抗NusA/抗INFγ IgGκλ；泳道3，抗INFγ IgGλ；泳道4，抗IL6RC IgGκ；泳道5，抗IL6RC/抗IL6RC IgGκλ；泳道6，抗IL6RC IgGλ。
图19是通过组合可变λ基因和κ恒定基因获得的三种不同杂合蛋白的图示。融合点在不同杂合物之间不同：在19A中，Vλ融合至Cκ；在19B中，Vλ直到CDR3融合至VκFR4和Cκ；和在19C中，Vλ和Cλ的前四个氨基酸和排除前四个氨基酸的Cκ。CDR，互补决定区；FR，构架区。
图20是使用蛋白80芯片(Agilent Technologies)在Bionalyzer 2100系统上的两个杂合轻链构建体的分析的举例说明。指示了对应于凝胶图像的电泳图。
图21是描述了使用对于INFγ(A)或IL6RC(B)特异性的scFv的剂量应答ELISA结果的一系列图，其中VH结构域是最初选择的共同VH(上曲线)或允许scFv表达和纯化的其他VH结构域(下曲线)。
图22是描述了使用夹心ELISA形式对于IgGκλ双特异性抗体定量获得的结果的图。剂量应答使用单独的纯化的双特异性抗体或如所示的以不同比例与单特异性κ或λ抗体混合的纯化的双特异性抗体进行，以便评估这些分子在测定中的干扰。
发明详述
为了克服单克隆和单价抗体治疗仅可以靶向单一抗原的局限性，或克服单价抗体治疗的组合的局限性，强烈努力已针对使用双特异性抗体形式的多重抗原靶向。具有超过一种特异性的此类抗体在生物技术中是有利的，并且具有作为使新治疗方法成为可能的治疗剂的极大潜力(Fischer和Léger，Pathobiology 2007；74:3-14；Morrison SL Nature Biotechnol 2007；25:1233-1234)。双特异性抗体是有利的，因为它们允许多重靶向，它们增加治疗潜力，它们解决生物系统的冗余，并且它们通过例如重靶向和/或增加特异性的能力提供新型作用机制。随着验证的单一治疗靶变得越来越耗尽，由双特异性抗体允许的组合提供对于治疗剂和应用的新和广泛普遍的靶。
几个策略已用于生成此类双特异性分子例如抗体片段的化学交联、被迫异源二聚化、四源杂交瘤技术、经由多肽接头的抗体片段融合和单结构域抗体的使用。重组DNA技术的可用性已导致许多双特异性抗体形式的生成(参见例如Ridgway JB等人(1996)Protein Eng 9：617–621)。接头和突变已频繁引入抗体的不同区域内，以迫使异源二聚体形成或将不同结合部分连接成单一分子。然而，这些工程改造的分子通常具有弱制造特征，以及增加的免疫原性危险，其限制或阻止其向临床的进展。此外，开发双特异性形式的先前尝试由于例如弱稳定性和/或表达的因素而得到限制。这些方法在下文进一步描述，并且讨论的形式在图1中举例说明。
化学交联。使用化学交联试剂共价交联两种抗体是概念上直截了当的方法。通过酶促消化由其各自亲本抗体生成或通过重组技术生成的抗体片段使用双功能试剂缀合(Glennie MJ等人，J Exp Med 1992；175:217–225)。产物同质性是这种方法的主要局限性，因为双特异性种类必须由同源二聚体纯化，并且修饰步骤可以改变蛋白的完整性和稳定性。涉及的多个步骤使得这种方法在制造和产物同质性方面成为挑战。
四源杂交瘤。四源杂交瘤和三源杂交瘤可以分别通过使两个杂交瘤或一个杂交瘤与B淋巴细胞融合生成(Suresh MR等人，Methods Enzymol 1986；121：210–228)。在这种情况下，两条重和两条轻链的同时表达导致10个抗体组合的随机装配，并且所需bsAb仅代表小部分的分泌抗体。bsAb必须使用层析技术的组合进行纯化，并且极大减少产物得率。主要局限性是四源杂交瘤产生啮齿类动物来源的bsAb，其由于免疫原性问题限制其治疗潜力。
重组双特异性抗体。大多数双特异性抗体形式已通过遗传工程技术生成，其使用抗体片段例如scFv或Fab片段作为经由多肽接头连接的构建嵌段(building block)。基于连接的抗体片段的形式包括串联scFv(BiTE)、双抗体和串联-双抗体(Kipriyanov SM. Methods Mol Biol 2003；207:323–333；Korn T等人，Int J Cancer 2002；100:690–697)。这些构建嵌段可以进一步连接至免疫球蛋白Fc区，产生‘IgG样’分子。这些形式包括双抗体-Fc、串联双抗体-Fc、串联双抗体-CH3、(scFv)4-Fc和DVD-Ig(Lu D等人， J Immunol Methods 2003；279：219–232 ；Lu D等人，J Biol Chem 2005；280：19665–19672 ；Lu D等人， J Biol Chem 2004；279：2856–2865；Wu C等人， Nat Biotechnol 2007 25:1290-7)。接头使用的潜在局限性是这些肽的柔韧性质使得其更易于蛋白酶解切割，可能导致弱抗体稳定性、聚集和增加的免疫原性。此外，这些外源肽可能引发针对在蛋白和接头之间的连接或接头自身的免疫应答。一般而言，基于连接的构建嵌段的bsAbs是在制造方面的挑战分子，其局限其治疗潜力。
用于人治疗的理想双特异性分子应与正常IgG无法区别。已探索基于迫使两条重链的异源二聚化的策略。称为(coined)‘把手进孔’的第一种方法针对通过将突变引入CH3结构域内以修饰接触界面而迫使两条不同IgG重链的配对，(Ridgway JB等人，Protein Eng 1996；9：617–621)。在一条链上，引入具有大侧链的氨基酸，以制备‘把手’。相反，将庞大的氨基酸用具有短侧链的氨基酸替换，以生成进入其他CH3结构域内的‘孔’。通过共表达这两条重链，与同源二聚体形成(‘孔-孔’或‘把手-把手’)相比较，观察到超过90%的异源二聚体形成(‘把手-孔’)。使用基于人IgG和人IgA序列的链交换工程改造的结构域(SEED)人CH3结构域发展相似概念(Davis JH等人，2010，PEDS 23:195-202)。这些工程改造的结构域导致可以具有两种不同特异性的异源二聚体分子的形成。这两种方法是有吸引力的，因为它们支持目的异源二聚体的产生(最多达95%)，但未完全阻止同源二聚体形成。因此，仍需要能够从异源二聚体中去除同源二聚体的下游纯化程序。这些方法的另一个潜在问题是突变结构域并非完全人的，并且可以导致免疫原性且还可能影响分子的结构域稳定性和聚集倾向。因为这些策略允许重链的被迫配对，所以不同轻链可以与两条重链中的任一条随机配对，且导致需要彼此纯化的不同抗体生成。近来，对于‘把手进孔’方法的改进已得到描述，以解决轻链配对问题(WO 2009/080253 A1)。除了‘把手进孔’突变以外，这种方法还涉及一些轻链和重链结构域的交换。这种方法的主要优点是具有两个不同可变重链结构域和两个不同可变轻链结构域的双特异性二价抗体可以生成且已称为(coined)“CrossMab”。然而，这种双特异性抗体的序列并非完全人的，因为它含有在Fc中的两个突变，以迫使在不同免疫球蛋白结构域之间的异源二聚化和非天然连接点。此外，这些修饰导致与标准单克隆抗体相比较，双特异性形式的减少表达水平(Schaefer等人，PNAS 2011；108:11187-11192)。
基于单结构域的抗体。骆驼科(美洲驼(lamas)和骆驼)和软骨鱼(铰口鲨)的免疫系统使用融合至Fc的单一V结构域，证实单一结构域可以赋予与抗原的高亲和力结合。骆驼科、鲨鱼和甚至人V结构域代表对于抗体的替代物，但它们还用于bsAbs生成。它们可以重新格式为典型IgG，其中每个臂具有经由其VH或VL结构域结合两个靶的潜力。这个单一结构域-IgG具有类似于IgG的生物化学性质，并且可能解决用其他bsAbs形式在生产和异质性方面遇到的问题。然而，可能立体阻碍通常阻止两个抗原在两个抗体臂上的同时结合。
上文描述的双特异性抗体形式的代表显示于图1中。这些形式代表中的一些衍生自Fischer和Léger，Pathobiology 2007；74:3-14；和Morrison SL Nature Biotechnol 2007；25:1233-1234。
与其先前形式形成对比，本文提供的双特异性抗体、多特异性抗体、组合物和方法克服此类开发障碍。本文提供的双特异性抗体具有共同重链，两条轻链 – 一条κ(κ)、一条λ(λ)- 其各自具有不同特异性(即，两条轻链，两种特异性)。优选地，双特异性抗体不含有任何接头或其他修饰，包括氨基酸突变。本文提供的方法产生具有特异性结合的分子，其中多样性局限于VL区。通过三条链(一条VH链，两条VL链)的控制共表达，和双特异性抗体的纯化，这些方法产生双特异性抗体。与单特异性抗体对于给定靶的亲和力相比较，本文描述的双特异性和/或多特异性抗体显示出对于该相同靶的相似亲和力。优选地，本文描述的双特异性和/或多特异性抗体与标准IgG分子事实上是不能区别的。
本文提供的方法还提供了生成两种单特异性抗体和一种双特异性抗体的简单抗体混合物的方法，所述混合物用于例如多重靶向，而无需从混合物中纯化双特异性抗体。
双特异性抗体的可能作用方式
两种靶的同时抑制。按照定义双特异性抗体具有两种特异性并且因此可以抑制超过一种靶。这些靶应是可溶性因子或位于细胞的表面上。已成功地生成靶向多种细胞因子的许多形式(Wu C等人，Nat Biotechnol 2007 25:1290-7)。
重靶向。因为大多数双特异性抗体形式能够同时结合两种分子，所以它们因此可以用作桥接分子，以将细胞毒性效应细胞或细胞毒素剂重靶向涉及疾病过程中的细胞。在肿瘤学中已经探索这种应用。在一些情况下，抗体的一种特异性针对肿瘤细胞标记例如CD19、CD20、HER2、癌胚抗原(CEA)。双特异性抗体的第二个臂使毒性部分或活性例如药物、毒素、细胞因子或来自免疫系统的效应细胞(T细胞、NK细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞，分别通过靶向CD3、CD16、CD64和CD89)达到紧密接近(Thielemans K，Blood 1996；87：4390–4398；Goldstein J等人，J Immunol 1997；158：872–879)。
经由亲合力增加的特异性。在典型IgG形式中，抗体结合通过每个组合位点对于其抗原的亲合力和通过二价结合提供的亲合效应而引导。当为了抗体释放必须发生两个解离事件时，亲合效应急剧增加抗体对于细胞表面标记的表观亲和力。上文描述的一些双特异性形式是二价的(即，一个结合位点用于一种靶)，而其他是四价的。后者具有四个结合位点或更多，并且具有以二价方式结合每种靶的潜力。二价双特异性作为治疗剂选择性靶向表达细胞表面标记组合的细胞群体。这种独特的作用方式原则上局限于可以获益于亲合力组分的分子，所述亲合力组分区分表达两种抗原的细胞和仅表达一种标记的细胞。
通过双特异性抗体介导的可能作用方式的代表显示于图2中。这种代表衍生自Fischer和Léger，Pathobiology 2007；74:3-14。
双特异性抗体形式的表征和局限性
目前双特异性抗体形式的关键特征概述于表I中。除了基于人结构域的那些外的所有形式都含有并非人来源的序列或含有通过不同蛋白结构域融合生成的非人蛋白序列。使用接头的大多数形式导致由于结构域聚集引起的潜在制造问题。外源序列的存在和不利的稳定性特征可以潜在地显著增加免疫原性的危险。在形式之间的关键差异是其结合位点的效价，其与其介导重靶向或通过亲合力介导的选择性结合的能力直接相关。因此，所有形式都不能使所有作用方式成为可能。特别地，与完全人免疫球蛋白无法区别的唯一形式不能介导重靶向或增加的选择性活性。因此，需要生成对于治疗剂开发具有有利性质的新型双特异性抗体，即所述有利性质与完全人免疫球蛋白分子无法区别、具有良好的可制造性性质且使完全范围的可能作用方式成为可能。
表 I. 不同双特异性抗体形式的特征。
交联片段 四源杂交瘤 重组形式– 连接的抗体片段 重组形式– 被迫的异源二聚体 重组形式– 基于单一结构域
结合方式 二价 二价 四价(或更多) 二价 四价
作用方式 DI，R，IS DI，R，IS DI，IS DI，R，IS DI
制造 复合物，多步过程 从抗体复杂混合物的纯化 由于抗体片段不稳定性和聚集可以是挑战性的 简单混合物(产物的主要部分是双特异性的) 简单
序列来源 人，通过交联过程的修饰位点 啮齿类动物序列 人，接头和非人蛋白连接的存在 人，突变的存在以迫使异源二聚化 人
作用方式：DI，双重抑制；R，重靶向；IS，增加的选择性。
用于生成双特异性和二价抗体的改进方法。
本发明提供了生成在结构上等同于人免疫球蛋白的双特异性抗体的方法。这类分子由两个拷贝的独特的重链多肽，融合至恒定κ结构域的第一个轻链可变区和融合至恒定λ结构域的第二个轻链可变区组成。每个组合位点展示出不同的重和轻链两者贡献的抗原特异性。轻链可变区可以是λ或κ家族的且分别优选融合至λ和κ恒定结构域。为了避免非天然多肽连接的生成，这是优选的。然而，还可能通过将κ轻链可变结构域融合至恒定λ结构域用于第一种特异性，并且将λ轻链可变结构域融合至恒定κ结构域用于第二种特异性，获得本发明的双特异性抗体(图3)。本文描述的双特异性抗体也称为IgGκλ抗体或“κλ体”，新的完全人双特异性IgG形式。这种κλ体形式允许与标准IgG分子无法区别的双特异性抗体的亲和纯化，所述双特异性抗体具有与标准单克隆抗体无法区别的特征，并且因此与先前形式相比较是有利的。
该方法的必需步骤是鉴定具有不同抗原特异性的两个抗体Fv区域(各自由可变轻链和可变重链结构域组成)，其共享相同重链可变结构域。用于生成单克隆抗体及其片段的众多方法已得到描述。(参见例如，通过引用并入本文的Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow E和Lane D，1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。完全人抗体是其中轻链和重链包括CDRs 1和2的序列源于人基因的抗体分子。CDR3区可以是人来源的或通过合成方法设计的。此类抗体在本文中被称为“人抗体”、或“完全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用下述进行制备：三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor,等人，1983 Immunol Today 4：72)；和EBV杂交瘤技术，以产生人单克隆抗体(参见Cole,等人，1985 在：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc.，第77-96页)。人单克隆抗体可以被利用且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote,等人，1983. Proc Natl Acad Sci USA 80：2026-2030)或通过在体外用EB病毒转化人B细胞(参见Cole,等人，1985 In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc.，第77-96页)而产生。
例如通过用靶抗原或其免疫原性片段、衍生物或变体免疫接种动物生成单克隆抗体。可替代地，动物用细胞进行免疫，所述细胞用含有编码靶抗原的核酸分子的载体转染，从而使得靶抗原被表达且与转染细胞的表面结合。用于生产异种非人动物的多种技术是本领域众所周知的。例如，参见在此整体通过引用并入的美国专利号6,075,181和6,150,584。
可替代地，通过筛选含有抗体或抗原结合结构域序列的文库与靶抗原的结合获得抗体。该文库例如在细菌噬菌体中被制备为与细菌噬菌体衣壳蛋白的蛋白或肽融合物和包含在噬菌体颗粒内的编码DNA序列(即，“噬菌体展示的文库”)，所述蛋白或肽融合物在装配的噬菌体颗粒的表面上表达。
随后筛选获得自骨髓瘤/B细胞融合物的杂交瘤的与靶抗原的反应性。单克隆抗体例如使用杂交瘤方法例如由Kohler和Milstein，Nature，256:495(1975)描述的那些进行制备。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其他合适宿主动物一般用免疫试剂进行免疫，以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将与免疫试剂特异性结合。可替代地，淋巴细胞可以在体外免疫。
尽管并非严格不可能，但具有相同重链可变结构域但针对不同抗原的不同抗体的偶然鉴定是高度不可能的。事实上，在大多数情况下，重链在很大程度上促成抗原结合表面，并且在序列中也是最可变的。特别地，在重链上的CDR3是序列、长度和结构中最多样的CDR。因此，对于不同抗原特异性的两种抗体将几乎总是具有不同重链可变结构域。
本发明的方法克服这个局限性，并且通过使用抗体文库极大促进具有相同重链可变结构域的抗体的分离，在所述文库中，重链可变结构域对于所有文库成员都是相同的，并且因此多样性局限于轻链可变结构域。此类文库例如在于2010年5月20日提交且于2010年11月25日作为PCT公开号WO 2010/135558公开的共同未决的申请PCT/US2010/035619，和于2010年11月23日提交的共同未决的申请PCT/US2010/057780中描述，所述申请中每一个在此整体通过引用并入。然而，因为轻链可变结构域与重链结构域结合表达，所以两个结构域可以促成抗原结合。为了进一步促进该过程，含有相同重链可变结构域和λ可变轻链或κ可变轻链的多样性的抗体文库可以平行用于针对不同抗原的抗体的体外选择。这种方法使两种抗体的鉴定成为可能，所述两种抗体具有共同重链但一个具有λ轻链可变结构域并且另一个具有κ轻链可变结构域，其可以用作用于生成本发明的完全免疫球蛋白形式中的双特异性抗体的构建嵌段。本发明的双特异性抗体可以是不同同种型的，并且其Fc部分可以是修饰的，以便改变与不同Fc受体的结合性质，并且以这种方式修饰抗体的效应子功能以及其药物代谢动力学性质。用于修饰Fc部分的众多方法已得到描述且可应用于本发明的抗体。(参见例如WR Curr Opin Biotechnol 2009(6):685-91；美国专利号6,528,624；于2009年1月9日提交的PCT/US2009/0191199)。本发明的方法还可以用于生成双特异性抗体和以缺乏Fc部分的F(ab’)2形式的抗体混合物。
本发明的另一个关键步骤是共同重链和两条不同轻链在单一细胞内的共表达的最佳化，以允许本发明的双特异性抗体的装配。如果所有多肽都在相同水平变得表达并且变得同样良好装配，以形成免疫球蛋白分子，那么单特异性(相同轻链)和双特异性(两条不同轻链)的比例应当是50%。然而，可能不同轻链以不同水平表达和/或不以相同效率装配。因此，本发明的方法还提供了调节不同多肽的相对表达的方法，以补偿其固有表达特征或与共同重链装配的不同倾向。这种调节可以经由启动子强度，特征在于不同效率的内部核糖体进入位点(IRES)或其他类型的调节元件的使用以及对mRNA稳定性起作用而达到，所述调节元件可以在转录或翻译水平起作用。不同强度的不同启动子可以包括CMV(立即早期巨细胞病毒病毒启动子)；EF1-1α(人延伸因子1α-亚单位启动子)；Ubc(人泛素C启动子)；SV40(猿猴病毒40启动子)。来自哺乳动物和病毒来源的不同IRES也已得到描述。(参见例如，Hellen CU和Sarnow P. Genes Dev 2001 15：1593–612)。这些IRES在其长度和核糖体招募效率方面极大不同。此外，可能通过引入多拷贝的IRES进一步微调活性(Stephen等人2000 Proc Natl Acad Sci USA 97：1536-1541)。表达的调节还可以通过细胞的多次相继转染达到，以增加表达一条或另一条轻链的个别基因的拷贝数，并且因此修饰其相对表达。本文提供的实施例证实控制不同链的相对表达对于使双特异性抗体的装配和总体得率达到最大是关键的。
重链和两条轻链的共表达生成在细胞培养上清液内的三种不同抗体的混合物：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化，以获得目的分子。本文描述的方法通过使用亲和层析介质极大促进这个纯化程序，所述亲和层析介质与κ或λ轻链恒定结构域特异性相互作用，例如CaptureSelect Fabκ和CaptureSelect Fabλ亲和介质(BAC BV，荷兰)。这个多步亲和层析纯化方法是有效的且一般可应用于本发明的抗体。这与特异性纯化方法形成鲜明对比，所述特异性纯化方法必须对于衍生自四源杂交瘤的每种双特异性抗体或表达抗体混合物的其他细胞系开发且最佳化。事实上，如果混合物中的不同抗体的生物化学特征是相似的，那么其使用标准层析技术例如离子交换层析的分离可以是挑战性的或完全不可能的。
本发明还提供了产生两种或更多种单特异性抗体和一种或多种共享相同重链的双特异性抗体的简单抗体混合物的新方法，且可以使用用于单克隆抗体纯化的标准层析技术进行纯化。(参见例如Lowy，I等人 N Engl J Med 2010；362:197-205；Goudsmit，J.等人J Infect Dis. 2006. 193，796-801)。此类简单混合物可以用作多重靶向试剂用于治疗使用。
重链和两条轻链的成功共表达、纯化和表征和双特异性抗体的纯化显示于实施例中。将编码共同重链和两条轻链的基因克隆到含有三种启动子的载体内。在瞬时转染后，收集PEAK细胞的上清液。
三条链的共表达导致三种不同抗体的装配：两种单特异性和一种双特异性抗体。其理论相对比例应当是1:1:2，条件是表达水平和装配比对于两条轻链是相似的。双特异性抗体使用三步亲和层析程序进行纯化：(1)蛋白A：捕获IgG(单和双)，(2)κ选择：捕获含有一条或多条κ轻链的IgG，和(3)λ选择：捕获含有λ轻链的IgG。κ选择和λ选择是由BAC、BV和GE Healthcare开发的亲和层析介质。
如下表征纯化的双特异性抗体。来自每个亲和纯化步骤的流出物和洗脱物通过SDS-PAGE进行分析。结果指出，在每个步骤时，双特异性抗体是富集的(图8)。κλ体含有相等量的κ和λ轻链。与两种单特异性抗体相比较，κλ体显示出在等电聚焦凝胶和离子交换层析上的中间迁移模式(图10)。κλ体的特异性和亲和力通过ELISA和表面等离振子共振进行测定。本发明的方法允许在未最佳化的情况下具有在亚纳摩尔至纳摩尔范围中的亲和力的抗体鉴定。这不是显而易见的，因为本文描述的抗体文库中的多样性局限于轻链，而轻链对于标准抗体中的结合能的贡献更低。
为了避免被视为本发明局限性的接近具有κ和λ类型的轻链可变结构域的两种抗体的要求，本文描述的允许杂合轻链的生成，其中λ可变结构域可以融合至κ恒定结构域，和相反地κ可变结构域可以融合至λ恒定结构域，如图3中所述。这拓宽了本发明对于共享相同类型的轻链的抗体对的应用。如本文提供的实施例中描述的，在可变和恒定结构域之间的融合点是重要的，并且可以影响双特异性抗体纯化过程。
产生本发明的双特异性和/或多特异性抗体的一种方法的概述显示于图13中。在一些实施方案中，生成双特异性和/或多特异性抗体的方法使用完全无血清的化学限定过程。这些方法引入医药工业中最广泛使用的哺乳动物细胞系，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。本文描述的方法用于生成半稳定和稳定细胞系。该方法可以用于在小规模(例如在锥形瓶中)和在中等规模(例如在25L Wave袋中)制造本发明的双特异性和/或多特异性抗体。该方法还可容易地适合于本发明的双特异性和/或多特异性抗体以及抗体混合物的更大规模生产。
生成本发明的双特异性和/或多特异性抗体的方法是有利的，因为它们采用如图8A中所示的通用纯化过程。图16证实从半稳定细胞系中纯化的双特异性抗体的纯化和产物完整性测试。双特异性抗体使用下述三步亲和层析程序进行纯化：(i)蛋白A纯化以捕获IgG分子，包括单特异性和双特异性；(ii)κ选择纯化以捕获含有一条或多条κ轻链的IgG；和(3)λ选择纯化以捕获含有λ轻链的IgG。来自每个亲和纯化步骤的流出物和洗脱物通过SDS-PAGE进行分析。结果证实在纯化过程期间每种单特异性形式(即，具有κ轻链的单特异性IgG分子和具有λ轻链的单特异性IgG分子)的去除(图16A)。纯化的含κλ抗体(即具有κ和λ轻链的抗体)含有相等量的κ和λ轻链(图16B)。与两种单特异性抗体相比较，纯化的含κλ抗体呈现在等电聚焦凝胶上的中间迁移模式(图16C)。
用于制造本发明的双特异性和/或多特异性抗体的化学限定过程可以与CHO细胞的合并物或用建立的细胞系一起使用。使用合并物或建立的细胞系用化学限定过程获得的结果证实与表达相应κ或λ单特异性抗体的生产率和生长特征相当的生产率和生长特征。因此，κλ体保持了典型人IgG的结构和制造特征。
使用上文描述的不同抗体工程改造方法针对迫使产生同质双特异性分子的产生双特异性抗体形式的先前方法是在以产物的生产率、可扩缩性和稳定性为代价的情况下完成的。本发明是允许生产抗体简单混合物的不同方法，所述抗体简单混合物具有单克隆抗体的生产率和可扩缩性的标准特征，并且提供了从混合物中纯化双特异性抗体或纯化抗体混合物的有效和一般方法。
实施例
实施例1：具有固定重链的抗体文库的生成。
如下生成其中重链结构域对于所有文库成员是相同的抗体文库。首先，使用SfiI和XhoI限制位点，将含有限定CDR3 AKSYGAFDY(SEQ ID NO：1)(根据IMGT的CDR命名法)和限定FR4序列的重链可变VH3-23结构域克隆到pNDS载体内，以获得噬菌粒载体pNDS_VHfixed。VK FR4的氨基酸序列对应于由种系J基因JK1编码的FR4区。Vλ FR4的氨基酸序列对应于由种系J基因JL2和JL3编码的FR4区。生成具有在位置106上的单一氨基酸置换(精氨酸或甘氨酸)的Vk FR4序列的两个变体。将含有填充片段代替CDR3编码序列的总共6个κ(VK1-33、VK1-39、VK3-11、VK3-15、VK3-20、VK4-1)和5个λ可变结构域基因(Vλ1-44、Vλ1-51、Vλ6-57、Vλ2-14、Vλ1-40)克隆到pNDS_VHfixed内，以便生成17个受体载体，其中根据于2010年5月20日提交、作为WO2010/135558公开的共同未决的申请PCT/US2010/035619中所述的方法，和Ravn等人(2010)Nucl Acid Res 38(21):e193中所述的方法(其各自整体通过引用并入本文)，其中可以克隆合成或天然来源的多样性且可以生成高多样性文库。这个过程导致含有总共6.9x109变体的17个文库的生成，所有都具有共同VH3-23结构域和在可变轻链互补决定区3(CDRL3区)中多样化的Vκ或Vλ结构域(图5A)。180个随机挑选的转化体的测序指示>90%的克隆已整合符合读框且因此是潜在功能性的CDRL3序列。
实施例2：文库的噬菌体拯救(phage rescue)
根据下文简要概括的标准噬菌体展示程序独立地拯救每个文库。将足以覆盖文库的理论多样性至少10倍的来自冷冻文库等分试样的细胞体积加入500 ml 2xTYAG(100μg/ml氨苄青霉素；2%葡萄糖)中，且在37℃伴随搅动(240 rpm)生长直至达到0.3 - 0.5的OD600。随后将培养物用MK13KO7辅助噬菌体超感染且在37℃(150 rpm)孵育一小时。随后通过将细胞以2000 rpm离心10分钟，去除培养基且将沉淀在500 ml 2xTY-AK(100μg/ml 氨苄青霉素；50 μg/ml卡那霉素)中重悬浮，来更换培养基。随后使培养物在30℃(240 rpm)生长过夜。将培养物以4000 rpm离心20分钟，以沉淀细胞。收集上清液，并且加入30%(体积/体积)PEG 8000(20%)/2.5M NaCl，以通过将混合物在冰上孵育1小时沉淀噬菌体颗粒。通过以10,000 rpm离心30分钟收集噬菌体颗粒，并且重悬浮于10ml TE缓冲液(10 mM tris-HCl pH 8.0；1mM EDTA)中。将重悬浮的溶液以10,000 rpm离心，以清除细菌碎片并且重复沉淀程序。在最后重悬浮后，通过大肠杆菌(E. coli)感染和在260 nm处吸收而滴定噬菌体。scFv在噬菌体的表面的展示水平也通过使用抗c-myc单克隆抗体的蛋白印迹分析进行评估。在加入甘油至15%(w/v)的终浓度后，将来自不同文库的纯化噬菌体于-80℃冷冻贮存。
实施例3：使用固定重链文库的噬菌体展示选择
针对生物素化的 hCXCL10-NusA 融合蛋白 (hCXCL10-NusA) 和生物素化的 hIL6 受体复合物 (hIL6RC) 的液相选择：VH-Vκ和VH-Vλ噬菌体文库(1011-1012 Pfu)的等分试样保持分离，且用含有3%(w/v)脱脂乳的PBS在室温在旋转式混合器上封闭一小时。随后封闭的噬菌体在链霉抗生物素蛋白磁珠(Dynal M-280)上在室温在旋转式混合器上取消选择(deselect)一小时。取消选择的噬菌体随后与体内生物素化的hCXCL10-NusA或hIL6RC(100 nM)一起在室温在旋转式混合器上孵育两小时。将珠加入靶中，并且使用磁力架(magnetic stand)捕获，随后为用PBS/0.1% Tween 20的四次洗涤和用PBS的3次洗涤。随后将珠直接加入10 ml指数生长的TG1细胞中，并且在37℃伴随缓慢振荡(100 rpm)孵育一小时。将受感染的TG1的等分试样系列稀释，以滴定选择输出物。剩余受感染的TG1以3000 rpm旋转15分钟，并且重悬浮于0.5 ml 2xTYAG(含有100 μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的2xTY培养基)中，且在2xTYAG琼脂Bioassay板上展开。在30℃过夜孵育后，将10 ml 2xTYAG加入板中，从表面刮取细胞且转移至50 ml聚丙烯管。将含有50%甘油的2xTYAG加入细胞悬液中，以获得17%甘油的最终浓度。将选择轮次的等分试样保持于-80℃。
噬菌体拯救：将得自先前选择轮次的100 μl细胞悬液加入20 ml 2xTYAG中，并且在37℃伴随搅动(240 rpm)生长直至达到0.3 - 0.5的OD600。随后将培养物用3.3 x 1010 MK13KO7辅助噬菌体超感染且在37℃(150 rpm)孵育一小时。随后通过将细胞以3800 rpm离心10分钟，去除培养基且将沉淀在20 ml 2xTY-AK(100μg/ml 氨苄青霉素；50 μg/ml卡那霉素)中重悬浮，来更换培养基。随后使培养物在30℃(240 rpm)生长过夜。第二天，离心上清液的等分试样用作用于下一轮选择的输入物。
用于 ELISA 的单克隆噬菌体拯救：将单一克隆挑选到含有150 μl 2xTYAG培养基(2%葡萄糖)/孔的微量滴定板内，且在37℃(100-120 rpm)生长5-6小时。将M13KO7辅助噬菌体加入每个孔中，以获得10的感染复数(MOI)(即，10个噬菌体用于培养物中的每个细胞)，并且在37℃(100 rpm)孵育1小时。在生长后，将板以3,200 rpm离心10分钟。将上清液小心去除，将细胞重悬浮于150 μl 2xTYAK培养基中，并且在30℃(120 rpm)生长过夜。对于ELISA，通过加入150μl含有5%脱脂奶粉的2x浓缩PBS，随后为在室温的一小时孵育，来封闭噬菌体。随后将板以3000 rpm离心10分钟，并且含有噬菌体的上清液用于ELISA。
噬菌体 ELISA：将ELISA板(Maxisorp，NUNC)用2 μg/ml hCXCL10-NusA的PBS溶液或2 μg/ml hIL6RC的PBS溶液包被过夜。随后将板用3%脱脂乳/PBS在室温封闭1小时。将板用PBS 0.05% Tween 20洗涤3次，随后转移封闭前的噬菌体上清液且在室温孵育一小时。每个克隆针对两种靶进行测试，以测试其特异性。随后将板用PBS 0.05% Tween 20洗涤3次。将含有(HRP)-缀合的抗M13抗体(Amersham，稀释1:10,000)的50μl 3%脱脂乳 / PBS加入每个孔中。在室温孵育1小时后，将板用PBS 0.05% Tween 20洗涤5次。随后通过加入50μl TMB(Sigma)和停止反应的50μl 2N H2SO4以揭示ELISA。吸收强度在450nm处阅读。可以鉴定对于hCXCL10-NusA或hIL6RC特异性的具有相同可变重链结构域的克隆。(图4)。
噬菌体克隆测序：单一克隆在5 ml 2xTYAG培养基(2%葡萄糖)/孔中生长且在37℃(120 rpm)生长过夜。第二天，将噬菌粒DNA纯化且用于使用对于pNDS1特异性的引物的DNA测序，所述引物为：mycseq，5’-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG。(SEQ ID NO：1)。
大规模 scFv 纯化：将1 ml 2xTYAG的起始培养物用来自新鲜划线培养的2xTYAG琼脂板的单一菌落接种，并且伴随振荡(240 rpm)在37℃孵育5小时。将 0.9 ml这种培养物用于接种相同培养基的400 ml培养物，并且在30℃伴随剧烈振荡(300 rpm)生长过夜。第二天，通过加入400 μl 1M IPTG诱导培养物，并且将孵育继续另外3小时。通过以5,000 rpm在4℃离心10分钟收集细胞。如上所述将沉淀的细胞重悬浮于补充有蛋白酶抑制剂的10 ml冰冷的TES缓冲液中。通过加入15 ml 1:5稀释的TES缓冲液且在冰上孵育1小时达到渗透休克。将细胞以10,000 rpm在4℃离心20分钟，以沉淀细胞碎片。将上清液小心地转移至新鲜管。将咪唑加入上清液中至10 mM的终浓度。将在PBS中平衡的1 ml Ni-NTA树脂(Qiagen)加入每个管中，并且在旋转式混合器上在4℃(20 rpm)孵育1小时。将管以2,000 rpm离心5分钟，并且小心地去除上清液。将沉淀的树脂重悬浮于10 ml冷的(4℃)洗涤缓冲液1(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM咪唑，pH至8.0)中。将悬浮液加入polyprep柱(Biorad)中。8 ml冷的洗涤缓冲液2(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、20 mM咪唑，pH至8.0)用于通过重力流动洗涤柱。用2 ml洗脱缓冲液(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、250 mM咪唑，pH至8.0)从柱中洗脱scFv。通过在280 nm处的吸收分析部分，并且合并含蛋白部分，随后在用PBS平衡的NAP5脱盐柱(Amersham)上进行缓冲液更换。通过SDS-PAGE分析scFv的PBS溶液，并且通过在280 nm处的吸收进行定量。将纯化的scFv等分且贮存于-20℃和4℃。纯化的scFv用于ELISA中，以证实与它们已针对其选择的靶的特异性结合。
实施例4：使用不同固定的VH文库的另外选择
还通过捕获天然重排的轻链储库且在实施例1中所述的单一VH结构域的背景下克隆其，来生成抗体文库。在这种情况下，使用对应于人重排的可变区的5’和3’区的引物从人cDNA中扩增整个轻链可变基因区，并且克隆到实施例1中所述的pNDS_VHfixed载体内。另一组文库如实施例1中所述生成，但使用含有不同CDRH3序列ARGDDVS(SEQ ID NO:3)的固定VH3-23结构域。上文描述的文库在图5中图示。这些固定的VH文库针对靶蛋白实验对象组使用，使用实施例2和3中所述的选择和筛选方法。选择已使用下述靶进行：hCXCL10-NusA、IL-6RC、CD47、CD16、CD8和hIFNγ。鉴定且显示对于其靶特异性的候选物在表II中列出。这些结果证实可以生成结合不同靶且具有共同重链的抗体，并且局限于轻链的多样性足以赋予抗原特异性。可以由含有具有不同CDRH3序列的VH3-23结构域或具有使用不同策略多样化的VL储库的文库生成候选物。因此，结果证实该方法不局限于特定VH序列或特定轻链可变结构域多样性策略。
表II. 使用具有含有两个不同CDRH3序列的固定VH序列的文库针对靶实验对象组鉴定的独立克隆数目。NA：未进行选择。
Figure 794979DEST_PATH_IMAGE001
实施例5：重新格式(reformat)为IgG固定VH候选物和在哺乳动物细胞中的瞬时表达
在筛选后，scFv候选物重新格式为IgG且通过瞬时转染到PEAK细胞内表达。如下生成具有共同重链且分别对于IFNγ和IL6RC特异性且具有不同轻链序列的几个IgGλ(n=5)和IgGκ(n=9)。所选scFv的VH和VL序列用特异性寡核苷酸扩增且克隆到含有重和轻链恒定区的表达载体内，并且通过测序验证构建。使用Fugene 6转染试剂(Roche，Basel，瑞士)，将表达载体转染到哺乳动物细胞内。简言之，峰细胞以6 x 105细胞/孔的浓度在含有胎牛血清的2 ml培养基中在6孔板中培养。根据制造商的说明书，使用Fugene 6转染试剂，将编码候选VH和VL序列的表达载体共转染到细胞内。在转染后一天，抽吸培养基，并且将3 ml新鲜无血清培养基加入细胞中，并且在37℃培养三天。在三天培养期后，根据制造商的说明书，收获上清液用于在蛋白G-Sepharose 4B快速流动柱(Sigma，St. Louis，MO)上纯化的IgG。简言之，将来自转染细胞的上清液在4℃与ImmunoPure(G)IgG结合缓冲液(Pierce，Rockford IL)一起孵育过夜。随后将样品经过蛋白G-Sepharose 4B快速流动柱，并且因此使用洗脱缓冲液纯化IgG。洗脱的IgG部分随后针对PBS透析，并且通过在280 nm处的吸收定量IgG含量。通过SDS-PAGE验证纯度和IgG完整性。随后通过ELISA就与IFNγ和IL-6/IL-6R受体复合物(在本文中称为IL6RC)的结合测试IgG。将生物素化的IFNγ和IL6RC固定在链霉抗生物素蛋白包被的微板(Streptawell，Roche)上，并且随后将板用补充有2%BSA的PBS在室温封闭1小时。将板用PBS 0.05% Tween 20洗涤3次，随后在用任一靶包被的孔上加入纯化的抗INFγ IgGλ或抗IL6RC IgGκ。在室温的一小时孵育和板的洗涤后，用与辣根过氧化物酶偶联的抗人Cκ或抗人Cλ抗体检测结合的抗体。随后通过加入50μl TMB(Sigma)和停止反应的50μl 2N H2SO4以揭示ELISA。吸收强度在450nm处阅读。结果指示从固定的VH文库中分离的scFv的结合特异性以IgG形式维持，且证实具有相同重链但不同轻链的两种IgGs对于独特靶可以是特异性的(图6)。
抗INFγ IgGλ或抗IL6RC IgGκ的重和轻链氨基酸序列在下文指示：
抗IL6RC Vκ轻链
Figure 712120DEST_PATH_IMAGE002
抗IFNγVλ轻链
Figure 429540DEST_PATH_IMAGE003
共同重链
Figure 824749DEST_PATH_IMAGE004
Figure 639121DEST_PATH_IMAGE005
。
实施例6：单一重链和两条轻链在哺乳动物细胞中的共表达
一条重链和两条轻链在相同细胞中的同时表达可以导致三种不同抗体的装配(图8A)。同时表达可以以表达待共表达的链之一的多载体转染的不同方式或通过使用驱动多基因表达的载体来实现。设计载体pNovi κHλ，以允许一条重链、一条κ轻链和一条λ轻链的共表达(图7A)。三种基因的表达通过人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动，并且载体还含有谷氨酰胺合成酶基因(GS)，其使稳定细胞系的选择和建立成为可能。还构建另一种载体pNovi κHλκ，其中将κ轻链的第二个拷贝插入λ轻链之后，并且其表达通过内部核糖体进入位点(IRES)驱动。使用这种双顺反子设计，可以增加κ轻链的相对表达。两种载体在图7中图示。
实施例7：单一重链和两条轻链在哺乳动物细胞中的瞬时共表达和总IgG的纯化。
将抗INFγ IgGλ或抗IL6RC IgGκ的VH和VL基因克隆到实施例5中所述的载体pNovi κHλ中，用于在哺乳动物细胞中瞬时表达。峰细胞以6 x 105细胞/孔的浓度在含有胎牛血清的2 ml培养基中在6孔板中培养。根据制造商的说明书，使用TransIT-LT1转染试剂(Mirus)，将2 μg质粒DNA转染到细胞内。在转染后一天，抽吸培养基，并且将3 ml新鲜无血清培养基加入细胞中，并且在37℃培养五天。在五天培养期后，根据制造商的说明书，收获上清液，以4000 rpm离心且应用于MabSelect Sure PA树脂(GE Healthcare)上。总IgGs在酸性条件下洗脱，随后为中和且缓冲液更换至PBS。通过在280 nm处的吸收定量IgG含量，并且通过SDS-PAGE分析。对应于两条轻链的两个条带和对应于重链的一个条带的存在指示三条链可以在相同细胞中同时表达(图8B)。
实施例8：具有λ和κ轻链的双特异性抗体的纯化
一条重链和两条轻链在相同细胞中的共表达可以导致三种不同抗体的装配：在两个臂上具有相同轻链的两种单特异性抗体和在每个臂上具有与重链结合的不同轻链的双特异性抗体。后者可以通过层析技术与单特异性抗体分离，所述层析技术利用单特异性和双特异性抗体的不同生物化学性质。为了开发可应用于所有双特异性抗体生成的通用纯化方法，我们使用在图8A中图示描述的亲和层析方法。将来自转染细胞的培养上清液应用于MabSelect Sure PA树脂(GE Healthcare)柱，并且如实施例7中所述纯化总IgG。随后将总IgG应用于由十体积PBS平衡的含有CaptureSelect Fabκ亲和基质(BAC BV，荷兰)的柱。随后将柱用5-10柱体积的PBS洗涤。通过应用5柱体积0.1 M甘氨酸pH 2.0从柱中洗脱具有κ轻链的免疫球蛋白分子，并且收集且中和部分。合并含有抗体的部分，然后在由PBS平衡的PD10脱盐柱(Amersham)上缓冲液更换。随后将抗体应用于由十体积的PBS平衡的含有CaptureSelect Fabλ亲和基质的第二个柱。随后将柱用5-10柱体积的PBS洗涤。仅具有κ轻链的免疫球蛋白分子的确与柱结合并且在流出物中发现。通过应用5柱体积0.1 M甘氨酸pH 3.0从柱中洗脱具有λ轻链的抗体，并且收集部分。合并含有双特异性抗体的部分，然后在由PBS平衡的PD10脱盐柱(Amersham)上缓冲液更换。通过应用5柱体积0.1 M甘氨酸pH 2.0从柱中洗脱具有κ轻链的免疫球蛋白分子，并且收集且中和部分。合并含有抗体的部分，然后在由PBS平衡的PD10脱盐柱(Amersham)上缓冲液更换。随后将抗体应用于由十体积的PBS平衡的含有CaptureSelect Fabλ亲和基质的第二个柱。随后将柱用5-10柱体积的PBS洗涤。仅具有κ轻链的免疫球蛋白分子的确与柱结合并且在流出物中发现。通过应用5柱体积0.1 M甘氨酸pH 3.0从柱中洗脱具有λ轻链的抗体，并且收集部分。合并含有双特异性抗体的部分，然后在由PBS平衡的PD10脱盐柱(Amersham)上缓冲液更换。通过SDS-PAGE分析每个纯化步骤的流出物和洗脱部分，并且指示具有λ轻链的抗体在CaptureSelect Fabκ亲和基质的流出物中发现，并且相反，具有κ轻链的抗体在CaptureSelect Fabλ亲和基质的流出物中发现(图8B)。如预期的，在最终洗脱部分中，对应于两条轻链的条带的强度是相等的。因此，这个三步方法允许纯化具有κ和λ轻链的双特异性抗体。具有κ和λ轻链的双特异性抗体的最终回收在不同实验中是约10-21%。蛋白A洗脱部分也指示比κ轻链更多的λ轻链装配成纯化的IgG，暗示κ轻链的增加表达可以增加双特异性抗体的装配和回收。
实施例9：调节轻链表达以最佳化双特异性抗体装配
为了增加κ轻链的表达，将共同VH基因、抗INFγ抗体的Vλ基因和两个拷贝的抗IL6RC的Vκ克隆到实施例6中所述的载体pNovi κHλκ中。Vκ轻链的第二个拷贝的表达通过IRES驱动。测试不同IRES元件，以达到不同水平的Vκ轻链表达。这导致五个独立载体的构建：pNovi κHλκ 1至5。这些载体如实施例7中所述用于在哺乳动物细胞中的瞬时转染，并且使用蛋白A亲和纯化从上清液中纯化总IgG。SDS-PAGE分析指示与使用pNovi κHλ载体的表达相比较，不同pNovi κHλκ载体增加κ轻链表达和装配成IgG(图9)。对于这些构建体中每一种在蛋白A纯化后获得的总IgG部分进一步如实施例8中所述在两个连续步骤中使用CaptureSelect Fab κ和CaptureSelect Fabλ进行纯化。双特异性抗体中的得率对于pNovi κHλ是20%，并且对于pNovi κHλκ构建体的范围为33 - 41%，指示增加的κ轻链表达导致增加的双特异性抗体装配。为了进一步证实这些发现，进行使用pNovi κHλ和表达单特异性抗IL6RC IgGκ的载体的共转染。以这种方式，κ轻链的相对表达以及双特异性抗体的得率也是增加的，指示可以采取几种方法以调整相对轻链表达。
实施例10：纯化的双特异性抗体的表征
使用不同技术表征如上文实施例中所述分离的纯化双特异性抗体。
等电聚焦凝胶 (IEF)。使用具有pH 3-10范围(Lonza)的IsoGel Agarose IEF板分析如实施例9中所述分离的纯化双特异性抗体，并且与单特异性抗INFγ IgGλ和抗IL6RC IgGκ抗体相比较。在聚焦后，将凝胶置于固定液中30分钟，用水洗涤5分钟，并且随后在RT干燥。用考马斯染色将凝胶染色15分钟，用水短暂清洗并用脱色液清洗2x15分钟。最后凝胶在RT进行干燥，然后成像。在图10A中所示的结果指示如由抗体形式和理论计算预测的，与两种单特异性抗体的pI相比较，IgGκλ双特异性抗体具有不同和中间pI。染色还证实双特异性抗体在实施例8中所述的三步纯化过程后是高纯的。
离子交换层析 (IEX)。使用Agilent柱Bio Mab，NP5,(Agilent)，通过离子交换高效液相层析(IEX-HPLC)(HPLC Waters e2695 / 检测器2489)分析50 μg纯化的单特异性和双特异性抗体：移动相是：A：Na2HPO4/NaH2PO4 10mM，pH6.5；B：Na2HPO4/NaH2PO4 10mM，NaCl 100 mM，pH6.5；使用0.8 mL/分钟的流动和20%-60%梯度，经过133分钟。三种抗体具有不同保留时间，其中双特异性抗体的对应峰具有与单特异性抗体相比的中间特征(图10B)。
ELISA。通过ELISA就与INFγ和IL6RC的结合测试单特异性抗INFγ IgGλ、抗IL6RC IgGκ和双特异性IgGκλ抗体。图11中所示的结果指示双特异性IgGκλ能够与两种靶结合且可以用抗人Cκ和抗人Cλ二抗进行检测。
表面等离振子共振 (SPR)。在Biacore 2000仪器(Biacore AB，Uppsala，瑞典)上表征单特异性抗INFγ IgGλ、抗IL6RC IgGκ和双特异性IgGκλ抗体的亲和力和结合动力学。通过在CM5 Biacore芯片上的EDC/NHS化学固定200RU山羊抗人多克隆IgG(ahIgG；Biacore)。这个表面用于捕获单特异性或双特异性人IgG。在每个循环后，通过以30μL/分钟注射10mM甘氨酸pH=1.5持续30秒，随后为在HBS-EP缓冲液中的1分钟稳定时间，而再生表面。根据1:1兰米尔模型拟合数据，并且测定Kon、Koff和KD值(表III)。对于单特异性抗体和双特异性IgGκλ抗体获得类似的亲和力值。数据指示，在单特异性和双特异性形式中，两个抗体组合位点类似地与hIFNγ和IL6RC结合。
通过SPR同时测试双特异性IgGκλ与两种靶相互作用的能力。将生物素化的INFγ固定在链霉抗生物素蛋白包被的CM5 Biacore芯片上。将单特异性和双特异性抗体注射到这个表面上，随后注射IL6RC。图11A中所示的传感图显示，双特异性IgGκλ抗体能够与固定的IFNγ结合且能够同时捕获IL6RC。SPR也用于评价纯化的双特异性抗体中κ和λ轻链的相对量。IgGκλ经由胺偶联直接固定在CM5 Biacore芯片的表面上，并且注射抗人Cκ抗体随后为以相同浓度的抗人Cλ抗体。用两种抗轻链抗体获得等价应答，指示如通过形式预测的，等价量的κ和λ轻链存在于双特异性IgGκλ抗体中(图12B)。
表III. 在Biacore 2000系统上测量的关于单特异性和IgGκλ双特异性抗体对于IFNγ和IL6RC的结合动力学分析。
Figure 399267DEST_PATH_IMAGE006
实施例11：双特异性抗体的制造
还在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行IgGκλ双特异性抗体的表达，所述中国仓鼠卵巢细胞广泛用于单克隆抗体的制造。在本文呈现的实施例中，生成转染的CHO细胞的半稳定合并物以及稳定CHO系用于生产IgGκλ双特异性抗体。在本文呈现的研究中，生成稳定CHO系且使用化学限定的无动物组分的(CDACF)制造过程生长。总体过程在图13中描述。
CHO 合并物。用编码上文实施例中所述的IgGκλ 抗 INFγ/抗IL6RC双特异性抗体的线性化载体pNovi κHλκ以及驱动单特异性抗INFγ IgGλ和抗IL6RC IgGκ表达的质粒，将CHO细胞电穿孔。在电穿孔后，转染细胞的合并物在非补料(non-fed)10天过度生长条件下生长。与用单特异性表达载体转染的细胞相比较，用双特异性构建体转染的细胞呈现相似的生长特征。此外，生产率也是相当的并且达到一般范围的抗体生产率：对于非补料过度生长合并培养物在100-200 mg/L之间(图14A)。成功达到在锥形瓶(100 mL)中的小规模生产和在25L Wave袋中的中等规模生产之间的按比例放大(图14B)。这些结果指示，在CHO细胞系中的双特异性IgGκλ抗体和相应单特异性抗体的表达过程中获得相似的生长曲线和生产率。
稳定 CHO 细胞系。通过用pNovi κHλκ载体电穿孔CHO细胞生成产生双特异性抗体的重组细胞系。在转染后，通过在50µM甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)终浓度的存在下稀释细胞培养物选择重组细胞系。在孵育6周后，通过FastELISA®(R&D Biotech)就总IgG生产率筛选重组细胞系的集落(图15A-B)。在含有25 µM MSX的细胞培养基中扩增所选细胞系，转移至24孔微量滴定板且在悬浮培养物中筛选生产率和生长特征(图15C-D)。结果揭示，IgGκλ双特异性抗体可以以与表达标准单特异性抗体的细胞系相当的水平在振荡分批过度生长条件下产生。选择最高生产细胞系且在摇瓶中在50mL分批过度生长培养物中操作最多10天。蛋白A HPLC用于上清液中的总IgG定量。使用1mL HiTrap(GE Healthcare)预填充柱，通过MabSelect SuRE层析纯化来自10个最高生产细胞系的上清液的总IgG。如实施例10中所述，通过IEX-HPLC评价总纯化IgG中的单特异性和双特异性抗体的相对量。对于大多数细胞系，IgGκλ双特异性抗体部分在37-42%总IgG之间变动，并且两种细胞系已表达更少量的IgGκλ(22和25%)。关于10个CHO细胞系的结果概括于表IV中。
表IV.
总抗体滴度(mg/mL) 在MabSelect SuRr纯化后的总抗体(mg) 来自IEX-HPLC的双特异性抗体相对量(%) 双特异性抗体总量(mg)
细胞系1 0.35 10.73 37 3.97
细胞系2 0.32 9.54 25 2.37
细胞系3 0.31 10.02 37 3.72
细胞系4 0.42 10.01 40 4.00
细胞系5 0.38 11.59 38 4.39
细胞系6 0.43 11.10 43 4.75
细胞系7 0.49 12.67 42 5.32
细胞系8 0.33 8.96 22 2.01
细胞系9 0.38 9.94 42 4.18
细胞系10 0.39 10.98 42 4.61
在 CHO 中表达的 IgG κλ双特异性抗体的纯化和表征。用双特异性和单特异性构建体转染的CHO细胞合并物的上清液用于纯化。使用蛋白A亲和层析纯化单特异性抗INFγ IgGλ和抗IL6RC IgGκ，并且在PBS内脱盐，而双特异性IgGκλ抗体使用实施例8中所述的三步亲和层析过程纯化。通过SDS-PAGE和IEF分析不同步骤的洗脱部分和流出物以及最后的纯化样品(图16)。在每个纯化步骤后通过ELISA监测IgGκλ的特异性(图17)。结果证实，纯化过程是强有力的且与在CHO中的表达相容且获得高纯IgGκλ双特异性抗体。
实施例12：双特异性gGκλ抗体的另外例子
如上文实施例中所述分离、表达且纯化IgGκλ双特异性抗体的其他例子。这些包括抗NusA/抗INFγ IgGκλ双特异性抗体和抗IL6RC/抗IL6RC IgGκλ双特异性抗体，其中两个组合位点与IL6RC结合但具有κ和λ轻链。这些纯化的双特异性抗体连同其各自的单特异性配对物通过IEF进行分析(图18)。结果显示双特异性抗体的pI总是在单特异性抗体的pI之间，但取决于轻链可变结构域的序列，该差异可以显著不同。这说明，如果两条轻链具有相似的生物化学性质，那么基于电荷差异的双特异性抗体的纯化可能是困难的，这突出显示本发明的亲和纯化方法的优点。
实施例13：使用两个κ或两个λ可变结构域的双特异性IgGκλ抗体的生成
双特异性抗体还可以使用相同类型(λ或κ)的两个可变结构域生成。因为亲和纯化步骤要求轻链的恒定κ和恒定λ结构域的存在，所以任何轻链可变结构域原则上可以融合至这些恒定结构域，以生成如图3中举例说明的杂合轻链。这通过使用从实施例1中所述的固定VH抗体文库中分离的针对INFγ和IL6RC的两种抗体加以证实。在这种情况下，两种抗体共享相同VH且具有λ轻链可变结构域。抗INFγ抗体的Vλ结构域与λ恒定结构域组合，而抗IL6RC抗体的Vλ结构域与κ恒定结构域组合。对于后者，生成三种不同构建体，其包括在Vλ结构域和Cκ结构域之间的不同融合点。在一种构建体(杂合物1)中，融合点在Vλ结构域的构架4(FR4)区末端上，并且包括整个恒定κ结构域(图19A)。在另一种构建体(杂合物2)中，将λFR4区由κFR4区替换(图19B)。在第三种构建体(杂合物3)中，恒定κ结构域的前4个氨基酸由恒定λ结构域的4个氨基酸置换(图19C)。这些不同杂合λ-κ轻链连同共同重链和λ轻链一起克隆到pNovi κHλ载体内。IgGκλ的哺乳动物细胞转染、蛋白表达和三步亲和纯化如上文实施例中所述进行。洗脱部分的分析指示，杂合物3轻链不与κ选择树脂结合并且因此不允许有效的双特异性抗体纯化。杂合物1和杂合物2允许有效的IgGκλ双特异性纯化。具有杂合轻链的这些纯化的IgGκλ使用蛋白80芯片(Agilent Technologies)在Agilent Bionalyzer 2100上进行分析，并且在电泳图上对应于轻链的峰显示为等同的(图20)。结果显示，本发明的双特异性抗体可以使用具有共同重链和具有相同类型(κ或λ)的可变结构域的两条轻链的两种抗体生成。
实施例14：所述抗体的VH和VL都涉及抗原结合
为了测试共同VH对于抗原结合的贡献，将实施例1和4中选择的具有共同VH的scFv的不同轻链与两个不同VH组合，所述两个不同VH不同于原始共同VH。不同scFv可以如实施例3中所述表达且纯化且测试针对它们已针对其进行选择的靶的结合。图21中所示的实施例显示，当与它们最初针对其进行选择的VH结构域组合时，对于IFNγ特异性的scFv和针对IL6RC特异性的scFv仅可以与其各自靶结合，并且当与允许其表达和纯化的两个其他VH结构域组合时，未观察到结合。结果指示，尽管存在多样性局限于VH结构域的事实，但共同VH和VL都促成抗原结合。
实施例15：用于IgGκλ双特异性抗体定量的ELISA的开发
开发了定量IgGκλ双特异性抗体的夹心ELISA。将96孔Maxisorp(Nunc)板用10 ug/ml小鼠抗人λ抗体(Southern Biotech)包被，并且在4℃孵育过夜。在洗涤(PBS Tween 20 0.05%，3次洗涤)后，将板用PBS-BSA 3%(Sigma)在室温封闭2小时。纯化的IgGκλ标准在PBS-BSA 1%中在500 ng/ml - 1 ng/ml之间系列稀释，以获得用于样品定量的良好线性范围。取决于其来源，将样品如下稀释以进入定量范围：粗CHO上清液1/1500；纯化的蛋白A 1/15000。随后将样品1:2系列稀释。在板洗涤后，将50 ul每个制备的稀释物一式两份加入，并且在室温孵育1小时。将板再次洗涤且与50 ul 1:2000抗人κ抗体(Southern Biotech)一起在室温孵育1小时。在最后洗涤(PBST 0.05%，5次洗涤)后，用50 ul TMB底物(Sigma)揭示反应，并且在15分钟后通过加入50 ul H2SO4(氢氧化钠2N)停止。使用精确的微板阅读器(Epoch，Witec)记录在450 nm处的吸光度。因为单特异性抗体可能通过与包被的捕获抗体结合而影响测定，所以通过将渐增量的单特异性IgGκ和单特异性IgGλ抗体加入IgGκλ双特异性标准中进行掺料实验。测试不同比例：(50% IgGκλ双特异性、25%单特异性IgGκ、25%单特异性IgGλ)；(67% IgGκλ双特异性；33%单特异性IgGλ)；(50% IgGκλ双特异性、50%单特异性IgGλ)；(25% IgGκλ双特异性、75%单特异性IgGλ)；(50% IgGκλ双特异性、50%单特异性IgGκ)。
图22中所示的结果指示，测定不受单特异性抗体显著影响，并且因此它可以用于复杂样品例如细胞培养上清液中的IgGκλ双特异性抗体定量。通过蛋白A亲和层析从相同上清液中纯化总IgG后，ELISA用于定量来自稳定CHO细胞系的上清液中的IgGκλ双特异性抗体。ELISA定量结果与通过蛋白A HPLC或通过在280 nm处的吸收测定的总IgG含量相比较，并且概括于表V中。通过ELISA获得的浓度对应于30-40%总IgG，这是预期的双特异性比例。数据显示，这个测定可以用于测定在细胞培养上清液中的IgGκλ双特异性抗体量，且促进稳定细胞系就其在IgGκλ双特异性抗体中的生产率的筛选。
表V. 通过ELISA使用粗上清液或总IgG关于不同稳定CHO细胞系的IgGκλ双特异性抗体定量，并且与总IgG的蛋白A HPLC和A280定量结果相比较。
其他实施方案
虽然本发明已结合其详细描述进行描述，但前述描述预期举例说明而不是限制本发明的范围，所述本发明的范围通过附加权利要求的范围限定。其他方面、优点和修饰在下述权利要求的范围内。

Claims (42)

1.分离的单克隆抗体，其在每个组合位点中具有不同特异性且由两个拷贝的单一重链多肽以及第一条轻链和第二条轻链组成，其中所述第一条和第二条轻链是不同的。
2.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述第一条轻链的至少部分是κ类型的，并且所述第二条轻链的至少部分是λ类型的。
3.权利要求2的分离的单克隆抗体，其中所述第一条轻链包含至少κ恒定区。
4.权利要求3的分离的单克隆抗体，其中所述第一条轻链进一步包含κ可变区。
5.权利要求3的分离的单克隆抗体，其中所述第一条轻链进一步包含λ可变区。
6.权利要求2的分离的单克隆抗体，其中所述第二条轻链包含至少λ恒定区。
7.权利要求6的分离的单克隆抗体，其中所述第二条轻链进一步包含λ可变区。
8.权利要求6的分离的单克隆抗体，其中所述第二条轻链进一步包含κ可变区。
9.权利要求2的分离的单克隆抗体，其中所述第一条轻链包含κ恒定区和κ可变区，并且所述第二条轻链包含λ恒定区和λ可变区。
10.前述权利要求中任一项的分离的单克隆抗体，其中所述恒定和可变构架区序列是人的。
11.生成权利要求1的双特异性抗体的方法，其包括：
a. 分离具有特异性的抗体或抗体片段区，所述特异性由与第一个轻链可变结构域组合的重链可变结构域决定；
b. 分离具有不同特异性的抗体或抗体片段区，所述不同特异性由与第二个轻链可变结构域组合的与步骤a)的抗体相同的重链可变结构域决定；
c. 在细胞中共表达：
i. 融合至免疫球蛋白重链恒定区的所述共同重链可变结构域；
ii. 融合至κ类型的轻链恒定结构域或融合至λ类型的轻链恒定结构域的所述第一个轻链可变结构域；和
iii. 融合至与所述第一条轻链的恒定结构域不同类型的轻链恒定结构域的所述第二个轻链可变结构域。
12.权利要求11的方法，其中κ轻链可变结构域融合至κ类型的恒定区。
13.权利要求11的方法，其中κ轻链可变结构域融合至λ类型的恒定区。
14.权利要求11的方法，其中λ轻链可变结构域融合至κ类型的恒定区。
15.权利要求11的方法，其中λ轻链可变结构域融合至λ类型的恒定区。
16.权利要求11 – 15中任一项的方法，其进一步包括(d)从步骤c)中产生的所述单特异性抗体中纯化在步骤c)中产生的所述双特异性抗体的步骤。
17.权利要求16的方法，其中步骤d)是亲和层析纯化步骤。
18.权利要求17的方法，其中所述纯化步骤使用κ恒定结构域特异性、λ恒定结构域特异性或κ恒定结构域特异性和λ恒定结构域特异性亲和层析介质进行。
19.权利要求11 – 18中任一项的方法，其中所述步骤a)和b)通过使用具有共同重链和多样性局限于轻链可变结构域的抗体文库得到促进。
20.权利要求19的方法，其中所述抗体文库展示在丝状噬菌体上，在酵母、细菌或哺乳动物细胞的表面，或用于核糖体或其他类型的体外展示。
21.制备双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体与第一种抗原和第二种抗原特异性结合，其中所述第一种抗原和第二种抗原是不同的，所述方法包括：
(a)提供编码第一种多肽的第一种核酸分子，所述第一种多肽包含偶联至免疫球蛋白恒定区且结合所述第一种抗原的免疫球蛋白多肽的重可变链区或其片段；
(b)提供编码第二种多肽的第二种核酸分子，所述第二种多肽包含偶联至第一个κ类型或λ类型轻链恒定区且结合所述第一种抗原的免疫球蛋白多肽的轻链可变区或其片段；
(c)提供编码第三种多肽的第三种核酸分子，所述第三种多肽包含偶联至第二个κ类型或λ类型轻链恒定区的免疫球蛋白多肽的轻链可变区或其片段，所述免疫球蛋白多肽的轻链可变区或其片段共享步骤(a)的相同的所述免疫球蛋白多肽的重可变链区或其片段且结合所述第二种抗原，其中所述第一个和第二个轻链恒定结构域是不同类型的；和
(d)在允许所述第一种、第二种和第三种多肽表达的条件下，培养包含所述第一种、第二种和第三种核酸分子的宿主细胞。
22.权利要求21的方法，其进一步包括(e)回收所述双特异性抗体的步骤。
23.权利要求21的方法，其中所述第二种核酸编码κ类型轻链可变结构域。
24.权利要求23的方法，其中所述第二种核酸编码κ类型恒定区。
25.权利要求23的方法，其中所述第二种核酸编码λ类型恒定区。
26.权利要求21的方法，其中所述第二种核酸编码λ类型轻链可变结构域。
27.权利要求26的方法，其中所述第二种核酸编码κ类型恒定区。
28.权利要求26的方法，其中所述第二种核酸编码λ类型恒定区。
29.权利要求21的方法，其中所述第三种核酸编码κ类型轻链可变结构域。
30.权利要求29的方法，其中所述第三种核酸编码κ类型恒定区。
31.权利要求29的方法，其中所述第三种核酸编码λ类型恒定区。
32.权利要求21的方法，其中所述第三种核酸编码λ类型轻链可变结构域。
33.权利要求32的方法，其中所述第三种核酸编码κ类型恒定区。
34.权利要求32的方法，其中所述第三种核酸编码λ类型恒定区。
35.权利要求21 – 34中任一项的方法，其中在步骤(e)中使用亲和层析纯化步骤回收所述双特异性抗体。
36.权利要求35的方法，其中所述纯化步骤使用κ恒定结构域特异性、λ恒定结构域特异性或κ恒定结构域特异性和λ恒定结构域特异性亲和层析介质进行。
37.抗体混合物，其包含两种单特异性抗体和一种双特异性抗体，所有所述抗体都具有共同重链。
38.生成权利要求37的抗体混合物的方法，其包括：
a. 分离具有特异性的抗体或抗体片段区，所述特异性由与第一个轻链可变结构域组合的重链可变结构域决定；
b. 分离具有不同特异性的抗体或抗体片段区，所述不同特异性由与第二个轻链可变结构域组合的与步骤a)的抗体相同的重链可变结构域决定；
c. 在细胞中共表达：
i. 融合至免疫球蛋白重链恒定区的所述共同重链可变结构域；
ii. 融合至κ类型的轻链恒定结构域或融合至λ类型的轻链恒定结构域的所述第一个轻链可变结构域；和
iii. 融合至κ类型的轻链恒定结构域或融合至λ类型的轻链恒定结构域的所述第二个轻链可变结构域。
39.权利要求38的方法，其进一步包括(d)从细胞培养上清液中纯化步骤c)中产生的所述抗体混合物的步骤。
40.抗体混合物，其包含三种或更多种单特异性抗体和三种或更多种双特异性抗体，所有所述抗体都具有共同重链。
41.生成权利要求40的抗体混合物的方法，其包括：
a. 分离具有特异性的抗体或抗体片段区，所述特异性由与第一个轻链可变结构域组合的重链可变结构域决定；
b. 分离具有不同特异性的数种抗体或抗体片段区，所述不同特异性由与不同轻链可变结构域组合的与步骤a)的抗体相同的重链可变结构域决定；
c. 在细胞中共表达：
i. 融合至免疫球蛋白重链恒定区的所述共同重链可变结构域；
ii. 融合至κ类型的轻链恒定结构域或融合至λ类型的轻链恒定结构域的所有步骤a)和b)中分离的抗体的轻链。
42.权利要求41的方法，其进一步包括(d)从细胞培养上清液中纯化步骤c)中产生的所述抗体混合物的步骤。
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