JP6925278B2 - 液性免疫応答の増強方法 - Google Patents
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Description
〔1〕下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原を免疫動物に投与する工程を含む、該免疫原に対する抗体の製造方法。
〔2〕前記免疫動物から単離された前記免疫原に対する抗体の遺伝子を含む発現ベクターを導入された宿主細胞を培養し、該免疫原に対する抗体を回収する工程をさらに含む、〔1〕に記載の抗体の製造方法。
〔2'〕以下の工程(b)〜(d):
(b) 前記免疫動物から該免疫原に対する抗体の遺伝子を単離する工程;
(c) 前記工程(b)で単離された遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程;及び
(d) 宿主細胞を培養し、該免疫原に対する抗体を回収する工程
をさらに含む、〔1〕に記載の抗体の製造方法。
〔3〕前記免疫原に対する抗体が、マウス、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である、〔1〕又は〔2〕に記載の抗体の製造方法。
〔4〕前記免疫原が、前記免疫動物で免疫寛容が成立しやすいペプチド又はタンパク質である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の抗体の製造方法。
〔5〕前記免疫原が、前記免疫動物に存在するペプチド又はタンパク質と高い相同性を有するものである、〔4〕に記載の抗体の製造方法。
〔6〕前記免疫応答を抑制する機能を有する細胞が、制御性T細胞又は疲弊T細胞である、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の抗体の製造方法。
〔7〕前記免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子が、CTLA4、PD1、TIM3、LAG3、CD244 (2B4)、CD160、GARP、OX40、CD137 (4-1BB)、CD25、VISTA、BTLA、TNFR25、CD57、KLRG1、CCR2、CCR5、CCR6、CD39、CD73、CD4、CD18、CD49b、CD1d、CD5、CD21、TIM1、CD19、CD20、CD23、CD24、CD38、CD93、IgM、B220(CD45R)、CD317、PD-L1、CD11b、Ly6G、ICAM-1、FAP、PDGFR、 PodoplaninおよびTIGITから選ばれるいずれかの分子である、〔6〕に記載の抗体の製造方法。
〔8〕前記T細胞受容体複合体に結合するドメインがCD3結合ドメインである、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の抗体の製造方法。
〔9〕前記抗原結合分子がFcRn結合ドメインをさらに含む、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗体の製造方法。
〔10〕下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む、治療用ワクチンと併用するための医薬組成物。
〔11〕前記免疫応答を抑制する機能を有する細胞が、制御性T細胞又は疲弊T細胞である、〔10〕に記載の医薬組成物。
〔12〕前記T細胞受容体複合体に結合するドメインがCD3結合ドメインである、〔10〕又は〔11〕に記載の医薬組成物。
〔13〕前記抗原結合分子がFcRn結合ドメインをさらに含む、〔10〕〜〔12〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔14〕前記FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している抗体のFc領域である、〔13〕に記載の医薬組成物。
〔15〕前記治療用ワクチンが、免疫寛容が成立しやすいペプチド又はタンパク質である1以上の免疫原を含む、〔10〕〜〔14〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔16〕前記免疫原が、癌細胞特異的な抗原又はその断片である、〔15〕に記載の医薬組成物。
〔17〕下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む、液性免疫応答増強剤。
〔18〕前記免疫応答を抑制する機能を有する細胞が、制御性T細胞又は疲弊T細胞である、〔17〕に記載の液性免疫応答増強剤。
〔19〕前記T細胞受容体複合体に結合するドメインがCD3結合ドメインである、〔17〕又は〔18〕に記載の液性免疫応答増強剤。
〔20〕前記抗原結合分子がFcRn結合ドメインをさらに含む、〔17〕〜〔19〕のいずれかに記載の液性免疫応答増強剤。
〔21〕前記FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している抗体のFc領域である、〔20〕に記載の液性免疫応答増強剤。
〔22〕癌細胞特異的な抗原に対する液性免疫応答を増強することを特徴とする、〔17〕〜〔21〕のいずれかに記載の液性免疫応答増強剤。
〔23〕免疫寛容が成立しやすいペプチド又はタンパク質に対する液性免疫応答を増強することを特徴とする、〔17〕〜〔21〕のいずれかに記載の液性免疫応答増強剤。
〔24〕下記のドメインを含む抗原結合分子を投与する工程を含む、対象における液性免疫応答を増強する方法:
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン。
〔25〕前記対象が非ヒト動物である、〔24〕に記載の方法。
〔26〕対象における液性免疫応答増強において用いるための、下記のドメインを含む抗原結合分子:
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン。
〔27〕液性免疫応答増強剤の製造における、下記のドメインを含む抗原結合分子の使用:
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン。
本発明における「抗原結合分子」とは、本発明の「結合ドメイン」を含む分子であれば特に限定されず、さらに、5アミノ酸程度以上の長さを有するペプチドやタンパク質(蛋白質)が含まれていてもよい。生物由来のペプチドやタンパク質に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。
(a)L234F、L235E、P331S、
(b)C226S、C229S、P238S、
(c)C226S、C229S、
(d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
が施されているFc領域、又は、231位から238位のアミノ酸配列が欠失したFc領域を有する抗原結合分子も適宜使用され得る。
(e)H268Q、V309L、A330S、P331S
(f)V234A
(g)G237A
(h)V234A、G237A
(i)A235E、G237A
(j)V234A、A235E、G237A
が施されているFc領域を有する抗原結合分子も適宜使用され得る。
(k)F241A
(l)D265A
(m)V264A
が施されているFc領域を有する抗原結合分子も適宜使用され得る。
(n)L235A、G237A、E318A
(o)L235E
(p)F234A、L235A
が施されているFc領域を有する抗原結合分子も適宜使用され得る。
を起源とするCD3結合ドメインが適宜使用され得る。CD3結合ドメインの起源となる抗CD3抗体は下記のとおり適宜ヒト化された抗体やヒト抗体が適宜用いられる。CD3を構成するγ鎖、δ鎖又はε鎖の構造は、そのポリヌクレオチド配列が、配列番号:14(NM_000073.2)、16(NM_000732.4)及び18(NM_000733.3)に、そのポリペプチド配列が、配列番号:15(NP_000064.1)、17(NP_000723.1)及び19(NP_000724.1)に記載されている(カッコ内はRefSeq登録番号を示す)。
本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス(アイソタイプ)が知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。
−膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
−免疫抗原を精製する必要が無い
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得る。
−グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
−AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体を所望の抗原発現細胞に接触させる工程、
(2)該抗原発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(3)該抗原発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
(1)哺乳類細胞、:CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Veroなど
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
−酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces)属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
−糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM (いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:20)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:21)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:22)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:23)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:24)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:25)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:26)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:27)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:22))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:23))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
(a)グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、
(b)リジン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含むものであればよく、その構造は限定されない。当該抗原結合分子は、これら2つの結合ドメインを含むことにより、(1)に記載の分子を発現する細胞による免疫応答を抑制する作用を阻害することで免疫応答を活性化し、癌細胞又は当該細胞を含む腫瘍組織に対して優れた細胞傷害作用を誘導することが可能となる。本発明の(1)及び(2)に記載の結合ドメインは、それぞれ、上述の免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子あるいは、T細胞受容体複合体に属する抗原から適宜選択することができる。これらの結合ドメインは、ペプチド結合で直接連結することもできるし、リンカーを介して結合することもできる。
例えば、(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメインとしてF(ab')2、(2)T細胞受容体複合体に結合するドメインとしてF(ab')2を用い、(3)FcRn結合ドメインとして、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメインを用いた場合に、(1)と(2)に記載された抗原結合ドメインと(3)に記載されたFc領域を含むドメインとをペプチド結合で直接連結したときは、連結されたポリペプチドは抗体の構造を形成する。そのような抗体を作製するためには前述のハイブリドーマの培養液から精製する他、当該抗体を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを安定に保持している所望の宿主細胞の培養液から当該抗体を精製することもできる。
本発明における非限定の一態様として、下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原を免疫動物に投与する工程(a)を含む、該免疫原に対する抗体の製造方法を提供する。
(b) 前記免疫動物から前記免疫原に対する抗体の遺伝子を単離する工程;
(c) 前記工程(b)で単離された遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程;及び
(d) 宿主細胞を培養し、該免疫原に対する抗体を回収する工程
をさらに含むと表現することもできる。
このことによって、特定の理論に拘束されることはないが、免疫動物の免疫寛容が抗原結合分子の投与によって抑制され、投与された所望の免疫原に感作されて、当該所望の免疫原に対する抗体を製造することができる。
なお、抗原結合分子と免疫原との投与を順次交互に繰り返し投与する操作がより好ましく、それぞれインターバルをおいて投与する操作がさらに好ましい。
また、繰り返し投与する操作の回数、インターバル(投与間隔)及び全投与期間は、例えば、マウスやラットでは、繰り返し投与する操作の回数は2回以上が好ましく、3回〜8回がより好ましく、このときの投与間隔は、3日以上間隔が好ましく、5日〜9日間隔がより好ましく、全投与期間は、3週間以上が好ましく、5週間以上がより好ましく、7週間〜11週間がさらに好ましい。
ここで、本発明において高い相同性とは、通常、アミノ酸配列において70%以上、75%以上、80%以上、85%以上の相同性、好ましくは90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上の相同性、さらに95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の相同性である。この相同性の決定は、Wilbur,W.J.及びLipman D.J.が記載したアルゴリズムに従えばよい(Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80,726−730)。
その他の一態様として、例えば、当業者公知の技術であるB細胞クローニングを用いて、免疫動物から当該免疫原に対する抗体の遺伝子を効率的に単離することも可能である(WO2011/147903, WO2004/051268, JPB4148367)。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原を免疫動物に投与する工程(a)、及び
該免疫動物から得られた免疫細胞とミエローマ細胞を融合する工程(b)を含む、該免疫原に対する抗体を産生するハイブリドーマの製造方法を提供する。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原を免疫動物に投与する工程(a)を含む、該免疫動物に対する免疫方法を提供する。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原を非ヒトである免疫動物に免疫する非治療的な工程(a)を含む、該免疫原に対する抗体の製造方法を提供する。
好ましくは、以下の工程(b)〜(d):
(b) 前記免疫動物から該免疫原に対する抗体の遺伝子を単離する工程;
(c) 前記工程(b)で単離された遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程;及び
(d) 宿主細胞を培養し、該免疫原に対する抗体を回収する工程
をさらに含む、該免疫原に対する抗体の製造方法を提供する。
さらに好ましくは、該免疫原に対する抗体が、マウス、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である、上記工程(a)〜(d)を含む、該免疫原に対する抗体の製造方法を提供する。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原を免疫動物に投与する工程によって得られる、該免疫原に対する抗体をコードする核酸分子を提供する。
さらには、以下の工程(a)〜(b):
(a) 上記核酸分子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程;及び
(b) 宿主細胞を培養し、該免疫原に対する抗体を回収する工程
を含む、該免疫原に対する抗体の製造方法を提供する。
さらに好ましくは、該免疫原に対する抗体が、マウス、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である、上記工程(a)〜(b)を含む、該免疫原に対する抗体の製造方法を提供する。
(a) 下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原が投与された免疫動物から単離された該免疫原に対する抗体の遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程; 及び
(b) 宿主細胞を培養し、該免疫原に対する抗体を回収する工程
を含む、該免疫原に対するマウス、キメラ、ヒト化又はヒト抗体の製造方法を提供する。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原が投与された免疫動物から単離された該免疫原に対する抗体の遺伝子を含む発現ベクターが導入された宿主細胞を培養し、該免疫原に対する抗体を回収する工程を含む、該免疫原に対するマウス、キメラ、ヒト化又はヒト抗体の製造方法を提供する。
本発明の非限定の一態様として、下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む、治療用ワクチンと併用するための医薬組成物を提供する。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子と併用するための医薬組成物を提供する。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む、予防用ワクチンと併用するための医薬組成物を提供する。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び治療用ワクチンを組み合わせてなる医薬組成物を提供する。
本態様において、好ましくは、該医薬組成物は配合剤である。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び治療用ワクチンの組み合わせを提供する。
本態様において、抗原結合分子と治療用ワクチンは別々に投与されてもよいし、同時又は順次に投与されてもよい。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び有効量の治療用ワクチンを投与することを含む、個体における、がんを治療する方法を提供する。
本態様において、抗原結合分子と治療用ワクチンは別々に投与されてもよいし、同時又は順次に投与されてもよい。
(A)下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物、
(B) 容器、並びに
(C) 個体におけるがんを治療するために、前記抗原結合分子と少なくとも一種の治療用ワクチンを組み合わせて個体に投与することを示す指示書又はラベル、を含むキットを提供する。
(A)治療用ワクチン、
(B) 容器、並びに
(C) 個体におけるがんを治療するために、前記治療用ワクチンと少なくとも一種の下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物を組み合わせて個体に投与することを示す指示書又はラベル、を含むキットを提供する。
(A)下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物、
(B) 容器、並びに
(C) 治療用ワクチン、
を含むキットを提供する。
本発明の非限定の一態様として、下記のドメイン;
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む、液性免疫応答増強剤又は免疫寛容抑制剤を提供する。
(1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む、免疫寛容が成立しやすいペプチド又はタンパク質に対する液性免疫応答増強剤又は免疫寛容抑制剤を提供する。
本発明の液性免疫応答増強剤又は免疫寛容抑制剤は、がん治療以外の用途(例えば、所望の免疫原に対する抗体を産生する用途、治療用ワクチンの効果を増強する用途)も有し得る。すなわち、本発明の一態様において、例えば、本発明の液性免疫応答増強剤又は免疫寛容抑制剤には、がん治療剤としての用途が除かれ、本発明の液性免疫応答増強方法又は免疫寛容抑制方法には、がん治療方法としての用途が除かれる場合がある。
さらに好ましくは、免疫寛容が成立しやすいペプチド又はタンパク質とは、癌細胞に発現している抗原又はその断片であり、より好ましくは、癌細胞特異的な抗原又はその断片が挙げられる。ここで、癌細胞特異的な抗原とは、がん細胞に多く発現し正常細胞には全く発現せず、又は発現していても少量であり、がん特異性を有する抗原をいう。
の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本発明に含まれることが当
業者には当然に理解される。
(1−1)免疫応答を抑制する機能を有する細胞を除去することによる液性免疫増強
上述の背景技術に記載の通り、癌免疫療法において、強い抗腫瘍効果を発揮するためには、癌細胞に対して特異的に傷害活性を有する細胞傷害性T細胞の誘導(細胞性免疫の誘導)および癌細胞を特異的に認識する抗体分子の誘導(液性免疫の誘導)の両方が必要である(非特許文献4)が、生体の抗体産生は、自己と非自己を厳密に区別し、自己に対する免疫応答は厳密に制御されているため、自己と極めて類似する癌細胞の表面抗原に対して、強い抗体産生を誘導することは困難である。
抗体の改良技術として、前述のADCC活性の増強や血中滞留性の延長、抗原に対する結合活性の向上、免疫原性リスクの低減が行われてきた。通常抗体は抗原の1つのエピトープを認識して結合することから、これらの改良技術を抗体に適用しても、ターゲットとなる抗原は1種類のみである。複数のターゲットを阻害する分子として、1分子で2種類以上の抗原と結合する抗体(Bispecific二重特異性抗体という)が研究されている。Bispecific二重特異性抗体は2種類以上の抗原と相互作用するため、2種類以上の抗原を1つの分子で中和する作用だけでなく、細胞傷害活性をもつ細胞と癌細胞をクロスリンク(架橋)することで抗腫瘍活性を高める作用がある。
(2−1)抗ヒトIL-6レセプター抗体、抗マウスCTLA4抗体、および抗keyhole limpet hemocyanin(KLH)抗体の作製
抗ヒトIL-6レセプター抗体(H237)を作製した。可変領域として重鎖可変領域H237(配列番号:50)および軽鎖可変領域L104(配列番号:51)を用い、定常領域は、野生型ヒト重鎖定常領域hIgG1(配列番号:52)および野生型ヒト軽鎖定常領域k0(配列番号:53)を使用した。
抗マウスCTLA4抗体(hUH02UL01-ADCC)を作製した。可変領域として重鎖可変領域hUH02(配列番号:54)および軽鎖可変領域hUL01(配列番号:55)を用い、定常領域は、Fcγ受容体への結合を増強する改変を加え、NK細胞によるADCC活性を増強させたマウス重鎖定常領域mFa55(配列番号:56)および野生型マウス軽鎖定常領域mk1(配列番号:57)を使用した。
抗KLH抗体(IC17Hdk-ADCC)を陰性コントロール抗体として作製した。可変領域として重鎖可変領域IC17Hdk(配列番号:64)および軽鎖可変領域IC17L(配列番号:65)を用い、定常領域は、Fcγ受容体への結合を増強する改変を加え、NK細胞によるADCC活性を増強させたマウス重鎖定常領域mFa55(配列番号:56)および野生型マウス軽鎖定常領域mk1(配列番号:57)を使用した。
以下の方法を用いて、抗ヒトIL-6レセプター抗体、抗マウスCTLA4抗体、および抗KLH抗体を発現させた。FreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で懸濁し、播種したヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)に対して、リポフェクション法により調製されたプラスミドを導入した。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2、90 rpm)で4日間培養した培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。分光光度計を用いて、精製した抗体溶液の280 nmでの吸光度を測定した。得られた測定値からPACE法により算出した吸光係数を用いて、精製した抗体の濃度を算出した(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
2-2-1. 抗ヒトGPC3/抗マウスCD3二重特異性抗体(陰性コントロール)の作製
抗ヒトGPC3抗体と抗マウスCD3抗体を組み合わせた、抗ヒトGPC3/抗マウスCD3二重特異性抗体を作製した。抗ヒトGPC3側の可変領域として、重鎖可変領域H0000(配列番号:58)および軽鎖可変領域GL4(配列番号:59)を用いた。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域mF18mN4(配列番号:60)および軽鎖定常領域mk1(配列番号:57)を使用した。また抗マウスCD3側の可変領域として、重鎖可変領域2C11VH(配列番号:61)および軽鎖可変領域2C11VL(配列番号:62)を用いた。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域mF18mP4(配列番号:63)、軽鎖定常領域mk1(配列番号:57)を使用した。
抗マウスCTLA4抗体と抗マウスCD3抗体を組み合わせた、抗マウスCTLA4/抗マウスCD3二重特異性抗体を作製した。抗マウスCTLA4側の可変領域として重鎖可変領域hUH02(配列番号:54)および軽鎖可変領域hUL01(配列番号:55)を用いた。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域mF18mN4(配列番号:60)、軽鎖定常領域mk1(配列番号:57)を使用した。また、抗マウスCD3側の可変領域として、重鎖可変領域2C11VH(配列番号:61)および軽鎖可変領域2C11VL(配列番号:62)を用いた。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域mF18mP4(配列番号:63)および軽鎖定常領域mk1(配列番号:57)を使用した。
抗KLH抗体と抗マウスCD3抗体を組み合わせた、抗KLH/抗マウスCD3二重特異性抗体を作製した。抗KLH側の可変領域として重鎖可変領域IC17Hdk(配列番号:64)および軽鎖可変領域IC17L(配列番号:65)を用いた。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域mF18mN4(配列番号:60)、軽鎖定常領域mk1(配列番号:57)を使用した。また、抗マウスCD3側の可変領域として、重鎖可変領域2C11VH(配列番号:61)および軽鎖可変領域2C11VL(配列番号:62)を用いた。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域mF18mP4(配列番号:63)および軽鎖定常領域mk1(配列番号:57)を使用した。
精製したそれぞれのホモ体は、表1の組み合わせで、定常領域の電荷の違いを利用した当業者公知の方法(WO2015/046467)で混合し、目的の二重特異性抗体を作製した。
(3−1)同系腫瘍株移植マウスモデルの作製
BALB/cAnNCrlCrljマウスおよびC57BL/6NCrlマウス、C3H/HeNマウスは日本チャールス・リバー(株)から購入した。
マウスへ自家移植する腫瘍細胞株として、CT26, Renca, MethA, B16/BL6, AE17, FM3Aを用いた。CT26, Renca, MethAについてはBALB/cマウスの皮下に、B16/BL6、AE17についてはC57BL/6Nマウスの皮下に、FM3AはC3H/HeNマウスの皮下に細胞を移植し、移植腫瘍の体積の平均が100 mm3から200 mm3程度になった時点でモデル成立とした。この時点で実施例2に記載のmCTLA4//mCD3, hUH02UL01-ADCCをそれぞれ100μg/mouse, 200μg/mouseの用量で投与し、投与後6日から15日のタイミングで採血を行い、ADA(抗薬物抗体)の産生を検証した。
マウス血漿中のmCTLA4//mCD3, hUH02UL01-ADCCに対するADA濃度は、抗体投与後7日から15日までの採血終了後にECL法によって測定された。まず、mCTLA4//mCD3, hUH02UL01-ADCCはそれぞれNHS-Biotin(Thermo)と反応しBiotinラベルされた。またmCTLA4//mCD3, hUH02UL01-ADCCはそれぞれSULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)と反応し、Ru(ruthenium)ラベルされた。ラベルされた各抗体は、BCA Protein Assay Kit(Thermo)を用いて濃度調整された。0.05% Tween20/PBS[pH7.4]で10倍に希釈されたmCTLA4//mCD3, hUH02UL01-ADCC投与後の各時点における血漿サンプル30μLあるいは各系統マウスから採取された抗体非投与の5匹分の血漿サンプルと、0.1%BSA(Roche)/0.05% Tween20/ PBS[pH7.4]で3μg/mLに調整されたBiotinラベルされたmCTLA4//mCD3, hUH02UL01-ADCCならびにRuラベルされたmCTLA4 //mCD3, hUH02UL01-ADCCは、それぞれ30μLずつ混合され室温で5分振盪された後、5℃で一晩保存された。0.5%BSA(Roche)/0.05% Tween20/PBS[pH7.4]で予め一晩ブロッキングされたECL Plate(4スポットplate、Meso Scale Discovery社)に前日混合したサンプルのうち30μLが添加され、2時間室温にて振盪された。ECL Plateから、添加されたサンプルが除去され、Read Buffer T(x2)試薬(Meso Scale Discovery社)100μLが各ウェルに添加された後、SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery社)を用いて発光シグナルが測定された。各マウス系統の抗体非投与マウス5匹の測定値の平均値にそれらの標準偏差(S.D.)を1.645倍した値を足した値を閾値とし、閾値より大きい値を示した測定ポイントをADA Positiveポイントとし、各個体において全測定ポイントの80%以上がPositiveである、もしくは測定最終ポイントが閾値の1.5倍以上の値を示す個体がADA産生した個体(ADA Positive個体)と判定された。表2にADA産生したと判定されたマウスの匹数を示した。
(4−1)マウスへの投与および採血
マウス(C57BL/6NCrl、日本チャールス・リバー(株))ならびにマウス(BALB/cAnNCrlCrlj、日本チャールス・リバー(株))各系統5匹ずつに、H237のみを投与、H237とmCTLA4//mCD3を同時に投与、あるいはH237とhGPC3//mCD3を同時に投与した後の、H237に対するADA(抗薬物抗体)産生が評価された。H237のみ、H237とmCTLA4//mCD3の混合溶液、あるいはH237とhGPC3//mCD3の混合溶液(それぞれ500μg/mLになるように0.05% Tween20/PBS[pH7.4]にて調製)が、それぞれ5mg/kgで尾静脈に10mL/kgで単回投与された。投与後1日後、3日後、7日後、14日後、21日後、28日後、35日後、42日後に血液が採取された。採取した血液を直ちに4℃、15,000 rpmで10分遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定が実施されるまで-40℃以下に設定された冷凍庫に保存された。
マウス血漿中のH237に対するADA濃度は、抗体投与後42日後までの採血終了後にECL法によって測定された。まず、H237はNHS-Biotin(Thermo)と反応しBiotinラベルされた。また、H237はSULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)と反応しRu(ruthenium)ラベルされた。ラベル化された各抗体は、BCA Protein Assay Kit(Thermo)を用いて濃度調整された。0.05% Tween20/PBS[pH7.4]で10倍に希釈されたH237投与後の各時点における血漿サンプル30μLあるいは各系統マウスから採取された抗体非投与の5匹分の血漿サンプルと、0.1%BSA(Roche)/0.05% Tween20/ PBS[pH7.4]で3μg/mLに調整されたBiotinラベルされたH237ならびにRuラベルされたH237は、それぞれ30μLずつ混合され室温で5分振盪された後、5℃で一晩保存された。0.5%BSA(Roche)/0.05% Tween20/PBS[pH7.4]で予め一晩ブロッキングされたECL Plate(4スポットplate、Meso Scale Discovery社)に、前日混合したサンプルのうち30μLが添加され、2時間室温にて振盪された。ECL Plateから、添加されたサンプルが除去され、Read Buffer T(x2)試薬(Meso Scale Discovery社)100μLが各ウェルに添加された後、SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery社)を用いて発光シグナルが測定された。各マウス系統の抗体非投与マウス5匹の測定値の平均値にそれらの標準偏差(S.D.)を1.645倍した値を足した値を閾値とし、閾値より大きい値を示した測定ポイントをADA Positiveポイントとし、各個体において全測定ポイントの80%以上がPositiveである、もしくは測定最終ポイントが閾値の1.5倍以上の値を示す個体がADA産生した個体(ADA Positive個体)と判定された。表3にADA産生したと判定されたマウスの匹数を示した。
〔実施例5〕ノーマルマウスにおける液性免疫増強による抗薬物抗体産生の評価
(5−1)マウスへの投与および採血
マウス(C57BL/6JCrl、日本チャールス・リバー(株))5匹に、H237のみを投与、もしくは実施例2で作成された以下の抗体との同時投与を行い、H237に対するADA(抗薬物抗体)産生が評価された。同時投与した抗体はhUH02UL01-ADCC、IC17Hdk-ADCC、mCTLA4//mCD3、KLH//mCD3の4検体である。
H237のみ、H237とhUH02UL01-ADCCの混合溶液、H237とIC17Hdk-ADCCの混合溶液、H237とmCTLA4//mCD3の混合溶液、あるいはH237とKLH//mCD3の混合溶液(H237は100μg/mLになるように、また同時投与した抗体はそれぞれ500μg/mLになるように0.05% Tween20/PBS[pH7.4]に混合して調製)が、H237は1mg/kgで同時投与抗体はそれぞれ5mg/kgで尾静脈に10mL/kgで単回投与された。投与から3日後、7日後、14日後に血液が採取された。採取した血液を直ちに4℃、15,000 rpmで10分遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定が実施されるまで-40℃以下に設定された冷凍庫に保存された。
マウス血漿中のH237に対するADA濃度は、抗体投与後14日後までの採血終了後にECL法によって測定された。まず、H237はNHS-Biotin(Thermo)と反応しBiotinラベルされた。また、H237はSULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)と反応しRu(ruthenium)ラベルされた。ラベル化された各抗体は、BCA Protein Assay Kit(Thermo)を用いて濃度調整された。0.05% Tween20/PBS[pH7.4]で10倍に希釈されたH237投与後の各時点における血漿サンプル30μLあるいは各系統マウスから採取された抗体非投与の5匹分の血漿サンプルと、0.1%BSA(Roche)/0.05% Tween20/ PBS[pH7.4]で3μg/mLに調整されたBiotinラベルされたH237ならびにRuラベルされたH237は、それぞれ30μLずつ混合され室温で5分振盪された後、5℃で一晩保存された。0.5%BSA(Roche)/0.05% Tween20/PBS[pH7.4]で予め一晩ブロッキングされたECL Plate(4スポットplate、Meso Scale Discovery社)に、前日混合したサンプルのうち30μLが添加され、2時間室温にて振盪された。ECL Plateから、添加されたサンプルが除去され、Read Buffer T(x2)試薬(Meso Scale Discovery社)100μLが各ウェルに添加された後、SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery社)を用いて発光シグナルが測定された。各マウス系統の抗体非投与マウス5匹の測定値の平均値にそれらの標準偏差(S.D.)を1.645倍した値を足した値を閾値とし、閾値より大きい値を示した測定ポイントをADA Positiveポイントとし、各個体において全測定ポイントの80%以上がPositiveである、もしくは測定最終ポイントが閾値の1.5倍以上の値を示す個体がADA産生した個体(ADA Positive個体)と判定された。表4にADA産生したと判定されたマウスの匹数を示した。
すなわち、マウスCTLA4/マウスCD3二重特異性抗体の投与により制御性T細胞を傷害し、液性免疫をより強く誘導できることが示された。このことから、マウスCTLA4/マウスCD3二重特異性抗体は、(1以上の免疫原を含む)治療用ワクチンと併用することによって当該ワクチンの効果を高める医薬組成物の有効成分としても有用であると言える。
(1−1)制御性T細胞を除去することによる抗CTLA4抗体の抗腫瘍効果
上述の背景技術に記載の通り、イピリムマブはエフェクターT細胞表面に発現するCTLA4によるエフェクターT細胞の活性化抑制を阻害することで抗腫瘍効果が発揮されていると考えられていたが、最近、CTLA4発現T細胞に対する抗体依存的細胞傷害活性(ADCC活性)も重要であることが報告され、腫瘍中の制御性T細胞の除去とADCC活性が抗CTLA4抗体の抗腫瘍効果の重要な作用機序であることが見出されている。
抗体の改良技術として、前述のADCC活性の増強や血中滞留性の延長、抗原に対する結合活性の向上、免疫原性リスクの低減が行われてきた。通常抗体は抗原の1つのエピトープを認識して結合することから、これらの改良技術を抗体に適用しても、ターゲットとなる抗原は1種類のみである。複数のターゲットを阻害する分子として、1分子で2種類以上の抗原と結合する抗体(二重特異性抗体という)が研究されている。二重特異性抗体は2種類以上の抗原と相互作用するため、2種類以上の抗原を1つの分子で中和する作用だけでなく、細胞傷害活性をもつ細胞と癌細胞をクロスリンク(架橋)することで抗腫瘍活性を高める作用がある。
(2−1)マウスCTLA4に特異的に結合するADCC活性増強抗体(hUH02hUL01-mFa55)の発現と精製
抗マウスCTLA4抗体hUH02hUL01の可変領域(重鎖可変領域UH02は配列番号:28、軽鎖可変領域UL01は配列番号:29)をコードする遺伝子を、それぞれマウスIgG2a/kappaの動物発現用プラスミドへ挿入した。このとき、定常領域はマウスFcγRへの結合を増強するような改変を加えた定常領域を使用している(重鎖定常領域mFa55は配列番号:30、軽鎖定常領域mk1は配列番号:31)。
参考実施例2−1に記載の方法で精製、調製した抗マウスCTLA4抗体hUH02hUL01-mFa55およびコントロール抗体hUH02hUL01-mIgG2a(重鎖可変領域UH02は配列番号:28、軽鎖可変領域UL01は配列番号:29、重鎖定常領域mIgG2aは配列番号:32、軽鎖定常領域mk1は配列番号:31)について、Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、各種マウスFcgR(mFcgRI、II、III、IV)との抗原抗体反応を解析した。ランニングバッファーとして、20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.4を用い、25 ℃で測定した。センサーチップCM7上にアミンカップリングによりProtein A/Gを固定化し、hUH02hUL01-mFa55をキャプチャーした後、FcgRをアナライトとして120秒間相互作用させ、その結合量の変化を観察した。hUH02hUL01-mFa55の希釈には、ランニングバッファーを使用した。測定結果は、Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)を用い、カーブフィッティングによる解析により、結合速度定数ka (1/Ms)及び解離速度定数kd (1/s)を算出し、その値を元に解離定数KD (M)を算出した。測定結果を表5に示した。
参考実施例2−1に記載の方法で精製、調製された抗マウスCTLA4抗体hUH02hUL01-mFa55が、マウスCTLA4発現細胞(マウスCTLA4発現細胞は、CHO細胞に対して全長マウスCTLA4遺伝子を導入することで当業者公知の方法で作成された)に対してADCC活性が発現するかを、参考実施例11の方法に従って検証した。測定の結果、抗体濃度依存的なADCC活性が認められた(図5)。
(3−1)マウスCTLA4およびマウスCD3に特異的に結合する二重特異性抗体の発現と精製
抗マウスCTLA4抗体hUH02hUL01の可変領域(重鎖可変領域UH02は配列番号:28、軽鎖可変領域UL01は配列番号:29)をコードする遺伝子を、それぞれヒトIgG1/kappaの動物発現用プラスミドへ挿入した。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた定常領域を使用している(重鎖定常領域F760nN17は配列番号:33、軽鎖定常領域k0は配列番号:34)。
参考実施例3−1に記載の方法で精製、調製した抗マウスCTLA4/抗マウスCD3二重特異性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)は、Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、各抗原(mCTLA4及びmCD3)との抗原抗体反応を解析した。ランニングバッファーとしてHBS-EP+、pH7.4を用い、37 ℃で測定した。センサーチップCM4上にアミンカップリングによりProteinA/Gを固定化し、hUH02UL01/2C11-F760をキャプチャーした後、抗原(マウスCTLA4もしくはマウスCD3)をアナライトとして相互作用させ(マウスCTLA4は120秒間、マウスCD3は90秒間)、その結合量の変化を観察した。hUH02UL01/2C11-F760の希釈にはランニングバッファーを使用した。測定結果は、Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)を用い、カーブフィッティングによる解析により、結合速度定数ka (1/Ms)及び解離速度定数kd (1/s)を算出し、その値を元に解離定数KD (M)を算出した。結果を表6に示した。
参考実施例3−1に記載の方法で精製、調製した抗マウスCTLA4/抗マウスCD3二重特異性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)がマウスCTLA4発現細胞株に対して細胞傷害活性が発現するかを、参考実施例12の方法に従って検証した。測定の結果、抗体濃度依存的な細胞傷害活性が認められた(図6)。
抗CTLA4/抗CD3二重特異性抗体により制御性T細胞(CTLA4およびCD3が発現している)とエフェクターT細胞(CD3が発現している)の表面抗原が認識されて両細胞間の架橋が起こりうるかを、理化学的な実験によって検証した。
参考実施例2−1に記載の方法で精製、調製した抗マウスCTLA4抗体hUH02hUL01-mFa55および参考実施例3−1に記載の方法で精製、調製した抗マウスCTLA4/抗マウスCD3二重特異性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)がマウス大腸癌細胞株に対してin vivoで薬効を示すかを検証した。マウス大腸癌細胞株CT26.WT(ATCC)1 x 106個を、BALB/cマウス(日本チャールスリバー)の右側腹部皮下に移植し、固形腫瘍を形成させた。移植後10日目に、hUH02hUL01-mFa55を200 μg/マウス、hUH02UL01/2C11-F760を100 μg/マウスの投与量で、腫瘍内(i.t.)へ投与した(各群n=2)。その結果、hUH02UL01/2C11-F760はhUH02hUL01-mFa55よりも強い抗腫瘍効果を示し、hUH02UL01/2C11-F760はin vivoにおいて顕著な抗腫瘍作用を示すことが明らかとなった(図8)。つまり、制御性T細胞(CTLA4およびCD3が発現している)とエフェクターT細胞(CD3が発現している)の表面抗原を認識し、両細胞間の架橋が生体内で起こりうることが示唆された。
参考実施例3−1に記載の方法で精製、調製した抗マウスCTLA4/抗マウスCD3二重特異性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)が、参考実施例5に記載したマウス大腸癌細胞株CT26.WT移植モデルに対して、静脈内投与(i.v.)でも薬効を示すかを検証した。CT26.WT(ATCC)1 x 106個を、BALB/cマウス(日本チャールスリバー)の右側腹部皮下に移植し、固形腫瘍を形成させた。移植後8日目に、hUH02UL01/2C11-F760を100 μg/マウスの投与量で、腫瘍内(i.t.)あるいは静脈内(i.v.)へ投与した(各群n=5)。その結果、腫瘍内及び静脈内投与共に同等の抗腫瘍効果を示し、hUH02UL01/2C11-F760はin vivoにおいて局所投与、全身投与に関わらず抗腫瘍作用を示すことが明らかとなった(図9)。
(7−1)ヒトCTLA4およびヒトCD3に特異的に結合する二重特異性抗体の発現と精製
抗ヒトCTLA4抗体MDX10-F760nN17の可変領域(重鎖可変領域MDX10Hは配列番号:38、軽鎖可変領域MDX10Lは配列番号:39)をコードする遺伝子を、それぞれヒトIgG1/kappaの動物発現用プラスミドへ挿入した。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた定常領域を使用している(重鎖定常領域F760nN17は配列番号:33、軽鎖定常領域k0は配列番号:34)。
健常人ドナー2名に対しヘパリン採血を行い、それぞれの血液を5%FBS (Moregate BioTech) を含むHBSS (GIBCO) にて希釈した後、Ficoll-Paque Plus (GE healthcare) に重層した。400 x gで30分間遠心分離し、末梢血単核球 (PBMC) 画分を分離した。得られたPBMCを10%FBS、100 Units/mL penicillin-100 μg/mL Streptomycin (GIBCO) を含むRPMI 1640 (Nacalai Tesque) 培地にて5 x 105細胞/ウェルとなるよう96 well round bottom plate (Corning) に播種した。
7日後に細胞をV bottom plate (Corning) に移し、400 x gで5分間遠心分離し、上清を除去した。1%FBS、2 mM EDTA (Sigma) を含むPBS(FACS buffer)で10倍希釈したFcR blocking reagent(Miltenyi Biotec)100μLにて、細胞を再懸濁した。10分間室温でインキュベートした後、PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4(BD Pharmingen)を2.5μL、PE Mouse Anti-Human CD25(BD Pharmingen)を5μL、PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD45RA(BD Pharmingen)を2.5μL各ウェルに加えた。4℃で1時間インキュベートした後、100μLのFACS bufferを加え、400 x gで5分間遠心分離し上清を除去した。
免疫応答を抑制する機能を有する細胞のうち、CD25およびCD45RAの発現に基づいて計算されたCD4陽性T細胞中の制御性T細胞(Treg)、すなわちCD4+ CD25high CD45RA- の細胞画分は、免疫応答抑制機能が高いと報告されている(Immunity, 2009, 30 (6), 899-911)。この情報に基づいて、CD4陽性細胞の中で、CD25high CD45RA-の細胞画分で有意に発現の高い細胞表面分子をコードする遺伝子を、RNA-seqを用いて同定した。 その結果、免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現する分子であるCTLA4、PD1、TIM3、LAG3、CD244 (2B4)、CD160、GARP、OX40、CD137 (4-1BB)、CD25、VISTA、BTLA、TNFR25、CD57、KLRG1、CCR2、CCR5、CCR6、CD39、CD73、CD4、CD18、CD49b、CD1d、CD5、CD21、TIM1、CD19、CD20、CD23、CD24、CD38、CD93、IgM、B220(CD45R)、CD317、PD-L1、CD11b、Ly6G、ICAM-1、FAP、PDGFR、 PodoplaninおよびTIGIT の分子のうち、CTLA4, TIM3, LAG3, CD137(4-1BB), CD25, CCR5, CCR6, CD38, 及びTIGITの9つの分子が、免疫応答抑制機能が高いと報告されている細胞画分(CD4+, CD25high, CD45RA-)で特異的に発現の高い細胞表面分子であることが判明した。
(9−1)ヒトLAG3およびヒトCD3に特異的に結合する二重特異性抗体の発現と精製
抗ヒトLAG3抗体25F7-F760nN17の可変領域(重鎖可変領域25F7Hは配列番号:46、軽鎖可変領域25F7Lは配列番号:47)をコードする遺伝子を、それぞれヒトIgG1/kappaの動物発現用プラスミドへ挿入した。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた定常領域を使用している(重鎖定常領域F760nN17は配列番号:33、軽鎖定常領域k0は配列番号:34)。
健常人ドナーに対しヘパリン採血を行い、それぞれの血液をPBSにて希釈した後、Leucosep チューブ(greiner bio-one)を用いてFicoll-Paque Plus (GE healthcare) と共に重層した。1000x gで10分間遠心分離し、末梢血単核球 (PBMC) 画分を分離した。得られたPBMCを10%FBS、100 Units/mL penicillin-100 μg/mL Streptomycin (GIBCO) を含むRPMI 1640 (Nacalai Tesque) 培地にて1 x 106細胞/ウェルとなるよう96 well round bottom plate (Corning) に播種した。
TRAB(25F7//TR01H113)を最終濃度1 μg/mL、10 μg/mLとなるように培地で希釈し、ウェルに添加した。37℃、5%CO2に設定したCO2インキュベーターにて、4日間または6日間培養した。
4日後または6日後に細胞をFACS解析用チューブに移し、400 x gで5分間遠心分離し、上清を除去した。0.2% BSA (Wako) を含むCell WASH (BD Biosciences)を用意し、これをFACS Bufferとした。培地成分を完全に取り除くために、上清を除去した細胞にFACS Bufferを2mL加え、再度400 x gで5分間遠心分離し、上清を除去して洗浄を行った。
FcR blocking reagent(Miltenyi Biotec)をFACS Bufferで10倍希釈し、そこに1/1000 volumeの死細胞染色用のeFluor780(eBioscience)を加えたものを用意し、これをStaining Bufferとした。Staining buffer 50μLにPerCP Mouse Anti-Human CD4 (BD Pharmingen)を5μL 、PE-CyTM7 Mouse Anti-Human CD45RA (BD Pharmingen)を2.5μL、PE Mouse Anti-Human CD25を5μL加えたものを各チューブに加え、4℃で1時間インキュベートした後、2mLのFACS bufferを加え、400 x gで5分間遠心分離し上清を除去した後、洗浄操作として更に2mLのFACS bufferを加え、400 x gで5分間遠心分離し上清を除去した。400μLのFACS bufferで再懸濁し、FACSVerseTM フローサイトメーター(BD)で解析を行った。
FACSDiva Software (BD) にて発現解析を行った。死細胞を除いた解析対象となる細胞集団からCD4陽性細胞をゲーティングし、CD25およびCD45RAの発現を解析した。CD25high CD45RA-の画分、CD25-CD45RA+の画分をそれぞれ制御性T細胞(Regulatory T cell (Treg) )、エフェクターT細胞(Effector T cell (Teff)) とした。CD4陽性細胞中のTregおよびTeffの存在比率からTeff/Treg比を算出した。
CD25およびCD45RAの発現に基づいてCD4陽性細胞を解析した結果を示した(図13)。TRAB(25F7//TR01H113) 1 μg/mL、10 μg/mL処理により、4日後、6日後ともに、TRAB抗体の用量依存的にTregの減少が認められた(図14)。また、TRAB(25F7//TR01H113) 1 μg/mL、および10 μg/mL処理は、Teff/Treg比を増加させた (図15)。
(10−1)ヒトOX40およびヒトCD3に特異的に結合する二重特異性抗体の発現と精製
抗ヒトOX40抗体12H3-F760nN17の可変領域(重鎖可変領域12H3VHは配列番号:48、軽鎖可変領域12H3VLは配列番号:49)をコードする遺伝子を、それぞれヒトIgG1/kappaの動物発現用プラスミドへ挿入した。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた定常領域を使用している(重鎖定常領域F760nN17は配列番号:33、軽鎖定常領域k0は配列番号:34)。
2名の健常人ドナーに対しヘパリン採血を行い、それぞれの血液をPBSにて希釈した後、Leucosep チューブ(greiner bio-one)を用いてFicoll-Paque Plus (GE healthcare) と共に重層した。1000x gで10分間遠心分離し、末梢血単核球 (PBMC) 画分を分離した。得られたPBMCを10%FBS、100 Units/mL penicillin-100 μg/mL Streptomycin (GIBCO) を含むRPMI 1640 (Nacalai Tesque) 培地にて1 x 106細胞/ウェルとなるよう96 well round bottom plate (Corning) に播種した。
TRAB(12H3//TR01H113)を最終濃度1 μg/mL、10 μg/mLとなるように培地で希釈し、ウェルに添加した。37℃、5%CO2に設定したCO2インキュベーターにて、7日間培養した。
7日後に細胞をFACS解析用チューブに移し、400 x gで5分間遠心分離し、上清を除去した。0.2% BSA (Wako) を含むCell WASH (BD Biosciences)を用意し、これをFACS Bufferとした。培地成分を完全に取り除くために、上清を除去した細胞にFACS Bufferを2mL加え、再度400 x gで5分間遠心分離し、上清を除去して洗浄を行った。
FcR blocking reagent(Miltenyi Biotec)をFACS Bufferで10倍希釈し、そこに1/1000 volumeの死細胞染色用のeFluor780(eBioscience)を加えたものを用意し、これをStaining Bufferとした。Staining buffer 50μLにPerCP Mouse Anti-Human CD4 (BD Pharmingen)を5μL 、PE-CyTM7 Mouse Anti-Human CD45RA (BD Pharmingen)を2.5μL、PE Mouse Anti-Human CD25を5μL加えたものを各チューブに加え、4℃で1時間インキュベートした後、2mLのFACS bufferを加え、400 x gで5分間遠心分離し上清を除去した後、洗浄操作として更に2mLのFACS bufferを加え、400 x gで5分間遠心分離し上清を除去した。400μLのFACS bufferで再懸濁し、FACSVerseTM フローサイトメーター(BD)で解析を行った。
FACSDiva Software (BD) にて発現解析を行った。死細胞を除いた解析対象となる細胞集団からCD4陽性細胞をゲーティングし、CD25およびCD45RAの発現を解析した。CD25high CD45RA-の画分、CD25-CD45RA+の画分をそれぞれ制御性T細胞(Regulatory T cell (Treg) )、エフェクターT細胞(Effector T cell (Teff)) とした。CD4陽性細胞中のTregおよびTeffの存在比率からTeff/Treg比を算出した。
CD25およびCD45RAの発現に基づいてCD4陽性細胞を解析した結果を示した(図16)。双方のドナー由来のPBMCにおいて、TRAB(12H3//TR01H113) 1 μg/mL、10 μg/mL処理により、TRAB抗体の用量依存的にTregの減少が認められた(図17)。また、TRAB(12H3//TR01H113) 1 μg/mL、および10 μg/mL処理は、Teff/Treg比を増加させた (図18)。
抗マウスCTLA4抗体について、以下の方法に従い、マウスFcgR4発現ヒトNK細胞株NK-92(以下、mFcgR4-NK92と指称する。)をエフェクター細胞として用いて被検抗体の抗体濃度依存的なADCC活性を測定した。
mFcgR4-NK92を、10%FBSを含むRPMI-1640(nacalai tesque)(以下10%FBS/RPMIと称する)によって洗浄した後、当該細胞が10%FBS/RPMI中にその細胞密度が4x105 細胞/mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液をmFcgR4-NK92溶液として以後の実験に供した。
CHO細胞にマウスCTLA4を強制発現させたCHO/マウスCTLA4 2x106 細胞に3.7MBqのCr-51を加えた。Cr-51を加えた細胞を5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で1時間インキュベートした後、10%FBS/RPMIで3回細胞を洗浄し、当該細胞が10%FBS/RPMI中にその細胞密度が2x105 細胞/mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液を標的細胞として以後の実験に供した。
ADCC活性をクロムリリース法による特異的クロム遊離率にて評価した。まず、各濃度(0、0.04、0.4、4、40 μg/ml)に調製した抗体溶液を96ウェルU底プレートの各ウェル中に50μlずつ添加した。次に、(2)で調製した標的細胞を50μlずつ播種した(1x104 細胞/ウェル)。さらに、10%FBS/RPMIを50μlずつ添加し、室温にて15分間静置した。各ウェル中に(1)で調製したmFcgR4-NK92溶液各50μl(2x104 細胞/ウェル)を加えた当該プレートを、5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で4時間静置した後に、遠心操作した。当該プレートの各ウェル中の100μlの培養上清の放射活性をガンマカウンターを用いて測定した。下式に基づいて特異的クロム遊離率を求めた。
クロム遊離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
上式において、Aは各ウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。また、Bは標的細胞に50μlの4% NP-40水溶液(Nonidet P-40、ナカライテスク)および100μlの10% FBS/RPMIを添加したウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。さらに、Cは標的細胞に150μlの10% FBS/RPMIを添加したウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。試験はduplicateにて実施し、被検抗体の特異的クロム遊離率(%)の平均値を算出した。
抗マウスCTLA4/抗マウスCD3二重特異性抗体 (hUH02UL01/2C11-F760)について、以下の方法に従い、マウス脾臓細胞をエフェクター細胞として用いて被検抗体の抗体濃度依存的な細胞傷害活性を測定した。
BALB/cマウスより摘出した脾臓に10%FBS/RPMIを10mL加え細切化した。セルストレイナーを通し、遠心分離(2,150 rpm、10分間、室温)の後、Mouse Erythrocyte Lysing Kit(R&D Systems)で溶血操作を行った。10%FBS/RPMIで1回洗浄した後、当該細胞が10%FBS/RPMI中にその細胞密度が6x106 細胞/mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液をマウス脾臓細胞溶液として以後の実験に供した。
細胞傷害活性は、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザー(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いた細胞増殖抑制率で評価した。標的細胞には、CHOにマウスCTLA4を強制発現させたCHO/mCTLA4を用いた。当該細胞を10%FBSを含むCHO-S-SFM II (Life technologies)で懸濁し、5×103 細胞/ウェルとなるようにE-Plate 96プレート(ロシュ・ダイアグノスティックス社)に100μl播き、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを用いて生細胞の測定を開始した。翌日xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーからプレートを取り出し、当該プレートに各濃度(0.04、0.4、4、40 μg/ml)に調製した各抗体50μlを添加した。室温にて15分間静置した後に(1)で調製したマウス脾臓細胞溶液50μl(3×105 細胞/ウェル)を加え、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーに当該プレートを再セットすることによって、生細胞の測定を開始した。反応は5%炭酸ガス、37℃インキュベータ中において行い、マウス脾臓細胞溶液添加72時間後のCell Index値から、下式により細胞増殖抑制率(%)を求めた。なお、計算に用いたCell Index値には、抗体添加直前のCell Index値が1となるようにノーマライズした後の数値を用いた。
細胞増殖抑制率(%)= (A-B)×100/(A-1)
Aは抗体を添加していないウェルにおけるCell Index値の平均値(標的細胞とヒトPBMCのみ)、Bは各ウェルにおけるCell Index値の平均値を示す。試験はduplicateにて実施した。
Claims (12)
- 下記のドメイン;
(1)CTLA4に結合するドメイン、及び
(2)CD3に結合するドメイン
を含む抗原結合分子、及び該抗原結合分子が結合する抗原とは異なる免疫原を免疫動物(ヒトを除く)に投与する工程を含む、該免疫原に対する抗体の製造方法。 - 前記免疫動物から単離された前記免疫原に対する抗体の遺伝子を含む発現ベクターを導入された宿主細胞を培養し、該免疫原に対する抗体を回収する工程をさらに含む、請求項1に記載の抗体の製造方法。
- 前記免疫原に対する抗体が、マウス、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である、請求項1又は2に記載の抗体の製造方法。
- 前記抗原結合分子がFcRn結合ドメインをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体の製造方法。
- 下記のドメイン;
(1)CTLA4に結合するドメイン、及び
(2)CD3に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む、治療用ワクチンと併用するための医薬組成物。 - 前記抗原結合分子がFcRn結合ドメインをさらに含む、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している抗体のFc領域である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記治療用ワクチンが、癌細胞特異的な抗原を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 下記のドメイン;
(1)CTLA4に結合するドメイン、及び
(2)CD3に結合するドメイン
を含む抗原結合分子を有効成分として含む、液性免疫応答増強剤。 - 前記抗原結合分子がFcRn結合ドメインをさらに含む、請求項9に記載の液性免疫応答増強剤。
- 前記FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している抗体のFc領域である、請求項10に記載の液性免疫応答増強剤。
- 癌細胞特異的な抗原に対する液性免疫応答を増強することを特徴とする、請求項9〜11のいずれか一項に記載の液性免疫応答増強剤。
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