ES2900898T3

ES2900898T3 - Anticuerpos biespecíficos inmunoactivadores

Info

Publication number: ES2900898T3
Application number: ES15776419T
Authority: ES
Inventors: Tomoyuki Igawa; Taro Miyazaki; Kenji Taniguchi; Naoka Hironiwa
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2035-04-07
Also published as: CN118440206A; RU2016143383A3; US11485790B2; JP7015819B2; AU2015244814A1; TW201613965A; KR102568808B1; NZ724710A; WO2015156268A1; EP3130606B1; MY194892A; BR112016022912A2; RU2016143383A; TWI726842B; MX2016012552A; PL3130606T3; IL247715A0; CA2943943C; AU2015244814B2; KR20160142332A

Abstract

Anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad, que comprende: (1) un dominio Fab de unión a antígeno específico de cáncer, (2) un dominio Fab de unión a superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), que es un dominio Fab de unión a CD137 o un dominio Fab de unión a CD40, y (3) un dominio de unión a FcRn que es una región Fc de anticuerpo que presentan una actividad reducida de unión a receptor de Fcγ, en el que el anticuerpo biespecífico presenta una actividad agonista contra un receptor del factor de necrosis tumoral (TNF).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos biespecíficos inmunoactivadores

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad para la utilización en el tratamiento del cáncer, tal como se especifica en las reivindicaciones.

Antecedentes de la técnica

El cáncer es una de las causas principales de muerte en todo el mundo. Con la excepción de determinados carcinomas, el cáncer con frecuencia es inoperable en el momento en que se encuentra y el resultado del tratamiento con agentes quimioterapéuticos, que es el principal método terapéutico, no es necesariamente bueno. La heterogeneidad de las células de cáncer de por sí no es el único factor que dificulta el tratamiento del cáncer: se ha sugerido que el microambiente tumoral desempeña un papel importante (documento no de patente n° 1). Recientemente, se ha propuesto la posibilidad de curar el melanoma maligno no resecable y similares con un anticuerpo anti-CTLA-4 que atenúa las células T supresoras (documento no de patente n° 2). Lo anterior sugiere que la inmunoestimulación tumoral podría formar la base para el diseño de nuevas estrategias de tratamiento del cáncer.

Se entiende que las células T, que presentan importantes funciones en la inmunidad tumoral, resultan activadas por dos señales: 1) la unión de un receptor de células T (RCT) a un péptido antigénico presentado por moléculas de complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I y la activación del RCT, y 2) la unión de un coestimulador sobre la superficie de las células T a los ligandos en las células presentadoras de antígenos y la activación del coestimulador. Además, la activación de moléculas pertenecientes a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) y la superfamilia de receptores de TNF, tales como CD137(4-1BB) sobre la superficie de las células T, se ha descrito que resulta importante para la activación de las células T (documento no de patente n° 3).

Moléculas tales como CD137, CD137L, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, RANK, RANKL, CD30, CD153, GITR y GITRL están incluidas en la superfamilia de TNF y en la superfamilia de receptores de TNF. Se ha informado de que CD137 se expresa no sólo sobre la superficie de las células T, sino también sobre la superficie de otras células inmunitarias, tales como las células dendríticas (CD), células B, células NK y neutrófilos (documento no de patente n° 4).

Ya se ha demostrado que los anticuerpos agonistas de CD137 muestran efectos antitumorales, y ello se ha demostrado experimentalmente que se debe principalmente a la activación de las células T positivas para CD8 y de las células NK (documento no de patente n° 5). Sin embargo, los efectos secundarios debidos a hepatotoxicidad no específica de los anticuerpos agonistas de CD137 ha sido un problema clínico y no clínico, y el desarrollo de agentes farmacéuticos no ha avanzado (documentos no de patente n° 6 y n° 7) La causa principal de los efectos secundarios se ha sugerido que implica la unión al receptor de Fcy mediante la región constante de anticuerpo (documento no de patente n° 8). Además, se ha informado de que, para que los anticuerpos agonistas con diana en receptores que pertenecen a la superfamilia de receptores de TNF ejerzan una actividad agonista in vivo, resulta necesario el entrecruzamiento de anticuerpos por células expresantes de receptor de Fcy (células expresantes de FcyRII) Más específicamente, los efectos medicinales de los anticuerpos agonistas de CD137, que son efectos antitumorales, y los efectos secundarios, incluyendo la hepatotoxicidad, implican ambos la unión de los anticuerpos a los receptores de Fcy. Por lo tanto, en el caso de que se potencie la unión de los anticuerpos a receptores de Fcy, se esperaría que mejorasen los efectos medicinales, aunque también se incrementarían los efectos secundarios hepatotóxicos, y en el caso de que se redujese la unión de los anticuerpos a receptores de Fcy, se reducirían los efectos secundarios pero también resultarían reducidos los efectos medicinales, y hasta el momento no se ha informado de anticuerpos agonistas de CD137 cuyos efectos medicinales estén separados de los efectos secundarios. Además, los efectos antitumorales de los anticuerpos agonistas de CD137 de por sí no son fuertes en absoluto, y resultaría deseable evitar la toxicidad y simultáneamente incrementar los efectos medicinales adicionalmente.

Los anticuerpos biespecíficos se caracterizan porque presentan por lo menos dos dominios de unión, y su morfología molecular ya es bien conocida por el experto en la materia. Entre ellas, también se han construido moléculas en las que uno de los dos dominios de unión se une específicamente a un antígeno de superficie del cáncer y el segundo dominio de unión se une al antígeno CD3 de superficie celular (documento no de patente n° 10). Se ha mostrado que dichos anticuerpos monocatenarios biespecíficos ejercen un efecto antitumoral mediante la activación de las células T de una manera dependiente de los antígenos del cáncer.

El glipicán 3 (GPC3) es una proteína que pertenece a la familia del glipicán, es decir, un grupo de proteoglicanos de sulfato de heparán que se unen a la superficie celular mediante glucosilfosfatidilinositol (documento no de patente n° 11). Los glipicanos desempeñan un papel importante en la proliferación, diferenciación y migración celular. El GPC3 se expresa en 70% o más de los tejidos de hepatoma obtenidos mediante extirpación quirúrgica o biopsia, y se expresa poco o nada en lesiones hepáticas no neoplásicas vecinas y en la mayoría de tejidos adultos (documentos no de patente n° 12 y n° 13). Además, los pacientes con un nivel elevado de expresión de GPC3 en el tejido de hepatoma se ha informado de que presentan un mal pronóstico (documento no de patente n° 14) y se considera que GPC3 es una molécula diana prometedora para el hepatoma.

El documento n° WO 2011/039126 A1 da a conocer anticuerpos agonistas biespecíficos del receptor de muerte. Müller et al. (2008) J. Immunother., 31(8):714-722 dan a conocer un anticuerpo de unión al antígeno de cáncer FAP fusionado con el ligando de proteína natural 4-BBL.

Documento de la técnica anterior

Documentos no de patente

Documento no de patente n° 1. Hanahan, Cell, 2011, 144, 646-74.

Documento no de patente n° 2. Prieto, Clin Cancer Res. 2012, 18, 2039-47.

Documento no de patente n° 3. Summers, Nat. Rev. Immunol., 2012, 12, 339-51.

Documento no de patente n° 4. Vinay, Cell Biol Int., 2009, 33, 453-65.

Documento no de patente n° 5. Houot, Blood, 2009, 114, 3431-8.

Documento no de patente n° 6. Ascierto, Semin Oncol., 2010, 37, 508-16.

Documento no de patente n° 7. Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 59, 1223-33.

Documento no de patente n° 8. Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22.

Documento no de patente n° 9. Li, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013, 110(48), 19501-6.

Documento no de patente n° 10. Brandl, Cancer Immunol. Immunother., 2007, 56, 1551-63.

Documento no de patente n° 11. Filmus, J. Clin. Invest., 2001, 108, 497-501.

Documento no de patente n° 12. Zhu-Zu-W, Gut, 2001, 48, 558-564

Documento no de patente n° 13. Yamauchi, Mod. Pathol., 2005, 18, 1591-1598.

Documento no de patente n° 14. Yorita, Liver Int., 2010, 1, 120-131

Descripción resumida de la invención

Problemas que debe resolver la invención

La presente invención se llevó a cabo en vista de las circunstancias anteriormente indicadas. Un objetivo de la presente invención es proporcionar moléculas de unión a antígeno que presenten una actividad agonista contra la superfamilia de TFN o la superfamilia de receptores de TNF, que eviten la toxicidad, activando simultáneamente las células inmunitarias y que muestren un excelente efecto antitumoral. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden la molécula de unión a antígeno como un ingrediente activo o usos para el tratamiento del cáncer utilizando la composición farmacéutica.

Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores han encontrado que, aunque las moléculas de unión a antígeno que presentan únicamente el dominio de unión o únicamente el dominio de unión a la superfamilia de receptores de TNF, no presentan un efecto activador de las células inmunitarias, las moléculas de unión a antígeno que presentan un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y un dominio de unión a la superfamilia de TNF o un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y un dominio de unión a la superfamilia de receptores de TNF activan las células inmunitarias ejerciendo una actividad agonista de factores pertenecientes a la superfamilia de TNF o a la superfamilia de receptores de TNF únicamente en presencia de células expresantes de antígenos específicos de cáncer y evitan efectos secundarios tales como la hepatoxicidad, manteniendo simultáneamente una actividad antitumoral. Además, los presentes inventores han encontrado que, mediante la utilización de las moléculas de unión a antígeno en combinación con moléculas de unión a antígeno que presentan un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y un dominio de unión a complejo de receptores de células T, pueden evitarse efectos secundarios y puede incrementar la actividad antitumoral, y de esta manera han completado la presente invención.

Más específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente:

Un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad, que comprende:

(1) un dominio Fab de unión a antígeno específico de cáncer,

(2) un dominio Fab de unión a superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), que es un dominio Fab de unión a CD137 o un dominio Fab de unión a CD40, y

(3) un dominio de unión a FcRn que es una región Fc de anticuerpo que presentan una actividad reducida de unión a receptor de Fcy,

en el que el anticuerpo biespecífico presenta una actividad agonista contra un receptor del factor de necrosis tumoral (TNF).

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica inductora de citotoxicidad, que comprende como ingrediente activo el anticuerpo biespecífico de la invención.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica inductora de citotoxicidad de la invención, que comprende además una molécula de unión a antígeno que comprende:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

(2) un dominio de unión a CD3 y

(3) un dominio de unión a FcRn que presenta actividad reducida de unión a receptor de Fcy.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica inductora de citotoxicidad para la utilización en el tratamiento del cáncer, en el que dicha composición comprende como ingrediente activo un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad de la invención, para la administración simultánea o separadamente con una molécula de unión a antígeno tal como se ha definido anteriormente.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica inductora de citotoxicidad para la utilización en el tratamiento del cáncer, en el que dicha composición comprende como ingrediente activo tal como se ha definido anteriormente, para la administración simultánea o separadamente con un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad de la invención.

Los puntos [1]-[46] representan un resumen de los aspectos más destacados de la exposición:

[1] una molécula de unión a antígeno que comprende:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

(2) un dominio de unión a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) o un dominio de unión a la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF),

[2] la molécula de unión a antígeno de [1], que comprende además un dominio de unión a FcRn,

[3] la molécula de unión a antígeno de [2], en la que el dominio de unión a FcRn es una región Fc de anticuerpo que presenta una actividad reducida de unión a receptores de Fcy,

[4] la molécula de unión a antígeno de cualquiera de [1] a [3], en la que el dominio de unión a la superfamilia de TNF o el dominio de unión a la superfamilia de receptores de TNF es un dominio de unión a CD137,

[5] la molécula de unión a antígeno de cualquiera de [1] a [4], que es un anticuerpo biespecífico,

[6] una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo la molécula de unión a antígeno de cualquiera de [1] a [5],

[7] la composición farmacéutica de [6], que es una composición inductora de citotoxicidad,

[8] la composición farmacéutica de [6], que es una composición para utilización en el tratamiento del cáncer, [9] una composición farmacéutica que comprende una combinación de una primera molécula de unión a antígeno de cualquiera de [1] a [5] y una segunda molécula de unión a antígeno que comprende:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

(2) un dominio de unión a complejo de receptores de células T,

[10] la composición farmacéutica de [9], en la que la segunda molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno que comprende además un dominio de unión a FcRn,

[11] la molécula de unión a antígeno de [10], en la que el dominio de unión a FcRn es una región Fc de anticuerpo que presenta una actividad reducida de unión a receptores de Fcy,

[12] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [11], en la que el dominio de unión al complejo de receptores de células T es un dominio de unión a receptores de células T,

[13] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [11], en la que el dominio de unión al complejo de receptores de células T es un dominio de unión a CD3,

[14] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [13], en la que la segunda molécula de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico,

[15] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [14], en la que la primera molécula de unión a antígeno y la segunda molécula de unión a antígeno están mezcladas,

[16] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [14], en la que la primera molécula de unión a antígeno y la segunda molécula de unión a antígeno se utilizan concomitantemente,

[17] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [14], en la que la primera molécula de unión a antígeno y la segunda molécula de unión a antígeno se utilizan simultáneamente,

[18] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [14], en la que la primera molécula de unión a antígeno y la segunda molécula de unión a antígeno se administran por separado,

[19] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [18], que es una composición inductora de citotoxicidad, [20] la composición farmacéutica de cualquiera de [9] a [18], que es una composición para utilización en el tratamiento del cáncer,

[21] una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo una primera molécula de unión a antígeno que comprende:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

para la utilización concomitante con una segunda molécula de unión a antígeno que comprende:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

(2) un dominio de unión a complejo de receptores de células T,

[22] la composición farmacéutica de [21], que es una composición inductora de citotoxicidad,

[23] la composición farmacéutica de [21], que es una composición para utilización en el tratamiento del cáncer, [24] la composición farmacéutica de cualquiera de [21] a [23], en la que la primera molécula de unión a antígeno y/o la segunda molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno que comprende además un dominio de unión a FcRn,

[25] la molécula de unión a antígeno de [24], en la que el dominio de unión a FcRn es una región Fc de anticuerpo que presenta una actividad reducida de unión a receptores de Fcy,

[26] la composición farmacéutica de cualquiera de [21] a [25], en la que el dominio de unión a la superfamilia de TNF o el dominio de unión a la superfamilia de receptores de TNF es un dominio de unión a CD137 o un dominio de unión a CD40,

[27] la composición farmacéutica de cualquiera de [21] a [26], en la que el dominio de unión al complejo de receptores de células T es un dominio de unión a receptores de células T,

[28] la composición farmacéutica de cualquiera de [21] a [26], en la que el dominio de unión al complejo de receptores de células T es un dominio de unión a CD3,

[29] la composición farmacéutica de cualquiera de [21] a [28], en la que la primera molécula de unión a antígeno y/o la segunda molécula de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico,

[30] la composición farmacéutica de cualquiera de [21] a [29], que se administra simultáneamente con la segunda molécula de unión a antígeno,

[31] la composición farmacéutica de cualquiera de [21] a [29], que se administra separadamente de la segunda molécula de unión a antígeno,

[32] una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo una segunda molécula de unión a antígeno que comprende:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

(2) un dominio de unión a complejo de receptores de células T,

para la utilización concomitante con una primera molécula de unión a antígeno que comprende:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

[33] la composición farmacéutica de [32], que es una composición inductora de citotoxicidad,

[34] la composición farmacéutica de [32], que es una composición para utilización en el tratamiento del cáncer, [35] la composición farmacéutica de cualquiera de [32] a [34], en la que la primera molécula de unión a antígeno y/o la segunda molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno que comprende además un dominio de unión a FcRn,

[36] la molécula de unión a antígeno de [35], en la que el dominio de unión a FcRn es una región Fc de anticuerpo que presenta una actividad reducida de unión a receptores de Fcy,

[37] la composición farmacéutica de cualquiera de [32] a [36], en la que el dominio de unión al complejo de receptores de células T es un dominio de unión a receptores de células T,

[38] la composición farmacéutica de cualquiera de [32] a [36], en la que el dominio de unión al complejo de receptores de células T es un dominio de unión a CD3,

[39] la composición farmacéutica de cualquiera de [32] a [38], en la que el dominio de unión a la superfamilia de TNF o el dominio de unión a la superfamilia de receptores de TNF es un dominio de unión a CD137 o un dominio de unión a CD40,

[40] la composición farmacéutica de cualquiera de [32] a [39], en la que la primera molécula de unión a antígeno y/o la segunda molécula de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico,

[41] la composición farmacéutica de cualquiera de [32] a [40], que se administra simultáneamente con la primera molécula de unión a antígeno,

[42] la composición farmacéutica de cualquiera de [32] a [40], que se administra separadamente de la primera molécula de unión a antígeno,

[43] un método para inducir citotoxicidad, suprimir la proliferación celular, activar la inmunidad contra una célula de cáncer o un tejido tumoral que comprende células de cáncer, o el tratamiento o la prevención del cáncer, que comprende la etapa de administrar la molécula de unión a antígeno de cualquiera de [1] a [5] o la composición farmacéutica de cualquiera de [6] a [42],

[44] la molécula de unión a antígeno de cualquiera de [1] a [5] o la composición farmacéutica de cualquiera de [6] a [42], para la utilización en la inducción de citotoxicidad, la supresión de la proliferación celular, la activación de la inmunidad contra una célula de cáncer o un tejido tumoral que comprende células de cáncer, o el tratamiento o la prevención del cáncer,

[45] utilización de la molécula de unión a antígeno de cualquiera de [1] a [5] en la producción de la composición farmacéutica de cualquiera de [6] a [42], y

[46] un método para la producción de la composición farmacéutica de cualquiera de [6] a [42], que comprende la etapa de utilizar la molécula de unión a antígeno de cualquiera de [1] a [5].

Además, la presente invención se refiere a usos para el tratamiento del cáncer, que comprende administrar una molécula de unión a antígeno de la presente invención o una composición farmacéutica de la presente invención en un paciente en necesidad de tratamiento según se especifica en las reivindicaciones. La presente exposición se refiere además a un kit para la utilización en el método de la presente exposición, que comprende una molécula de unión a antígeno de la presente invención. La presente exposición se refiere además a la utilización de una molécula de unión a antígeno de la presente invención en la producción de una composición farmacéutica para la inducción de citotoxicidad (por ejemplo, una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer). Además, la presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención o composiciones farmacéuticas de la presente invención para la utilización en el tratamiento del cáncer.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 presenta un gráfico que muestra los resultados de evaluación del efecto de los anticuerpos anti-CD137 de ratón sobre la activación de las células T mediante ELISA de IFN-y. mIgGI de control indica el anticuerpo IgG1 de ratón de control negativo.

La fig. 2 presenta un diagrama que demuestra conceptualmente el efecto de activación de las células T de un anticuerpo anti-CD137 de ratón en diversas formas moleculares.

La fig 3 presenta un diagrama que demuestra conceptualmente el efecto de activación de células T dependiente del antígeno GPC3 de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón.

La fig. 4 presenta un gráfico que muestra el resultado de evaluar el efecto de activación de células T dependiente del antígeno GPC3 de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón utilizando ELISA de IFN-Y-La fig. 5 presenta un gráfico que muestra el resultado de evaluar la influencia de cambios en las regiones constantes de anticuerpo de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón sobre el efecto de activación de células T dependiente del antígeno GPC3 utilizando ELISA de IFN-y.

La fig. 6 presenta un gráfico que muestra el resultado de evaluar el efecto de potenciación de células T producido por una mezcla de anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón utilizando ELISA de IFN-y. hIgGI de control indica el anticuerpo IgG1 humano de control negativo (Alexis Corporation).

La fig. 7 presenta un gráfico que muestra el efecto antitumoral de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo anti-CD137 de ratón en un modelo singénico de ratón de tumor CT26. Las flechas indican el tiempo en que se administraron los anticuerpos.

La fig. 8 presenta un gráfico que muestra la influencia de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo anti-CD137 de ratón sobre la aspartato-aminotransferasa (AST) en la sangre de un modelo singénico de ratón de tumor CT26.

La fig. 9 presenta un gráfico que muestra la influencia de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo anti-CD137 de ratón sobre la aspartato-aminotransferasa (ALT) en la sangre de un modelo singénico de ratón de tumor CT26.

La fig. 10 presenta un gráfico que muestra la influencia de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo anti-CD137 de ratón sobre la bilirrubina total en la sangre de un modelo singénico de ratón de tumor CT26.

La fig. 11 muestra fotografías de resultados histopatológicos hepáticos en un modelo singénico de ratón de tumor CT26 por un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo anti-CD137 de ratón. Las fotografías son imágenes histopatológicas teñidas con hematoxilina-eosina de secciones hepáticas de un ratón representativo, en las que a y d muestran los resultados de la administración del solvente; b y e muestran los resultados de administrar 1D8-MB492 y c y f muestran los resultados de administrar GPC3 ERY22-3-1D8. Las cabezas de flecha indican las células hepáticas degeneradas o necróticas, y * indica la observación de inflamación. La fig. 12 presenta un gráfico que demuestra el efecto antitumoral del uso concomitante de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón en un modelo singénico de ratón de tumor LLC. Las flechas indican el tiempo en que se administraron los anticuerpos.

La fig. 13 muestra la relación entre los residuos aminoácidos que constituyen las regiones Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y la numeración EU de Kabat (en la presente memoria también se denomina ÍNDICE UE).

La fig. 14-1 muestra los resultados de ELISA para la evaluación de la unión de anticuerpos anti-CD137 humano a proteínas de fusión CD137-Fc humano fragmentadas. En la figura, "Sin" indica el nivel de revelado de color de ELISA en los pocillos que no habían sido inmovilizados con el antígeno (sin recubrimiento).

La fig. 14-2 muestra los valores (relaciones respecto al nivel en Sin recubrimiento) obtenidos mediante la división de los niveles de revelado de color de ELISA de cada muestra mostrados en la fig. 14-1 según nivel de revelado de color de ELISA en los pocillos Sin recubrimiento (Sin) (unión a pocillos que no han sido inmovilizados con el antígeno).

La fig. 15 presenta un gráfico que muestra la actividad inductora de IFNy de los anticuerpos anti-CD137 humano. La fig. 16 muestra el efecto de activación de las células T y el perfil de unión de los anticuerpos anti-CD137 humano. La fig. 17 presenta un gráfico que muestra el resultado de evaluar el efecto de potenciación de células T producido por una mezcla de anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD40 de ratón y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón utilizando ELISA de IFN-y. hIgGI de control indica el anticuerpo IgG1 humano de control negativo.

La fig. 18 presenta un gráfico que muestra los resultados de evaluar el efecto de activación de células T del anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 humano GPC3 FAE-BMS utilizando ELISA de IFN-y. hIgGI de control indica el anticuerpo IgG1 humana de control negativo.

La fig. 19 presenta un gráfico que muestra los resultados de evaluar la actividad agonista mediada por CD137 de diversos anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 humano según el nivel de producción de IL-6 que activa las células B. hIgG1 de control indica el anticuerpo IgG1 humano de control negativo.

Modo de llevar a cabo la invención

Se proporcionan las definiciones siguientes con el fin de facilitar la comprensión de la invención descrita en la presente memoria. La información técnica proporcionada posteriormente puede en algunos respectos ir más allá del alcance de la invención, que se define exclusivamente mediante las reivindicaciones adjuntas. Dicha información técnica adicional se proporciona para situar la invención misma en un contexto técnico más amplio y con el fin de ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. La información técnica adicional que no se encuentra comprendida dentro del alcance según las reivindicaciones adjuntas no es parte de la invención.

Moléculas de unión a antígeno

En la presente invención, las "moléculas de unión a antígeno" no se encuentran particularmente limitadas con la condición de que sean moléculas que comprendan un "dominio de unión" y pueden comprender además un péptido o proteína con una longitud de aproximadamente cinco aminoácidos o más. El péptido y proteína no se limitan a los derivados de un organismo vivo, y por ejemplo, pueden ser un polipéptido producido a partir de una secuencia diseñada artificialmente. También puede ser cualquiera de entre un polipéptido natural, polipéptido sintético, polipéptido recombinante y similares.

Un ejemplo favorable de una molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn contenido en una región Fc de anticuerpo. Como método para extender la semivida en sangre de una proteína administrada en un cuerpo vivo, es bien conocido el método de adición de un dominio de unión a FcRn de un anticuerpo a la proteína de interés y la utilización de la función de reciclado mediado por FcRn.

En la presente invención, el "dominio de unión a FcRn" no se encuentra particularmente limitado con la condición de que presente actividad de unión a FcRn y entre los ejemplos se incluyen regiones variables de anticuerpo, regiones Fab y Fc de anticuerpo cuyos antígenos son FcRn, y fragmentos de los mismos. Una exposición preferente incluye regiones Fc de anticuerpo o fragmentos que contienen una región de unión a FcRn de una región Fc. En la presente memoria, por ejemplo, puede utilizarse una región Fc derivada de una IgG natural como la "región Fc". Una IgG natural se refiere a un polipéptido que comprende la misma secuencia de aminoácidos que una IgG observada en la naturaleza, y pertenece a una clase de anticuerpos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina gamma. Una IgG humana natural se refiere, por ejemplo, a una IgG1 humana natural, a una IgG2 humana natural, a una IgG3 humana natural o a una IgG4 humana natural. Entre las IgG naturales se incluyen además mutantes y similares que se generan naturalmente a partir de los mismos. Una pluralidad de secuencias de alotipo que resulta del polimorfismo genético ha sido descrita en Sequences of Proteins of Immunological Interest, publicación de NIH n° 91 3242 para la región constante de anticuerpo IgG1 humano, IgG2 humano, IgG3 humano e IgG4 humano, y puede utilizarse cualquiera de las secuencias en la presente invención. En particular, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 356 a 358 según la numeración EU puede ser DEL o EEM para la secuencia IgG1 humana.

Son regiones Fc de anticuerpo existentes, por ejemplo, las regiones Fc de tipo IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. Por ejemplo, puede utilizarse una región Fc derivada de un anticuerpo IgG humano natural como la región Fc de anticuerpo en anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención. Las regiones Fc derivadas de una región constante de una IgG natural, o más específicamente, una región constante derivada de una IgG1 humana natural (SEC ID n° 1), una región constante derivada de una IgG2 humana natural (SEC ID n° 2), una región constante derivada de una IgG3 humana natural (SEC ID n° 3) y una región constante derivada de una IgG4 humana natural (SEC ID n° 4) pueden utilizarse como una región Fc en anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención. Los mutantes y similares que se generan naturalmente a partir de los mismos también se encuentran incluidos en las regiones constantes de IgG natural.

Dichas regiones Fc de anticuerpo pueden obtenerse convenientemente, por ejemplo, mediante digestión parcial de anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, utilizando una proteasa, tal como pepsina, seguido de la adsorción de los fragmentos resultantes en una columna de proteína A o una columna de proteína G, y posteriormente la elución utilizando un tampón de elución apropiado y similares. La proteasa no se encuentra particularmente limitada con la condición de que pueda digerir un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, mediante el establecimiento apropiado de las condiciones de la reacción enzimática, tales como el pH, y entre los ejemplos se incluyen la pepsina y la ficina.

El isotipo de un anticuerpo se determina a partir de la estructura de la región constante. La región constante de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 se denomina Cy1, Cy2, Cy3 y Cy4, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos que constituyen las regiones Fc de las Cy1, Cy2, Cy3 y Cy4 humanas se ejemplifican en las SEC ID n° 5, n° 6, n° 7 y n° 8. La relación entre residuos aminoácidos que constituyen cada una de dichas secuencias de aminoácidos y la numeración EU de Kabat (en la presente memoria también denominada ÍNDICE UE) se muestra en la fig. 13.

Una región Fc se refiere a una región que excluye F(ab')², que contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen parte de la región constante entre el dominio CH1 y el dominio CH2, de manera que los enlaces disulfuro entre las cadenas se forman entre las dos cadenas pesadas. Las regiones Fc que forman las moléculas de unión a antígeno dadas a conocer en la presente memoria pueden obtenerse convenientemente mediante la digestión parcial de los anticuerpos monoclonales IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o similares utilizando una proteasa, tal como pepsina, y después eluyendo nuevamente las fracciones adsorbidas en la columna de proteína A. La proteasa no se encuentra particularmente limitada con la condición de que pueda digerir un anticuerpo de longitud completa de una manera restrictiva para producir F(ab')²mediante el establecimiento apropiado de las condiciones de la reacción enzimática, tales como el pH. Entre dichas proteasas se incluyen, por ejemplo, la pepsina y la ficina.

Un dominio con actividad reducida de unión a receptor de Fcy es el dominio de unión a FcRn en los anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención. En la presente memoria, un receptor de Fcy (en la presente memoria, también denotado como receptor de Fcy, FcyR, o FcgR) se refiere a un receptor que puede unirse a la región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 e incluye todos los elementos pertenecientes a la familia de proteínas sustancialmente codificadas por los genes de receptor de Fcy. En el ser humano, dicha familia incluye, aunque sin limitación, FcyRI (CD64), incluyendo las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), incluyendo las isoformas FcYRIIa (incluyendo los alotipos H131 (tipo H) y R131 (tipo R), FcyR iIb (incluyendo FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2), y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), incluyendo las isoformas FcyRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcyRIIIb (incluyendo los alotipos FcYRIIIb-NAl y FcYRIIIb-NA2); así como cualesquiera FcyR humanas no identificadas todavía e isoformas o alotipos de FcyR. Entre los FcyR se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los derivados de seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos, y pueden derivarse de cualquier organismo. Entre los FcyR de ratón se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) y FcyRIII-2 (CD16-2), así como cualesquiera FcyR de ratón todavía no identificadas, e isoformas o alotipos de FcyR. Entre los ejemplos adecuados de dichos receptores de Fcy se incluyen FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32), FcYRIIb (CD32), FcyRIIIa (CD16) y/o FcyRIIIb (CD16) humanos.

Los receptores activadores que portan un motivo inmunorreceptor de activación a base de tirosinas (ITAM) y los receptores inhibitorios que portan un motivo inmunorreceptor de inhibición a base de tirosinas (ITIM) se encuentran presentes entre los FcyR. Los FcyR se clasifican en FcyR activadores: FcyRI, FcYRIIa R, FcYRIIa H, FcYRIIIa y FcYRIIIb, y FcyR inhibitorio: FcYRIIb.

La secuencia polinucleótida y la secuencia de aminoácidos de FcyRI se muestran en NM_000566.3 y NP_000557.1, respectivamente; la secuencia polinucleótida y la secuencia de aminoácidos de FcyRIIa se muestran en BC020823.1 y AAH20823.1, respectivamente; la secuencia polinucleótida y la secuencia de aminoácidos de FcyRIIb se muestran en BC146678.1 y AAI46679.1, respectivamente; la secuencia polinucleótida y la secuencia de aminoácidos de FcYRIIIa se muestran en BC033678.1 y AAH33678.1, respectivamente; y la secuencia polinucleótida y la secuencia de aminoácidos de FcYRIIIb se muestran en BC128562.1 y AAI28563.1, respectivamente (número de acceso RefSeq). Existen dos tipos de polimorfismos génicos de FcyRIIa, en los que el aminoácido en la posición 131 de FcyRIIa se sustituye por histidina (tipo H) o por arginina (tipo R) (J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990). Además, existen dos tipos de polimorfismos génicos de FcyRIIb, en los que el aminoácido en la posición 232 de FcyRIIb se sustituye por isoleucina (tipo I) o por treonina (tipo T) (J. Exp. Rheum. 46: 1242-1254, 2002). Además, existen dos tipos de polimorfismos génicos de FcyRIIIa, en los que el aminoácido en la posición 158 de FcyRIIIa se sustituye por valina (tipo V) o por fenilalanina (tipo F) (J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070, 1997). También existen dos tipos de polimorfismos génicos de FcYRIIIb, que son el tipo NA1 y el tipo NA2 (J. Clin. Invest. 85: 1287-1295, 1990).

Si la actividad de unión a un receptor de Fcy está reducida puede confirmarse mediante métodos bien conocidos, tales como FACS, formato ELISA, cribado mediante ensayo de proximidad luminiscente homogéneo amplificado (ALPHA), método BIACORE basado en resonancia del plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11), 4005-4010, 2006).

El cribado mediante ALPHA se lleva a cabo con tecnología ALPHA que utiliza dos perlas, una perla donante y una perla aceptora, basándose en el principio siguiente. Las señales luminiscentes se detectan únicamente cuando las moléculas unidas a las perlas donantes interactúan biológicamente con las moléculas unidas a las perlas aceptoras, y las dos perlas se encuentran en estrecha proximidad mutua. El fotosensibilizador excitado por láser dentro de las perlas donantes convierte el oxígeno ambiental en oxígeno singlete en estado excitado. El oxígeno singlete se encuentra dispersado en torno a las perlas donantes y cuando alcanza las perlas aceptoras contiguas, se induce una reacción quimioluminiscente dentro de las perlas y finalmente se emite luz. En el caso de que las moléculas unidas a las perlas donantes no interactúen con las moléculas unidas a las perlas aceptoras, no tiene lugar la reacción quimioluminiscente debido a que el oxígeno singlete producido por las perlas donantes no alcanza las perlas aceptoras.

Por ejemplo, en el caso de que una molécula de unión a antígeno contenga una región Fc de anticuerpo como el dominio de unión a FcRn, se prepara una molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc de tipo salvaje y una molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc mutante producida por la adición de mutaciones de aminoácidos para modificar la unión a un receptor de Fcy, se une una molécula de unión a antígeno biotinilada a las perlas donantes y se une un receptor de Fcy etiquetado con glutatión-S-transferasa (GST) a las perlas aceptoras. En presencia de una molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc mutante, la molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc de tipo salvaje interactúa con el receptor de Fcy y produce señales a 520-620 nm. En el caso de que la molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc mutante no se encuentre etiquetada, competirá con la molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc de tipo salvaje para la interacción con el receptor de Fcy. La afinidad de unión relativa puede determinarse mediante la cuantificación de la reducción de fluorescencia observada como resultado de la competición. La biotinilación de las moléculas de unión a antígeno con sulfo-NHS-biotina y similares es bien conocida. Como método para etiqueta un receptor de Fcy con GST, puede adoptarse apropiadamente el método de expresión del receptor de Fcy y GST en una célula portadora de un vector que puede expresar un gen de fusión producido mediante la fusión de un polinucleótido codificante del receptor de Fcy en el mismo marco con un polinucleótido codificante de GST y la purificación del mismo utilizando una columna de glutatión. Las señales obtenidas se analizan convenientemente, por ejemplo ajustándolas a un modelo de competición de un sitio que utiliza un análisis de regresión no lineal con software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).

Una de las sustancias (ligandos) observadas para la interacción se inmoviliza sobre una película delgada de oro sobre un chip sensor y mediante la proyección de luz desde la cara reversa del chip sensor de manera que tiene lugar una reflexión total en la interfaz entre la película delgada de oro y el vidrio, se forma una porción con intensidad de reflexión reducida en parte de la luz reflejada (señal SPR). La otra sustancia (analito) observada para la interacción se hace fluir sobre la superficie del chip sensor y al unirse el ligando al analito, se incrementa la masa de la molécula de ligando inmovilizada y el índice de refracción del solvente sobre la superficie del chip sensor cambia. La posición de la señal de SPR cambia como resultado de dicho cambio de índice de refracción (a la inversa, la posición de la señal se reestablece en el caso de que se disocie dicha unión). El sistema Biacore muestra la magnitud del desplazamiento indicado anteriormente, o más específicamente, la variación temporal de la masa, mediante la representación gráfica del cambio de masa sobre la superficie del chip sensor en el eje vertical como datos de medición (sensograma). Se determinan parámetros cinéticos, tales como la constante de tasa de asociación (ka) y la constante de tasa de disociación (kd), a partir de la curva en el sensograma y se determina la afinidad (K^d) a partir de la relación de dichas constantes. En el método BIACORE, también se utiliza convenientemente un método para medir la inhibición. Se describe un ejemplo del método para medir la inhibición en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005-4010.

En la presente memoria, "actividad reducida de unión a receptor de Fcy" se refiere a que, por ejemplo, basándose en el método analítico anteriormente indicado, la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno es 50% o inferior, preferentemente de 45% o inferior, de 40% o inferior, de 35% o inferior, de 30% o inferior, de 20% o inferior, de 15% o inferior, o particularmente preferentemente de 10% o inferior, de 9% o inferior, de 8% o inferior, de 7% o inferior, de 6% o inferior, de 5% o inferior, de 4% o inferior, de 3% o inferior, de 2% o inferior, o de 1% o inferior, en comparación con la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno de control que contiene una región Fc.

Para la molécula de unión a antígeno de control, pueden utilizarse convenientemente moléculas de unión a antígeno que presentan, por ejemplo, un dominio que comprende una región Fc de un anticuerpo monoclonal IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Las estructuras de las regiones Fc se muestran en SEC ID n° 1 (A se añade al extremo N-terminal de RefSeq n° de acceso AAC82527.1), SEC ID n° 2 (A se añade al extremo N-terminal de RefSeq n° de acceso AAB59393.1), SEC ID n° 3 (A se añade al extremo N-terminal de RefSeq n° de acceso CAA27268.1) y SEC ID n° 4 (A se añade al extremo N-terminal de RefSeq n° de acceso AAB59394.1). Además, en el caso de que se utilice una molécula de unión a antígeno que contiene un mutante de una región Fc de un isotipo particular de anticuerpo como la sustancia de ensayo, se somete a ensayo el efecto de la mutación que posee el mutante de la actividad de unión a receptor de Fcy mediante la utilización como control de una molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc de un anticuerpo de ese isotipo particular. De esta manera, se producen convenientemente moléculas de unión a antígeno que contienen un mutante de región Fc cuya actividad de unión hacia el receptor de Fcy que se ha verificado que se encuentra reducida.

Entre los ejemplos de dichos mutantes se incluyen mutantes con una deleción 231A-238S (documento n° WO 2009/011941), o mutantes C226S, C229S, P238S, (C220S) (J. Rheumatol (2007) 34, 11), C226S, C229S (Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54), C226S, C229S, E233P, L234V, o L235A (Blood (2007) 109, 1185-1192), en los que los aminoácidos se especifican mediante numeración de UE.

Es decir, entre los ejemplos adecuados se incluyen moléculas de unión a antígeno que presentan una región Fc en la que cualquiera de los aminoácidos en las posiciones 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331 y 332 especificadas según la numeración de UE ha sido sustituido en los aminoácidos que constituyen la región Fc de un anticuerpo de un isotipo específico. El isotipo del anticuerpo del que se origina la región Fc no se encuentra particularmente limitado y la región Fc derivada de un anticuerpo monoclonal IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 puede utilizarse apropiadamente y se utiliza convenientemente la región Fc derivada de un anticuerpo IgG1 humano natural.

Por ejemplo, una molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc que comprende cualquier sustitución especificada posteriormente basada en numeración de UE de entre los aminoácidos que constituyen la región Fc del anticuerpo IgG1 (en el que el número indica la posición del residuo aminoácido especificado según la numeración de UE, el código de una letra del aminoácido situado antes del número indica el residuo aminoácido situado antes de la sustitución, y el código de una letra de aminoácido situado después del número indica el residuo aminoácido antes de la sustitución):

(a) L234F, L235E, P331S

(b) C226S, C229S, P238S

(c) C226S, C229S

(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A;

o puede utilizarse apropiadamente una región Fc que no posee la secuencia de aminoácidos de las posiciones 231 a 238 de entre los aminoácidos que constituyen la región Fc del anticuerpo IgG1.

Además, pueden utilizarse apropiadamente moléculas de unión a antígeno que presentan una región Fc que comprende cualquier sustitución especificada posteriormente basada en numeración de UE de entre los aminoácidos que constituyen la región Fc del anticuerpo IgG2 (en el que el número indica la posición del residuo aminoácido especificado según la numeración de UE, el código de una letra del aminoácido situado antes del número indica el residuo aminoácido situado antes de la sustitución, y el código de una letra de aminoácido situado después del número indica el residuo aminoácido antes de la sustitución):

(e) H268Q, V309L, A330S, P331S

(f) V234A

(g) G237A

(h) V234A, G237A

(i) A235E, G237A

(j) V234A, A235E, G237A

Además, pueden utilizarse apropiadamente moléculas de unión a antígeno que presentan una región Fc que comprende cualquier sustitución especificada posteriormente basada en numeración de UE de entre los aminoácidos que constituyen la región Fc del anticuerpo IgG3 (en el que el número indica la posición del residuo aminoácido especificado según la numeración de UE, el código de una letra del aminoácido situado antes del número indica el residuo aminoácido situado antes de la sustitución, y el código de una letra de aminoácido situado después del número indica el residuo aminoácido antes de la sustitución):

(k) F241A

( l) D265A

(m) V264A

Además, pueden utilizarse apropiadamente moléculas de unión a antígeno que presentan una región Fc que comprende cualquier sustitución especificada posteriormente basada en numeración de UE de entre los aminoácidos que constituyen la región Fc del anticuerpo IgG4 (en el que el número indica la posición del residuo aminoácido especificado según la numeración de UE, el código de una letra del aminoácido situado antes del número indica el residuo aminoácido situado antes de la sustitución, y el código de una letra de aminoácido situado después del número indica el residuo aminoácido antes de la sustitución):

(n) L235A, G237A, E318A

(o) L235E

(p) F234A, L235A

Entre otros ejemplos preferentes se incluyen moléculas de unión a antígeno que presentan una región Fc en la que cualquiera de los aminoácidos en las posiciones 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330 y 331 especificadas según la numeración de UE en los aminoácidos que constituyen la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano natural se sustituye con aminoácidos de numeración de UE correspondiente en la IgG2 o IgG4 correspondiente.

Entre otros ejemplos preferentes se incluyen convenientemente moléculas de unión a antígeno que presentan una región Fc en la que uno o más cualesquiera de los aminoácidos en las posiciones 234, 235 y 297 especificadas según la numeración de UE en los aminoácidos que constituyen la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano natural se sustituyen por otros aminoácidos. El tipo de aminoácido presente después de la sustitución no se encuentra particularmente limitado y resulta particularmente preferente una molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc en la que uno o más cualesquiera de los aminoácidos en las posiciones 234, 235 y 297 se sustituyen por alanina.

Entre otros ejemplos preferentes se incluyen convenientemente moléculas de unión a antígeno que presentan una región Fc en la que el aminoácido en la posición 265 especificada según la numeración de UE de entre los aminoácidos que constituyen la región Fc de un anticuerpo IgG1 se sustituyen por otro aminoácido. El tipo de aminoácido presente después de la sustitución no se encuentra particularmente limitado y resulta particularmente preferente una molécula de unión a antígeno que presenta una región Fc en la que el aminoácido en la posición 265 se sustituye por alanina.

El "dominio de unión a antígeno específico de cáncer", "dominio de unión de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF)", "dominio de unión de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF)" y "dominio de unión al complejo de receptores de células T" (en lo sucesivo en la presente memoria, los cuatro dominios de unión se denominan colectivamente dominios de unión a antígeno) incluidos en las moléculas de unión a antígeno de la presente invención y las moléculas de la presente exposición se refieren a regiones que se unen específicamente a la totalidad o a una parte de sus antígenos respectivos que son antígenos específicos de cáncer, factores pertenecientes a la superfamilia de TNF, factores pertenecientes a la superfamilia de receptores de TNF o complejo de receptores de células T, y un ejemplo del dominio de unión es una región que comprende la región de unión a antígeno de un anticuerpo. En el caso de que el peso molecular del antígeno sea grande, la región de unión a antígeno del anticuerpo puede unirse únicamente a una parte específica del antígeno. Dicha parte específica se denomina epítopo. El dominio de unión a antígeno es proporcionado por uno o más dominios variables de un anticuerpo. Preferentemente, el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo. Entre los ejemplos adecuados de dichos dominios de unión a antígeno se incluyen "Fv de cadena sencilla (scFv)", "anticuerpo de cadena sencilla", "Fv", "Fv 2 de cadena sencilla (scFv2)", "Fab", "F(ab')²" y similares.

En la presente memoria, un "antígeno específico de cáncer" se refiere a un antígeno expresado por células de cáncer, que permite distinguir entre las células de cáncer y las células sanas y, por ejemplo, incluye antígenos que se expresan a medida que las células se malignizan, o cadenas sacáridas anormales que aparecen sobre moléculas de proteínas o la superficie celular al volverse cancerosas las células. Entre los ejemplos específicos se incluyen el receptor ALK (receptor de pleiotrofina), pleiotrofina, antígeno del carcinoma pancreático KS %, antígeno del carcinoma ovárico (CA125), fosfato de ácido prostático, antígeno especifico prostático (PSA), antígeno asociado a melanoma p97, antígeno del melanoma gp75, antígeno del melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA), antígeno membranal especifico prostático, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de mucina epitelial polimórfica, antígeno de glóbulos de grasa humana, antígeno humano de glóbulos de grasa, antígenos asociados a tumor colorrectal, tales como CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 y LEA, antígeno-38.13 del linfoma de Burkitt, CD19, antígeno-CD20 del linfoma de células B humano, CD33, antígenos específicos del melanoma, tales como gangliósido GD2, gangliósido GD3, gangliósido GM2 y gangliósido GM3, antígeno de superficie celular de tipo trasplante específico tumoral (TSTA), antígenos tumorales inducidos por virus, incluyendo el antígeno T y los antígenos de cubierta de virus ADN tumorales y virus ARN tumorales, CEA de colon, antígenos oncofetales, tales como la glucoproteína trofoblástica oncofetal as5T4 y el antígeno oncofetal de tumor vesicular, a-fetoproteína, antígenos de diferenciación, tales como los antígenos del carcinoma pulmonar humano L6 y L20, antígenos del fibrosarcoma, antígeno Gp37 de la leucemia de células T humana, neoglucoproteína, esfingolípidos, antígenos del cáncer de mama, tales como EGFR (receptor de factor de crecimiento epidérmico), antígenos NY-BR-16, NY-BR-16 y HER2 (p185HER2), mucina epitelial polimórfica (PEM), antígeno APO-1 de linfocitos humanos malignos, antígeno APO-1 de linfocitos humanos malignos, antígenos de diferenciación, tales como el antígeno I presente en los eritrocitos fetales, el antígeno I del endoderma primario presente en los eritrocitos adultos, embriones preimplantación, I(Ma) observado en el cáncer gástrico, M18 y M39 observados en el epitelio mamario, SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl y VIM-D5 observados en las células mieloides, D156-22 observado en el cáncer colorrectal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), SCP-1 observado en el cáncer testicular y ovárico, C14 observado en el cáncer de colon, F3 observado en el cáncer pulmonar, AH6 observado en el cáncer gástrico, hapteno Y, Ley observado en células de carcinoma embrionario, TL5 (grupo sanguíneo A), receptor EGF observado en células a 431, serie E1 (grupo sanguíneo B) observado en el cáncer pancreático, FC10.2 observado en células de carcinoma embrionario, antígeno de cáncer gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) observado en adenocarcinoma, NS-10 observado en adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49 observado en el receptor EGF de las células A431, MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) observado en el cáncer de colon, 19.9 observado en el cáncer de colon, mucinas del cáncer gástrico, T5A7 observado en células mieloides, R24 observado en el melanoma, 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 y M1:22:25:8 observado en las células de carcinoma embrionario, así como SSEA-3 y SSEA-4 observados en los embriones de estadio de 4 a 8 células, antígeno del linfoma subcutáneo de células T, antígeno MART-1, antígeno sialil-T n (STn), antígeno NY-CO-45 del cáncer de colon, antígeno NY-LU-12 variante A de cáncer pulmonar, antígeno ART1 de adenocarcinoma, antígeno de cáncer de cerebro-testículo de tipo paraneoplásico (antígeno onconeuronal MA2, antígeno neuronal paraneoplásico), antígeno ventral 2 neuro-oncológico (NOVA2), gen 520 de antígeno de carcinoma de hemocitos, antígeno asociado a tumor CO-029, antígenos asociados a tumor MAGE-C1 (antígeno C57 de cáncer/testículo), MAGE-B1 (antígeno MAGE-XP), MAGE-B2 (DAM6), MAGE-2, MAGE-4a, MAGE-4b y MAGE-X2, antígeno de cáncer testicular (NY-EOS-1), YKL-40, fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriormente indicados, o estructuras producidas mediante modificación de los mismos (por ejemplo, el grupo fosfato o cadena sacárida modificado anteriormente indicado), EpCAM, EREG, CA19-9, CA15-3, sialil-SSEA-1(SLX), HER2, PSMA, CEA y CLEC12A. Los antígenos específicos de cáncer que se convierten en dianas de los dominios de unión a antígeno específicos de cáncer de los anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención son, en particular, preferentemente los expresados sobre la superficie celular, y entre los ejemplos de dichos antígenos específicos de cáncer se incluyen CD19, CD20, EGFR, HER2, EpCAM y EREG.

Además, como factores pertenecientes a la "superfamilia de TNF" o la "superfamilia de receptores de TNF", se conocen ligandos que presentan una estructura trimérica y receptores con una estructura trimérica a la que se unen los ligandos, que contribuyen a la activación de diversas células inmunitarias (Nat. Rev. Immunol., 2012, 12, 339-51). Entre los ejemplos de factores pertenecientes a la superfamilia de TNF o a la superfamilia de receptores de TNF se incluyen CD137, CD137L, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, RANK, RANKL, CD30, CD153, GITR y GITRL. Entre los factores preferentes se incluyen, por ejemplo, CD137 y CD40. Un factor más preferente es, por ejemplo, CD137.

Además, el "complejo de receptores de células T" puede ser un receptor de células T mismo, o una molécula adaptadora que constituye un complejo de receptores de células T junto con un receptor de células T. CD3 resulta adecuada como molécula adaptadora.

Para el receptor de células T, un epítopo al que se une el dominio de unión a receptores de células T puede ser una región variable o una región constante, aunque resulta preferente un epítopo presente en la región constante. Entre los ejemplos de la secuencia de la región constante se incluyen la cadena a de receptor de células T de n° de acceso RefSeq CAA26636.1 (SEC ID n° 9); la cadena p de receptor de células T de n° de acceso RefSeq C25777 (SEC ID n° 10); la cadena y1 de receptor de células T de n° de acceso RefSeq A26659 (SEC ID n° 11); la cadena y2 de receptor de células T de n° de acceso RefSeq AAB63312.1 (SEC ID n° 12) y la cadena 6 de receptor de células T de n° de acceso RefSeq AAA61033.1 (SEC ID n° 13).

En la presente invención, en el caso de que se utilice el "dominio de unión a CD3" como el dominio de unión al complejo de receptores de células T, el dominio de unión a CD3 puede proporcionarse mediante uno o más dominios variables de anticuerpo. Preferentemente, el dominio de unión a CD3 incluye una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo de CD3. Entre los ejemplos adecuados de dichos dominios de unión a CD3 se incluyen "Fv de cadena sencilla (scFv)", "anticuerpo de cadena sencilla", "Fv", "Fv 2 de cadena sencilla (scFv2)", "Fab", "F(ab')²" y similares.

El dominio de unión a CD3 de una molécula de unión a antígeno comprendida en una composición farmacéutica inductora de citotoxicidad de la presente invención puede ser uno que se une a cualquier epítopo con la condición de que exista el epítopo en la cadena y, la cadena 6 o la cadena £ que constituye la CD3 humana. En la presente invención, preferentemente se utiliza convenientemente un dominio de unión a CD3 que comprende una región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo de CD3 y una región variable de cadena pesada (VH) de un anticuerpo de CD3, y que se une a un epítopo presente en la región extracelular de la cadena £ del complejo de CD3 humano. Para dicho dominio de unión a c D3, se utiliza convenientemente un dominio de unión a CD3 que comprende la región variable de cadena ligera (VL) y la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo de OKT3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4914-4917) o diversos anticuerpos de CD3 conocidos. Puede utilizarse apropiadamente un dominio de unión a CD3 derivado de un anticuerpo de CD3 que presenta las propiedades deseadas y que se obtiene mediante inmunización de un animal deseado con la cadena y, la cadena 6 o la cadena £ que constituye la CD3 humana mediante el método anteriormente indicado. Los anticuerpos humanos y anticuerpos apropiadamente humanizados tal como se indican posteriormente pueden utilizarse convenientemente como el anticuerpo de CD3 que sirve como el origen para el dominio de unión a CD3. para la estructura de la cadena y, la cadena 6 o la cadena £ que constituye CD3, se muestran sus secuencias polinucleótidas en las SEC ID n° 14 (NM_000073.2), 16 (NM_000732.4) y 18 (NM_000733.3), y sus secuencias polipeptídicas se muestran en las SeC ID n° 15 (NP_000064.1), 17 (NP_000723.1) y 19 (n P_000724.1) (el número de acceso RefSeq se muestra entre paréntesis).

Preferentemente, la "moléculas de unión a antígeno" incluye un anticuerpo que comprende una región variable de anticuerpo de la presente exposición.

Entre los ejemplos de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria se incluyen los anticuerpos siguientes:

[1] un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 66 como la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 85 como la región variable de cadena ligera,

[2] un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 67 como la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 86 como la región variable de cadena ligera,

[3] un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 70 como la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 89 como la región variable de cadena ligera,

[4] un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 76 como la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 95 como la región variable de cadena ligera,

[5] un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 77 como la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 96 como la región variable de cadena ligera,

[6] un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 78 como la región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 97 como la región variable de cadena ligera,

[7] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [6], que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 99 como la región constante de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 59 o la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 60 como la región constante de cadena ligera,

[8] un anticuerpo que presenta una actividad equivalente a la del anticuerpo de cualquiera de [1] a [7], y

[9] un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo de cualquiera de [1] a [7].

En el anticuerpo de [8], una "actividad equivalente" se refiere a una actividad agonista de CD137 que es 70% o más, preferentemente 80% o más, y más preferentemente 90% o más de la actividad de unión del anticuerpo de cualquiera de [1] a [7].

Se proporciona además el anticuerpo de [9] que se une al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad anti-CD137 dado a conocer en la presente invención. Dicho anticuerpo puede obtenerse, por ejemplo, mediante el método proporcionado posteriormente.

Si un anticuerpo de ensayo comparte un epítopo común con un determinado anticuerpo puede evaluarse basándose en la competición entre los dos anticuerpos para el mismo epítopo. La competición entre los anticuerpos puede detectarse mediante un ensayo de bloqueo cruzado o similar. Por ejemplo, el ensayo ELISA competitivo es un ensayo de bloqueo cruzado preferente. Específicamente, en un ensayo de bloqueo cruzado, la proteína CD137 utilizada para recubrir los pocillos de una placa de microtitulación se preincuba en presencia o en ausencia de un anticuerpo competidor candidato y después se añade al mismo un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad anti-CD137 de la presente invención. La cantidad de anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad anti-CD137 de la presente invención unido a la proteína CD137 en los pocillos se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión del anticuerpo competidor candidato (anticuerpo de ensayo) que compite para la unión al mismo epítopo. Es decir, a mayor afinidad del anticuerpo de ensayo para el mismo epítopo, menor cantidad del anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad anti-CD137 de la presente invención unido a los pocillos recubiertos con proteína CD137 y mayor la cantidad de anticuerpo de ensayo unido a los pocillos con recubrimiento de proteína CD137.

La cantidad del anticuerpo unida a los pocillos puede determinarse fácilmente mediante marcaje previo del anticuerpo. Por ejemplo, puede medirse un anticuerpo marcado con biotina mediante la utilización de un conjugado de avidina/peroxidasa y un sustrato apropiado. En particular, un ensayo de bloqueo cruzado que utiliza un marcaje enzimático, tal como la peroxidasa, se denomina "ensayo ELISA competitivo". El anticuerpo puede marcarse con otras sustancias de marcaje que permiten la detección o la medición. Específicamente, se conocen marcajes radioactivos, marcajes fluorescentes y similares.

Además, en el caso de que el anticuerpo de ensayo presente una región constante derivada de una especie diferente de la del anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad anti-CD137 de la presente invención, la cantidad de anticuerpo unida a los pocillos puede medirse mediante la utilización de un anticuerpo marcado que reconozca la región constante de ese anticuerpo. Alternativamente, en el caso de que los anticuerpos se deriven de la misma especie, pero que pertenezcan a clases diferentes, la cantidad de los anticuerpos unida a los pocillos puede medirse utilizando anticuerpos que distinguen clases individuales.

En el caso de que un anticuerpo candidato pueda bloquear la unión de un anticuerpo anti-CD137 como mínimo en 20%, preferentemente en como mínimo 20% a 50%, y todavía más preferentemente en como mínimo 50%, respecto a la actividad de unión obtenida en un experimento de control llevado a cabo en ausencia del anticuerpo competidor candidato, en el que el anticuerpo competidor candidato es un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo o un anticuerpo que compite para la unión al mismo epítopo que el de un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad anti-CD137 de la presente invención.

Un ejemplo preferente de un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo de cualquiera de [1] a [7] incluye, por ejemplo, un anticuerpo que reconoce una región que comprende la secuencia SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQD CKQGQELTKKGC

(SEC ID n° 113) en la proteína CD137. Un ejemplo adicional incluye un anticuerpo que reconoce una región que comprende la secuencia DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC (SEC ID n° 108) en la proteína CD137.

Un anticuerpo biespecífico antígeno anticáncer/anti-CD137 humano que muestra los efectos antitumorales deseados puede proporcionarse mediante la modificación del anticuerpo anti-CD137 humano anteriormente indicado en un anticuerpo biespecífico con un anticuerpo de antígeno específico de cáncer (por ejemplo, un anticuerpo anti-GPC3 humano) y la evaluación de su capacidad agonista de CD13 dependiente de antígeno específico de cáncer.

En la presente invención, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y un dominio de unión a CD137 humano, tal como se define en las reivindicaciones.

Entre los ejemplos de un anticuerpo biespecífico proporcionado por la presente invención se incluyen los anticuerpos siguientes:

[i] un anticuerpo biespecífico que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 122 (región variable de cadena pesada) y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 123 (región variable de cadena ligera) como dominio de unión a CD137 humano,

[ii] un anticuerpo biespecífico que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 124 (región variable de cadena pesada) y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 82 (región variable de cadena ligera) como dominio de unión a CD137 humano,

[ii] un anticuerpo biespecífico que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 125 (región variable de cadena pesada) y la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 84 (región variable de cadena ligera) como dominio de unión a CD137 humano, y

[iv] un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el epítopo que se une al anticuerpo biespecífico de cualquiera de [i] a [iii].

Según el antígeno de cáncer diana, el experto en la materia puede seleccionar apropiadamente una secuencia de región variable de cadena pesada y una secuencia de región variable de cadena ligera que se unen al antígeno de cáncer como la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera que deben incluirse en el dominio de unión a antígeno específico de cáncer.

Se proporciona además el anticuerpo biespecífico de [iv] que se une al mismo epítopo que el epítopo que se une al anticuerpo biespecífico anti-antígeno específico de cáncer/anticuerpo anti-CD137 humano inductor de citotoxicidad en la presente invención. Dicho anticuerpo puede obtenerse, por ejemplo, mediante el método proporcionado posteriormente.

Además, en el caso de que el anticuerpo de ensayo presente una región constante derivada de una especie diferente de la del anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad anti-CD137 de la presente invención, la cantidad de anticuerpo unida a los pocillos puede medirse mediante la utilización de un anticuerpo marcado que reconozca la región constante de ese anticuerpo. Alternativamente, en el caso de que los anticuerpos se deriven de la misma especie pero que pertenezcan a clases diferentes, la cantidad de los anticuerpos unida a los pocillos puede medirse utilizando anticuerpos que distinguen clases individuales.

Alternativamente, la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse competitivamente o con competición cruzada con otro anticuerpo puede ser apropiadamente determinada por el experto en la materia utilizando un ensayo de unión estándar, tal como análisis BIAcore o citometría de flujo conocidos de la técnica.

Entre los métodos para determinar la conformación espacial de un epítopo se incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional (ver Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, G. E. Morris (ed.), vol. 66 (1996)).

Entre los ejemplos favorables de un anticuerpo biespecífico que se une al mismo epítopo que el epítopo de CD137 humano al que se une el anticuerpo biespecífico de cualquiera de [i] a [iii] incluye anticuerpos biespecíficos que reconocen una región que comprende la secuencia Sp Cp PNSF S sAg GQRTCDICRQCKGVFRTRKEC S ST SNAECDCTPGFHCLGa Gc SMCEQD CKQGQELTKKGC (SEC ID n° 113), una región que comprende la secuencia DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC (SEC iD n° 108), una región que comprende la secuencia LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNA EC (SEC ID n° 111), o una región que comprende la secuencia LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQr Tc (SEC ID n° 106) en la proteína CD137 humana. Entre los ejemplos más preferentes se incluyen anticuerpos biespecíficos que reconocen una región que comprende la secuencia LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNA EC (SEC ID n° 111) o una región que comprende la secuencia LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTC (SEC ID n° 106) en la proteína CD137 humana.

Un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y un dominio de unión a CD40 humano tal como se especifica adicionalmente en las reivindicaciones se proporciona como un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad de la presente invención.

Actividad de unión de los anticuerpos

La actividad de unión a antígeno de un anticuerpo puede medirse utilizando medios conocidos (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA), un inmunoensayo enzimático (EIA), un radioinmunoensayo (RIA), FACS, cribado ALPHA (por sus siglas en inglés, ensayo de proximidad luminiscente homogéneo amplificado), método BIACORE basado en la resonancia del plasmón superficial (SPR) o un fluoroinmunoensayo. Entre los métodos para someter a ensayo la actividad de unión de un anticuerpo a un antígeno expresado por la célula se incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en las páginas 359 a 420 en "Antibodies: A Laboratory Manual".

En particular, los métodos que utilizan un citómetro de flujo pueden utilizarse convenientemente como método para medir la unión entre un antígeno expresado sobre la superficie de las células suspendidas en tampón o similar y un anticuerpo contra el antígeno. Entre los citómetros de flujo que se utilizan se incluyen, por ejemplo, FACSCanto™ II, FACSAria™, FACSArray™, FACSVantage™ SE y FACSCalibur™ (los anteriormente indicados son de BD Biosciences) y EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC, y Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos los anteriormente indicados son de Beckman Coulter).

Un ejemplo de un método adecuado para medir la actividad de unión de un anticuerpo de CD137 de ensayo a un antígeno incluye el método de hacer reaccionar células expresantes de CD137 con un anticuerpo de ensayo y después teñirlas con un anticuerpo secundario marcado con FITC que reconoce el anticuerpo de ensayo y seguidamente realizar mediciones utilizando FACSCalibur (BD) y analizar la intensidad de fluorescencia obtenida utilizando el software CELL QUEST (BD).

Anticuerpo

En la presente memoria, un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina natural o a una inmunoglobulina producida mediante síntesis parcial o completa. Los anticuerpos pueden aislarse a partir de fuentes naturales, tales como plasma y suero naturales, o sobrenadantes de cultivo de células de hibridoma productoras de anticuerpos. Alternativamente, pueden sintetizarse parcial o completamente anticuerpos utilizando técnicas tales como la recombinación genética. Entre los ejemplos adecuados de los anticuerpos se incluyen anticuerpos de un isotipo de una inmunoglobulina o subclase de dicho isotipo. Entre las inmunoglobulinas humanas conocidas se incluyen las de las nueve clases (isotipos) siguientes: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM. De estos isotipos, entre los anticuerpos de la presente invención se incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los métodos para producir anticuerpos con la actividad de unión deseada son conocidos por el experto en la materia y los anticuerpos pueden obtenerse en forma de anticuerpos policlonales o monoclonales. Pueden producirse convenientemente anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos para la utilización en los anticuerpos de la presente invención. Entre dichos anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos se incluyen anticuerpos producidos por hibridomas y anticuerpos producidos por células huésped transformadas con un vector de expresión que porta un gen de anticuerpo, mediante técnicas de ingeniería genética.

No existe ninguna limitación particular en el mamífero a la inmunización para la obtención de anticuerpos. Resulta preferente seleccionar el mamífero mediante la consideración de su compatibilidad con las células parentales que deben utilizarse en la fusión celular para la producción de hibridomas. En general, se utilizan convenientemente conejos, monos y roedores, tales como ratones, ratas y hámsters.

Los animales anteriormente indicados se inmunizan con un antígeno sensibilizador mediante métodos conocidos. Entre los métodos de inmunización generalmente realizados se incluyen, por ejemplo, la inyección intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizador en mamíferos. Específicamente, se diluye apropiadamente un antígeno sensibilizador con solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), solución salina fisiológica o similar. Si se desea, se mezcla un adyuvante convencional, tal como adyuvante completo de Freund, con el antígeno y se emulsiona la mezcla. A continuación, se administra el antígeno sensibilizador en el mamífero varias veces a intervalos de 4 a 21 días. Pueden utilizarse portadores apropiados en la inmunización con el antígeno sensibilizador. En particular, en el caso de que se utilice un péptido parcial de bajo peso molecular como el antígeno sensibilizador, en ocasiones resulta deseable acoplar el péptido antigénico sensibilizador con una proteína portadora, tal como albúmina o hemocianina de lapa americana, para la inmunización.

Alternativamente, pueden prepararse hibridomas que producen un anticuerpo deseado utilizando la inmunización con ADN, tal como se indica posteriormente. La inmunización con ADN es un método de inmunización que confiere inmunoestimulación mediante la expresión de un antígeno sensibilizador en un animal inmunizado como resultado de la administración de un ADN de vector construido para permitir la expresión de un gen codificante de proteína antigénica en el animal. En comparación con los métodos convencionales de inmunización en los que se administra una proteína antigénica en animales que deben inmunizarse, se espera que la inmunización con ADN resulte superior en el aspecto de que:

- puede proporcionarse inmunoestimulación, reteniendo simultáneamente la estructura de una proteína membranal, y

- no hay necesidad de purificar el antígeno para la inmunización.

Con el fin de preparar un anticuerpo monoclonal utilizando la inmunización con ADN, en primer lugar, se administra un ADN que expresa una proteína antigénica en un animal que debe inmunizarse. El a Dn codificante de proteína antigénica puede sintetizarse mediante métodos conocidos, tales como PCR. El ADN obtenido se inserta en un vector de expresión apropiado y después lo anterior se administra en un animal que debe inmunizarse. Preferentemente, entre los vectores de expresión utilizados se incluyen, por ejemplo, vectores de expresión disponibles comercialmente, tales como pcDNA3.1. Los vectores pueden administrarse en un organismo utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, la inmunización con ADN se lleva a cabo mediante la utilización de una pistola génica para introducir partículas de oro recubiertas con vector de expresión en células del cuerpo de un animal que debe inmunizarse.

Tras la inmunización del mamífero tal como se ha indicado anteriormente, se confirma en el suero un incremento del título de un anticuerpo de unión a antígeno. A continuación, se recogen las células inmunitarias a partir del mamífero y después se someten a fusión celular. En particular, preferentemente se utilizan esplenocitos como células inmunitarias.

Se utiliza una célula de mieloma de mamífero como célula para la fusión con las células inmunitarias anteriormente indicadas. Las células de mieloma preferentemente comprenden un marcador de selección adecuado para el cribado. Un marcador de selección confiere características a las células para su supervivencia (o muerte) bajo unas condiciones de cultivo específicas. La deficiencia en hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como deficiencia en HGPRT) o deficiencia en timidina quinasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como deficiencia en TK) son conocidas de la técnica como marcadores de selección. Las células que presentan la deficiencia en HGPRT o TK presentan sensibilidad a hipoxantina-aminopterina-timidina (en lo sucesivo en la presente memoria, abreviada como sensibles a HAT). Las células sensibles a HAT no pueden sintetizar ADN en un medio de selección HAT y, de esta manera, resultan eliminadas. Sin embargo, en el caso de que las células se fusionen con células normales, pueden continuar la síntesis de ADN utilizando la ruta de salvamento de las células normales y, por lo tanto, pueden crecer incluso en el medio de selección HAT.

Las células deficientes en HGPRT y deficientes en TK pueden seleccionarse en un medio que contiene 6-tioguanina, 8-azaguanina (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como 8AG) o 5-bromodesoxiuridina. Las células normales mueren en dicho medio debido a que incorporan dichos análogos de pirimidina en su ADN. En contraste, las células deficientes en dichos enzimas pueden sobrevivir en el medio selectivo debido a que no pueden incorporar dichos análogos de pirimidina. Además, un marcador de selección denominado resistencia a G418 proporcionado por el gen de resistencia a neomicina confiere resistencia a los antibióticos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Se conocen diversos tipos de células de mieloma que resultan adecuados para la fusión celular.

Por ejemplo, preferentemente pueden utilizarse células de mieloma que incluyen las células siguientes:

P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550);

P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7);

NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519);

MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);

SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);

FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);

S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);

R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.

Las fusiones celulares entre los inmunocitos y las células de mieloma se llevan a cabo esencialmente utilizando métodos conocidos, por ejemplo el método de Kohler y Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).

Más específicamente, la fusión celular puede llevarse a cabo, por ejemplo en un medio de cultivo convencional en presencia de un agente promotor de la fusión celular. Entre los agentes promotores de la fusión se incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y el virus Sendai (HVJ). En caso necesario, también se añade una sustancia auxiliar, tal como dimetilsulfóxido, para mejorar la eficiencia de la fusión.

La relación de inmunocitos a células de mieloma puede fijarse arbitrariamente, preferentemente, por ejemplo, una célula de mieloma por cada uno a diez inmunocitos. Entre los medios de cultivo para la utilización para las fusiones celulares se incluyen, por ejemplo, medios que resultan adecuados para el crecimiento de las líneas celulares de mieloma, tales como el medio RPMI1640 y el medio MEM, y otro medio de cultivo convencional utilizado para este tipo de cultivo celular. Además, preferentemente pueden añadirse al medio de cultivo complementos séricos, tales como suero de feto bovino (FCS, por sus siglas en inglés).

Para la fusión celular, se mezclan bien cantidades predeterminadas de las células inmunitarias anteriormente indicadas y las células de mieloma se mezclan bien en el medio de cultivo anteriormente indicado. A continuación, una solución de PEG (por ejemplo, el peso molecular medio es de aproximadamente 1.000 a 6.000) precalentado a aproximadamente 37°C se añade a lo anterior a una concentración generalmente de 30% a 60% (p/v). La solución mezclada se mezcla suavemente para producir las células de fusión (hibridomas) deseadas. A continuación, un medio de cultivo apropiado indicado anteriormente se añade gradualmente a las células y se centrifuga repetidamente para separar el sobrenadante. De esta manera, pueden eliminarse los agentes de fusión celular y similares que no resultan favorables al crecimiento del hibridoma.

Los hibridomas obtenidos de esta manera pueden seleccionarse mediante el cultivo con un medio selectivo convencional, por ejemplo medio HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Se continúa el cultivo en el medio anteriormente indicado utilizando el medio HAT durante un periodo de tiempo suficiente para eliminar células diferentes de los hibridomas deseados (células no fusionadas). Típicamente, el periodo es de varios días a varias semanas. A continuación, los hibridomas productores del anticuerpo deseado se criban y se clonan individualmente mediante métodos convencionales de dilución limitante.

Los hibridomas obtenidos de esta manera pueden seleccionarse mediante la utilización de un medio de cultivo selectivo basado en el marcador de selección que posee el mieloma utilizado para la fusión celular. Por ejemplo, pueden seleccionarse células deficientes en HGPRT o TK mediante el cultivo utilizando el medio HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Específicamente, al utilizar células de mieloma sensibles a HAT para la fusión celular, sólo las células fusionadas con éxito con las células normales pueden proliferar selectivamente en el medio de cultivo de HAT. Se continúa el cultivo en el medio anteriormente indicado utilizando el medio HAT durante un periodo de tiempo suficiente para eliminar células diferentes de los hibridomas deseados (células no fusionadas). Específicamente, pueden seleccionarse hibridomas deseados mediante el cultivo durante generalmente varios días a varias semanas. A continuación, los hibridomas productores del anticuerpo deseado se criban y se clonan individualmente mediante métodos convencionales de dilución limitante.

El cribado y clonación individual de anticuerpos deseados puede llevarse a cabo convenientemente mediante métodos de cribado basados en una reacción de antígeno-anticuerpo conocida. Por ejemplo, puede seleccionarse un anticuerpo deseado mediante cribado utilizando separación celular activada por fluorescencia (FACS). FACS es un sistema que permite la medición de la unión de un anticuerpo a la superficie celular mediante el análisis de células puestas en contacto con un anticuerpo fluorescente utilizando un haz láser, y la medición de la fluorescencia emitida a partir de células individuales.

Para cribar para los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal mediante FACS, en primer lugar se preparan células que expresan el antígeno unido al anticuerpo producido. Las células preferentes utilizadas para el cribado son células de mamífero que se fuerzan para que expresen el antígeno. Mediante la utilización de células de mamífero que se utilizan como la célula huésped pero que no han sido transformadas a modo de control, puede detectarse selectivamente la actividad de un anticuerpo para la unión al antígeno de superficie celular. Específicamente, pueden obtenerse hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal deseado mediante la selección de hibridomas que producen un anticuerpo que se une a las células forzadas a expresar el antígeno pero que no se une a la célula huésped.

Alternativamente, las células que expresan el antígeno de interés se inmovilizan y la actividad del anticuerpo de unirse a las células expresantes de antígeno pueden evaluarse basándose en el principio de un ELISA. Por ejemplo, se inmovilizan células expresantes de antígeno a los pocillos de una placa de ELISA. Los sobrenadantes de cultivo de hibridomas se ponen en contacto con las células inmovilizadas en los pocillos y se detectan los anticuerpos que se unen a las células inmovilizadas. En el caso de que los anticuerpos monoclonales se deriven del ratón, pueden detectarse los anticuerpos unidos a las células utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón. Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado que presentan la capacidad de unión a antígeno se seleccionan mediante el cribado anteriormente indicado y pueden clonarse mediante un método de dilución limitante o similar.

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales preparados de esta manera pueden cultivarse en un medio de cultivo convencional. Los hibridomas pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante un periodo prolongado.

Los hibridomas anteriormente indicados se cultivan mediante un método convencional y pueden obtenerse anticuerpos monoclonales deseados a partir de los sobrenadantes de cultivo. Alternativamente, los hibridomas se administran y se cultivan en mamíferos compatibles y pueden obtenerse anticuerpos monoclonales a partir del ascites. El primer método resulta adecuado para la obtención de anticuerpos con una pureza elevada.

Los anticuerpos que están codificados por genes de anticuerpo clonados a partir de células productoras de anticuerpos, tales como los hibridomas anteriormente indicados, también pueden utilizarse preferentemente. Se inserta un gen de anticuerpo en un vector apropiado y éste se introduce en un huésped para expresar el anticuerpo codificado por el gen. Los métodos para aislar genes de anticuerpo, la inserción de genes en vectores y la transformación de células huésped ya han sido establecidos, por ejemplo en Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775); Los métodos para producir anticuerpos recombinantes también son conocidos, tal como se describen posteriormente.

Generalmente, para obtener un ADNc codificante de la región variable de anticuerpo (región V), en primer lugar se extrae el ARN total a partir de los hibridomas. Por ejemplo, pueden utilizarse los métodos siguientes como métodos para extraer ANRm a partir de las células:

- el método de ultracentrifugación de guanidina (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), y

- el método de AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156-159);

Los ARNm extraídos pueden purificarse utilizando el kit de purificación de ARNm (GE Healthcare Bioscience) o similares. Alternativamente, se encuentran disponibles comercialmente kits para extraer ARNm total directamente de las células, tales como el kit de purificación de ARNm QuickPrep (GE Healthcare Bioscience). Los ARNm pueden prepararse a partir de hibridomas utilizando dichos kits. Los ADNc codificantes de la región V de anticuerpo pueden sintetizarse a partir de los ARNm preparados utilizando una transcriptasa inversa. Los ADNc pueden sintetizarse utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena de transcriptasa inversa AMV (Seikagaku Corporation) o similar. Además, puede utilizarse apropiadamente el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech) y el método de 5'-RACE basado en PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(23), 8998-9002, 1988; Nucleic Acids Res. 17(8), 2919-2932, 1989) para sintetizar y amplificar los ADNc. En dicho procedimiento de síntesis de ADNc, pueden introducirse sitios de enzima de restricción apropiados indicados posteriormente en ambos extremos de un ADNc.

El fragmento de ADNc de interés se purifica a partir del producto de PCR resultante y después se liga a un ADN de vector. De esta manera, se construye un vector recombinante y se introduce en E. coli o similar. Tras la selección de colonias, el vector recombinante deseado puede repararse a partir de los E. co liformadores de colonia. A continuación, se somete a ensayo si el vector recombinante presenta la secuencia de nucleótidos de ADNc de interés mediante un método conocido, tal como el método de determinación de cadena de nucleótidos dideoxi.

El método de 5'-RACE que utiliza cebadores para amplificar el gen de región variable se utiliza convenientemente para aislar el gen codificante de la región variable. En primer lugar, se construye una biblioteca de ADNc 5'-RACE mediante síntesis de ADNc utilizando ARN extraídos de células de hibridoma como molde. Se utiliza apropiadamente un kit disponible comercialmente, tal como el kit de amplificación de ADNc SMART RACE para sintetizar la biblioteca de ADNc 5'-RACE.

El gen de anticuerpo se amplifica mediante PCR utilizando la biblioteca de ADNc 5'-RACE como molde. Los cebadores para amplificar el gen de anticuerpo de ratón pueden diseñarse basándose en secuencias génicas de anticuerpo conocidas. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores varían según la subclase de inmunoglobulina. Por lo tanto, resulta preferente que la subclase se determine previamente utilizando un kit disponible comercialmente, tal como el kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón Iso Strip (Roche Diagnostics).

Específicamente, por ejemplo, se utilizan cebadores que permiten la amplificación de genes codificantes de cadenas pesadas y1, Y2a, Y2b y y3 y cadenas ligeras k y A para aislar los genes codificantes de IgG de ratón. En general, un cebador que se hibride con un sitio de región constante próxima a la región variable se utiliza como cebador del extremo 3' para amplificar un gen de región variable de IgG. Además, se utiliza un cebador unido a un kit de construcción de biblioteca de ADNc 5' RACE como cebador del extremo 5'.

Las inmunoglobulinas compuestas de una combinación de cadenas pesadas y cadenas ligeras pueden conformarse nuevamente utilizando los productos de PCR amplificados de esta manera. Puede seleccionarse un anticuerpo deseado mediante cribado utilizando la actividad de unión a antígeno de una inmunoglobulina conformada nuevamente a modo de indicador. El cribado puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, las etapas siguientes:

(1) poner en contacto una célula expresante de antígeno deseada con un anticuerpo que comprende la región V codificada por un ADNc obtenida de un hibridoma,

(2) detectar la unión del anticuerpo a la célula expresante de antígeno, y

(3) seleccionar un anticuerpo que se une a la célula expresante de antígeno.

Los métodos para detectar la unión de un anticuerpo a las células expresantes de antígeno son conocidos. Específicamente, la unión de un anticuerpo a las células expresantes de antígeno puede detectarse mediante las técnicas anteriormente descritas, tales como FACS. Pueden utilizarse apropiadamente muestras fijadas de las células expresantes de antígeno con el fin de evaluar la actividad de unión de un anticuerpo.

Para los métodos de cribado de anticuerpos que utilizan la actividad de unión como indicador, también pueden utilizarse convenientemente métodos de inmunoadsoción ('panning') que utilizan vectores fágicos. Los métodos de cribado que utilizan vectores fágicos resultan ventajosos en el caso de que se obtengan los genes de anticuerpo a partir de una población celular expresante de anticuerpos policlonales en forma de bibliotecas de subclase de cadena pesada y de cadena ligera. Los genes codificantes de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera pueden unirse mediante una secuencia conectora apropiada para formar un Fc de cadena sencilla (scFv). Los fagos que expresan scFv sobre su superficie pueden producirse mediante inserción de un gen codificante de scFv en un vector fágico. Los fagos se ponen en contacto con un antígeno de interés. A continuación, puede aislarse un ADN codificante de scFv que presenta la actividad de unión de interés mediante la recolección de fagos unidos al antígeno. Dicho procedimiento puede repetirse según resulte necesario para enriquecer en scFv que presentan la actividad de unión de interés.

Tras el aislamiento del ADNc codificante de la región V del anticuerpo de interés, se digiere el ADNc con enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción introducidos en ambos extremos del ADNc. Los enzimas de restricción preferentes reconocen y cortan una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la secuencia de nucleótidos del gen de anticuerpo a una frecuencia baja. Además, un sitio de restricción para un enzima que produce un extremo cohesivo se introduce preferentemente en un vector para insertar un fragmento digerido de copia única en la orientación correcta. El ADNc codificante de la región V del anticuerpo se digiere tal como se ha indicado anteriormente, y se inserta en un vector de expresión apropiado para construir un vector de expresión de anticuerpo. En dicho caso, en el caso de que un gen codificante de la región constante de anticuerpo (región C) y un gen codificante de la región V anteriormente indicada se fusionen en el mismo marco, se obtiene un anticuerpo quimérico. En la presente memoria, un “anticuerpo quimérico” se refiere a que el origen de la región constante es diferente al origen de la región variable. De esta manera, además de los anticuerpos heteroquiméricos de ratón/humanos, se incluyen anticuerpos aloquiméricos humanos/humanos en los anticuerpos quiméricos. Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo quimérico mediante la inserción del gen de región V anteriormente indicado en un vector de expresión que ya presenta la región constante. Específicamente, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento para un enzima de restricción que extrae el gen de región V anteriormente indicado puede situarse apropiadamente en el extremo 5' de un vector de expresión que porta un ADN que codifica una región constante de anticuerpo deseado (región C). Se construye un vector de expresión de anticuerpo quimérico mediante la fusión de dos genes en el mismo marco digeridos con la misma combinación de enzimas de restricción.

Para producir un anticuerpo monoclonal, se insertan genes de anticuerpo en un vector de expresión de manera que los genes se expresan bajo el control de una región reguladora de la expresión. La región reguladora de la expresión para la expresión de anticuerpos incluye, por ejemplo, intensificadores y promotores. Además, puede unirse una secuencia de señal apropiada al extremo amino-terminal de manera que el anticuerpo expresado se secrete hacia el exterior de las células. La secuencia de señal es cortada del extremo carboxilo-terminal del polipéptido expresado y el anticuerpo resultante puede secretarse al exterior de las células. A continuación, se transforman células huésped apropiadas con el vector de expresión y pueden obtenerse células recombinantes que expresan el ADN codificante de anticuerpos.

Los ADN codificantes de la cadena pesada (cadena H) y de la cadena ligera (cadena L) de anticuerpo se insertan por separado en diferentes vectores de expresión para expresar el gen de anticuerpo. Una molécula de anticuerpo que presenta las cadenas H y L puede expresarse mediante cotransfección de la misma célula huésped con vectores en los que se han insertado las cadenas H y L. Alternativamente, pueden transformarse las células huésped con un único vector de expresión en el que se han insertado ADN codificantes de las cadenas H y L (ver el documento n° WO 94/11523).

Existen muchas combinaciones conocidas de células huésped y vectores de expresion para la preparación de anticuerpos mediante la introducción de genes de anticuerpo aislados en los huéspedes apropiados. La totalidad de dichos sistemas de expresión son aplicables al aislamiento de dominios de unión de antígeno específico de cáncer de anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención, superfamilia de receptores de factor de necrosis tumoral (TNFRSF) y dominio de unión a complejo de receptores de células T.

Entre las células eucarióticas apropiadas que se utilizan como células huésped se incluyen células animales, células vegetales y células fúngicas. Específicamente, entre las células animales se incluyen, por ejemplo, las células siguientes.

(1) Células de mamífero: CHO, COS, mieloma, renal de hámster neonato (BHK, por sus siglas en inglés), HeLa, Vero o similares.

(2) Células de anfibio: oocitos de Xenopus, o similares, y

(3) células de insecto: sf9, sf21, Tn5 o similares.

Además, como célula vegetal, se conoce un sistema de expresión génica de anticuerpos que utiliza células derivadas del género Nicotiana, tal como Nicotiana tabacum. Pueden utilizarse apropiadamente células de cultivo de callos para transformar células vegetales.

Además, pueden utilizarse las células siguientes como células fúngicas:

levaduras: el género Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae, y el género Pichia, tal como Pichia pastoris, y

hongos filamentosos: el género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.

Además, también se conocen sistemas de expresión de genes de anticuerpo que utilizan células procarióticas. Por ejemplo, al utilizar células bacterianas, pueden utilizarse convenientemente en la presente invención células de E. coli, células de Bacillus subtilis y similares. Se introducen vectores de expresión que portan los genes de anticuerpo de interés en dichas células mediante transfección. Las células transfectadas se cultivan in vitro y el anticuerpo deseado puede prepararse a partir del cultivo de las células transformadas.

Además de las células huésped anteriormente indicadas, también pueden utilizarse animales transgénicos para producir un anticuerpo recombinante. Es decir, el anticuerpo puede obtenerse de un animal en el que se introduce el gen codificante del anticuerpo de interés. Por ejemplo, el gen de anticuerpo puede construirse en forma de un gen de fusión mediante la inserción en el mismo marco en un en que codifica una proteína producida específicamente en la leche. Puede utilizarse caseína p o similar, por ejemplo, como la proteína secretada en la leche. Los fragmentos de ADN que contienen el gen fusionado en el que se ha insertado el gen de anticuerpo se inyectan en un embrión de cabra y después este embrión se introduce en una cabra hembra. Pueden obtenerse los anticuerpos deseados en forma de una proteína fusionada con la proteína láctea de leche producida por la cabra transgénica que nace de la cabra receptora del embrión (o progenie de la misma). Además, para incrementar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, pueden administrarse hormonas en la cabra transgénica según resulte necesario (Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).

En el caso de que se administre una molécula de unión a antígeno indicada en la presente memoria en un ser humano, puede utilizarse apropiadamente un dominio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo recombinante genéticamente que ha sido artificialmente modificado para reducir la antigenicidad heteróloga contra el ser humano y similares, a modo de diversos dominios de unión en la molécula en el caso de que se utilicen dominios que comprenden una región variable de anticuerpo. Entre dichos anticuerpos genéticamente recombinantes se incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados. Dichos anticuerpos modificados se producen apropiadamente mediante métodos conocidos.

Una región variable de anticuerpo utilizada para producir los diversos dominios de unión de moléculas de unión a antígeno está generalmente formada por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que están separadas por cuatro regiones marco (FR). CDR es una región que determina sustancialmente la especificidad de unión de un anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de las CDR son altamente diversas. Por otra parte, las secuencias de aminoácidos formadoras de FR con frecuencia presentan una elevada identidad, incluso entre anticuerpos con diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, en general, la especificidad de unión de un determinado anticuerpo puede introducirse en otro anticuerpo mediante injertación de CDR.

Un anticuerpo humanizado también se denomina anticuerpo humano reconformado. Específicamente, se conocen anticuerpos humanizados preparados mediante injertación de la CDR de un anticuerpo animal no humano, tal como un anticuerpo de ratón, en un anticuerpo humano y similar. También se conocen técnicas comunes de ingeniería genética para la obtención de anticuerpos humanizados. Específicamente, se conoce, por ejemplo, la PCR de extensión por solapamiento como método para injertar una CDR de anticuerpo de ratón en una FR humana. En la PCR de extensión por solapamiento, se añadió una secuencia de nucleótidos codificante de una CDR de anticuerpo de ratón para la injertación a cebadores para la síntesis de una FR de anticuerpo humano. Los cebadores se preparan para cada una de las cuatro FR. Se considera generalmente que, al injertar un CDR de ratón en una FR humana, la selección de una FR humana que presenta una identidad elevada con una FR de ratón resulta ventajosa para mantener la función de la CDR. Es decir, resulta generalmente preferente utilizar una FR humana que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad elevada con la secuencia de aminoácidos de la FR contigua a la CDR de ratón que debe injertarse.

Se diseñan secuencias de nucleótidos para el ligado de manera que se conecten entre sí en el mismo marco. Se sintetizan individualmente FR humanas utilizando los cebadores respectivos. Como resultado, se obtienen productos en los que el ADN codificante de CDR de ratón se une a los a Dn codificantes de FR individuales. Se diseñan secuencias de nucleótidos codificantes de la CDR de ratón de cada producto de manera que se solapen entre sí. A continuación, se lleva a cabo una reacción de síntesis de la cadena complementaria para hibridar las regiones de CDR solapantes de los productos sintetizados utilizando un gen de anticuerpo humano como mole. Las FR humanas se ligan mediante las secuencias de CDR de ratón mediante dicha reacción.

El gen de la región V de longitud completa, en la que finalmente se ligan tres CDR y cuatro FR, se amplifica utilizando cebadores que se hibridan con su extremo 5' o 3', que se añaden con secuencias de reconocimiento de un enzima de restricción adecuado. Puede producirse un vector de expresión para anticuerpo humanizado mediante la inserción del ADN obtenido tal como se ha indicado anteriormente y un AND que codifica una región C de anticuerpo humano en un vector de expresión de manera que se liguen en el mismo marco. Tras transfectar el vector recombinante en un huésped para establecer células recombinantes, las células recombinantes se cultivan y el ADN codificante del anticuerpo humanizado se expresa para producir el anticuerpo humanizado en el cultivo celular (ver la publicación de patente europea n° EP 239400 y la publicación de patente internacional n° WO 1996/002576).

Mediante la medición cualitativa o cuantitativa y la evaluación de la actividad de unión a antígeno del anticuerpo humanizado producido tal como se ha indicado anteriormente, pueden seleccionarse convenientemente las FR de anticuerpo humano que permiten que las CDR formen un sitio de unión a antígeno favorable al ligarse mediante las CDR. Los residuos aminoácidos en las FR pueden sustituirse según se requiera, de manera que las CDR de un anticuerpo humano conformado nuevamente forman un sitio de unión a antígeno apropiado. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones de secuencia de aminoácidos en las FR mediante la aplicación del método de PCR utilizado para injertar una CDR de ratón en una FR humana. Más específicamente, pueden introducirse mutaciones parciales de secuencias de nucleótidos en cebadores que se hibridan con la FR. Se introducen mutaciones de secuencias de nucleótidos en las FR sintetizadas mediante la utilización de dichos cebadores. Las secuencias de FR mutantes que presentan las características deseadas pueden seleccionarse mediante la medición y evaluación de la actividad del anticuerpo mutante con sustitución de aminoácidos para la unión al antígeno mediante el método anteriormente indicado (Sato K. et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-856).

Alternativamente, pueden obtenerse anticuerpos humanos deseados mediante la inmunización de animales transgénicos que presentan el repertorio entero de los genes de anticuerpo humano (ver los documentos n° WO 1993/012227, n° WO 1992/003918, n° WO 1994/002602, n° WO 1994/025585, n° WO 1996/034096 y n° WO 1996/033735) mediante inmunización con ADN.

Además, también se conocen técnicas para preparar anticuerpos humanos mediante inmunoadsorción ('panning') utilizando bibliotecas de anticuerpos humanos. Por ejemplo, la región V de un anticuerpo humano se expresa en forma de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) sobre la superficie fágica mediante el método de expresión fágica. Pueden seleccionarse los fagos que expresan un scFv que se une al antígeno. Las secuencias de ADN codificantes de la región V de anticuerpo humano que se unen al antígeno pueden determinarse mediante el análisis de los genes de fagos seleccionados. Se determina la secuencia de ADN de la scFv que se une al antígeno. Se prepara un vector de expresión mediante fusión de la secuencia de región V en un mismo marco con la secuencia de región C de un anticuerpo humano deseado, y se inserta lo anterior en un vector de expresión apropiado. Se introduce el vector de expresión en células apropiadas para la expresión tal como las indicadas anteriormente. El anticuerpo humano puede producirse mediante la expresión del gen codificante de anticuerpo humano en las células. Dichos métodos ya se conocen (ver los documentos n° WO 1992/001047, n° WO 1992/020791, n° WO 1993/006213, n° WO 1993/011236, n° WO 1993/019172, n° WO 1995/001438 y n° WO 1995/015388).

Además del método de expresión fágica, también se conocen técnicas que utilizan un sistema de traducción sin células, técnicas para expresar moléculas de unión a antígeno sobre la superficie de virus o células y técnicas que utilizan emulsiones como técnicas para obtener anticuerpos humanos mediante inmunoadsorción ('panning') utilizando bibliotecas de anticuerpos humanos. Por ejemplo, el método de expresión ribosómica en que se forma un complejo entre la proteína traducida y el ARNm mediante el ribosoma mediante eliminación del codón de parada y similares, el método de expresión de ADNc o el método de expresión de ARNm en que una secuencia genética y la proteína traducida se unen covalentemente utilizando un compuesto, tal como purimicina, puede utilizarse el método de expresión de CIS en que se forma un complejo entre el gen y la proteína traducida utilizando una proteína de unión a ácido nucleico, o similar, como técnicas de utilización de un sistema de traducción sin células. Para la técnica de moléculas presentadoras de antígeno sobre la superficie de células o virus, a parte del método de expresión fágica, puede utilizarse el método de expresión de E. coli, el método de expresión en bacterias Gram-positivas, el método de expresión en levaduras, el método de expresión en células de mamífero, el método de expresión vírica y similares. Como técnica que utiliza emulsiones, puede utilizarse el método de expresión vírica in vitro que implica incorporar genes y moléculas relacionadas con la traducción en una emulsión y similares. Dichos métodos ya se conocen públicamente (Nat. Biotechnol. 18(12): 1287-92, dic. de 2000; Nucleic Acids Res. 2006;34(19): e127; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101(9):2806-10, 2 de mar., 2004; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(25):9193-8, 22 de junio, 2004; Protein Eng Des Sel. 2008 Apr;21(4):247-55; Proc Natl Acad Sci USA, 26;97(20):10701-5, 26 de sept., 2000; MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):508-18; y Methods Mol Biol. 2012, 911:183-98).

En la presente invención, el término “específico” se refiere a una condición en la que una de las moléculas que participa en la unión específica no muestra ninguna unión significativa a moléculas aparte de una sola o varias moléculas de pareja de unión. Además, el término “específico” también se utiliza en el caso de que el dominio de unión a antígeno sea específico a un epítopo particular de entre múltiples epítopos contenidos en un antígeno. En el caso de que un epítopo unido a un dominio de unión a antígeno se encuentre contenido en múltiples antígenos diferentes, las moléculas de unión a antígeno que contienen el dominio de unión a antígeno pueden unirse a diversos antígenos que presentan el epítopo.

El término “epítopo” se refiere a un determinante antigénico en un antígeno, y se refiere a un sitio de antígeno al que se unen diversos dominios de unión en las moléculas de unión a antígeno dadas a conocer en la presente memoria. De esta manera, por ejemplo, puede definirse un epítopo según su estructura. Alternativamente, el epítopo puede definirse según la actividad de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno que reconoce el epítopo. En el caso de que el antígeno sea un péptido o polipéptido, el epítopo puede especificarse mediante los residuos aminoácidos que forman el epítopo. Alternativamente, en el caso de que el epítopo sea una cadena sacárida, el epítopo puede especificarse mediante su estructura específica de cadena sacárida.

Un epítopo lineal es un epítopo que contiene un epítopo cuya secuencia primaria de aminoácidos es reconocida. Dicho epítopo lineal típicamente contiene por lo menos tres, y más comúnmente por lo menos cinco, por ejemplo, entre aproximadamente 8 y 10 o entre 6 y 20 aminoácidos en su secuencia específica.

En contraste con el epítopo lineal, un “epítopo conformacional” es un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos que contiene el epítopo no es el único determinante del epítopo reconocido (por ejemplo, la secuencia primaria de aminoácidos de un epítopo conformacional no resulta necesariamente reconocida por un anticuerpo definitorio de epítopo). Los epítopos conformacionales pueden contener un gran número de aminoácidos en comparación con los epítopos lineales. Un anticuerpo que reconoce epítopo conformacional reconoce la estructura tridimensional de un péptido o proteína. Por ejemplo, en el caso de que una molécula de proteína se pliegue y forme una estructura tridimensional, los aminoácidos y/o cadenas principales polipeptídicas que forman un epítopo conformacional se alinean y el epítopo se vuelve más reconocible por el anticuerpo. Entre los métodos para determinar las conformaciones de los epítopos se incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X la espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional, el marcaje de espín específico de sitio y la espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones, aunque sin limitarse a ellos. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), vol. 66, Morris (ed.).

Los ejemplos de un método para evaluar la unión de un epítopo en un antígeno específico de cáncer mediante una molécula de unión a antígeno de ensayo se muestran posteriormente. Según los ejemplos, posteriormente, también pueden llevarse a cabo apropiadamente métodos para evaluar la unión de un epítopo en un antígeno diana a otro dominio de unión.

Por ejemplo, puede confirmarse si una molécula de unión a antígeno de ensayo que comprende un dominio de unión a antígeno para un antígeno específico de cáncer reconoce un epítopo lineal en la molécula de antígeno tal como se indica posteriormente. Por ejemplo, para el propósito anterior se sintetiza un péptido lineal que comprende una secuencia de aminoácidos que forma el dominio extracelular de un antígeno específico de cáncer. El péptido puede sintetizarse químicamente u obtenerse mediante técnicas de ingeniería genética utilizando una región en un ADNc de un antígeno específico de cáncer codificante de la secuencia de aminoácidos que corresponde al dominio extracelular. A continuación, una molécula de unión a antígeno de ensayo contiene un dominio de unión a antígeno para un antígeno específico de cáncer se evalúa para su actividad de unión a un péptido lineal que comprende la secuencia de aminoácidos que constituye el dominio extracelular. Por ejemplo, puede utilizarse un péptido lineal inmovilizado como antígeno para evaluar la actividad de unión al péptido de la molécula de unión a antígeno mediante ELISA. Alternativamente, la actividad de unión a un péptido lineal puede evaluarse basándose en el nivel al que el péptido lineal inhibe la unión de la molécula de unión a antígeno a las células expresantes de antígeno específicas de cáncer. La actividad de unión de la molécula de unión a antígeno al péptido lineal puede demostrarse mediante dichos ensayos.

Pude confirmarse si la molécula de unión a antígeno de ensayo anteriormente indicada que contiene un dominio de unión a antígeno hacia un antígeno reconoce un epítopo conformacional tal como se indica posteriormente. Por ejemplo, una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno para un antígeno específico de cáncer se une fuertemente a células expresantes de antígeno específica de cáncer con el contacto, aunque no se une sustancialmente a un péptido lineal inmovilizado que comprende una secuencia de aminoácidos que forma el dominio extracelular del antígeno específico de cáncer. En la presente memoria, “no se une sustancialmente” se refiere a que la actividad de unión es de 80% o inferior, generalmente de 50% o inferior, preferentemente de 30% o inferior, y particularmente preferentemente de 15% o inferior en comparación con la actividad de unión a las células expresantes de antígeno.

Entre los métodos de ensayo de la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de ensayo que comprende un dominio de unión a antígeno a células expresantes de antígeno se incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en Antibodies A Laboratory Manual (ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Específicamente, la evaluación puede llevare a cabo basándose en el principio de ELISA o separación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando células expresantes de antígenos como antígeno.

En el formato de ELISA, la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de ensayo que comprende un dominio de unión a antígeno a células expresantes de antígeno puede evaluarse cuantitativamente mediante la comparación de los niveles de señales generadas mediante reacción enzimática. Específicamente, una molécula de unión a antígeno de ensayo se añade a una placa ELISA en la que se inmovilizan células expresantes de antígeno. A continuación, la molécula de unión a antígeno de ensayo unida a las células se detecta utilizando un anticuerpo marcado enzimáticamente que reconoce la molécula de unión a antígeno de ensayo. Alternativamente, en el caso de que se utilice FACS, se prepara una serie de dilución de una molécula de unión a antígeno de ensayo y el título de unión a anticuerpos para las células expresantes de antígenos puede determinarse para comparar la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno de ensayo a las células expresantes de antígenos.

La unión de una molécula de unión a antígeno de ensayo a un antígeno expresado sobre la superficie de las células suspendidas en tampón o similares puede detectarse utilizando un citómetro de flujo. Entre los citómetros de flujo conocidos se incluyen, por ejemplo, los dispositivos siguientes:

FACSCanto™ II

FACSAria™

FACSArray™

FACSVantage™ SE

FACSCalibur™ (todos son nombres comerciales de BD Biosciences)

EPICS ALTRAHyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos son nombres comerciales de Beckman Coulter).

Entre los métodos adecuados para someter a ensayo la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno de ensayo anteriormente indicada que comprende un dominio de unión a antígeno hacia un antígeno se incluyen, por ejemplo, el método posteriormente. En primer lugar, se hacen reaccionar células expresantes de antígenos con una molécula de unión a antígeno de ensayo y después lo anterior se tiñe con un anticuerpo secundario marcado con FITC que reconoce la molécula de unión a antígeno. La molécula de unión a antígeno de ensayo se diluye apropiadamente con un tampón adecuado, preparando la molécula de unión a antígeno a una concentración deseada. Por ejemplo, la molécula puede utilizarse a una concentración comprendida en el intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. A continuación, se determina la intensidad de fluorescencia y el recuento celular utilizando FACSCalibur (BD). La intensidad de fluorescencia obtenida mediante análisis utilizando el software CELL QUEST (BD), es decir, el valor de media geométrica, refleja la cantidad de anticuerpo unido a las células. Es decir, la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de ensayo, que se representa mediante la cantidad de molécula de unión a antígeno de ensayo unida, puede medirse mediante la determinación del valor de la media geométrica.

Puede evaluarse si una molécula de unión a antígeno de ensayo que comprende un dominio de unión a antígeno utilizado en la presente invención comparte un epítopo común con otra molécula de unión a antígeno basándose en la competición entre las dos moléculas para el mismo epítopo. La competición entre las moléculas de unión a antígeno puede detectarse mediante un ensayo de bloqueo cruzado o similar. Por ejemplo, el ensayo ELISA competitivo es un ensayo de bloqueo cruzado preferente.

Específicamente, en un ensayo de bloqueo cruzado, el antígeno que recubre los pocillos de una placa de microtitulación se preincuba en presencia o en ausencia de una molécula candidata de unión a antígeno competidora, y después se añade a lo anterior una molécula de unión a antígeno de ensayo. La cantidad de molécula de unión a antígeno de ensayo unida al antígeno en los pocillos se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión de una molécula candidata de unión a antígeno competidora que compita para la unión al mismo epítopo. Es decir, a mayor afinidad de la molécula de unión a antígeno competidora para el mismo epítopo, menor actividad de unión de la molécula de unión a antígeno de ensayo en los pocillos recubiertos con antígeno.

La cantidad de la molécula de unión a antígeno de ensayo unida a los pocillos mediante el antígeno puede determinarse fácilmente mediante marcaje previo de la molécula de unión a antígeno. Por ejemplo, puede medirse una molécula de unión a antígeno marcada con biotina utilizando un conjugado de avidina/peroxidasa y sustrato apropiado. En particular, un ensayo de bloqueo cruzado que utiliza un marcaje enzimático, tal como la peroxidasa, se denomina "ensayo ELISA competitivo". La molécula de unión a antígeno también puede marcarse con otras sustancias de marcaje que permiten la detección o la medición. Específicamente, se conocen marcajes radioactivos, marcajes fluorescentes y similares.

En el caso de que la molécula de unión a antígeno competidora candidata pueda bloquear la unión de una molécula de unión a antígeno de ensayo que comprende un dominio de unión a antígeno en por lo menos 20%, preferentemente por lo menos 20% a 50%, y más preferentemente por lo menos 50%, en comparación con la actividad de unión en un experimento de control realizado en ausencia de la molécula de unión a antígeno competidora, se determina que la molécula de unión a antígeno de ensayo se une sustancialmente al mismo epítopo al que se une la molécula de unión a antígeno competidora, o que compite para la unión al mismo epítopo.

En el caso de que ya se haya identificado la estructura del epítopo que se une a una molécula de unión a antígeno de ensayo que comprende un dominio de unión a antígeno utilizado en la presente invención, puede evaluarse si las moléculas de unión a antígeno de ensayo de control comparten un epítopo común, mediante la comparación de las actividades de unión de las dos moléculas de unión a antígeno a un péptido preparado mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos en el péptido que forma el epítopo.

Como método para medir dichas actividades de unión, por ejemplo, se miden las actividades de unión de moléculas de unión a antígeno de ensayo y de control a un péptido lineal en el que se introduce una mutación, mediante comparación en el formato ELISA anteriormente indicado. Aparte de los métodos de ELISA, la actividad de unión al péptido mutante unido a la columna puede determinarse haciendo pasar las moléculas de unión a antígeno de ensayo y de control por la columna y cuantificando después la molécula de unión a antígeno que se eluye en el eluido. Los métodos para adsorber un péptido mutante a una columna, por ejemplo en la forma de un péptido de fusión GST, son conocidos.

Alternativamente, en el caso de que el epítopo identificado sea un epítopo conformacional, puede evaluarse si las moléculas de unión a antígeno de ensayo y de control comparten un epítopo común, mediante el método siguiente. En primer lugar, se preparan células que expresan un antígeno que es diana de un dominio de unión a antígeno y células que expresan un antígeno que presenta un epítopo introducido con una mutación. Las moléculas de unión a antígeno de ensayo y de control se añaden a una suspensión celular preparada mediante la suspensión de dichas células en un tampón apropiado, tal como PBS. A continuación, la suspensión celular se lava apropiadamente con un tampón y se añade a la misma un anticuerpo marcado con FITC que puede reconocer las moléculas de unión a antígeno de ensayo y de control. Se determina la intensidad de la fluorescencia y el número de células teñidas con el anticuerpo marcado utilizando FACScalibur (BD). Las moléculas de unión a antígeno de ensayo y de control se diluyen apropiadamente utilizando un tampón adecuado, y se utilizan a concentraciones deseadas. Por ejemplo, pueden utilizarse a una concentración comprendida en el intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. La intensidad de fluorescencia determinada mediante análisis utilizando el software CELL QUEST (BD), es decir, el valor de media geométrica, refleja la cantidad de anticuerpo marcado que está unido a las células. Es decir, las actividades de unión de las moléculas de unión a antígeno de ensayo y de control, que se representan mediante la cantidad de anticuerpo marcado que está unido, pueden medirse mediante la determinación del valor de la media geométrica.

Una “molécula de unión a antígeno” de la presente exposición comprende tanto cadenas pesadas como cadenas ligeras que forman una “región variable de anticuerpo” en una única cadena polipeptídica; sin embargo, puede ser un fragmento de anticuerpo que no presenta una región constante. Entre los ejemplos de dichos fragmentos de anticuerpo se incluyen un diacuerpo (Db), un scFv, un anticuerpo de cadena sencilla, un sc(Fv)²y un sc(Fab')².

Db es un dímero compuesto de dos cadenas polipeptídicas (Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 6448 (1993); patente Ep n° 404.097 y documento n° WO93/11161). En cada cadena polipeptídica, se une una región variable de cadena L (VL) y una región variable de cadena H (VH) mediante un conector suficientemente corto para que dichas dos regiones en la misma cadena no puedan asociarse entre sí, por ejemplo un conector de aproximadamente cinco residuos.

Debido a que el conector entre VL y VH es excesivamente corto para la formación de un fragmento de región variable de cadena sencilla, VL y VH codificados en la misma cadena polipeptídica dimerizan para formar dos sitios de unión a antígeno.

Además, en la presente memoria, los términos “scFv”, “anticuerpo de cadena sencilla” y "sc(Fv)²“ se refieren todos a un fragmento de anticuerpo de una única cadena polipeptídica que contiene regiones variables derivadas de las cadenas pesadas y ligeras, pero no la región constante. En general, un anticuerpo de cadena sencilla contiene además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite la formación de una estructura desada que se cree que permite la unión de antígenos. El anticuerpo de cadena sencilla se comenta en detalle en Pluckthun, en: "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)". Ver también la publicación de patente internacional n° WO 1988/001649; las patentes US n° 4.946.778 y n° 5.260.203. En una exposición particular, el anticuerpo de cadena sencilla puede ser biespecífico y/ o humanizado.

scFv es un dominio de unión a antígeno en el que VH y VL que forman Fv se unen entre sí mediante un conector peptídico (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85(16), 5879-5883); VH y VL pueden conservarse en estrecha proximidad mediante el conector peptídico.

sc(Fv)²es un anticuerpo de cadena sencilla en la que se unen cuatro regiones variables de dos VL y dos VH, mediante conectores, tales como conectores peptídicos, formando una cadena sencilla (J. Immunol. Methods (1999) 231(1-2), 177-189). Los dos VH y dos Vl pueden derivarse de anticuerpos monoclonales diferentes. Dicho sc(Fv)²preferentemente incluye, por ejemplo, un sc(Fv)²biespecífico que reconoce dos tipos de epítopo presentes en un único antígeno tal como se da a conocer en Journal of Immunology (1994) 152(11), 5368-5374. Puede producirse sc(Fv)²mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, puede producirse sc(Fv)²mediante la unión de scFv mediante un conector, tal como un conector peptídico.

En la presente memoria, la forma de un dominio de unión a antígeno que forma un sc(Fv)2 incluye un anticuerpo en el que las dos unidades VH y las dos unidades VL se disponen en el orden de VH, VL, VH y VL ([VH]-conector-[VL]-conector-[VH]-conector-[VL]) partiendo del extremo N-terminal de un polipéptido de cadena sencilla. El orden de las dos unidades VH y dos unidades VL no se encuentra limitado a la forma anteriormente indicada, y pueden disponerse en cualquier orden. Se proporcionan a continuación ejemplos de orden.

[VL]-conector-[VH]-conector-[VH]-conector-[VL]

[VH]-conector-[VL]-conector-[VL]-conector-[VH]

[VHj-conector-[VH]-conector-[VL]-conector-[VL]

[VL]-conector-[VL]-conector-[VH]-conector-[VH]

[VL]-conector-[VH]-conector-[VL]-conector-[VH]

La forma molecular de sc(Fv)²también se describe en detalle en el documento n° WO2006/132352. Según dichas descripciones, el experto en la materia puede preparar apropiadamente sc(Fv)²deseado para producir las moléculas de unión a antígeno dadas a conocer en la presente memoria.

En la presente memoria, la expresión “fragmento variable (Fv)” se refiere a la unidad mínima de un dominio de unión a antígeno derivada de anticuerpo compuesta de una pareja de región varaible de cadena ligera de anticuerpo (VL) y región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH). En 1988, Skerra y Pluckthun encontraron que los anticuerpos homogéneos y activos pueden prepararse a partir de la fracción periplásmica de E. coli mediante la inserción de un gen de anticuerpo corriente abajo de una secuencia de señal bacteriana e inducir la expresión del gen en E. coli (Science (1988) 240(4855), 1038-1041). En el Fv preparado a partir de la fracción de periplasma, VH se asocia con VL de manera que se une a un antígeno.

Además, la molécula de unión a antígeno puede conjugarse con un polímero portador, tal como PEG o un compuesto orgánico, tal como un agente anticáncer. Alternativamente, puede insertarse una secuencia de glucosilación para añadir convenientemente una cadena sacárida para el propósito de producir un efecto deseado.

Los conectores que deben utilizarse para la unión de las regiones variables de un anticuerpo comprenden conectores peptídicos arbitrarios que pueden introducirse mediante ingeniería genética, conectores sintéticos y conectores dados a conocer en, por ejemplo, Protein Engineering 9(3), 299-305, 1996. Sin embargo, los conectores peptídicos resultan preferentes. La longitud de los conectores peptídicos no se encuentra particularmente limitada, y puede ser seleccionada convenientemente por el experto en la materia según el propósito. La longitud es preferentemente de cinco aminoácidos o más (sin limitación particular, el límite superior es generalmente de 30 aminoácidos o inferior, preferentemente de 20 aminoácidos o inferior) y particularmente preferentemente de 15 aminoácidos. En el caso de que sc(Fv)²contenga tres conectores peptídicos, la longitud de todos ellos puede ser igual o diferente.

Por ejemplo, entre dichos conectores peptídicos se incluyen:

Ser

G lySer

G lyG lySer

SerG lyG ly

G lyG lyG lyS er (SEC ID n° 20)

Ser Gly Gly Gly (SEC ID n° 21)

G lyG lyG lyG lyS e r (SEC ID n° 22)

Ser Gly Gly Gly Gly (SEC ID n° 23)

G lyG lyG lyG lyG lyS e r (SEC ID n° 24)

Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEC ID n° 25)

G lyG lyG lyG lyG lyG lyS e r (SEC ID n° 26)

S e rG lyG lyG lyG lyG lyG ly (SEC ID n° 27)

(Gly Gly Gly Gly Ser (SEC ID n° 22))n

(S erG IyG lyG lyG ly (SEC ID n° 23))n

en donde n representa un número entero igual a 1 o superior. La longitud de las secuencias de los conectores peptídicos puede ser seleccionada correspondientemente por el experto en la materia según el propósito.

Los conectores sintéticos (agentes de entrecruzamiento químicos) se utilizan rutinariamente para entrecruzar péptidos, y por ejemplo:

N-hidroxisuccinimida (NHS),

suberato de disuccinimidilo (DSS),

suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3),

ditiobis(propionato de succinimidilo) (DSP),

ditiobis(propionato de succinimidilo) (DTSSP),

etilenglicol bis(succinato de succinimidilo) (EGS),

etilenglicol bis(succinato de sulfosuccinimidilo) (sulfo-EGS),

tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST),

bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES),

y bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo-BSOCOES). Estos agentes de entrecruzamiento se encuentran disponibles comercialmente.

En general, se requieren tres conectores para unir cuatro regiones variables de anticuerpo entre sí. Los conectores que deben utilizarse pueden ser del mismo tipo o de tipos diferentes.

Además, "Fab" está compuesto de una única cadena sencilla y un dominio CH1 y región variable de una única cadena pesada. La cadena pesada de la molécula de Fab forma enlaces disulfuro con otra molécula de cadena pesada.

"F(ab')²" o "Fab"' se produce mediante tratamiento de una inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) con una proteasa, tal como pepsina y papaína, y se refiere a un fragmento de anticuerpo generado mediante digestión de una inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) en proximidad a los enlaces disulfuro presentes entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas H. Por ejemplo, la papaína corta la IgG corriente arriba de los enlaces disulfuro presentes entre las regiones bisagra en cada una de las dos cadenas H para generar dos fragmentos de anticuerpo homólogos, en los que una cadena L que comprende VL (región variable de cadena L) y CL (región constante de cadena L) está unida a un fragmento de cadena H que comprende VH (región variable de cadena H) y CHy I (región Y1 en una región constante de cadena H) mediante un enlace disulfuro en sus regiones C-terminales. Cada uno de dichos dos fragmentos de anticuerpo homólogos se denomina Fab'.

"F(ab')²" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que comprenden la región constante de un dominio CH1 y una parte de un dominio CH2 de manera que se forman enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas. El fragmento F(ab')²que constituye una molécula de unión a antígeno dada a conocer en la presente memoria puede obtenerse preferentemente tal como se indica posteriormente. Un anticuerpo monoclonal de longitud completa o similar que comprende un dominio de unión a antígeno deseado se digiere parciamente con una proteasa, tal como pepsina, y después se eliminan los fragmentos Fc mediante adsorción en una columna con proteína A. La proteasa no se encuentra particularmente limitada con la condición de que pueda digerir un anticuerpo de longitud completa de una manera restrictiva para producir F(ab')²mediante el establecimiento apropiado de las condiciones de la reacción enzimática, tales como el pH. Entre dichas proteasas se incluyen, por ejemplo, la pepsina y la ficina.

Se da a conocer que la "molécula de unión a antígeno" incluye un anticuerpo multiespecífico. Al utilizar una región Fc con actividad de unión a receptor de Fcy reducida como la región Fc de un anticuerpo multiespecífico, también puede utilizarse apropiadamente una región Fc derivada de un anticuerpo multiespecífico. Para los anticuerpos multiespecíficos, en particular, resultan preferentes los anticuerpos biespecíficos.

Para la asociación de anticuerpos multiespecíficos, puede aplicarse la técnica de introducir repulsión de cargas en la interfaz de la segunda región constante de la cadena H de anticuerpo (CH2) o la tercera región constante de la cadena H (CH3) para suprimir las asociaciones no deseadas entre cadenas H (documento n° WO2006/106905).

En la técnica de supresión de la asociación no deseada entre las cadenas H mediante la introducción de repulsión de cargas en la interfaz de CH2 o CH3, entre los ejemplos de los residuos aminoácidos que se ponen en contacto en la interfaz de otras regiones constantes de la cadena H se incluye la región orientada hacia el residuo en la posición 356 (numeración de UE), el residuo en la posición 439 (numeración de UE), el residuo en la posición 357 (numeración de UE), el residuo en la posición 370 (numeración de UE), el residuo en la posición 399 (numeración de UE) y el residuo en la posición 409 (numeración de UE) en la región CH3.

Más específicamente, por ejemplo, para un anticuerpo que comprende dos tipos de regiones CH3 de cadena H, puede producirse el anticuerpo de manera que una a tres parejas de residuos aminoácidos seleccionados de las parejas de residuos aminoácidos mostradas posteriormente en (1) a (3) en la región CH3 de la primera cadena H presenten la misma carga: (1) los residuos aminoácidos en las posiciones 356 y 439 (numeración de UE), que son residuos aminoácidos contenidos en la región CH3 de la cadena H, (2) los residuos aminoácidos en las posiciones 357 y 370 (numeración de UE), que son residuos aminoácidos contenidos en la región CH3 de la cadena H, y (3) los residuos aminoácidos en las posiciones 399 y 409 (numeración de UE), que son residuos aminoácidos contenidos en la región CH3 de la cadena H.

Además, puede producirse el anticuerpo de manera que una a tres parejas de residuos aminoácidos correspondientes a las parejas de residuos aminoácidos mostradas anteriormente en (1) a (3) presenten el mismo tipo de carga en la región CH3 de la primera cadena H, que son parejas de residuos aminoácidos seleccionados de las parejas de residuos aminoácidos mostradas anteriormente en (1) a (3) en la región CH3 de la segunda cadena H, que difiere de la región CH3 de la primera cadena H, presenten una carga opuesta a los residuos aminoácidos correspondientes en la región CH3 de la primera cadena H anteriormente indicada.

Los residuos aminoácidos respectivos de (1) a (3) indicados anteriormente se encuentran situados próximos entre sí al asociarse. Para la región c H3 de la cadena H deseada o la región constante de cadena H, el experto en la materia puede encontrar sitios correspondientes a los residuos aminoácidos anteriormente indicados de (1) a (3) mediante modelado de homologías y similares utilizando software disponible comercialmente, y los residuos aminoácidos de dichos sitios pueden someterse a modificación según resulte apropiado.

En los anticuerpos anteriormente indicados, se seleccionan preferentemente "residuos aminoácidos que presentan una carga", por ejemplo de entre los residuos aminoácidos contenidos en cualquiera de los grupos (a) y (b), a continuación:

(a) ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D), y

(b) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

Con respecto a los anticuerpos anteriormente indicados, "que presentan el mismo tipo de carga" se refiere a que, por ejemplo, dos o más residuos aminoácidos están incluidos en cualquiera de los dos grupos anteriormente indicados, (a) y (b). La expresión "que presenta la carga opuesta" se refiere a que, por ejemplo, en el caso de que por lo menos uno de entre los dos o más residuos aminoácidos presenta un residuo aminoácido incluido en cualquiera de los grupos anteriormente indicados (a) y (b), el resto de residuos aminoácidos presentará un residuo aminoácido incluido en el otro grupo.

Preferentemente, en el anticuerpo anteriormente indicado, la región CH3 de la primera cadena H y la región CH3 de la segunda cadena H pueden entrecruzarse mediante un enlace disulfuro.

El residuo aminoácido que debe someterse a alteración no se encuentra limitado a un residuo aminoácido de la región constante o región variable del anticuerpo indicado anteriormente. Con respecto a los mutantes o heterodímeros polipeptídicos, el experto en la materia puede encontrar residuos aminoácidos que forman la interfaz mediante modelado de homologías y similares utilizando software disponible comercialmente y puede someter los residuos aminoácidos en esos sitios a alteraciones de manera que la asociación esté regulada.

También pueden utilizarse otras técnicas conocidas para la asociación de anticuerpos multiespecíficos. Los polipéptidos con diferentes aminoácidos que presentan una región Fc pueden asociarse eficientemente entre sí mediante la sustitución de una cadena lateral de aminoácidos en una de las regiones variables de cadena H del anticuerpo por una cadena lateral más grande (botón) y la sustitución de una cadena de aminoácidos presente en la región variable correspondiente de la otra cadena H por una cadena lateral más pequeña (ojal), para permitir la introducción del botón dentro del ojal (documento n° WO1996/027011; Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681 y documento n° US20130336973).

Además, también pueden utilizarse otras técnicas conocidas para formar anticuerpos multiespecíficos. La asociación de polipéptidos que presentan diferentes secuencias puede inducirse eficientemente mediante la asociación complementaria de CH3 utilizando un dominio CH3 manipulado por intercambio de cadenas producido mediante la modificación de parte de CH3 en una de las cadenas H de un anticuerpos en su secuencia derivada de IgA correspondiente y la introducción en la parte complementaria de CH3 en la otra cadena H de su secuencia derivada de IgA correspondiente (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). Dicha técnica conocida también puede utilizarse para formar eficientemente anticuerpos multiespecíficos de interés.

Además, pueden utilizarse las técnicas siguientes y similares para la formación de anticuerpos multiespecíficos: técnicas para la producción de anticuerpos utilizando la asociación de CH1 y CL de anticuerpo, y la asociación de VH y VL tal como se indica en los documentos n° WO 2011/028952 y n° WO2014/018572 y en Nat. Biotechnol. 32(2): 191-8, feb. de 2014; técnicas para producir anticuerpos biespecíficos utilizando anticuerpos monoclonales preparados por separado en combinación (intercambio de brazos de Fab) tal como se indica en los documentos n° WO2008/119353 y n° WO2011/131746; técnicas para regular la asociación entre las CH3 de cadena pesada de anticuerpo tal como se indica en los documentos n° WO2012/058768 y n° WO2013/063702; técnicas para producir anticuerpos biespecíficos compuestos de dos tipos de cadena ligera y un tipo de cadena pesada tal como se indica en el documento n° WO2012/023053; técnicas para producir anticuerpos biespecíficos utilizando dos cepas de células bacterianas que expresan individualmente una de las cadenas de un anticuerpo que comprende una única cadena H y una única cadena L tal como indican Christoph et al. (Nature Biotechnology vol. 31, páginas 753 a 758 (2013)).

La formación de anticuerpos multiespecíficos incluye métodos para obtener anticuerpos biespecíficos mediante la mezcla de dos tipos de anticuerpo monoclonal en presencia de un agente reductor para cortar los enlaces disulfuro en la región bisagra nuclear, seguido de la nueva asociación para la heterodimerización (FAE), tal como se ha indicado anteriormente. Además, la introducción de interacciones electrostáticas en la interfaz de interacción de la región CH3 (documento n° WO2006/106905) puede inducir una heterodimerización todavía más eficiente durante la reasociación (documento n° WO2015/046467). En las FAE utilizando IgG naturales, la reasociación tiene lugar aleatoriamente y, de esta manera, en teoría, sólo pueden obtenerse anticuerpos biespecíficos con una eficiencia de 50%; sin embargo, en dicho método, pueden producirse anticuerpos biespecíficos con un rendimiento elevado.

Alternativamente, aunque no pueda formarse eficientemente un anticuerpo multiespecífico de interés, puede obtenerse un anticuerpo multiespecífico mediante la separación y purificación del anticuerpo multiespecífico de interés a partir de los anticuerpos producidos. Por ejemplo, se ha informado de un método que permite la purificación de dos tipos de forma homóloga y el anticuerpo de interés heterólogo mediante cromatografía de intercambio iónico, mediante la provisión de una diferencia en los puntos isoeléctricos mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos en las regiones variables de los dos tipos de cadena H (documento n° WO2007/114325). Hasta hoy, como método para purificar formas heterólogas, se ha informado de un método que utiliza proteína A para purificar un anticuerpo heterodimerizado que comprende una cadena H de IgG2a de ratón que se une a proteína A y una cadena H de IgG2b de rata que no se une a proteína A (documentos n° WO98/050431 y n° WO95/033844). Además, el anticuerpo heterodimerizado mismo puede purificarse eficientemente utilizando una columna con proteína A mediante la modificación de la interacción entre cada una de las cadenas H y proteína A, mediante la utilización de cadenas H en las que los residuos aminoácidos en el sitio de unión de IgG-proteína A, posiciones 435 y 436 (numeración de UE), se sustituyen con aminoácidos que rinden una fuerza de unión diferente a proteína A, tal como Tyr, His o similar.

Alternativamente, una cadena L común que puede proporcionar capacidad de unión a una pluralidad de diferentes cadenas H puede obtenerse y utilizarse como la cadena L común de un anticuerpo multiespecífico. Puede conseguirse la expresión eficiente de una IgG multiespecífica mediante la introducción de los genes de dicha cadena L común y una pluralidad de diferentes cadenas H en células y la expresión de las IgG (Nature Biotechnology 16:677-681, 1998). Un método para seleccionar una cadena L común que muestra una fuerte capacidad de unión a cualesquiera cadenas H diferentes también puede utilizarse en el caso de que se seleccione una cadena H común (documento n° WO 2004/065611).

Además, una región Fc cuya heterogeneidad C-terminal ha sido mejorada puede utilizarse apropiadamente como una región Fc en la presente invención. Más específicamente, se proporcionan regiones Fc que no presentan glicina en la posición 446 y lisina en la posición 447, tal como se especifica mediante numeración de UE, en las secuencias de aminoácidos de dos polipéptidos que constituyen una región Fc derivada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Puede utilizarse una pluralidad, tal como dos o más, de dichas técnicas en combinación. Además, dichas técnicas pueden aplicarse apropiadamente y por separado a las dos cadenas H que deben asociarse. Además, dichas técnicas pueden utilizarse en combinación con la región Fc anteriormente indicada de la que se ha reducido la actividad de unión a receptores de Fcy. Además, una molécula de unión a antígeno puede ser una molécula producida por separado basada en una molécula de unión a antígeno sometida a las modificaciones anteriormente indicadas, de manera que presente la misma secuencia de aminoácidos.

Una molécula de unión a antígeno (primera molécula de unión a antígeno) de la presente exposición puede comprender: (1) el dominio de unión a antígeno específico de cáncer indicado anteriormente, y (2) un dominio de unión a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (t Nf ) o un dominio de unión a la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), y su estructura no se encuentra limitada. Al comprender dichos dos dominios de unión, la primera molécula de unión a antígeno activa específicamente células que expresan una molécula que pertenece a la superfamilia de TNF o a la superfamilia de receptores de TNF, y que expresa un antígeno específico de cáncer o son células contenidas en tejidos tumorales que comprenden dichas células, e induce efectos citotóxicos excelentes (específicos) contra dichas células expresantes de antígeno específico de cáncer o tejidos tumorales que contienen dichas células. Un dominio de unión a antígeno específico de cáncer, un dominio de unión a la superfamilia de TNF y un dominio de unión a la superfamilia de receptores de TNF puede seleccionarse apropiadamente utilizando un antígeno específico de cáncer o un antígeno perteneciente a la superfamilia de TNF o a la superfamilia de receptores de TNF indicados anteriormente, respectivamente. Dichos dominios de unión pueden unirse directamente mediante enlaces peptídicos o unirse mediante conectores.

Las moléculas de unión a antígeno utilizadas en la presente invención y el anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad de la invención comprenden además un dominio de unión a FcRn. En el caso de que se utilice una región Fc de anticuerpo indicada anteriormente como el dominio de unión a FcRn, es una región Fc con una actividad reducida de unión a receptores de Fcy. La reducción de la actividad se une a un receptor de Fcy permite la supresión de efectos secundarios producidos por inmunoestimulación, tal como la liberación de citoquinas causada por el entrecruzamiento entre las células expresantes de receptor de Fcy y las células que expresan factores pertenecientes a la superfamilia de receptores de TNF.

Las moléculas de unión a antígeno utilizadas en la presente invención y los anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención pueden producirse utilizando métodos conocidos indicados anteriormente. Por ejemplo, en el caso de que se utilice (1) F(ab')²como dominio de unión a antígeno específico de cáncer, (2) F(ab')²como dominio de unión a superfamilia de TNF o dominio de unión a superfamilia de receptores de TNF, y (3) dominio que comprende una región Fc con actividad reducida de unión a receptor de Fcy como dominio de unión a FcRn, y en el caso de que los dominios de unión a antígeno indicados en (1) y (2) y el dominio que contiene región Fc indicada en (3) se unen directamente mediante enlaces peptídicos, los polipéptidos unidos formarán una estructura de anticuerpo. Dichos anticuerpos pueden producirse mediante purificación a partir del medio de cultivo de hibridoma anteriormente indicado y también mediante purificación de anticuerpos a partir del medio de cultivo de células huésped deseadas que portan establemente polinucleótidos codificantes de polipéptidos que constituyen el anticuerpo.

Además de los conectores ejemplificados anteriormente, los conectores con etiquetas peptídicas, tales como etiqueta His, etiqueta HA, etiqueta myc y etiqueta FLAG también pueden utilizarse convenientemente como los conectores para la utilización en la conexión de cada uno de los dominios mediante conectores. Además, puede utilizarse convenientemente la unión de hidrógeno, unión de disulfuro, unión covalente, interacción iónica o la propiedad de unión mutua como resultado de la combinación de los mismos. Por ejemplo, puede utilizarse la afinidad entre CH1 y CL de anticuerpo y también pueden utilizarse regiones Fc derivadas de los anticuerpos multiespecíficos anteriormente indicados para la asociación heteróloga de regiones Fc.

En la presente invención, puede utilizarse una primera molécula de unión a antígeno, que es un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad de la invención, en combinación con una segunda molécula de unión a antígeno.

Tal como en el caso con la primera molécula de unión a antígeno, se da a conocer que la estructura de una segunda molécula de unión a antígeno no se encuentra limitada y puede comprender:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

(2) un dominio de unión a complejo de receptores de células T,

y puede obtenerse mediante métodos similares a aquellos para la primera molécula de unión a antígeno. Además, con la condición de que la segunda molécula de unión a antígeno contenga un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y un dominio de unión a complejo de receptores de células T, su estructura no debe ser necesariamente la misma que la de la primera molécula de unión a antígeno. El antígeno específico de cáncer unido mediante el dominio de unión a antígeno específico de cáncer de la primera molécula de unión a antígeno y el antígeno específico de cáncer unido mediante el dominio de unión a antígeno específico de cáncer de la segunda molécula de unión a antígeno puede ser igual o diferente, aunque preferentemente son el mismo antígeno específico de cáncer. En el caso de que los antígenos específicos de cáncer sean iguales, los epítopos a los que se une la primera y segunda moléculas de unión a antígeno pueden ser iguales o diferentes. La utilización de dicha primera y segunda moléculas de unión a antígeno en combinación rinde una excelente actividad citotóxica. El dominio de unión a antígeno específico de cáncer y el dominio de unión a complejo de receptores de células T en el segundo dominio de unión a antígeno puede seleccionarse apropiadamente, respectivamente, a partir de los antígenos específicos de cáncer anteriormente indicados o los antígenos pertenecientes a los complejos de receptores de células T.

De manera similar a la primera molécula de unión a antígeno, la segunda molécula de unión a antígeno utilizada en la presente invención comprende además un dominio de unión a FcRn. En el caso de que una región Fc de anticuerpo indicada anteriormente se utilice como el dominio de unión a FcRn, resulta preferente una región Fc con actividad reducida de unión a receptor de Fcy, tal como en el caso de la primera molécula de unión a antígeno. La reducción de la actividad de unión a un receptor de Fcy permite la supresión de efectos secundarios producidos por inmunoestimulación, tales como la liberación de citoquinas causada por el entrecruzamiento entre las células expresantes de receptor de Fcy y las células que expresan complejo de receptores de células T y/o células que expresan factores pertenecientes a la superfamilia de receptores de TNF.

La presente exposición se refiere además a polinucleótidos codificantes de las moléculas de unión a antígeno en la presente memoria, y pueden incorporarse en vectores de expresión arbitrarios. Pueden transformarse huéspedes adecuados con los vectores de expresión para producir células que expresan las moléculas de unión a antígeno. Las moléculas de unión a antígeno codificadas por los polinucleótidos pueden obtenerse mediante el cultivo de células que expresan las moléculas de unión a antígeno y recogerse los productos de expresión a partir del sobrenadante de cultivo. Es decir, la presente exposición se refiere a vectores que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de unión a antígeno en la presente memoria, células portadoras de dicho vector y métodos para producir moléculas de unión a antígeno, que comprende cultivar las células y recoger moléculas de unión a antígeno a partir de sobrenadante de cultivo. Estas pueden obtenerse mediante técnicas similares a las técnicas para anticuerpos recombinantes indicados anteriormente.

Composiciones farmacéuticas

Desde otro punto de vista, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la primera molécula de unión a antígeno anteriormente indicada, que es un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad de la invención, como el ingrediente activo. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que inducen citotoxicidad (agentes terapéuticos inductores de citotoxicidad), inhibidores de la proliferación celular y agentes anticáncer, que comprenden la molécula de unión a antígeno como ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse como agentes para el tratamiento del cáncer o como agentes para la prevención del cáncer. Los agentes terapéuticos inductores de citotoxicidad, inhibidores de la proliferación celular y agentes anticáncer de la presente invención se administran preferentemente en sujetos que sufren de cáncer, o en sujetos que pueden experimentar una recaída.

Además, los agentes terapéuticos inductores de citotoxicidad, los inhibidores de la proliferación celular y los agentes anticáncer que comprenden la primera molécula de unión a antígeno como ingrediente activo, indicado anteriormente, pueden presentarse como usos en la inducción de citotoxicidad, como métodos de supresión de la proliferación celular, como métodos de activación de la inmunidad contra las células de cáncer o tejidos tumorales que contienen células de cáncer de la exposición, o como usos de prevención del cáncer de la exposición o usos en el tratamiento del cáncer de la invención, que comprenden la etapa de administrar la molécula de unión a antígeno en un sujeto, o pueden presentarse como uso de las moléculas de unión a antígeno en la producción de composiciones farmacéuticas para inducir citotoxicidad, inhibidores de la proliferación celular y agentes anticáncer. Alternativamente, pueden presentarse como moléculas de unión a antígeno para el uso en la inducción de citotoxicidad, la supresión de la proliferación celular, la activación de la inmunidad contra las células de cáncer o tejidos tumorales que contienen células de cáncer, o el tratamiento o prevención del cáncer.

En la presente invención, "que comprende la molécula de unión a antígeno como ingrediente activo" se refiere a que contiene la molécula de unión a antígeno como componente activo principal y no limita el contenido de molécula de unión a antígeno.

Además, pueden utilizarse composiciones farmacéuticas o composiciones farmacéuticas para inducir citotoxicidad, inhibidores de la proliferación celular y agentes anticáncer de la presente invención (en lo sucesivo en la presente memoria denominados composiciones farmacéuticas o similares), en combinación con las segundas moléculas de unión a antígeno anteriormente indicadas. La utilización de una segunda molécula de unión a antígeno en combinación con una composición farmacéutica o similar que contiene una primera molécula de unión a antígeno puede fortalecer las acciones citotóxicas contra las células expresantes de antígenos. En la presente memoria, "utilización de una segunda molécula de unión a antígeno en combinación" puede referirse al caso de la mezcla de una segunda molécula de unión a antígeno en una composición farmacéutica o similar que contiene una primera molécula de unión a antígeno, o el caso en que una segunda molécula de unión a antígeno se incluye en una composición farmacéutica o similar que es diferente de la composición farmacéutica o similar que contiene una primera molécula de unión a antígeno. Sus formas de dosificación pueden ser iguales o diferentes. Además, en el caso de que se incluya la primera molécula de unión a antígeno y la segunda molécula de unión a antígeno en diferentes composiciones farmacéuticas o similares, dichas composiciones farmacéuticas o similares pueden administrarse simultáneamente o por separado en el sujeto. Además, dichas composiciones farmacéuticas o similares pueden proporcionarse en forma de un kit.

En la presente invención, una primera molécula de unión a antígeno, que es un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad de la invención, o una composición farmacéutica que comprende una primera molécula de unión a antígeno, que es un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad de la invención, como ingrediente activo puede utilizarse como composición farmacéutica para fortalecer la actividad citotóxica o potenciar la inducción de actividad citotóxica mediante la utilización concomitante de la misma con una segunda molécula de unión a antígeno o una composición farmacéutica o similar que comprende una segunda molécula de unión a antígeno a modo de un ingrediente activo. Además, una segunda molécula de unión a antígeno o una composición farmacéutica que comprende una segunda molécula de unión a antígeno como un ingrediente activo puede utilizarse como composición farmacéutica para fortalecer la actividad citotóxica o potenciar la inducción de actividad citotóxica mediante la utilización concomitante de la misma con una primera molécula de unión a antígeno o una composición farmacéutica o similar que comprende una primera molécula de unión a antígeno a modo de un ingrediente activo.

En la presente memoria, "utilización concomitante" incluye el caso en que una composición farmacéutica o similar que comprende una primera molécula de unión a antígeno como ingrediente activo y una composición farmacéutica o similar que comprende una segunda molécula de unión a antígeno como ingrediente activo se administran simultáneamente en un sujeto, y el caso en que se administran por separado en un sujeto. Sus formas de dosificación pueden ser iguales o diferentes. Además, dichas composiciones farmacéuticas o similares pueden proporcionarse en forma de un kit.

Además, la presente exposición proporciona un método que utiliza los efectos producidos por la utilización concomitante de una primera molécula de unión a antígeno indicada anteriormente o una composición farmacéutica o similar que comprende dicha molécula de unión a antígeno como ingrediente activo y una segunda molécula de unión a antígeno o una composición farmacéutica o similar que comprende la segunda molécula de unión a antígeno como ingrediente activo para potenciar la actividad citotóxica o efecto antitumoral de la segunda molécula de unión a antígeno o una composición farmacéutica o similar que comprende la segunda molécula de unión a antígeno como ingrediente activo por la primera molécula de unión a antígeno o una composición farmacéutica o similar que comprende la primera molécula de unión a antígeno a modo de un ingrediente activo. Además, la presente exposición proporciona un método para fortalecer la actividad citotóxica o efecto antitumoral de una primera molécula de unión a antígeno o una composición farmacéutica o similar que comprende una primera molécula de unión a antígeno como un ingrediente activo con una segunda molécula de unión a antígeno o una composición farmacéutica o similar que comprende una segunda molécula de unión a antígeno a modo de un ingrediente activo.

Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse mediante combinación de múltiples tipos de una primera molécula de unión a antígeno y/o una segunda molécula de unión a antígeno según sea necesario. Por ejemplo, mediante la utilización de un cóctel de una pluralidad de anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención que se unen al mismo antígeno, puede potenciarse la acción citotóxica contra células que expresan el antígeno.

En caso necesario, las moléculas de unión a antígeno utilizadas en la presente invención y los anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención pueden encapsularse en microcápsulas (microcápsulas realizadas en hidroximetilcelulosa, gelatina, poli[metilmetacrilato] y similares) y realizarse en componentes de sistemas coloidales de administración de fármaco (liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) (por ejemplo, ver "Remington's Pharmaceutical Science 16a edición", Oslo Ed. 1980. Además, se conocen métodos para preparar agentes de liberación sostenida, y estos pueden aplicarse en las moléculas de unión a antígeno utilizadas en la presente invención y en anticuerpos biespecíficos inductores de citotoxicidad de la presente invención (J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277; Chemtech. (1982) 12, 98-105; patente US n° 3773719; publicación de patente europea (EP) n° EP58481 y n° EP133988; Biopolymers (1983) 22, 547-556).

Las composiciones farmacéuticas, agentes supresores de la proliferación celular o agentes anticáncer de la presente invención pueden administrarse por vía oral o por vía parenteral en los pacientes. La administración parenteral resulta preferente. Específicamente, entre dichos métodos de administración se incluyen la inyección, la administración nasal, la administración transpulmonar y la administración percutánea. Entre las inyecciones se incluyen, por ejemplo, las inyecciones intravenosas, las inyecciones intramusculares, las inyecciones intraperitoneales y las inyecciones subcutáneas. Por ejemplo, pueden administrarse localmente o sistémicamente mediante inyección composiciones farmacéuticas, agentes terapéuticos para la inducción de citotoxicidad celular, agentes supresores de la proliferación celular o agentes anticáncer de la presente invención. Además, pueden seleccionarse métodos apropiados de administración según la edad y síntomas del paciente. La dosis administrada puede seleccionarse, por ejemplo, del intervalo de 0,0001 mg y 1.000 mg por kg de peso corporal en cada administración. Alternativamente, la dosis puede seleccionarse, por ejemplo, del intervalo de 0,001 mg/cuerpo y 100.000 mg/cuerpo por paciente. Sin embargo, la dosis de una composición farmacéutica de la presente invención no se encuentra limitada a dichas dosis.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse según métodos convencionales (por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, E.E.U.U.) y pueden contener además portadores y aditivos farmacéuticamente aceptables. Entre los ejemplos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, surfactantes, excipientes, agentes colorantes, agentes saborizantes, conservantes, estabilizadores, tampones, agentes de suspensión, agentes isotónicos, ligantes, desintegrantes, lubricantes, agentes promotores de la fluidez y correctores, y pueden utilizarse convenientemente otros portadores utilizados comúnmente. Entre los ejemplos específicos de los portadores se incluyen ácido silícico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, carmelosa cálcica, carmelosa sódica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicérido de cadena intermedia, polioxietilén-aceite de ricino 60 endurecido, sacarosa, carboximetilcelulosa, almidón de maíz, sal inorgánica y similares.

Además, la presente exposición proporciona métodos de inducción de daños en las células que expresan un antígeno específico de cáncer o en tejidos tumorales que contienen células que expresan un antígeno específico de cáncer, y métodos para suprimir la proliferación de dichas células o dichos tejidos tumorales, mediante la puesta en contacto de las células que expresan el antígeno específico de cáncer determinado con una primera molécula de unión a antígeno o con una primera molécula de unión a antígeno, así como con una segunda molécula de unión a antígeno de la presente invención que se une al antígeno específico de cáncer. Las células a las que se une la molécula de unión a antígeno de la presente invención que se une al antígeno específico de cáncer no se encuentran particularmente limitadas con la condición de que sean células que expresen los antígenos específicos de cáncer. Son ejemplos adecuados de las células expresantes de antígeno de cáncer preferentes, específicamente, células de cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de vejiga y cáncer colorrectal.

En la presente invención, el "contacto" se lleva a cabo, por ejemplo, mediante adición de una molécula de unión a antígeno de la presente invención que se une el antígeno de cáncer a una solución de células expresantes de antígeno de cáncer cultivadas in vitro. En dicho caso, una forma adecuada para la utilización de la molécula de unión a antígeno añadida puede ser una solución, o un sólido o similar obtenido mediante liofilización, y similar. En el caso de que se añade en forma de una solución acuosa, puede utilizarse una solución acuosa que contiene puramente la molécula de unión a antígeno de la presente invención, o puede utilizarse una solución que contiene surfactantes, excipientes, agentes colorantes, perfumes, conservantes, estabilizadores, tampones, agentes de suspensión, agentes isotonificantes, ligantes, desintegrantes, lubricantes, agentes promotores de la fluidez, agentes saborizantes y similares indicados anteriormente. La concentración utilizada para la adición no se encuentra particularmente limitada, aunque una concentración final adecuada en la solución de cultivo preferentemente se encuentra comprendida en el intervalo de entre 1 pg/ml y 1 g/ml, más preferentemente de entre 1 ng/ml y 1 mg/ml, y todavía más preferentemente de entre 1 pg/ml y 1 mg/ml.

Además, alternativamente, el "contacto" de la presente invención se lleva a cabo mediante la administración de una molécula de unión a antígeno de la presente invención que se une a un antígeno de cáncer en un animal no humano con células que expresan el antígeno específico de cáncer trasplantado en sus cuerpos, y en un animal que presenta células de cáncer que expresan intrínsecamente los antígenos específicos de cáncer. El método de administración puede ser oral o parenteral, y la administración parenteral resulta particularmente preferente. Entre los ejemplos específicos del método de administración se incluyen la administración mediante inyección, la administración transnasal, la administración transpulmonar y la administración transdérmica. Entre los ejemplos de administración mediante inyección se incluyen la inyección intravenosa, la inyección intramuscular, la inyección intraperitoneal y la inyección subcutánea. Una composición farmacéutica de la presente invención o una composición farmacéutica para inducir citotoxicidad, un inhibidor de la proliferación celular y un agente anticáncer pueden administrarse sistémica o localmente, por ejemplo mediante la administración mediante inyección. El método de administración puede seleccionarse apropiadamente según la edad y síntomas del animal de ensayo. En el caso de que se administre en forma de una solución acuosa, puede utilizarse una solución acuosa que contiene puramente la molécula de unión a antígeno de la presente invención por sí sola, o puede utilizarse una solución que contiene surfactantes, excipientes, agentes colorantes, perfumes, conservantes, estabilizadores, tampones, agentes de suspensión, agentes isotonificantes, ligantes, desintegrantes, lubricantes, agentes promotores de la fluidez, agentes saborizantes y similares indicados anteriormente. La dosis puede seleccionarse, por ejemplo, del intervalo entre 0,0001 mg y 1000 mg por kilogramo de peso corporal para una única administración. Alternativamente, la dosis puede seleccionarse, por ejemplo, del intervalo de entre 0,001 mg/cuerpo y 100.000 mg/cuerpo por paciente. Sin embargo, la dosis de una molécula de unión a antígeno de la presente invención no se encuentra limitada a dichas dosis.

El método siguiente se utiliza convenientemente como método para evaluar o medir la citotoxicidad inducida en células que expresan un antígeno específico de cáncer unido por el dominio de unión a antígeno específico de cáncer que constituye una molécula de unión a antígeno de la presente invención, como resultado de la puesta en contacto de la molécula de unión a antígeno con las células. Entre los ejemplos de un método para evaluar o medir la actividad citotóxica in vitro se incluyen métodos para medir la actividad de las células T citotóxicas, y similares. Si una molécula de unión a antígeno de la presente invención presenta citotoxicidad de células T puede medirse mediante métodos conocidos (por ejemplo, Current protocols in Immunology, capítulo 7. Immunologic studies in humans, editor, John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993) y similares). Para las mediciones de actividad, una molécula de unión a antígeno con un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno que difiere del antígeno unido en la presente invención y es un antígeno no expresado en las células utilizadas para el examen puede utilizarse a modo de control y, de la misma manera, como la molécula de unión a antígeno de la presente invención, y la actividad puede determinarse que se encuentra presente en el caso de que la molécula de unión a antígeno de la presente invención muestre una actividad citotóxica más fuerte que la de la molécula de unión a antígeno utilizada como control.

Con el fin de valuar o medir la actividad citotóxica in vivo, por ejemplo, las células que expresan un antígeno unido a un dominio de unión a antígeno específico de cáncer que constituye una molécula de unión a antígeno de la presente invención se trasplantan intradérmica o subcutáneamente en un animal de ensayo no humano y después una molécula de unión a antígeno de ensayo se administra por vía intravenosa o intraperitoneal diariamente o con un intervalo de pocos días, partiendo del día del trasplante o el día siguiente. El tamaño tumoral se mide diariamente y la diferencia en el cambio de tamaño tumoral puede definirse como la actividad citotóxica. De una manera similar a la evaluación in vitro, se administra una molécula de unión a antígeno de control y puede determinarse que una molécula de unión a antígeno de la presente invención muestra actividad citotóxica basada en el resultado de que el tamaño tumoral en el grupo sometido a la administración de una molécula de unión a antígeno de la presente invención es significativamente más pequeña que el tamaño tumoral en el grupo sometido a administración de molécula de unión a antígeno.

Como método para evaluar o medir el efecto de supresión de la proliferación de las células que expresan un antígeno unido mediante un dominio de unión a antígeno específico de cáncer que constituye una molécula de unión a antígeno de la presente invención mediante contacto con la molécula de unión a antígeno, puede utilizarse convenientemente un método de medición de la incorporación de timidina marcada isotópicamente en las células, o el método de MTT. Como método para evaluar o medir la actividad de supresión de la proliferación celular in vivo, puede utilizarse convenientemente el mismo método que el descrito anteriormente para evaluar o medir la actividad citotóxica in vivo.

La presente exposición proporciona además kits para la utilización en los métodos de la presente exposición, que comprende una molécula de unión a antígeno de la presente invención o una molécula de unión a antígeno producida mediante un método de producción de la presente exposición. Además, el kit puede incluir en su paquete, un portador farmacéuticamente aceptable, solvente e instrucciones que describen el método de utilización.

La presente invención se refiere además a una molécula de unión a antígeno de la presente invención, que es un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad, para la utilización de la presente invención.

Ejemplos

[Ejemplo de referencia 1] Construcción de vectores de expresión de anticuerpos, y expresión y purificación de los anticuerpos.

La síntesis de genes de longitud completa codificantes de las secuencias de nucleótidos de las cadenas H y L de las regiones variables de anticuerpo se llevó a cabo mediante métodos de producción conocidos por el experto en la materia utilizando PCR de ensamblaje y similar. La introducción de sustituciones de aminoácidos se llevó a cabo mediante métodos conocidos por el experto en la materia utilizando PCR o similar. El fragmento de plásmido obtenido se insertó en un vector de expresión de célula animal y se produjeron el vector de expresión de cadena H y el vector de expresión de cadena L. La secuencia de nucleótidos de los vectores de expresión obtenidos se determinó mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Los plásmidos producidos se introdujeron transitoriamente en la línea celular HEK293H derivada de células de cáncer renal embrionario humano (Invitrogen) o en células FreeStyle293 (Invitrogen) para la expresión de anticuerpos. El sobrenadante de cultivo obtenido se recogió y después se pasó por un filtro MiLLeX(R)-g V de 0,22 pm (Millipore) o a través de un filtro MILLER(R)-GV de 0,45 pm (Millipore) para obtener el sobrenadante de cultivo. Los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo obtenido mediante métodos conocidos por el experto en la materia utilizando una columna de rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) o Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para la concentración de los anticuerpos purificados, se midió su absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro. A partir del valor obtenido, se calculó la concentración del anticuerpo utilizando el coeficiente de extinción determinado mediante métodos tales como PACE (Protein Science 4: 2411-2423, 1995).

[Ejemplo de referencia 2] Método para preparar receptor de Fcy de ratón (mFcyR) y método para analizar la interacción entre un anticuerpo modificado y mFcyR.

Se prepararon dominios extracelulares de FcyR de ratón mediante el método siguiente. En primer lugar, se sintetizaron genes de dominios extracelulares de FcyR mediante un método bien conocido por el experto en la materia. De esta manera, se produjo la secuencia de cada FcyR basándose en la información registrada en NCBI. Específicamente, se produjo mFcyRI basándose en la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI: NP_034316.1; se produjo itiFcyRN basándose en la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI: NP_034317.1; se produjo t FcyRIII basándose en la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI: NP_034318.2; se produjo t FcyRIV basándose en la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI: NP_653142.2. Se unió una etiqueta de His al extremo C-terminal de dichas secuencias. Se insertó cada uno de los fragmentos génicos obtenidos en un vector de expresión de célula animal para construir vectores de expresión. El vector de expresión construido se introdujo transitoriamente en células FreeStyle293 derivadas de células de cáncer renal embrionario humano (Invitrogen) para expresar las proteínas de interés. Se recogió el sobrenadante de cultivo obtenido y después se pasó por un filtro de 0,22 pm para obtener el sobrenadante de cultivo. Los sobrenadantes de cultivo obtenidos se purificaron en principio mediante las cuatro etapas siguientes: etapa 1 - cromatografía de columna de intercambio iónico, etapa 2 - cromatografía de columna de afinidad para la etiqueta His (HisTrap HP), etapa 3 - cromatografía de columna de filtración en gel (Superdex200) y etapa 4 -filtración aséptica. La cromatografía de columna de intercambio iónico de la etapa 1 se llevó a cabo utilizando Q Sepharose HP para mFcyRI, utilizando SP Sepharose FF para mFcyRII y mFcyRIV, y utilizando SP Sepharose HP para mFcyRIII. Aunque el solvente utilizado en la etapa 3 y la etapa posterior era D-PBS(-), para mFcyRIII se utilizó D-PBS(-) que contenía arginina 0,1 M. Se midió la absorbancia a 280 nm para las proteínas purificadas utilizando un espectrofotómetro. A partir de los valores obtenidos, se calcularon las concentraciones de las proteínas purificadas utilizando los coeficientes de extinción determinados mediante métodos tales como PACE (Protein Science 4: 2411 2423, 1995). La interacción entre cada anticuerpo modificado y el receptor de Fcy preparado tal como se ha indicado anteriormente se analizó utilizando Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100 y Biacore 4000. El tampón de migración era HBS-EP+ (GE Healthcare) y la temperatura de medición se fijó en 25°C. El chip utilizado era: un chip sensor Serie S CM5 (GE Healthcare) o un chip sensor Serie S CM4 (GE Healthcare) en el que se inmovilizó proteína L (ACTIGEN o BioVision) mediante el método de acoplamiento de aminas. Los anticuerpos de interés se capturaron en dichos chips sensores y se dejó que mFcyR diluido con el tampón de migración interactuase con ellos. Se midió la cantidad ligada por los anticuerpos y se comparó entre los anticuerpos. Sin embargo, debido a que la cantidad de mFcyR ligado depende de la cantidad de anticuerpo capturado, la comparación se llevó a cabo con los valores corregidos obtenidos mediante división de la cantidad de mFcyR ligado por la cantidad de cada anticuerpo capturado. Además, se hizo reaccionar glicina-HCl 10 mM, pH 1,5, para lavar el anticuerpo capturado respecto de los chips sensores, y el chip sensor se regeneró y se utilizó repetidamente. Se llevaron a cabo análisis cinéticos para calcular los valores de KD de cada anticuerpo alterado de FcyR siguiendo el método a continuación. En primer lugar, se capturaron los anticuerpos de interés sobre los chips sensores anteriormente indicados, y se dejó que mFcyR diluido con el tampón de migración interactuase con ellos. Respecto a los sensogramas obtenidos, los resultados de las mediciones se procesaron mediante ajuste global según un modelo de unión 1:1 de Langmuir utilizando el software de evaluación de Biacore para calcular la constante de tasa de asociación ka (L/mol/s) y la constante de tasa de disociación kd (1/s). A partir de dichos valores, se determinó la constante de disociación KD (moles/l).

[Ejemplo de referencia 3] Animales experimentales y líneas celulares.

Los animales experimentales utilizados eran ratones C57BL/6 hembra (Charles River Laboratories Japan, Inc.) o ratones Balb/c hembra (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Se criaron en una sala de cría bajo condiciones constantes (temperatura: 20°C a 26°C; iluminación: ciclo de 12 horas de luz-oscuridad) con acceso a d lib itu m a alimentos y agua. El gen GPC3 humano se integró en el cromosoma de la línea celular de cáncer de pulmón de ratón LLC (ATCC n° CRL-1642) mediante un método bien conocido por el experto en la materia, obteniendo la línea celular LLC-GPC3, que expresa GPC3 humano a niveles altos. Se determinó el nivel de expresión de GPC3 humano (2,3x105/célula) utilizando el kit QIFI (Dako) siguiendo el método recomendado por el fabricante. De manera similar, se integró el gen GPC3 humano en la línea celular de cáncer colorrectal de ratón CT-26 (ATCC n° CRL-2638), obteniendo la línea celular de alta expresión CT26-GPC3 (nivel de expresión: 3,1x105/célula). Para mantener el gen GPC3 humano, se cultivaron dichas líneas celulares recombinantes en medio recomendado por ATCC mediante la adición de geneticina (GIBCO) una concentración de 400 pg/ml para LLC-GPC3 y de 200 pg/ml para CT26-GPC3. Tras el cultivo, se desprendieron dichas células utilizando tripsina 2,5 g/l-EDTA 1 mM (Nacalai Tesque) y después se utilizaron para cada uno de los experimentos.

[Ejemplo 1] Preparación de anticuerpos anti-CD137 de ratón y evaluación de la actividad agonista.

1-1. Preparación de anticuerpo de ratón anti-CD137 de ratón y evaluación de la unión de mFcYR.

Se preparó 1D8VH (SEC ID n° 28), una región variable contra CD137 de ratón dada a conocer en el documento n° WO2005/017148, que se utilizó como la región variable de cadena H de anticuerpo y 1D8VH-mIgG1 (SEC ID n° 29), que presentaba la región constante de cadena H de una IgG1 de ratón natural, que se utilizó como la región constante de cadena H de anticuerpo, siguiendo el método del Ejemplo de referencia 1. Se produjo 1D8VH-mF18 (SEC ID n° 30) mediante la introducción en 1D8VH-mIgG1 de una modificación de sustitución de Lys por Pro en la posición 235 (numeración de UE) y una modificación de sustitución de Lys por Ser en la posición 239 (numeración de UE), que son modificaciones que eliminan la unión de FcyR tal como se indica en el documento n° WO2012/133782. Además, se produjo 1D8VH-MB492 (SEC ID n° 31) mediante la introducción en 1D8VH-mIgG1 de modificaciones (T230E, V231P, P232N, S238E, S239D, N324D) que potencian la unión de mFcgRII. Se utilizó 1D8VL, dado a conocer en el documento WO2005/017148, como la región variable de cadena L de anticuerpo y se utilizó 1D8VH-mk0 (SEC ID n° 32), que presenta la región constante de la cadena k de ratón, como la región constante de cadena L. Se expresaron y se purificaron según el método del Ejemplo de referencia 1, obteniendo 1D8VH-mIgG1/1D8VL-mk0, 1D8VH-mF18/1D8VL-mk0 y ID8VH-MB492/1D8VL-mk0. A continuación en la presente memoria dichos anticuerpos se denotan como 1D8-mIgG1, 1D8-mF18 y 1D8-MB492 por simplicidad.

Además, para medir la unión de mFcyR de cada región constante, se preparó H237-mIgG1 (SEC ID n° 34) y H237-MB492 (SEC ID n° 35), que presentan la región variable H237 del anticuerpo anti-receptor de interleuquina 6 humana (SEC ID n° 33) indicada en el documento n° WO2009/125825, como la región variable de cadena H. Se utilizó MRAL-k0 (SEC ID n° 36), que es la cadena L de tocilizumab, como la cadena L de anticuerpo. La expresión y purificación se llevaron a cabo según el método del Ejemplo de referencia 1, obteniendo H237-mIgG1/MRAL-k0 y H237-MB492/MRAL-k0. De manera similar, se produjo mPM1H-mIgG1 (SEC ID n° 37) y mPM1H-mF18 (SEC ID n° 38), que presentan la región variable (mPM1H) de PM-1 de ratón, un anticuerpo de ratón que se une a IL6R humano (Sato, Cancer Res., 1993, 53, 851-856), como la región variable de cadena H de anticuerpo. Se utilizó MRAL-k0 como la cadena L de anticuerpo. La expresión y purificación se llevaron a cabo según el método del Ejemplo de referencia 1, obteniendo mPM1H-mIgG1/MRAL-k0 y mPM1H-mF18/MRAL-k0.

Se evaluó la capacidad de mPM1H-mIgG1/MRAL-k0 y mPM1H-mF18/MRAL-k0 de unirse a itiFcyRN y itiFcyRNI según el método del Ejemplo de referencia 2. La IgG1 de ratón natural (mIgGI) no se une a itFcyRI o itFcyRIV, y se une únicamente a itFcyRII y itFcyRIN, entre los cuatro tipos de FcyR de ratón (Nimmerjahn, Science, 310, 1510-1512, 2005). Por lo tanto, la introducción de modificaciones que reducen la unión de it FcyR en mIgG1 natural se esperaba que proporcionase variantes con una unión reducida a itFcyRN y itFcyRNI, y de esta manera, una unión reducida a todos los itFcyR. Se muestran los resultados en la Tabla 1.

Tabla 1.

Los resultados anteriormente indicados demuestran que la región constante mF18 es una variante que presenta una unión a itFcyR notablemente reducida.

De manera similar, la Tabla 2 muestra los resultados de la evaluación de H237-mIgG1/MRAL-k0 y H237-MB492/MRAL-k0 para la unión a mFcYRIl y mFcYRIII.

Tabla 2

La expresión "actividad de unión relativa" en la tabla indica la actividad de unión de MB492 en el caso de que la actividad de unión de la mIgGI natural a cada uno de los mFcYR se defina como 1. Los resultados anteriormente indicados mostraron que MB492 es una variante con un incremento de 621,5 veces de la unión de mFcYRII y un incremento de 10,9 veces de la unión de mFcYRIII en comparación con mIgGI.

1- 2. Evaluación del efecto agonista in v itro de CD137 de los anticuerpos anti-CD137 de ratón.

Se recogieron bazos de ratones C57BL/6 hembra no expuestos. Las células se resuspendieron en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10% complementado con 0,5 pg/ml de yonomicina y 10 ng/ml de FORBOL 12-MIRISTATO 13-ACETATO (PMA) y se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 2x105 células/100 pl/pocillo. Se añadieron anticuerpo anti-CD137 de ratón a dichos pocillos a una concentración de 3 pg/ml y las células se cultivaron bajo las condiciones de 37°C y 5% de CO²durante 3 días. Se recolectó el sobrenadante de cultivo y se determinó la concentración de IFN-y de ratón contenido en el sobrenadante mediante ELISA a fin de evaluar la activación de las células T derivadas de bazo. Se llevó a cabo un ELISA siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit (PreproTech).

Como resultado (fig. 1), entre los anticuerpos de ratón anti-CD137 de ratón, el anticuerpo (1D8-mF18) con unión a FcyR extremadamente reducida no mostraba la actividad y el anticuerpo (1D8-mIgG1) con un Fc de tipo salvaje mostró activación de las células T. Además, la actividad específica del anticuerpo (1D8-MB492) con una capacidad de unión potenciada a FcyRIIB se incrementó en aproximadamente ocho veces en comparación con la del anticuerpo Fc de tipo salvaje.

Lo anterior reveló que, de una manera similar a los anticuerpos agonistas contra otros TNFRSF, tal como se indica en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110(48), 19501-6, 2013, para que los anticuerpos anti-CD137 ejerzan una actividad agonista, los anticuerpos deben unirse a FcyRII, y los anticuerpos anti-CD137 unidos a células T expresantes de CD137 deben entrecruzarse con células expresantes de FcyRII (fig. 2). FcyRII se expresa en muchas células inmunitarias y fagocitos, tales como células B. Por lo tanto, la actividad agonista por los anticuerpos anti-CD137 deben tener lugar sistémicamente y de esta manera causa efectos secundarios.

[Ejemplo 2] Preparación de anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y evaluación de sus actividades agonistas.

2- 1. Concepto de un anticuerpo agonista dependiente de antígeno de cáncer basado en anticuerpos biespecíficos de antígeno de cáncer y CD137.

De acuerdo con el examen en el Ejemplo 1, debido a que la actividad agonista por anticuerpos anti-CD137 comunes tiene lugar sistémicamente, se ha considerado que los efectos antitumorales y los efectos secundarios en tejidos normales (tales como la activación de células T) son inseparables. Por lo tanto, los presentes inventores han concebido que la utilización de anticuerpos biespecíficos contra un antígeno de cáncer y CD137 podría permitir la manifestación de la actividad agonista de un anticuerpo anti-CD137 sólo en tejidos de cáncer en los que el antígeno de cáncer se encuentra presente mediante el entrecruzamiento de células T expresantes de CD137 y células expresantes de antígeno de cáncer (tales como células de cáncer) mediante los anticuerpos biespecíficos (fig. 3).

2-1. Preparación de anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón (GPC3 ERY22-1D8, GPC3 ERY22-G2-1D8 y GPC3 ERY22-G4-1D8)

Se prepararon tres tipos de anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón con la región constante de la IgG1, IgG2 o IgG4 humana, respectivamente. Para dichas moléculas, se utilizó la técnica CrossMab informada por Schaefer et al. (Schaefer, Proc. Natl. Acad. Sci., 108, 11187-11192, 2011) para regular la asociación entre las cadenas H y L y obtener eficientemente los anticuerpos biespecíficos. Más específicamente, dichas moléculas se produjeron mediante intercambio de los dominios VH y VL de Fab contra la GPC3 humana descrita en el documento n° WO2012/073985. Para el fomento de la asociación heteróloga, se utilizó la tecnología de botones-en-ojales para la región constante de la cadena H de anticuerpo. La tecnología de botones-en-ojales es una técnica que permite la preparación de anticuerpos heterodimerizados de interés mediante el fomento de la heterodimerización de cadenas H mediante sustitución de una cadena lateral de aminoácidos presente en la región CH3 de una de las cadenas H por una cadena lateral de mayor tamaño (botón) y la sustitución de una cadena lateral de aminoácidos en la región CH3 de la otra cadena H por una cadena lateral de menor tamaño (ojal) de manera que el botón se posicionará dentro del ojal (Burmeister, Nature, 372, 379-383, 1994). A continuación, en la presente memoria, la región constante en la que se ha introducido la modificación de botón se indicará como Kn, y la región constante en la que se ha introducido la modificación de ojal se indicará como H1. Además, se utilizaron las modificaciones indicadas en el documento n° WO2011/108714 para reducir la unión de Fcy. Específicamente, se introdujeron los tipos IgG1 y IgG4 con modificaciones de sustitución por Ala de los aminoácidos en las posiciones 234, 235 y 297 (numeración de UE). Se introdujo el tipo IgG2 con modificaciones de sustitución por Ala de los aminoácidos en las posiciones 234, 237 y 297. Gly en la posición 446 y Lys en la posición 447 (numeración de UE) se eliminaron de los extremos C-terminales de las cadenas H de anticuerpo. Con el fin de facilitar adicionalmente la purificación tras la expresión de los anticuerpos, se añadió una etiqueta de histidinas al extremo C-terminal de la cadena H de anti-GPC3 humano y se añadió una etiqueta FLAG al extremo C-terminal de la cadena H de anti-CD137 de ratón. Las cadenas H de anti-GPC3 humano preparadas mediante la introducción de las modificaciones anteriormente indicadas eran GC33(2)H-G1dKnHS (SEC ID n° 39), GC33(2)H-G2dmKnHS (SEC ID n° 40) y GC33(2)H-G4dKnHS (SEC ID n° 41). Las cadenas H anti-CD137 de ratón eran 1D8VH-G1dHlFS (SEC ID n° 42), 1D8VH-G2dmHlFS (SEC ID n° 43) y 1D8VH-G4dHlFS (SEC ID n° 44). En GC33(2)H-G2dmKnHS y ID8VH-G2dmHlFS que presentan la región constante de tipo IgG2, sólo el dominio Ch 1 y la primera mitad de la región de bisagra son del tipo IgG1. Específicamente, contienen, en comparación con la secuencia CH1 de la IgG2 humana natural, Ser en la posición 131, Lys en la posición 133 y Gly en las posiciones 137 y 138, y la región de bisagra contiene Ser en la posición 219 (numeración de UE). Las cadenas L de anticuerpo GC33(2)L-k0 (SEC ID n° 45) y 1D8VL-k0 (SEC ID n° 46) se utilizaron comúnmente en el lado anti-GPC3 humano y el lado anti-CD137 de ratón, respectivamente. Los anticuerpos con las combinaciones mostradas en la Tabla 3 se expresaron para obtener los anticuerpos biespecíficos de interés. Dichos anticuerpos se expresaron mediante expresión transitoria en células FreeStyle293 (Invitrogen) según "1-1". El sobrenadante de cultivo obtenido se añadió a una columna M2 anti-FLAG (Sigma) y la columna se lavó, seguido de la elución con péptido FLAG 0,1 mg/ml (Sigma). Se añadió la fracción que contenía anticuerpo a una columna HP HisTrap (GE Healthcare) y la columna se lavó, seguido de la elución con un gradiente de concentración de imidazol. Se concentró la fracción que contenía anticuerpo utilizando una membrana de ultrafiltración y después se añadió la solución concentrada a una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Sólo se recogieron los anticuerpos monoméricos en el eluido, obteniendo los anticuerpos purificados.

Tabla 3

2-2 Evaluación del efecto agonista in v itro de CD137 dependiente de GPC3 de los anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón.

Se suspendió la línea de células T de ratón CTLL2 (ATCC n° de cat. TIB-214) en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10% complementado con yonomicina 0,5 pg/ml y PMA 10 ng/ml, y las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 2x104 células/100 pl/pocillo. La línea celular de cáncer de pulmón de ratón expresante de GPC3 humana, LLC-GPC3 (Ejemplo de referencia 3) se suspendió en el mismo medio y lo anterior se sembró en la misma placa de 96 pocillos a una densidad de 2 x 104 células/100 pl/pocillo. Además, se prepararon suspensiones, cada una de las cuales contenía el mismo número de células CTLL-2 o LLC-GPC3 y después las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 4x104 células/100 pl/pocillo. A los pocillos, se añadió un anticuerpo de tipo IgGl humano biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón que presentaba una unión a FcyR extremadamente reducida (GPC3 ERY22-1D8), o un anticuerpo de tipo IgG1 humano monoespecífico anti-GPC3 humano (GC33(2)-hG1S que comprendía GC33(2)H2-G1dS y GC33(2)L2-k0), a una concentración de 5 pg/ml, y las células se cultivaron bajo las condiciones de 37°C y 5% de CO²durante 24 horas. Se recolectó el sobrenadante de cultivo y se determinó la concentración de IFN-y de ratón en el sobrenadante mediante ELISA a fin de evaluar la activación de CTLL-2. Se llevó a cabo un ELISA siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit (PreproTech).

Como resultado, se encontró que IFN-y de ratón se acumulaba a nivel elevado únicamente bajo condiciones en las que se encontraban presentes células LLC-GPC3 y CTLL-2 (fig. 4). Basándose en dicho resultado, se cree que se producía la activación de las células T de acuerdo con la asociación de CD137 sobre las células T mediada por una pluralidad de anticuerpos biespecíficos unidos a células expresantes de GPC3 (fig. 3).

Además, la fig. 5 muestra la actividad de anticuerpos biespecíficos cuya parte Fc ha sido modificada a la del tipo IgG2 humano GPC3 ERY22-G2-1D8) o a la del tipo IgG4 humano (GPC3 ERY22-G4-1D8), que presenta una unión a FcyR extremadamente reducida. La modificación de la subclase de anticuerpo no resultó en ningún cambio significativo de la actividad agonista de CD137.

A partir de dichos resultados, se confirmó que los anticuerpos biespecíficos con unión a FcyR reducida contra un antígeno de cáncer (GPC3 en los presentes Ejemplos) y CD137 eran capaces de mostrar una actividad agonista tras la asociación de CD137 sobre las células T únicamente en el caso de que se encontrasen presentes células expresantes de antígeno de cáncer (células de cáncer y similares). Más específicamente, las células T no resultan activadas en los tejidos normales en los que el antígeno de cáncer no se encuentra presente, y de esta manera, pueden reducirse o evitarse los efectos secundarios.

[Ejemplo 3] Efecto potenciador de la activación de las células T de una mezcla de anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón.

3-1. Concepto.

Aunque los anticuerpos agonistas anti-CD137 es conocido que ejercen un efecto antitumoral mediante la activación de células T, es conocido que este efecto es reducido en el caso de que se utilicen anticuerpos agonistas anti-CD137 como agente único. Por lo tanto, con el fin de potenciar la capacidad de los anticuerpos biespecíficos anti-antígeno de cáncer/anti-CD137 de activar las células T y de esta manera ejercer un efecto antitumoral más fuerte, se examinó la utilización concomitante con un agente que activa de manera similar las células T. Los anticuerpos biespecíficos antiantígeno de cáncer/anti-CD3 pueden redirigir las células T al antígeno de cáncer y ejercer una actividad citotóxica mediada por células T contra las células de cáncer. Sin embargo, el efecto antitumoral de los anticuerpos biespecíficos anti-antígeno de cáncer/anti-CD3 también no es necesariamente elevado en el caso de que se utilicen como agentes únicos. Por lo tanto, se examinó la utilización concomitante de un anticuerpo biespecífico anti-antígeno de cáncer/anti-CD137 y un anticuerpo biespecífico anti-antígeno de cáncer/anti-CD3 con el fin de ver si podía demostrarse la capacidad de activación de células T y efecto antitumoral sinérgicos.

3-2. Preparación de GPC3 ERY22-3-1D8 y GPC3 ERY22-3-2C11

Se preparó un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón, GPC3 ERY22-3-1D8 y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón, GPC3 ERY22-3-2C11. Se produjo GPC3 ERY22-3-1D8 mediante la adición de modificaciones que es conocido por el experto en la materia que simplifican adicionalmente la purificación del anticuerpo biespecífico GPC3 ERY22-1D8 preparado en el Ejemplo 2-1. Específicamente, se preparó GC33(2)H-G1dKnHSG3 (SEC ID n° 489 mediante la adición de la modificación H435R para simplificar la purificación, que es conocido por el experto en la materia, al gen de región constante de la cadena H de anti-GPC3 humano, GC33(2)H-G1dKnHS. Junto con lo anterior, se preparó 1D8VH-G1dHlS (SEC ID n° 47) mediante la eliminación de la etiqueta FLAG del gen de región constante de la cadena H de anti-CD137 de ratón, 1D8VH-G1dHlFS. Además, se preparó 2C11VH-G1dHIS (SEC ID n° 50) mediante la utilización de la secuencia de 2C11VH (SEC ID n° 49) como la región variable de la cadena H del anticuerpo anti-CD3 de ratón. Se utilizaron las cadenas L de anticuerpo GC33(2)L-k0, 1D8VL-k0 y 2C11VL-k0 (SEC ID n° 51) para el lado anti-GPC3 humano, el lado anti-CD137 de ratón y el lado anti-CD3 de ratón, respectivamente. Los anticuerpos con las combinaciones mostradas en la Tabla 4 se expresaron para obtener los anticuerpos biespecíficos de interés. Dichos anticuerpos se expresaron mediante expresión transitoria en células FreeStyle293 según el Ejemplo de referencia 1. El sobrenadante de cultivo obtenido se añadió a una columna MabSelect SuRe (GE Healthcare) y la columna se lavó, seguido de la elución con ácido acético 50 mM. Se añadió la fracción que contenía anticuerpo a una columna HP HisTrap (GE Healthcare) o una columna Ni Sepharose FF (GE Healthcare) y la columna se lavó, seguido de la elución con imidazol. Se concentró la fracción que contenía anticuerpo utilizando una membrana de ultrafiltración. A continuación, se añadió la solución concentrada a una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Sólo se recogieron los anticuerpos monoméricos en el eluido, obteniendo los anticuerpos purificados.

Tabla 4

Además, GC33(2)-G1 dS, que presenta una unión a FcRn reducida y también es un anticuerpo anti-GPC3 humano, se preparó en forma de un control comparativo. GC33(2)-G1dS es un anticuerpo anti-GPC3 humano natural preparado sin utilizar la técnica CrossMab y presenta una región constante con unión reducida a FcyR. Específicamente, se preparó GC33(2)H2-G1dS (SEC ID n° 53), que presenta GC33(2)H2 (SEC ID n° 52) como la región variable de cadena H de anticuerpo y en el que se ha introducido G1d con L234A, L235A y N297A como la región constante de cadena H de anticuerpo. Se utilizó GC33(2)L2-k0 (SEC ID n° 54) como la cadena L de anticuerpo. Se llevó a cabo la expresión y la purificación según el método del Ejemplo de referencia 1 para obtener GC33(2)H2-G1dS/GC33(2)L2-k0. A continuación en la presente memoria, en aras de la simplicidad, el anticuerpo se denotará como GC33(2)-G1dS.

3-3. Evaluación del efecto de potenciación de la activación in vitro de las células T por una mezcla de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón.

Se recogieron bazos de ratones C57BL/6 hembra no expuestos. Las células se suspendieron en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10% complementado con IL2 de ratón 10 ng/ml a una densidad de 4x106 células/ml. Además, se suspendió la línea celular de cáncer colorrectal de ratón expresante de GPC3 humana, CT26-GPC3 (Ejemplo de referencia 3) en el mismo medio a una densidad de 4x105 células/ml. Se mezclaron cantidades iguales de cada suspensión celular y la mezcla se sembró en una placa de 96 pocillos a razón de 100 pl/pocillo. A algunos de los pocillos se añadieron además 0,5 pg/ml de yonomicina y PMA 10 ng/ml. A lo anterior, se añadió un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón con unión a FcyR extremadamente reducida (GPC3 ERY22-1D8) y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón con unión a FcyR extremadamente reducida (GPC ERY22-2C11;GPC3 ERY22-3-2C11 en el que la modificación H435R se ha restaurado a su estado original), a una concentración de 3 pg/ml, y las células se cultivaron bajo las condiciones de 37°C y 5% de CO²durante 24 horas. Se recolectó el sobrenadante de cultivo y se determinó la concentración de IFN-y de ratón contenido en el sobrenadante mediante ELISA a fin de evaluar la activación de las células T contenidas en las células de bazo. Se llevó a cabo un ELISA siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit (PreproTech).

Como resultado (fig. 6), 1D8-MB492 y GPC3 ERY22-1D8 mostraban una actividad inductora de IFN-y al añadirles yonomicina y PMA. Se supuso que lo anterior era el resultado de la inducción de CD137 en las células T de bazo debido a la estimulación por mitógeno y similar. Además, se encontró que IFN-y se acumulaba a nivel elevado en la mezcla que contenía GPC3 ERY22-1D8 y GPC3 ERY22-2C11. Lo anterior sugiere que la estimulación simultánea de CD3 y CD137 induce fuertemente la activación de las células T.

[Ejemplo 4] Efecto antitumoral de anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y su efecto en la reducción de la hepatotoxicidad.

4-1. Comparación de la eficacia farmacológica de los anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y de los anticuerpos anti-CD137 de ratón.

La línea celular de cáncer colorrectal de ratón recombinante CT26-GPC3, que expresa GPC3 humano (Ejemplo de referencia 3) se introdujo en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a razón de 5x106 células/ml y 200 pl de lo anterior (1x106 células) se trasplantaron por vía subcutánea en el abdomen de ratones BALB/c (hembra, 7 semanas de edad, Charles River Laboratories Japan Inc.). Los animales se dividieron aleatoriamente en cinco grupos de cinco individuos cada uno y después se administraron los anticuerpos mediante inyección intravenosa por la vena de la cola tres días, siete días, diez días y 17 días después del trasplante. Se generaron preparaciones de 0,75 mg/ml y 0,15 mg/ml del anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón (GPC3 ERY22-3-1D8) utilizando un solvente (una solución acuosa que contenía NaCl 150 mM y His-HCl 20 mM, pH 6,0) que se había pasado por un filtro de 0,22 pm) y lo anterior se administró a razón de 10 ml/kg (7,5 mg/kg y 1,5 mg/kg, respectivamente). Se generaron preparaciones de 1,5 mg/ml y 0,3 mg/ml de anticuerpo anti-CD137 (1D8-MB492) utilizando un solvente y lo anterior se administró a razón de 10 ml/kg /15 mg/kg y 3 mg/kg, respectivamente). Se evaluó el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (%) a partir del volumen tumoral calculado utilizando la ecuación a continuación.

Volumen tumoral (mm3) = eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm) / 2

T: volumen tumoral medio de cada grupo en cada fecha de ensayo.

T0: volumen tumoral medio de cada grupo el primer día de administración.

C: volumen tumoral medio del grupo de control en cada fecha de ensayo.

C0: volumen tumoral medio del grupo de control el primer día de administración.

Tal como se muestra en la fig. 7, todos los grupos sometidos a administración de anticuerpo mostraron fuertes efectos antitumorales con una inhibición del crecimiento tumoral de 95% o superior. Más específicamente, se mostró que los anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón presentaban fuertes efectos antitumorales similares a los de los anticuerpos anti-CD137 de ratón, y también muestran fuertes efectos antitumorales al activar CD137 de una manera dependiente de antígeno de cáncer.

4-2. Atenuación del daño hepático por anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón en el modelo de trasplante subcutáneo de CT26-GPC3.

Al final de los ensayos de eficacia farmacológica para la administración de anticuerpos, los animales fueron eutanizados mediante exsanguinación bajo anestesia, y se aisló el plasma. El plasma se utilizó para medir la aspartatoaminotransferasa (AST; método JSCC transferible), alanina aminotransferasa (ALT; método JSCC transferible) y bilirrubina total (TBIL, método enzimático) en un analizador automático TBA-120FR (Toshiba Medical Systems Corporation). Se recogió el hígado durante la autopsia, se fijó en una solución de formalina tamponada neutra al 10% para generar una preparación tisular de secciones delgadas de tejido incluidas en parafina (hematoxilina-eosina (HE)) siguiendo métodos generales, y se observó histopatológicamente bajo un microscopio óptico. Se llevó a cabo un análisis estadístico llevando a cabo una prueba no paramétrica de comparaciones múltiples de Dunnett con el grupo de control.

Como resultado, tal como se muestra en las figs. 8 a 11, en el grupo en el que se había administrado anticuerpo anti CD137 de ratón (1D8-MB492), se encontró que AST, ALT y TBIL en sangre se habían incrementado o mostraban una tendencia creciente bajo todas las dosis, e histopatológicamente, se observó en todos los ejemplos daños hepáticos ligeros a moderados, tales como degeneración/necrosis e inflamación de células hepáticas. Por otra parte, en el grupo en el que se había administrado anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón (GPC3 ERY22-3-1D8), no se encontraron cambios que se consideraban causados por daños hepáticos con respecto a AST, ALT y TBIL en sangre. Histopatológicamente, se observó una ligera degeneración/necrosis o inflamación de células hepáticas en dos a tres casos de cada cinco en cada grupo de dosis y se redujeron los trastornos hepáticos. En un caso en el grupo sometido a la administración del mismo anticuerpo a una dosis de 3 mg/kg, se observaron notables incrementos de AST y ALT en sangre, mientras que no se observaron cambios en TBIL de sangre. Debido a que no se observaron resultados sugerentes de daños hepáticos a partir de la observación histopatológica del hígado, se consideró que el origen de los enzimas no era atribuible a daños hepáticos.

A partir de los resultados anteriormente indicados, se mostró que el anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón, GPC3 ERY22-3-1D8, presentaba un fuerte efecto antitumoral sin inducir daños hepáticos graves, tales como los informados hasta el momento con anticuerpos agonistas anti-CD137 generales. Más específicamente, se cree que los anticuerpos biespecíficos con unión reducida a FcyR contra un antígeno de cáncer y CD137 ejercen una actividad agonista de CD137 dependiente de antígeno de cáncer y mediante la activación de las células T en tumores sin activación de las células T en tejidos normales, ejercen una actividad citotóxica contra las células de cáncer, evitando simultáneamente efectos secundarios tales como la citotoxicidad y la liberación de citoquinas.

[Ejemplo 5] Efecto antitumoral mediante la utilización concomitante de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón.

La línea celular de cáncer pulmonar de ratón LLC-GPC3, que expresa GPC3 humano (Ejemplo de referencia 3) se suspendió en HBSS a razón de 5x106 células/ml y 200 pl de lo anterior (1x106 células) se trasplantaron por vía subcutánea en el abdomen de ratones C57BL/6N (hembra, 6 semanas de edad, Charles River Laboratories Japan Inc.). Diez días después del trasplante, basándose en los datos de volumen tumoral y peso corporal, los animales se dividieron en cinco grupos de cinco individuos cada uno sin sesgos, y después se administraron los anticuerpos mediante inyección intravenosa por la vena de la cola diez días, 14 días y 17 días después del trasplante. Se preparó un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón (GPC3 ERY22-3-1D8) en una preparación de 0,5 mg/ml utilizando un solvente (una solución acuosa que contenía NaCl 150 mM y His-HCl 20 mM, pH 6,0) que se había pasado por un filtro de 0,22 pm) y lo anterior se administró a razón de 10 ml/kg (5 mg/kg). Se produjo un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón (GPC3 ERY22-3-2C11) en una preparación de 0,45 mg/ml utilizando el solvente, y lo anterior se administró a razón de 10 ml/kg (4,5 mg/kg). Además, se preparó un grupo en el que se administraron dos tipos de anticuerpos concomitantemente. Se evaluó el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (%) a partir del volumen tumoral calculado utilizando la ecuación a continuación.

Volumen tumoral (mm3) = eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm) / 2

Porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (%) = [1 - (T - T0)/(C - C0)] x 100

T: volumen tumoral medio de cada grupo en cada fecha de ensayo.

T0: volumen tumoral medio de cada grupo el primer día de administración.

C: volumen tumoral medio del grupo de control en cada fecha de ensayo.

Tal como se muestra en la fig. 12, el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral 23 días después del trasplante tumoral fue de 36% para el grupo en que se había administrado anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón por sí solo, y de 29% para el grupo en que se había administrado anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón por sí solo, aunque el grupo en que se habían administrado estos dos anticuerpos concomitantemente mostraron una inhibición de 100% y se observó claramente un efecto sinérgico de la utilización concomitante.

Al final de los ensayos de eficacia farmacológica, se llevó a cabo un análisis de los parámetros de función hepática (AST, ALT y TBIL) en plasma y el análisis histopatológico de secciones de tejido hepático mediante tinción HE, mediante métodos similares a los de "4-2". No se observaron cambios sugerentes de daño hepático en ninguno de los grupos de administración.

De acuerdo con lo anterior, se mostró que la utilización concomitante de un anticuerpo biespecífico contra un antígeno de cáncer y CD137 y de un anticuerpo biespecífico contra un antígeno de cáncer y CD3 resulta en la asociación simultánea de CD137 y CD3 específica y localmente en el tumor y ejerce una fuerte capacidad de activación de las células T, que no pudo conseguirse mediante la estimulación separada de cada uno de los anticuerpos, tal como se observó en los experimentos in vitro, y de esta manera se consigue un fuerte efecto antitumoral que tampoco pudo ejercerse con sus agentes individuales in vivo.

[Ejemplo 6] Adquisición de anticuerpos de unión a CD137 humano de una biblioteca de anticuerpos humanos utilizando una técnica de expresión fágica.

6-1. Preparación de una biblioteca de anticuerpos humanos de expresión fágica no expuestos.

Según los métodos conocidos por el experto en la materia, se utilizó ARN poli-A preparado a partir de PBMC humana y ARN pol-A humano disponible comercialmente y similar, como molde para construir una biblioteca de anticuerpos humanos de expresión fágica que comprendía una pluralidad de fagos que expresaban los dominios Fab de secuencias de anticuerpos humanos que son diferentes entre sí.

6-2. Adquisición de anticuerpos de unión a CD137 humano de una biblioteca de anticuerpos humanos no expuestos mediante inmunoadsorción ('panning') con perlas.

Se seleccionaron los anticuerpos que mostraban actividades de unión a antígeno mediante cribado de la biblioteca de anticuerpos humanos de expresión fágica no expuestos construida en el Ejemplo 6-1. Más específicamente, se recogieron fagos que presentaban anticuerpos que mostraban una actividad de unión de los antígenos capturados por las perlas. Se utilizó CD137 humano biotinilado como el antígeno. Específicamente, se llevó a cabo inmunoadsorción ('panning') utilizando el antígeno fijado sobre perlas magnéticas. Se utilizaron perlas recubiertas con neutravidina (SpeedBeads Sera-Mag recubiertas con neutravidina) o perlas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280 estreptavidina) como las perlas magnéticas.

En primer lugar, los fagos producidos a partir de Escherichia coli portadores de los fagémidos construidos para la expresión fágica se purificaron mediante un método común. A continuación, se obtuvo una suspensión de bibliotecas fágicas que había sido dializada frente a TBS. Seguidamente, se añadió BSA a la suspensión de bibliotecas fágicas para preparar una concentración final de 4%.

A continuación, se añadieron 250 pmoles de CD137 humano biotinilado a la suspensión de bibliotecas fágicas preparada para poner en contacto la suspensión de bibliotecas fágicas con CD137 humano a temperatura ambiente durante 60 minutos. Seguidamente, se añadieron perlas magnéticas bloqueadas con BSA a la suspensión de bibliotecas fágicas y se dejó que los complejos de CD137 humano-fago se uniesen a las perlas magnéticas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las perlas se lavaron una vez con TBS. A continuación, se añadieron 0,5 ml de solución de tripsina 1 mg/ml a las perlas, se suspendieron las perlas a temperatura ambiente durante 15 minutos y se separaron inmediatamente las perlas utilizando un soporte magnético para recoger una suspensión de fagos. La suspensión fágica recogida se añadió a 10 ml de la cepa ER2738 de E. coli en la etapa de crecimiento logarítmico (DÜ600=0,4 a 0,7). Los E. coli se sometieron a agitación suave y se incubaron a 37°C durante una hora para permitir que los fagos infectasen los E. coli. Los E. coli infectados se sembraron en una placa (225 mm x 225 mm). A continuación, se recogieron los fagos del medio de cultivo de los E. coli sembrados para preparar una suspensión de bibliotecas fágicas.

En la segunda ronda de inmunoadsorción, se enriqueció en fagos capaces de unión a CD137 humano. Se añadieron 100 pmoles de CD137 humano biotinilado a la suspensión de bibliotecas fágicas obtenida y la suspensión de bibliotecas fágicas se puso en contacto con CD137 humano a temperatura ambiente durante 60 minutos. Seguidamente, se añadieron perlas magnéticas bloqueadas con BSA a la suspensión de bibliotecas fágicas y se dejó que los complejos de CD137 humano-fago se uniesen a las perlas magnéticas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después, se lavaron tres veces con TBST (TBS que contenía Tween-20 al 0,1%) y dos veces con TBS. Después, se añadieron a las perlas 0,5 ml de solución de tripsina 1 mg/ml. Las perlas se suspendieron a temperatura ambiente durante 15 minutos y se separaron inmediatamente utilizando un soporte magnético para recoger una suspensión de fagos. La suspensión fágica recogida se añadió a 10 ml de la cepa ER2738 de E. coli en la etapa de crecimiento logarítmico (DÜ600=0,4 a 0,7). Los E. coli se sometieron a agitación suave y se incubaron a 37°C durante una hora para permitir que los fagos infectasen los E. coli. Los E. coli infectados se sembraron en una placa (225 mm x 225 mm). A continuación, se recogieron los fagos del medio de cultivo de los E. coli sembrados para preparar una suspensión de bibliotecas fágicas.

La inmunoadsorción para obtener anticuerpos capaces de unirse a CD137 humano se repitió tres veces mediante el mismo procedimiento. Se llevó a cabo una cuarta operación de inmunoadsorción utilizando 40 pmoles de CD137 humano biotinilado.

6-3. Construcción de una biblioteca sintética de anticuerpos humanos de expresión fágica.

Se construyó una biblioteca sintética de anticuerpos humanos de expresión fágica mediante un método conocido por el experto en la materia utilizando diez tipos de secuencias de línea germinal de cadena pesada y siete tipos de secuencias de línea germinal de cadena ligera. La frecuencia de aparición en el repertorio de células B humanas y las propiedades físicoquímicas en la familia de regiones variables se utilizaron como indicadores para seleccionar VH1-2, VH1-69, VH3-23, VH3-66, VH3-72, VH4-59, VH4-61, VH4-b, VH5-51, VH6-1, Vk1-39, Vk2-28, Vk3-20, VA1-40, VA1-44, VA2-14 y VA3-21 para la utilización como las secuencias de línea germinal. Los sitios de reconocimiento de antígeno de la biblioteca sintética de anticuerpos se diversificaron mediante imitación de los repertorios de anticuerpos de las células B humanas.

6-4. Adquisición de anticuerpos de unión a CD137 humano de una biblioteca sintética de anticuerpos humanos mediante inmunoadsorción.

Se seleccionaron los anticuerpos que mostraban actividades de unión a antígeno mediante cribado de la biblioteca sintética de anticuerpos humanos de expresión fágica construida en el Ejemplo 6-3. Más específicamente, se recogieron fagos que presentaban anticuerpos que mostraban una actividad de unión de los antígenos capturados por las perlas. Se utilizó CD137 humano biotinilado como el antígeno.

Los fagos producidos a partir de E. coli portadores de los fagémidos construidos para la expresión fágica se purificaron mediante un método común. Una población de fagos se precipitó a partir del medio de cultivo de E. coli utilizado para la producción de fagos mediante la adición de NaCl 2,5 M/PEG al 1%. A continuación, se diluyó el precipitado con TBS para preparar una suspensión de bibliotecas fágicas. Seguidamente, se añadió BSA a la suspensión de bibliotecas fágicas para preparar una concentración final de 4%. Se llevó a cabo un procedimiento de inmunoadsorción utilizando perlas magnéticas con antígeno inmovilizado. Las perlas magnéticas utilizadas eran perlas recubiertas con neutravidina (SpeedBeads Sera-Mag recubiertas con neutravidina) o perlas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280 estreptavidina).

A continuación, se añadieron 250 pmoles de CD137 humano biotinilado a la suspensión de bibliotecas fágicas preparada para poner en contacto la suspensión de bibliotecas fágicas con CD137 humano a temperatura ambiente durante 60 minutos. Seguidamente, se añadieron perlas magnéticas bloqueadas con BSA a la suspensión de bibliotecas fágicas y se dejó que los complejos de CD137 humano-fago se uniesen a las perlas magnéticas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las perlas se lavaron una vez con TBS. A continuación, se añadieron 0,5 ml de solución de tripsina 1 mg/ml a las perlas, se suspendieron las perlas a temperatura ambiente durante 15 minutos y se separaron inmediatamente utilizando un soporte magnético para recoger una suspensión de fagos. La suspensión fágica recogida se añadió a 10 ml de la cepa ER2738 de E. coli en la etapa de crecimiento logarítmico (DO600=0,4 a 0,7). Los E. coli se sometieron a agitación suave y se incubaron a 37°C durante una hora para permitir que los fagos infectasen los E. coli. Los E. coli infectados se sembraron en una placa (225 mm x 225 mm). A continuación, se recogieron los fagos del medio de cultivo de los E. coli sembrados para preparar una suspensión de bibliotecas fágicas.

En la segunda ronda de inmunoadsorción, se enriqueció en fagos capaces de unión a CD137 humano. Se añadieron 100 pmoles de CD137 humano biotinilado a la suspensión de bibliotecas fágicas obtenida y la suspensión de bibliotecas fágicas se puso en contacto con CD137 humano a temperatura ambiente durante 60 minutos. Seguidamente, se añadieron perlas magnéticas bloqueadas con BSA a la suspensión de bibliotecas fágicas y se dejó que los complejos de CD137 humano-fago se uniesen a las perlas magnéticas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con TBST y dos veces con TBS. A continuación, se añadieron 0,5 ml de solución de tripsina 1 mg/ml a las perlas, se suspendieron las perlas a temperatura ambiente durante 15 minutos y se separaron inmediatamente utilizando un soporte magnético para recoger una suspensión de fagos. La suspensión fágica recogida se añadió a 10 ml de la cepa ER2738 de E. coli en la etapa de crecimiento logarítmico (DO600=0,4 a 0,7). Los E. coli se sometieron a agitación suave y se incubaron a 37°C durante una hora para permitir que los fagos infectasen los E. coli. Los E. coli infectados se sembraron en una placa (225 mm x 225 mm). A continuación, se recogieron los fagos del medio de cultivo de los E. coli sembrados para preparar una suspensión de bibliotecas fágicas.

6-5. Evaluación de la propiedad de unión a CD137 humano mediante ELISA fágico.

A partir de colonias individuales de E. coli obtenidas mediante el método de inmunoadsorción descrito en los Ejemplos, anteriormente, se recogieron sobrenadantes de cultivo que contenían fagos mediante un método convencional (Methods Mol. Biol. 178: 133-145, 2002).

Se sometieron fagos complementados con TBS a ELISA mediante el procedimiento a continuación. Se recubrieron placas de microtitulación StreptaWell 96 (Roche) utilizando 100 pl de TBS que contenía el antígeno marcado con biotina (CD137 humano biotinilado) a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar cada pocillo de la placa con TBST (TBS que contenía Tween-20 al 0,1%) para eliminar el antígeno que no se había unido a la placa, los pocillos se bloquearon con 250 pl de leche desnatada al 2%-TBS durante una hora o más. Se eliminó leche desnatada al 2%-TBS y después se añadieron los fagos preparados a cada pocillo. Las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante una hora para conseguir la unión de los fagos expresantes de anticuerpos al antígeno en cada uno de los pocillos. Tras lavar cada pocillo con TBST, se añadió a los pocillos anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluido con TBS y las placas se incubaron durante una hora. Tras los lavados con TBST, se añadió a cada pocillo la solución individual TMB (ZYMED). La reacción cromogénica en la solución de cada pocilio se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico. A continuación, se evaluó el color revelado mediante la medición de la absorbancia a 450 nm.

Entre los 192 clones sometidos a ELISA fágico, se identificó una pluralidad de anticuerpos que presentaban actividad de unión a CD137 humano. Los resultados del ELISA fágico se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

6-6. Análisis de secuencias de anticuerpos que se unen a CD137 humano biotinilado.

A partir de los clones que se evalúa que presentan una actividad de unión específica a CD137 humano como resultado del ELISA fágico descrito en el Ejemplo 6-5, se analizaron las secuencias de nucleótidos de los genes amplificados utilizando parejas de cebadores específicos (SEC ID n° 55 y n° 56 para las bibliotecas de anticuerpos humanos no expuestas y s Ec ID n° 57 y n° 56 para las bibliotecas sintéticas de anticuerpos humanos). El resultado de los análisis confirmó la presencia de múltiples tipos de secuencias de anticuerpos que presentan actividad de unión a CD137 humano.

6-7. Preparación de anticuerpos de unión a CD137 humano.

A partir de los clones obtenidos en el Ejemplo 6-6, que se había evaluado que presentaban actividad de unión a CD137 humano marcado con biotina, se unieron las secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera de los cinco clones derivados de la biblioteca de anticuerpos humanos no expuestos (R1 a R5) y 14 clones derivados de la biblioteca sintética de anticuerpos humanos (R6 a R19) a la región constante del anticuerpo de cadena pesada (SEC ID n° 58, que es una secuencia producida mediante modificación de la región constante de IgG1 humana) o la secuencia de la región constante de la cadena ligera kappa (SEC ID n° 59) o la secuencia de la región constante lambda (SEC ID n° 60) y después se insertó cada una en plásmidos para la expresión en animales. Las secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera de cada uno de los clones se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6

Se expresó y purificó cada uno de los anticuerpos mediante el método descrito en el Ejemplo de referencia 1. Además, con el objetivo de potenciar el efecto activador in vitro de las células T de los anticuerpos anti-CD137 humanos, se produjeron genes en los que una región VH mostrada en la Tabla 6 se encuentra unida a la región constante (SEC ID n° 99) que presenta una unión potenciada a FcyRIIB humana, se insertaron los genes en un vector plasmídico para la expresión en células animales y se expresaron y purificaron los anticuerpos mediante un método similar para conseguir que su combinación de regiones variables fuese igual a las combinaciones mostradas en la Tabla 6.

[Ejemplo 7] Análisis de epítopos de anticuerpos anti-CD137 humano.

7-1. Preparación de proteínas de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc y preparación de anticuerpos.

Para el análisis de los epítopos de los anticuerpos anti-CD137 humano obtenidos, se prepararon proteínas de fusión que comprendían un CD137 humano fragmentado y una región Fc de anticuerpo, en los que el CD137 humano fragmentado se dividió en dominios basándose en una estructura común a TNFRSf y estructuras formadas por Cys-Cys denominadas CDR en referencia a J. Exp. Med. 211(7):1433-48, 30 de junio de 2014 (Tabla 7). La proteína de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc se insertó en un vector plasmídico para la expresión en células animales mediante un método conocido por el experto en la materia mediante la obtención de cada fragmento génico mediante PCR a partir del polinucleótido codificante de la proteína de fusión de CD137 humano de longitud completa-Fc (SEC ID n° 100), de manera que contuviese una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 7. La proteína de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc se purificó de la misma manera que los anticuerpos, mediante el método descrito en el Ejemplo de referencia 1. Además, como control para el ELISA, se obtuvieron anticuerpos mediante el método descrito en el Ejemplo de referencia 1, mediante la incorporación en un vector plasmídico para la expresión en células animales, de genes codificantes de un anticuerpo (SEC ID n° 101 para la cadena H, y SEC ID n° 102 para la cadena L) producidos mediante modificación de la región constante de la cadena H del anticuerpo anti-CD137 humano indicado en el documento n° WO2005/035584A1 (abreviadamente, B) por una región constante eliminada de la Gly y Lys C-terminales en la región constante de la cadena H de la IgG1 humana y codificantes de un anticuerpo (SEC ID n° 103 para la cadena H, y SEC ID n° 104 para la cadena L) producidos mediante modificación de la región constante del anticuerpo anti-CD137 humano indicado en el documento n° WO2012/145183A3 (abreviadamente, M) por una región constante con unión potenciada a FcyRIIB humano.

7-2-1. Análisis de epítopos utilizando las proteínas de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc.

Las proteínas de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc preparadas en el Ejemplo 7-1 se utilizaron para evaluar la unión mediante ELISA a fin de determinar qué sitios en CD137 humano resultan ligados por los anticuerpos (que utilizan la SEC ID n° 99 como la región constante de cadena pesada) obtenidos en el Ejemplo 6, indicado anteriormente. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo que se una al dominio 1, se predice que dicho anticuerpo se une a las proteínas de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc que contienen dominio 1, aunque no a proteínas de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc que no contienen dominio 1.

7-2-2. Método ELISA

Se diluyeron las proteínas de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc a una concentración de 2 pg/ml en una solución acuosa de carbonato sódico ajustada a pH 9,6. Se añadieron cincuenta pl de una proteína de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc diluida individualmente a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano Nunc MaxiSorp (Nunc). Lo anterior se dejó en reposo a 4°C durante la noche o más tiempo y después se dejó la placa bajo reposo a temperatura ambiente durante una hora de manera que la placa presente una temperatura igual a la temperatura ambiente. La solución que contiene la proteína de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc se eliminó mediante decantación y cada pocillo se lavó tres veces con 300 pl de tampón de lavado (TBS que contiene Tween-20al 0,1%, TaKaRa). A continuación, se añadieron 150 pl de tampón de bloqueo (TBS que contiene BSA al 2%) a cada pocillo y se dejó bajo reposo durante una hora o más. Se eliminó el tampón de bloqueo mediante decantación y se lavó cada pocillo tres veces con tampón de lavado de una manera similar a una etapa anterior. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 pl de una solución de anticuerpo preparada previamente mediante dilución con TBS a 10 pg/ml o 5 pg/ml. Lo anterior se sometió a una velocidad de 600 rpm aproximadamente durante una hora a temperatura ambiente para unir el anticuerpo al antígeno inmovilizado. Tras eliminar la solución de anticuerpo mediante decantación, se lavó cada pocillo tres veces con tampón de lavado de una manera similar a una etapa anterior. Se añadieron a cada pocillo 100 pl de una solución de anticuerpo secundario producida mediante dilución de 1000 veces con TBS que contenía Tween-20 al 0,1%. Como anticuerpo secundario, se utilizó conjugado de anticuerpo y fosfatasa alcalina inmunoglobulina humana anticuerpo de cabra anti-kappa humana-fosfatasa alcalina de Biosource en el caso de anticuerpos portadores de una cadena kappa, y se utilizó anticuerpo de cadena ligera lambda humana; conjugado de anticuerpo de cabra anti-cadena ligera lambda humana-fosfatasa alcalina de Bethyl Laboratories Inc., en el caso de anticuerpos portadores de una cadena lambda. Tras una hora de reacción mediante incubación a temperatura ambiente, se eliminó la solución de anticuerpo mediante decantación, y se lavó cada pocillo tres veces con tampón de lavado de una manera similar a una etapa anterior. Se llevó a cabo el revelado de color utilizando el kit BluePhos Microwell de KPL. Tras detener la reacción criogénica utilizando la solución de parada AP de IPL, se midió la absorbancia a 620 nm en un absorciómetro. Se muestran los resultados en la fig. 14. Tal como se muestra en la fig.

14, cada anticuerpo mostró un valor diferente de revelado del color hacia su proteína de fusión de CD137 humano fragmentado-Fc respectivo y se unía a una parte diferente de CD137 humano-Fc. Además, se mostró que los anticuerpos obtenidos eran diferentes de los anticuerpos existentes B y M.

[Ejemplo 8] Evaluación de los anticuerpos anti-CD137 humanos para su efecto in vitro activador de células T.

Las células T se cultivaron expansivamente a partir de PBMC disponible comercialmente (AllCells) utilizando Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Gibco, 11132D). Las células T humanas se suspendieron a una densidad de 4 x 105 células/ml en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, 60 U/ml de IL2 humana, 0,5 pg/ml de yonomicina, 10 ng/ml de PMA y una concentración específica de penicilina y estreptomicina. Además, se suspendió la línea celular de linfoma de células B humanas Raji en el mismo medio a una densidad de 4x105 células/ml. Se mezclaron dichas suspensiones celulares en cantidades iguales y se sembraron en una placa de 96 pocillos a razón de 100 pl/pocillo. Los anticuerpos de unión a CD137 humano obtenidos en el Ejemplo 6 (R1 a R19: los anticuerpos utilizados eran los mismos que en el ELISA descrito en el Ejemplo 7) se añadieron a una concentración de 5 pg/ml y las células se cultivaron bajo las condiciones de 37°C y 5% de CO²durante tres días. Se recolectó el sobrenadante de cultivo y se midió la concentración de IFN-y humana en el sobrenadante mediante ELISA a fin de evaluar la activación de las células T humanas. Se llevó a cabo un ELISA siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit de ELISA (PreproTech).

Como resultado (fig. 15), en comparación con la IgG humana de control (Allexis, 804-133-C100; hIgG en la fig. 15), todos los clones aparte de R7 y R l5 mostraron una actividad inductora de IFN-y. Se evaluó que dichos anticuerpos con actividad inductora de IFN-y eran anticuerpos agonistas contra CD137.

Las características de los anticuerpos obtenidos se resumen en la fig. 16. Se obtuvieron muchos anticuerpos que reconocen epítopos diferentes de los de los anticuerpos anti-CD137 humanos B y M mostrados en los Ejemplos anteriormente indicados. Dichos anticuerpos anti-CD137 humanos se modificaron formando anticuerpos biespecíficos con un anticuerpo de GC33 (anticuerpo anti-GPC3 humano) y se evaluaron para su capacidad agonista de CD137 dependiente de antígeno de cáncer (GPC3). Lo anterior puede proporcionar anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 humano que ejercen los efectos antitumorales deseados.

[Ejemplo 9] Preparación de anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD40 de ratón (GPC3 FAE-FGK45).

El anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD40 de ratón GPC3 FAE-FGK45 portador de las regiones constantes de IgG1 humana se produjo mediante el procedimiento proporcionado posteriormente. Para el lado anti-CD40 de ratón, se utilizó FGK45VH6 (SEC ID n° 120) para la región variable de cadena pesada, y FGK45VL4 (SEC ID n° 121) como la región variable de cadena ligera. En este caso, se utilizó F760nG3P17 (SEC ID n° 119) y k0 (SEC ID n° 118) para las regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente. El lado anti-GPC3 humano de los anticuerpos compartía la región variable de cadena pesada H0000 (SEC ID n° 115) y la región variable de cadena ligera GL4 (SEC ID n° 116) en común. En este caso, la región constante de cadena pesada F760nN17 (SEC ID n° 117), que ha sido modificada de manera que haya una asociación heteróloga entre las dos cadenas pesadas y la unión a receptor de Fcy, está reducida, y la región constante de cadena ligera k0 (SEC ID n° 118) se utilizaron para las regiones constantes. Dichos anticuerpos se expresaron utilizando el método siguiente. Las células de la cepa 293-F derivada de células renales embrionarias humanas (Invitrogen) se suspendieron en medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) y se sembraron a una densidad celular de 1,33x106 células/ml. Los plásmidos preparados se introdujeron en las células mediante un método de lipofección. Las células se cultivaron durante cuatro días en un incubador de CO2 (37°C, 8% de CO², 90 rpm) y a partir de los sobrenadantes de cultivo, se purificaron los anticuerpos utilizando rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) o Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE HEALTHCARE) mediante un método conocido por el experto en la materia. Se midió la absorbancia a 280 nm de la solución purificada de anticuerpo utilizando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de los anticuerpos purificados a partir de los valores determinados utilizando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science 4: 2411-2423, 1995). Cada una de las formas homólogas purificadas se mezcló utilizando las combinaciones mostradas en la Tabla 8 para preparar los anticuerpos biespecíficos de interés utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia (documento n° WO2015/046467).

Tabla 8

[Ejemplo 10] Evaluación del efecto de potenciación de la activación in vitro de esplenocitos por una mezcla de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD40 de ratón y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón.

Se extrajo el bazo de ratones Balb/c hembra no expuestos y las células se suspendieron a una densidad de 4x106 células/ml en un medio preparado mediante la adición de IL2 de ratón a una concentración de 10 ng/ml a un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, 0,5 pg/ml de yonomicina y 10 ng/ml de PMA. La línea celular de cáncer colorrectal de ratón CT26-GPC3 que expresase GPC3 humana (Ejemplo de referencia 3) también se suspendió en el mismo medio a una densidad de 4x105 células/ml. Se mezclaron dichas dos suspensiones celulares en cantidades iguales y lo resultante se sembró en una placa de 96 pocillos a razón de 100 pl/pocillo. Se añadió un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD40 de ratón con unión a FcyR extremadamente reducida (GPC3 ERY22-FGK45) a una concentración de 3 pg/ml y un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 de ratón con unión a FcyR extremadamente reducida (GPC3 ERY22-2C11) se añadió a razón de 1 pg/ml y las células se cultivaron bajo condiciones de 37°C y 5% de CO²durante 72 horas. Se recolectó el sobrenadante de cultivo y se midió la concentración de IFN-y de ratón contenido en el sobrenadante mediante ELISA a fin de evaluar la activación de las células T contenidas en los esplenocitos. Se llevó a cabo un ELISA siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit de ELISA (PreproTech).

Como resultado (fig. 17), mientras que GPC3 ERY22-2C11 mostraba actividad de inducción de IFN-y como agente individual, GPC3 ERY22-FGK45 como agente individual prácticamente no mostró ninguna actividad. Sin embargo, una mezcla de GPC3 ERY22-FGK45 y GPC3 ERY22-2C11 mostró una acumulación elevada de IFN-y. Lo anterior sugiere que la aplicación de estimulación de CD3 y de estimulación de CD40 simultáneamente en diversas mezclas de células inmunitarias resulta en una fuerte activación de las células T.

[Ejemplo 11] Preparación de anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón y evaluación de sus actividades agonistas.

11-1. Preparación de anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 humano.

Los anticuerpos biespecíficos anti-GPC3 humano/anti-CD137 de ratón portadores de regiones constantes de IgG1 humana se produjeron mediante el procedimiento siguiente. Las secuencias (R3 y R5), que se había confirmado que se unían a CD137 humano en el Ejemplo 7, se modificaron utilizando cebadores diseñados para causar cambios aleatorios en los aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada. Las secuencias de la región variable se muestran en la Tabla 9. En dicho caso, al modificarlos a partir de R3 y R5, una secuencia producida mediante la adición de Gly-Lys (también escrita "GK") al extremo C-terminal de la secuencia de F760nG3P17 construida en el Ejemplo 9 y la secuencia de la región constante lambda (SEC ID n° 60) se utilizaron para la región constante de cadena pesada y la región constante de cadena ligera, respectivamente. El lado anti-GPC3 humano de los anticuerpos compartía la región variable de cadena pesada H0000 (SEC ID n° 115) y la región variable de cadena ligera g L4 (SEC ID n° 116) en común. En este caso, la región constante de cadena pesada F760nN17 (SEC ID n° 117), que ha sido modificada de manera que haya una asociación heteróloga entre las dos cadenas pesadas y que presenta una unión de receptor de Fcy reducida, y la región constante de cadena ligera k0 (SEC ID n° 118) se utilizaron para las regiones constantes. Dichos anticuerpos se expresaron utilizando el método siguiente. Las células de la cepa FreeStyle 293-F derivada de células renales embrionarias humanas (Invitrogen) se suspendieron en medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) y se sembraron en una placa a una densidad celular de 1,33x106 células/ml. Los plásmidos preparados se introdujeron en las células mediante un método de lipofección. Las células se cultivaron durante cuatro días en un incubador de CO²(37°C, 8% de CO², 90 rpm) y a partir de los sobrenadantes de cultivo, se purificaron los anticuerpos utilizando rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) o Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE HEALTHCARE) mediante un método conocido por el experto en la materia. Se midió la absorbancia a 280 nm de la solución purificada de anticuerpo utilizando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de los anticuerpos purificados a partir de los valores determinados utilizando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science 4: 2411-2423, 1995). Para los anticuerpos anti-CD137 humanos (derivados de R3 y R5), se llevaron a cabo cálculos utilizando E1%=14. Tal como se muestra en la Tabla 9, el anticuerpo anti-GPC humano y las formas homólogas de cada uno de los anticuerpos de CD137 humanos purificados de la misma manera que en el Ejemplo 9 se mezclaron para preparar los anticuerpos biespecíficos de interés utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia (documento n° WO2015/046467).

Tabla 9

11-2. Evaluación del efecto agonista in vitro de CD137 dependiente de GPC3 de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 humano.

Las células T se cultivaron expansivamente a partir de PBMC disponible comercialmente (AllCells) utilizando Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Gibco, 11132D). Las células T humanas se suspendieron a una densidad de 4x105 células/ml en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, 60 U/ml de IL2 humana, 0,5 pg/ml de yonomicina, 10 ng/ml de PMA y una concentración específica de penicilina-estreptomicina. Además, la línea celular de cáncer colorrectal de ratón CT26-GPC3 que expresa GPC3 humana (Ejemplo de referencia 3) también se suspendió en el mismo medio a una densidad de 4x105 células/ml. Se mezclaron dichas dos suspensiones celulares en cantidades iguales y lo resultante se sembró en una placa de 96 pocillos a razón de 100 pl/pocillo. IgG humana de control (Allexis, 804-133-C100: hIgG1 de control en la fig. 18) o Gp C3 FAE-BMS preparado en el Ejemplo 11-1, anteriormente (anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 humano con unión a FcyR extremadamente reducida) se añadió a lo anterior a una concentración de 10 pg/ml y las células se cultivaron bajo las condiciones de 37°C y 5% de CO²durante tres días. Se recolectó el sobrenadante de cultivo y se midió la concentración de IFN-y humana en el sobrenadante mediante ELISA a fin de evaluar la activación de las células T. Se llevó a cabo un ELISA siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit de ELISA (PreproTech).

Como resultado (fig. 18), el anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 humano mostró una actividad inductora de IFN-y. Lo anterior sugiere que en las células T humanas también, la estimulación con CD137 resulta en una fuerte activación de las células T, de manera similar a la utilización de células T de ratón en el Ejemplo 2.

11-3. Evaluación del efecto agonista in vitro de CD137 dependiente de GPC3 de un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD137 humano.

CD137 humano también se expresa en la línea de células B HDML-2 y la actividad agonista de CD137 también puede medirse utilizando HDML-2. Se suspendieron células de la línea celular de cáncer de células B humanas HDLM-2 a una densidad de 8x105 células/ml en medio RPMI1640 que contenía FBS al 20% y una concentración especificada de penicilina-estreptomicina. Además, la línea celular de cáncer colorrectal de ratón CT26-GPC3 que expresa GPC3 humana (Ejemplo de referencia 3) también se suspendió en el mismo medio a una densidad de 4x105 células/ml. Se mezclaron dichas suspensiones celulares en cantidades iguales y lo resultante se sembró en una placa de 96 pocillos a razón de 100 pl/pocillo. Se añadió IgG humana de control (Allexis, 804-133-C100: hIgG1 de control en la fig. 19) o

Claims

REIVINDICACIONESi . Anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad, que comprende:

(1) un dominio Fab de unión a antígeno específico de cáncer,

(2) un dominio Fab de unión a superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), que es un dominio Fab de unión a CD137 o un dominio Fab de unión a CD40, y

(3) un dominio de unión a FcRn que es una región Fc de anticuerpo que presentan una actividad reducida de unión a receptor de Fcy,

en el que el anticuerpo biespecífico presenta una actividad agonista contra un receptor del factor de necrosis tumoral (TNF).
2. Anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad según la reivindicación 1, en el que el dominio Fab de unión a la superfamilia de receptores de TNF es un dominio Fab de unión a CD137.
3. Composición farmacéutica inductora de citotoxicidad, que comprende como ingrediente activo el anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1 o 2.
4. Composición farmacéutica inductora de citotoxicidad según la reivindicación 3, que comprende además una molécula de unión a antígeno que comprende:

(1) un dominio de unión a antígeno específico de cáncer y

(2) un dominio de unión a CD3 y

(3) un dominio de unión a FcRn que presenta actividad reducida de unión a receptor de Fcy.
5. Composición farmacéutica inductora de citotoxicidad para la utilización en el tratamiento del cáncer, en la que dicha composición comprende como ingrediente activo un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad según se define en la reivindicación 1 o 2 para la administración simultánea o separada con una molécula de unión a antígeno según se define en la reivindicación 4.
6. Composición farmacéutica inductora de citotoxicidad para la utilización en el tratamiento del cáncer, en el que dicha composición comprende como ingrediente activo una molécula de unión a antígeno tal como se ha definido en la reivindicación 4, para la administración simultánea o separada con un anticuerpo biespecífico inductor de citotoxicidad según se define en la reivindicación 1 o 2.
7. Composición farmacéutica inductora de citotoxicidad según la reivindicación 4, o composición farmacéutica inductora de citotoxicidad para la utilización según la reivindicación 5 o 6, en la que la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico.