KR20160142332A - 면역활성화 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

암 특이적 항원 결합 도메인과, TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자를 사용함으로써, 암 특이적 항원 발현 세포 존재하에서만 TNF 슈퍼패밀리 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 인자에 대한 아고니스트 활성이 발휘됨으로써 면역세포가 활성화되어, 항종양 활성을 유지하면서 간독성 등의 부작용을 회피할 수 있는 것을 발견하였다. 또한 상기 항원 결합 분자에 암 특이적 항원 결합 도메인과 T세포 수용체 복합체 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자를 병용함으로써 부작용을 회피하면서 상기 항종양 활성을 높일 수 있는 것을 발견하였다.

Description

면역활성화 항원 결합 분자{Immunoactivating antigen-binding molecule}
본 발명은 이중 특이성 항체를 사용한 신규한 암 치료법에 관한 것이다.
암은 전세계에 있어서 사망의 주된 원인 중 하나이다. 일부의 암종을 제외하고 그 발견 시에 있어서는 수술 불가능한 경우도 적지 않으며, 더 나아가서는 주된 치료법인 화학 요법제를 사용한 치료 성적도 결코 높다고는 할 수 없다. 암의 치료를 곤란하게 하고 있는 요인으로서 암세포 그 자체의 불균일성뿐 아니라 종양 미소환경이 큰 역할을 하고 있는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 1). 최근 들어 절제 불가능한 악성 흑색종 등에 있어서 억제성 T세포를 감소시키는 항CTLA-4 항체에 의해 치료의 가능성이 나타내어졌다(비특허문헌 2). 이것은 종양 면역부활이 새로운 암 치료 전략의 기축이 될 수 있는 것을 시사하고 있다.
종양 면역에 중요한 역할을 갖는 T세포의 활성화는 1) 종양 조직 적합 유전자 복합체(MHC) 클래스 I 분자에 의해 제시된 항원 펩티드에 대한 T세포 수용체(TCR)의 결합 및 활성화；2) 항원 제시 세포 상의 그 리간드에 대한 T세포 표면 상의 공자극 분자의 결합과 활성화의 두 신호에 의해 이루어진다고 이해되어 있다. 더 나아가서는 T세포 표면 상의 CD137(4-1BB)을 비롯한 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리나 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 분자의 활성화가 T세포 활성화에 중요한 것도 기술되어 있다(비특허문헌 3).
TNF 슈퍼패밀리 및 TNF 수용체 슈퍼패밀리에는 CD137, CD137L, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, RANK, RANKL, CD30, CD153, GITR, GITRL 등의 분자가 포함된다. CD137은 T세포 표면뿐 아니라 수상세포(DC), B세포, NK세포, 호중구 등 다른 면역세포 표면에도 발현되고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4).
CD137 아고니스트 항체가 항종양 효과를 나타내는 것은 이미 실증되어 있으며, 그것이 주로 CD8 양성 T세포와 NK세포의 활성화에 의한 것임이 실험적으로 나타내어져 있다(비특허문헌 5). 그러나 임상 및 비임상에 있어서 CD137 아고니스트 항체의 비특이적인 간독성에 의한 부작용이 문제가 되고 있어 약제의 개발은 진행되고 있지 않다(비특허문헌 6；비특허문헌 7). 이 부작용의 주된 원인으로서는 항체 불변영역을 매개로 한 Fcγ 수용체로의 결합의 관여가 시사되어 있다(비특허문헌 8). 또한 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 수용체의 아고니스트 항체가 생체 내에서 아고니스트 활성을 발휘하기 위해서는 Fcγ 수용체 발현 세포(FcγRII 발현 세포)에 의한 항체의 가교가 필요한 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9). 즉, CD137 아고니스트 항체의 항종양 효과의 약효와 간독성 등의 부작용은 모두 항체의 Fcγ 수용체로의 결합이 관여하고 있는 것으로부터, 항체의 Fcγ 수용체의 결합을 증강시키면 약효의 향상은 기대되나 간독성의 부작용도 증대되며, 항체와 Fcγ 수용체의 결합을 저감시키면 부작용은 저감되나 약효도 저감되어 버리는 것으로 생각되어, 이제까지 약효와 부작용을 분리한 CD137 아고니스트 항체는 보고되어 있지 않다. 더 나아가서는 CD137 아고니스트 항체의 항종양 효과 그 자체에 대해서도 결코 강한 것은 아니어서 독성의 회피와 동시에 추가적인 약효의 증대가 요망되고 있다.
이중 특이성 항체는 적어도 2개의 결합 도메인을 갖도록 특징지어지며, 당업자에게 있어 이미 잘 알려진 분자 형태이다. 이 중에서 2개의 결합 도메인 중 하나가 암표면 항원에 특이적으로 결합하고, 또한 제2 결합 도메인이 T세포 표면 항원의 CD3에 결합하는 분자도 구축되어 있다(비특허문헌 10). 이 이중 특이성 단일 사슬 항체는 암 항원 의존적으로 T세포를 활성화하여 항종양 효과를 발휘하는 것이 나타내어져 있다.
글리피칸3(GPC3)는 글리코실포스파티딜이노시톨을 매개로 세포 표면에 결합되어 있는 헤파란 황산 프로테오글리칸의 1군, 즉 글리피칸 패밀리에 속하는 단백질이다(비특허문헌 11). 글리피칸은 세포의 증식, 분화, 유주(migration)에 중요한 역할을 하고 있다. GPC3는 외과적 절제 또는 생체 검사에 의해 얻어진 간세포 암조직의 70% 이상에 발현하고 있으며, 인접하는 비종양성 간병변이나 대부분의 성인 조직에 있어서는 전혀, 또는 거의 발현하고 있지 않다(비특허문헌 12；비특허문헌 13). 더 나아가서는 간세포 암조직 GPC3 발현이 높은 환자에게서 예후가 나쁘다는 보고도 있어(비특허문헌 14), GPC3는 간세포암에 대한 유망한 표적 분자로 생각되고 있다.
Hanahan, Cell, 2011, 144, 646-74 Prieto, Clin Cancer Res. 2012, 18, 2039-47 Summers, Nat. Rev. Immunol., 2012, 12, 339-51 Vinay, Cell Biol Int., 2009, 33, 453-65 Houot, Blood, 2009, 114, 3431-8 Ascierto, Semin Oncol., 2010, 37, 508-16 Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 59, 1223-33 Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22 Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6 Brandl, Cancer Immunol. Immunother., 2007, 56, 1551-63 Filmus, J. Clin. Invest., 2001, 108, 497-501 Zhu-Zu-W, Gut, 2001, 48, 558-564 Yamauchi, Mod. Pathol., 2005, 18, 1591-1598 Yorita, Liver Int., 2010, 1, 120-131
본 발명은 상기와 같은 정황을 감안하여 이루어진 것으로, 독성을 회피하면서 면역세포를 활성화하여 우수한 항종양 효과를 발휘하는 TNF 슈퍼패밀리 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 대해 아고니스트 활성을 갖는 항원 결합 분자를 제공하는 것, 및 당해 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 또는 당해 의약 조성물에 의한 암의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인만 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인만을 갖는 항원 결합 분자의 경우는 면역세포를 활성화하는 작용이 없음에도 불구하고, 암 특이적 항원 결합 도메인과 TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인, 또는 암 특이적 항원 결합 도메인과 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자에 의해, 암 특이적 항원 발현 세포 존재하에서만 TNF 슈퍼패밀리 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 인자에 대한 아고니스트 활성을 발휘함으로써 면역세포가 활성화되어 항종양 활성을 유지하면서 간독성 등의 부작용을 회피할 수 있는 것을 발견하였다. 또한 당해 항원 결합 분자에 암 특이적 항원 결합 도메인과 T세포 수용체 복합체 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자를 조합하여 사용함으로써 부작용을 회피하면서 그의 항종양 활성을 높이는 것이 가능해지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 아래의 것을 제공하는 것이다.
〔1〕아래의 도메인：
(1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
(2) 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인
을 포함하는 항원 결합 분자.
〔2〕FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는,〔1〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔3〕FcRn 결합 도메인이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 항체의 Fc영역인,〔2〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔4〕TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인이 CD137 결합 도메인인,〔1〕내지〔3〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔5〕이중 특이성 항체인,〔1〕내지〔4〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔6〕〔1〕내지〔5〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
〔7〕세포상해(cytotoxicity)를 유도하는 조성물인,〔6〕에 기재된 의약 조성물.
〔8〕암 치료용 조성물인,〔6〕에 기재된 의약 조성물.
〔9〕〔1〕내지〔5〕중 어느 하나에 기재된 제1 항원 결합 분자와 아래의 도메인：
(1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
(2) T세포 수용체 복합체 결합 도메인
을 포함하는 제2 항원 결합 분자를 조합하여 이루어지는 의약 조성물.
〔10〕제2 항원 결합 분자가 FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인,〔9〕에 기재된 의약 조성물.
〔11〕FcRn 결합 도메인이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 항체의 Fc영역인,〔10〕에 기재된 의약 조성물.
〔12〕 T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T세포 수용체 결합 도메인인,〔9〕내지〔11〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔13〕 T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인,〔9〕내지〔11〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔14〕제2 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인,〔9〕내지〔13〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔15〕제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 배합되어 있는,〔9〕내지〔14〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔16〕제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 병용되는,〔9〕내지〔14〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔17〕제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 동시에 투여되는,〔9〕내지〔14〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔18〕제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 따로따로 투여되는,〔9〕내지〔14〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔19〕세포상해를 유도하는 조성물인,〔9〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔20〕암 치료용 조성물인,〔9〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔21〕아래의 도메인：
(1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
(2) 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인
을 포함하는 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는,
아래의 도메인：
(1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
(2) T세포 수용체 복합체 결합 도메인
을 포함하는 제2 항원 결합 분자와 병용하기 위한 의약 조성물.
〔22〕세포상해를 유도하는 조성물인,〔21〕에 기재된 의약 조성물.
〔23〕암 치료용 조성물인,〔21〕에 기재된 의약 조성물.
〔24〕제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자가 FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인,〔21〕내지〔23〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔25〕FcRn 결합 도메인이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 항체의 Fc영역인,〔24〕에 기재된 의약 조성물.
〔26〕TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인이 CD137 결합 도메인 또는 CD40 결합 도메인인,〔21〕내지〔25〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔27〕 T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T세포 수용체 결합 도메인인,〔21〕내지〔26〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔28〕 T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인,〔21〕내지〔26〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔29〕제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인,〔21〕내지〔28〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔30〕제2 항원 결합 분자와 동시에 투여되는,〔21〕내지〔29〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔31〕제2 항원 결합 분자와 따로따로 투여되는,〔21〕내지〔29〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔32〕아래의 도메인：
(1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
(2) T세포 수용체 복합체 결합 도메인
을 포함하는 제2 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는,
　아래의 도메인：
(1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
(2) 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인
을 포함하는 제1 항원 결합 분자와 병용아래의 위한 의약 조성물.
〔33〕세포상해를 유도하는 조성물인,〔32〕에 기재된 의약 조성물.
〔34〕암 치료용 조성물인,〔32〕에 기재된 의약 조성물.
〔35〕제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자가 FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인,〔32〕내지〔34〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔36〕FcRn 결합 도메인이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 항체의 Fc영역인,〔35〕에 기재된 의약 조성물.
〔37〕 T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T세포 수용체 결합 도메인인,〔32〕내지〔36〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔38〕 T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인,〔32〕내지〔36〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔39〕TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인이 CD137 결합 도메인 또는 CD40 결합 도메인인,〔32〕내지〔38〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔40〕제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인,〔32〕내지〔39〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔41〕제1 항원 결합 분자와 동시에 투여되는,〔32〕내지〔40〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔42〕제1 항원 결합 분자와 따로따로 투여되는,〔32〕내지〔40〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔43〕상기〔1〕내지〔5〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 상기〔6〕내지〔42〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, 세포상해를 유도하는, 세포증식을 억제하는, 암세포 또는 암세포를 포함하는 종양조직에 대한 면역을 활성화하는, 또는 암을 치료 또는 예방하는 방법.
〔44〕세포상해의 유도, 세포증식의 억제, 암세포 또는 암세포를 포함하는 조직에 대한 면역의 활성화, 또는 암의 치료 또는 예방에 있어서 사용하기 위한 상기〔1〕내지〔5〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 상기〔6〕내지〔42〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔45〕상기〔6〕내지〔42〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물의 제조에 있어서의 상기〔1〕내지〔5〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 사용.
〔46〕상기〔1〕내지〔5〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 사용하는 공정을 포함하는, 상기〔6〕내지〔42〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물을 제조하는 방법.
또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 의약 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자의 세포상해를 유도하기 위한 의약 조성물(예를 들면 암의 치료 또는 예방용 의약 조성물)의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 의약 조성물에 관한 것이다.
도 1은 항마우스 CD137 항체에 의한 T세포 활성화 작용을 IFN-γ ELISA로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. Ctrl mIgG1은 음성 대조 마우스 IgG1 항체를 나타낸다.
도 2는 다양한 분자형의 항마우스 CD137 항체에 의한 T세포 활성화 작용을 개념적으로 나타내는 도면이다.
도 3은 항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체에 의한 GPC3 항원 의존적인 T세포 활성화 작용을 개념적으로 나타내는 도면이다.
도 4는 항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체에 의한 GPC3 항원 의존적인 T세포 활성화 작용을 IFN-γ ELISA로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체의 항체 불변영역을 바꾼 것에 의한 GPC3 항원 의존적인 T세포 활성화 작용으로의 영향을 IFN-γ ELISA로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체와 항인간 GPC3/항마우스 CD3 이중 특이성 항체의 혼합물에 의한 T세포 활성화 증강 작용을 IFN-γ ELISA로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. Ctrl hIgG1은 음성 대조 인간 IgG1 항체(Alexis사)를 나타낸다.
도 7은 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체 및 항마우스 CD137 항체의 동계 CT26 종양 마우스 모델(syngeneic CT26 tumor mouse model)에서의 항종양 효과를 나타내는 그래프이다. 화살표는 항체 투여 시를 나타낸다.
도 8은 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체 및 항마우스 CD137 항체의 동계 CT26 종양 마우스 모델에서의 혈중 아스파라긴산 아미노트랜스페라아제(AST)로의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 9는 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체 및 항마우스 CD137 항체의 동계 CT26 종양 마우스 모델에서의 혈중 알라닌 아미노트랜스페라아제(ALT)로의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 10은 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체 및 항마우스 CD137 항체의 동계 CT26 종양 마우스 모델에서의 혈중 총 빌리루빈(total bilirubin)으로의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 11은 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체 및 항마우스 CD137 항체의 동계 CT26 종양 마우스 모델에서의 간장 병리 조직학적 소견을 나타내는 사진이다. a 및 d는 용매, b 및 e는 1D8-MB492, c 및 f는 GPC3 ERY22-3-1D8을 각각 투여한 마우스 대표예의 간장 절편을 헤마톡실린·에오신 염색한 병리조직 사진이다. 화살표 머리는 간세포의 변성·괴사, *는 염증 소견을 나타낸다.
도 12는 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체 및 항인간 GPC3/마우스 CD3 이중 특이성 항체의 병용에 의한 동계 LLC 종양 마우스 모델에서의 항종양 효과를 나타내는 그래프이다. 화살표는 항체 투여 시를 나타낸다.
도 13은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc영역을 구성하는 아미노산 잔기와 kabat의 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX로도 불림)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 14a는 항인간 CD137 항체와 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질의 결합을 평가하기 위한 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중 「Non」은 항원을 고상화하지 않은 웰(Non-Coating)에 있어서의 ELISA 발색값을 나타낸다.
도 14b는 도 14a에 나타내는 각 샘플의 ELISA 발색값을 Non-Coating(Non)에 있어서의 ELISA 발색값(항원을 고상화하지 않은 웰에 대한 결합)으로 나눈 값(Non coating에 대한 비)을 나타내는 도면이다.
도 15는 항인간 CD137 항체의 IFNγ 유도활성을 나타내는 그래프이다.
도 16은 항인간 CD137 항체의 T세포 활성화 작용과 결합 프로파일을 나타내는 도면이다.
도 17은 항인간 GPC3/항마우스 CD40 이중 특이성 항체와 항인간 GPC3/항마우스 CD3 이중 특이성 항체의 혼합물에 의한 T세포 활성화 증강 작용을 IFN-γ ELISA로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. Ctrl hIgG1은 음성 대조 인간 IgG1 항체를 나타낸다.
도 18은 항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체 GPC3 FAE-BMS의 T세포 활성화 작용을 IFN-γ ELISA로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. Ctrl hIgG1은 음성 대조 인간 IgG1 항체를 나타낸다.
도 19는 각종 항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체의 CD137을 매개로 한 아고니스트 활성을 B세포 활성화 IL-6의 생산량으로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. Ctrl hIgG1은 음성 대조 인간 IgG1 항체를 나타낸다.
아래의 정의는 본 명세서에 있어서 설명하는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.
항원 결합 분자
본 발명에 있어서의 「항원 결합 분자」란 본 발명의 「결합 도메인」을 포함하는 분자라면 특별히 한정되지 않으며, 또한 5아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩티드나 단백질이 포함되어 있어도 된다. 생물 유래의 펩티드나 단백질에 한정되지 않고, 예를 들면 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩티드여도 된다. 또한 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등 중 어느 것이어도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자의 바람직한 예로서 항체의 Fc영역에 포함되는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 들 수 있다. 생체 내에 투여된 단백질의 혈중 반감기를 늘리는 방법으로서 목적 단백질에 항체의 FcRn 결합 도메인을 부가하여 FcRn을 매개로 한 리사이클링 기능을 이용하는 방법이 잘 알려져 있다.
본 발명에 있어서 「FcRn 결합 도메인」은 FcRn에 대해 결합활성을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 FcRn을 항원으로 하는 항체의 가변영역, Fab, 항체의 Fc영역, 이들의 단편을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양의 하나로서 항체의 Fc영역, 또는 Fc영역 중 FcRn 결합 영역을 포함하는 단편을 들 수 있다. 여기서 「Fc영역」으로서, 예를 들면 천연형 IgG 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 천연형 IgG란 천연에서 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 면역글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그 자체에서 자연적으로 생기는 변이체 등도 포함된다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 항체의 불변영역으로서는, 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 시퀀스 오브 프로테인즈 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트, NIH 퍼블리케이션(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication) No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다. 특히 인간 IgG1의 서열로서는 EU 넘버링 356~358번째 아미노산 서열이 DEL이어도 되고 EEM이어도 된다.
항체의 Fc영역으로서는, 예를 들면 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 타입의 Fc영역이 존재하고 있다. 본 발명의 항체의 Fc영역은, 예를 들면 천연형 인간 IgG 항체 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 본 발명의 Fc영역으로서, 예를 들면 천연형 IgG의 불변영역, 구체적으로는 천연형 인간 IgG1을 기원으로 하는 불변영역(서열번호：1), 천연형 인간 IgG2를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：2), 천연형 인간 IgG3를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：3), 천연형 인간 IgG4를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：4) 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 천연형 IgG의 불변영역에는 그 자체에서 자연적으로 생기는 변이체 등도 포함된다.
이러한 항체의 Fc영역은, 예를 들면 단일클론 항체 등의 항체를 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에 단편을 프로틴 A 칼럼, 또는 프로틴 G 칼럼에 흡착시킨 후 적절한 용출 버퍼 등에 의해 용출시킴으로써 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정함으로써 단일클론 항체 등의 항체를 소화시킬 수 있는 것이면 특별히 한정은 되지 않으며, 예를 들면 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
항체의 아이소타입은 불변영역의 구조에 의해 결정된다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 아이소타입의 불변영역은 각각 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4로 불리고 있다. 인간 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호：5, 6, 7, 8로 예시된다. 각 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기와 kabat의 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX로도 불림)의 관계는 도 13에 나타내어져 있다.
Fc영역은 2개의 경쇄 및 사슬 간 디설피드 결합이 2개의 중쇄 사이에서 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인 간 불변영역의 일부분을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 F(ab')2를 제외한 영역을 말한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자를 구성하는 Fc영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에 프로틴 A 칼럼에 흡착된 분획을 재용출함으로써 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절하게 설정함으로써 제한적으로 F(ab')2를 생성하도록 전장 항체를 소화시킬 수 있는 것이면 특별히 한정은 되지 않으며, 예를 들면 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 FcRn 결합 도메인으로서는 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 도메인이 바람직하다. 여기서 Fcγ 수용체(본 명세서에서는 Fcγ 수용체, FcγR 또는 FcgR로 기재하는 경우가 있음)란 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 Fc영역에 결합할 수 있는 수용체를 말하며, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우에는 이 패밀리에는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64)；아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131(H형) 및 R131(R형)을 포함함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)；및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데 이들에 한정되는 것은 아니다. FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이 유래의 것이 포함되는데, 이들에 한정되지 않고 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16) 및/또는 FcγRIIIb(CD16)를 들 수 있다.
FcγR에는 ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)을 갖는 활성형 수용체와 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)을 갖는 억제형 수용체가 존재한다. FcγR은 FcγRI, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 활성형 FcγR과 FcγRIIb의 억제형 FcγR로 분류된다.
FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 NM_000566.3 및 NP_000557.1로, FcγRIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC020823.1 및 AAH20823.1로, FcγRIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC146678.1 및 AAI46679.1로, FcγRIIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC033678.1 및 AAH33678.1로, FcγRIIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC128562.1 및 AAI28563.1로 기재되어 있다(RefSeq 등록번호). 또한 FcγRIIa에는 FcγRIIa의 131번째 아미노산이 히스티딘(H형) 또는 아르기닌(R형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990). 또한 FcγRIIb에는 FcγRIIb의 232번째 아미노산이 이소류신(I형) 또는 트레오닌(T형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002)). 또한 FcγRIIIa에는 FcγRIIIa의 158번째 아미노산이 발린(V형) 또는 페닐알라닌(F형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)). 또한 FcγRIIIb에는 NA1형, NA2형 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990)).
Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는지 여부는 FACS, ELISA 포맷, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR)현상을 이용한 비아코어(BIACORE)법 등, 주지의 방법에 의해 확인할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은 도너와 억셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 아래의 원리에 기초하여 실시된다. 도너 비드(donor beads)에 결합한 분자가 억셉터 비드(acceptor beads)에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하고, 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 신호가 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드 내의 감광제는 주변의 산소를 여기 상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변으로 확산되어 근접해 있는 억셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광 반응을 일으켜 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 억셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 억셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들면 항원 결합 분자가 FcRn 결합 도메인으로서 항체의 Fc영역을 포함하는 경우, 야생형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체에 대한 결합을 변화시키기 위한 아미노산 변이가 가해진 변이 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 준비하여 도너 비드에 비오틴 표지된 항원 결합 분자를 결합시키고, 억셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라아제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체를 결합시킨다. 변이 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자의 존재하에서는 야생형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 ㎚의 신호를 발생시킨다. 변이 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 태그화하지 않는 경우, 야생형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항원 결합 분자를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화 하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는 Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터를 보유한 세포 등에 있어서 발현시켜, 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 신호는 예를 들면 그래퍼드 프리즘(GRAPHPAD PRISM)(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 1부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시킴으로써 적절하게 해석된다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 위에 고정하고, 센서칩의 뒤쪽에서 금박막과 유리의 경계면에서 전반사되도록 빛을 조사하면 반사광의 일부에 반사 강도가 저하된 부분(SPR 신호)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른쪽(분해물질)을 센서칩 표면에 흐르게 하여 리간드와 분해물질(analyte)이 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하고 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화에 의해 SPR 신호의 위치가 이동한다(역으로 결합이 해리되면 신호의 위치는 되돌아간다). 비아코어 시스템은 상기의 이동량, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축으로 하고 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)를, 당해 상수의 비로부터 어피니티(KD)를 구할 수 있다. 비아코어법에서는 저해 측정법도 적합하게 사용된다. 저해 측정법의 예는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 기재되어 있다.
본 명세서에 있어서 「Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있다」는 것은, 예를 들면 상기의 해석 방법에 기초하여 대조로 하는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자의 결합활성과 비교하여 피험 항원 결합 분자의 결합활성이 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 결합활성을 나타내는 것을 말한다.
대조로 하는 항원 결합 분자로서는, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 단일클론 항체의 Fc영역을 포함하는 도메인을 갖는 항원 결합 분자가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：1(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N 말단에 A 부가), 서열번호：2(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N 말단에 A 부가), 서열번호：3(RefSeq 등록번호 CAA27268.1의 N 말단에 A 부가), 서열번호：4(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N 말단에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한 어떤 특정 아이소타입 항체의 Fc영역의 변이체를 갖는 항원 결합 분자를 피험 물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정 아이소타입 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써 당해 변이체가 갖는 변이에 의한 Fcγ 수용체로의 결합활성에 대한 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 것이 검증된 Fc영역의 변이체를 갖는 항원 결합 분자가 적절히 제작된다.
이러한 변이체의 예로서는, EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산인 231A-238S의 결실(WO2009/011941), C226S, C229S, P238S, (C220S)(J.Rheumatol (2007) 34, 11), C226S, C229S(Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54), C226S, C229S, E233P, L234V, L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192) 등의 변이체가 공지이다.
즉, 특정 아이소타입 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 아래의 어느 하나의 아미노산：220번 위치, 226번 위치, 229번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 325번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치가 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. Fc영역의 기원인 항체의 아이소타입으로서는 특별히 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 단일클론 항체를 기원으로 하는 Fc영역이 적절히 이용될 수 있으나, 천연형 인간 IgG1 항체를 기원으로 하는 Fc영역이 적합하게 이용된다.
예를 들면 IgG1 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 아래의 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타냄)：
(a) L234F, L235E, P331S,
(b) C226S, C229S, P238S,
(c) C226S, C229S,
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A
이 행해져 있는 Fc영역, 또는 231번 위치에서 238번 위치의 아미노산 서열이 결실된 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한 IgG2 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 아래의 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타냄)：
(e) H268Q, V309L, A330S, P331S
(f) V234A
(g) G237A
(h) V234A, G237A
(i) A235E, G237A
(j) V234A, A235E, G237A
이 행해져 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한 IgG3 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 아래의 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타냄)：
(k) F241A
(l) D265A
(m) V264A
이 행해져 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한 IgG4 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 아래의 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타냄)：
(n) L235A, G237A, E318A
(o) L235E
(p) F234A, L235A
이 행해져 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
기타 바람직한 예로서, 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 아래의 어느 하나의 아미노산：233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 331번 위치가 대응하는 IgG2 또는 IgG4에 있어서 그 EU 넘버링이 대응하는 아미노산으로 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 들 수 있다.
기타 바람직한 예로서, 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 아래의 어느 하나 또는 그 이상의 아미노산：234번 위치, 235번 위치, 297번 위치가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만 234번 위치, 235번 위치, 297번 위치 중 어느 하나 또는 그 이상의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 특히 바람직하다.
기타 바람직한 예로서, IgG1 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 265번 위치의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 265번 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 특히 바람직하다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 「암 특이적 항원 결합 도메인」, 「종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 결합 도메인」, 「종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인」 및 「T세포 수용체 복합체 결합 도메인」(이하, 이들 4개의 결합 도메인을 통틀어 항원 결합 도메인이라 함)은 각각의 항원인 암 특이적 항원, TNF 슈퍼패밀리에 속하는 인자, TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 인자, 또는 T세포 수용체 복합체의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하는 영역을 의미하며, 예를 들면 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 영역을 결합 도메인으로서 들 수 있다. 항원의 분자량이 큰 경우, 항체의 항원 결합 영역은 항원의 특정 부분에만 결합하는 것이 가능하다. 당해 특정 부분은 에피토프라 불린다. 항원 결합 도메인은 하나 또는 복수의 항체의 가변 도메인으로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변영역(VL)과 항체 중쇄 가변영역(VH)을 포함한다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는「scFv(single chain Fv)」,「단일 사슬 항체(single chain antibody)」,「Fv」,「scFv2(single chain Fv 2)」,「Fab」 또는 「F(ab')2」등을 적합하게 들 수 있다.
여기서 「암 특이적 항원」이란 암세포와 건강한 정상세포를 구별하는 것을 가능하게 하는 암세포가 발현하는 항원을 의미하며, 예를 들면 세포의 악성화에 수반하여 발현하는 항원, 세포가 암화되었을 때 세포 표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄가 포함된다. 구체적으로는 예를 들면 ALK 수용체(플레이오트로핀 수용체), 플레이오트로핀, KS 1/4 췌장암 항원, 난소암 항원(CA125), 전립선산인산, 전립선 특이적 항원(PSA), 흑색종 관련 항원 p97, 흑색종 항원 gp75, 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA), 전립선 특이적 막항원, 암성 배 항원(CEA), 다형 상피 뮤신 항원, 인간 유지방구 항원, CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 및 LEA 등의 결장직장 종양 관련 항원, 버킷림프종 항원-38.13, CD19, 인간 B 림프종 항원-CD20, CD33, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2 및 강글리오시드 GM3 등의 흑색종 특이적 항원, 종양 특이적 이식형 세포 표면 항원(TSTA), T항원, DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 엔벨로프 항원 등의 바이러스에 의해 유도되는 종양 항원, 결장의 CEA, 5T4 암태아 영양막 당단백질(oncofetal trophoblast glycoprotein) 및 방광 종양 암태아 항원 등의 암태아 항원 α-태아단백(α-fetoprotein), 인간 폐암 항원 L6 및 L20 등의 분화 항원, 섬유육종의 항원, 인간 백혈병 T세포 항원-Gp37, 신생 당단백질, 스핑고지질, EGFR(상피 증식 인자 수용체) 등의 유방암 항원, NY-BR-16, NY-BR-16 및 HER2 항원(p185HER2), 다형 상피 뮤신(PEM), 악성 인간 림프구 항원-APO-1, 태아 적혈구에 확인되는 I항원 등의 분화 항원, 성인 적혈구에 확인되는 초기 내배엽 I항원, 이식 전의 배, 위암에 확인되는 I(Ma), 유선 상피에 확인되는 M18, M39, 골수세포에 확인되는 SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, 결장직장암에 확인되는 D156-22, TRA-1-85(혈액군 H), 정소 및 난소암에 확인되는 SCP-1, 결장암에 확인되는 C14, 폐암에 확인되는 F3, 위암에 확인되는 AH6, Y 합텐, 배아 암세포(embryonal carcinoma cells)에 확인되는 Ley, TL5(혈액군 A), A431세포에 확인되는 EGF 수용체, 췌장암에 확인되는 E1 시리즈(혈액군 B), 배아 암세포에 확인되는 FC10.2, 위암 항원, 선암에 확인되는 CO-514(혈액군 Lea), 선암에 확인되는 NS-10, CO-43(혈액군 Leb), A431세포의 EGF 수용체에 확인되는 G49, 결장암에 확인되는 MH2(혈액군 ALeb/Ley), 결장암에 확인되는 19.9, 위암 뮤신, 골수세포에 확인되는 T5A7, 흑색종에 확인되는 R24, 배아 암세포에 확인되는 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, 및 M1:22:25:8 및 4~8 세포 단계의 배아에 확인되는 SSEA-3 및 SSEA-4, 피하 T세포 림프종 항원, MART-1 항원, 시알릴 Tn(STn) 항원, 결장암 항원 NY-CO-45, 폐암 항원 NY-LU-12 변이체 A, 선암 항원 ART1, 종양 수반성 관련 뇌-정소암 항원(암신경 항원 MA2, 종양 수반성 신경 항원), 신경암 복부 항원 2(NOVA2), 혈액세포암 항원 유전자 520, 종양 관련 항원 CO-029, 종양 관련 항원 MAGE-C1(암-정소 항원 CT7), MAGE-B1(MAGE-XP 항원), MAGE-B2(DAM6), MAGE-2, MAGE-4a, MAGE-4b 및 MAGE-X2, 암-정소항원(NY-EOS-1), YKL-40 및 상기 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편 또는 이들에 대해 수식된 구조 등(상기 수식 인산기나 당쇄 등), EpCAM, EREG, CA19-9, CA15-3, 시알릴 SSEA-1(SLX), HER2, PSMA, CEA, CLEC12 A 등을 들 수 있다. 본 발명의 암 특이적 항원 결합 도메인의 대상이 되는 암 특이적 항원으로서는 특히 세포 표면에 발현하는 것이 바람직하며, 그러한 암 특이적 항원으로서는 예를 들면 CD19, CD20, EGFR, HER2, EpCAM, EREG를 들 수 있다.
또한 「TNF 슈퍼패밀리」 또는 「TNF 수용체 슈퍼패밀리」에 속하는 인자로서는 다양한 면역세포의 활성화에 기여하는 3량체 구조를 갖는 리간드와 당해 리간드가 결합하는 3량체 구조의 수용체가 알려져 있다(Nat. Rev. Immunol., 2012, 12, 339-51). TNF 슈퍼패밀리 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 인자로서는, 예를 들면 CD137, CD137L, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, RANK, RANKL, CD30, CD153, GITR, GITRL을 들 수 있다. 바람직한 인자로서는 예를 들면 CD137, CD40을 들 수 있다. 더욱 바람직한 인자로서는 예를 들면 CD137을 들 수 있다.
또한 「T세포 수용체 복합체」는 T세포 수용체 자신이어도 되고, T세포 수용체와 함께 T세포 수용체 복합체를 구성하는 어댑터 분자여도 된다. 어댑터 분자로서 바람직한 것은 CD3이다.
T세포 수용체로서는 가변영역이어도 되고 불변영역이어도 되지만, 바람직한 T세포 수용체 결합 도메인이 결합하는 에피토프는 불변영역에 존재하는 에피토프이다. 불변영역의 서열로서, 예를 들면 RefSeq 등록번호 CAA26636.1의 T세포 수용체 α쇄(서열번호：9), RefSeq 등록번호 C25777의 T세포 수용체 β쇄(서열번호：10), RefSeq 등록번호 A26659의 T세포 수용체 γ1쇄(서열번호：11), RefSeq 등록번호 AAB63312.1의 T세포 수용체 γ2쇄(서열번호：12), RefSeq 등록번호 AAA61033.1의 T세포 수용체 δ쇄(서열번호：13)의 서열을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 T세포 수용체 복합체 결합 도메인으로서 「CD3 결합 도메인」을 사용하는 경우, CD3 결합 도메인은 하나 또는 복수의 항체의 가변 도메인으로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는 CD3 결합 도메인은 CD3 항체의 경쇄 가변영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변영역(VH)을 포함한다. 이러한 CD3 결합 도메인의 예로서는 「scFv(single chain Fv)」, 「단일 사슬 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv 2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」등을 적합하게 들 수 있다.
본 발명의 CD3 결합 도메인은 인간 CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄 서열에 존재하는 에피토프라면 어느 에피토프에 결합하는 것이어도 된다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 인간 CD3 복합체의 ε쇄의 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 CD3 항체의 경쇄 가변영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 CD3 결합 도메인이 적합하게 사용된다. 이러한 CD3 결합 도메인으로서는 OKT3 항체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4914-4917)나 각종 공지의 CD3 항체의 경쇄 가변영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 CD3 결합 도메인이 적합하게 사용된다. 또한 인간 CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄를 상기 방법에 의해 목적하는 동물에 면역함으로써 취득된 목적하는 성질을 갖는 CD3 항체를 기원으로 하는 CD3 결합 도메인이 적절히 사용될 수 있다. CD3 결합 도메인의 기원이 되는 CD3 항체는 아래와 같이 적절히 인간화된 항체나 인간 항체가 적절히 사용된다. CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄의 구조는 그의 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호：14(NM_000073.2), 16(NM_000732.4) 및 18(NM_000733.3)로, 그의 폴리펩티드 서열이 서열번호：15(NP_000064.1), 17(NP_000723.1) 및 19(NP_000724.1)로 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다).
또한 본 발명의 「항원 결합 분자」의 바람직한 태양의 하나로서 본 발명의 항체의 가변영역을 포함하는 항체를 들 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항체의 예로서 아래의 [1] 내지 [9]의 항체를 들 수 있다.
[1] 중쇄 가변영역으로서 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열 및 경쇄 가변영역으로서 서열번호 85에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체；
[2] 중쇄 가변영역으로서 서열번호 67에 기재된 아미노산 서열 및 경쇄 가변영역으로서 서열번호 86에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체；
[3] 중쇄 가변영역으로서 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열 및 경쇄 가변영역으로서 서열번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체；
[4] 중쇄 가변영역으로서 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열 및 경쇄 가변영역으로서 서열번호 95에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체；
[5] 중쇄 가변영역으로서 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열 및 경쇄 가변영역으로서 서열번호 96에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체；
[6] 중쇄 가변영역으로서 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열 및 경쇄 가변영역으로서 서열번호 97에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체；
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항체로서, 중쇄 불변영역으로서 서열번호 99에 기재된 아미노산 서열 및 경쇄 불변영역으로서 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 60에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체；
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체；
[9] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 항체.
상기 [8]에 기재된 항체에 있어서 「동등한 활성」이란, CD137에 대한 아고니스트 활성이 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항체의 결합활성의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것을 말한다.
또한 본 발명은 상기 [9]에 기재된 본 발명에서 개시된 항CD137 항체가 결합하는 에피토프과 같은 에피토프에 결합하는 항체도 또한 제공한다. 이러한 항체는 예를 들면 아래의 방법에 의해 얻을 수 있다.
피험 항체가 어느 항체와 에피토프를 공유하는 것은 양자의 같은 에피토프에 대한 경합에 의해 확인할 수 있다. 항체 간의 경합은 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는 바람직한 교차 블로킹 어세이이다. 구체적으로는 교차 블로킹 어세이에 있어서는 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 CD137 단백질을 후보 경합 항체의 존재하 또는 비존재하에서 예비 배양한 후에 본 발명의 항CD137 항체가 첨가된다. 웰 중의 CD137 단백질에 결합한 본 발명의 항CD137 항체의 양은 같은 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보 경합 항체(피험 항체)의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 피험 항체의 친화성이 커질수록 본 발명의 항CD137 항체의 CD137 단백질을 코트한 웰에 대한 결합량은 저하되고, 피험 항체의 CD137 단백질을 코트한 웰에 대한 결합량은 증가한다.
웰에 결합한 항체량은 사전에 항체를 표지해 둠으로써 용이하게 측정할 수 있다. 예를 들면 비오틴 표지된 항체는 아비딘퍼옥시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정할 수 있다. 퍼옥시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이를 특히 경합 ELISA 어세이라 한다. 항체는 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지할 수 있다. 구체적으로는 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.
또한 피험 항체가 본 발명의 항CD137 항체와 상이한 종에 유래하는 불변영역을 갖는 경우에는 웰에 결합한 항체의 양을 그 항체의 불변영역을 인식하는 표지 항체에 의해 측정하는 것도 가능하다. 또는 동종 유래의 항체라도 클래스가 상이한 경우에는 각 클래스를 식별하는 항체에 의해 웰에 결합한 항체의 양을 측정할 수 있다.
후보 경합 항체의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합활성과 비교하여 후보 항체가 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 20~50%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 항CD137 항체의 결합을 블로킹할 수 있다면, 그 후보 경합 항체는 본 발명의 항CD137 항체와 실질적으로 같은 에피토프에 결합하거나 또는 같은 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 항체이다.
상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 항체의 바람직한 예로서, 예를 들면 CD137 단백질 중의 SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC의 서열(서열번호 113)을 갖는 영역을 인식하는 항체를 들 수 있다.
더 나아가서는 CD137 단백질 중의 DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC의 서열(서열번호 108)을 갖는 영역을 인식하는 항체를 들 수 있다.
전술한 항인간 CD137 항체를 암 특이적 항원 항체(예를 들면 항인간 GPC3 항체)와의 이중 특이성 항체로 개변하여 암 특이적 항원 의존적 CD137 아고니스트능을 평가함으로써 목적하는 항종양 효과를 발휘하는 항암 항원/항인간 CD137 이중 특이성 항체를 제공할 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서 암 특이적 항원 결합 도메인 및 인간 CD137 결합 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
본 발명에서 제공되는 이중 특이성 항체의 예로서 아래의 [i] 내지 [iv]의 항체를 들 수 있다.
[i] 인간 CD137 결합 도메인으로서 서열번호 122에 기재된 아미노산 서열(중쇄 가변영역) 및 서열번호 123에 기재된 아미노산 서열(경쇄 가변영역)을 갖는 이중 특이성 항체；
[ii] 인간 CD137 결합 도메인으로서 서열번호 124에 기재된 아미노산 서열(중쇄 가변영역) 및 서열번호 82에 기재된 아미노산 서열(경쇄 가변영역)을 갖는 이중 특이성 항체；
[iii] 인간 CD137 결합 도메인으로서 서열번호 125에 기재된 아미노산 서열(중쇄 가변영역) 및 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열(경쇄 가변영역)을 갖는 이중 특이성 항체；
[iv] [i] 내지 [iii] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이성 항체가 결합하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 항체.
암 특이적 항원 결합 도메인에 포함되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 표적으로 하는 암 항원에 따라 당업자가 그 암 항원에 결합하는 중쇄 가변영역 서열 및 경쇄 가변영역 서열을 적절히 선택할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 [iv]에 기재된 본 발명에서 개시된 항암 특이적 항원/항인간 CD137 이중 특이성 항체가 결합하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 이중 특이성 항체도 또한 제공한다. 이러한 항체는 예를 들면 아래의 방법에 의해 얻을 수 있다.
피험 항체가 어느 항체와 에피토프를 공유하는 것은 양자의 같은 에피토프에 대한 경합에 의해 확인할 수 있다. 항체 간의 경합은 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는 바람직한 교차 블로킹 어세이이다. 구체적으로는 교차 블로킹 어세이에 있어서는 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 CD137 단백질을 후보 경합 항체의 존재하 또는 비존재하에서 예비 배양한 후에 본 발명의 항CD137 항체가 첨가된다. 웰 중의 CD137 단백질에 결합한 본 발명의 항CD137 항체의 양은 같은 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보 경합 항체(피험 항체)의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 피험 항체의 친화성이 커질수록 본 발명의 항CD137 항체의 CD137 단백질을 코트한 웰에 대한 결합량은 저하되고, 피험 항체의 CD137 단백질을 코트한 웰에 대한 결합량은 증가한다.
웰에 결합한 항체량은 사전에 항체를 표지해 둠으로써 용이하게 측정할 수 있다. 예를 들면 비오틴 표지된 항체는 아비딘퍼옥시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정할 수 있다. 퍼옥시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이를 특히 경합 ELISA 어세이라 한다. 항체는 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지할 수 있다. 구체적으로는 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.
또한 피험 항체가 본 발명의 항CD137 항체와 상이한 종에 유래하는 불변영역을 갖는 경우에는 웰에 결합한 항체의 양을 그 항체의 불변영역을 인식하는 표지 항체에 의해 측정하는 것도 가능하다. 또는 동종 유래의 항체라도 클래스가 상이한 경우에는 각 클래스를 식별하는 항체에 의해 웰에 결합한 항체의 양을 측정할 수 있다.
후보 경합 항체의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합활성과 비교하여 후보 항체가 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 20~50%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 항CD137 항체의 결합을 블로킹할 수 있다면, 그 후보 경합 항체는 본 발명의 항CD137 항체와 실질적으로 같은 에피토프에 결합하거나 또는 같은 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 항체이다.
다른 일태양으로서 피험 항체가 다른 항체와의 결합에 관하여 경합하거나 또는 교차 경합하는 능력은 당해 기술분야에 알려진 표준적 결합 어세이, 예를 들면 비아코어 분석 또는 유동 세포 분석법(flow cytometry) 등을 사용하여 당업자가 적절히 결정할 수 있다.
또한 에피토프의 공간 구조(spatial conformation)를 결정하는 방법으로서는, 예를 들면 X선 결정학 및 2차원 핵자기공명이 포함된다(Methods in Molecular Biology, G．E．Morris 감수, Vol.66, Epitope Mapping Protocols(1996)를 참조).
상기 [i] 내지 [iii] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이성 항체가 결합하는 인간 CD137 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 이중 특이성 항체의 바람직한 예로서, 예를 들면 인간 CD137 단백질 중의 SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC의 서열(서열번호 113)을 갖는 영역, DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC의 서열(서열번호 108)을 갖는 영역, LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC의 서열(서열번호 111)을 갖는 영역, 또는 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTC의 서열(서열번호 106)을 갖는 영역을 인식하는 이중 특이성 항체를 들 수 있다.
더욱 바람직하게는 예를 들면 인간 CD137 단백질 중의 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC의 서열(서열번호 111)을 갖는 영역, 또는 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTC의 서열(서열번호 106)을 갖는 영역을 인식하는 이중 특이성 항체를 들 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서 암 특이적 항원 결합 도메인 및 인간 CD40 결합 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
암 특이적 항원 결합 도메인에 포함되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 표적으로 하는 암 항원에 따라 당업자가 그 암 항원에 결합하는 중쇄 가변영역 서열 및 경쇄 가변영역 서열을 적절히 선택할 수 있다.
항체의 결합활성
항체의 항원 결합활성의 측정에는 공지의 수단을 사용할 수 있다(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 예를 들면 ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정법), EIA(효소 면역 측정법), RIA(방사 면역 측정법), FACS, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR)현상을 이용한 비아코어법 또는 형광 면역법 등을 사용할 수 있다. 또한 세포에 발현하는 항원에 대한 항체의 결합활성을 측정하는 수단으로서는, 예를 들면 상기 안티바디즈 어 라보라토리 매뉴얼(Antibodies A Laboratory Manual) 중 359-420 페이지에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.
또한 완충액 등에 현탁한 세포의 표면 상에 발현하고 있는 항원과 당해 항원에 대한 항체와의 결합을 측정하는 방법으로서 특히 유동 세포 분석기를 사용한 방법을 적합하게 사용할 수 있다. 사용하는 유동 세포 분석기로서는, 예를 들면 FACSCantoTMII, FACSAriaTM, FACSArrayTM, FACSVantageTM SE, FACSCaliburTM(이상, BD Biosciences사)나, EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC, Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(이상, Beckman Coulter사) 등을 들 수 있다.
피험 CD137 항체의 항원에 대한 결합활성의 적합한 측정방법의 일례로서, CD137을 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항체를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색 후, FACSCalibur(BD사)에 의해 측정을 행하여 그 형광 강도를 셀 퀘스트 소프트웨어(CELL QUEST Software)(BD사)를 사용해 해석하는 방법을 들 수 있다.
항체
본 명세서에 있어서 항체란, 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연에 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있으며, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 적합하게 들 수 있다. 인간의 면역글로불린으로서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는 이들 아이소타입 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 포함될 수 있다.
목적하는 결합활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에 있어서 공지이며, 다중클론 또는 단일클론 항체로서 취득될 수 있다. 본 발명의 항체로서는 포유동물 유래의 단일클론 항체가 적합하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 단일클론 항체에는 하이브리도마에 의해 생산되는 것 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포에 의해 생산되는 것 등이 포함된다.
항체 취득을 위해 면역되는 포유동물로서는 특정 동물에 한정되는 것은 아니지만, 하이브리도마 제작을 위한 세포 융합에 사용하는 부모세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 설치류 동물, 예를 들면 마우스, 랫트, 햄스터 또는 토끼, 원숭이 등이 적합하게 사용된다.
공지의 방법에 따라 상기 동물이 감작항원(sensitizing antigen)에 의해 면역된다. 예를 들면 일반적인 방법으로서, 감작항원이 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사에 의해 투여됨으로써 면역이 실시된다. 구체적으로는 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당한 희석배율로 희석된 감작항원이 목적하는 바에 따라 통상의 애쥬번트, 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트와 혼합되어 유화된 후에 그 감작항원이 포유동물에 4~21일 간격으로 수회 투여된다. 또한 감작항원의 면역 시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드가 감작항원으로서 사용되는 경우에는 알부민, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 등의 담체 단백질과 결합한 그 감작항원 펩티드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.
또한 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 DNA 면역을 사용하여 아래와 같이 하여서도 제작될 수 있다. DNA 면역이란, 면역 동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역 동물 중에서, 감작항원이 당해 면역 동물의 생체 내에서 발현됨으로써 면역자극이 부여되는 면역방법이다. 단백질 항원이 면역 동물에 투여되는 일반적인 면역방법과 비교하여 DNA 면역에는 다음과 같은 우위성이 기대된다.
-막단백질의 구조를 유지하고 면역자극이 부여될 수 있다
-면역 항원을 정제할 필요가 없다
DNA 면역에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 얻기 위해서 먼저 항원 단백질을 발현하는 DNA가 면역 동물에 투여된다. 항원 단백질을 코드하는 DNA는 PCR 등의 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되고 면역 동물에 투여된다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터가 적합하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서 일반적으로 사용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면 발현 벡터가 흡착된 금입자가 유전자 총(gene gun)으로 면역 동물 개체의 세포 내에 도입됨으로써 DNA 면역이 행해진다.
이와 같이 포유동물이 면역되고 혈청 중에 있어서의 항원에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에 포유동물로부터 면역세포가 채취되어 세포 융합에 제공된다. 바람직한 면역세포로서는 특히 비장세포가 사용될 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 세포로서 포유동물의 골수종세포가 사용된다. 골수종세포는 스크리닝을 위한 적당한 선택마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택마커란, 특정 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택마커에는 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하, HGPRT 결손으로 생략함), 또는 티미딘키나아제 결손(이하, TK 결손으로 생략함) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하, HAT 감수성으로 생략함)을 가진다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택배지 중에서 DNA 합성을 행하지 못하고 사멸하나, 정상세포와 융합하면 정상세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속하는 것이 가능하기 때문에 HAT 선택배지 중에서도 증식하게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는 각각 6티오구아닌, 8아자구아닌(이하, 8AG로 생략함), 또는 5'브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들 피리미딘 유사체(pyrimidine analogs)를 DNA 안에 포함하는 정상세포는 사멸한다. 한편, 이들 피리미딘 유사체를 포함하지 못하는 이들 효소를 결손한 세포는 선택배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성이라 불리는 선택마커는 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포 융합에 적합한 각종 골수종세포가 공지이다.
이와 같은 골수종세포로서, 예를 들면 P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11(Cell (1976) 8 (3), 405-415), SP2/0(Nature (1978) 276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), R210(Nature (1979) 277 (5692), 131-133) 등이 적합하게 사용될 수 있다.
기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 상기 면역세포와 골수종세포의 세포 융합이 행해진다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 중에서 상기 세포 융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가로 융합 효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.
면역세포와 골수종세포의 사용 비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들면 골수종세포에 대해 면역세포를 1에서 10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 골수종세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용되고, 또한 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 적합하게 첨가될 수 있다.
세포 융합은 상기 면역세포와 골수종세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하여 사전에 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들면 평균 분자량 1,000에서 6,000 정도)이 통상 30에서 60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합됨으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서 상기에 예로 들었던 적당한 배양액이 차례로 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등이 제거될 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는 데 충분한 시간(통상 이러한 충분한 시간은 수 일에서 수 주간임) 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속될 수 있다. 이어서 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 세포 융합에 사용된 골수종이 갖는 선택마커에 따른 선택배양액을 이용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종세포를 세포 융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서 정상세포와의 세포 융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식할 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는 데 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는 일반적으로 수 일에서 수 주간의 배양에 의해 목적하는 하이브리도마가 선택될 수 있다. 이어서 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.
목적하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이 공지의 항원 항체 반응에 기초한 스크리닝 방법에 의해 적합하게 실시될 수 있다. 목적하는 항체는, 예를 들면 FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석하여 각 세포가 발하는 형광을 측정함으로써 세포 표면으로의 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.
FACS에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는 먼저 생산되는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝을 위한 바람직한 세포는 당해 항원을 강제 발현시킨 포유동물 세포이다. 숙주세포로서 사용한 형질전환되어 있지 않은 포유동물세포를 대조로서 사용함으로써 세포 표면의 항원에 대한 항체의 결합활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉, 숙주세포에 결합하지 않고 항원을 강제 발현시킨 세포에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써 목적하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.
또는 대상이 되는 항원을 발현한 세포를 고정화하여 당해 항원 발현 세포에 대한 항체의 결합활성이 ELISA의 원리에 기초하여 평가될 수 있다. 예를 들면 ELISA 플레이트의 웰에 항원 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 단일클론 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는 항마우스 면역글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들의 스크리닝에 의해 선택된 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 한계희석법 등에 의해 클로닝될 수 있다.
이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양될 수 있다. 또한 상기 하이브리도마는 액체 질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.
당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고 그 배양상청으로부터 목적하는 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시켜, 그의 복수로부터 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는 데 적합한 것이다.
당해 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 클로닝되는 항체 유전자에 의해 코드되는 항체도 적합하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여 숙주에 도입함으로써 당해 유전자에 의해 코드되는 항체가 발현한다. 항체 유전자의 단리와 벡터로의 도입, 그리고 숙주세포의 형질전환을 위한 방법은 예를 들면 반담(Vandamme) 등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). 아래에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조방법도 또한 공지이다.
항체의 가변영역(V영역)을 코드하는 cDNA를 취득하기 위해서는, 통상 먼저 하이브리도마에서 전체 RNA가 추출된다. 세포에서 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서, 예를 들면 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다.
　-구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
　-AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
추출된 mRNA는 예를 들면 mRNA 정제 키트(mRNA Purification Kit)(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 또는 퀵프레프 mRNA 정제 키트(QuickPrep mRNA Purification Kit)(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등과 같이, 세포에서 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이러한 키트를 사용하여 하이브리도마에서 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA에서 역전사효소를 사용하여 항체 V영역을 코드하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는 AMV 리버스 트랜스크립타제 퍼스트-스트랜드 cDNA 신테시스 키트(AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit)(생화학공업사 제조) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한 cDNA의 합성 및 증폭을 위해 스마트 레이스 cDNA(SMART RACE cDNA) 증폭 키트(Clontech 제조) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적절히 이용될 수 있다. 또한 이러한 cDNA의 합성 과정에 있어서 cDNA의 양 말단에 후술하는 적절한 제한효소 사이트가 도입될 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고, 이어서 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되고, 대장균 등에 도입되어 콜로니가 선택된 후에, 그 콜로니를 형성한 대장균으로부터 목적하는 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고 상기 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열을 갖고 있는지 여부에 대해 공지의 방법, 예를 들면 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법(dideoxy nucleotide chain termination method) 등에 의해 확인된다.
가변영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는 가변영역 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 먼저 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되어 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적절히 사용된다.
얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 PCR법에 의해 항체 유전자가 증폭된다. 공지의 항체 유전자 서열을 바탕으로 마우스 항체 유전자 증폭용 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는 면역글로불린의 서브클래스마다 상이한 염기서열이다. 따라서 서브클래스는 사전에 Iso Strip 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(로슈·다이아그노스틱스) 등의 시판 키트를 사용하여 결정해 두는 것이 바람직하다.
구체적으로는 예를 들면 마우스 IgG를 코드하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때에는 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코드하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변영역 유전자를 증폭하기 위해서는 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변영역에 가까운 불변영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는 5'RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속되는 프라이머가 이용된다.
이렇게 해서 증폭된 PCR 산물을 이용하여 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 면역글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 면역글로불린의 항원에 대한 결합활성을 지표로 하여 목적하는 항체가 스크리닝될 수 있다. 예를 들면 다음과 같이 해서 스크리닝될 수 있다；
(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코드되는 V영역을 포함하는 항체를 목적하는 항원 발현 세포에 접촉시키는 공정,
(2) 상기 항원 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정, 및
(3) 상기 항원 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.
항체와 그 항원 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는 앞에 기술한 FACS 등의 수법에 의해 항체와 그 항원 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합활성을 평가하기 위해 그 항원 발현 세포의 고정 표본이 적절히 이용될 수 있다.
결합활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝 방법으로서 파지 벡터를 이용한 패닝법도 적합하게 사용된다. 다중클론 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스 라이브러리로서 취득한 경우에는 파지 벡터를 이용한 스크리닝 방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변영역을 코드하는 유전자는 적당한 링커 서열로 연결함으로써 단일 사슬 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv를 코드하는 유전자를 파지 벡터에 삽입함으로써 scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 목적하는 항원의 접촉 후에 항원에 결합한 파지를 회수함으로써 목적의 결합활성을 갖는 scFv를 코드하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라 반복함으로써 목적하는 결합활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.
목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양 말단에 삽입한 제한효소 사이트를 인식하는 제한효소에 의해 그 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한효소는 항체 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1 카피의 소화 단편을 벡터에 올바른 방향으로 삽입하기 위해서는 부착 말단을 부여하는 제한효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 하여 소화된 항체의 V영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이때 항체 불변영역(C영역)을 코드하는 유전자와 상기 V영역을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되면 키메라 항체가 취득된다. 여기서 키메라 항체란 불변영역과 가변영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서 마우스-인간 등의 이종 키메라 항체에 추가로 인간-인간의 동종 키메라 항체도 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 사전에 불변영역을 갖는 발현 벡터에 상기 V영역 유전자를 삽입함으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 목적하는 항체 불변영역(C영역)을 코드하는 DNA를 유지한 발현 벡터의 5'측에 상기 V영역 유전자를 소화하는 제한효소의 제한효소 인식서열이 적절히 배치될 수 있다. 같은 조합의 제한효소로 소화된 양자가 인프레임으로 융합됨으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.
단일클론 항체의 제조에는 항체 유전자가 발현 제어영역에 의한 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입된다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어영역이란, 예를 들면 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한 발현한 항체가 세포 외로 분비되도록 적절한 신호 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 발현된 폴리펩티드로부터 신호 서열이 그의 카르복실 말단부분에서 절단되어 항체가 세포 외로 분비될 수 있다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주세포가 형질전환됨으로써 항체를 코드하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.
항체 유전자의 발현을 위해 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA는 각각 다른 발현 벡터에 삽입된다. H쇄와 L쇄가 삽입된 벡터에 의해 같은 숙주세포에 동시에 형질전환(co-transfect)됨으로써 H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA가 단일 발현 벡터에 삽입됨으로써 숙주세포가 형질전환될 수 있다(국제공개 WO 94/11523을 참조할 것).
단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들 발현계는 모두 본 발명의 암 특이적 항원 결합 도메인, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF)나 T세포 수용체 복합체 결합 도메인을 단리하는 데 응용될 수 있다.
진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우 동물세포, 식물세포, 또는 진균세포가 적절히 사용될 수 있다. 구체적으로는 동물세포로서는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포：CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero 등
(2) 양서류세포：아프리카발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등
또는 식물세포로서는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana) 속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는 캘러스 배양한 세포가 적절히 이용될 수 있다.
또한 진균세포로서는 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
-효모：사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia 속
-사상균：아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus) 속
또한 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들면 세균세포를 사용하는 경우 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균세포가 적절히 이용될 수 있다. 이들 세포 중 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질전환에 의해 도입된다. 형질전환된 세포를 생체 외(in vitro)에서 배양함으로써 당해 형질전환 세포의 배양물로부터 목적하는 항체가 취득될 수 있다.
재조합 항체의 생산에는 상기 숙주세포에 더하여 형질전환 동물(transgenic animals)도 이용될 수 있다. 즉 목적하는 항체를 코드하는 유전자가 도입된 동물로부터 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면 항체 유전자는 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입함으로써 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서 예를 들면 염소 β카제인 등이 이용될 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배아에 주입되고, 당해 주입된 배아가 암컷 염소에 도입된다. 배아를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소(또는 그의 자손)가 생산하는 유즙으로부터는 목적하는 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한 형질전환 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해 호르몬이 형질전환 염소에게 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자가 인간에게 투여되는 경우, 예를 들면 당해 분자에 있어서의 각종 결합 도메인으로서 항체의 가변영역을 포함하는 도메인을 사용하는 경우는 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 항원 결합 도메인이 적절히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는 예를 들면 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변항체는 공지의 방법을 사용하여 적절히 제조된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자에 있어서의 각종 결합 도메인을 제작하기 위해 사용되는 항체의 가변영역은, 통상 4개의 프레임워크 영역(FR) 사이에 끼워진 3개의 상보성 결정영역(complementarity-determining region；CDR)으로 구성되어 있다. CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 간에도 높은 동일성을 나타내는 경우가 많다. 그렇기 때문에 일반적으로 CDR의 이식에 의해 어떤 항체의 결합 특이성을 다른 항체에 이식하는 것이 가능하다고 여겨지고 있다.
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는 마우스 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서 예를 들면 중복 확장 PCR(Overlap Extension PCR)이 공지이다. 중복 확장 PCR에 있어서는 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에 이식 대상 마우스 항체의 CDR을 코드하는 염기서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR 각각에 대해 준비된다. 일반적으로 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 있어서는 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이 CDR의 기능 유지에 있어서 유리하다고 여겨지고 있다. 즉, 일반적으로 이식 대상 마우스 CDR에 인접해 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 연결되는 염기서열은 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별 합성된다. 그 결과, 각 FR에 마우스 CDR을 코드하는 DNA가 부가된 산물을 얻을 수 있다. 각 산물의 마우스 CDR을 코드하는 염기서열은 서로 중복되도록 디자인되어 있다. 계속해서 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 중복된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜 상보가닥(complementary strand) 합성반응이 행해진다. 이 반응에 의해 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 매개로 연결된다.
최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V영역 유전자는 그 5' 말단과 3' 말단에 어닐링하여 적당한 제한효소 인식 서열이 부가된 프라이머에 의해 그의 전장이 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간형 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 상기 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에 그 재조합 세포를 배양하여 상기 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 그 인간화 항체가 그 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP 239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).
상기와 같이 제작한 인간화 항체의 항원으로의 결합활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하여 평가함으로써 CDR을 매개로 연결되었을 때 그 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는 FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이러한 프라이머에 의해 합성된 FR에는 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원으로의 결합활성을 상기 방법으로 측정하고 평가함으로써 목적하는 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856).
또한 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역 동물로 하여 DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 V영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V영역 서열을 목적하는 인간 항체 C 영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
파지 디스플레이법 이외에도 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술로서 무세포 번역계를 사용하는 기술, 세포 또는 바이러스 표면에 항원 결합 분자를 제시하는 기술, 에멀션을 사용하는 기술 등이 알려져 있다. 예를 들면 무세포 번역계를 사용하는 기술로서는, 종지 코돈의 제거 등에 의해 리보솜을 매개로 mRNA와 번역된 단백질의 복합체를 형성시키는 리보솜 디스플레이법, 퓨로마이신 등의 화합물을 사용하여 유전자 서열과 번역된 단백질을 공유결합시키는 cDNA 디스플레이법, mRNA 디스플레이법이나, 핵산에 대한 결합 단백질을 사용하여 유전자와 번역된 단백질의 복합체를 형성시키는 CIS 디스플레이법 등이 사용될 수 있다. 또한 세포 또는 바이러스 표면에 항원 결합 분자를 제시하는 기술로서는 파지 디스플레이법 이외에도 E. coli 디스플레이법, 그람 양성균 디스플레이법, 효모 디스플레이법, 포유류세포 디스플레이법, 바이러스 디스플레이법 등이 사용될 수 있다. 에멀션을 사용하는 기술로서는 에멀션 중에 유전자 및 번역 관련 분자를 내포시키는 것에 의한 생체 외 바이러스 디스플레이법 등이 사용될 수 있다. 이들 방법은 이미 공지이다(Nat Biotechnol. 2000 Dec；18(12):1287-92, Nucleic Acids Res. 2006；34(19):e127, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Mar 2；101(9):2806-10, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jun 22；101(25):9193-8, Protein Eng Des Sel. 2008 Apr；21(4):247-55, Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26；97(20):10701-5, MAbs. 2010 Sep-Oct；2(5):508-18, Methods Mol Biol. 2012；911:183-98).
본 발명에 있어서 「특이적」이란, 특이적으로 결합하는 분자의 한쪽 분자가 그 하나 또는 복수의 결합하는 상대쪽 분자 이외의 분자에 대해서는 조금도 유의한 결합을 나타내지 않는 상태를 말한다. 또한 항원 결합 도메인이 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 사용된다. 또한 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가 복수의 상이한 항원에 포함되는 경우에는 당해 항원 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자는 당해 에피토프를 포함하는 다양한 항원과 결합할 수 있다.
또한 항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 「에피토프」는 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자 중의 각종 결합 도메인이 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 따라서 예를 들면 에피토프는 그 구조에 따라 정의될 수 있다. 또한 당해 에피토프를 인식하는 항원 결합 분자 중의 항원에 대한 결합활성에 의해서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에는 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한 에피토프가 당쇄인 경우에는 특정 당쇄구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.
직선형상 에피토프는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 직선형상 에피토프는 전형적으로는 적어도 3개 및 가장 보통으로는 적어도 5개, 예를 들면 약 8~약 10개, 6~20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.
입체구조 에피토프는 직선형상 에피토프와는 대조적으로 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이 인식된 에피토프의 단일 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들면 아미노산의 1차 서열이 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되는 것은 아닌 에피토프)이다. 입체구조 에피토프는 직선형상 에피토프에 대해 증대된 수의 아미노산을 포함할 지도 모른다. 입체구조 에피토프의 인식에 관하여 항체는 펩티드 또는 단백질의 3차원 구조를 인식한다. 예를 들면 단백질 분자가 폴딩되어 3차원 구조를 형성하는 경우에는 입체구조 에피토프를 형성하는 어떤 아미노산 및/또는 폴리펩티드 주쇄는 병렬이 되어 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체구조를 결정하는 방법에는, 예를 들면 X선 결정학, 2차원 핵자기공명 분광학, 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성공명 분광학이 포함되는데, 이들에는 한정되지 않는다. 예를 들면 에피토프 맵핑 프로토콜즈 인 메쏘즈 인 몰레큘러 바이올로지(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology)(1996), 제66권, Morris(편)을 참조.
아래에 피험 항원 결합 분자에 의한 암 특이적 항원 중 에피토프로의 결합의 확인방법이 예시되는데, 다른 결합 도메인의 대상 항원 중 에피토프로의 결합의 확인방법도 아래의 예시에 준하여 적절히 실시될 수 있다.
예를 들면 암 특이적 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 그 항원 분자 중에 존재하는 선형상 에피토프를 인식하는 것은, 예를 들면 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기 목적을 위해 예를 들면 암 특이적 항원의 세포 외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선형상의 펩티드가 합성된다. 당해 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또는 암 특이적 항원의 cDNA 중 세포 외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코드하는 영역을 이용하여 유전자공학적 수법에 의해 얻을 수 있다. 다음으로 세포 외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선형상 펩티드와 암 특이적 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합활성이 평가된다. 예를 들면 고정화된 선형상 펩티드를 항원으로 하는 ELISA에 의해 당해 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합활성이 평가될 수 있다. 또는 암 특이적 항원을 발현하는 세포에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합에 있어서의 선형상 펩티드에 의한 저해 레벨에 기초하여 선형상 펩티드에 대한 결합활성이 명확해질 수 있다. 이들 시험에 의해 선형상 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합활성이 명확해질 수 있다.
상기 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 입체구조 에피토프를 인식하는 것은 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 예를 들면 암 특이적 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 암 특이적 항원 발현 세포에 접촉했을 때 당해 세포에 강하게 결합하는 한편, 당해 항원 결합 분자가 고정화된 암 특이적 항원의 세포 외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선형상 펩티드에 대해 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기서 실질적으로 결합하지 않는다는 것은 항원 발현 세포에 대한 결합활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합활성을 말한다.
항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원 발현 세포에 대한 결합활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 안티바디즈 어 라보라토리 매뉴얼(Antibodies A Laboratory Manual)에 기재된 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉, 항원 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리에 의해 평가될 수 있다.
ELISA 포맷에 있어서 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원 발현 세포에 대한 결합활성은 효소 반응에 의해 생성되는 신호 레벨을 비교함으로써 정량적으로 평가된다. 즉, 항원 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 항원 결합 분자를 첨가하고, 그 세포에 결합한 피험 항원 결합 분자가 피험 항원 결합 분자를 인식하는 효소 표지 항체를 이용해서 검출된다. 또는 FACS에 있어서는 피험 항원 결합 분자의 희석계열을 제작하여 항원 발현 세포에 대한 항체 결합 역가를 결정함으로써 항원 발현 세포에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합활성이 비교될 수 있다.
완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현하고 있는 항원에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합은 유동 세포 분석기에 의해 검출할 수 있다. 유동 세포 분석기로서는, 예를 들면 다음과 같은 장치가 알려져 있다.
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(모두 BD Biosciences사의 상품명)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명)
예를 들면 전술한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합활성의 적합한 측정방법의 일례로서 다음의 방법을 들 수 있다. 먼저 항원을 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항원 결합 분자를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 항원 결합 분자를 적절히 적합한 완충액으로 희석함으로써 당해 항원 결합 분자를 목적하는 농도로 조제해 사용된다. 예를 들면 10 ㎍/㎖에서 10 ng/㎖까지 사이의 어느 하나의 농도로 사용될 수 있다. 다음으로 FACSCalibur(BD사)에 의해 형광 강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용해 해석함으로써 얻어진 형광 강도, 즉 기하평균값(Geometric Mean value)에 반영된다. 즉, 당해 기하평균값을 얻음으로써 피험 항원 결합 분자의 결합량에 의해 나타내어지는 피험 항원 결합 분자의 결합활성이 측정될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 어떤 항원 결합 분자와 에피토프를 공유하는 것은 양자의 같은 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 항원 결합 분자 간의 경합은 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는 바람직한 교차 블로킹 어세이이다.
구체적으로는 교차 블로킹 어세이에 있어서는 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 항원이 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 존재하 또는 비존재하에서 예비 배양된 후에 피험 항원 결합 분자가 첨가된다. 웰 중의 항원에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은 같은 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 항원 결합 분자의 친화성이 커지면 커질수록 피험 항원 결합 분자의 항원을 코트한 웰에 대한 결합활성은 저하된다.
항원을 매개로 웰에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은 사전에 항원 결합 분자를 표지해 둠으로써 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면 비오틴 표지된 항원 결합 분자는 아비딘퍼옥시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정된다. 퍼옥시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는 특히 경합 ELISA 어세이라 불린다. 항원 결합 분자는 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.
후보 경합 항원 결합 분자의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합활성과 비교하여 경합 항원 결합 분자가 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합을 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 20-50%, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 블로킹할 수 있다면 당해 피험 항원 결합 분자는 경합 항원 결합 분자와 실질적으로 같은 에피토프에 결합하거나, 또는 같은 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 항원 결합 분자이다.
본 발명의 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 구조가 동정(identification)되어 있는 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은 당해 에피토프를 구성하는 펩티드에 아미노산 변이를 도입한 펩티드에 대한 양자의 항원 결합 분자의 결합활성을 비교함으로써 평가될 수 있다.
이러한 결합활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 상기 ELISA 포맷에 있어서 변이를 도입한 선형상의 펩티드에 대한 피험 항원 결합 분자 및 대조 항원 결합 분자의 결합활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는 칼럼에 결합한 당해 변이 펩티드에 대한 결합활성을 당해 칼럼에 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 흘려보낸 후 용출액 중에 용출되는 항원 결합 분자를 정량함으로써도 측정될 수 있다. 변이 펩티드를 예를 들면 GST와의 융합펩티드로서 칼럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.
또한 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은 다음의 방법으로 평가될 수 있다. 먼저 항원 결합 도메인의 대상이 되어 있는 항원을 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 항원을 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적절한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 첨가된다. 이어서, 적절히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광 강도와 세포 수가 FACSCalibur(BD사)에 의해 측정된다. 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 농도는 적합한 완충액에 의해 적절히 희석함으로써 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면 10 ㎍/㎖에서 10 ng/㎖까지 사이의 어느 하나의 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용해 해석함으로써 얻어진 형광 강도, 즉 기하평균값에 반영된다. 즉, 당해 기하평균값을 얻음으로써 표지 항체의 결합량으로 나타내어지는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 결합활성을 측정할 수 있다.
또한 본 발명의 「항원 결합 분자」는 단일 폴리펩티드 사슬 내에 본 발명의 「항체의 가변영역」을 형성하는 중쇄 및 경쇄 양쪽을 포함하는데, 불변영역이 결여되어 있는 항체 단편이어도 된다. 그러한 항체 단편으로서는, 예를 들면 디아바디(diabody；Db), scFv, 단일 사슬 항체, sc(Fv)2, sc(Fab')2 여도 된다.
Db는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다이머(Holliger P et al., Proc. Natl.　Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404，097호, W093/11161호 등)이며, 각각의 폴리펩티드 사슬은 같은 사슬 중에서 L쇄 가변영역(VL) 및 H쇄 가변영역(VH)이 서로 결합하지 못할 정도로 짧은, 예를 들면 5잔기 정도의 링커에 의해 결합 되어 있다.
동일 폴리펩티드 사슬 상에 코드되는 VL과 VH는 그 사이의 링커가 짧기 때문에 경쇄 가변영역 프래그먼트를 형성하지 못하여 2량체화함으로써 2개의 항원 결합 부위를 형성한다.
또한 본 명세서에 있어서 「scFv」, 「단일 사슬 항체」 또는 「sc(Fv)2」라는 용어는 단일 폴리펩티드 사슬 내에 중쇄 및 경쇄 양쪽에 유래하는 가변영역을 포함하나, 불변영역이 결여되어 있는 항체 단편을 의미한다. 일반적으로 단일 사슬 항체는 항원 결합을 가능하게 한다고 생각되는 목적하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 단일 사슬 항체는 더 파마콜로지 오브 모노클로날 안티바디즈(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies), 113권, 로젠버그(Rosenburg) 및 무어(Moore)편, 스프링어-버래그(Springer-Verlag), New York, 269~315(1994)에 있어서 플럭쳔(Pluckthun)에 의해 상세히 고찰되어 있다. 마찬가지로 국제 특허출원공개 WO1988/001649 및 미국 특허 제4,946,778호 및 동 제5,260,203호를 참조. 특정 태양에 있어서 단일 사슬 항체는 또한 이중 특이성 및/또는 인간화될 수 있다.
scFv는 Fv를 구성하는 VH와 VL이 펩티드 링커에 의해 연결된 항원 결합 도메인이다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883). 당해 펩티드 링커에 의해 VH와 VL이 근접한 상태로 유지될 수 있다.
sc(Fv)2는 2개의 VL과 2개의 VH의 4개의 가변영역이 펩티드 링커 등의 링커에 의해 연결되어 하나의 사슬을 구성하는 단일 사슬 항체이다(J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189). 이 2개의 VH와 VL은 상이한 단일클론 항체에서 유래하는 경우도 있을 수 있다. 예를 들면 저널 오브 이뮤놀로지(Journal of Immunology) (1994) 152 (11), 5368-5374에 개시되는 바와 같은 동일 항원 중에 존재하는 2종류의 에피토프를 인식하는 이중 특이성(bispecific) sc(Fv)2도 적합하게 들 수 있다. sc(Fv)2는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작될 수 있다. 예를 들면 scFv를 펩티드 링커 등의 링커로 연결함으로써 제작될 수 있다.
본 명세서에 있어서의 sc(Fv)2를 구성하는 항원 결합 도메인의 구성으로서는, 2개의 VH 및 2개의 VL이 단일 사슬 폴리펩티드의 N 말단 측을 기점으로 하여 VH, VL, VH, VL(［VH］링커［VL］링커［VH］링커［VL］)의 순으로 나열되어 있는 것을 특징으로 하는 항체를 들 수 있으나, 2개의 VH와 2개의 VL의 순서는 특별히 상기 구성에 한정되지 않으며, 어떠한 순서로 나열되어도 된다. 예를 들면 아래와 같은 순서의 구성도 들 수 있다.
［VL］링커［VH］링커［VH］링커［VL］
［VH］링커［VL］링커［VL］링커［VH］
［VH］링커［VH］링커［VL］링커［VL］
［VL］링커［VL］링커［VH］링커［VH］
［VL］링커［VH］링커［VL］링커［VH］
sc(Fv)2의 분자형태에 대해서는 WO2006/132352에 있어서도 상세하게 기재되어 있어 당업자라면 이들의 기재를 토대로 본 명세서에서 개시되는 항원 결합 분자의 제작을 위해 적절히 목적하는 sc(Fv)2를 제작하는 것이 가능하다.
여기서 Fv(variable fragment)는 항체의 경쇄 가변영역(VL(light chain variable region))과 항체의 중쇄 가변영역(VH(heavy chain variable region))의 페어로 이루어지는 항체 유래의 항원 결합 도메인의 최소 단위를 의미한다. 1988년에 스케라(Skerra)와 플럭쳔(Pluckthun)은 박테리아의 신호 서열의 하류에 항체의 유전자를 삽입하여 대장균 중에서 당해 유전자의 발현을 유도함으로써, 균일하고 또한 활성을 유지한 상태로 대장균의 페리플라즘 분획으로부터 조제되는 것을 발견하였다(Science (1988) 240 (4855), 1038-1041). 페리플라즘 분획으로부터 조제된 Fv는 항원에 대한 결합을 갖는 태양으로 VH와 VL이 회합되어 있었다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자는 PEG 등의 캐리어 고분자나 항암제 등의 유기화합물을 콘쥬게이트해도 된다. 또한 당쇄 부가 서열을 삽입하여 당쇄가 목적하는 효과를 얻는 것을 목적으로 적합하게 부가될 수 있다.
항체의 가변영역을 결합하는 링커로서는, 유전자공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성화합물 링커(예를 들면 Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996 참조)에 개시되는 링커 등을 사용할 수 있으나, 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하나, 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않으나, 통상 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이며, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다. sc(Fv)2에 3개의 펩티드 링커가 포함되는 경우에는 전부 같은 길이의 펩티드 링커를 사용해도 되고, 상이한 길이의 펩티드 링커를 사용해도 된다.
예를 들면 펩티드 링커의 경우：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：20)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호：21)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：22)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：23)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：24)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：25)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：26)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：27)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：22))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：23))n
［n은 1 이상의 정수이다］등을 들 수 있다. 단, 펩티드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성화합물 링커(화학가교제)는 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜타르타르산염(설포-DST), 비스［2-(숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸］설폰(BSOCOES), 비스［2-(설포숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸］설폰(설포-BSOCOES) 등이며, 이들 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변영역을 결합하는 경우에는 통상 3개의 링커가 필요해지는데 전부 같은 링커를 사용해도 되고, 상이한 링커를 사용해도 된다.
또한 「Fab」는 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1영역 및 가변영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와의 디설피드 결합을 형성할 수 없다.
「F(ab')2」 및 「Fab'」란 면역글로불린(단일클론 항체)을 단백질 분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리함으로써 제조되고, 힌지영역 중 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설피드 결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들면 IgG를 파파인으로 처리함으로써 힌지영역 중 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설피드 결합의 상류에서 절단되어 VL(L쇄 가변영역)과 CL(L쇄 불변영역)로 이루어지는 L쇄, 및 VH(H쇄 가변영역)와 CHγ1(H쇄 불변영역 중의 γ1영역)로 이루어지는 H쇄 프래그먼트가 C 말단영역에서 디설피드 결합에 의해 결합한 상동한 2개의 항체 프래그먼트가 제조될 수 있다. 이들 2개의 상동한 항체 프래그먼트는 각각 Fab'라 불린다.
「F(ab')2」는 2개의 경쇄 및 사슬 간의 디설피드 결합이 2개의 중쇄 사이에서 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인의 일부분의 불변영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자를 구성하는 F(ab')2는 목적하는 항원 결합 도메인을 갖는 전장 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에 Fc 단편을 프로틴 A 칼럼에 흡착시켜 제거함으로써 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정함으로써 제한적으로 F(ab')2를 생성하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 「항원 결합 분자」의 바람직한 태양의 하나로서 다중 특이성 항체를 들 수 있다. 다중 특이성 항체의 Fc영역으로서 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 Fc영역을 사용하는 경우 다중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc영역도 적절히 사용된다. 본 발명의 다중 특이성 항체로서는 특히 이중 특이성 항체가 바람직하다.
다중 특이성 항체의 회합화에는 항체 H쇄의 제2 불변영역(CH2) 또는 H쇄의 제3 불변영역(CH3)의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 의도하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제시키는 기술에 있어서 H쇄의 다른 불변영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 CH3영역에 있어서의 EU 넘버링 356번째 잔기, EU 넘버링 439번째 잔기, EU 넘버링 357번째 잔기, EU 넘버링 370번째 잔기, EU 넘버링 399번째 잔기, EU 넘버링 409번째 잔기에 상대하는 영역을 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 2종의 H쇄 CH3영역을 포함하는 항체에 있어서는 제1 H쇄 CH3영역에 있어서의 아래의 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조(pair)에서 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다；(1) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기, (2) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기, (3) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기.
또한 상기 제1 H쇄 CH3영역과는 상이한 제2 H쇄 CH3영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에서 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제1 H쇄 CH3영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 상기 제1 H쇄 CH3영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다.
상기 (1)~(3)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는 회합했을 때 서로 근접해 있다. 당업자라면 목적하는 H쇄 CH3영역 또는 H쇄 불변영역에 대해 시판의 소프트웨어를 사용한 상동성 모델링(homology modeling) 등에 의해 상기 (1)~(3)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견할 수 있어, 적절히 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들면 아래의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기에서 선택되는 것이 바람직하다；
(a) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서 「동종의 전하를 갖는」다는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는」다는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에 나머지 아미노산 잔기가 상이한 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는 제1 H쇄 CH3영역과 제2 H쇄 CH3영역이 디설피드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 개변에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 전술한 항체의 가변영역 또는 항체의 불변영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자라면 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체에 대해 시판의 소프트웨어를 사용한 상동성 모델링 등에 의해 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있어, 회합을 제어하도록 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 다중 특이성 항체의 회합화에는 또한 다른 공지 기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob；돌기)로 치환하고, 다른 한쪽의 H쇄에 상대하는 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole；공극)로 치환하여 돌기가 공극에 배치될 수 있도록 함으로써 효율적으로 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681, US20130336973).
이에 더하여 본 발명의 다중 특이성 항체의 형성에는 추가로 다른 공지 기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄 CH3의 일부를 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열로 하고, 다른 한쪽의 H쇄 CH3의 상보적인 부분에 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열을 도입한 SEED(strand-exchange engineered domain) CH3를 사용함으로써 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합화를 CH3의 상보적인 회합화에 의해 효율적으로 일으킬 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23；195-202, 2010). 이 공지 기술을 사용해도 효율적으로 목적의 다중 특이성 항체를 형성시킬 수 있다.
이외에도 다중 특이성 항체의 형성에는 WO2011/028952나 WO2014/018572나 Nat Biotechnol. 2014 Feb；32(2):191-8.에 기재된 항체의 CH1과 CL의 회합화, VH, VL의 회합화를 이용한 항체 제작기술, WO2008/119353이나 WO2011/131746에 기재된 따로따로 조제한 단일클론 항체끼리를 사용하여 이중 특이성 항체를 제작하는 기술(Fab Arm Exchange), WO2012/058768이나 WO2013/063702에 기재된 항체 중쇄의 CH3 간의 회합을 제어하는 기술, WO2012/023053에 기재된 2종류의 경쇄와 1종류의 중쇄로 구성되는 이중 특이성 항체를 제작하는 기술, 크리스토프(Christoph) 등(Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))에 기재된 하나의 H쇄와 하나의 L쇄로 이루어지는 항체의 한쪽 사슬을 각각 발현하는 2개의 박테리아 세포주를 이용한 이중 특이성 항체를 제작하는 기술 등을 사용하는 것도 가능하다.
다중 특이성 항체 형성의 일태양으로서는 전술한 바와 같이 2종류의 단일클론 항체를 환원제 존재하에서 혼합하고, 코어 힌지의 디설피드 결합을 개열(cleavage)시킨 후에 재회합시켜 헤테로 2량화한 이중 특이성 항체를 얻는 방법을 들 수 있는데(FAE), CH3영역의 상호작용 계면에 정전 상호작용(WO2006/106905)을 도입함으로써 재회합 시에 더욱 효율적으로 헤테로 2량화를 야기할 수 있다(WO2015/046467). 천연형 IgG를 사용한 FAE의 경우에는 재회합이 랜덤으로 일어나기 때문에 이론상 50%의 효율로밖에 이중 특이성 항체를 얻을 수 없으나, 당해 방법으로는 고수율로 이중 특이성 항체를 제조할 수 있다.
또한 효율적으로 목적의 다중 특이성 항체를 형성시킬 수 없는 경우라도, 생산된 항체 중에서 목적의 다중 특이성 항체를 분리, 정제함으로써도 본 발명의 다중 특이성 항체를 얻는 것이 가능하다. 예를 들면 2종류의 H쇄 가변영역에 아미노산 치환을 도입하고 등전점의 차를 부여함으로써 2종류의 호모체와 목적의 헤테로 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325). 또한 헤테로체를 정제하는 방법으로서 지금까지 프로틴 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로틴 A에 결합하지 않는 랫트 IgG2b의 H쇄로 이루어지는 헤테로 2량화 항체를 프로틴 A를 사용하여 정제하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431, WO95033844). 또한 IgG와 프로틴 A의 결합 부위인 EU 넘버링 435번째 및 436번째 아미노산 잔기를 Tyr, His 등의 프로틴 A에 대한 결합력이 상이한 아미노산으로 치환한 H쇄를 사용함으로써, 각 H쇄와 프로틴 A의 상호작용을 변화시켜 프로틴 A 칼럼을 사용함으로써 헤테로 2량화 항체만을 효율적으로 정제할 수 있다.
또한 상이한 복수의 H쇄에 결합능을 부여할 수 있는 공통의 L쇄를 취득하여 다중 특이성 항체의 공통 L쇄로서 사용해도 된다. 이러한 공통 L쇄와 상이한 복수의 H쇄 유전자를 세포에 도입함으로써 IgG를 발현시켜 효율적인 다중 특이성 IgG의 발현이 가능해진다(Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681). 공통 H쇄를 선택할 때 임의의 상이한 H쇄에 대응하여 높은 결합능을 나타내는 공통 L쇄를 선택하는 방법도 이용할 수 있다(WO2004/065611).
또한 본 발명의 Fc영역으로서 Fc영역 C 말단의 이질성(heterogeneity)이 개선된 Fc영역이 적절히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 기원으로 하는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 446번 위치의 글리신 및 447번 위치의 리신이 결실된 Fc영역이 제공된다.
이들 기술을 복수, 예를 들면 2개 이상 조합하여 사용하는 것도 가능하다. 또한 이들 기술은 회합시키고자 하는 2개의 H쇄에 적절히 따로따로 적용시키는 것도 가능하다. 또한 이들 기술은 전술한 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 Fc영역에 조합하여 사용하는 것도 가능하다. 또한 본 발명의 항원 결합 분자는 상기 개변이 가해진 것을 베이스로 하여 동일한 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 분자를 별도 제작한 것이어도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자(제1 항원 결합 분자)는 상기의
(1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
(2) 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인
을 포함하는 것이면 되며, 그 구조는 한정되지 않는다. 제1 항원 결합 분자는 이들 2개의 결합 도메인을 포함함으로써 TNF 슈퍼패밀리 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 분자를 발현하는 세포로서, 암 특이적 항원을 발현하는 세포 또는 당해 세포를 포함하는 종양조직에 포함되는 세포를 특이적으로 활성화하여, 암 특이적 항원을 발현하는 당해 세포 또는 당해 세포를 포함하는 종양조직에 대해 우수한(특이적인) 세포상해 작용을 유도하는 것이 가능해진다. 본 발명의 암 특이적 항원 결합 도메인, TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 및 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인은 각각 전술한 암 특이적 항원, 또는 TNF 슈퍼패밀리 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 항원에서 적절히 선택할 수 있다. 이들 결합 도메인은 펩티드 결합으로 직접 연결하는 것도 가능하며, 링커를 매개로 결합하는 것도 가능하다.
본 발명의 항원 결합 분자는 또한 FcRn 결합 도메인을 포함하고 있어도 된다. 그 FcRn 결합 도메인으로서 전술한 항체의 Fc영역을 사용하는 경우는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 Fc영역이 바람직하다. Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 저하시킴으로써 Fcγ 수용체 발현 세포와 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 인자를 발현하는 세포 사이의 가교에 의해 생기는 사이토카인 릴리스 등의 면역활성화에 의해 발생하는 부작용을 억제하는 것이 가능하다.
본 발명의 항원 결합 분자는 전술한 공지의 방법을 사용해 제작할 수 있다.
예를 들면 (1) 암 특이적 항원 결합 도메인으로서 F(ab')2, (2) TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인으로서 F(ab')2를 사용하고, (3) FcRn 결합 도메인으로서 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 Fc영역을 포함하는 도메인을 사용한 경우에, (1)과 (2)에 기재된 항원 결합 도메인과 (3)에 기재된 Fc영역을 포함하는 도메인을 펩티드 결합으로 직접 연결했을 때는 연결된 폴리펩티드는 항체의 구조를 형성한다. 이러한 항체를 제작하기 위해서는 전술한 하이브리도마의 배양액으로부터 정제하는 외에, 당해 항체를 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 안정하게 유지하고 있는 목적하는 숙주세포의 배양액으로부터 당해 항체를 정제하는 것도 가능하다.
또한 그밖에 링커를 매개로 각 도메인을 결합하는 경우는 채용되는 링커로서는 상기에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적절히 사용될 수 있다. 또한 수소 결합, 디설피드 결합, 공유 결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합에 의해 서로 결합하는 성질도 또한 적합하게 이용될 수 있다. 예를 들면 항체의 CH1과 CL 간의 친화성이 이용되거나, 헤테로 Fc영역의 회합 시에 전술한 다중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc영역이 사용되거나 한다.
본 발명에 있어서는 제1 항원 결합 분자에 추가로 제2 항원 결합 분자를 조합하여 사용할 수 있다.
그 제2 항원 결합 분자는
　(1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
　(2) T세포 수용체 복합체 결합 도메인
을 포함하는 것이면 되고, 제1 항원 결합 분자와 마찬가지로 그 구조는 한정되지 않으며, 제1 항원 결합 분자와 동일한 방법으로 취득하는 것이 가능하다. 또한 제2 항원 결합 분자는 암 특이적 항원 결합 도메인과 T세포 수용체 복합체 결합 도메인을 포함하고 있으면 그 구조는 제1 항원 결합 분자와 동일할 필요도 없다. 또한 제1 항원 결합 분자의 암 특이적 항원 결합 도메인이 결합하는 암 특이적 항원과 제2 항원 결합 분자의 암 특이적 항원 결합 도메인이 결합하는 암 특이적 항원은 동일한 항원이어도 되고 상이한 항원이어도 되지만, 동일한 암 특이적 항원인 것이 바람직하다. 암 특이적 항원이 동일한 경우, 제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프는 동일해도 되고 상이한 것이어도 된다. 이들 제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자를 조합하여 사용함으로써 우수한 세포상해활성을 얻을 수 있다. 제2 항원 결합 도메인에 포함되는 암 특이적 항원 결합 도메인 및 T세포 수용체 복합체 결합 도메인은 각각 전술한 암 특이적 항원 또는 T세포 수용체 복합체에 속하는 항원에서 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 제2 항원 결합 분자도 제1 항원 결합 분자와 마찬가지로 또한 FcRn 결합 도메인을 포함하고 있어도 된다. 그 FcRn 결합 도메인으로서 전술한 항체의 Fc영역을 사용하는 경우는 제1 항원 결합 분자와 마찬가지로 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 Fc영역이 바람직하다. Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 저하시킴으로써 Fcγ 수용체 발현 세포와 T세포 수용체 복합체 발현 세포 및/또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 인자를 발현하는 세포 사이의 가교에 의해 생기는 사이토카인 릴리스 등의 면역활성화에 의해 발생하는 부작용을 억제하는 것이 가능하다.
또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 항원 결합 분자는 임의의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 발현 벡터로 적당한 숙주를 형질전환하여 항원 결합 분자의 발현 세포로 할 수 있다. 항원 결합 분자의 발현 세포를 배양하고 배양상청으로부터 발현 산물을 회수하면 당해 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 항원 결합 분자를 취득할 수 있다. 즉 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 당해 벡터를 보유하는 세포 및 당해 세포를 배양하고 배양상청으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 것을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법에 관한 것이다. 이들은 예를 들면 상기 재조합 항체와 동일한 수법에 의해 얻을 수 있다.
의약 조성물
다른 관점에 있어서는 본 발명은 전술한 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 당해 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 함유하는 세포상해를 유도하는 의약 조성물(세포상해 유도 치료제), 세포증식 억제제 및 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물은 암 치료제 또는 암 예방제로서 사용하는 것도 가능하다. 본 발명의 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 항암제는 암을 앓고 있는 대상 또는 재발할 가능성이 있는 대상에게 투여되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 있어서 전술한 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 항암제는 당해 항원 결합 분자를 대상에게 투여하는 공정을 포함하는 세포상해를 유도하는 방법, 세포증식을 억제하는 방법, 암세포 또는 암세포를 포함하는 종양조직에 대한 면역을 활성화하는 방법, 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법으로 표현할 수 있으며, 또는 세포상해를 유도하기 위한 의약 조성물, 세포증식 억제제 및 항암제의 제조에 있어서의 당해 항원 결합 분자의 사용이라 표현하는 것도 가능하며, 또는 세포상해의 유도, 세포증식의 억제, 암세포 또는 암세포를 포함하는 종양조직에 대한 면역의 활성화 또는 암의 치료 또는 예방에 있어서 사용하기 위한 당해 항원 결합 분자라 표현하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 「항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함한다」는 것은, 당해 항원 결합 분자를 주요한 활성 성분으로서 포함한다는 의미이며, 당해 항원 결합 분자의 함유율을 제한하는 것은 아니다.
또한 본 발명에 있어서의 의약 조성물, 또는 세포상해를 유도하기 위한 의약 조성물, 세포증식 억제제 및 항암제(이하, 의약 조성물 등)는 전술한 제2 항원 결합 분자를 조합해서 사용할 수 있다. 제1 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물 등에 제2 항원 결합 분자를 조합해서 사용함으로써 당해 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해 작용을 강화할 수 있다. 여기서 「제2 항원 결합 분자를 조합해서 사용한다」는 것은, 제2 항원 결합 분자가 제1 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물 등 중에 함께 배합되어 있어도 되고, 제1 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물 등과는 상이한 의약 조성물 등 중에 제2 항원 결합 분자가 포함되어 있어도 된다. 그 제형도 동일한 것이어도 되고 상이한 것이어도 된다. 또한 제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 상이한 의약 조성물 등 중에 포함되는 경우에는 이들 의약 조성물 등은 대상에 대해 동시에 투여되어도 되며 따로따로 투여되어도 된다. 또한 이들 의약 조성물 등을 키트로서 제공해도 된다.
또한 본 발명에 있어서의 제1 항원 결합 분자 또는 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물은 제2 항원 결합 분자 또는 제2 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등과 병용함으로써, 그 세포상해활성의 유도를 높이거나 또는 세포상해활성을 강화하기 위한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 또한 제2 항원 결합 분자 또는 제2 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물은 제1 항원 결합 분자 또는 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등과 병용함으로써, 그 세포상해활성의 유도를 높이거나 또는 세포상해활성을 강화하기 위한 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
여기서「병용」에는 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등과 제2 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등이 대상에 대해 동시에 투여되는 것도 포함되며 따로따로 투여되는 것도 포함된다. 또한 그 제형은 동일한 것이어도 되고 상이한 것이어도 된다. 또한 이들 의약 조성물 등을 키트로서 제공하는 것이어도 된다.
또한 본 발명은 상기 제1 항원 결합 분자 또는 당해 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등과 제2 항원 결합 분자 또는 제2 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등을 병용함으로써 발생하는 효과를 이용함으로써, 제1 항원 결합 분자 또는 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등에 의해, 제2 항원 결합 분자 또는 제2 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등의 세포상해활성 또는 항종양 효과를 강화하는 방법을 제공한다. 또한 제2 항원 결합 분자 또는 제2 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등에 의해 제1 항원 결합 분자 또는 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등의 세포상해활성 또는 항종양 효과를 강화하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명에 있어서의 의약 조성물 등은 필요에 따라 복수 종류의 제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자를 조합해서 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면 동일 항원에 결합하는 복수의 본 발명 항원 결합 분자의 칵테일을 사용함으로써 당해 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해 작용을 강화할 수 있는 가능성이 있다.
또한 필요에 따라 본 발명의 항원 결합 분자는 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입되어 콜로이드 드럭 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 될 수 있다("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980) 등 참조). 또한 약제를 서방성 약제로 하는 방법도 공지이며, 당해 방법은 본 발명의 항원 결합 분자에 적용될 수 있다(J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277, Chemtech. (1982) 12, 98-105, 미국 특허 제3773719호, 유럽 특허공개공보 EP58481호·EP133988호, Biopolymers (1983) 22, 547-556).
본 발명의 의약 조성물 또는 세포증식 억제제 및 항암제는 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여이다. 이러한 투여방법으로서는 구체적으로는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여로서는, 예를 들면 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등을 들 수 있다. 예를 들면 주사 투여에 의해 본 발명의 의약 조성물, 또는 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 투여량으로서는 예를 들면 1회 투여 시 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎에서 1,000 ㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는 예를 들면 환자당 0.001 ㎎/body에서 100,000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나 본 발명의 의약 조성물은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은 통상의 방법에 따라 제제화하는 것이 가능하며(예를 들면 Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 모두 포함하는 것이어도 된다. 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있다. 또한 이들에 제한되지 않고 기타 상용의 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는 경질 무수 규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 녹말, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복실메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 담체로서 들 수 있다.
또한 본 발명은 어떤 암 특이적 항원을 발현하는 세포를 당해 암 특이적 항원에 결합하는 본 발명의 제1 항원 결합 분자, 또는 제1 항원 결합 분자 및 제2 항원 결합 분자와 접촉시킴으로써 당해 암 특이적 항원의 발현 세포 또는 당해 암 특이적 항원의 발현 세포를 포함하는 종양조직에 상해를 일으키는 방법, 또는 당해 세포 또는 당해 종양조직의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 당해 암 특이적 항원에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자가 결합하는 세포는 당해 암 특이적 항원이 발현되고 있는 세포라면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서의 바람직한 당해 암 항원의 발현 세포는 구체적으로는 난소암, 전립선암, 유방암, 자궁암, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 방광암 및 대장암 세포 등을 적합하게 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「접촉」은, 예를 들면 생체 외에서 배양하고 있는 암 항원 발현 세포의 배양액에 당해 암 항원에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자를 첨가함으로써 행해진다. 이 경우에 있어서 첨가되는 항원 결합 분자의 형상으로서는, 용액 또는 동결건조 등에 의해 얻어지는 고체 등의 형상이 적절히 사용될 수 있다. 수용액으로서 첨가되는 경우에 있어서는 순수하게 본 발명의 항원 결합 분자만을 함유하는 수용액일 수 있으며, 예를 들면 상기 기재된 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액일 수도 있다. 첨가하는 농도는 특별히 한정되지 않지만, 배양액 중의 최종 농도로서 바람직하게는 1 pg/㎖에서 1 g/㎖의 범위이고, 보다 바람직하게는 1 ng/㎖에서 1 ㎎/㎖이며, 더욱 바람직하게는 1 ㎍/㎖에서 1 ㎎/㎖가 적합하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 있어서 「접촉」은 또한 다른 태양에서는 암 특이적 항원의 발현 세포를 체내에 이식한 비인간 동물이나 내재적으로 당해 암 특이적 항원을 발현하는 암세포를 갖는 동물에 당해 암 항원에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자를 투여함으로써도 행해진다. 투여방법은 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 의해 실시할 수 있다. 특히 바람직하게는 비경구 투여에 의한 투여방법이며, 이러한 투여 방법으로서는 구체적으로는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여로서는, 예를 들면 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등을 들 수 있다. 예를 들면 주사 투여에 의해 본 발명의 의약 조성물, 또는 세포상해를 유도하기 위한 의약 조성물, 세포증식 저해제 및 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한 피험동물의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 수용액으로서 투여되는 경우에 있어서는 순수하게 본 발명의 항원 결합 분자만을 함유하는 수용액이어도 되며, 예를 들면 상기 기재한 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액이어도 된다. 투여량으로서는, 예를 들면 1회 투여 시 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎에서 1,000 ㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는 예를 들면 환자당 0.001에서 100,000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나 본 발명의 항원 결합 분자 투여량은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항원 결합 분자의 접촉에 의해 당해 항원 결합 분자를 구성하는 암 특이적 항원 결합 도메인이 결합하는 암 특이적 항원을 발현하는 세포에 일어난 세포상해를 평가 또는 측정하는 방법으로서 아래의 방법이 적합하게 사용된다. 생체 외에서 상기 세포상해활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서는, 세포상해성 T세포 활성 등의 측정법을 들 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자가 T세포성 상해활성을 갖는지 여부를 공지의 방법으로 측정할 수 있다(예를 들면 Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993) 등). 활성의 측정 시에는 본 발명과는 그 항원 결합 도메인이 결합하는 항원이 상이한 항원으로 시험에 사용하는 세포가 발현되지 않은 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 대조로서 본 발명의 항원 결합 분자와 동일하게 사용하여, 본 발명의 항원 결합 분자가 대조로서 사용된 항원 결합 분자보다도 강한 세포상해활성을 나타냄으로써 활성을 판정할 수 있다.
또한 생체 내에서 세포상해활성을 평가 또는 측정하기 위해, 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자를 구성하는 암 특이적 항원 결합 도메인이 결합하는 항원을 발현하는 세포를 비인간 피험 동물의 피부 또는 피하에 이식 후, 당일 또는 익일부터 매일 또는 수일 간격으로 피험 항원 결합 분자를 정맥 또는 복강 내에 투여한다. 종양의 크기를 경일적으로 측정함으로써 당해 종양 크기 변화의 차이를 세포상해활성으로 규정할 수 있다. 생체 외에서의 평가와 마찬가지로 대조가 되는 항원 결합 분자를 투여하고, 본 발명의 항원 결합 분자 투여군에 있어서의 종양의 크기가 대조 항원 결합 분자 투여군에 있어서의 종양의 크기보다도 유의하게 작은 것으로 인해 본 발명의 항원 결합 분자가 세포상해활성을 갖는다고 판정할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자의 접촉에 따른, 당해 항원 결합 분자를 구성하는 암 특이적 항원 결합 도메인이 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식에 대한 억제 효과를 평가 또는 측정하는 방법으로서는, 아이소토프 라벨한 티미딘의 세포로의 흡수 측정이나 MTT법이 적합하게 사용된다. 또한 생체 내에서 세포증식 억제활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서, 상기 기재된 생체 내에 있어서 세포상해활성을 평가 또는 측정하는 방법과 동일한 방법을 적합하게 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 포함하는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트에는 기타 약학적으로 허용되는 담체, 매체, 사용방법을 기재한 지시서 등을 패키지해 둘 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 하나 또는 복수의 태양을 임의로 조합한 것도 당업자의 기술상식에 기초하여 기술적으로 모순되지 않는 한 본 발명에 포함되는 것이 당업자에게는 당연히 이해된다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
아래에 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
〔참고예 1〕항체의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현과 정제
항체의 가변영역의 H쇄 및 L쇄의 염기서열을 코드하는 전장 유전자의 합성은 Assemble PCR 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 제작하였다. 아미노산 치환의 도입은 PCR 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행하였다. 얻어진 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 제작한 플라스미드를 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen사) 또는 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 항체의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore) 또는 0.45 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE 헬스케어) 또는 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE 헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는 분광광도계를 사용하여 280 ㎚에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도를 산출하였다(Protein Science 1995；4:2411-2423).
〔참고예 2〕마우스 Fcγ 수용체(mFcγR)의 조제방법 및 개변 항체와 mFcγR의 상호작용 해석방법
마우스 FcγR의 세포 외 도메인을 아래의 방법으로 조제하였다. 먼저 FcγR의 세포 외 도메인 유전자의 합성을 당업자 공지의 방법으로 실시하였다. 그때, 각 FcγR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보를 토대로 제작하였다. 구체적으로는 mFcγRI에 대해서는 NCBI 레퍼런스 시퀀스(NCBI Reference Sequence): NP_034316.1, mFcγRII에 대해서는 NCBI 레퍼런스 시퀀스: NP_034317.1, mFcγRIII에 대해서는 NCBI 레퍼런스 시퀀스: NP_034318.2, mFcγRIV에 대해서는 NCBI 레퍼런스 시퀀스: NP_653142.2의 서열을 토대로 제작하고, C 말단에 His 태그를 부가하였다. 얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 제작한 발현 벡터를 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 목적 단백질의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청은 원칙으로서 다음의 4단계로 정제하였다. 제1 단계는 이온 교환 칼럼크로마토그래피, 제2 단계는 His 태그에 대한 친화성 칼럼크로마토그래피(HisTrap HP), 제3 단계는 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200), 제4 단계는 무균 여과를 실시하였다. 제1 단계의 이온 교환 칼럼크로마토그래피에 대해 mFcγRI는 Q Sepharose HP, mFcγRII 및 mFcγRIV는 SP Sepharose FF, mFcγRIII는 SP Sepharose HP를 사용하였다. 또한 제3 단계 이후에 사용한 용매는 D-PBS(-)로 하였으나, mFcγRIII에 대해서는 0.1 M 아르기닌을 포함하는 D-PBS(-)로 하였다. 정제한 단백질에 대해서는 분광광도계를 사용하여 280 ㎚에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 정제 단백질의 농도를 산출하였다(Protein Science 1995；4:2411-2423). 비아코어 T100(GE 헬스케어), 비아코어 T200(GE 헬스케어), 비아코어 A100, 비아코어 4000을 사용하여 각 개변 항체와 상기에서 조제한 Fcγ 수용체의 상호작용 해석을 행하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 사용하고, 측정온도는 25℃로 하였다. S 시리즈 센서 칩 CM5(GE 헬스케어) 또는 S 시리즈 센서 칩 CM4(GE 헬스케어)에 아민 커플링법에 의해 프로틴 L(ACTIGEN 또는 BioVision)을 고정화한 칩을 사용하였다. 이들 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 mFcγR을 상호작용시켜 항체에 대한 결합량을 측정하여 항체 간에 비교하였다. 단, mFcγR의 결합량은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문에 각 항체의 캡쳐량으로 mFcγR의 결합량을 나눈 보정값으로 비교하였다. 또한 10 mM 글리신-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 센서칩에 캡쳐된 항체를 세정하고, 센서칩을 재생해 반복하여 사용하였다. 또한 각 개변 항체의 FcγR에 대한 KD값을 산출하기 위한 속도론적인 해석은 아래의 방법에 따라 실시하였다. 먼저 상기 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고 러닝 버퍼로 희석한 mFcγR을 상호작용시켜, 얻어진 센서그램에 대해 비아코어 평가 소프트웨어(Biacore Evaluation Software)에 의해 측정결과를 1:1 랭뮤어 결합 모델(Langmuir binding model)로 글로벌 피팅(global fitting)시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
〔참고예 3〕실험동물 및 세포주
실험동물은 C57BL/6 암컷 마우스(일본 찰스·리버 주식회사), 또는 Balb/c 암컷 마우스(일본 찰스·리버 주식회사)를 사용하여, 동물 사육실에서 일정 조건(온도：20~26℃, 명암：12시간의 명암 주기)으로 사료와 음용수의 자유섭취하에서 사육하였다. 마우스 폐암 세포주인 LLC(ATCC No. CRL-1642)의 염색체에 당업자 공지의 방법으로 인간 GPC3 유전자를 삽입하여 인간 GPC3를 고발현하는 세포주 LLC-GPC3를 얻었다. 인간 GPC3 발현 레벨(2.3×105/cell)은 QIFI 키트(Dako사)를 사용하여 제조원이 추천 장려하는 방법으로 결정하였다. 마찬가지로 마우스 대장암 세포주인 CT-26(ATCC No. CRL-2638)에 대해서도 인간 GPC3 유전자를 삽입하여 고발현주 CT26-GPC3(발현 레벨：3.1×105/cell)를 얻었다. 이들 재조합 세포주는 ATCC 추천 장려 배지에 인간 GPC3 유전자 유지를 위해 제네티신(GIBCO)을 LLC-GPC3에 대해서는 400 ㎍/㎖, CT26-GPC3에 대해서는 200 ㎍/㎖ 첨가해 배양하였다. 배양 후, 이들 세포를 2.5 g/L 트립신-1 mM EDTA(nacalai tesque사)로 박리한 후에 각 실험에 사용하였다.
〔실시예 1〕항CD137 마우스 항체의 제작과 아고니스트 활성의 평가
1-1． 항마우스 CD137 마우스 항체의 제작과 mFc γR에 대한 결합 평가
항체 H쇄 가변영역으로서는 WO2005/017148에 개시되어 있는 마우스 CD137에 대한 가변영역인 1D8VH(서열번호：28)를, 항체 H쇄 불변영역으로서는 천연형 마우스 IgG1의 H쇄 불변영역을 갖는 1D8VH-mIgG1(서열번호：29)을 참고예 1의 방법에 따라 제작하였다. 또한 1D8VH-mIgG1에 대해 WO2012/133782에 기재되어 있는 FcγR에 대한 결합을 배제하는 개변인 EU 넘버링 235번째 Pro를 Lys로 치환하는 개변, 및 EU 넘버링 239번째 Ser을 Lys로 치환하는 개변을 도입한 1D8VH-mF18(서열번호：30)을 제작하였다. 또한 mFcgRII에 대한 결합을 증강시키는 개변(T230E, V231P, P232N, S238E, S239D, N324D)을 1D8VH-mIgG1에 대해 도입한 1D8VH-MB492(서열번호：31)를 제작하였다. 항체 L쇄 가변영역으로서는 WO2005/017148에 개시되어 있는 1D8VL을, L쇄 불변영역으로서는 마우스 κ쇄의 불변영역을 갖는 1D8VL-mk0(서열번호：32)를 사용하고, 참고예 1의 방법에 따라 발현, 정제함으로써 1D8VH-mIgG1/1D8VL-mk0, 1D8VH-mF18/1D8VL-mk0, 1D8VH-MB492/1D8VL-mk0를 얻었다. 이들 항체는 이후 간략화를 위해 1D8-mIgG1, 1D8-mF18, 1D8-MB492로 기재한다.
또한 각각의 불변영역의 mFcγR에 대한 결합을 측정하기 위해, H쇄 가변영역으로서 WO2009/125825에 기재되어 있는 항인간 인터류킨 6 수용체 항체의 가변영역인 H237(서열번호：33)을 갖는 H237-mIgG1(서열번호：34), H237-MB492(서열번호：35)를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 토실리주맙(tocilizumab)의 L쇄인 MRAL-k0(서열번호：36)를 사용하고, 참고예 1의 방법에 따라 발현, 정제함으로써 H237-mIgG1/MRAL-k0, H237-MB492/MRAL-k0를 얻었다. 또한 마찬가지로 항체 H쇄 가변영역으로서 인간 IL6R에 대한 결합을 갖는 마우스 항체인 mouse PM-1(Sato, Cancer Res., 1993, 53, 851-856)의 가변영역(mPM1H)을 갖는 mPM1H-mIgG1(서열번호：37), mPM1H-mF18(서열번호：38)을 제작하였다. 항체 L쇄로서는 MRAL-k0를 사용하고, 참고예 1의 방법에 따라 발현, 정제함으로써 mPM1H-mIgG1/MRAL-k0, mPM1H-mF18/MRAL-k0를 얻었다.
참고예 2의 방법에 따라 mPM1H-mIgG1/MRAL-k0 및 mPM1H-mF18/MRAL-k0의 mFcγRII, mFcγRIII에 대한 결합능을 평가하였다. 천연형 마우스 IgG1(mIgG1)은 4종류의 마우스 FcγR 중 mFcγRI 및 mFcγRIV에는 결합하지 않고, mFcγRII 및 mFcγRIII에만 결합을 나타낸다(Nimmerjahn, 2005, Science, 310, 1510-1512). 따라서 천연형 mIgG1에 대해 mFcγR에 대한 결합을 감소시키는 개변을 도입함으로써 mFcγRII 및 mFcγRIII에 대한 결합을 감소시켜, 모든 mFcγR에 대한 결합이 저감된 개변체를 얻을 수 있는 것으로 기대되었다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
이상의 결과로부터, 불변영역 mF18은 mFcγR에 대한 결합이 현저히 저감된 개변체인 것이 나타내어졌다.
또한 마찬가지로 H237-mIgG1/MRAL-k0 및 H237-MB492/MRAL-k0의 mFcγRII, mFcγRIII로의 결합을 평가한 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
표 중 「상대적 결합활성」이란, 각 mFcγR에 대한 천연형 mIgG1의 결합활성을 1로 했을 때의 MB492의 결합활성을 나타낸다. 이상의 결과로부터, MB492는 mFcγRII에 대해 mIgG1의 621.5배, mFcγRIII에 대해 10.9배 증강된 개변체인 것이 나타내어졌다.
1-2．항마우스 CD137 항체의 생체 외 CD137 아고니스트 작용의 평가
나이브(naive) C57BL/6 암컷 마우스로부터 비장을 채취하여, FBS 10%를 포함하는 RPMI1640 배지에 0.5 ㎍/㎖ 이오노마이신 및 10 ng/㎖ PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE(PMA)를 첨가한 배지로 세포를 현탁하여, 2×105 세포/100 ㎕/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 거기에 항마우스 CD137 항체를 3 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 3일간 배양하였다. 배양 후의 상청을 회수하여 포함되는 마우스 IFN-γ 농도를 ELISA에 의해 측정함으로써 비장 유래 T세포의 활성화를 평가하였다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech사)의 지시에 따라 실시하였다.
그 결과(도 1), 제작한 항마우스 CD137 마우스 IgG1 항체에 있어서 FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 것(1D8-mF18)에서는 활성이 보이지 않고, 야생형 Fc인 것(1D8-mIgG1)에서는 T세포 활성화가 확인되었다. 더 나아가서는 FcγRIIB에 대한 결합능을 높인 것(1D8-MB492)에서는 야생형 Fc인 것에 비해 약 8배 비활성(specific activity)이 상승하였다.
이것으로부터 Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6에 기재되어 있는 바와 같이 다른 TNFRSF에 대한 아고니스트 항체와 마찬가지로, 항CD137 항체가 아고니스트 활성을 발휘하기 위해서는 항체의 FcγRII로의 결합이 필요하며, CD137이 발현되고 있는 T세포에 결합한 항CD137 항체가 FcγRII 발현 세포에 의해 가교되는 것이 필요한 것을 알 수 있었다(도 2). FcγRII는 B세포 등 많은 면역세포·탐식세포에 발현되고 있는 것으로부터, 항CD137 항체에 의한 아고니스트 활성은 전신적으로 일어나고, 그로 인해 부작용이 발생하는 것으로 생각되었다.
〔실시예 2〕항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체의 제작과 아고니스트 활성의 평가
2-1．암 항원 과 CD137 의 이중 특이성 항체에 의한 암 항원 의존적인 아고니스트 항체의 콘셉트
실시예 1의 검토에서 통상의 항CD137 항체에 의한 아고니스트 활성은 전신적으로 일어나기 때문에 항종양 효과와 정상조직에서의 부작용(T세포의 활성화 등)을 분리하는 것이 불가능하다고 생각되었다. 이에 암 항원과 CD137의 이중 특이성 항체를 사용함으로써 CD137을 발현하고 있는 T세포와 암 항원을 발현하고 있는 세포(암세포 등)가 당해 이중 특이성 항체에 의해 가교됨으로써, 암 항원이 존재하고 있는 암조직에 있어서만 항CD137 항체에 의한 아고니스트 활성이 발휘되는 것이 아닌지 생각하였다(도 3).
2-1． 항인간 GPC3 / 항마우스 CD137 이중 특이성 항체( GPC3 ERY22 -1 D8 , GPC3 ERY22-G2-1D8, GPC3 ERY22 - G4 -1 D8 )의 제작
인간 IgG1, IgG2, IgG4의 불변영역을 갖는 3종류의 항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체를 제작하였다. 이들 분자의 경우는 H쇄와 L쇄의 회합을 제어하여 효율적으로 이중 특이성 항체를 얻기 위해 Schaefer 등에 의해 보고되어 있는 크로스맵(CrossMab) 기술을 사용하였다(Schaefer, Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, 108, 11187-11192). 즉, 이들 분자는 WO2012/073985에 기재되어 있는 인간 GPC3에 대한 Fab의 VH 도메인과 VL 도메인이 치환된 분자로 되어 있다. 또한 항체 H쇄 불변영역에는 헤테로 회합을 촉진하기 위해 놉-인투-홀(Knobs-into-Holes) 기술을 사용하였다. 놉-인투-홀 기술은 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(Knob；돌기)로 치환하고, 또 다른쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(Hole；공극)로 치환함으로써 돌기가 공극 내에 배치되도록 하여 H쇄의 헤테로 2량화를 촉진하여 목적의 헤테로 2량화 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 기술이다(Burmeister, Nature, 1994, 372, 379-383). 이후, 놉(Knob) 개변이 도입된 불변영역을 Kn, 홀(Hole) 개변이 도입된 불변영역을 Hl로 나타낸다. 또한 FcγR에 대한 결합을 감소시키는 개변으로서 WO2011/108714에 기재되어 있는 개변을 사용하였다. 구체적으로는 IgG1형, IgG4형에 대해서는 EU 넘버링 234번째, 235번째, 297번째를 Ala로 치환하는 개변을 도입하였다. 또한 IgG2형에 대해서는 234번째, 237번째, 297번째를 Ala로 치환하는 개변을 도입하였다. 항체 H쇄의 C 말단으로부터는 EU 넘버링 446번째 Gly 및 447번째 Lys를 제거하고, 거기에 추가로 항체 발현 후의 정제를 용이하게 하기 위해 항인간 GPC3측 H쇄의 C 말단에 히스티딘 태그를, 항마우스 CD137측 H쇄의 C 말단에 FLAG 태그를 부가하였다. 이상의 개변을 도입한 항인간 GPC3측 H쇄로서 GC33(2)H-G1dKnHS(서열번호：39), GC33(2)H-G2dmKnHS(서열번호：40), GC33(2)H-G4dKnHS(서열번호：41)를 제작하였다. 또한 항마우스 CD137측 H쇄로서 1D8VH-G1dHlFS(서열번호：42), 1D8VH-G2dmHlFS(서열번호：43), 1D8VH-G4dHlFS(서열번호：44)를 제작하였다. 여기서 IgG2형 불변영역을 갖는 GC33(2)H-G2dmKnHS 및 1D8VH-G2dmHlFS는 CH1 도메인 및 힌지영역의 전반부분만 IgG1형으로 되어 있다. 구체적으로는 천연형 인간 IgG2의 CH1 서열과 비교하여 EU 넘버링 131번째가 Ser로, 133번째가 Lys로, 137번째, 138번째가 Gly로 되어 있으며, 힌지영역은 219번째가 Ser로 되어 있다. 항체 L쇄로서는 항인간 GPC3측으로서 GC33(2)L-k0(서열번호：45)를, 항마우스 CD137측으로서 1D8VL-k0(서열번호：46)를 공통으로 사용하였다. 이들 항체를 표 3의 조합으로 발현하여 목적의 이중 특이성 항체를 얻었다. 또한 이들 항체의 발현은 1-1에 따라 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에서 일과성 발현시켰다. 얻어진 배양상청을 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가하고 당해 칼럼을 세정한 후, 0.1 ㎎/㎖ FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출을 실시하였다. 항체를 포함하는 분획을 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가하고 당해 칼럼을 세정한 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출을 실시하였다. 항체를 포함하는 분획을 한외여과막으로 농축한 후, 농축액을 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가하여 그 용출액의 단량체 항체만을 회수함으로써 정제 항체를 얻었다.
Figure pct00003
2-2． 항인간 GPC3 / 항마우스 CD137 이중 특이성 항체의 GPC3 의존적인 생체 외 CD137 아고니스트 작용의 평가
마우스 T세포주 CTLL-2(ATCC Cat. No. TIB-214)를 FBS 10%를 포함하는 RPMI1640 배지에 0.5 ㎍/㎖ 이오노마이신 및 10 ng/㎖ PMA를 첨가한 배지에서 현탁하고, 2×104 세포/100 ㎕/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 거기에 인간 GPC3를 발현하는 마우스 폐암 세포주 LLC-GPC3(참고예 3)를 같은 배지에서 현탁하여 2×104 세포/100 ㎕/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 더 나아가서는 CTLL-2와 LLC-GPC3를 각각 같은 세포 수 포함하는 현탁액을 조제해 4×104 세포/100 ㎕/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 거기에 FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 인간 IgG1형 항체(GPC3 ERY22-1D8), 또는 항인간 GPC3 단일 특이성 인간 IgG형 항체(GC33(2)H2-G1dS 및 GC33(2)L2-k0로 이루어지는 GC33(2)-hG1S)를 5 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후의 상청을 회수하여 포함되는 마우스 IFN-γ 농도를 ELISA에 의해 측정함으로써 CTLL-2의 활성화를 평가하였다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech사)의 지시에 따라 실시하였다.
그 결과, LLC-GPC3 및 CTLL-2 양쪽의 세포가 존재하는 조건하에 있어서만 마우스 IFN-γ의 높은 축적이 보였다(도 4). 이것은 GPC3 발현 세포와 결합한 복수의 상기 이중 특이성 항체에 의한 T세포 상 CD137의 회합화에 수반되는 T세포 활성화가 일어나고 있는 것이라고 생각되었다(도 3).
또한 상기 이중 특이성 항체의 Fc부분을 FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 인간 IgG2형(GPC3 ERY22-G2-1D8) 및 인간 IgG4형(GPC3 ERY22-G4-1D8)으로 바꾼 경우의 활성을 도 5에 나타낸다. 항체의 서브클래스를 바꿔도 CD137 아고니스트 활성에 큰 차이는 없었다.
이들 결과로부터, FcγR에 대한 결합을 감소시킨 암 항원(본 실시예에서는 GPC3)과 CD137에 대한 이중 특이성 항체는 암 항원을 발현한 세포(암세포 등)가 존재하고 있을 때 비로소 T세포 상 CD137의 회합화가 일어나 아고니스트 활성을 발휘할 수 있는 것이 확인되었다. 즉 암 항원이 존재하지 않는 정상조직에 있어서는 T세포가 활성화되지 않기 때문에 부작용을 저감 내지는 회피할 수 있다고 생각된다.
〔실시예 3〕항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체와 항인간 GPC3/항마우스 CD3 이중 특이성 항체의 혼합물에 의한 T세포 활성화 증강작용
3-1． 콘셉트
항CD137 아고니스트 항체는 T세포를 활성화함으로써 항종양 효과를 발휘하는 것이 알려져 있는 한편, 항CD137 아고니스트 항체는 단일 제제로는 그 효과가 낮은 것이 알려져 있다. 이에 항암 항원/항CD137 이중 특이성 항체에 의한 T세포의 활성화 능력을 증강시켜 보다 강한 항종양 효과를 발휘하기 위해 동일하게 T세포를 활성화하는 약제와 병용하는 것을 검토하였다. 항암 항원/항CD3 이중 특이성 항체는 T세포를 암 항원에 리다이렉트하여 T세포에 의해 암세포에 대해 세포상해활성을 발휘하는 것이 가능한 한편, 항암 항원/항CD3 이중 특이성 항체도 단일 제제로는 반드시 그의 항종양 효과가 높지만은 않다. 이에 항암 항원/항CD137 이중 특이성 항체와 항암 항원/항CD3 이중 특이성 항체를 병용함으로써 상승적인 T세포 활성화 능력과 항종양 효과를 발휘할 수 없을지 검토하였다.
3-2． GPC3 ERY22 -3-1 D8 , GPC3 ERY22 -3-2 C11 의 제작
항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체인 GPC3 ERY22-3-1D8 및 항인간 GPC3/항마우스 CD3 이중 특이성 항체 GPC3 ERY22-3-2C11을 제작하였다. GPC3 ERY22-3-1D8은 실시예 2-1에서 제작한 이중 특이성 항체 GPC3 ERY22-1D8의 불변영역에 대해 보다 정제를 간편화하기 위한 당업자 공지의 개변을 가한 것이다. 구체적으로는 항인간 GPC3측 H쇄 불변영역 유전자 GC33(2)H-G1dKnHS에 대해 정제를 간편화하기 위한 당업자 공지의 개변인 H435R 개변을 가한 GC33(2)H-G1dKnHSG3(서열번호：48)를 제작하였다. 또한 이에 수반하여 항마우스 CD137측 H쇄 불변영역 유전자 1D8VH-G1dHlFS에서 FLAG 태그를 제거한 1D8VH-G1dHlS(서열번호：47)를 제작하였다. 또한 항마우스 CD3 항체의 H쇄 가변영역으로서 2C11VH(서열번호：49)의 서열을 사용해 2C11VH-G1dHlS(서열번호：50)를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 항인간 GPC3 측으로서 GC33(2)L-k0, 항마우스 CD137 측으로서 1D8VL-k0, 항마우스 CD3 측으로서 2C11VL-k0(서열번호：51)를 사용해 이들 항체를 표 4의 조합으로 발현하여 목적의 이중 특이성 항체를 얻었다. 또한 이들 항체의 발현은 참고예 1에 따라 FreeStyle293 세포에서 일과성 발현시켰다. 얻어진 배양상청을 MabSelect SuRe 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가하고 당해 칼럼을 세정한 후, 50 mM 초산에 의한 용출을 실시하였다. 항체를 포함하는 분획을 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사) 또는 Ni Sepharose FF 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가하고 당해 칼럼을 세정한 후, 이미다졸에 의한 용출을 실시하였다. 항체를 포함하는 분획을 한외여과막으로 농축한 후, 농축액을 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가하고 그 용출액의 단량체 항체만을 회수함으로써 정제 항체를 얻었다.
Figure pct00004
또한 비교 대조로서 같은 항인간 GPC3 항체로 FcγR에 대한 결합을 감소시킨 GC33(2)-G1dS를 제작하였다. GC33(2)-G1dS는 CrossMab 기술을 사용하지 않은 천연형 항인간 GPC3 항체로, FcγR에 대한 결합을 감소시킨 불변영역을 갖는 것이다. 구체적으로는 항체 H쇄 가변영역으로서 GC33(2)H2(서열번호：52)를 갖고, 항체 H쇄 불변영역으로서 G1d에 대해 L234A, L235A, N297A를 도입한 GC33(2)H2-G1dS(서열번호：53)를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 GC33(2)L2-k0(서열번호：54)를 사용하고, 참고예 1의 방법에 따라 발현, 정제함으로써 GC33(2)H2-G1dS/GC33(2)L2-k0를 얻었다. 이후 간략화를 위해 본 항체를 GC33(2)-G1dS로 기재한다.
3-3． 항인간 GPC3 / 항마우스 CD137 이중 특이성 항체와 항인간 GPC3 / 항마우스 CD3 이중 특이성 항체의 혼합물에 의한 생체 외 T세포 활성화 증강작용의 평가
나이브 C57BL/6 암컷 마우스로부터 비장을 채취하여 FBS 10%를 포함하는 RPMI1640 배지에 10 ng/㎖ 마우스 IL2를 첨가한 배지에서 세포를 4×106 세포/㎖의 밀도로 현탁하였다. 또한 인간 GPC3를 발현하는 마우스 대장암 세포주 CT26-GPC3(참고예 3)를 같은 배지에서 4×105 세포/㎖의 밀도로 현탁하였다. 양 세포 현탁액을 같은 양씩 혼합하여 100 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 웰의 일부에는 추가로 0.5 ㎍/㎖ 이오노마이신 및 10 ng/㎖ PMA를 첨가하였다. 거기에 FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체(GPC3 ERY22-1D8) 및 FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 항인간 GPC3/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(GPC3 ERY22-2C11：GPC3 ERY22-3-2C11에서 H435R 개변을 원래대로 돌려놓은 것)를 3 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후의 상청을 회수하여 포함되는 마우스 IFN-γ 농도를 ELISA에 의해 측정함으로써 비장세포에 포함되는 T세포의 활성화를 평가하였다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech사)의 지시에 따라 실시하였다.
그 결과(도 6), 1D8-MB492 및 GPC3 ERY22-1D8은 이오노마이신 및 PMA 첨가의 경우에 있어서 IFN-γ 유도활성을 나타내었다. 이것은 마이토젠 등의 자극에 의해 비장 T세포에 있어서 CD137이 유도된 결과라고 추찰되었다. 그리고 GPC3 ERY22-1D8 및 GPC3 ERY22-2C11의 혼합물에 있어서는 IFN-γ의 높은 축적이 보였다. 이것은 CD3 자극과 CD137 자극을 동시에 행함으로써 T세포의 활성화가 강하게 야기되어 있는 것을 시사하고 있다.
〔실시예 4〕항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체의 항종양 효과 및 간장에 대한 독성의 경감작용
4-1． 항인간 GPC3 / 항마우스 CD137 이중 특이성 항체와 항마우스 CD137 항체와의 약효 비교
인간 GPC3를 발현하는 재조합 마우스 대장암 세포주 CT26-GPC3(참고예 3)를 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)로 5×106 세포/mL로 조제하고, BALB/c 마우스(암컷, 7주령, 일본 찰스·리버사)의 복부 피하에 200 ㎕(1×106 세포) 이식하였다. 무작위로 5마리씩 5군으로 군을 나눈 뒤, 이식 3일 후, 7일 후, 10일 후, 17일 후에 꼬리정맥 주사에 의해 항체를 투여하였다. 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체(GPC3 ERY22-3-1D8)는 용매(150 mM NaCl, 20 mM His-HCl을 포함하는 수용액(pH 6.0)을 0.22 ㎛ 필터를 통과시킨 것)로 0.75 ㎎/mL, 0.15 ㎎/mL로 조제하여 10 mL/㎏로 투여하였다(각각 7.5 ㎎/㎏, 1.5 ㎎/㎏). 항마우스 CD137 항체(1D8-MB492)는 용매로 1.5 ㎎/mL, 0.3 ㎎/mL로 조제하여 10 mL/㎏으로 투여하였다(각각 15 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏). 종양증식 억제율(%)은 아래의 식으로부터 산출한 종양 체적에 의해 평가하였다.
종양 체적(㎣)=장경(㎜)×단경(㎜)×단경(㎜)/2
종양증식 억제율(%)=[1 - (T - T0)/(C - C0)] × 100
　T：각 군의 각 측정일의 평균 종양 체적
　T0：각 군의 초회 투여일의 평균 종양 체적
　C：대조군의 각 측정일의 평균 종양 체적
　C0：대조군의 초회 투여일의 평균 종양 체적
도 7에 나타내어지는 바와 같이, 항체를 투여한 어느 군에 있어서도 종양증식 억제율이 95% 이상인 강한 항종양 효과를 나타내었다. 즉, 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체는 항마우스 CD137 항체와 마찬가지로 강한 항종양 효과를 나타내며, 암 항원 의존적으로 CD137을 활성화한 경우에도 강한 항종양 효과를 발현하는 것이 나타내어졌다.
4-2． CT26 - GPC3 피하 이식 모델에서의 항인간 GPC3 /마우스 CD137 이중 특이성 항체에 의한 간손상(liver damage) 저감
항체 투여 약효시험의 종료 시에 마취하 전채혈에 의해 안락사 처치를 실시 후, 혈장을 분리하였다. 혈장을 사용하여 아스파라긴산 아미노트랜스페라아제(AST；JSCC Transferable법), 알라닌 아미노트랜스페라아제(ALT；JSCC Transferable법), 총 빌리루빈(TBIL；효소법)을 자동분석장치 TBA-120FR(도시바 메디컬시스템즈 주식회사)을 사용해서 측정하였다. 부검 시에 간장을 채취하여 10% 중성 완충 포르말린액에 고정하고, 통상의 방법에 따라 파라핀 포매 얇게 자른 조직표본(헤마톡실린·에오신(HE))을 제작하여 광학현미경으로 병리조직학적으로 관찰하였다. 통계해석은 대조군에 대한 비모수 던네트형 다중 비교 검정(non-parametric Dunnett's multiple comparison test)에 의해 행하였다.
그 결과 도 8 내지 도 11에 나타내어지는 바와 같이, 항마우스 CD137 항체(1D8-MB492) 투여군에 있어서는 어느 용량에 있어서도 혈중 AST, ALT 및 TBIL의 증가 또는 증가 경향이 확인되고, 병리조직학적으로는 경미 내지 경도의 간세포의 변성·괴사, 염증 등의 간손상이 전체 예에서 보였다. 한편 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체(GPC3 ERY22-3-1D8) 투여군에서는 혈중 AST, ALT 및 TBIL에 있어서 간손상에 기인하는 것으로 생각되는 변화는 확인되지 않고, 병리조직학적으로는 경미한 간세포의 변성·괴사 또는 염증이 각 용량군에서 5 예 중 2 내지 3 예에서 보여 간손상은 경감되어 있었다. 또한 같은 항체 3 ㎎/㎏ 투여군의 1 예에 있어서 혈중 AST 및 ALT의 현저한 증가가 확인되었으나, 혈중 TBIL에는 변화가 보이지 않고 간장의 병리조직학적 관찰에서는 간손상을 시사하는 소견은 보이지 않았던 것으로부터, 본 효소의 유래는 간손상에 기인하는 것은 아니라고 판단되었다.
이상의 결과로부터, 항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체 GPC3 ERY22-3-1D8은 통상의 항CD137 아고니스트 항체에서 지금까지 보고되어 있는 바와 같은 심각한 간손상을 일으키지 않고 강한 항종양 효과를 갖는 것이 나타내어졌다. 즉, FcγR에 대한 결합을 저감시킨 암 항원과 CD137에 대한 이중 특이성 항체는 암 항원 의존적으로 CD137 아고니스트 활성을 발휘하고, 종양 중에서만 T세포를 활성화함으로써 선택적으로 암세포에 대한 세포상해활성을 발휘하며, 정상조직에 있어서는 T세포를 활성화하지 않고 세포상해나 사이토카인 방출(cytokine release) 등의 부작용을 회피할 수 있었던 것으로 생각되었다.
〔실시예 5〕항인간 GPC3/항마우스 CD137 이중 특이성 항체와 항인간 GPC3/항마우스 CD3 이중 특이성 항체의 병용에 의한 항종양 효과
인간 GPC3를 발현하는 마우스 폐암 세포주 LLC-GPC3(참고예 3)를 HBSS로 5×106 세포/mL로 현탁하고, C57BL/6N 마우스(암컷, 6주령, 일본 찰스·리버사)의 복부 피하에 200 μL(1×106 세포) 이식하였다. 이식 10일 후에 종양 체적과 체중 데이터를 바탕으로 편중되지 않는 형태로 5마리씩 5군으로 군을 나누고 이식 10일 후, 14일 후, 17일 후에 꼬리정맥 주사에 의해 항체를 투여하였다. 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체(GPC3 ERY22-3-1D8)는 용매(150 mM NaCl, 20 mM His-HCl을 포함하는 수용액(pH 6.0)을 0.22 ㎛ 필터를 통과시킨 것)으로 0.5 ㎎/mL로 조제하여 10 mL/㎏으로 투여하였다(5 ㎎/㎏). 항인간 GPC3/마우스 CD3 이중 특이성 항체(GPC3 ERY22-3-2C11)는 용매로 0.45 ㎎/mL로 조제하여 10 mL/㎏으로 투여하였다(4.5 ㎎/㎏). 추가로 2종류의 항체를 병용 투여하는 군을 설정하였다. 종양증식 억제율(%)은 아래의 식으로부터 산출한 종양 체적에 의해 평가하였다.
　종양 체적(㎣)=장경(㎜)×단경(㎜)×단경(㎜)/2
　종양증식 억제율(%)=[1 - (T - T0)/(C - C0)] × 100
　T：각 군의 각 측정일의 평균 종양 체적
　T0：각 군의 초회 투여일의 평균 종양 체적
　C：대조군의 각 측정일의 평균 종양 체적
　C0：대조군의 초회 투여일의 평균 종양 체적　
도 12에 나타내어지는 바와 같이, 종양 이식 23일 후에 있어서의 종양증식 억제율은 항인간 GPC3/마우스 CD137 이중 특이성 항체 단독 투여군에서 36%, 항인간 GPC3/마우스 CD3 이중 특이성 항체 단독 투여군에서 29%였으나, 양 항체의 병용 투여군에서는 100%의 억제율을 나타내, 명확하게 상승적인 병용효과가 확인되었다.
또한 약효시험 종료 시에 4-2와 동일한 수법으로 혈장 중 간기능 파라미터(AST, ALT 및 TBIL)의 해석과 간장 조직 절편의 HE 염색에 의한 병리조직학적 해석을 행하였으나, 어느 투여군에 있어서도 간손상을 시사하는 변화는 확인되지 않았다.
이상으로부터 암 항원 및 CD137에 대한 이중 특이성 항체와 암 항원 및 CD3에 대한 이중 특이성 항체의 병용에 의해 종양 국소 특이적으로 CD137과 CD3를 동시에 회합화함으로써, 생체 외 시험에서 확인된 바와 같이 각각의 단독 자극에 있어서는 달성할 수 없었던 강한 T세포 활성화능을 발휘하고, 그로 인해 생체 내(in vivo)에 있어서도 각각 단일 제제로는 발휘되지 않았던 강한 항종양 효과를 발현하는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 6〕파지 디스플레이 기술을 사용한 인간 항체 라이브러리로부터의 인간 CD137에 결합하는 항체의 취득
6-1． 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작
인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나, 시판되어 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하고 당업자에게 공지인 방법에 따라 서로 상이한 인간 항체 서열의 Fab 도메인을 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.
6-2． 비드 패닝에 의한 나이브 인간 항체 라이브러리로부터의 인간 CD137 에 결합하는 항체의 취득
실시예 6-1에서 구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항원에 대한 결합활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 즉, 비드에 캡쳐된 항원에 대해 결합활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 수집되었다. 항원으로서 비오틴화 인간 CD137이 사용되었다. 구체적으로는 자기 비드(magnetic beads)에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용된다.
먼저, 구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 생산된 파지가 일반적인 방법에 의해 정제되었다. 그 후, TBS로 투석 처리된 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다.
그 후, 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴화 인간 CD137을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액과 인간 CD137을 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 인간 CD137과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBS로 1회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신용액 0.5 mL가 첨가된 비드가 실온에서 15분간 현탁된 뒤, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4~0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만히 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 패닝에 있어서도 인간 CD137에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 얻어진 파지 라이브러리액에 100 pmol의 비오틴화 인간 CD137을 첨가함으로써, 당해 파지 라이브러리액을 인간 CD137과 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 인간 CD137과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBST(0.1% Tween20을 포함하는 TBS)로 3회, TBS로 2회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신용액 0.5 mL가 첨가된 비드가 실온에서 15분간 현탁된 뒤, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4~0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만히 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
동일한 순서로 인간 CD137에 대해 결합 가능한 항체를 취득하는 패닝이 3회 반복되었다. 단, 4회째 패닝에는 40 pmol의 비오틴화 인간 CD137이 사용되었다.
6-3．합성 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작
당업자 공지의 방법에 의해 10종류의 중쇄 생식세포계열 서열(germline sequences), 7종류의 경쇄 생식세포계열 서열을 사용한 합성 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 사용한 생식세포계열 서열은 인간 B세포 레퍼토리에 있어서의 출현빈도, 가변영역 패밀리에서의 물리화학적 성질을 지표로 하여 VH1-2, VH1-69, VH3-23, VH3-66, VH3-72, VH4-59, VH4-61, VH4-b, VH5-51, VH6-1, Vκ1-39, Vκ2-28, Vκ3-20, Vλ1-40, Vλ1-44, Vλ2-14, Vλ3-21을 선택하였다. 인간 B세포의 항체의 레퍼토리를 본뜬 형태로 합성 항체 라이브러리의 항원 인식부위에 다양성을 부여하였다.
6-4． 비드 패닝에 의한 합성 인간 항체 라이브러리로부터의 인간 CD137 에 결합하는 항체의 취득
실시예 6-3에서 구축된 합성 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항원에 대한 결합활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 즉 비드에 캡쳐된 항원에 대해 결합활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 수집되었다. 항원으로서 비오틴화 인간 CD137이 사용되었다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 생산된 파지는 일반적인 방법에 의해 정제되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5M NaCl/10% PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.
그 후, 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴화 인간 CD137을 더함으로써 당해 파지 라이브러리액과 인간 CD137을 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 인간 CD137과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBS로 1회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신용액 0.5 mL가 첨가된 비드가 실온에서 15분간 현탁된 뒤, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4~0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만히 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 패닝에 있어서도 인간 CD137에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 얻어진 파지 라이브러리액에 100 pmol의 비오틴화 인간 CD137을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 인간 CD137과 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 인간 CD137과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBST로 3회, TBS로 2회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신용액 0.5 mL가 첨가된 비드가 실온에서 15분간 현탁된 뒤, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4~0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만히 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
동일한 순서로 인간 CD137에 대해 결합 가능한 항체를 취득하는 패닝이 3회 반복되었다. 단, 4회째 패닝에는 40 pmol의 비오틴화 인간 CD137이 사용되었다.
6-5．파지 ELISA 에 의한 인간 CD137 결합성 평가
전술한 실시예에서 나타내어진 패닝법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Method Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다.
TBS가 첨가된 파지가 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원(비오틴화 인간 CD137)을 포함하는 100 μL의 TBS로 실온에서 1시간 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST(0.1% Tween20을 포함하는 TBS)로 세정함으로써 플레이트에 결합하지 않은 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거하고, 그 후 각 웰에 조제된 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 항체를 제시한 파지를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. TBST로 세정된 각 웰에 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트하였다. TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 ㎚의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
파지 ELISA를 실시한 192 클론 중에서 인간 CD137에 대해 결합활성을 갖는 복수의 항체가 확인되었다. 파지 ELISA의 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure pct00005
6-6. 비오틴화 인간 CD137 결합 항체의 서열 해석
실시예 6-5에서 나타내어진 파지 ELISA의 결과, 인간 CD137에 대해 특이적인 결합활성이 있는 것으로 판단된 클론으로부터 특이적인 프라이머쌍(나이브 인간 항체 라이브러리：서열번호 55 및 56, 합성 인간 항체 라이브러리：서열번호 57 및 56)을 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다. 해석 결과, 인간 CD137에 대해 결합활성을 갖는 복수 종의 항체의 서열이 존재하고 있는 것이 확인되었다.
6-7．인간 CD137 결합 항체의 조제
실시예 6-6에서 취득된 비오틴 표지 인간 CD137에 대한 결합활성을 갖는 것으로 판단된 클론 중 나이브 인간 항체 라이브러리 유래의 5 클론(R1~R5) 및 합성 인간 항체 라이브러리 유래의 14 클론(R6~R19)의 중쇄 및 경쇄의 가변영역 서열을, 중쇄 항체 불변영역(인간 IgG1의 불변영역을 개변한 서열；서열번호：58) 또는 경쇄 카파(kappa) 불변영역 서열(서열번호：59) 또는 람다(lambda) 불변영역 서열(서열번호：60)과 연결하여 동물 발현용 플라스미드에 각각 삽입하였다. 각 클론의 중쇄 및 경쇄의 가변영역 서열을 표 6에 나타내었다.
Figure pct00006
각 항체는 참고예 1에 기재된 방법으로 발현·정제되었다. 또한 항인간 CD137 항체의 생체 외 T세포 활성화 작용을 증강시킬 목적으로, 표 6에 나타내어지는 VH영역과 인간 FcγRIIB에 대한 결합을 증강시킨 불변영역(서열번호 99)을 연결한 유전자를 제작하고, 동물세포 발현용 플라스미드 벡터에 삽입하여 가변영역의 조합이 표 6에 나타내어진 조합이 되도록 동일한 방법으로 항체를 발현·정제하였다.
〔실시예 7〕항인간 CD137 항체의 에피토프 해석
7-1．단편화 인간 CD137 - Fc 융합 단백질의 조제 및 항체의 조제
취득된 항인간 CD137 항체의 에피토프를 해석하기 위해 TNFRSF에 공통된 구조 및 J Exp Med. 2014 Jun 30；211(7):1433-48을 참고로 CRD라 불리는 Cys-Cys로 형성되는 구조로 도메인을 나눈 단편화 인간 CD137과 항체의 Fc영역의 융합 단백질을 제작하였다(표 7). 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질은 표 7에 나타내어져 있는 아미노산 서열을 포함하도록, 전장의 인간 CD137-Fc 융합 단백질(서열번호 100)을 코드하는 폴리뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 각 유전자 단편을 취득하고, 당업자 공지의 방법으로 동물세포 발현용 플라스미드 벡터에 삽입하였다. 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질은 참고예 1에 기재된 방법으로 항체와 동일하게 정제되었다. 또한 ELISA의 대조로서 WO2005/035584A1에 기재된 항인간 CD137 항체(B로 생략함)의 H쇄 불변영역을 인간 IgG1의 H쇄 불변영역 C 말단의 Gly 및 Lys를 제거한 불변영역으로 개변한 항체(H쇄 서열번호 101, L쇄 서열번호 102)와, WO2012/145183A3에 기재된 항인간 CD137 항체(M으로 생략함)의 불변영역을 인간 FcγRIIB에 대한 결합을 증강시킨 불변영역으로 개변한 항체(H쇄 서열번호 103, L쇄 서열번호 104)를 각각 코드하는 유전자를 동물세포 발현용 플라스미드 벡터에 삽입하고 참고예 1에 기재된 방법으로 항체를 취득하였다.
Figure pct00007
7-2-1．단편화 인간 CD137 - Fc 융합 단백질을 사용한 에피토프 해석
실시예 7-1에서 조제된 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질을 사용하여 전술한 실시예 6에서 얻어진 항체(중쇄 불변영역은 서열번호 99를 사용하였음)가 인간 CD137의 어느 부위에 결합하는지 ELISA법으로 결합 평가를 행하였다. 예를 들면 도메인 1에 결합하는 항체의 경우, 도메인 1을 포함하는 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질과는 결합하지만, 도메인 1을 포함하지 않는 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질과는 결합하지 않을 것으로 예상된다.
7-2-2． ELISA 법
단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질을 pH 9.6으로 조정되어 있는 탄산나트륨 수용액에 2 ㎍/mL가 되도록 희석하였다. 희석된 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질은 50 μL씩 눈크 맥시소프 플랫-바텀 96 웰 플레이트(Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate)(Nunc)의 각 웰에 첨가되었다. 4℃에서 하룻밤 이상 정치한 후 실온에 1시간 정치함으로써 플레이트를 실온과 같은 온도가 되도록 하였다. 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질을 포함하는 용액을 전도 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼(0.1% Tween20을 포함하는 TBS, TaKaRa) 300 μL로 3회 세정하였다. 계속해서 블로킹 버퍼(2% BSA를 포함하는 TBS)를 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 1시간 이상 정치하였다. 블로킹 버퍼를 전도 제거하고, 세정 버퍼로 각 웰을 앞의 공정과 마찬가지로 3회 세정한 후, 사전에 TBS로 10 ㎍/mL 또는 5 ㎍/mL로 희석한 항체용액을 각 웰에 50 μL씩 첨가하였다. 실온에서 1시간 600 rpm 정도의 속도로 고상화되어 있는 항원과 항체를 결합시켰다. 항체용액을 전도 제거 후, 세정 버퍼로 각 웰을 앞의 공정과 마찬가지로 3회 세정하였다. 0.1% Tween20을 포함하는 TBS로 1,000배로 희석된 2차 항체를 각 웰에 100 μL씩 첨가하였다. 또한 2차 항체는 카파(Kappa)쇄를 갖는 항체의 경우는 안티바디 알칼린 포스페이트 콘쥬게이트 휴먼 이뮤노글로불린 업조브드 고트 안티-휴먼 카파 알칼린 포스페이트(ANTIBODY ALKALINE PHOSPHATASE CONJUGATE HUMAN IMMUNOGLOBULIN ABSORBED Goat Anti-Human Kappa Alkaline Phosphate)(BIOSOURCE사)를 사용하고, 람다(Lambda)쇄를 갖는 항체의 경우는 휴먼 람다 라이트 체인 안티바디;고트 안티-휴먼 람다 라이트 체인 안티바디 알칼린 포스페이트 콘쥬게이티드(Human Lambda Light Chain Antibody；Goat anti-Human Lambda Light Chain Antibody Alkaline Phosphatase Conjugated)(BETHYL LABORATORIES.INC)를 사용하였다. 실온에서 정치하고 1시간 반응시킨 후 항체용액을 전도 제거하고, 세정 버퍼로 각 웰을 앞의 공정과 마찬가지로 3회 세정하였다. KPL사의 블루포스 마이크로웰 키트(BluePhos Microwell kit)를 사용하여 발색을 행하였다. KPL사의 AP 정지액(stop solution)을 사용하여 발색반응을 정지시킨 후 흡광광도계로 620 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 14에 나타낸다. 도 14에 나타내어지는 바와 같이 각 항체는 각각 단편화 인간 CD137-Fc 융합 단백질에 대해 상이한 발색값을 나타내, 인간 CD137-Fc 중 상이한 부분과 결합하고 있는 것이 나타내어졌다. 또한 취득된 항체는 기존의 항체 B나 M과는 상이한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 8〕항인간 CD137 항체의 생체 외 T세포 활성화 작용의 평가
시판 PBMC(AllCells사)로부터 디나비즈 휴먼 티-액티베이터 CD3/CD28(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28)(Gibco, 11132D)을 사용하여 T세포를 확대 배양하였다. 10% FBS, 60 U/㎖ 인간 IL2, 0.5 ㎍/㎖ 이오노마이신, 10 ng/㎖ PMA, 및 페니실린 및 스트렙토마이신을 소정 농도 포함하는 RPMI1640 배지에 인간 T세포를 4×105 세포/㎖의 밀도로 현탁하였다. 또한 인간 B세포 림프종주 Raji를 같은 배지에서 4×105 세포/㎖의 밀도로 현탁하였다. 양 세포 현탁액을 같은 양 씩 혼합하여 100 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 거기에 실시예 6에서 얻어진 인간 CD137 결합 항체(R1~R19；실시예 7에 기재한 ELISA와 같은 항체를 사용하였음)를 5 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 3일간 배양하였다. 배양 후의 배양상청을 회수하고, 포함되는 인간 IFN-γ 농도를 ELISA에 의해 측정함으로써 인간 T세포의 활성화를 평가하였다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech사)의 지시에 따라 실시하였다.
그 결과(도 15), 대조 인간 IgG(Allexis, 804-133-C100：도 15 중 hIgG)와 비교하여 R7, R15 이외의 클론은 모두 IFN-γ 유도활성을 나타내었다. 이들 IFN-γ 유도활성을 갖는 항체는 CD137에 대한 아고니스트 항체로 판단된다.
도 16에 얻어진 항체의 성질을 정리한 것을 나타낸다. 전술한 실시예에서 나타낸 항인간 CD137 항체인 B나 M과는 상이한 에피토프를 인식하는 항체가 다량 얻어졌다. 이들 항인간 CD137 항체를 GC33 항체(항인간 GPC3 항체)와의 이중 특이성 항체로 개변하여 암 항원(GPC3) 의존적 CD137 아고니스트능을 평가함으로써, 목적하는 항종양 효과를 발휘하는 항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체를 제공할 수 있다.
〔실시예 9〕항인간 GPC3/항마우스 CD40 이중 특이성 항체(GPC3 FAE-FGK45)의 제작
인간 IgG1의 불변영역을 갖는 항인간 GPC3/항마우스 CD40 이중 특이성 항체 GPC3 FAE-FGK45는 아래의 순서로 제작하였다. 항마우스 CD40 측에는 중쇄 가변영역으로서 FGK45VH6(서열번호 120), 경쇄 가변영역으로서 FGK45VL4(서열번호 121)를 사용하였다. 이때 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역에는 F760nG3P17(서열번호 119), k0(서열번호 118)를 각각 사용하였다. 항인간 GPC3 측의 항체로서는 중쇄 가변영역 H0000(서열번호 115) 및 경쇄 가변영역 GL4(서열번호 116)를 공통으로 사용하였다. 이때 불변영역은 Fcγ 수용체로의 결합을 저감시켜 2개의 중쇄가 헤테로 회합화 하도록 개변을 가한 중쇄 불변영역 F760nN17(서열번호 117), 경쇄 불변영역 k0(서열번호 118)를 사용하였다. 이들 항체를 아래의 방법을 사용하여 발현시켰다. 프리스타일 293 익스프레션 미디엄(FreeStyle 293 Expression Medium) 배지(Invitrogen)에 1.33×106 세포/mL의 세포밀도로 현탁하고, 파종한 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에 대해 조제된 플라스미드를 리포펙션법에 의해 도입하였다. CO2 인큐베이터(37℃, 8% CO2, 90 rpm)에서 4일간 배양한 배양상청으로부터 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences) 또는 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE HEALTHCARE)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 분광광도계를 사용하여 정제한 항체용액의 280 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 측정값으로부터 PACE법에 의해 산출한 흡광계수를 사용하여 정제한 항체의 농도를 산출하였다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423). 정제한 각각의 호모체를 표 8의 조합으로 혼합하여 당업자 공지의 수법(WO2015/046467)을 사용하여 목적의 이중 특이성 항체를 제작하였다.
Figure pct00008
〔실시예 10〕항인간 GPC3/항마우스 CD40 이중 특이성 항체와 항인간 GPC3/항마우스 CD3 이중 특이성 항체의 혼합물에 의한 생체 외 비장세포 활성화 증강작용의 평가
나이브 Balb/c 암컷 마우스로부터 비장을 채취하여 FBS 10%, 0.5 ㎍/㎖ 이오노마이신, 및 10 ng/㎖ PMA를 포함하는 RPMI1640 배지에 10 ng/㎖ 마우스 IL2를 첨가한 배지에서 세포를 4×106 세포/㎖의 밀도로 현탁하였다. 또한 인간 GPC3를 발현하는 마우스 대장암 세포주 CT26-GPC3(참고예 3)를 같은 배지에서 4×105 세포/㎖의 밀도로 현탁하였다. 양 세포 현탁액을 같은 양 씩 혼합하여 100 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 거기에 FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 항인간 GPC3/항마우스 CD40 이중 특이성 항체(GPC3 ERY22-FGK45)를 3 ㎍/㎖ 및 FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 항인간 GPC3/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(GPC3 ERY22-2C11)를 1 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 72시간 배양하였다. 배양 후의 상청을 회수하여 포함되는 마우스 IFN-γ 농도를 ELISA에 의해 측정함으로써 비장세포에 포함되는 T세포의 활성화를 평가하였다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech사)의 지시에 따라 실시하였다.
그 결과(도 17), GPC3 ERY22-2C11은 단일 제제로 IFN-γ 유도활성을 나타내는 한편, GPC3 ERY22-FGK45 단일 제제는 거의 활성을 나타내지 않았다. 그러나 GPC3 ERY22-FGK45 및 GPC3 ERY22-2C11의 혼합물에 있어서는 IFN-γ의 높은 축적을 볼 수 있었다. 이것은 다양한 면역세포 혼합물에 대해 CD3 자극과 CD40 자극을 동시에 행함으로써 결과적으로 T세포의 활성화가 강하게 야기되는 것을 시사하고 있다.
〔실시예 11〕항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체의 제작과 아고니스트 활성의 평가
11-1． 항인간 GPC3 / 항인간 CD137 이중 특이성 항체의 제작
인간 IgG1의 불변영역을 갖는 항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체는 아래의 순서로 제작하였다. 실시예 7에서 인간 CD137과의 결합이 확인된 서열(R3와 R5)로부터 중쇄 CDR3의 아미노산이 랜덤으로 바뀌도록 설계된 프라이머를 사용하여 개변하였다. 가변영역 서열을 표 9에 나타낸다. 이때 R3 및 R5로부터 개변한 경우, 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역에는 실시예 9에서 구축되어 있는 F760nG3P17 서열의 C 말단에 Gly-Lys("GK"로도 기재됨)를 부가한 서열, lambda 불변영역 서열(서열번호：60)을 각각 사용하였다. 항인간 GPC3 측의 항체로서는 중쇄 가변영역 H0000(서열번호 115) 및 경쇄 가변영역 GL4(서열번호 116)을 공통으로 사용하였다. 이때 불변영역은 Fcγ 수용체로의 결합을 저감시켜 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 중쇄 불변영역 F760nN17(서열번호 117), 경쇄 불변영역 k0(서열번호 118)를 사용하였다. 이들 항체를 아래의 방법을 사용하여 발현시켰다. 프리스타일 293 익스프레션 미디엄(FreeStyle 293 Expression Medium) 배지(Invitrogen)에 1.33×106 세포/mL의 세포밀도로 현탁하고, 파종한 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에 대해 조제된 플라스미드를 리포펙션법에 의해 도입하였다. CO2 인큐베이터(37℃, 8% CO2, 90 rpm)에서 4일간 배양한 배양상청으로부터 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences) 또는 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE HEALTHCARE)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 분광광도계를 사용하여 정제한 항체용액의 280 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 측정값으로부터 PACE법에 의해 산출한 흡광계수를 사용하여 정제한 항체의 농도를 산출하였다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423). 또한 항인간 CD137 항체(R3와 R5 유래)에 대해서는 E1%＝14로서 계산하였다. 표 9에 나타낸 바와 같이 실시예 9와 동일하게 정제한 항인간 GPC 항체와 인간 CD137 항체 각각의 호모체를 혼합하여 당업자 공지의 수법(WO2015/046467)을 사용하여 목적의 이중 특이성 항체를 제작하였다.
Figure pct00009
11-2． 항인간 GPC3 / 항인간 CD137 이중 특이성 항체의 GPC3 의존적인 생체 외 CD137 아고니스트 작용의 평가
시판 PBMC(AllCells사)로부터 디나비즈 휴먼 티-액티베이터 CD3/CD28(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28)(Gibco, 11132D)을 사용하여 T세포를 확대 배양하였다. 10% FBS, 60 U/㎖ 인간 IL2, 0.5 ㎍/㎖ 이오노마이신, 10 ng/㎖ PMA, 및 페니실린 스트렙토마이신을 소정 농도 포함하는 RPMI1640 배지에 인간 T세포를 4×105 cells/㎖의 밀도로 현탁하였다. 또한 인간 GPC3를 발현하는 마우스 대장암 세포주 CT26-GPC3(참고예 3)를 같은 배지에서 4×105 cells/㎖의 밀도로 현탁하였다. 양 세포 현탁액을 같은 양 씩 혼합하여 100 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 거기에 대조 인간 IgG(Allexis, 804-133-C100：도 18 중 Ctrl hIgG1) 또는 전항 11-1에서 조제된 GPC3 FAE-BMS(FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체)를 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 3일간 배양하였다. 배양 후의 상청을 회수하여 포함되는 인간 IFN-γ 농도를 ELISA에 의해 측정함으로써 T세포의 활성화를 평가하였다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech사)의 지시에 따라 실시하였다.
그 결과(도 18), 항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체는 IFN-γ 유도활성을 나타내었다. 이것은 인간 T세포에 있어서도 실시예 2에서 나타내어진 마우스 T세포를 사용한 경우와 동일하게 CD137 자극을 행함으로써 T세포의 활성화가 강하게 야기되는 것을 시사하고 있다.
11-3． 항인간 GPC3 / 항인간 CD137 이중 특이성 항체의 GPC3 의존적인 생체 외 CD137 아고니스트 작용의 평가
인간 CD137은 B세포주 HDML-2에도 발현하고 있어 CD137의 아고니스트 활성은 HDML-2를 사용해도 측정할 수 있다. 20% FBS 및 페니실린 스트렙토마이신을 소정 농도 포함하는 RPMI1640 배지에, 인간 B세포 암세포주 HDLM-2를 8×105 cells/㎖의 밀도로 현탁하였다. 또한 인간 GPC3를 발현하는 마우스 대장암 세포주 CT26-GPC3(참고예 3)를 같은 배지에서 4×105 cells/㎖의 밀도로 현탁하였다. 양 세포 현탁액을 같은 양 씩 혼합하여 100 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 거기에 대조 인간 IgG(Allexis, 804-133-C100：도 19 중 Ctrl hIgG1) 또는 전항 11-1에서 조제된 FcγR에 대한 결합을 매우 감소시킨 항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체를 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 3일간 배양하였다. 배양 후의 상청을 회수하여 포함되는 인간 IL-6 농도를 ELISA에 의해 측정함으로써 B세포의 활성화를 평가하였다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech사)의 지시에 따라 실시하였다.
그 결과(도 19), 항인간 GPC3/항인간 CD137 이중 특이성 항체는 IL-6 유도활성을 나타내었다. 이것은 인간 B세포주에 있어서도 실시예 2에서 나타내어진 마우스 T세포를 사용한 경우나 실시예 11-2에서 나타내어진 인간 T세포를 사용한 경우와 마찬가지로 CD137 자극을 평가할 수 있는 것이 나타내어졌다.
실시예 11-2와 11-3으로부터, 인간 CD137도 마우스 CD137로 행한 실시예 2 내지 5에 나타낸 결과와 마찬가지로 이중 특이성 항체로 아고니스트 활성을 갖는 것이 나타나, 마우스 CD137과 동일한 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명에 의해 암 항원 비의존적으로 사이토카인 발작(cytokine storm)이나 정상조직 손상 등에 의한 독성을 갖지 않고, 안전성이 높으며, 또한 우수한 항종양 활성을 갖는 새로운 항원 결합 분자 또는 의약 조성물이 제공되었다. 본 발명의 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물이 암 항원 의존적으로 면역세포를 활성화함으로써 암세포를 포함하는 다양한 세포를 표적으로 하는 세포상해 작용을 초래하여 다양한 암을 치료 또는 예방하는 것이 가능하다. 환자에 있어서도 안전성이 높을 뿐만 아니라 신체적 부담이 적고 이용 편리성도 높은 바람직한 치료가 가능해진다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Immune activating antigen-binding molecule <130> C1-A1401Y1P <150> JP 2014-078457 <151> 2014-04-07 <150> JP 2014-264589 <151> 2014-12-26 <160> 125 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 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62 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Leu Asn Pro Ser Ile Ala Ala Arg Pro Gly Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Thr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met 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<400> 65 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Thr Gly Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 66 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 66 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 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325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 104 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 104 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu 85 90 95 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 105 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 106 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys 35 <210> 107 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr 1 5 10 15 Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu 20 25 30 Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys 35 40 <210> 108 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys 1 5 10 15 Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys 20 25 30 <210> 109 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys 1 5 10 15 Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn 20 25 30 Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu 35 40 45 Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro 50 55 60 Gly His Ser Pro Gln 65 <210> 110 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys 85 90 <210> 111 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys 50 55 60 <210> 112 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr 1 5 10 15 Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu 20 25 30 Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His 35 40 45 Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly 50 55 60 Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe 65 70 75 80 Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu 85 90 95 Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val 100 105 110 Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln 130 135 140 <210> 113 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr 1 5 10 15 Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu 20 25 30 Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His 35 40 45 Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly 50 55 60 Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys 65 70 <210> 114 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys 1 5 10 15 Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys 20 25 30 Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg 35 40 45 Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly 50 55 60 Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser 65 70 75 80 Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly 85 90 95 His Ser Pro Gln 100 <210> 115 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 115 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 116 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 116 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 117 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 117 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 118 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 118 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 119 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 119 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 120 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 120 Glu Val Gln Val Val Glu Ser Asp Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg His Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 121 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 121 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Asp Ser Val Ser Thr Leu Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp 65 70 75 80 Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 122 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 122 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 123 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 123 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 124 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 124 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Thr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Pro Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 125 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 125 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ile Gly Asn His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (42)

  1. 아래의 도메인：
    (1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
    (2) 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인
    을 포함하는 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자.
  3. 제2항에 있어서,
    FcRn 결합 도메인이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 항체의 Fc영역인 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인이 CD137 결합 도메인인 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,　
    이중 특이성 항체인 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    세포상해를 유도하는 조성물인 의약 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    암 치료용 조성물인 의약 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 제1 항원 결합 분자와, 아래의 도메인：
    (1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
    (2) T세포 수용체 복합체 결합 도메인
    을 포함하는 제2 항원 결합 분자를 조합하여 이루어지는 의약 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    제2 항원 결합 분자가 FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인 의약 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    FcRn 결합 도메인이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 항체의 Fc영역인 의약 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T세포 수용체 결합 도메인인 의약 조성물.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인 의약 조성물.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,　
    제2 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인 의약 조성물.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,　
    제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 배합되어 있는 의약 조성물.
  16. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 병용되는 의약 조성물.
  17. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 동시에 투여되는 의약 조성물.
  18. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 분자와 제2 항원 결합 분자가 따로따로 투여되는 의약 조성물.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포상해를 유도하는 조성물인 의약 조성물.
  20. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 치료용 조성물인 의약 조성물.
  21. 아래의 도메인：
    (1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
    (2) 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인
    을 포함하는 제1 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는,
    아래의 도메인：
    (1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
    (2) T세포 수용체 복합체 결합 도메인
    을 포함하는 제2 항원 결합 분자와 병용하기 위한 의약 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    세포상해를 유도하는 조성물인 의약 조성물.
  23. 제21항에 있어서,
    암 치료용 조성물인 의약 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자가 FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인 의약 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    FcRn 결합 도메인이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 항체의 Fc영역인 의약 조성물.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인이 CD137 결합 도메인 또는 CD40 결합 도메인인 의약 조성물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T세포 수용체 결합 도메인인 의약 조성물.
  28. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인 의약 조성물.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인 의약 조성물.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 분자와 동시에 투여되는 의약 조성물.
  31. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,　
    제2 항원 결합 분자와 따로따로 투여되는 의약 조성물.
  32. 아래의 도메인：
    (1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
    (2) T세포 수용체 복합체 결합 도메인
    을 포함하는 제2 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는,
    아래의 도메인：
    (1) 암 특이적 항원 결합 도메인, 및
    (2) 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인
    을 포함하는 제1 항원 결합 분자와 병용하기 위한 의약 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    세포상해를 유도하는 조성물인 의약 조성물.
  34. 제32항에 있어서,
    암 치료용 조성물인 의약 조성물.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,　
    제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자가 FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인 의약 조성물.
  36. 제35항에 있어서,
    FcRn 결합 도메인이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 저하되어 있는 항체의 Fc영역인 의약 조성물.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T세포 수용체 결합 도메인인 의약 조성물.
  38. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    T세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인 의약 조성물.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 슈퍼패밀리 결합 도메인 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 결합 도메인이 CD137 결합 도메인 또는 CD40 결합 도메인인 의약 조성물.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 분자 및/또는 제2 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인 의약 조성물.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,　
    제1 항원 결합 분자와 동시에 투여되는 의약 조성물.
  42. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 분자와 따로따로 투여되는 의약 조성물.
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