KR20170017916A - 면역 억제 기능을 갖는 세포에 대한 t 세포 리다이렉트 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

(1) 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인과, (2) T 세포 수용체 복합체에 결합하는 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포와 T 세포를 가교하여, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 상해를 유도하는 것에 의해, 종래의 항원 결합 분자보다도 우수한 항종양 효과를 발휘한다는 것을 발견했다.

Description

면역 억제 기능을 갖는 세포에 대한 T 세포 리다이렉트 항원 결합 분자{T CELL-REDIRECTED ANTIGEN-BINDING MOLECULE FOR CELLS HAVING IMMUNOSUPPRESSION FUNCTION}
본 발명은, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포를 상해하는 것에 의해, 암의 치료를 가능하게 하는 항원 결합 분자, 당해 항원 결합 분자를 포함하는 다양한 암종을 치료하기 위한 의약 조성물 또는 당해 의약 조성물을 이용하는 암의 치료 방법에 관한 것이다.
항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고, 부작용도 적기 때문에 의약품으로서 주목받고 있다. 그 중에서도 IgG형의 항체 의약은 다수 상시(上市)되어 있고, 현재도 수많은 항체 의약이 개발되고 있다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2).
항체 의약을 이용한 암 치료약으로서 지금까지 CD20 항원에 대한 리툭산, EGFR 항원에 대한 세툭시마브, HER2 항원에 대한 허셉틴 등이 승인되어 있다(비특허문헌 3). 이들 항체 분자는, 암 세포에 발현하고 있는 항원에 결합하여, ADCC 등에 의해 암 세포에 대한 상해 활성을 발휘한다.
이와 같이 직접 암 세포에 대해서 상해 활성을 나타내는 항체 의약에 대해서, 최근, CTLA4에 대한 IgG1형의 항체인 이필리무마브가 전이성 멜라노마에 대해서 주효하다는 것이 확인되어 2011년에 FDA의 승인을 받았다. 고형암의 미소 환경 에 있어서는, 종양을 인식하는 이펙터 T 세포가 암 미소 환경의 다양한 인자에 의해 억제되고 있다는 것이 알려져 있다(비특허문헌 4). 그 중에서도 면역 체크 포인트 분자인 CTLA4는 T 세포의 활성화를 억제하는 기능을 갖는다는 것이 알려져 있고, 활성화된 이펙터 T 세포 및 제어성 T 세포에 있어서 강하게 발현되고 있다. 암 미소 환경에 있어서는, 종양을 인식하는 이펙터 T 세포가 CTLA4에 의해 억제되고 있다고 생각되고 있다. 이필리무마브는 CTLA4에 대한 중화 항체이며, 이펙터 T 세포의 활성화 억제를 저해하는 것에 의해, 종양을 인식하는 이펙터 T 세포를 활성화시켜, 항종양 효과를 발휘한다고 생각되고 있다(비특허문헌 5). 마찬가지로, 면역 체크 포인트 분자인 PD1에 대한 중화 항체인 니볼루마브도, PD1에 의해 억제되고 있는 종양을 인식하는 이펙터 T 세포를 활성화하는 것에 의해, 전이성 멜라노마에 대해서 높은 효과를 나타낸다는 것이 최근 보고되었다(비특허문헌 6). 또한, 암 미소 환경에 있어서는, 제어성 T 세포뿐만 아니라, 피폐 T 세포가 존재하고 있다는 것이 알려져 있고, 피폐 T 세포는 세포 상해 활성(항종양 활성)이 없을 뿐만 아니라, 종양 내의 면역 억제에 공헌하고 있다는 것이 알려져 있다(비특허문헌 7).
이와 같이 면역 체크 포인트 분자에 대한 항체 의약은, 면역 체크 포인트 분자의 T 세포 억제 작용을 저해함으로써 항종양 효과를 발휘한다고 생각되고 있었다. 그렇지만, 최근, 이필리무마브와 같은 CTLA4에 대한 항체의 항종양 효과는, CTLA4에 대한 중화 효과에 의하는 것일 뿐만 아니라, CTLA4 발현 세포에 대한 항체 의존적 세포 상해 활성(ADCC 활성)이 중요하다는 것이 보고되었다(비특허문헌 8, 9). 종양 미소 환경에 있어서는, 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포가 CTLA4를 강하게 발현하고 있다는 것이 알려져 있고, ADCC 활성을 갖는 항CTLA4 항체는 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포를 죽일 수 있다고 생각된다. 비특허문헌 8, 9에 있어서, ADCC 활성을 갖는 항CTLA4 항체는 마우스에 있어서, 종양 중의 제어성 T 세포를 제거하여, 강한 항종양 효과를 발휘하지만, 아미노산 치환에 의해 ADCC 활성을 없앤 항CTLA4 항체는 종양 중의 제어성 T 세포를 제거할 수 없어 항종양 효과를 발휘할 수 없었다.
이와 같이, ADCC 활성이 항CTLA4 항체의 항종양 효과에 중요한 역할을 하여, ADCC 활성에 의해 제어성 T 세포를 죽이는 것이 중요한 작용 기서라는 것이 발견되어 있다.
한편, 항체에 의한 ADCC 활성은, 그의 Fc 영역이 Fcγ 수용체와 결합하는 것에 의해 발휘된다. 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 영역의 아미노산을 치환(개변)하는 것에 의해 Fcγ 수용체와의 결합을 강화하는 것에 의해, ADCC 활성을 증강하는 것이 가능하다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10). 실제, Fc 영역의 개변에 의해 ADCC 활성을 증강한 항CD19 항체는, 천연형 항CD19 항체보다 강한 항종양 효과를 발휘했다(비특허문헌 10).
이러하기 때문에, 항CTLA4 항체에 대해서, Fc 영역의 개변에 의해 ADCC 활성을 증강할 수 있으면, 보다 강하게 종양 중의 제어성 T 세포를 제거할 수 있어 강한 항종양 효과를 발휘할 수 있다고 생각된다.
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E. & Ansell, S. M. Intratumoral CD4+CD25+ regulatory T-cell-mediated suppression of infiltrating CD4+ T cells in B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood 107, 3639-3646, doi:10.1182/blood-2005-08-3376 (2006).
본 발명은 상기와 같은 정황에 비추어 이루어진 것으로, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포를 상해함으로써, 우수한 항종양 효과를 발휘하는 항원 결합 분자를 제공하는 것, 및 당해 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물, 또는 당해 의약 조성물에 의한 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인 및 T 세포 수용체(TCR) 복합체에 결합하는 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포를 상해하여, 지금까지의 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포의 표면에 발현하는 분자에 결합하고 또한 ADCC 활성을 갖는 항원 결합 분자보다도 우수한 항종양 활성을 발휘한다는 것을 발견했다. 또한, 당해 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함함으로써, 다양한 암종을 치료하는 것이 가능한 의약 조성물을 발견했다.
즉, 본 발명은 이하를 제공하는 것이다.
〔1〕 하기의 도메인;
(1) 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인, 및
(2) T 세포 수용체 복합체에 결합하는 도메인
을 포함하고, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 면역 응답 억제 활성을 저해하는 항원 결합 분자.
〔2〕 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포가, 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포인, 〔1〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔3〕 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자가, CTLA4, PD1, TIM3, LAG3, CD244(2B4), CD160, GARP, OX40, CD137(4-1BB), CD25, VISTA, BTLA, TNFR25, CD57, KLRG1, CCR2, CCR5, CCR6, CD39, CD73, CD4, CD18, CD49b, CD1d, CD5, CD21, TIM1, CD19, CD20, CD23, CD24, CD38, CD93, IgM, B220(CD45R), CD317, PD-L1, CD11b, Ly6G, ICAM-1, FAP, PDGFR, Podoplanin 및 TIGIT로부터 선택되는 어느 하나의 분자인, 〔1〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔4〕 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자가, CTLA4, TIM3, LAG3, CD137(4-1BB), CD25, CCR5, CCR6, CD38, TIGIT, 및 OX40로부터 선택되는 어느 하나의 분자인, 〔3〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔5〕 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T 세포 수용체 결합 도메인인, 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔6〕 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인, 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔7〕 FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는, 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔8〕 FcRn 결합 도메인이, 항체의 Fc 영역인, 〔7〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔9〕 FcRn 결합 도메인이, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 항체의 Fc 영역인, 〔8〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔10〕 다중 특이성 항체인, 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔11〕 〔1〕 내지 〔10〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는, 의약 조성물.
〔12〕 〔1〕 내지 〔10〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는, 면역 응답의 억제 활성을 저해하기 위한 의약 조성물.
〔13〕 면역 응답의 억제 활성의 저해가, T 세포에 의한 저해인, 〔12〕에 기재된 의약 조성물.
〔14〕 T 세포에 의한 저해가, T 세포의 세포 상해 활성에 의한 저해인, 〔13〕에 기재된 의약 조성물.
〔15〕 면역 응답의 억제 활성이, 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포에 의한 활성인, 〔12〕 내지 〔14〕 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔16〕 면역 응답의 억제 활성이, CTLA4, PD1, TIM3, LAG3, CD244(2B4), CD160, GARP, OX40, CD137(4-1BB), CD25, VISTA, BTLA, TNFR25, CD57, KLRG1, CCR2, CCR5, CCR6, CD39, CD73, CD4, CD18, CD49b, CD1d, CD5, CD21, TIM1, CD19, CD20, CD23, CD24, CD38, CD93, IgM, B220(CD45R), CD317, PD-L1, CD11b, Ly6G, ICAM-1, FAP, PDGFR, Podoplanin 및 TIGIT로부터 선택되는 어느 하나의 분자를 발현하는 세포의 활성인, 〔12〕 내지 〔14〕 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔17〕 암 치료제인, 〔11〕 내지 〔16〕 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔18〕 난소암, 위암, 식도암, 췌장암, 신장세포암, 간세포암, 유방암, 악성 흑색종, 비소세포 폐암, 자궁경암, 교아종, 전립선암, 신경아종양, 만성 림프성 백혈병, 갑상선 유두암, 대장암, 호지킨 림프종 및 자궁 내막증으로부터 선택되는 어느 하나의 암의 치료제인, 〔17〕에 기재된 의약 조성물.
〔19〕 상기 〔1〕∼〔10〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 상기 〔11〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, 세포 장애를 유도하거나, 세포 증식을 억제하거나, 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 종양 조직에 대한 면역을 활성화하거나, 또는 암을 치료 또는 예방하는 방법.
〔20〕 세포 장애의 유도, 세포 증식의 억제, 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 종양 조직에 대한 면역의 활성화, 또는 암 치료 또는 예방에 있어서 사용하기 위한 상기 〔1〕∼〔10〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 상기 〔11〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔21〕 상기 〔11〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물의 제조에 있어서의, 상기 〔1〕∼〔10〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 사용.
〔22〕 상기 〔1〕∼〔10〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 사용하는 공정을 포함하는, 상기 〔11〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물을 제조하는 방법.
또한, 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 의약 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법 또는 면역 응답의 억제를 저해하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는, 본 발명의 방법에 이용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자의, 면역 응답의 억제를 저해하기 위한 의약 조성물의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 의약 조성물에 관한 것이다.
도 1은 암 세포 상에 발현하는 암 항원과 T 세포 상에 발현하는 CD3에 대한 이중 특이성 항체에 의한 암 세포 상해 활성을 나타내는 개념도이다.
도 2a는 항CD3 항체에 의한 상이한 T 세포 상의 CD3간의 가교에 의한 T 세포간 가교를 나타내는 개념도이다.
도 2b는 항CD3 항체에 의한 동일 T 세포 상의 CD3간의 가교를 나타내는 개념도이다.
도 3은 항CTLA4/CD3 이중 특이성 항체에서는, 동일 제어성 T 세포 상의 CTLA4와 CD3에 있어서의 가교가 일어나는 것에 의해, 이펙터 T 세포와 제어성 T 세포의 세포간 가교는 일어나지 않는 것을 나타내는 개념도이다. 본 개념도에서는 표적 세포가 제어성 T 세포이며 항원이 CTLA4라고 기재되어 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
도 4는 항CTLA4/CD3 이중 특이성 항체에 의한 이펙터 T 세포 상의 CD3과 제어성 T 세포 상의 CTLA4 사이의 가교에 의한 세포간 가교를 나타내는 개념도이다. 본 개념도에서는 표적 세포가 제어성 T 세포이며 항원이 CTLA4라고 기재되어 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
도 5는 항마우스 CTLA4 항체 hUH02hUL01-mFa55의 마우스 CTLA4 발현 세포에 대한 ADCC 활성을 나타내는 도면이다.
도 6은 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)의 마우스 CTLA4 발현 세포에 대한 세포 상해 활성을 나타내는 도면이다.
도 7a는 마우스 CTLA4 결합 비드와 마우스 CD3 결합 비드의, 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체에 의한 가교의 개념도이다.
도 7b는 마우스 CTLA4 결합 비드와 마우스 CD3 결합 비드의, 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체에 의한 가교 실험의 결과(N=3)를 나타낸 도면이다. 그래프는 각 측정 결과의 평균치와 표준 편차를 나타내고 있다.
도 7c는 마우스 CTLA4/마우스 CD3 결합 비드와 마우스 CD3 결합 비드의, 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체에 의한 가교 실험의 결과를 나타낸 도면이다. 그래프는 각 측정 결과의 평균치와 표준 편차를 나타내고 있다.
도 7d는 마우스 CTLA4/마우스 CD3 결합 비드와 마우스 CD3 결합 비드의, 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체에 의한 가교의 개념도이다.
도 8은 항마우스 CTLA4 항체(hUH02hUL01-mFa55, ADCC 증강 항체) 및 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760, T 세포 리다이렉트 항체(T cell redirecting antibody))의 종양내 투여(i.t.)에 의한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT에 대한 in vivo 항종양 효과를 나타내는 도면이다(각 군 n=2, 플롯은 각 개체의 종양 체적을 나타낸다).
도 9는 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2 11-F760, T 세포 리다이렉트 항체)의 종양내 투여(i.t.) 및 정맥내 투여(i.v.)에 의한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT에 대한 in vivo 항종양 효과를 나타내는 도면이다(각 군 n=5, 플롯은 각 군의 종양 체적 평균치+표준 편차를 나타낸다).
도 10a는 건상인(健常人) 유래의 PBMC에 대해서, 컨트롤 항체(control) 및 항인간 CTLA4/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 CD4 양성 세포를 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10b는 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 컨트롤 항체(control) 및 항인간 CTLA4/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 계산된 CD4 양성 T 세포 중의 제어성 T 세포(Treg)의 비율을 나타내는 도면이다.
도 10c는 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 컨트롤 항체(control) 및 항인간 CTLA4/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 계산된 이펙터 T 세포(Teff)와 제어성 T 세포(Treg)의 비(Teff/Treg)를 나타내는 도면이다.
도 11a는 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 컨트롤 항체(control) 및 항인간 CTLA4/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, FoxP3 및 CD45RA 발현에 기초하여 CD4 양성 세포를 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11b는 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 컨트롤 항체(control) 및 항인간 CTLA4/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, FoxP3 및 CD45RA 발현에 기초하여 계산된 CD4 양성 T 세포 중의 제어성 T 세포(Treg)의 비율을 나타내는 도면이다.
도 11c는 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 컨트롤 항체(control) 및 항인간 CTLA4/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, FoxP3 및 CD45RA 발현에 기초하여 계산된 이펙터 T 세포(Teff)와 제어성 T 세포(Treg)의 비(Teff/Treg)를 나타내는 도면이다.
도 12는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 잔기와 kabat의 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX라고도 불린다)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 13은 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 항인간 LAG3/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 4 또는 6일간 반응 후, CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 CD4 양성 세포를 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 항인간 LAG3/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 4 또는 6일간 반응 후, CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 계산된 CD4 양성 T 세포 중의 제어성 T 세포(Treg)의 비율을 나타내는 도면이다.
도 15는 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 항인간 LAG3/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 4 또는 6일간 반응 후, CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 계산된 CD4 양성 T 세포 중의 이펙터 T 세포(Teff)와 제어성 T 세포(Treg)의 비(Teff/Treg)를 나타내는 도면이다.
도 16은 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 항인간 OX40/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 CD4 양성 세포를 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 항인간 OX40/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, CD25 및 CD45RA 발현에 기초하여 계산된 CD4 양성 T 세포 중의 제어성 T 세포(Treg)의 비율을 나타내는 도면이다.
도 18은 건상인 유래의 PBMC에 대해서, 항인간 OX40/항인간 CD3 이중 특이성 항체(TRAB)를 7일간 반응 후, CD25 및 CD45RA 발현에 기초하여 계산된 CD4 양성 T 세포 중의 이펙터 T 세포(Teff)와 제어성 T 세포(Treg)의 비(Teff/Treg)를 나타내는 도면이다.
이하의 정의는, 본 명세서에 있어서 설명하는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해서 제공된다.
항원 결합 분자
본 발명에 있어서의 「항원 결합 분자」란 본 발명의 「결합 도메인」을 포함하는 분자이면 특별히 한정되지 않고, 또한 5아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩타이드나 단백질이 포함되어 있어도 된다. 생물 유래의 펩타이드나 단백질로 한정되지 않고, 예를 들어 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩타이드여도 된다. 또한, 천연 폴리펩타이드, 또는 합성 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드 등 중 어느 것이어도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자의 바람직한 예로서 항체의 Fc 영역에 포함되는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 들 수 있다. 생체 내에 투여된 단백질의 혈중 반감기를 늘리는 방법으로서 목적 단백질에 항체의 FcRn 결합 도메인을 부가하여 FcRn을 통한 리사이클링 기능을 이용하는 방법이 잘 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 「FcRn 결합 도메인」은 FcRn에 대해서 결합 활성을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않으며, FcRn에 직접 결합하는 도메인이어도 되고, 간접적으로 결합하는 도메인이어도 된다. FcRn에 직접 결합하는 도메인으로서는, 예를 들어, FcRn을 항원으로 하는 항체의 가변 영역, Fab, 항체의 Fc 영역, 이들의 단편, 알부민, 알부민 도메인 3, 인간 혈청 알부민(HSA), 트랜스페린 등을 들 수 있다. 또한, FcRn과 간접적으로 결합하는 도메인으로서는, 예를 들어, 전술한 FcRn에 직접 결합하는 도메인에 대해서 결합 활성을 갖는 도메인을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양의 하나로서 항체의 Fc 영역, 또는 Fc 영역 내의 FcRn 결합 영역을 포함하는 단편을 들 수 있다. 여기에서, 「Fc 영역」으로서, 예를 들어, 천연형 IgG 유래의 Fc 영역을 이용할 수 있다. 천연형 IgG란, 천연에서 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 면역 글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그 자체에서 자연히 생기는 변이체 등도 포함된다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 항체의 정상(定常) 영역으로서는, 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242에 기재되어 있지만, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다. 특히 인간 IgG1의 서열로서는, EU 넘버링 356∼358번째의 아미노산 서열이 DEL이어도 EEM이어도 된다.
항체의 Fc 영역으로서는, 예를 들어 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 타입의 Fc 영역이 존재하고 있다. 본 발명의 항체의 Fc 영역은, 예를 들어 천연형 인간 IgG 항체 유래의 Fc 영역을 이용할 수 있다. 본 발명의 Fc 영역으로서 예를 들어, 천연형 IgG의 정상 영역, 구체적으로는, 천연형 인간 IgG1을 기원으로 하는 정상 영역(서열번호: 1), 천연형 인간 IgG2를 기원으로 하는 정상 영역(서열번호: 2), 천연형 인간 IgG3을 기원으로 하는 정상 영역(서열번호: 3), 천연형 인간 IgG4를 기원으로 하는 정상 영역(서열번호: 4) 유래의 Fc 영역을 이용할 수 있다. 천연형 IgG의 정상 영역에는 그 자체에서 자연히 생기는 변이체 등도 포함된다.
이와 같은 항체의 Fc 영역은, 예를 들어 단일클론 항체 등의 항체를 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, 단편을 프로틴 A 컬럼, 또는 프로틴 G 컬럼에 흡착시킨 후에, 적절한 용출 버퍼 등에 의해 용출시키는 것에 의해 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정하는 것에 의해 단일클론 항체 등의 항체를 소화할 수 있는 것이면 특별히 한정은 되지 않으며, 예를 들어 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
항체의 아이소타입은, 정상 영역의 구조에 의해 결정된다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 아이소타입의 정상 영역은, 각각 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4로 불리고 있다. 인간 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4의 Fc 영역을 구성하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열이, 서열번호: 5, 6, 7, 8로 예시된다. 각 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기와 kabat의 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX라고도 불림)의 관계는 도 12에 나타내어져 있다.
Fc 영역은 2개의 경쇄 및 쇄간의 다이설파이드 결합이 2개의 중쇄 사이에서 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인 간의 정상 영역의 일부분을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 F(ab')2를 제외한 영역을 말한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자를 구성하는 Fc 영역은, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, 프로틴 A 컬럼에 흡착된 획분을 재용출하는 것에 의해 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정하는 것에 의해 제한적으로 F(ab')2를 생성하도록 전장(全長) 항체를 소화할 수 있는 것이면 특별한 한정은 되지 않고, 예를 들어, 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 FcRn 결합 도메인으로서는, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 도메인이 바람직하다. 여기에서, Fcγ 수용체(본 명세서에서는 Fcγ 리셉터, FcγR 또는 FcgR이라고 기재하는 경우가 있다)란, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 Fc 영역에 결합할 수 있는 수용체를 말하며, 실질적으로 Fcγ 리셉터 유전자에 코드되는 단백질의 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간에서는, 이 패밀리에는, 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131(H형) 및 R131(R형)을 포함함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. FcγR은, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이 유래의 것이 포함되지만, 이들로 한정되지 않고, 어떠한 생물 유래라도 된다. 마우스 FcγR류에는, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16) 및/또는 FcγRIIIb(CD16)를 들 수 있다.
FcγR에는, ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)을 갖는 활성형 리셉터와 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)을 갖는 억제형 리셉터가 존재한다. FcγR은 FcγRI, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 활성형 FcγR과 FcγRIIb의 억제형 FcγR로 분류된다.
FcγRI의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 NM_000566.3 및 NP_000557.1에, FcγRIIa의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 BC020823.1 및 AAH20823.1에, FcγRIIb의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 BC146678.1 및 AAI46679.1에, FcγRIIIa의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 BC033678.1 및 AAH33678.1에, 및 FcγRIIIb의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 BC128562.1 및 AAI28563.1에 기재되어 있다(RefSeq 등록번호). 한편, FcγRIIa에는, FcγRIIa의 131번째의 아미노산이 히스티딘(H형) 또는 아르기닌(R형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990). 또한, FcγRIIb에는, FcγRIIb의 232번째의 아미노산이 아이소류신(I형) 또는 트레오닌(T형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002)). 또한, FcγRIIIa에는, FcγRIIIa의 158번째의 아미노산이 발린(V형) 또는 페닐알라닌(F형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)). 또한, FcγRIIIb에는, NA1형, NA2형의 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990)).
Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는지 여부는, FACS, ELISA 포맷, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등, 주지된 방법에 따라 확인할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은, 도너와 억셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리에 기초하여 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가, 억셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여, 2개의 비드가 근접한 상태일 때에만, 발광 시그널이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드 내의 포토센서타이저는, 주변의 산소를 여기 상태의 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소는 도너 비드 주변으로 확산하여, 근접하고 있는 억셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광 반응을 야기하여, 최종적으로 광이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 억셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는, 도너 비드가 산생하는 일중항 산소가 억셉터 비드에 도달하지 않기 때문에, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들어, 항원 결합 분자가 FcRn 결합 도메인으로서 항체의 Fc 영역을 포함하는 경우, 야생형 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체에 대한 결합을 변화시키기 위한 아미노산 변이가 가해진 변이 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 준비하고, 도너 비드에 비오틴 표지된 항원 결합 분자를 결합시키고, 억셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체를 결합시킨다. 변이 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자의 존재하에서는, 야생형 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620nm의 시그널을 생성한다. 변이 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 태그화하지 않는 경우, 야생형 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체간의 상호작용과 경합한다. 경합의 결과 나타나는 형광의 감소를 정량하는 것에 의해 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항원 결합 분자를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 이용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는, Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오타이드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터를 보지한 세포 등에 있어서 발현시키고, 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 시그널은 예를 들어 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시키는 것에 의해 적합하게 해석된다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서 칩의 금박막 상에 고정하고, 센서 칩의 뒤쪽으로부터 금박막과 유리의 경계면에서 전반사되도록 광을 조사하면, 반사광의 일부에 반사 강도가 저하된 부분(SPR 시그널)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(애널라이트)을 센서 칩의 표면에 흐르게 하여 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여 센서 칩 표면의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화에 의해, SPR 시그널의 위치가 시프트한다(역으로 결합이 해리되면 시그널의 위치는 되돌아간다). Biacore 시스템은 상기의 시프트하는 양, 즉 센서 칩 표면에서의 질량 변화를 세로축으로 하고 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 키네틱스: 결합 속도 상수(ka)와 해리 속도 상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 어피니티(KD)가 구해진다. BIACORE법에서는 저해 측정법도 적합하게 이용된다. 저해 측정법의 예는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 기재되어 있다.
본 명세서에 있어서, 「Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있다」란, 예를 들어, 상기의 해석 방법에 기초하여, 대조(컨트롤)로 하는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자의 결합 활성과 비교하여, 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.
대조로 하는 항원 결합 분자로서는, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 단일클론 항체의 Fc 영역을 포함하는 도메인을 갖는 항원 결합 분자가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc 영역의 구조는, 서열번호: 1(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N 말단에 A 부가), 서열번호: 2(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N 말단에 A 부가), 서열번호: 3(RefSeq 등록번호 CAA27268.1의 N 말단에 A 부가), 서열번호: 4(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N 말단에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한, 어떤 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 영역의 변이체를 갖는 항원 결합 분자를 피검 물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 이용하는 것에 의해, 당해 변이체가 갖는 변이에 의한 Fcγ 수용체로의 결합 활성에 대한 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 것이 검증된 Fc 영역의 변이체를 갖는 항원 결합 분자가 적절히 제작된다.
이와 같은 변이체의 예로서는, EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산인 231A-238S의 결실(WO 2009/011941), C226S, C229S, P238S, (C220S)(J. Rheumatol (2007) 34, 11), C226S, C229S(Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54), C226S, C229S, E233P, L234V, L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192) 등의 변이체가 공지이다.
즉, 특정 아이소타입의 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 하나의 아미노산: 220번 위치, 226번 위치, 229번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 325번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치가 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. Fc 영역의 기원인 항체의 아이소타입으로서는 특별히 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 단일클론 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 적절히 이용될 수 있지만, 천연형 인간 IgG1 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 적합하게 이용된다.
예를 들어, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다):
(a) L234F, L235E, P331S,
(b) C226S, C229S, P238S,
(c) C226S, C229S,
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A
이 실시되어 있는 Fc 영역, 또는 231번 위치에서 238번 위치의 아미노산 서열이 결실된 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG2 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다):
(e) H268Q, V309L, A330S, P331S
(f) V234A
(g) G237A
(h) V234A, G237A
(i) A235E, G237A
(j) V234A, A235E, G237A
이 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG3 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다):
(k) F241A
(l) D265A
(m) V264A
이 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG4 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다):
(n) L235A, G237A, E318A
(o) L235E
(p) F234A, L235A
이 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
그 외의 바람직한 예로서, 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 하나의 아미노산: 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 331번 위치가, 대응하는 IgG2 또는 IgG4에 있어서 그 EU 넘버링이 대응하는 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 들 수 있다.
그 외의 바람직한 예로서, 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 하나 또는 그 이상의 아미노산: 234번 위치, 235번 위치, 297번 위치가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 234번 위치, 235번 위치, 297번 위치의 어느 하나 또는 그 이상의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자가 특히 바람직하다.
그 외의 바람직한 예로서, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 265번 위치의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 265번 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자가 특히 바람직하다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 「면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인」 및 「T 세포 수용체 복합체 결합 도메인」(이하, 이들 결합 도메인을 통틀어 항원 결합 도메인이라고 함)은, 각각의 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하는 영역을 의미하며, 그와 같은 결합 도메인으로서, 예를 들어, 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 영역을 결합 도메인으로서 들 수 있다. 항원의 분자량이 큰 경우, 항체의 항원 결합 영역은 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. 당해 특정 부분은 에피토프라 불린다. 항원 결합 도메인은 1 또는 복수의 항체의 가변 도메인으로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL)과 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는, 「scFv(single chain Fv)」, 「단쇄 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv 2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 등을 적합하게 들 수 있다.
여기에서, 「면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포」는, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 제어성 T 세포(regulatory T cell(Treg)), 피폐 T 세포(exhausetd T cell), MDSC(myeloma derived stromal cell), TAM(tumor associated macrophage), Tr1(induced regulatory T cell), TADC(tumor-associated dendritic cell), TAN(tumor-associated neutrophil), CAF(cancer-associated fibroblast), Breg(regulatory B cell) 등을 들 수 있고, 특히 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포가 본 발명의 대상 세포로서 바람직하다. 이들 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하는 분자로서는, 구체적으로는, 예를 들어, CTLA4, PD1, TIM3, LAG-3, CD244(2B4), CD160, GARP, OX40, CD137(4-1BB), CD25, VISTA, VISATA, BTLA, TNFR25, CD57, KLRG1, CCR2, CCR5, CCR6, CD39, CD73, CD4, CD18, CD49b, CD1d, CD5, CD21, TIM1, CD19, CD20, CD23, CD24, CD38, CD93, IgM, B220(CD45R), CD317, PD-L1, CD11b, Ly6G, ICAM-1, FAP, PDGFR, Podoplanin, TIGIT 등을 들 수 있다. 이들 분자 중, 본 발명의 결합 도메인의 대상이 되는 바람직한 분자로서는, 예를 들어, 면역 응답 억제 기능이 높다고 보고되어 있는 세포 획분(CD4+, CD25high, CD45RA-)에 특이적으로 발현하고 있는 세포 표면 분자인 CTLA4, TIM3, LAG3, CD137(4-1BB), CD25, CCR5, CCR6, CD38, 및 TIGIT를 들 수 있다. 본 발명의 결합 도메인의 대상이 되는 바람직한 분자로서는, 특히, CTLA4, LAG3, OX40을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「제어성 T 세포」란, 면역 응답의 억제적 제어를 맡는 T 세포의 일종을 의미한다. 당해 세포는, 과잉한 면역 응답을 억제하기 위한 음의 제어 기구나, 면역의 항상성 유지에 있어서 중요한 역할을 하고, CD4 또는 CD8을 발현하는 2종류의 제어성 T 세포(Treg)로 분류된다. CD4 Treg는 정상적으로 CD25와 FoxP3을 발현하고 있는 내재성 Treg 세포(natural Tregs 또는 nTregs)와 나이브 CD4 양성 T 세포로부터 분화하여 자기 인식능이 낮은 능동적 또는 유도적인 Treg(iTregs)로 분류된다. iTreg에는 Foxp3+ Treg와 Fop3- Treg가 존재하고, FoxP3- Treg는 타입 I Treg(Tr1)로 불린다. Tr1에 극히 유사한 성질을 가지는 Treg로서 CD4+CD25+LAG3+ Treg가 동정되어 있다(Proc Natl Acad Sci USA. 2009). 또한 Treg 세포에서는, CD127의 발현이 저하되어 있다는 것도 알려져 있고, CD127loCD25hi-int(CD127이 저발현, CD25가 고∼중간 정도의 발현을 나타내는 집단)의 분획은, Foxp3 양성의 모든 Treg 집단을 포함한다. CD8 Treg도 내재성 Treg와 유도성 Treg로 나눌 수 있다. 전자는 CD8+CD122+ Treg로서 분류되고 후자는 Qa-1a 구속성 CD8+ Treg로서 분류되고 있다. Treg는, 제어성의 분자를 발현한다는 것이 알려져 있고, CTLA4, PD1, TIM3, LAG3 등의 발현량이 상승하고 있어, 본 발명의 항원 결합 분자의 결합 도메인이 결합하는 분자로서는, 이와 같은 분자가 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서, 「피폐 T 세포」는, 지속적 항원 자극에 의해 사이토카인 산생이나 이펙터 기능이 현저하게 약해져, 증식능이나 장기 생존능이 저하된 T 세포를 의미한다. 이들 피폐 T 세포는 PD1 등의 제어성 리셉터와 제어성 사이토카인을 산생하기 때문에, 기능 부전뿐만 아니라, 면역 응답에 있어서 억제적으로도 작용한다. 피폐 T 세포는 주로 PD1의 발현이 상승되어 있다(Nature 439, 682-687 (2006)). 또한 PD1 외에, LAG-3, CD244(2B4), CD160, TIM-3, CTLA-4 등의 분자의 발현도 상승되어 있다(Nature Immunology Volume: 12, Pages: 492-499 Year published: (2011)). 본 발명의 항원 결합 분자의 결합 도메인이 결합하는 분자로서는, 이와 같은 분자가 바람직하다.
또한, 「T 세포 수용체 복합체」는, T 세포 수용체 자신이어도 되고, T 세포 수용체와 함께 T 세포 수용체 복합체를 구성하는 어댑터 분자여도 된다. 어댑터 분자로서 적합한 것은 CD3이다.
T 세포 수용체로서는, 가변 영역이어도 되고, 정상 영역이어도 되지만, 바람직한 T 세포 수용체 결합 도메인이 결합하는 에피토프는 정상 영역에 존재하는 에피토프이다. 정상 영역의 서열로서 예를 들어 RefSeq 등록번호 CAA26636.1의 T 세포 수용체 α쇄(서열번호: 9), RefSeq 등록번호 C25777의 T 세포 수용체 β쇄(서열번호: 10), RefSeq 등록번호 A26659의 T 세포 수용체 γ1쇄(서열번호: 11), RefSeq 등록번호 AAB63312.1의 T 세포 수용체 γ2쇄(서열번호: 12), RefSeq 등록번호 AAA61033.1의 T 세포 수용체 δ쇄(서열번호: 13)의 서열을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, T 세포 수용체 복합체 결합 도메인으로서 「CD3 결합 도메인」을 이용하는 경우, CD3 결합 도메인은 1 또는 복수의 항체의 가변 도메인으로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, CD3 결합 도메인은 CD3 항체의 경쇄 가변 영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 이러한 CD3 결합 도메인의 예로서는, 「scFv(single chain Fv)」, 「단쇄 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv 2)」, 「Fab」또는 「F(ab')2」 등을 적합하게 들 수 있다.
본 발명에 따른 CD3 결합 도메인은, 인간 CD3을 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄 서열에 존재하는 에피토프이면 어느 에피토프에 결합하는 것이어도 된다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 인간 CD3 복합체의 ε쇄의 세포외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 CD3 항체의 경쇄 가변 영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 CD3 결합 도메인이 적합하게 이용된다. 이러한 CD3 결합 도메인으로서는, OKT3 항체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4914-4917)나 각종 공지의 CD3 항체의 경쇄 가변 영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 CD3 결합 도메인이 적합하게 이용된다. 또한, 인간 CD3을 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄를 상기의 방법에 따라 소망하는 동물에 면역하는 것에 의해 취득된 소망하는 성질을 갖는 CD3 항체를 기원으로 하는 CD3 결합 도메인이 적절히 사용될 수 있다. CD3 결합 도메인의 기원이 되는 CD3 항체는 하기와 같이 적절히 인간화된 항체나 인간 항체가 적절히 이용된다. CD3을 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄의 구조는, 그 폴리뉴클레오타이드 서열이, 서열번호: 14(NM_000073.2), 16(NM_000732.4) 및 18(NM_000733.3)에, 그 폴리펩타이드 서열이, 서열번호: 15(NP_000064.1), 17(NP_000723.1) 및 19(NP_000724.1)에 기재되어 있다(괄호안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다).
또한, 본 발명의 「항원 결합 분자」의 바람직한 태양의 하나로서 본 발명의 항체의 가변 영역을 포함하는 항체를 들 수 있다.
항체
본 명세서에 있어서, 항체란, 천연의 것이거나, 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역 글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연에 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 산생하는 하이브리도마 세포의 배양 상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 이용하는 것에 의해 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역 글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 적합하게 들 수 있다. 인간의 면역 글로불린으로서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는, 이들 아이소타입 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 포함될 수 있다.
소망하는 결합 활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에 있어서 공지이며, 다중클론 또는 단일클론 항체로서 취득될 수 있다. 본 발명의 항체로서는, 포유동물 유래의 단일클론 항체가 적합하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 단일클론 항체에는, 하이브리도마에 의해 산생되는 것, 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환한 숙주 세포에 의해 산생되는 것 등이 포함된다.
항체 취득을 위해서 면역되는 포유동물로서는, 특정 동물로 한정되는 것은 아니지만, 하이브리도마 제작을 위한 세포 융합에 사용하는 부모세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로 설치류의 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼, 원숭이 등이 적합하게 사용된다.
공지의 방법에 따라 상기의 동물이 감작 항원에 의해 면역된다. 예를 들어, 일반적인 방법으로서, 감작 항원이 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사에 의해 투여되는 것에 의해 면역이 실시된다. 구체적으로는, PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리 식염수 등으로 적당한 희석 배율로 희석된 감작 항원이, 소망에 따라 통상의 아주반트, 예를 들어 프로인트 완전 아쥬반트와 혼합되고, 유화된 후에, 해당 감작 항원이 포유동물에 4 내지 21일마다 수회 투여된다. 또한, 감작 항원의 면역 시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩타이드가 감작 항원으로서 이용되는 경우에는, 알부민, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌 등의 담체 단백질과 결합한 해당 감작 항원 펩타이드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.
또한, 소망하는 항체를 산생하는 하이브리도마는, DNA 면역을 사용하여, 이하와 같이 해도 제작될 수 있다. DNA 면역이란, 면역 동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역 동물 중에서, 감작 항원이 당해 면역 동물의 생체 내에서 발현되는 것에 의해, 면역 자극이 주어지는 면역 방법이다. 단백질 항원이 면역 동물에 투여되는 일반적인 면역 방법과 비교하여, DNA 면역에는, 다음과 같은 우위성이 기대된다.
- 막단백질의 구조를 유지하여 면역 자극이 주어질 수 있다
- 면역 항원을 정제할 필요가 없다
DNA 면역에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 얻기 위해서, 우선, 항원 단백질을 발현하는 DNA가 면역 동물에 투여된다. 항원 단백질을 코드하는 DNA는, PCR 등의 공지의 방법에 따라 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되어 면역 동물에 투여된다. 발현 벡터로서는, 예를 들어 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터가 적합하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서 일반적으로 이용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 흡착한 금 입자가, gene gun으로 면역 동물 개체의 세포 내에 도입되는 것에 의해 DNA 면역이 행해진다.
이와 같이 포유동물이 면역되어, 혈청 중에 있어서의 항원에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역 세포가 채취되어 세포 융합에 제공된다. 바람직한 면역 세포로서는, 특히 비장 세포가 사용될 수 있다.
상기 면역 세포와 융합되는 세포로서 포유동물의 골수종 세포가 이용된다. 골수종 세포는, 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란, 특정의 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커에는, 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라제 결손(이하 HGPRT 결손으로 약칭함), 또는 티미딘키나제 결손(이하 TK 결손으로 약칭함) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 약칭함)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택 배지 중에서 DNA 합성을 행하지 못하고 사멸하지만, 정상적인 세포와 융합하면 정상 세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택 배지 중에서도 증식하게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는, 각각 6티오구아닌, 8아자구아닌(이하 8AG로 생략함), 또는 5'브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 포함하는 정상적인 세포는 사멸한다. 한편, 이들 피리미딘 아날로그를 포함하지 못하는 이들 효소를 결손한 세포는, 선택 배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생 물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포 융합에 적합한 각종 골수종 세포가 공지이다.
이와 같은 골수종 세포로서, 예를 들어, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11(Cell(1976) 8 (3), 405-415), SP2/0(Nature(1978) 276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods(1980) 35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), R210(Nature(1979) 277 (5692), 131-133) 등이 적합하게 사용될 수 있다.
기본적으로는 공지의 방법, 예를 들어, 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 상기 면역 세포와 골수종 세포의 세포 융합이 행해진다.
보다 구체적으로는, 예를 들어 세포 융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 중에서, 상기 세포 융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 더욱 융합 효율을 높이기 위해서 소망에 따라 다이메틸설폭사이드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.
면역 세포와 골수종 세포의 사용 비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들어, 골수종 세포에 대해서 면역 세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 이용하는 배양액으로서는, 예를 들어, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 밖에, 이런 종류의 세포 배양에 이용되는 통상의 배양액이 사용되고, 추가로 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 적합하게 첨가될 수 있다.
세포 융합은, 상기 면역 세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하여 사전에 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들어 평균 분자량 1000 내지 6000 정도)이 통상 30 내지 60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합되는 것에 의해 소망하는 융합 세포(하이브리도마)가 형성된다. 그 다음에, 상기에서 든 적당한 배양액이 순서대로 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복하는 것에 의해 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등이 제거될 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 통상의 선택 배양액, 예를 들어 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양하는 것에 의해 선택될 수 있다. 소망하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데 충분한 시간(통상, 이러한 충분한 시간은 수일 내지 수주간이다) 상기 HAT 배양액을 이용한 배양이 계속될 수 있다. 그 다음에, 통상의 한계 희석법에 의해, 소망하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 세포 융합에 이용된 골수종이 갖는 선택 마커에 응한 선택 배양액을 이용하는 것에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양하는 것에 의해 선택될 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포 융합에 이용한 경우, HAT 배양액 중에서, 정상 세포와의 세포 융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식할 수 있다. 소망하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 이용한 배양이 계속된다. 구체적으로는, 일반적으로, 수일 내지 수주간의 배양에 의해, 소망하는 하이브리도마가 선택될 수 있다. 그 다음에, 통상의 한계 희석법에 의해, 소망하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.
소망하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이, 공지의 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝 방법에 의해 적합하게 실시될 수 있다. 소망하는 항체는, 예를 들어, FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는, 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석해, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정하는 것에 의해 세포 표면에의 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.
FACS에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는, 우선 산생되는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝을 위한 바람직한 세포는, 당해 항원을 강제 발현시킨 포유동물 세포이다. 숙주 세포로서 사용한 형질 전환되어 있지 않은 포유동물 세포를 대조로서 이용하는 것에 의해, 세포 표면의 항원에 대한 항체의 결합 활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉, 숙주 세포에 결합하지 않고, 항원을 강제 발현시킨 세포에 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하는 것에 의해, 소망하는 단일클론 항체를 산생하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.
또는 대상이 되는 항원을 발현한 세포를 고정화하여, 당해 항원 발현 세포에 대한 항체의 결합 활성이 ELISA의 원리에 기초하여 평가될 수 있다. 예를 들어, ELISA 플레이트의 웰에 항원 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양 상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜, 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 단일클론 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는, 항마우스 이뮤노글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들 스크리닝에 의해 선택된, 항원에 대한 결합능을 갖는 소망하는 항체를 산생하는 하이브리도마는, 한계 희석법 등에 의해 클로닝될 수 있다.
이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 산생하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양될 수 있다. 또한, 해당 하이브리도마는 액체 질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.
당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양 상청으로부터 소망하는 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그의 복수(腹水)로부터 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은, 고순도의 항체를 얻는데 적합한 것이다.
당해 하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 클로닝 되는 항체 유전자에 의해 코드되는 항체도 적합하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여 숙주에 도입하는 것에 의해, 당해 유전자에 의해 코드되는 항체가 발현한다. 항체 유전자의 단리와 벡터로의 도입, 그리고 숙주 세포의 형질 전환을 위한 방법은 예를 들어 Vandamme 등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조 방법도 또한 공지이다.
항체의 가변 영역(V 영역)을 코드하는 cDNA를 취득하기 위해서는, 통상, 우선 하이브리도마로부터 전체 RNA가 추출된다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서 예를 들어 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다.
- 구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
- AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
추출된 mRNA는 예를 들어 mRNA Purification Kit(GE 헬스케어바이오사이언스제) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 또는 QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어바이오사이언스제) 등과 같이, 세포로부터 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이와 같은 키트를 이용하여, 하이브리도마로부터 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 V 영역을 코드하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학공업사제) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 위해 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech제) 및 PCR을 이용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적절히 이용될 수 있다. 또한 이러한 cDNA의 합성의 과정에 있어서 cDNA의 양 말단에 후술하는 적절한 제한 효소 사이트가 도입될 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고, 그 다음에 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되고, 대장균 등에 도입되어 콜로니가 선택된 후에, 해당 콜로니를 형성한 대장균으로부터 소망하는 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고, 해당 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열을 가지고 있는지 여부에 대해서, 공지의 방법, 예를 들어, 다이데옥시뉴클레오타이드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인된다.
가변 영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는, 가변 영역 유전자 증폭용의 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 우선 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되어, 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적절히 이용된다.
얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR법에 따라 항체 유전자가 증폭된다. 공지의 항체 유전자 서열을 기초로 마우스 항체 유전자 증폭용의 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는, 이뮤노글로불린의 서브클래스마다 상이한 염기서열이다. 따라서, 서브클래스는 미리 Iso Strip 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(로슈·다이아그노스틱스) 등의 시판 키트를 이용하여 결정해 두는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들어 마우스 IgG를 코드하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때는, 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코드하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변 영역 유전자를 증폭하기 위해서는, 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변 영역에 가까운 정상 영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는, 5' RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속되는 프라이머가 이용된다.
이렇게 해서 증폭된 PCR 산물을 이용하여 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 이뮤노글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 이뮤노글로불린의, 항원에 대한 결합 활성을 지표로 하여, 소망하는 항체가 스크리닝될 수 있다. 예를 들어 다음과 같이 하여 스크리닝될 수 있다;
(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코드되는 V 영역을 포함하는 항체를 소망하는 항원 발현 세포에 접촉시키는 공정,
(2) 해당 항원 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정, 및
(3) 해당 항원 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.
항체와 해당 항원 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는, 앞서 기술한 FACS 등의 수법에 의해 항체와 해당 항원 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 해당 항원 발현 세포의 고정 표본이 적절히 이용될 수 있다.
결합 활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝 방법으로서, 파지 벡터를 이용한 패닝법도 적합하게 이용된다. 다중클론 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득한 경우에는 파지 벡터를 이용한 스크리닝 방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역을 코드하는 유전자는 적당한 링커 서열로 연결하는 것에 의해 싱글 체인 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv를 코드하는 유전자를 파지 벡터에 삽입하는 것에 의해, scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 소망하는 항원의 접촉 후에, 항원에 결합한 파지를 회수하는 것에 의해, 목적하는 결합 활성을 갖는 scFv를 코드하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라서 반복하는 것에 의해, 소망하는 결합 활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.
목적으로 하는 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양 말단에 삽입한 제한 효소 사이트를 인식하는 제한 효소에 의해 해당 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한 효소는, 항체 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1 카피의 소화 단편을 벡터에 올바른 방향으로 삽입하기 위해서는, 부착 말단을 부여하는 제한 효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 하여 소화된 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입하는 것에 의해, 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이 때, 항체 정상 영역(C 영역)을 코드하는 유전자와, 상기 V 영역을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되면, 키메라 항체가 취득된다. 여기에서, 키메라 항체란, 정상 영역과 가변 영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서, 마우스-인간 등의 이종 키메라 항체에 더하여 인간-인간 동종 키메라 항체도, 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 미리 정상 영역을 갖는 발현 벡터에, 상기 V 영역 유전자를 삽입하는 것에 의해, 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 소망하는 항체 정상 영역(C 영역)을 코드하는 DNA를 보지한 발현 벡터의 5'측에, 상기 V 영역 유전자를 소화하는 제한 효소의 제한 효소 인식 서열이 적절히 배치될 수 있다. 동일한 조합의 제한 효소로 소화된 양자가 인프레임으로 융합되는 것에 의해, 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.
단일클론 항체의 제조에는, 항체 유전자가 발현 제어 영역에 의한 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입된다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어 영역이란, 예를 들어, 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한, 발현한 항체가 세포 외로 분비되도록 적절한 시그널 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 발현된 폴리펩타이드로부터, 시그널 서열이 그의 카복실 말단 부분으로부터 절단되어 항체가 세포 외로 분비될 수 있다. 그 다음에, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주 세포가 형질 전환되는 것에 의해, 항체를 코드하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.
항체 유전자의 발현을 위해서, 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA는, 각각 다른 발현 벡터에 삽입된다. H쇄와 L쇄가 삽입된 벡터에 의해 같은 숙주 세포에 동시에 형질 전환(co-transfect)되는 것에 의해, H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA가 단일 발현 벡터에 삽입되는 것에 의해 숙주 세포가 형질 전환될 수 있다(국제 공개 WO 94/11523을 참조할 것).
단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입하는 것에 의해 항체를 제작하기 위한 숙주 세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들 발현계는, 모두 본 발명의 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인이나 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인을 단리하는데 응용될 수 있다.
진핵세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포, 또는 진균세포가 적절히 사용될 수 있다. 구체적으로는, 동물세포로서는, 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포: CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero 등
(2) 양서류세포: 아프리카발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포: sf9, sf21, Tn5 등
또는 식물세포로서는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질 전환에는, 캘러스 배양한 세포가 적절히 이용될 수 있다.
또한 진균세포로서는, 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
- 효모: 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속
- 사상균: 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 등의 아스페르길루스(Aspergillus)속
또한, 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들어, 세균 세포를 이용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균 세포가 적절히 이용될 수 있다. 이들 세포 중에, 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질 전환에 의해 도입된다. 형질 전환된 세포를 in vitro로 배양하는 것에 의해, 당해 형질 전환 세포의 배양물로부터 소망하는 항체가 취득될 수 있다.
재조합 항체의 산생에는, 상기 숙주 세포에 더하여, 형질전환 동물도 이용될 수 있다. 즉 소망하는 항체를 코드하는 유전자가 도입된 동물로부터, 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 유전자는, 유즙(乳汁) 중에 고유하게 산생되는 단백질을 코드하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입하는 것에 의해 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서, 예를 들어, 염소 β 카제인 등을 이용될 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배(胚)에 주입되고, 당해 주입된 배가 암컷 염소에게 도입된다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소(또는 그 자손)가 산생하는 유즙으로부터는, 소망하는 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한, 형질전환 염소로부터 산생되는 소망하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해서, 호르몬이 형질전환 염소에 대해 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자가 인간에 투여되는 경우, 예를 들어, 당해 분자에 있어서의 각종 결합 도메인으로서 항체의 가변 영역을 포함하는 도메인을 이용하는 경우는, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 항원 결합 도메인이 적절히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는, 예를 들어, 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변 항체는, 공지의 방법을 이용하여 적절히 제조된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자에 있어서의 각종 결합 도메인을 제작하기 위해서 이용되는 항체의 가변 영역은, 통상, 4개의 체제 영역(FR)에 끼워진 3개의 상보성 결정 영역(complementarity-determining region; CDR)으로 구성되어 있다. CDR은, 실질적으로, 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은, 상이한 결합 특이성을 가지는 항체 사이에서도, 높은 동일성을 나타내는 경우가 많다. 그 때문에, 일반적으로, CDR의 이식에 의해, 어느 항체의 결합 특이성을, 다른 항체에 이식할 수 있다고 여겨지고 있다.
인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는, 인간 이외의 동물, 예를 들어 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서 예를 들어 Overlap Extension PCR이 공지이다. Overlap Extension PCR에 있어서는, 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에, 이식할 마우스 항체의 CDR을 코드하는 염기서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR 각각에 대해 준비된다. 일반적으로, 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 있어서는, 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이, CDR의 기능의 유지에 있어서 유리하다고 여겨지고 있다. 즉, 일반적으로, 이식할 마우스 CDR에 인접하고 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 연결되는 염기서열은 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별적으로 합성된다. 그 결과, 각 FR에 마우스 CDR을 코드하는 DNA가 부가된 산물을 얻을 수 있다. 각 산물의 마우스 CDR을 코드하는 염기서열은, 서로 오버랩하도록 디자인되어 있다. 계속해서, 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 오버랩된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜 상보쇄 합성 반응을 행한다. 이 반응에 의해, 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 통하여 연결된다.
최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V 영역 유전자는, 그의 5' 말단과 3' 말단에 어닐링하여 적당한 제한 효소 인식 서열이 부가된 프라이머에 의해 그 전체 길이가 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C 영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입하는 것에 의해, 인간형 항체 발현용 벡터를 작성할 수 있다. 해당 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에, 해당 재조합 세포를 배양하고, 해당 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시키는 것에 의해, 해당 인간화 항체가 해당 배양 세포의 배양물 중에 산생된다(유럽 특허공개 EP 239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).
상기와 같이 제작한 인간화 항체의 항원에의 결합 활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하여 평가하는 것에 의해, CDR을 통하여 연결되었을 때에 해당 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환할 수도 있다. 예를 들어, 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 이용한 PCR법을 응용하여, FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는, FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이와 같은 프라이머에 의해 합성된 FR에는, 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원으로의 결합 활성을 상기의 방법으로 측정하여 평가하는 것에 의해 소망하는 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856).
또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역 동물로 하여 DNA 면역에 의해 소망하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리를 이용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들어, 인간 항체의 V 영역이 1본쇄 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하는 것에 의해, 항원에 결합하는 인간 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정될 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V 영역 서열을 소망하는 인간 항체 C 영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입하는 것에 의해 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 든 것과 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 해당 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시키는 것에 의해 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
파지 디스플레이법 이외에도, 인간 항체 라이브러리를 이용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술로서, 무세포 번역계를 사용하는 기술, 세포 또는 바이러스 표면에 항원 결합 분자를 제시하는 기술, 에멀션을 사용하는 기술 등이 알려져 있다. 예를 들어, 무세포 번역계를 사용하는 기술로서는, 종지 코돈의 제거 등에 의해 리보솜을 통하여 mRNA와 번역된 단백질의 복합체를 형성시키는 리보솜 디스플레이법, 퓨로마이신 등의 화합물을 이용하여 유전자 서열과 번역된 단백질을 공유결합시키는 cDNA 디스플레이법, mRNA 디스플레이법이나, 핵산에 대한 결합 단백질을 이용하여 유전자와 번역된 단백질의 복합체를 형성시키는 CIS 디스플레이법 등이 사용될 수 있다. 또한 세포 또는 바이러스 표면에 항원 결합 분자를 제시하는 기술로서는, 파지 디스플레이법 이외에도, E. coli 디스플레이법, 그람 양성균 디스플레이법, 효모 디스플레이법, 포유류세포 디스플레이법, 바이러스 디스플레이법 등이 사용될 수 있다. 에멀션을 사용하는 기술로서는, 에멀션 중에 유전자 및 번역 관련 분자를 내포시키는 것에 의한, 인비트로 바이러스 디스프레이법 등이 사용될 수 있다. 이들 방법은 이미 공지이다(Nat Biotechnol. 2000 Dec;18(12): 1287-92, Nucleic Acids Res. 2006;34(19): e127, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Mar 2;101(9): 2806-10, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jun 22;101(25): 9193-8, Protein Eng Des Sel. 2008 Apr;21(4): 247-55, Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26;97(20): 10701-5, MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5): 508-18, Methods Mol Biol. 2012;911:183-98).
본 발명에 있어서 「특이적」이란, 특이적으로 결합하는 분자의 한쪽 분자가 그 하나 또는 복수의 결합하는 상대쪽 분자 이외의 분자에 대해서는 전혀 유의한 결합을 나타내지 않는 상태를 말한다. 또한, 항원 결합 도메인이 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 이용된다. 또한, 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가 복수의 상이한 항원에 포함되는 경우에는, 당해 항원 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자는 당해 에피토프를 포함하는 다양한 항원과 결합할 수 있다.
또한 항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 「에피토프」는 본 명세서 에 있어서 개시되는 항원 결합 분자 중의 각종 결합 도메인이 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 따라서, 예를 들어 에피토프는 그 구조에 의해 정의될 수 있다. 또한, 당해 에피토프를 인식하는 항원 결합 분자 중의 항원에 대한 결합 활성에 의해서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 경우에는, 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한, 에피토프가 당쇄(糖鎖)인 경우에는, 특정의 당쇄 구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.
직선상 에피토프는, 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 직선상 에피토프는, 전형적으로는, 적어도 3개, 및 가장 보통으로는 적어도 5개, 예를 들어 약 8∼약 10개, 6∼20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.
입체 구조 에피토프는, 직선상 에피토프와는 대조적으로, 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이, 인식된 에피토프의 단일의 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들어, 아미노산의 1차 서열이, 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되지는 않는 에피토프)이다. 입체 구조 에피토프는, 직선상 에피토프에 대해서 증대한 수의 아미노산을 포함할지도 모른다. 입체 구조 에피토프의 인식에 관해서, 항체는, 펩타이드 또는 단백질의 삼차원 구조를 인식한다. 예를 들어, 단백질 분자가 절첩되어 삼차원 구조를 형성하는 경우에는, 입체 구조 에피토프를 형성하고 있는 아미노산 및/또는 폴리펩타이드 주쇄는, 병렬이 되어, 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체 구조를 결정하는 방법에는, 예를 들어 X선 결정학, 이차원 핵자기 공명 분광학 및 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성 공명 분광학이 포함되지만, 이들에는 한정되지 않는다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), 제66권, Morris(편)을 참조.
하기에 피험 항원 결합 분자에 의한 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자 중의 에피토프로의 결합의 확인 방법이 예시되지만, 다른 결합 도메인의 대상 항원 중의 에피토프로의 결합의 확인 방법도 하기의 예시에 준하여 적절히 실시될 수 있다.
예를 들어, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자로서 CTLA4를 선택한 경우, 당해 분자에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가, 해당 항원 분자 중에 존재하는 선상 에피토프를 인식하는 것은, 예를 들어 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기의 목적을 위해서 예를 들어 CTLA4의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상의 펩타이드가 합성된다. 당해 펩타이드는, 화학적으로 합성될 수 있다. 또는, CTLA4의 cDNA 중의, 세포외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코드하는 영역을 이용하여, 유전자 공학적 수법에 의해 얻을 수 있다. 다음에, 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩타이드와 CTLA4에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가된다. 예를 들어, 고정화된 선상 펩타이드를 항원으로 하는 ELISA에 의해, 당해 펩타이드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가될 수 있다. 또는, CTLA4를 발현하는 세포에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합에 있어서의, 선상 펩타이드에 의한 저해의 레벨에 기초하여, 선상 펩타이드에 대한 결합 활성이 밝혀질 수 있다. 이들 시험에 의해, 선상 펩타이드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 밝혀질 수 있다.
상기 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 입체 구조 에피토프를 인식하는 것은, 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 전술한 CTLA4에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 CTLA4 발현 세포에 접촉했을 때에 당해 세포에 강하게 결합하는 한편으로, 당해 항원 결합 분자가 고정화된 CTLA4의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩타이드에 대해서 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기에서, 실질적으로 결합하지 않는다란, 항원 발현 세포에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합 활성을 말한다.
항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원 발현 세포에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, Antibodies A Laboratory Manual에 기재된 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉, 항원 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리에 의해 평가될 수 있다.
ELISA 포맷에 있어서, 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원 발현 세포에 대한 결합 활성은, 효소 반응에 의해 생성되는 시그널 레벨을 비교하는 것에 의해 정량적으로 평가된다. 즉, 항원 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 항원 결합 분자를 가하고, 해당 세포에 결합한 피험 항원 결합 분자가, 피험 항원 결합 분자를 인식하는 효소 표지 항체를 이용하여 검출된다. 또는 FACS에 있어서는, 피험 항원 결합 분자의 희석 계열을 작성하여, 항원 발현 세포에 대한 항체 결합 역가(titer)를 결정하는 것에 의해, 항원 발현 세포에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교될 수 있다.
완충액 등으로 현탁한 세포 표면 상에 발현하고 있는 항원에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합은, 유동 세포 분석기에 의해 검출할 수 있다. 유동 세포 분석기로서는, 예를 들어 다음과 같은 장치가 알려져 있다.
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM (모두 BD Biosciences사의 상품명)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명)
예를 들어, 전술한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성의 적합한 측정 방법의 일례로서 다음의 방법을 들 수 있다. 우선, 항원을 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항원 결합 분자를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 항원 결합 분자를 적절히 적합한 완충액에 의해 희석하는 것에 의해, 당해 항원 결합 분자가 소망하는 농도로 조제되어 이용된다. 예를 들어, 10μg/ml에서 10ng/ml까지 사이의 어느 하나의 농도로 사용될 수 있다. 다음에, FACSCalibur(BD사)에 의해 형광 강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항체의 결합량은, CELL QUEST Software(BD사)를 이용하여 해석하는 것에 의해 얻어진 형광 강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻는 것에 의해, 피험 항원 결합 분자의 결합량에 의해 나타내어지는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 측정될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 어떤 항원 결합 분자와 에피토프를 공유하는 것은, 양자의 동일 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 항원 결합 분자간의 경합은, 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들어 경합 ELISA 어세이는, 바람직한 교차 블로킹 어세이이다.
구체적으로는, 교차 블로킹 어세이에 있어서는, 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 항원이, 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 존재하, 또는 비존재하에서 프리인큐베이트된 후에, 피험 항원 결합 분자가 첨가된다. 웰 중의 항원에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은, 동일 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 항원 결합 분자의 친화성이 커지면 커질수록, 피험 항원 결합 분자의 항원을 코트한 웰로의 결합 활성은 저하된다.
항원을 통하여 웰에 결합한 피험 항원 결합분의 양은, 미리 항원 결합 분자를 표지해 두는 것에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들어, 비오틴 표지된 항원 결합 분자는, 아비딘퍼옥시다제 컨주게이트와 적절한 기질을 사용하는 것에 의해 측정된다. 퍼옥시다제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는, 특히 경합 ELISA 어세이라고 한다. 항원 결합 분자는, 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는, 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.
후보인 경합 항원 결합 분자의 비존재하에서 실시되는 컨트롤 시험에 있어서 얻어지는 결합 활성과 비교하여, 경합 항원 결합 분자가, 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합을 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 20-50%, 더 바람직하게는 적어도 50% 블록할 수 있다면, 당해 피험 항원 결합 분자는 경합 항원 결합 분자와 실질적으로 동일 에피토프에 결합하거나, 또는 동일 에피토프로의 결합에 대해서 경합하는 항원 결합 분자이다.
본 발명의 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 구조가 동정되어 있는 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합분이 에피토프를 공유하는 것은, 당해 에피토프를 구성하는 펩타이드에 아미노산 변이를 도입한 펩타이드에 대한 양자의 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교하는 것에 의해 평가될 수 있다.
이러한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, 상기의 ELISA 포맷 에 있어서 변이를 도입한 선상의 펩타이드에 대한 피험 항원 결합 분자 및 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교하는 것에 의해 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는, 컬럼에 결합한 당해 변이 펩타이드에 대한 결합 활성을, 당해 컬럼에 피검항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 유하(流下)시킨 후에 용출액 중에 용출되는 항원 결합 분자를 정량하는 것에 의해서도 측정될 수 있다. 변이 펩타이드를 예를 들어 GST와의 융합 펩타이드로서 컬럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.
또한, 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 다음의 방법으로 평가될 수 있다. 우선, 항원 결합 도메인의 대상이 되고 있는 항원을 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 항원을 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적절한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해서 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 첨가된다. 그 다음에, 적절히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해서, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광 강도와 세포수가 FACSCalibur(BD사)에 의해 측정된다. 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 농도는 적합한 완충액에 의해 적절히 희석하는 것에 의해 소망하는 농도로 조제하여 이용된다. 예를 들어, 10μg/ml에서 10ng/ml까지 사이의 어느 하나의 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은, CELL QUEST Software(BD사)를 이용하여 해석하는 것에 의해 얻어진 형광 강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻는 것에 의해, 표지 항체의 결합량에 의해 나타내어지는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 「항원 결합 분자」는, 단일 폴리펩타이드쇄 내에, 본 발명의 「항체의 가변 영역」을 형성하는 중쇄 및 경쇄의 양방을 포함하지만, 정상 영역을 결여하고 있는 항체 단편이어도 된다. 그와 같은 항체 단편으로서는, 예를 들어, 다이아보디(diabody; Db), scFv, 단쇄 항체, sc(Fv)2, sc(Fab')2여도 된다.
Db는, 2본의 폴리펩타이드쇄로 구성되는 다이머(Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404, 097호, W093/11161호 등)이며, 각각의 폴리펩타이드쇄는, 동일 쇄 중에서 L쇄 가변 영역(VL) 및 H쇄 가변 영역(VH)이, 서로 결합할 수 없을 정도로 짧은, 예를 들어 5잔기 정도의 링커에 의해 결합되어 있다.
동일 폴리펩타이드쇄 상에 코드되는 VL와 VH는, 그 사이의 링커가 짧기 때문에 단쇄 가변 영역 프래그먼트를 형성하지 못하고, 이량체화하는 것에 의해, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「scFv」, 「단쇄 항체」, 또는 「sc(Fv)2」라는 용어는, 단일 폴리펩타이드쇄 내에, 중쇄 및 경쇄의 양방에서 유래하는 가변 영역을 포함하지만, 정상 영역을 결여하고 있는 항체 단편을 의미한다. 일반적으로, 단쇄 항체는, 항원 결합을 가능하게 한다고 생각되는 소망하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. 단쇄 항체는, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113권, Rosenburg, 및 Moore편, Springer-Verlag, New York, 269∼315(1994)에서 Pluckthun에 의해 상세하게 고찰되고 있다. 마찬가지로, 국제 특허출원공개 WO1988/001649 및 미국 특허 제4,946,778호 및 동 제5,260,203호를 참조. 특정 태양에 있어서, 단쇄 항체는 또한 이중 특이성이거나 또한/또는 인간화될 수 있다.
scFv는 Fv를 구성하는 VH와 VL이 펩타이드 링커에 의해 연결된 항원 결합 도메인이다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883). 당해 펩타이드 링커에 의해 VH와 VL이 근접한 상태로 보지될 수 있다.
sc(Fv)2는 2개의 VL과 2개의 VH의 4개의 가변 영역이 펩타이드 링커 등의 링커에 의해 연결되어 1본 쇄를 구성하는 단쇄 항체이다(J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189). 이 2개의 VH와 VL은 상이한 단일클론 항체로부터 유래하는 경우도 있을 수 있다. 예를 들어, Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374에 개시된 바와 같은 동일 항원 중에 존재하는 2종류의 에피토프를 인식하는 이중 특이성 sc(Fv)2(bispecific sc(Fv)2)도 적합하게 들 수 있다. sc(Fv)2는, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제작될 수 있다. 예를 들어, scFv를 펩타이드 링커 등의 링커로 연결하는 것에 의해 제작될 수 있다.
본 명세서에 있어서의 sc(Fv)2를 구성하는 항원 결합 도메인의 구성으로서는, 2개의 VH 및 2개의 VL이, 1본 쇄 폴리펩타이드의 N 말단측을 기점으로 하여 VH, VL, VH, VL([VH] 링커 [VL] 링커 [VH] 링커 [VL])의 순서로 줄지어 있는 것을 특징으로 하는 항체를 들 수 있지만, 2개의 VH와 2개의 VL의 순서는 특별히 상기의 구성으로 한정되지 않고, 어떠한 순서로 줄지어 있어도 된다. 예를 들어 이하와 같은 순서의 구성도 들 수 있다.
[VL] 링커 [VH] 링커 [VH] 링커 [VL]
[VH] 링커 [VL] 링커 [VL] 링커 [VH]
[VH] 링커 [VH] 링커 [VL] 링커 [VL]
[VL] 링커 [VL] 링커 [VH] 링커 [VH]
[VL] 링커 [VH] 링커 [VL] 링커 [VH]
sc(Fv)2의 분자 형태에 대해서는 WO2006/132352에 있어서도 상세하게 기재되어 있어, 당업자라면 이들 기재에 기초하여, 본 명세서에서 개시되는 항원 결합 분자의 제작을 위해서 적절히 소망하는 sc(Fv)2를 제작하는 것이 가능하다.
여기에서, Fv(variable fragment)는, 항체의 경쇄 가변 영역(VL(light chain variable region))과 항체의 중쇄 가변 영역(VH(heavy chain variable region))의 페어로 이루어지는 항체 유래의 항원 결합 도메인의 최소 단위를 의미한다. 1988년에 Skerra와 Pluckthun은, 박테리아의 시그널 서열의 하류에 항체의 유전자를 삽입하여 대장균 중에서 당해 유전자의 발현을 유도하는 것에 의해, 균일하고 또한 활성을 유지한 상태로 대장균의 페리플라즘 획분으로부터 조제된다는 것을 발견했다(Science (1988) 240 (4855), 1038-1041). 페리플라즘 획분으로부터 조제된 Fv는, 항원에 대한 결합을 갖는 태양으로 VH와 VL가 회합하고 있었다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자는, PEG 등의 캐리어 고분자나 항암제 등의 유기 화합물을 컨주게이트해도 된다. 또한 당쇄 부가 서열을 삽입하여, 당쇄가 소망하는 효과를 얻는 것을 목적으로 하여 적합하게 부가될 수 있다.
항체의 가변 영역을 결합하는 링커로서는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩타이드 링커, 또는 합성 화합물 링커(예를 들어, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996 참조)에 개시되는 링커 등을 이용할 수 있지만, 본 발명에 있어서는 펩타이드 링커가 바람직하다. 펩타이드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않지만, 통상, 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이며, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다. sc(Fv)2에 3개의 펩타이드 링커가 포함되는 경우에는, 모두 동일한 길이의 펩타이드 링커를 이용해도 되고, 상이한 길이의 펩타이드 링커를 이용해도 된다.
예를 들어, 펩타이드 링커의 경우:
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 20)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호: 21)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 22)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 23)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 24)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 25)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 26)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 27)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 22))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 23))n
[n는 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다. 단, 펩타이드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성 화합물 링커(화학 가교제)는, 펩타이드의 가교에 통상 이용되고 있는 가교제, 예를 들어 N-하이드록시석신이미드(NHS), 다이석신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포석신이미딜)수베레이트(BS3), 다이싸이오비스(석신이미딜프로피오네이트)(DSP), 다이싸이오비스(설포석신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜비스(석신이미딜석시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(설포석신이미딜석시네이트)(설포-EGS), 다이석신이미딜타르타르산염(DST), 다이설포석신이미딜타르타르산염(설포-DST), 비스[2-(석신이미드옥시카보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포석신이미드옥시카보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES) 등이고, 이들 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변 영역을 결합하는 경우에는, 통상, 3개의 링커가 필요하지만, 모두 동일한 링커를 이용해도 되고, 상이한 링커를 이용해도 된다.
또한, 「Fab」는, 1본의 경쇄, 및 1본의 중쇄의 CH1 영역 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는, 다른 중쇄 분자와의 다이설파이드 결합을 형성할 수 없다.
「F(ab')2」 및 「Fab'」란, 이뮤노글로불린(단일클론 항체)을 단백질 분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리하는 것에 의해 제조되고, 힌지 영역 중의 2본의 H쇄 사이에 존재하는 다이설파이드 결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들어, IgG를 파파인으로 처리하는 것에 의해, 힌지 영역 중의 2본의 H쇄 사이에 존재하는 다이설파이드 결합의 상류에서 절단되어 VL(L쇄 가변 영역)과 CL(L쇄 정상 영역)로 이루어지는 L쇄, 및 VH(H쇄 가변 영역)와 CHγ1(H쇄 정상 영역 중의 γ1 영역)로 이루어지는 H쇄 프래그먼트가 C말단 영역에서 다이설파이드 결합에 의해 결합한 상동인 2개의 항체 프래그먼트가 제조될 수 있다. 이들 2개의 상동인 항체 프래그먼트는 각각 Fab'라고 한다.
「F(ab')2」는, 2본의 경쇄, 및 쇄간의 다이설파이드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인의 일부분의 정상 영역을 포함하는 2본의 중쇄를 포함한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자를 구성하는 F(ab')2는, 소망하는 항원 결합 도메인을 갖는 전장 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, Fc 단편을 프로틴 A 컬럼에 흡착시켜 제거하는 것에 의해, 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정하는 것에 의해 제한적으로 F(ab')2를 생성하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이면 특별한 한정은 되지 않고, 예를 들어, 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 「항원 결합 분자」의 바람직한 태양의 하나로서, 다중 특이성 항체를 들 수 있다. 다중 특이성 항체의 Fc 영역으로서 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 이용하는 경우, 다중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역도 적절히 사용된다. 본 발명의 다중 특이성 항체로서는, 특히 이중 특이성 항체가 바람직하다.
다중 특이성 항체의 회합화에는, 항체 H쇄의 제 2의 정상 영역(CH2) 또는 H쇄의 제 3의 정상 영역(CH3)의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 의도하지 않은 H쇄끼리의 회합을 억제시키는 기술에 있어서, H쇄의 다른 정상 영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 CH3 영역에 있어서의 EU 넘버링 356번째의 잔기, EU 넘버링 439번째의 잔기, EU 넘버링 357번째의 잔기, EU 넘버링 370번째의 잔기, EU 넘버링 399번째의 잔기, EU 넘버링 409번째의 잔기에 상대하는 영역을 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 예를 들어, 2종의 H쇄 CH3 영역을 포함하는 항체에 있어서는, 제 1의 H쇄 CH3 영역에 있어서의 이하의 (1)∼(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다; (1) H쇄 CH3 영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기, (2) H쇄 CH3 영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기, (3) H쇄 CH3 영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기.
또한, 상기 제 1의 H쇄 CH3 영역과는 상이한 제 2의 H쇄 CH3 영역에 있어서의 상기 (1)∼(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제 1의 H쇄 CH3 영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1)∼(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가, 상기 제 1의 H쇄 CH3 영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다.
상기 (1)∼(3)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는, 회합했을 때에 서로 접근하고 있다. 당업자라면, 소망하는 H쇄 CH3 영역 또는 H쇄 정상 영역에 대하여, 시판되는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 상기 (1)∼(3)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 찾아낼 수 있고, 적절히, 해당 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서, 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들어, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다;
(a) 글루탐산(E), 아스파라긴산(D),
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서, 「동종의 전하를 갖는다」란, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가, 상기 (a) 또는 (b)의 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는다」란, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 잔기 중의 적어도 1개의 아미노산 잔기가, 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에, 나머지 아미노산 잔기가 다른 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는, 제 1의 H쇄 CH3 영역과 제 2의 H쇄 CH3 영역이 다이설파이드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 개변에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 전술한 항체의 가변 영역 또는 항체의 정상 영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자라면, 폴리펩타이드 변이체 또는 이종 다량체에 대해, 시판되는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있어, 회합을 제어하도록 해당 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 다중 특이성 항체의 회합화에는 추가로 다른 공지 기술을 이용할 수도 있다. 항체의 한쪽 H쇄의 가변 영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 치환하고, 다른 한쪽의 H쇄의 상대하는 가변 영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole; 공극)로 치환하는 것에 의해, 돌기가 공극에 배치될 수 있도록 함으로써 효율적으로 Fc 영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩타이드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681, US20130336973).
이것에 더하여, 본 발명의 다중 특이성 항체의 형성에는 추가로 다른 공지 기술을 이용할 수도 있다. 항체의 한쪽 H쇄의 CH3의 일부를 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열로 하고, 다른 한쪽의 H쇄의 CH3의 상보적인 부분에 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열을 도입한 strand-exchange engineered domain CH3을 이용함으로써, 상이한 서열을 갖는 폴리펩타이드의 회합화를 CH3의 상보적인 회합화에 의해 효율적으로 야기할 수 있다 (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지 기술을 사용해도 효율적으로 목적하는 다중 특이성 항체를 형성시킬 수 있다.
그 밖에도 다중 특이성 항체의 형성에는, WO2011/028952나 WO2014/018572나 Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8.에 기재된 항체의 CH1과 CL의 회합화, VH, VL의 회합화를 이용한 항체 제작 기술, WO2008/119353이나 WO2011/131746에 기재된 따로따로 조제한 단일클론 항체끼리를 사용하여 이중 특이성 항체를 제작하는 기술(Fab Arm Exchange), WO2012/058768이나 WO2013/063702에 기재된 항체 중쇄의 CH3간의 회합을 제어하는 기술, WO2012/023053에 기재된 2종류의 경쇄와 1종류의 중쇄로 구성되는 이중 특이성 항체를 제작하는 기술, Christoph 등(Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))에 기재된 1본의 H쇄와 1본의 L쇄로 이루어지는 항체의 편쇄를 각각 발현하는 2개의 박테리아 세포주를 이용한 이중 특이성 항체를 제작하는 기술 등을 이용할 수도 있다.
다중 특이성 항체의 형성의 일 태양으로서는, 전술한 바와 같이, 2종류의 단일클론 항체를 환원제 존재하에서 혼합하고, 코어 힌지의 disulfide 결합을 개열시킨 후에, 재회합시켜 헤테로 이량화한 이중 특이성 항체를 얻는 방법을 들 수 있지만(FAE), CH3 영역의 상호작용 계면에 정전 상호작용(WO2006/106905)을 도입하는 것에 의해, 재회합 시에 더 효율적으로 헤테로 이량화를 유기(誘起)할 수 있다(WO2015/046467). 천연형 IgG를 이용한 FAE에서는 재회합이 랜덤으로 일어나기 때문에 이론상 50%의 효율로밖에 이중 특이성 항체를 얻을 수 없지만, 당해 방법에서는 고수율로 이중 특이성 항체를 제조할 수 있다.
또한, 효율적으로 목적하는 다중 특이성 항체를 형성시킬 수 없는 경우에도, 산생된 항체 중에서 목적하는 다중 특이성 항체를 분리, 정제하는 것에 의해서도, 본 발명의 다중 특이성 항체를 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 2종류의 H쇄의 가변 영역에 아미노산 치환을 도입하여 등전점의 차를 부여함으로써, 2종류의 호모체와 목적하는 헤테로 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325). 또한, 헤테로체를 정제하는 방법으로서, 지금까지, 프로틴 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로틴 A에 결합하지 않는 래트 IgG2b의 H쇄로 이루어지는 헤테로 이량화 항체를 프로틴 A를 이용하여 정제하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431, WO95033844). 또한, IgG와 ProteinA의 결합 부위인 EU 넘버링 435번째 및 436번째의 아미노산 잔기를, Tyr, His 등의 Protein A로의 결합력이 상이한 아미노산으로 치환한 H쇄를 이용함으로써, 각 H쇄와 Protein A의 상호작용을 변화시켜, Protein A 컬럼을 이용함으로써 헤테로 이량화 항체만을 효율적으로 정제할 수도 있다.
또한, 상이한 복수의 H쇄에 결합능을 줄 수 있는 공통의 L쇄를 취득하여, 다중 특이성 항체의 공통 L쇄로서 이용해도 된다. 이와 같은 공통 L쇄와 상이한 복수의 H쇄 유전자를 세포에 도입하는 것에 의해 IgG를 발현시키는 것에 의하여 효율이 좋은 다중 특이성 IgG의 발현이 가능해진다(Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681). 공통 H쇄를 선택할 때에, 임의의 상이한 H쇄에 대응하여 높은 결합능을 나타내는 공통 L쇄를 선택하는 방법도 이용할 수 있다(WO2004/065611).
또한, 본 발명의 Fc 영역으로서, Fc 영역의 C말단의 헤테로제니티(heterogeneity)가 개선된 Fc 영역이 적절히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 기원으로 하는 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 446번 위치의 글리신, 및 447번 위치의 리신이 결실된 Fc 영역이 제공된다.
이들 기술을 복수, 예를 들어 2개 이상 조합하여 이용할 수도 있다. 또한, 이들 기술은, 회합시키고자 하는 2개의 H쇄에 적절히 따로따로 적용시킬 수도 있다. 또한 이들 기술은, 전술한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역에 조합하여 이용할 수도 있다. 한편, 본 발명의 항원 결합 분자는, 상기 개변이 가해진 것을 베이스로 하여, 동일한 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 분자를 별도 제작한 것이어도 된다.
본 발명에 따른 항원 결합 분자는, 상기의
(1) 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인, 및
(2) T 세포 수용체 복합체에 결합하는 도메인
을 포함하는 것이면 되고, 그 구조는 한정되지 않는다. 당해 항원 결합 분자는, 이들 2개의 결합 도메인을 포함하는 것에 의해, (1)에 기재된 분자를 발현하는 세포에 의한 면역 응답을 억제하는 작용을 저해함으로써 면역 응답을 활성화하여, 암 세포 또는 당해 세포를 포함하는 종양 조직에 대해서 우수한 세포 상해 작용을 유도하는 것이 가능해진다. 본 발명의 (1) 및 (2)에 기재된 결합 도메인은, 각각, 전술한 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자, 또는 T 세포 수용체 복합체에 속하는 항원으로부터 적절히 선택할 수 있다. 이들 결합 도메인은, 펩타이드 결합으로 직접 연결할 수도 있고, 링커를 통하여 결합할 수도 있다.
본 발명의 항원 결합 분자는, 추가로 FcRn 결합 도메인을 포함하고 있어도 된다. 해당 FcRn 결합 도메인으로서 전술의 항체의 Fc 영역을 이용하는 경우는, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역이 바람직하다. Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 저하시킴으로써, Fcγ 수용체 발현 세포와 T 세포 수용체 복합체를 발현하는 세포 사이의 가교에 의해 생기는 사이토카인 릴리스 등의 전신성의 면역 활성화에 의해 생기는 부작용을 억제하는 것이 가능하다.
본 발명의 항원 결합 분자는, 전술한 공지의 방법을 이용하여 제작할 수 있다.
예를 들어, (1) 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인으로서 F(ab')2, (2) T 세포 수용체 복합체에 결합하는 도메인으로서 F(ab')2를 이용하고, (3) FcRn 결합 도메인으로서 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 포함하는 도메인을 이용한 경우에, (1)과 (2)에 기재된 항원 결합 도메인과 (3)에 기재된 Fc 영역을 포함하는 도메인을 펩타이드 결합으로 직접 연결했을 때는, 연결된 폴리펩타이드는 항체의 구조를 형성한다. 그와 같은 항체를 제작하기 위해서는 전술한 하이브리도마의 배양액으로부터 정제하는 것 외에, 당해 항체를 구성하는 폴리펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 안정되게 유지하고 있는 소망하는 숙주 세포의 배양액으로부터 당해 항체를 정제할 수도 있다.
또한, 그 외, 링커를 통하여 각 도메인을 결합하는 경우는, 채용되는 링커로서는, 상기에서 예시되는 링커 외에, 예를 들어 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩타이드 태그를 갖는 링커도 적절히 사용될 수 있다. 또한, 수소결합, 다이설파이드 결합, 공유결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합에 의해 서로 결합하는 성질도 또한 적합하게 이용될 수 있다. 예를 들어, 항체의 CH1과 CL 사이의 친화성이 이용되거나 헤테로 Fc 영역의 회합 시에 전술한 다중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 이용되거나 한다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 항원 결합 분자는, 임의의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 발현 벡터로 적당한 숙주를 형질 전환하여, 항원 결합 분자의 발현 세포로 할 수 있다. 항원 결합 분자의 발현 세포를 배양하고, 배양 상청으로부터 발현 산물을 회수하면, 당해 폴리뉴클레오타이드에 의해 코드되는 항원 결합 분자를 취득할 수 있다. 즉 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 당해 벡터를 보지하는 세포, 및 당해 세포를 배양하여 배양 상청으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 것을 포함하는, 항원 결합 분자의 제조 방법에 관한 것이다. 이들은 예를 들어, 상기 재조합 항체와 마찬가지의 수법에 의해 얻을 수 있다.
의약 조성물
다른 관점에 있어서는, 본 발명은, 전술한 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은, 당해 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 함유하는, 면역 응답의 억제 활성을 저해하는 의약 조성물(면역 응답 억제 활성 저해제), 면역 응답 활성화제, 세포 상해 유도제, 세포 증식 억제제(세포 증식 저해제) 및 항암제(이하, 의약 조성물 등)에 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물은, 암 치료제 또는 암 예방제로서 이용할 수도 있다. 본 발명의 면역 응답 억제 활성 저해제, 면역 응답 활성화제, 세포 상해 유도 치료제, 세포 증식 억제제 및 항암제는, 암을 이환하고 있는 대상 또는 재발할 가능성이 있는 대상에 투여되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서, 전술한 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는, 면역 응답 억제 활성 저해제, 면역 응답 활성제, 세포 상해 유도 치료제, 세포 증식 억제제 및 항암제는, 당해 항원 결합 분자를 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 면역 응답 억제 활성을 저해하는 방법, 면역 응답을 활성화하는 방법, 세포 상해를 유도하는 방법, 세포 증식을 억제하는 방법, 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 종양 조직에 대한 면역을 활성화하는 방법, 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법이라고 표현할 수 있고, 또는, 면역 응답 억제 활성을 저해하기 위한 의약 조성물, 면역 응답을 활성화하기 위한 의약 조성물, 세포 상해를 유도하기 위한 의약 조성물, 세포 증식 억제제 및 항암제의 제조에 있어서의 당해 항원 결합 분자의 사용이라고 표현할 수도 있으며, 또는, 면역 응답 억제 활성의 저해, 면역 응답의 활성화, 세포 상해의 유도, 세포 증식의 억제, 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 종양 조직에 대한 면역의 활성화, 또는 암 치료 또는 예방에 있어서 사용하기 위한 당해 항원 결합 분자라고 표현할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함한다」란, 당해 항원 결합 분자를 주요한 활성 성분으로서 포함한다고 하는 의미이며, 당해 항원 결합 분자의 함유율을 제한하는 것은 아니다.
또한 본 발명에 있어서의 의약 조성물 등은, 필요에 따라서 복수 종류의 항원 결합 분자를 조합하여 이용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 동일한 항원에 결합하는 복수의 본 발명의 항원 결합 분자의 칵테일을 이용하는 것에 의해, 당해 항원을 발현하는 세포에 대한 작용을 강화할 수 있을 가능성이 있다.
또한, 필요에 따라서 본 발명의 항원 결합 분자는 마이크로캡슐(하이드록시메틸셀룰로스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입되어, 콜로이드 약물 수송계(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐 등)가 될 수 있다("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980) 등 참조). 또한, 약제를 서방성의 약제로 하는 방법도 공지이며, 당해 방법은 본 발명의 항원 결합 분자에 적용될 수 있다(J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277, Chemtech. (1982) 12, 98-105, 미국 특허 제3773719호, 유럽 특허공개공보 EP58481호·EP133988호, Biopolymers (1983) 22, 547-556).
본 발명의 의약 조성물, 또는 면역 응답 활성화제, 세포 상해 유도제, 세포 증식 억제제(세포 증식 저해제) 및 항암제는, 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여이다. 이러한 투여 방법으로서는 구체적으로는, 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여로서는, 예를 들어, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등을 들 수 있다. 예를 들어 주사 투여에 의해, 본 발명의 의약 조성물, 또는 세포 상해 유도 치료제, 세포 증식 억제제 및 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여 방법을 선택할 수 있다. 투여량으로서는, 예를 들어, 1회의 투여에 대해 체중 1kg당 0.0001mg 내지 1000mg의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는, 예를 들어, 환자당 0.001mg/body 내지 100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그렇지만, 본 발명의 의약 조성물은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은, 통상적 방법에 따라 제제화할 수 있고(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 모두 포함하는 것이어도 된다. 예를 들어 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있다. 또한 이들에 제한되지 않고, 그 외 상용되는 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는, 경질 무수 규산, 유당, 결정 셀룰로스, 만니톨, 전분, 카멜로스칼슘, 카멜로스나트륨, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리바이닐아세탈다이에틸아미노아세테이트, 폴리바이닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트라이글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카복시메틸셀룰로스, 옥수수 전분, 무기염류 등을 담체로서 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 어떤 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포를, 당해 세포의 표면에 발현하는 분자에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자와 접촉시키는 것에 의해, 당해 세포를 상해하여, 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 종양 조직에 상해를 야기하는 방법, 또는 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 종양 조직의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항원 결합 분자의 대상이 되는 암 세포 또는 암 세포를 포함한 종양 조직으로서는 특별히 한정되지 않지만, 암의 악화에 면역 응답 억제 활성을 갖는 세포가 관여하고 있는 암종 또는 종양 중의 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포의 수와 예후가 상관되는 암종이 바람직하고, 그러한 암종으로서 예를 들어, 난소암(비특허문헌 11, 12), 위암(비특허문헌 13, 14), 식도암(비특허문헌 14), 췌장암(비특허문헌 15), 신장세포암(비특허문헌 16), 간세포암(비특허문헌 17), 유방암(비특허문헌 18, 19), 악성 흑색종(비특허문헌 20), 비소세포 폐암(비특허문헌 21), 자궁경암(비특허문헌 22), 교아종(비특허문헌 23), 전립선암(비특허문헌 24), 신경아종양(비특허문헌 25), 만성 림프성 백혈병(비특허문헌 26), 갑상선 유두암(비특허문헌 27), 대장암(비특허문헌 28), B세포 비호지킨 림프종(비특허문헌 29, 30)이 보고되어 있고, 본 발명의 적합한 암종으로서 들 수 있다. 한편, 본 명세서에 기재된 「암」은, 난소암, 위암 등의 상피성의 악성 종양 뿐만 아니라, 만성 림프성 백혈병이나 호지킨 림프종 등의 조혈기 암을 포함하는 비상피성의 악성 종양도 의미하는 것으로 한다.
본 발명에 있어서 「접촉」은, 예를 들어, 인비트로로 배양하고 있는 대상이 되는 항원이 발현하고 있는 세포의 배양액에, 당해 항원에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자를 첨가하는 것에 의해 행해진다. 이 경우에 있어서, 첨가되는 항원 결합 분자의 형상으로서는, 용액 또는 동결건조 등에 의해 얻어지는 고체 등의 형상이 적절히 사용될 수 있다. 수용액으로서 첨가되는 경우에 있어서는 순수하게 본 발명의 항원 결합 분자만을 함유하는 수용액일 수 있고, 예를 들어 상기 기재의 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액일 수도 있다. 첨가하는 농도는 특별히 한정되지 않지만, 배양액 중의 최종 농도로서 바람직하게는 1pg/ml 내지 1g/ml의 범위이며, 보다 바람직하게는 1ng/ml 내지 1mg/ml이며, 더욱 바람직하게는 1μg/ml 내지 1mg/ml가 적합하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 「접촉」은 또한, 다른 태양에서는, 예를 들어, 대상이 되는 암 세포주를 체내에 이식한 비인간 동물에, 당해 비인간 동물의 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자를 투여하거나, 또는 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 인간 유래의 세포를 발현하는 비인간 동물에, 대상이 되는 암 세포주를 체내에 이식하고, 이것에 당해 인간 유래의 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 본 발명의 분자를 투여하는 것에 의해서도 행해진다. 투여 방법은 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 따라 실시할 수 있다. 특히 바람직하게는 비경구 투여에 의한 투여 방법이며, 이러한 투여 방법으로서는 구체적으로는, 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여로서는, 예를 들어, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등을 들 수 있다. 예를 들어 주사 투여에 의해, 본 발명의 의약 조성물, 또는 면역 응답 억제 활성을 저해하기 위한 의약 조성물, 면역 응답을 활성화하기 위한 의약 조성물, 세포 상해를 유도하기 위한 의약 조성물, 세포 증식 억제제(세포 증식 저해제) 및 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 피험 동물의 연령, 증상에 따라 적절히 투여 방법을 선택할 수 있다. 수용액으로서 투여되는 경우에 있어서는 순수하게 본 발명의 항원 결합 분자만을 함유하는 수용액이어도 되고, 예를 들어 상기 기재의 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액이어도 된다. 투여량으로서는, 예를 들어, 1회의 투여에 대해 체중 1kg당 0.0001mg 내지 1000mg의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는, 예를 들어, 환자당 0.001 내지 100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그렇지만, 본 발명의 항원 결합 분자 투여량은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항원 결합 분자의 접촉에 의해, 대상이 되는 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 종양 조직에 야기된 세포 상해를 평가 또는 측정하는 방법으로서 이하의 방법이 적합하게 사용된다. 인비트로(in vitro)로 해당 세포 상해 활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서는, 세포 상해성 T 세포 활성 등의 측정법을 들 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자가 T 세포성 상해 활성을 갖는지 여부를 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다(예를 들어, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993) 등). 활성의 측정 시에는, 본 발명과는 그 항원 결합 도메인이 결합하는 항원이 상이한 항원으로서 시험에 사용하는 세포가 발현하고 있지 않은 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 대조로 하여, 본 발명의 항원 결합 분자와 마찬가지로 사용하여, 본 발명의 항원 결합 분자가, 대조로서 사용된 항원 결합 분자보다도 강한 세포 상해 활성을 나타내는 것에 의해 활성을 판정할 수 있다.
또한, 생체내(in vivo)에서 세포 상해 활성을 평가 또는 측정하기 위해서, 예를 들어 본 발명의 항원 결합 분자의 대상이 되는 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 종양 조직을, 비인간 피험 동물의 피내 또는 피하에 이식 후, 당일 또는 익일부터 매일 또는 수일 간격으로 피험 항원 결합 분자를 정맥 또는 복강내에 투여한다. 종양의 크기를 경일적(經日的)으로 측정하는 것에 의해, 당해 종양의 크기의 변화의 차이를 세포 상해 활성으로 규정할 수 있다. 인비트로에서의 평가와 마찬가지로 대조가 되는 항원 결합 분자를 투여하고, 본 발명의 항원 결합 분자의 투여군에 있어서의 종양의 크기가 대조 항원 결합 분자의 투여군에 있어서의 종양의 크기보다도 유의하게 작은 것에 의해 , 본 발명의 항원 결합 분자가 세포 상해 활성을 갖는다고 판정할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자의 접촉에 의한, 당해 항원 결합 분자를 구성하는, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인이 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식에 대한 억제 효과를 평가 또는 측정하는 방법으로서는, 아이소토프 라벨한 thymidine의 세포로의 흡수 측정이나 MTT법이 적합하게 이용된다. 또한, 생체내에서 세포 증식 억제 활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서 상기 기재의 생체내에 있어서 세포 상해 활성을 평가 또는 측정하는 방법과 동일한 방법을 적합하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 포함하는, 본 발명의 방법에서 이용하기 위한 키트를 제공한다. 해당 키트에는, 그 외, 약학적으로 허용되는 담체, 매체, 사용 방법을 기재한 지시서 등을 패키지해 둘 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 항원 결합 분자에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 하나 또는 복수의 태양을 임의로 조합한 것도, 당업자의 기술 상식에 기초하여 기술적으로 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함되는 것이 당업자에게는 당연하게 이해된다.
한편, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 도입될 수 있다.
실시예
〔실시예 1〕 제어성 T 세포의 세포 표면 마커에 대한 T 세포 리다이렉트 항체의 컨셉
(1-1) 제어성 T 세포를 제거하는 것에 의한 항CTLA4 항체의 항종양 효과
전술한 배경기술에 기재된 대로, 이필리무마브는 이펙터 T 세포 표면에 발현하는 CTLA4에 의한 이펙터 T 세포의 활성화 억제를 저해함으로써 항종양 효과가 발휘되고 있다고 생각되고 있었지만, 최근, CTLA4 발현 T 세포에 대한 항체 의존적 세포 상해 활성(ADCC 활성)도 중요하다는 것이 보고되어, 종양 중의 제어성 T 세포의 제거와 ADCC 활성이 항CTLA4 항체의 항종양 효과의 중요한 작용 기서라는 것이 발견되고 있다.
한편, IgG1 항체에 의한 ADCC 활성은 항체의 정상 영역이 NK 세포나 매크로파지의 FcγR과 결합함으로써 세포 상해 활성이 유도되어, 그 결합을 증강시키는 개변을 가한 정상 영역을 갖는 항체는, 보다 강한 세포 상해 활성을 유도하여, 항종양 효과를 발휘한다는 것도 알려져 있다.
이와 같이 암 미소 환경에 있어서 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포에 결합하여, 세포 상해 활성에 의해 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포를 제거하는 것이 강한 항종양 효과를 발휘한다는 것이 발견되었으므로, 보다 강력하게 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포를 제거할 수 있으면, 즉 보다 강한 세포 상해 활성을 발휘할 수 있으면, 보다 강한 항종양 효과가 발휘될 것이 기대된다.
(1-2) T 세포 리다이렉트 항체(T cell redirecting antibody)
항체의 개량 기술로서, 전술한 ADCC 활성의 증강이나 혈중 체류성의 연장, 항원에 대한 결합 활성의 향상, 면역원성 리스크의 저감이 행해져 왔다. 통상 항체는 항원의 하나의 에피토프를 인식하여 결합하므로, 이들 개량 기술을 항체에 적용해도, 타겟이 되는 항원은 1종류뿐이다. 복수의 타겟을 저해하는 분자로서 1분자로 2종류 이상의 항원과 결합하는 항체(이중 특이성 항체라고 한다)가 연구되고 있다. 이중 특이성 항체는 2종류 이상의 항원과 상호작용하기 때문에, 2종류 이상의 항원을 1개의 분자로 중화하는 작용뿐만 아니라, 세포 상해 활성을 갖는 세포와 암 세포를 크로스 링크함으로써 항종양 활성을 높이는 작용이 있다.
T 세포에 발현하고 있는 단백질(CD3ε이나 TCR)과 암 세포에 발현하고 있는 단백질(암 항원)을 인식하는 이중 특이성 항체로서 BiTE 분자인 블리나투모마브(blinatumomab)나 카투막소마브(Catumaxomab)가 알려져 있다. 이들 분자는, 2개의 항원 결합 도메인(scFv 또는 Fab)에 의해 각각 암 항원과 T 세포에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 결합하여, T 세포와 암 항원 발현 세포를 세포간 가교할 수 있다(도 1). 이것에 의해, 이와 같은 T 세포 리다이렉트 항체는, T 세포를 이펙터 세포로 하여 암 항원 발현 세포에 대해서 강한 세포 상해 활성을 유도하는 것이 가능하다.
한편, 지금까지 T 세포를 이펙터 세포로 하여 T 세포에 대해서 강한 세포 상해 활성을 유도하는 항체는 보고되어 있지 않다. 예를 들어, CD3ε은 일반적인 T 세포 마커이기 때문에, CD3ε에 대해서 양팔(2개의 Fab)로 결합하는 IgG 항체(FcgR 결합 활성은 갖지 않음)이면, 도 2a에 나타내는 바와 같이 CD3ε을 발현하는 T 세포를 이펙터 세포로 하여 CD3ε을 발현하는 T 세포에 대해서, 양자를 세포간 가교함으로써, T 세포가 T 세포에 대해서 강한 세포 상해 활성을 유도하는 것이 가능하다고 생각되지만, 실제는 이와 같은 일은 거의 일어나지 않는다. 왜냐하면, CD3ε에 대해서 양팔(2개의 Fab)로 결합하는 IgG 항체는 동일 세포 상에 발현하는 CD3ε에 대해서 2가로 어비디티(avidity)에 의해 강고하게 결합해 버리기 때문에, CD3ε을 발현하는 T 세포끼리의 세포간 가교는 일어나지 않는다(도 2b).
CD3은 일반적인 T 세포 마커이기 때문에, CD3은 이펙터 세포가 되는 T 세포, 및 표적이 되는 T 세포(예를 들어 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포)의 양방에 발현하고 있기 때문에, T 세포 리다이렉트 항체에 의해 표적 T 세포에 대해서 세포 상해 활성을 나타낼 수 없다고 생각되어 왔다. 즉, 특정의 T 세포 인구의 표면 마커인 항원 X를 발현하는 T 세포에 대한 T 세포 리다이렉트 항체(CD3ε과 항원 X에 대한 이중 특이성 항체)는, 표적 T 세포에는 CD3ε과 항원 X가 발현하고 있기 때문에, 상기 T 세포 리다이렉트 항체는, 표적 T 세포(예를 들어 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포)에 대해서 2가로 avidity에 의해 강고하게 결합해 버리기 때문에, 이펙터 세포가 되는 T 세포와의 세포간 가교는 일어나지 않는다고 생각되어 왔다(도 3). 실제로 지금까지 T 세포 항원에 대한 T 세포 리다이렉트 항체는 보고되어 있지 않다.
그 때문에, 도 4에 나타내는 것과 같은, 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포에 발현하는 CTLA4에 대한 T 세포 리다이렉트 항체(CD3ε과 CTLA4에 대한 이중 특이성 항체)는, 표적 세포인 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포에 CD3ε과 CTLA4의 양방이 발현하고 있기 때문에, 이펙터 세포가 되는 T 세포와 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포 사이에 가교는 일어나지 않아, 제어성 T 세포 및 피폐 T 세포에 대해서 강한 세포 상해 활성을 유도할 수 없다고 생각되고 있고, 지금까지 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포에 대한 T 세포 리다이렉트 항체의 보고도 없다.
즉, 실제로 생체내에서 CTLA4에 대한 T 세포 리다이렉트 항체(항CTLA4/항CD3ε 이중 특이성 항체)가, 세포간 가교를 일으킴으로써 제어성 T 세포를 상해하여, 항종양 효과를 발휘할 수 있을지 여부는 미지였다. 그래서, 우리는 실제로 CTLA4와 CD3에 대한 이중 특이성 항체를 제작하여 마우스 in vivo 및 인간 in vitro로 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 검증했다.
일반적인 암 항원에 대해서는, T 세포 리다이렉트 항체는, NK 세포를 이용한 ADCC 활성을 가지는 항체보다도 항종양 효과가 강하다는 것이 알려져 있지만, CTLA4에 대한 T 세포 리다이렉트 항체의 항종양 효과가 ADCC 활성을 증강한 항CTLA4 항체보다도 강한지 여부는 알려져 있지 않았었다.
〔실시예 2〕 제어성 T 세포를 타겟으로 한 ADCC 활성 증강 항체의 제작과 평가
(2-1) 마우스 CTLA4에 특이적으로 결합하는 ADCC 활성 증강 항체(hUH02hUL01-mFa55)의 발현과 정제
항마우스 CTLA4 항체 hUH02hUL01의 가변 영역(중쇄 가변 영역 UH02는 서열번호: 28, 경쇄 가변 영역 UL01은 서열번호: 29)을 코드하는 유전자를, 각각 마우스 IgG2a/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은 마우스 FcγR로의 결합을 증강하는 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 mFa55는 서열번호: 30, 경쇄 정상 영역 mk1은 서열번호: 31).
이하의 방법을 이용하여 항체를 발현시켰다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 1.33x106세포/mL의 세포 밀도로 현탁하여, 6웰 플레이트의 각 웰에 3mL씩 파종한 인간 태아신장 세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에 대해서, 리포펙션법에 의해 조제된 플라스미드를 도입했다. CO2 인큐베이터(37℃, 8% CO2, 90rpm)에서 4일간 배양한 배양 상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 이용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제 했다. 분광 광도계를 이용하여, 정제한 항체 용액의 280nm에서의 흡광도를 측정했다. 얻어진 측정치로부터 PACE법에 의해 산출한 흡광 계수를 이용하여, 정제한 항체의 농도를 산출했다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(2-2) 항마우스 CTLA4 항체(hUH02UL01-mFa55)의 각종 마우스 FcgR에 대한 결합의 평가
실시예 2-1에 기재된 방법으로 정제, 조제한 항마우스 CTLA4 항체 hUH02hUL01-mFa55 및 컨트롤 항체 hUH02hUL01-mIgG2a(중쇄 가변 영역 UH02는 서열번호: 28, 경쇄 가변 영역 UL01은 서열번호: 29, 중쇄 정상 영역 mIgG2a는 서열번호: 32, 경쇄 정상 영역 mk1은 서열번호: 31)에 대해, Biacore T200(GE Healthcare)을 이용하여, 각종 마우스 FcgR(mFcgRI, II, III, IV)과의 항원 항체 반응을 해석했다. 러닝 버퍼로서, 20mmol/L ACES, 150mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, pH 7.4를 이용하여 25℃에서 측정했다. 센서 칩 CM7 상에 아민 커플링에 의해 Protein A/G를 고정화하고, hUH02hUL01-mFa55를 캡처한 후, FcgR을 애널라이트로서 120초간 상호작용시켜, 그 결합량의 변화를 관찰했다. hUH02hUL01-mFa55의 희석에는, 러닝 버퍼를 사용했다. 측정 결과는, Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)를 이용하여 커브 피팅에 의한 해석에 의해, 결합 속도 상수 ka(1/Ms) 및 해리 속도 상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 바탕으로 해리 상수 KD(M)를 산출했다. 측정 결과를 표 1에 나타냈다.
Figure pct00001
(2-3) 항마우스 CTLA4 항체(hUH02UL01-mFa55)에 의한 ADCC 활성 증강 항체의 평가
실시예 2-1에 기재된 방법으로 정제, 조제된 항마우스 CTLA4 항체 hUH02hUL01-mFa55가, 마우스 CTLA4 발현 세포(마우스 CTLA4 발현 세포는, CHO 세포에 대해서 전장 마우스 CTLA4 유전자를 도입함으로써 당업자 공지의 방법으로 작성되었다)에 대해서 ADCC 활성이 발현하는지를, 참고 실시예 1의 방법에 따라 검증했다. 측정의 결과, 항체 농도 의존적인 ADCC 활성이 인정되었다(도 5).
〔실시예 3〕 제어성 T 세포와 이펙터 T 세포의 표면 항원을 인식하는, 이중 특이성 제작과 평가
(3-1) 마우스 CTLA4 및 마우스 CD3에 특이적으로 결합하는 이중 특이성 항체의 발현과 정제
항마우스 CTLA4 항체 hUH02hUL01의 가변 영역(중쇄 가변 영역 UH02는 서열번호: 28, 경쇄 가변 영역 UL01은 서열번호: 29)을 코드하는 유전자를, 각각 인간 IgG1/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은, Fcγ 수용체로의 결합을 저감하고, 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 F760nN17은 서열번호: 33, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34).
또한, 항마우스 CD3 항체 2C11의 가변 영역(중쇄 가변 영역은 서열번호: 35, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 36)을 코드하는 유전자를, 각각 인간 IgG1/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은, Fcγ 수용체로의 결합을 저감하고, 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 F760nP17은 서열번호: 37, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34).
hUH02hUL01-F760nN17, 2C11-F760nP17을, 각각 실시예 2에 나타난 방법으로 발현, 정제했다. 정제한 각각의 호모체는 정상 영역의 전하의 차를 이용한 당업자 공지의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013)으로 혼합하여, 목적하는 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)를 제작했다.
(3-2) 마우스 CTLA4 및 마우스 CD3에 특이적으로 결합하는 이중 특이성 항체의 항원(mCTLA4, mCD3)에 대한 결합의 평가
실시예 3-1에 기재된 방법으로 정제, 조제한 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)는, Biacore T200(GE Healthcare)을 이용하여, 각 항원(mCTLA4 및 mCD3)과의 항원 항체 반응을 해석했다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+, pH 7.4를 이용하여 37℃에서 측정했다. 센서 칩 CM4 상에 아민 커플링에 의해 Protein A/G를 고정화하고, hUH02UL01/2C11-F760을 캡처한 후, 항원(마우스 CTLA4 또는 마우스 CD3)을 애널라이트로서 상호작용시켜(마우스 CTLA4는 120초간, 마우스 CD3은 90초간), 그 결합량의 변화를 관찰했다. hUH02UL01/2C11-F760의 희석에는 러닝 버퍼를 사용했다. 측정 결과는, Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)를 이용하여 커브 피팅에 의한 해석에 의해, 결합 속도 상수 ka(1/Ms) 및 해리 속도 상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 바탕으로 해리 상수 KD(M)를 산출했다. 결과를 표 2에 나타냈다.
Figure pct00002
(3-2) 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)에 의한 세포 상해 활성의 평가
실시예 3-1에 기재된 방법으로 정제, 조제한 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)가 마우스 CTLA4 발현 세포주에 대해서 세포 상해 활성이 발현하는지를, 참고 실시예 2의 방법에 따라 검증했다. 측정 결과, 항체 농도 의존적인 세포 상해 활성이 인정되었다(도 6).
〔실시예 4〕 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)에 의한 CD3 및 CTLA4 고정화 비드와 CD3 결합 비드의 가교의 평가
항CTLA4/항CD3 이중 특이성 항체에 의해 제어성 T 세포(CTLA4 및 CD3이 발현하고 있음)와 이펙터 T 세포(CD3이 발현하고 있음)의 표면 항원이 인식되어 양 세포간의 가교가 일어날 수 있는지를, 이화학적인 실험에 의해 검증했다.
최초로, PerkinElmer사의 Alpha 테크놀로지에 의해, 실시예 3-1에 기재된 방법으로 정제, 조제한 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)를 이용하여, 마우스 CD3 고정화 비드와 마우스 CTLA4 고정화 비드의 가교를 평가 가능한 계의 구축을 검토했다. 구체적으로는, 100nmol/L의 비오틴화 마우스 CTLA4, 0, 20, 100, 500nmol/L의 hUH02UL01/2C11-F760, 50μg/mL의 AlphaScreen(등록상표) Streptavidin-coated Donor Beads(PerkinElmer), 50μg/mL의 마우스 CD3을 AlphaScreen(등록상표) Unconjugated Acceptor Beads(PerkinElmer)에 컨주게이트한 마우스 CD3-acceptor beads를 이용했다. 이 조건하에서는, 도 7a와 같이, AlphaScreen(등록상표) Streptavidin-coated Donor Beads에 결합한 비오틴화 마우스 CTLA4와 마우스 CD3-acceptor beads가 hUH02UL01/2C11-F760에 의해 가교되어 화학 발광한다고 생각되었다. 플레이트로는 Alpha384(PerkinElmer)를 이용하고 측정은 Envision으로 실시했다. 어느 실험도 3회 실시했다. 그 결과, 도 7b에 있는 바와 같이, hUH02UL01/2C11-F760의 농도 의존적인 비드간의 가교가 관찰되었다.
다음에, AlphaScreen(등록상표) Streptavidin-coated Donor Beads (PerkinElmer)에 대해서 100nmol/L의 비오틴화 마우스 CTLA4 및 10nmol/L의 비오틴화 마우스 CD3을 첨가하여, CTLA4 및 CD3이 발현하고 있는 제어성 T 세포를 모방한 도너 비드를 작성했다. 100nmol/L의 hUH02UL01/2C11-F760의 첨가에 의해 50μg/mL의 마우스 CD3-acceptor beads(이펙터 T 세포를 모방한 억셉터 비드) 존재하에서 도너 비드와 억셉터 비드의 가교가 일어나는지 여부를 검증했다. 100 nmol/L의 비오틴화 마우스 CTLA4, 50μg/mL의 AlphaScreen(등록상표) Streptavidin-coated Donor Beads(PerkinElmer), 50μg/mL의 마우스 CD3-acceptor beads에, hUH02UL01/2C11-F760을 가하지 않는 조건을, 각 비드간의 가교를 일으키지 않는 컨트롤로서 이용했다. 어느 실험도 3회 실시했다. 실험의 결과, 도 7c의 결과가 얻어지고, 비오틴화 마우스 CD3이 마우스 CTLA4와 동일한 비드 상에 존재할 수 있는 조건하에 있어서도, 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체에 의해, 도 7d에 나타나는 바와 같이 도너 비드와 억셉터 비드가 가교되는 것이 확인되었다.
비오틴화 마우스 CD3 및 마우스 CTLA4가 도너 비드 상에 결합하고 있는 상태는 제어성 T 세포(CTLA4 및 CD3이 발현하고 있음)를 모의하고 있다고 생각되고, 마우스 CD3을 컨주게이트한 억셉터 비드는 이펙터 T 세포(CD3이 발현하고 있음)를 모방하고 있다고 생각되었다. 이 조건하에 있어서도 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체에 의해 도너 비드와 억셉터 비드가 가교되는 것이 확인되었다고 하므로, 제어성 T 세포와 이펙터 T 세포에 있어서도 이와 같이 항CTLA4/항CD3 이중 특이성 항체에 의해 양 세포 사이를 가교하는 것이 가능하다는 것이 시사되었다.
〔실시예 5〕 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)에 의한 in vivo 약효 평가(종양내 투여)
실시예 2-1에 기재된 방법으로 정제, 조제한 항마우스 CTLA4 항체 hUH02hUL01-mFa55 및 실시예 3-1에 기재된 방법으로 정제, 조제한 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)가 마우스 대장암 세포주에 대해서 in vivo로 약효를 나타내는지를 검증했다. 마우스 대장암 세포주 CT26.WT(ATCC) 1x106개를, BALB/c 마우스(일본 찰스 리버)의 우측 복부 피하에 이식하여, 고형 종양을 형성시켰다. 이식 후 10일째에, hUH02hUL01-mFa55를 200μg/마우스, hUH02UL01/2C11-F760을 100μg/마우스의 투여량으로, 종양내(i.t.)에 투여했다(각 군 n=2). 그 결과, hUH02UL01/2C11-F760은 hUH02hUL01-mFa55보다도 강한 항종양 효과를 나타내어, hUH02UL01/2C11-F760은 in vivo에 있어서 현저한 항종양 작용을 나타낸다는 것이 분명해졌다(도 8). 즉, 제어성 T 세포(CTLA4 및 CD3이 발현하고 있다)와 이펙터 T 세포(CD3이 발현하고 있다)의 표면 항원을 인식하여, 양 세포 사이의 가교가 생체내에서 일어날 수 있다는 것이 시사되었다.
〔실시예 6〕 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)에 의한 in vivo 약효 평가(종양내 투여와 정맥내 투여의 비교)
실시예 3-1에 기재된 방법으로 정제, 조제한 항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체(hUH02UL01/2C11-F760)가, 실시예 5에 기재한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT 이식 모델에 대해서, 정맥내 투여(i.v.)에서도 약효를 나타내는지를 검증했다. CT26.WT(ATCC) 1x106개를, BALB/c 마우스(일본 찰스 리버)의 우측 복부 피하에 이식하여, 고형 종양을 형성시켰다. 이식 후 8일째에, hUH02UL01/2C11-F760을 100μg/마우스의 투여량으로, 종양내(i.t.) 또는 정맥내(i.v.)에 투여했다(각 군 n=5). 그 결과, 종양내 및 정맥내 투여 모두 동등의 항종양 효과를 나타내어, hUH02UL01/2C11-F760은 in vivo에 있어서 국소 투여, 전신 투여에 상관 없이 항종양 작용을 나타낸다는 것이 분명해졌다(도 9).
〔실시예 7〕 항인간 CTLA4/항인간 CD3 이중 특이성 항체에 의한 in vitro 약효 평가
(7-1) 인간 CTLA4 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중 특이성 항체의 발현과 정제
항인간 CTLA4 항체 MDX10-F760nN17의 가변 영역(중쇄 가변 영역 MDX10H는 서열번호: 38, 경쇄 가변 영역 MDX10L은 서열번호: 39)을 코드하는 유전자를, 각각 인간 IgG1/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은, Fcγ 수용체로의 결합을 저감하고, 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 F760nN17은 서열번호: 33, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34).
또한, 항인간 CD3 항체 TR01H113-F760mG3P17의 가변 영역(중쇄 가변 영역 TR01H113은 서열번호: 40, 경쇄 가변 영역 L0011은 서열번호: 41)을 코드하는 유전자를, 각각 인간 IgG1/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은, Fcγ 수용체로의 결합을 저감하고, 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 F760nG3P17은 서열번호: 42, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34).
MDX10-F760nN17, TR01H113-F760nG3P17은, 각각 실시예 2에 나타난 방법으로 발현, 정제했다. 정제한 각각의 호모체를 표 3의 조합으로 혼합하고, 당업자 공지의 수법(WO2015/046467)을 이용하여 목적하는 이중 특이성 항체를 제작했다.
Figure pct00003
또한 이 외에도 이중 특이성 항체의 형성 기술이 존재한다. WO2011/028952나 WO2014/018572나 Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8.에 기재된 항체의 CH1과 CL의 회합화, VH, VL의 회합화를 이용한 항체 제작 방법, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Jul 5;108(27):11187-92나 WO2009/080251, WO2009/080252, WO2009/080253에 기재된 CH1과 CL 또는 VH와 VL의 회합화를 이용한 방법, WO2012/058768이나 WO2013/063702에 기재된 항체 중쇄의 CH3간의 회합을 제어하는 방법, WO2006/106905에 기재된 CH1과 CL의 전하 제어를 이용한 방법, WO2013/065708에 기재된 VH와 VL의 전하 제어를 이용한 방법 등이 있다. 항인간 CTLA4 항체(중쇄 가변 영역 MDX10H는 서열번호: 38, 경쇄 가변 영역 MDX10L은 서열번호: 39) 및 항인간 CD3 항체(중쇄 가변 영역 TR01H113은 서열번호: 40, 경쇄 가변 영역 L0011은 서열번호: 41)에 대해서 상기의 기술을 적용함으로써, 목적하는 이중 특이성 항체를 제작할 수 있다.
(7-2) 항인간 CTLA4/항인간 CD3 이중 특이성 항체의 in vitro에 있어서의 제어성 T 세포에 대한 세포 상해 활성
건상인 도너 2명에 대해 헤파린 채혈을 행하고, 각각의 혈액을 5% FBS (Moregate BioTech)를 포함하는 HBSS(GIBCO)로 희석한 후, Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)에 중층했다. 400x g로 30분간 원심 분리하여, 말초혈 단핵구(PBMC) 획분을 분리했다. 얻어진 PBMC를 10% FBS, 100Units/mL penicillin-100μg/mL Streptomycin(GIBCO)을 포함하는 RPMI 1640(Nacalai Tesque) 배지에서 5x105 세포/웰이 되도록 96 well round bottom plate(Corning)에 파종했다.
컨트롤 항체(항KLH 인간 IgG1 중쇄 가변 영역 IC17H는 서열번호: 43, 경쇄 가변 영역 IC17L은 서열번호: 44, 중쇄 정상 영역 hIgG1d는 서열번호: 45, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34), 또는 MDX10//TR01H113을 각각 최종 농도 0.1μg/mL, 1μg/mL, 10μg/mL가 되도록 배지에서 희석하여, 웰에 첨가했다. 37℃, 5% CO2로 설정한 CO2 인큐베이터에서 7일간 배양했다.
7일 후에 세포를 V bottom plate(Corning)로 옮겨, 400x g로 5분간 원심 분리하여, 상청을 제거했다. 1% FBS, 2mM EDTA(Sigma)를 포함하는 PBS(FACS buffer)로 10배 희석한 FcR blocking reagent(Miltenyi Biotec) 100μL로, 세포를 재현탁했다. 10분간 실온에서 인큐베이트한 후, PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4(BD Pharmingen)를 2.5μL, PE Mouse Anti-Human CD25(BD Pharmingen)를 5μL, PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD45RA(BD Pharmingen)를 2.5μL 각 웰에 가했다. 4℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 100μL의 FACS buffer를 가하고 400x g로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거했다.
Intracellular Fixation and Permeabilization buffer set(eBioscience)의 프로토콜에 기초하여, Human FoxP3 buffer A를 100μL씩 가하고 차광하여, 실온에서 10분간 인큐베이트했다. 그 후 400x g로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거했다. Permeabilization buffer를 100μL씩 가하고 차광하여, 30분간 실온에서 인큐베이트했다. 100μL의 FACS buffer를 가하고 400x g로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거했다. 이 세정 조작을 1회 더 행했다.
100μL의 FACS buffer로 재현탁하고, Alexa Fluor488 Anti-Human FoxP3(BioLegend)을 5μL씩 가하고 차광하여, 30분간 실온에서 인큐베이트했다. 100μL의 FACS buffer를 가하고 400x g로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거했다. 이 세정 조작을 1회 더 행했다. 200μL의 FACS buffer로 재현탁하고, FACS CantoII 유동 세포 분석기(BD)로 해석했다.
FACSDiva Software(BD)로 발현 해석을 행했다. 해석 대상이 되는 세포 집단에 대해서 CD4 양성 세포를 게이팅하여, CD25 및 CD45RA의 발현을 해석했다. CD25high CD45RA-의 획분, CD25-CD45RA+의 획분을 각각 제어성 T 세포(Regulatory T cell(Treg)), 이펙터 T 세포(Effector T cell(Teff))로 했다. 또한, FoxP3highCD45RA-의 획분, FoxP3-CD45RA+의 획분을 각각 Treg, Teff로 했다. CD4 양성 세포 중의 Treg 및 Teff의 존재 비율로부터 Teff/Treg비를 산출했다.
CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 CD4 양성 세포를 해석한 결과를 나타냈다 (도 10a). 도너 1에 있어서 MDX10//TR01H113 1μg/mL, 10μg/mL 처리에 의해 Treg의 감소가 인정되었다. 또한, 도너 2에 있어서는 1μg/mL 처리에 의해 Treg의 감소 경향이 보이고, 10μg/mL에 의해 현저한 감소가 인정되었다(도 10b). 양 도너에 있어서, MDX10//TR01H113 1μg/mL, 및 10μg/mL 처리는, Teff/Treg비를 증가시켰다(도 10c).
또한, FoxP3 및 CD45RA 발현에 기초하여 Treg를 해석한 결과를 도 11a에 나타냈다. CD25 및 CD45RA에서의 해석과 마찬가지로, MDX10//TR01H113 처리에 의해 Treg는 감소하고, Teff/Treg비는 증가했다(도 11b, 도 11c).
본 검토에 의해, 마우스 in vivo에 있어서 CTLA4를 발현하는 제어성 T 세포에 대한 세포 상해 활성에 대해 보다 강한 항종양 효과를 나타낸 TRAB(CTLA4와 CD3에 대한 이중 특이성 항체)는, 인간 in vitro에 있어서도 제어성 T 세포에 대한 강한 세포 상해 활성을 나타내므로, 암환자에 대해서 강한 항종양 효과를 발휘할 것이 기대된다.
〔실시예 8〕 면역 응답 억제 기능이 높다고 보고되어 있는 세포 획분(CD4+, CD25high, CD45RA-)에 발현하고 있는 표면 분자의 해석
면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포 중, CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 계산된 CD4 양성 T 세포 중의 제어성 T 세포(Treg), 즉 CD4+ CD25high CD45RA- 의 세포 획분은, 면역 응답 억제 기능이 높다고 보고되어 있다(Immunity, 2009, 30 (6), 899-911). 이 정보에 기초하여, CD4 양성 세포 중에서, CD25high CD45RA-의 세포 획분에서 유의하게 발현이 높은 세포 표면 분자를 코드하는 유전자를, RNA-seq를 이용하여 동정했다. 그 결과, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하는 분자인 CTLA4, PD1, TIM3, LAG3, CD244(2B4), CD160, GARP, OX40, CD137(4-1BB), CD25, VISTA, BTLA, TNFR25, CD57, KLRG1, CCR2, CCR5, CCR6, CD39, CD73, CD4, CD18, CD49b, CD1d, CD5, CD21, TIM1, CD19, CD20, CD23, CD24, CD38, CD93, IgM, B220(CD45R), CD317, PD-L1, CD11b, Ly6G, ICAM-1, FAP, PDGFR, Podoplanin 및 TIGIT의 분자 중, CTLA4, TIM3, LAG3, CD137(4-1BB), CD25, CCR5, CCR6, CD38, 및 TIGIT의 9개의 분자가, 면역 응답 억제 기능이 높다고 보고되어 있는 세포 획분(CD4+, CD25high, CD45RA-)에서 특이적으로 발현이 높은 세포 표면 분자라는 것이 판명되었다.
〔실시예 9〕 항인간 LAG3/항인간 CD3 이중 특이성 항체에 의한 in vitro 약효 평가
(9-1) 인간 LAG3 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중 특이성 항체의 발현과 정제
항인간 LAG3 항체 25F7-F760nN17의 가변 영역(중쇄 가변 영역 25F7H는 서열번호: 46, 경쇄 가변 영역 25F7L은 서열번호: 47)을 코드하는 유전자를, 각각 인간 IgG1/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은, Fcγ 수용체로의 결합을 저감하고, 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 F760nN17은 서열번호: 33, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34).
또한, 항인간 CD3 항체 TR01H113-F760nG3P17의 가변 영역(중쇄 가변 영역 TR01H113은 서열번호: 40, 경쇄 가변 영역 L0011은 서열번호: 41)을 코드하는 유전자를, 각각 인간 IgG1/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은, Fcγ 수용체로의 결합을 저감하고, 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 F760nG3P17은 서열번호: 42, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34).
25F7-F760nN17, TR01H113-F760nG3P17은, 각각 실시예 2에 나타난 방법으로 발현, 정제했다. 정제한 각각의 호모체를 표 4의 조합으로 혼합하고, 당업자 공지의 수법(WO2015/046467)을 이용하여 목적하는 이중 특이성 항체를 제작했다.
Figure pct00004
(9-2) 항인간 LAG3/항인간 CD3 이중 특이성 항체의 in vitro에 있어서의 제어성 T 세포에 대한 세포 상해 활성
건상인 도너에 대해 헤파린 채혈을 행하고, 각각의 혈액을 PBS로 희석한 후, Leucosep 튜브(greiner bio-one)를 이용하여 Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)와 함께 중층했다. 1000x g로 10분간 원심 분리하여, 말초혈 단핵구(PBMC) 획분을 분리했다. 얻어진 PBMC를 10% FBS, 100 Units/mL penicillin-100μg/mL Streptomycin(GIBCO)을 포함하는 RPMI 1640(Nacalai Tesque) 배지에서 1x106 세포/웰이 되도록 96 well round bottom plate(Corning)에 파종했다.
TRAB(25F7//TR01H113)를 최종 농도 1μg/mL, 10μg/mL가 되도록 배지에서 희석하여, 웰에 첨가했다. 37℃, 5% CO2로 설정한 CO2 인큐베이터에서, 4일간 또는 6일간 배양했다.
4일 후 또는 6일 후에 세포를 FACS 해석용 튜브로 옮기고, 400x g로 5분간 원심 분리하여, 상청을 제거했다. 0.2% BSA(Wako)를 포함하는 Cell WASH(BD Biosciences)를 준비하여, 이것을 FACS Buffer로 했다. 배지 성분을 완전히 없애기 위해서, 상청을 제거한 세포에 FACS Buffer를 2mL 가하고 재차 400x g로 5분간 원심 분리하여, 상청을 제거하고 세정을 행했다.
FcR blocking reagent(Miltenyi Biotec)를 FACS Buffer로 10배 희석하고, 그것에 1/1000volume의 사(死) 세포 염색용의 eFluor780(eBioscience)을 가한 것을 준비하고, 이것을 Staining Buffer로 했다. Staining buffer 50μL에 PerCP Mouse Anti-Human CD4(BD Pharmingen)를 5μL , PE-CyTM7 Mouse Anti-Human CD45RA(BD Pharmingen)를 2.5μL, PE Mouse Anti-Human CD25를 5μL 가한 것을 각 튜브에 가하고 4℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 2mL의 FACS buffer를 가하고 400x g로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 세정 조작으로서 추가로 2mL의 FACS buffer를 가하고 400x g로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거했다. 400μL의 FACS buffer로 재현탁하고, FACSVerseTM 유동 세포 분석기(BD)로 해석을 행했다.
FACSDiva Software(BD)로 발현 해석을 행했다. 사 세포를 제외한 해석 대상이 되는 세포 집단으로부터 CD4 양성 세포를 게이팅하여, CD25 및 CD45RA의 발현을 해석했다. CD25high CD45RA-의 획분, CD25-CD45RA+의 획분을 각각 제어성 T 세포(Regulatory T cell(Treg)), 이펙터 T 세포(Effector T cell(Teff))로 했다. CD4 양성 세포 중의 Treg 및 Teff의 존재 비율로부터 Teff/Treg비를 산출했다.
CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 CD4 양성 세포를 해석한 결과를 나타냈다(도 13). TRAB(25F7//TR01H113) 1μg/mL, 10μg/mL 처리에 의해, 4일 후, 6일 후 모두, TRAB 항체의 용량 의존적으로 Treg의 감소가 인정되었다(도 14). 또한, TRAB(25F7//TR01H113) 1μg/mL 및 10μg/mL 처리는, Teff/Treg비를 증가시켰다(도 15).
〔실시예 10〕 항인간 OX40/항인간 CD3 이중 특이성 항체에 의한 in vitro 약효 평가
(10-1) 인간 OX40 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중 특이성 항체의 발현과 정제
항인간 OX40 항체 12H3-F760nN17의 가변 영역(중쇄 가변 영역 12H3VH는 서열번호: 48, 경쇄 가변 영역 12H3VL은 서열번호: 49)을 코드하는 유전자를, 각각 인간 IgG1/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은, Fcγ 수용체로의 결합을 저감하고, 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 F760nN17은 서열번호: 33, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34).
또한, 항인간 CD3 항체 TR01H113-F760nG3P17의 가변 영역(중쇄 가변 영역 TR01H113은 서열번호: 40, 경쇄 가변 영역 L0011은 서열번호: 41)을 코드하는 유전자를, 각각 인간 IgG1/kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입했다. 이 때, 정상 영역은, Fcγ 수용체로의 결합을 저감하고, 2개의 중쇄가 헤테로 회합화하도록 개변을 가한 정상 영역을 사용하고 있다(중쇄 정상 영역 F760nG3P17은 서열번호: 42, 경쇄 정상 영역 k0은 서열번호: 34).
12H3-F760nN17, TR01H113-F760nG3P17은, 각각 실시예 2에 나타난 방법으로 발현, 정제했다. 정제한 각각의 호모체를 표 5의 조합으로 혼합하고, 당업자 공지의 수법(WO2015/046467)을 이용하여 목적하는 이중 특이성 항체를 제작했다.
Figure pct00005
(10-2) 항인간 OX40/항인간 CD3 이중 특이성 항체의 in vitro에 있어서의 제어성 T 세포에 대한 세포 상해 활성
2명의 건상인 도너에 대해 헤파린 채혈을 행하고, 각각의 혈액을 PBS로 희석한 후, Leucosep 튜브(greiner bio-one)를 이용하여 Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)와 함께 중층했다. 1000x g로 10분간 원심 분리하여, 말초혈 단핵구(PBMC) 획분을 분리했다. 얻어진 PBMC를 10% FBS, 100 Units/mL penicillin-100μg/mL Streptomycin(GIBCO)을 포함하는 RPMI 1640(Nacalai Tesque) 배지에서 1x106 세포/웰이 되도록 96 well round bottom plate(Corning)에 파종했다.
TRAB(12H3//TR01H113)를 최종 농도 1μg/mL, 10μg/mL가 되도록 배지에서 희석하여, 웰에 첨가했다. 37℃, 5% CO2로 설정한 CO2 인큐베이터에서 7일간 배양했다.
7일 후에 세포를 FACS 해석용 튜브로 옮기고, 400x g로 5분간 원심 분리하여, 상청을 제거했다. 0.2% BSA(Wako)를 포함하는 Cell WASH(BD Biosciences)를 준비하고, 이것을 FACS Buffer로 했다. 배지 성분을 완전히 없애기 위해서, 상청을 제거한 세포에 FACS Buffer를 2mL 가하고 재차 400x g로 5분간 원심 분리하여, 상청을 제거하고 세정을 행했다.
FcR blocking reagent(Miltenyi Biotec)를 FACS Buffer로 10배 희석하고, 그것에 1/1000volume의 사 세포 염색용의 eFluor780(eBioscience)을 가한 것을 준비하고, 이것을 Staining Buffer로 했다. Staining buffer 50μL에 PerCP Mouse Anti-Human CD4(BD Pharmingen)를 5μL, PE-CyTM7 Mouse Anti-Human CD45RA(BD Pharmingen)를 2.5μL, PE Mouse Anti-Human CD25를 5μL 가한 것을 각 튜브에 가하고 4℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 2mL의 FACS buffer를 가하고 400x g로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 세정 조작으로서 추가로 2mL의 FACS buffer를 가하고 400x g로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거했다. 400μL의 FACS buffer로 재현탁하고, FACSVerseTM 유동 세포 분석기(BD)로 해석을 행했다.
FACSDiva Software(BD)로 발현 해석을 행했다. 사 세포를 제외한 해석 대상이 되는 세포 집단으로부터 CD4 양성 세포를 게이팅하여, CD25 및 CD45RA의 발현을 해석했다. CD25high CD45RA-의 획분, CD25-CD45RA+의 획분을 각각 제어성 T 세포(Regulatory T cell(Treg)), 이펙터 T 세포(Effector T cell(Teff))로 했다. CD4 양성 세포 중의 Treg 및 Teff의 존재 비율로부터 Teff/Treg비를 산출했다.
CD25 및 CD45RA의 발현에 기초하여 CD4 양성 세포를 해석한 결과를 나타냈다(도 16). 쌍방의 도너 유래의 PBMC에 있어서, TRAB(12H3//TR01H113) 1μg/mL, 10μg/mL 처리에 의해, TRAB 항체의 용량 의존적으로 Treg의 감소가 인정되었다(도 17). 또한, TRAB(12H3//TR01H113) 1μg/mL, 및 10μg/mL 처리는, Teff/Treg비를 증가시켰다(도 18).
〔참고예 1〕 마우스 FcgR4 발현 인간 NK 세포주 NK-92를 이펙터 세포로서 이용한 피검 항체의 ADCC 활성
항마우스 CTLA4 항체에 대해, 이하의 방법에 따라, 마우스 FcgR4 발현 인간 NK 세포주 NK-92(이하, mFcgR4-NK92로 지칭한다.)를 이펙터 세포로서 이용하여 피검 항체의 항체 농도 의존적인 ADCC 활성을 측정했다.
(1) mFcgR4-NK92 용액의 조제
mFcgR4-NK92를, 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640(nacalai tesque)(이하 10% FBS/RPMI라고 칭한다)에 의해 세정한 후, 당해 세포가 10% FBS/RPMI 중에 그 세포 밀도가 4x105 세포/ml가 되도록 현탁했다. 당해 세포 현탁액을 mFcgR4-NK92 용액으로서 이후의 실험에 제공했다.
(2) 표적 세포의 조제
CHO 세포에 마우스 CTLA4를 강제 발현시킨 CHO/마우스 CTLA4 2x106 세포에 3.7MBq의 Cr-51을 가했다. Cr-51을 가한 세포를 5% 탄산 가스 인큐베이터 중에서 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 10% FBS/RPMI로 3회 세포를 세정하고, 당해 세포가 10% FBS/RPMI 중에 그 세포 밀도가 2x105 세포/ml가 되도록 현탁했다. 당해 세포 현탁액을 표적 세포로서 이후의 실험에 제공했다.
(3) 크로뮴 유리 시험(ADCC 활성)
ADCC 활성을 크로뮴 릴리스법에 의한 특이적 크로뮴 유리율로 평가했다. 우선, 각 농도(0, 0.04, 0.4, 4, 40μg/ml)로 조제한 항체 용액을 96웰 U바닥 플레이트의 각 웰 중에 50μl씩 첨가했다. 다음에, (2)에서 조제한 표적 세포를 50μl씩 파종했다(1x104 세포/웰). 추가로 10% FBS/RPMI를 50μl씩 첨가하고, 실온에서 15분간 정치했다. 각 웰 중에 (1)에서 조제한 mFcgR4-NK92 용액 각 50μl(2x104 세포/웰)를 가한 당해 플레이트를, 5% 탄산 가스 인큐베이터 중에서 37℃에서 4시간 정치한 후에, 원심 조작했다. 당해 플레이트의 각 웰 중의 100μl의 배양 상청의 방사 활성을 감마 카운터를 이용하여 측정했다. 아래 식에 기초하여 특이적 크로뮴 유리율을 구했다.
크로뮴 유리율(%)=(A-C)×100/(B-C)
위 식에 있어서, A는 각 웰 중의 100μl의 배양 상청의 방사 활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 또한, B는 표적 세포에 50μl의 4% NP-40 수용액(Nonidet P-40, 나카라이테스크) 및 100μl의 10% FBS/RPMI를 첨가한 웰 중의 100μl의 배양 상청의 방사 활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 또한, C는 표적 세포에 150μl의 10% FBS/RPMI를 첨가한 웰 중의 100μl의 배양 상청의 방사 활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 시험은 duplicate로 실시하여, 피검 항체의 특이적 크로뮴 유리율(%)의 평균치를 산출했다.
〔참고예 2〕 마우스 비장 세포를 이펙터 세포로서 이용한 피검 항체의 세포 상해 활성의 측정
항마우스 CTLA4/항마우스 CD3 이중 특이성 항체 (hUH02UL01/2C11-F760)에 대해, 이하의 방법에 따라, 마우스 비장 세포를 이펙터 세포로서 이용하여 피검 항체의 항체 농도 의존적인 세포 상해 활성을 측정했다.
(1) 마우스 비장 세포 용액의 조제
BALB/c 마우스로부터 적출한 비장에 10% FBS/RPMI를 10mL 가하고 세절화했다. 셀 스트레이너를 통과시키고, 원심 분리(2,150rpm, 10분간, 실온) 후, Mouse Erythrocyte Lysing Kit(R&D Systems)로 용혈 조작을 행했다. 10% FBS/RPMI로 1회 세정한 후, 당해 세포가 10% FBS/RPMI 중에 그 세포 밀도가 6x106 세포/ml가 되도록 현탁했다. 당해 세포 현탁액을 마우스 비장 세포 용액으로서 이후의 실험에 제공했다.
(2) 세포 상해 활성 평가 시험
세포 상해 활성은, xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저(로슈·다이아그노스틱스사)를 이용한 세포 증식 억제율로 평가했다. 표적 세포로는, CHO에 마우스 CTLA4를 강제 발현시킨 CHO/mCTLA4를 이용했다. 당해 세포를 10% FBS를 포함하는 CHO-S-SFM II(Life technologies)로 현탁하고, 5×103 세포/웰이 되도록 E-Plate 96 플레이트(로슈·다이아그노스틱스사)에 100μl 파종하고, xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저를 이용하여 생(生) 세포의 측정을 개시했다. 익일 xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저로부터 플레이트를 꺼내고, 당해 플레이트에 각 농도(0.04, 0.4, 4, 40μg/ml)로 조제한 각 항체 50μl를 첨가했다. 실온에서 15분간 정치한 후에 (1)에서 조제한 마우스 비장 세포 용액 50μl(3×105 세포/웰)를 가하고 xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저에 당해 플레이트를 재세팅하는 것에 의해, 생 세포의 측정을 개시했다. 반응은 5% 탄산 가스, 37℃ 인큐베이터 중에서 행하여, 마우스 비장 세포 용액 첨가 72시간 후의 Cell Index치로부터, 아래 식에 의해 세포 증식 억제율(%)을 구했다. 한편, 계산에 이용한 Cell Index치에는, 항체 첨가 직전의 Cell Index치가 1이 되도록 노멀라이즈한 후의 수치를 이용했다.
세포 증식 억제율(%)=(A-B)×100/(A-1)
A는 항체를 첨가하지 않은 웰에 있어서의 Cell Index치의 평균치(표적 세포와 인간 PBMC만), B는 각 웰에 있어서의 Cell Index치의 평균치를 나타낸다. 시험은 duplicate로 실시했다.
본 발명에 의해, 우수한 항종양 활성을 갖는 새로운 항원 결합 분자 또는 의약 조성물이 제공되었다. 본 발명의 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물이, 면역 응답을 억제하는 기능을 저해함으로써, 세포 상해 작용을 활성화시켜, 다양한 암을 치료 또는 예방하는 것이 가능해진다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA OSAKA UNIVERSITY <120> T CELL-REDIRECTED ANTIGEN-BINDING MOLECULE FOR CELLS HAVING IMMUNOSUPPRESSION FUNCTION <130> C1-A1402P <140> PCT/JP2015/063716 <141> 2015-05-13 <150> JP 2014-099707 <151> 2014-05-13 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Ser Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Ile Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ile Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Asp Trp Asp Lys Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Asn Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Ser Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 37 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 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60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 39 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser 100 105 110 <210> 40 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Gln Asn Tyr Ala Thr Tyr Val Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Ala Ala Gly Tyr Gly Val Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly 85 90 95 Thr Gln Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 42 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 42 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 43 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Tyr Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val 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Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 46 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 46 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val 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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (18)

  1. 하기의 도메인;
    (1) 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자에 결합하는 도메인, 및
    (2) T 세포 수용체 복합체에 결합하는 도메인
    을 포함하고, 면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 면역 응답 억제 활성을 저해하는 항원 결합 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포가, 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포인 항원 결합 분자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자가, CTLA4, PD1, TIM3, LAG3, CD244(2B4), CD160, GARP, OX40, CD137(4-1BB), CD25, VISTA, BTLA, TNFR25, CD57, KLRG1, CCR2, CCR5, CCR6, CD39, CD73, CD4, CD18, CD49b, CD1d, CD5, CD21, TIM1, CD19, CD20, CD23, CD24, CD38, CD93, IgM, B220(CD45R), CD317, PD-L1, CD11b, Ly6G, ICAM-1, FAP, PDGFR, Podoplanin 및 TIGIT로부터 선택되는 어느 하나의 분자인 항원 결합 분자.
  4. 제 3 항에 있어서,
    면역 응답을 억제하는 기능을 갖는 세포의 표면에 발현하고 있는 분자가, CTLA4, TIM3, LAG3, CD137(4-1BB), CD25, CCR5, CCR6, CD38, TIGIT, 및 OX40으로부터 선택되는 어느 하나의 분자인 항원 결합 분자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T 세포 수용체 결합 도메인인 항원 결합 분자.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인 항원 결합 분자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    FcRn 결합 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자.
  8. 제 7 항에 있어서,
    FcRn 결합 도메인이, 항체의 Fc 영역인 항원 결합 분자.
  9. 제 8 항에 있어서,
    FcRn 결합 도메인이, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 항체의 Fc 영역인 항원 결합 분자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중 특이성 항체인 항원 결합 분자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는, 의약 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는, 면역 응답의 억제 활성을 저해하기 위한 의약 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    면역 응답의 억제 활성의 저해가, T 세포에 의한 저해인 의약 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    T 세포에 의한 저해가, T 세포의 세포 상해 활성에 의한 저해인 의약 조성물.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 응답의 억제 활성이, 제어성 T 세포 또는 피폐 T 세포에 의한 활성인 의약 조성물.
  16. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 응답의 억제 활성이, CTLA4, PD1, TIM3, LAG3, CD244(2B4), CD160, GARP, OX40, CD137(4-1BB), CD25, VISTA, BTLA, TNFR25, CD57, KLRG1, CCR2, CCR5, CCR6, CD39, CD73, CD4, CD18, CD49b, CD1d, CD5, CD21, TIM1, CD19, CD20, CD23, CD24, CD38, CD93, IgM, B220(CD45R), CD317, PD-L1, CD11b, Ly6G, ICAM-1, FAP, PDGFR, Podoplanin 및 TIGIT로부터 선택되는 어느 하나의 분자를 발현하는 세포의 활성인 의약 조성물.
  17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 치료제인 의약 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    난소암, 위암, 식도암, 췌장암, 신장세포암, 간세포암, 유방암, 악성 흑색종, 비소세포 폐암, 자궁경암, 교아종, 전립선암, 신경아종양, 만성 림프성 백혈병, 갑상선 유두암, 대장암, 호지킨 림프종 및 자궁 내막증으로부터 선택되는 어느 하나의 암의 치료제인 의약 조성물.
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