CN110023337B - 抗lag-3抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供特异性结合至LAG‑3(例如人类LAG‑3)且拮抗LAG‑3功能的抗体。还提供包含这些抗体的药物组合物、编码这些抗体的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。

Description

抗LAG-3抗体及其使用方法
1.相关申请
本申请要求2016年10月11日提交的美国临时申请第62/406,766号和2016年11月10日提交的美国临时申请第62/420,280号的权益，各临时申请以引用的方式整体并入本文中。
2.技术领域
本公开涉及特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体及其使用方法。
3.背景技术
淋巴细胞活化基因3(LAG-3)(又称CD223)是免疫球蛋白(Ig)超家族中的I型膜蛋白，其由四个细胞外Ig结构域以及一个含有保守重复EP基序和单个保守KIEELE基序的细胞质结构域构成(Triebel等人(1990)J Exp Med,171:1393-405；Workman等人(2002)JImmunol,169:5392-5)。LAG-3是在活化的效应性T淋巴细胞(Teff)、活化的调节性T淋巴细胞(Treg)、活化的B淋巴细胞、静息自然杀伤(NK)细胞亚群以及静息浆细胞样树突状细胞(PDC)上表达(Huang等人(2004)Immunity,21:503-13；Workman等人(2009)J Immunol,182:1885-91；Kisielow等人(2005)Eur J Immunol,35:2081-8；Baixeras等人(1992)J ExpMed,176:327-37；Workman等人(2002)Eur J Immunol,32:2255-63)。在持久暴露于抗原的条件下，诸如在慢性致病性感染中或在肿瘤微环境(TME)内，LAG-3在1型调节性T细胞(Tr1)和所谓的耗竭的抗原特异性T细胞上持续表达(Park等人(2012)Cell Immunol,278:76-83；Gagliani等人(2013)Nat Med,19:739-46；Blackburn等人(2009)Nat Immunol,10:29-37)。
LAG-3用于负调控活化的T细胞。LAG-3的配体是在抗原递呈细胞(APC)和活化T细胞上表达的II类MHC(Roche和Furuta(2015)Nat Rev Immunol,15:203-16)。LAG-3与其配体之间的相互作用抑制CD4+和CD8+Teff细胞的增殖和细胞因子分泌(Macon-Lemaitre和Triebel(2005)Immunology,115:170-8；Huard等人(1997)Proc Natl Acad Sci U S A,94:5744-9)。Treg和PDC中的LAG-3促成对T细胞功能的负调控(Huang等人(2004)Immunity,21:503-13；Workman等人(2009)J Immunol,182:1885-91)。与LAG-3在维持免疫自稳中的作用相符，其缺少在另外遗传性缺少PD-1的小鼠中诱发致死性心肌炎(Okazaki等人(2011)JExp Med,208:395-407)。此外，在同基因小鼠肿瘤模型中，在体内用针对小鼠LAG-3的单克隆抗体阻断与PD-1阻断协同加强抗肿瘤免疫性(Woo等人(2012)Cancer Res,72:917-27)。
鉴于LAG-3在调节免疫反应方面的作用，经设计以拮抗LAG-3信号传导的治疗剂大有希望治疗涉及LAG-3介导的免疫抑制的疾病。
4.发明内容
本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且拮抗LAG-3功能(例如LAG-3介导的免疫抑制)的抗体。还提供包含这些抗体的药物组合物、编码这些抗体的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。本文所公开的抗体特别适用于响应于抗原(例如肿瘤抗原或感染性疾病抗原)来增加T细胞活化和/或减少Treg介导的免疫抑制，且因此可用于治疗受试者的癌症或者治疗或预防受试者的感染性疾病。
因此，在一个方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区和包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：
(a)CDRH1包含氨基酸序列DX1YX2X3(SEQ ID NO:140)，其中
X1是T或N，
X2是I或M，且
X3是H、Y或D；
(b)CDRH2包含氨基酸序列X1IDPANX2X3X4X5X6X7PX8X9QX10(SEQ ID NO:142)，其中
X1是E、R、S或K，
X2是D或G，
X3是N或H，
X4是T或S，
X5是K或H，
X6是Y或F，
X7是D或A，
X8是K或R，
X9是F或L，且
X10是G或D；
(c)CDRH3包含氨基酸序列YX1X2X3YX4VGGX5DY(SEQ ID NO:144)，其中
X1是Y、F或S，
X2是Y或D，
X3是K或R，
X4是D或E，且
X5是F或C；
(d)CDRL1包含氨基酸序列SVSSX1ISSSX2LX3(SEQ ID NO:147)，其中
X1是S或G，
X2是N或T，且
X3是H或Y；
(e)CDRL2包含氨基酸序列GTSNLAS(SEQ ID NO:104)，且
(f)CDRL3包含氨基酸序列QQWX1X2YPX3T(SEQ ID NO:149)，其中
X1是S、N或R，
X2是S、T或R，且
X3是F、L、H或W。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区和包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：
(a)CDRH1包含氨基酸序列DX1YX2X3(SEQ ID NO:140)，其中
X1是T或N，
X2是I或M，且
X3是H、Y或D；
(b)CDRH2包含氨基酸序列X1IDPANX2X3X4X5X6X7PX8X9QX10(SEQ ID NO:142)，其中
X1是E、R、S或K，
X2是D或G，
X3是N或H，
X4是T或S，
X5是K或H，
X6是Y或F，
X7是D或A，
X8是K或R，
X9是F或L，且
X10是G或D；
(c)CDRH3包含氨基酸序列YX1X2X3YX4VGGX5DY(SEQ ID NO:144)，其中
X1是Y、F或S，
X2是Y或D，
X3是K或R，
X4是D或E，且
X5是F或C；
(d)CDRL1包含氨基酸序列SVSSX1ISSSX2LX3(SEQ ID NO:147)，其中
X1是S或G，
X2是N或T，且
X3是H或Y；
(e)CDRL2包含氨基酸序列GTSNLAS(SEQ ID NO:104)；且
(f)CDRL3包含氨基酸序列QQWX1X2YPX3T(SEQ ID NO:149)，其中
X1是S、N或R，
X2是S、T或R，且
X3是F、L、H或W。
在某些实施方案中，CDRH1包含氨基酸序列DX1YX2X3(SEQ ID NO:141)，其中：X1是T或N；X2是I或M；且X3是H或Y。在某些实施方案中，CDRH2包含氨基酸序列X1IDPANX2X3X4KX5X6PX7FQX8(SEQ ID NO:143)，其中：X1是E、R或S；X2是D或G；X3是N或H；X4是T或S；X5是Y或F；X6是D或A；X7是K或R；且X8是G或D。在某些实施方案中，CDRH3包含氨基酸序列YX1X2X3YDVGGX4DY(SEQ ID NO:145)，其中：X1是Y、F或S；X2是Y或D；X3是K或R；且X4是F或C。在某些实施方案中，CDRH3包含氨基酸序列YYYX1YX2VGGFDY(SEQ ID NO:146)，其中：X1是K或R；且X2是D或E。在某些实施方案中，CDRL1包含氨基酸序列SVSSSISSSNLX1(SEQ ID NO:148)，其中：X1是H或Y。在某些实施方案中，CDRL3包含氨基酸序列QQWX1SYPX2T(SEQ ID NO:150)，其中：X1是S、N或R；且X2是F、L或H。
在某些实施方案中：
(a)CDRH1包含氨基酸序列DTYIH(SEQ ID NO:79)；
(b)CDRH2包含氨基酸序列EIDPANDNTKYDPKFQG(SEQ ID NO:90)；
(c)CDRH3包含氨基酸序列YYYX1YX2VGGFDY(SEQ ID NO:146)，其中：X1是K或R；且X2是D或E；
(d)CDRL1包含氨基酸序列SVSSSISSSNLH(SEQ ID NO:100)；
(e)CDRL2包含氨基酸序列GTSNLAS(SEQ ID NO:104)；且
(f)CDRL3包含氨基酸序列QQWSSYPFT(SEQ ID NO:105)。
在某些实施方案中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:79、90和98中所陈述的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:65或220具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:65或220具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:220。在某些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:65。在某些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:220。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:226的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:169的重链。
在某些实施方案中，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:100、104和105中所陈述的氨基酸序列。在某些实施方案中，轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:73或221具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:73或221具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:221。在某些实施方案中，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:73。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:228的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在某些实施方案中，CDRH1包含选自由SEQ ID NO:78-82组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDRH2包含选自由SEQ ID NO:83-93组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDRH3包含选自由SEQ ID NO:94-99组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDRL1包含选自由SEQ ID NO:100-103组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDRL3包含选自由SEQ ID NO:105-112组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:78、83和94；78、85和95；78、86和96；78、86和97；78、91和94；78、92和96；79、84和95；79、88和95；79、89和95；79、90和95；79、90和98；79、90和99；80、85和96；81、87和96；或82、93和95中所陈述的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施方案中，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:100、104和105；100、104和106；100、104和107；100、104和109；100、104和110；101、104和108；102、104和105；102、104和112；或103、104和111中所陈述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在某些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ IDNO:78、83、94、100、104和105；78、85、95、100、104和105；78、86、96、100、104和105；78、86、96、100、104和109；78、86、96、100、104和110；78、86、96、101、104和108；78、86、96、103、104和111；78、86、97、102、104和112；78、91、94、100、104和107；78、92、96、100、104和105；78、92、96、100、104和109；79、84、95、100、104和105；79、84、95、100、104和106；79、84、95、102、104和105；79、88、95、100、104和105；79、89、95、100、104和105；79、90、95、100、104和105；79、90、98、100、104和105；79、90、99、100、104和105；80、85、96、100、104和105；81、87、96、100、104和105；81、87、96、100、104和107；或82、93、95、100、104和105中所陈述的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区和包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:79、90、95、100、104和105中所陈述的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，其包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区和包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:79、90、95、100、104和105中所陈述的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区和包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:79、90、98、100、104和105中所陈述的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，其包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区和包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:79、90、98、100、104和105中所陈述的氨基酸序列。
在某些实施方案中，重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:65或220具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:65或220具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:220。在某些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:65。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQID NO:226的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:169的重链。
在某些实施方案中，轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:73或221具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:73或221具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:221。在某些实施方案中，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:73。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQID NO:228的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:228的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在某些实施方案中，重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:65或220具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，且轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:73或221具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:65或220具有至少98％同一性的氨基酸序列，且轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:73或221具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列SEQID NO:220。在某些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:65。在某些实施方案中，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:73或221。在某些实施方案中，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:73。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:65或220的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含与氨基酸序列SEQ ID NO:73或221具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含与氨基酸序列SEQID NO:73或221具有至少98％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:73或221的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含与氨基酸序列SEQ ID NO:65或220具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含与氨基酸序列SEQID NO:65或220具有至少98％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在某些实施方案中，所述抗体包括包含重链可变区序列SEQ ID NO:151或222的框架区的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:151或222的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含重链可变区序列SEQ ID NO:218或223的框架区的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:218或223的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含与选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:220。在某些实施方案中，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:65。在某些实施方案中，所述抗体包括包含选自由SEQ ID NO:168-186和225-227组成的组的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包含具有人类来源的框架区的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含重链可变框架区，其是或来源于由人类基因编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选自由以下组成的组：IGHV1-46*01(SEQ ID NO:153)、IGHV1-69-2*01(SEQID NO:154)、IGHV1-3*01(SEQ ID NO:155)、IGHV1-24*01(SEQ ID NO:156)、IGHV1-2*01(SEQ ID NO:157)、IGHV1-45*01(SEQ ID NO:158)和IGHV1-18*01(SEQ ID NO:159)。在某些实施方案中，所述抗体包含来源于氨基酸序列IGHV1-46*01(SEQ ID NO:153)的重链可变框架区，其中所述氨基酸序列IGHV1-46*01(SEQ ID NO:153)中至少一个氨基酸被相应非人类重链可变框架区中类似位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，氨基酸取代是在选自由以下组成的组的氨基酸位置处：4、5、12、23、27、28、29、30、48、69、71、75、76、80、81和94，其中所述氨基酸位置是根据Kabat编号系统指示。在某些实施方案中，氨基酸取代选自由以下组成的组：4M、5K、12V、23T、27F、28N、29I、30K、48I、69I、71A、75S、76N、80L、81Q和94T，其中所述氨基酸取代的位置是根据Kabat编号系统指示。在某些实施方案中，氨基酸取代是在选自由以下组成的组的氨基酸位置处：4、27、28、29、30、69、71和94，其中所述氨基酸位置是根据Kabat编号系统指示。在某些实施方案中，氨基酸取代选自由以下组成的组：4M、27F、28N、29I、30K、69I、71A和94T，其中所述氨基酸取代的位置是根据Kabat编号系统指示。
在某些实施方案中，所述抗体包括包含轻链可变区序列SEQ ID NO:152或224的框架区的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:152或224的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含与选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:221。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:73。在某些实施方案中，所述抗体包括包含选自由SEQ ID NO:187-191组成的组的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包含具有人类来源的框架区的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含轻链可变框架区，其是或来源于由人类基因编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选自由以下组成的组：IGKV3-20*01(SEQ ID NO:160)、IGKV3D-15*01(SEQ ID NO:161)、IGKV3-15*01(SEQ ID NO:161)、IGKV3D-20*01(SEQ ID NO:162)、IGKV3D-7*01(SEQ ID NO:163)、IGKV1-9*01(SEQ ID NO:164)和IGKV3-11*01(SEQ ID NO:165)。在某些实施方案中，所述抗体包含来自氨基酸序列IGKV3-20*01(SEQ ID NO:160)的轻链可变框架区。在某些实施方案中，所述抗体包含来源于氨基酸序列IGKV3-20*01(SEQ ID NO:160)的轻链可变框架区，其中所述氨基酸序列IGKV3-20*01(SEQ ID NO:160)中至少一个氨基酸被相应非人类轻链可变框架区中类似位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，氨基酸取代是在选自由以下组成的组的氨基酸位置处：3、22、36、43、47、58、70和71，其中所述氨基酸位置是根据Kabat编号系统指示。在某些实施方案中，氨基酸取代选自由以下组成的组：3L、22T、36F、43S、47W、58V、70S和71Y，其中所述氨基酸取代的位置是根据Kabat编号系统指示。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:220。在某些实施方案中，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:65。在某些实施方案中，所述抗体包括包含选自由SEQ ID NO:168-186和225-227组成的组的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:168的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:226的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:169的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQID NO:170的重链。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:220。在某些实施方案中，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:65。在某些实施方案中，所述抗体包括包含选自由SEQID NO:168-186和225-227组成的组的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:168的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:226的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:169的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:170的重链。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:221。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:73。在某些实施方案中，所述抗体包括包含选自由SEQ ID NO:187-191和228组成的组的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:228的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:221。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:73。在某些实施方案中，所述抗体包括包含选自由SEQID NO:187-191和228组成的组的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:228的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含SEQ ID NO:56和73；56和74；56和75；56和76；56和77；57和73；57和74；57和75；57和76；57和77；58和73；58和74；58和75；58和76；58和77；59和73；59和74；59和75；59和76；59和77；60和73；60和74；60和75；60和76；60和77；61和77；62和77；63和73；64和73；65和73；220和73；65和221；220和221；66和73；67和73；68和73；69和73；70和73；71和73；或72和73中所陈述的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO:65和73中所陈述的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO:220和73；65和221；或220和221中所陈述的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:56和73；56和74；56和75；56和76；56和77；57和73；57和74；57和75；57和76；57和77；58和73；58和74；58和75；58和76；58和77；59和73；59和74；59和75；59和76；59和77；60和73；60和74；60和75；60和76；60和77；61和77；62和77；63和73；64和73；65和73；220和73；65和221；220和221；66和73；67和73；68和73；69和73；70和73；71和73；或72和73中所陈述的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:65和73中所陈述的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别由SEQ IDNO:220和73；65和221；或220和221中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含SEQID NO:56和73；56和74；56和75；56和76；
56和77；57和73；57和74；57和75；57和76；57和77；58和73；58和74；58和75；58和76；58和77；59和73；59和74；59和75；59和76；59和77；60和73；60和74；60和75；60和76；60和77；61和77；62和77；63和73；64和73；65和73；220和73；65和221；220和221；66和73；67和73；68和73；69和73；70和73；71和73；或72和73中所陈述的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO:65和73中所陈述的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO:220和73；65和221；或220和221中所陈述的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:56和73；56和74；56和75；56和76；56和77；57和73；57和74；57和75；57和76；57和77；58和73；58和74；58和75；58和76；58和77；59和73；59和74；59和75；59和76；59和77；60和73；60和74；60和75；60和76；60和77；61和77；62和77；63和73；64和73；65和73；220和73；65和221；220和221；66和73；67和73；68和73；69和73；70和73；71和73；或72和73中所陈述的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:65和73中所陈述的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:220和73；65和221；或220和221中所陈述的氨基酸序列组成。
在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:220中的X是Q。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:220中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:221中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:221中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:220中的X是Q，且SEQ ID NO:221中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:220中的X是Q，且SEQ ID NO:221中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:220中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:221中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:220中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:221中的X是焦谷氨酸。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:168或225的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187或228的轻链。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:168的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:168或225的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187或228的轻链。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:168的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:169或226的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187或228的轻链。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:169的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:169或226的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187或228的轻链。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:169的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:170或227的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187或228的轻链。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:170的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:170或227的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187或228的轻链。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:170的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:168或225中所陈述的氨基酸序列组成，且所述轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:187或228中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:168和187中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:168或225中所陈述的氨基酸序列组成，且所述轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:187或228中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:168和187中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:169或226中所陈述的氨基酸序列组成，且所述轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:187或228中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:169和187中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:169或226中所陈述的氨基酸序列组成，且所述轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:187或228中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:169和187中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:170或227中所陈述的氨基酸序列组成，且所述轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:187或228中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:170和187中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:170或227中所陈述的氨基酸序列组成，且所述轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:187或228中所陈述的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供一种特异性结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:170和187中所陈述的氨基酸序列组成。
在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:225中的X是Q。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:225中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:225中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:225中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:225中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:225中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。
在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:226中的X是Q。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:226中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:226中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:226中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:226中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:226中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。
在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:227中的X是Q。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:227中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:227中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:227中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:227中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是E。在前述方面任一个的某些实施方案中，适当时，SEQ ID NO:227中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。
在某些实施方案中，所述抗体包含选自由人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2组成的组的重链恒定区。在某些实施方案中，重链恒定区是IgG1。在某些实施方案中，IgG1的氨基酸序列包含N297A突变(根据EU编号系统编号)。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:194的重链恒定区。在某些实施方案中，IgG1的氨基酸序列包含N297Q突变(根据EU编号系统编号)。在某些实施方案中，IgG1是无岩藻糖基化的IgG1。在某些实施方案中，重链恒定区是IgG4。在某些实施方案中，IgG4的氨基酸序列包含S228P突变(根据EU编号系统编号)。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:196的重链恒定区。
在某些实施方案中，抗体包含选自由人类IgGκ和IgGλ组成的组的轻链恒定区。在某些实施方案中，轻链恒定区是IgGκ。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链恒定区。在某些实施方案中，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:219的轻链恒定区。在某些实施方案中，轻链恒定区是IgGλ。
在另一方面，本公开提供一种与本文所公开的抗体交叉竞争结合至人类LAG-3的抗体或分离的抗体。在某些实施方案中，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其与分别包含SEQ ID NO:15和16中陈述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体交叉竞争结合至人类LAG-3。在某些实施方案中，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其与分别包含SEQ IDNO:65和73；220和73；65和221；或220和221中陈述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体交叉竞争结合至人类LAG-3。
在另一方面，本公开提供一种与本文所公开的抗体结合至相同的人类LAG-3表位的抗体或分离的抗体。在某些实施方案中，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其与分别包含SEQ ID NO:15和16中陈述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体结合至相同的人类LAG-3表位。在某些实施方案中，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其与分别包含SEQID NO:65和73；220和73；65和221；或220和221中陈述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体结合至相同的人类LAG-3表位。
在另一方面，本公开提供一种抗体或分离的抗体，其结合，例如特异性结合至人类LAG-3的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ IDNO:216组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:215组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:214组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:213组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:212组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:211组成的区域内的表位。
在另一方面，本公开提供一种与任何本发明的抗体特异性结合至相同的人类LAG-3表位的抗体或分离的抗体。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:216组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:215组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:214组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:213组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:212组成的区域内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至位于人类LAG-3的由氨基酸序列SEQ ID NO:211组成的区域内的表位。
在另一方面，本公开提供一种抗体，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:216中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:216中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在另一方面，本公开提供一种抗体，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:215中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:215中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在另一方面，本公开提供一种抗体，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:214中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQID NO:214中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在另一方面，本公开提供一种抗体，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:213中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:213中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在另一方面，本公开提供一种抗体，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQID NO:212中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:212中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在另一方面，本公开提供一种抗体，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:211中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:211中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在一些实施方案中，氢/氘交换减少是使用氢-氘交换(HDX)，例如，如本文在实施例中所描述测量。
在另一方面，本公开提供一种与任何本发明的抗体特异性结合至相同的人类LAG-3表位的抗体或分离的抗体。在某些实施方案中，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:216中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:216中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在某些实施方案中，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:215中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:215中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在某些实施方案中，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:214中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:214中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在某些实施方案中，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:213中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQID NO:213中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在某些实施方案中，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:212中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:212中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在某些实施方案中，如通过氢/氘检定所测定，所述抗体当结合至人类LAG-3蛋白或其包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的片段时，使得由SEQ ID NO:211中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换相对于在无所述抗体存在下由SEQ ID NO:211中所陈述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换减少。在一些实施方案中，氢/氘交换减少是使用氢-氘交换(HDX)，例如，如本文在实施例中所描述测量。
在某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗体是鼠类抗体。在某些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在某些实施方案中，所述抗体对人类LAG-3具有拮抗性。在某些实施方案中，所述抗体使人类LAG-3减活，降低或抑制其活性。在某些实施方案中，所述抗体抑制人类LAG-3与II类MHC的结合。在某些实施方案中，所述抗体诱导用葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的外周血单核细胞(PBMC)产生IL-2。在某些实施方案中，所述抗体诱导用抗CD3和抗CD28抗体刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)产生TNFα。
在另一方面，本公开提供与细胞毒性剂缀合的如本文所公开的抗体或分离的抗体。
在另一方面，本公开提供与细胞抑制剂缀合的如本文所公开的抗体或分离的抗体。
在另一方面，本公开提供与毒素缀合的如本文所公开的抗体或分离的抗体。
在另一方面，本公开提供与放射性核素缀合的如本文所公开的抗体或分离的抗体。
在另一方面，本公开提供与可检测标记缀合的如本文所公开的抗体或分离的抗体。
在另一方面，本公开提供如本文所公开的抗体或分离的抗体，其中重链可变区的N末端氨基酸残基是焦谷氨酸(例如，由重链可变区N末端E或Q残基的游离氨基翻译后环化所产生)。在另一方面，本公开提供如本文所公开的抗体或分离的抗体，其中重链的N末端氨基酸残基是焦谷氨酸(例如，由重链N末端E或Q残基的游离氨基翻译后环化所产生)。
在另一方面，本公开提供如本文所公开的抗体或分离的抗体，其中轻链可变区的N末端氨基酸残基是焦谷氨酸(例如，由轻链可变区N末端E或Q残基的游离氨基翻译后环化所产生)。在另一方面，本公开提供如本文所公开的抗体或分离的抗体，其中轻链的N末端氨基酸残基是焦谷氨酸(例如，由轻链N末端E或Q残基的游离氨基翻译后环化所产生)。
在另一方面，本公开提供如本文所公开的抗体或分离的抗体，其中所述重链是无糖基化的。
在另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含如本文所公开的抗体和药学上可接受的载剂或赋形剂。
在另一方面，本公开提供一种多核苷酸分离的多核苷酸，其编码如本文所公开的抗体的重链和/或轻链。在另一方面，本公开提供一种包含所述多核苷酸的载体。在另一方面，本公开提供一种包含所述多核苷酸的重组宿主细胞。在另一方面，本公开提供一种包含所述载体的重组宿主细胞。在另一方面，本公开提供一种产生如本文所公开的抗体的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞，以便表达所述多核苷酸并产生所述抗体。在一个实施方案中，所述方法是体外方法。
在一个实施方案中，本发明涉及用作药物的本发明的抗体，或本发明的药物组合物，或本发明的多核苷酸，或本发明的载体，或本发明的重组宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及用作诊断剂的本发明的抗体，或本发明的药物组合物，或本发明的多核苷酸，或本发明的载体，或本发明的重组宿主细胞。
在另一方面，本公开提供一种在受试者中响应于抗原来增加T细胞活化的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。在另一方面，本公开提供一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。在前述方法的某些实施方案中，所述抗体或药物组合物是经皮下施用。在前述方法的某些实施方案中，所述抗体或药物组合物是经静脉内施用。在前述方法的某些实施方案中，所述抗体或药物组合物是在肿瘤内施用。在前述方法的某些实施方案中，所述抗体或药物组合物是递送至肿瘤引流淋巴结。在前述方法的某些实施方案中，所述抗体或药物组合物是经动脉内施用。在前述方法的某些实施方案中，所述抗体或药物组合物是经鼻内施用。
在一个方面，本发明涉及用于响应于抗原来增加T细胞活化的方法中的本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物。
在一个方面，本发明涉及用于在受试者中响应于抗原来增加T细胞活化的方法中的本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物。
在一个方面，本发明涉及用于在受试者中响应于抗原来增加T细胞活化的方法中的本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物。
在一个方面，本发明涉及用于治疗癌症的方法中的本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物。
在一个方面，本发明涉及用于治疗受试者癌症的方法中的本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物。
在一个方面，本发明涉及用于治疗受试者癌症的方法中的本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物。
在用于本发明的用途的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物的一个实施方案中，所述抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物是经皮下或静脉内施用。在用于本发明的用途的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物的一个实施方案中，所述抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物是瘤内或动脉内施用。在用于本发明的用途的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物的一个实施方案中，所述抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物是经鼻内施用。
在某些实施方案中，前述方法另外包括向受试者施用额外治疗剂。因此，在用于本发明的方法中的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物的一个实施方案中，所述方法另外包括向受试者施用额外治疗剂。
在一个方面，本发明涉及用作药物的(a)本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物，以及(b)额外治疗剂。
在一个方面，本发明涉及用于治疗癌症的方法中的(a)本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物，以及(b)额外治疗剂。
在一个方面，本发明涉及药物组合物、药盒或多部件药盒，其包含(a)本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物，以及(b)额外治疗剂。
在某些实施方案中，所述额外治疗剂是化学治疗剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是放射治疗剂。
在某些实施方案中，所述额外治疗剂是检查点靶向剂。在某些实施方案中，所述检查点靶向剂选自由以下组成的组：拮抗剂抗PD-1抗体、拮抗剂抗PD-L1抗体、拮抗剂抗PD-L2抗体、拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗剂抗TIM-3抗体、拮抗剂抗LAG-3抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、激动剂抗GITR抗体、激动剂抗OX40抗体、拮抗剂抗TIGIT抗体、激动剂抗CD137抗体、拮抗剂抗VISTA抗体、拮抗剂抗CD73抗体和拮抗剂抗CD96抗体。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是抗PD-1抗体。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是派姆单抗(pembrolizumab)。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是抗CTLA-4抗体。
在某些实施方案中，所述额外治疗剂包含小分子。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是PD-1路径的小分子抑制剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是PD-1或PD-L1的小分子抑制剂。
在某些实施方案中，所述额外治疗剂是吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂。在某些实施方案中，所述抑制剂选自由以下组成的组：艾卡哚司他(epacadostat)、BMS-986205(又称F001287，参见WO2016/073770的实施例19，该专利以引用的方式整体并入本文中)、吲哚莫德(indoximod)和NLG919。在某些实施方案中，所述抑制剂是艾卡哚司他。在某些实施方案中，所述抑制剂是BMS-986205。在某些实施方案中，所述抑制剂是吲哚莫德。在某些实施方案中，所述抑制剂是NLG919。
在某些实施方案中，所述额外治疗剂是ARG、LSD1、CD112、CD112R或VEGF的抑制剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是干扰素基因刺激蛋白(STING)激动剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是CD80-Fc蛋白。
在某些实施方案中，所述额外治疗剂是疫苗。在某些实施方案中，所述疫苗包括热休克蛋白肽复合物(HSPPC)，其包含热休克蛋白与抗原肽的复合物。在某些实施方案中，所述热休克蛋白是hsc70且与肿瘤相关抗原肽形成复合物。在某些实施方案中，所述热休克蛋白是gp96蛋白且与肿瘤相关抗原肽形成复合物，其中所述HSPPC是来源于从受试者获得的肿瘤。在某些实施方案中，所述热休克蛋白是gp96蛋白且与肿瘤相关抗原肽形成复合物，其中所述HSPPC是来源于从受试者获得的肿瘤。在某些实施方案中，所述额外治疗剂包含TCR。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是可溶性TCR。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是表达TCR的细胞。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是表达嵌合抗原受体的细胞。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是特异性结合至肽-MHC复合物的抗体。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是佐剂。在一个方面，本发明涉及用作药物，例如用于治疗癌症的方法中的(a)本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物，以及(b)疫苗，任选地其中所述疫苗包含热休克蛋白肽复合物(HSPPC)，其包含热休克蛋白与抗原肽的复合物。在一个方面，本发明涉及药物组合物、药盒或多部件药盒，其包含(a)本发明的抗体、多核苷酸、载体、重组宿主细胞和/或药物组合物，以及(b)疫苗，任选地其中所述疫苗包含热休克蛋白肽复合物(HSPPC)，其包含热休克蛋白与抗原肽的复合物。
5.附图说明
图1A、图1B和图1C是显示如通过流式细胞术测量的抗LAG-3Fab与野生型Jurkat细胞或经工程改造成表达人类LAG-3的Jurkat细胞的结合的一组直方图。本研究中测试的抗LAG-3Fab包括P01A12、P01C09、P05E01、P13A04、P13A06、P13B01、P13B02、P13B03、P13B11、P13C06、P13C08、P13C10、P13D04、P13D05、P13E02、P13F01、P13F02、P13F06、P13F09、P13G01、P13G04、P13G05、P13H05、P14A04、P14B07、P14C04、P14F01、P14F06、P14G01、P14G03、P15B06、P15C02、P15E06、P15F06、P15G05、P16D04和P16H05。
图2A和图2B是显示来自测试抗LAG-3Fab或对LAG-3不具特异性的阴性对照Fab阻断交联的重组LAG-3-6His与表达II类MHC的Raji细胞的结合的能力的检定的结果的图。图2A是显示由阴性对照Fab或者抗LAG-3Fab P13B02、P13C08、P13C10、P13E02、P13F02、P01A12、P13B01、P05E01或P01C09介导的阻断的百分比的条形图。图2B是显示在滴定剂量的抗LAG-3Fab P01A12、P13A06、P13B01、P13B02、P13C06、P13C08、P13C10、P13E02或P14C04，或者阴性对照Fab存在下LAG-3结合的百分比的线形图。
图3是与图2B中所示类似的线形图，其中以LAG-3的百分比对全长嵌合抗LAG-3抗体P13A06、P13B01、P13B02、P13C06、P13C08或P13E02，或同种型对照抗体的滴定剂量作图。
图4是显示在无任何抗体存在下，或在同种型对照抗体或嵌合抗LAG-3抗体P13B02存在下葡萄球菌内毒素A(SEA)刺激后人类外周血单核细胞(PBMC)中IL-2的产生的图。
图5A与图5B是具有相应鼠类序列和人类生殖细胞系序列的人源化可变区的序列比对。图5A是比较人源化重链可变区H0-H4(分别为SEQ ID NO:56-60)、鼠类抗体P13B02重链可变区(SEQ ID NO:15)，以及人类生殖细胞系序列IGHV1-46*01(SEQ ID NO:153)和IGHJ1*01(SEQ ID NO:200)的序列比对。图5B是比较人源化轻链可变区L0-L4(分别为SEQID NO:73-77)、鼠类抗体P13B02轻链可变区(SEQ ID NO:16)，以及人类生殖细胞系序列IGKV3-20*01(SEQ ID NO:160)和IGKJ1*01(SEQ ID NO:201)的序列比对。圆点表示与H0(图5A)或L0(图5B)中相应残基相同的残基。虚线表示与H0(图5A)或L0(图5B)相比缺少的氨基酸残基。
图6A和图6B是显示如通过流式细胞术所测量的抗LAG-3抗体与经葡萄球菌内毒素A(SEA)活化的人类T细胞的结合的图。图6A是测试嵌合抗体P13B02(IgG1)，以及人源化抗体P13B02-06(IgG1)、P13B02-07(IgG1)、P13B02-16(IgG1)、P13B02-25(IgG1)、P13B02-26(IgG1)、P13B02-27(IgG1)、P13B02-30(IgG1 G1m17 N297A)和P13B02-30(IgG4)的一组直方图。图6B是显示抗LAG-3抗体P13B02-16(IgG1)或同种型对照抗体与活化的原代人类CD4+T细胞的结合的图。以中值荧光强度(MFI)值对抗体浓度作图。
图7A和图7B是与图2B中所示类似的线形图，其中以LAG-3结合的百分比对同种型对照抗体、嵌合抗体P13B02(IgG1)、人源化抗体P13B02-06(IgG1)、P13B02-07(IgG1)、P13B02-16(IgG1)、P13B02-26(IgG1)或P13B02-27(IgG1)(图7A)，或人源化抗体P13B02-30(IgG1 G1m17 N297A)(图7B)的不同剂量作图。
图8A和图8B是显示在葡萄球菌内毒素A(SEA)刺激后人类外周血单核细胞(PBMC)中由抗LAG-3抗体或同种型对照抗体诱导产生IL-2的图。在图8A中，测试的抗LAG-3抗体是P13B02-30(IgG1)。在图8B中，抗LAG-3抗体P13B02-16(IgG1)或同种型对照抗体是在存在或不存在抗PD-1抗体派姆单抗(Pembro)或纳武单抗(Nivo)；抗PD-L1抗体#1、#2或#3；或抗CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)(Ipi)下测试。
图9A和图9B是显示由单独或与抗PD-1抗体派姆单抗(Pembro)组合的抗LAG-3抗体P13B02-30(IgG1 G1m3 N297A)或同种型对照抗体诱导原代肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)产生TNFα的图。TIL是从肾细胞癌(图9A)或结肠直肠癌(图9B)肿瘤分离得到且用抗CD3/CD28微珠活化。
图10A和图10B是显示在LAG-3介导的细胞抑制检定中抗LAG-3抗体P13B02-30(IgG1 G1m3 N297A)增强T细胞活化的图。在一式六份滴定剂量的抗LAG-3抗体(黑点)或同种型对照抗体(白点)、固定浓度的Raji细胞和固定浓度的葡萄球菌内毒素E(SEE)肽存在下孵育Jurkat-NFAT-荧光素酶-LAG-3细胞。在第一个实验中，测试的抗体浓度在0.2-50μg/mL之间(图10A)。在第二个实验中，测试的抗体浓度在0.1-100μg/mL之间(图10B)。RLU＝荧光素酶报告基因的相对光单位。
6.具体实施方式
本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且拮抗LAG-3功能，例如LAG-3介导的免疫抑制的抗体。还提供包含这些抗体的药物组合物、编码这些抗体的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞，以及使用这些抗体治疗受试者的方法。本文所公开的抗体特别适用于响应于抗原(例如肿瘤抗原或感染性疾病抗原)来增加T细胞活化，且因此可用于治疗受试者的癌症或者治疗或预防受试者的感染性疾病。预期本文所描述的“分离的抗体”的所有情形还为可以但未必分离的抗体。预期本文所描述的“分离的多核苷酸”的所有情形还为可以但未必分离的多核苷酸。预期本文所描述的“抗体”的所有情形还为可以但未必分离的抗体。预期本文所描述的“多核苷酸”的所有情形还为可以但未必分离的多核苷酸。
6.1定义
如本文所使用，术语“约”和“近似地”当用于修饰数字值或数字范围时，指示在所述值或范围以上5％至10％(例如，至多高5％至10％)和以下5％至10％(例如至多低5％至10％)的偏差存留在所述值或范围的预定含义内。
如本文所使用，术语“LAG-3”是指淋巴细胞活化基因3(又称为CD223)。如本文所使用，术语“人类LAG-3”是指由野生型人类LAG-3基因(例如GenBankTM登录号NM_002286.5)编码的人类LAG-3蛋白。人类LAG-3的例示性不成熟氨基酸序列以SEQ ID NO:166提供。人类LAG-3的例示性成熟氨基酸序列以SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:210提供。
如本文所使用，术语“抗体”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段和包含抗体CDR、VH区或VL区的分子。抗体的实例包括单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠类抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、内抗体、异源缀合物抗体、抗体-药物缀合物、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、affybody、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如，抗-抗Id抗体)和以上任一种的抗原结合片段。在某些实施方案中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群。抗体可以为属于任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，本文所述的抗体是IgG抗体，或其类别(例如人类IgG1或IgG4)或子类。在一个具体实施方案中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个具体实施方案中，所述抗体是人类单克隆抗体。
如本文所使用，术语“VH区”和“VL区”分别是指包含FR(框架区)1、2、3和4以及CDR(互补决定区)1、2和3的单一抗体重链可变区和轻链可变区(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(NIH出版号91-3242,Bethesda)，其以引用的方式整体并入本文中)。
如本文所使用，术语“CDR”或“互补决定区”意谓存在于重链多肽与轻链多肽的可变区内的非邻接抗原组合位点。这些特定区域已描述于Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)，和Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，以及Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)中，其全部以引用的方式整体并入本文中，其中当彼此相比较时，所述定义包括氨基酸残基的重叠或亚组。在某些实施方案中，术语“CDR”是如Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等人，Sequences of protein ofimmunological interest.(1991)所定义的CDR。在某些实施方案中，术语“CDR”是如Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)所定义的CDR。在某些实施方案中，术语“CDR”是如MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)和Martin A.“ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,”AntibodyEngineering,Kontermann以及Dübel编辑，第31章，第422-439页，Springer-Verlag,Berlin(2001)所定义的CDR。
如本文所使用，术语“框架(FR)氨基酸残基”是指在免疫球蛋白链的框架区中的氨基酸。如本文所使用，“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分但不为CDR(例如，使用Kabat或Chothia的CDR定义)的一部分的氨基酸残基。
如本文所使用，术语“可变区”与“可变结构域”可互换使用且是本领域中常用的。可变区典型地是指抗体的一部分，一般为轻链或重链的一部分，典型地为成熟重链中的氨基末端110至125个氨基酸和成熟轻链中约90至115个氨基酸，其序列随抗体而明显不同且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列变异集中在称为互补决定区(CDR)的区域，而可变结构域中保守性较高的区域称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论束缚，认为轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施方案中，可变区是人类可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和人类框架区(FR)。在特定实施方案中，可变区是灵长类动物(例如非人类灵长类动物)可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和灵长类动物(例如非人类灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VL”与“VL结构域”可互换使用，指抗体的轻链可变区。
术语“VH”与“VH结构域”可互换使用，指抗体的重链可变区。
如本文所使用，术语“恒定区”与“恒定结构域”可互换使用且是本领域中常用的。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合但能展现各种效应子功能，如与Fc受体(例如Fcγ受体)相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区一般具有较为保守的氨基酸序列。
如本文所使用，在提及抗体时使用的术语“重链”可以基于恒定结构域的氨基酸序列而指任何截然不同的类型，例如α、δ、ε、γ和μ，由此分别得到IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体类别，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文所使用，在提及抗体时使用的术语“轻链”可以基于恒定结构域的氨基酸序列而指任何截然不同的类型，例如κ或λ。轻链氨基酸序列是本领域中熟知的。
如本文所使用，术语“EU编号系统”是指针对抗体恒定区的EU编号惯例，如Edelman,G.M.等人，Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)和Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,美国卫生和公共服务部(U.S.Dept.Health andHuman Services)，第5版，1991中所描述，其各自以引用的方式整体并入本文中。
“结合亲和力”一般是指一个分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另作指示，否则如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域中已知的多种方式测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD是由koff/kon的商计算，而KA是由kon/koff的商计算。kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，且koff是指例如抗体与抗原的解离速率常数。kon和koff可以由本领域技术普通人员已知的技术，诸如或KinExA测定。如本文所使用，“较低亲和力”是指较大KD。
如本文所使用，术语“特异性结合”、“特异性识别”、“免疫特异性结合”和“免疫特异性识别”在抗体的情况下是类似术语且指分子与抗原(例如表位或免疫复合物)的结合，此结合是本领域技术人员所了解的。举例来说，如通过例如免疫检定，KinExA3000仪器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或本领域中已知的其它检定所测定，特异性结合至抗原的分子一般可以较低的亲和力结合至其它肽或多肽。在一个具体实施方案中，特异性结合至抗原的分子结合抗原的KA比所述分子非特异性结合至另一抗原时的KA高至少2log(即，10倍)、2.5log、3log、4log或更高。
在另一个具体实施方案中，特异性结合至抗原的分子在类似结合条件下不与其它蛋白质交叉反应。在另一个具体实施方案中，特异性结合至LAG-3的分子不与其它非LAG-3蛋白交叉反应。在一个具体实施方案中，本文提供一种以比结合至另一不相关抗原高的亲和力结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体。在某些实施方案中，本文提供这样一种抗体，如通过例如放射免疫检定、表面等离子共振或动力学排除检定所测量，所述抗体结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的亲和力比结合至另一不相关抗原的亲和力高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。在一个具体实施方案中，如通过例如放射免疫检定所测量，本文所描述的抗LAG-3抗体与不相关的非LAG-3蛋白的结合程度比所述抗体与LAG-3蛋白的结合低10％、15％或20％。
如本文所使用，术语“无岩藻糖基化”或“无岩藻糖基化的”在Fc的情况下是指基本上没有岩藻糖直接或间接共价连接至人类IgG1Fc区的残基297(根据EU编号系统编号)，或非IgG1或非人类IgG1免疫球蛋白中的相应残基。因此，在包含多种无岩藻糖基化抗体的组合物中，至少70％的抗体将在抗体Fc区的残基297处不为直接或间接(例如经由插入糖)岩藻糖基化的，并且在一些实施方案中，至少80％、85％、90％、95％或99％将在Fc区的残基297处不为直接或间接岩藻糖基化的。
如本文所使用，“表位”是本领域中的一个术语且是指能够与抗体特异性结合的抗原局部区域。表位可以例如是多肽的相连氨基酸(线性或连续表位)，或表位可以例如是来自一个或多个多肽的两个或更多个不相连区域(构象、非线性、不连续或不相连表位)。在某些实施方案中，可以通过例如NMR波谱法、X射线衍射结晶学研究、ELISA检定、氢/氘交换联用质谱法(例如液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描检定(例如使用支架上化学连接肽(Chemical Linkage of Peptides onto Scaffolds，CLIPS)定位不连续或构象表位的拘束肽)，和/或诱变定位(例如定点诱变定位)来测定抗体所结合的表位。对于X射线结晶学，结晶可以使用本领域中已知的任何方法实现(例如GiegéR等人(1994)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 50(第4部分):339-350；McPherson A(1990)Eur JBiochem 189:1-23；Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J BiolChem 251:6300-6303，其全部以引用的方式整体并入本文中)。抗体:抗原晶体可以使用熟知的X射线衍射技术研究并且可以使用计算机软件诸如X-PLOR精修(耶鲁大学(YaleUniversity)，1992，由Molecular Simulations,Inc.发布；参见例如，Meth Enzymol(1985)第114和115卷，Wyckoff HW等人编；U.S.2004/0014194)，和BUSTER(Bricogne G(1993)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 49(第1部分):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol276A:361-423,Carter CW编；Roversi P等人(2000)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 56(第10部分):1316-1323)，其全部以引用的方式整体并入本文中。诱变定位研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法实现。有关诱变技术(包括丙氨酸扫描诱变技术)的描述，参见例如，Champe M等人(1995)J Biol Chem 270:1388-1394以及Cunningham BC和Wells JA(1989)Science 244:1081-1085，其各自以引用的方式整体并入本文中。支架上化学连接肽(CLIPS)是以结构约束的构型呈现一个或多个肽以用于复杂蛋白质结构域的功能模拟的一项技术。参见例如，美国公开第US 2008/0139407 A1号和第US2007/099240 A1号，以及美国专利第7,972,993号，其各自以引用的方式整体并入本文中。在一个具体实施方案中，抗体的表位是使用丙氨酸扫描诱变研究测定。在一个具体实施方案中，抗体的表位是使用氢/氘交换联用质谱法测定。在一个具体实施方案中，抗体的表位是使用来自Pepscan Therapeutics的CLIPS表位定位技术测定。
如本文所使用，术语“位于由特定氨基酸序列或一组氨基酸残基组成的人类LAG-3的区域内的表位”是指包含所述指定区域的一个或多个氨基酸残基的表位，其中所述指定区域包括所述人类LAG-3区域的第一个指定的氨基酸残基和最后一个指定的氨基酸残基。在某些实施方案中，表位包含位于所述指定区域中的每一个氨基酸残基。在某些实施方案中，在人类LAG-3中指定区域外的一个或多个额外氨基酸残基与位于所述指定区域内的表位一起结合至抗体。
如本文所使用，术语“T细胞受体”与“TCR”可互换使用且是指全长异源二聚体αβ或γδTCR、全长TCR的抗原结合片段，和包含TCR CDR或可变区的分子。TCR的实例包括但不限于全长TCR、全长TCR的抗原结合片段、缺少跨膜和细胞质区的可溶性TCR、含有通过可柔性接头附接的TCR可变区的单链TCR、由工程改造的二硫键连接的TCR链、单特异性TCR、多特异性TCR(包括双特异性TCR)、TCR融合物、人类TCR、人源化TCR、嵌合TCR、重组产生的TCR和合成TCR。所述术语涵盖野生型TCR和遗传工程改造的TCR(例如包含嵌合TCR链的嵌合TCR，所述嵌合TCR链包括来自第一物种的TCR的第一部分和来自第二物种的TCR的第二部分)。
如本文所使用，术语“主要组织相容性复合物”与“MHC”可互换使用且是指I类MHC分子和/或II类MHC分子。
如本文所使用，术语“肽-MHC复合物”是指具有肽结合于MHC的技术公认的肽结合袋中的MHC分子(I类MHC或II类MHC)。
如本文所使用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指本文所描述的治疗或预防措施。为了预防、治愈、推迟所述疾病或病症或者复发疾病或病症，减轻其严重程度，或缓解其症状，或者为了延长受试者的存活期超出在无此治疗存在下所预期的存活期，“治疗”方法采用了向患有疾病或病症，或易患此类疾病或病症的受试者施用抗体。
如本文所使用，在向受试者施用疗法的情况下，术语“有效量”是指实现所希望的预防或治疗作用的疗法的量。
如本文所使用，术语“受试者”包括人或非人类动物。在一个实施方案中，受试者是人或非人类哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是人。
两个序列(例如氨基酸序列或核酸序列)之间的“同一性百分比”可以使用数学算法完成。用于比较两个序列的数学算法的特定非限制性实例是如Karlin S和Altschul SF(1993)PNAS 90:5873-5877中改进的Karlin S和Altschul SF(1990)PNAS 87:2264-2268的算法，其各自以引用的方式整体并入本文中。此种算法被并入Altschul SF等人(1990)JMol Biol 215:403(其以引用的方式整体并入本文中)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数设置执行，例如对于评分＝100，字长＝12，从而获得与本文所描述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序参数设置执行，例如对于评分50，字长＝3，从而获得与本文所描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得带空位的比对以实现比较目的，可以利用如Altschul SF等人(1997)NucAcids Res 25:3389-3402(其以引用的方式整体并入本文中)中所描述的带空位的BLAST。或者，可以使用PSI BLAST执行一种迭代搜索法，检测各分子之间的远近关系(同上文)。当利用BLAST、带空位的BLAST和PSI Blast程序时，可以使用各别程序(例如对于XBLAST和NBLAST)的预设参数(参见例如，National Center for Biotechnology Information(NCBI)，见万维网ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一特定非限制性实例是Myers和Miller,1988,CABIOS 4:11-17(其以引用的方式整体并入本文中)的算法。此种算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、12分的空位长度罚分和4分的空位罚分。
两个序列之间的同一性百分比可以在允许或不允许有空位情况下，使用与上文所述类似的技术测定。在计算同一性百分比时，典型地仅准确匹配被计算在内。
6.2抗LAG-3抗体
在一个方面，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且拮抗LAG-3功能的抗体。例示性抗体的氨基酸序列陈述于本文的表1-7中。
熟练技术人员应理解，N末端E或Q氨基酸残基在某些情况下可以通过游离氨基翻译后环化形成内酰胺而自发转化成焦谷氨酸。因此，在某些实施方案中，本公开提供包含本文所公开的抗体重链可变区或轻链可变区(例如分别为SEQ ID NO:56-72和73-77)或本文所公开的全长重链或轻链(例如分别为SEQ ID NO:168-186和187-191)的抗体，其中N末端E或Q氨基酸残基已转化成焦谷氨酸(例如由N末端E或Q残基的游离氨基的翻译后环化引起)。
表1.例示性抗LAG-3抗体的氨基酸序列。
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表2.例示性抗LAG-3抗体的重链CDR氨基酸序列。*
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*根据Kabat编号系统定义。
表3.例示性抗LAG-3抗体的轻链CDR氨基酸序列。*
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*根据Kabat编号系统定义。
表4.例示性抗LAG-3抗体的重链框架(FR)氨基酸序列。*
*表4中所述的重链框架区是基于Kabat编号系统针对CDR的边界确定。换句话说，VH CDR是通过Kabat确定且框架区是形式FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4中的可变区中CDR周围的氨基酸残基。
表5.例示性抗LAG-3抗体的轻链框架(FR)氨基酸序列。*
*表5中所述的轻链框架区是基于Kabat编号系统针对CDR的边界确定。换句话说，VL CDR是通过Kabat确定且框架区是形式FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4中的可变区中CDR周围的氨基酸残基。
表6.例示性鼠类抗LAG-3抗体。
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表7.例示性人源化抗LAG-3抗体。*
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表8.人类生殖细胞系序列。
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表9.例示性LAG-3序列。
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在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含本文表1、2、6和7中所陈述的VH结构的一个、两个或全部三个CDR的VH结构域。在某些实施方案中，所述抗体包含表1、2、6和7中所陈述的VH结构域之一的CDRH1。在某些实施方案中，所述抗体包含表1、2、6和7中所陈述的VH结构域之一的CDRH2。在某些实施方案中，所述抗体包含表1、2、6和7中所陈述的VH结构域之一的CDRH3。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含本文表1、3、6和7中所陈述的VL结构的一个、两个或全部三个CDR的VL结构域。在某些实施方案中，所述抗体包含表1、3、6和7中所陈述的VL结构域之一的CDRL1。在某些实施方案中，所述抗体包含表1、3、6和7中所陈述的VL结构域之一的CDRL2。在某些实施方案中，所述抗体包含表1、3、6和7中所陈述的VL结构域之一的CDRL3。
在某些实施方案中，抗体的CDR可以根据Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest(1991)测定，所述文献各自以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1、6和7中所公开的VH的Kabat VH CDR。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1、6和7中所公开的VL的Kabat VL CDR。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1、6和7中所公开的抗体的Kabat VH CDR和Kabat VL CDR。
在某些实施方案中，抗体的CDR可以根据Chothia编号方案确定，所述方案涉及免疫球蛋白结构环的位置(参见例如，Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia C等人(1992)J MolBiol 227:799-817；Tramontano A等人(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；和美国专利第7,709,226号，其全部以引用的方式整体并入本文中)。典型地，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDRH1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDRH2环存在于重链氨基酸52至56处，且Chothia CDRH3环存在于重链氨基酸95至102处，而Chothia CDRL1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDRL2环存在于轻链氨基酸50至56处，且Chothia CDRL3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDRH1环的末端依据环的长度在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处放置了插入；如果35A和35B均不存在，则所述环在32处结束；如果仅存在35A，则所述环在33处结束；如果同时存在35A和35B，则所述环在34处结束)。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1、6和7中所公开的VH的Chothia VH CDR。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1、6和7中所公开的VL的Chothia VL CDR。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1、6和7中所公开的抗体的Chothia VH CDR和Chothia VL CDR。在某些实施方案中，特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体包含一个或多个CDR，其中Chothia与Kabat CDR具有相同氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且包含Kabat CDR与Chothia CDR的组合的分离的抗体。
在某些实施方案中，抗体的CDR可以根据如Lefranc M-P,(1999)TheImmunologist 7:132-136和Lefranc M-P等人(1999)Nucleic Acids Res 27:209-212(其各自以引用的方式整体并入本文中)中所描述的IMGT编号系统确定。根据IMGT编号方案，CDRH1是在26至35位处，CDRH2是在51至57位处，CDRH3是在93至102位处，CDRL1是在27至32位处，CDRL2是在50至52位处，且CDRL3是在89至97位处。
在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且包含如通过IMGT编号系统(例如Lefranc M-P(1999)，同上文和Lefranc M-P等人(1999)，同上文所描述)所确定的本文表1、6和7中所公开的抗体的CDR的抗体。
在某些实施方案中，抗体的CDR可以根据AbM编号方案(其涉及AbM高变区，AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折中)确定且为Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group,Inc.)所用。在特定实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且包含如通过AbM编号方案确定的本文表1、6和7中所公开的抗体的CDR的抗体。
在某些实施方案中，抗体的CDR可以根据MacCallum RM等人(1996)J Mol Biol262:732-745(其以引用的方式整体并入本文中)确定。另参见例如，Martin A.AntibodyEngineering中的“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody VariableDomains,”，Kontermann和Dübel编，第31章，第422页至第439页，Springer-Verlag,Berlin(2001)，其以引用的方式整体并入本文中。在特定实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且包含如MacCallum RM等人(1996)，同上文所描述的本文表1、6和7中所公开的抗体的CDR的抗体。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、15、17、19、20、22、24、27、29、31、33、35、36、38、39、42、45、46、48、51、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72中所陈述的VH结构域的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的重链可变区；以及包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、16、18、21、23、25、26、28、30、32、34、37、40、41、43、44、47、49、50、52、55、73、74、75、76或77中所陈述的VL结构域的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列的轻链可变区，其中各CDR是根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义与Chothia定义的组合、IMGT编号系统、AbM定义或MacCallum定义进行界定。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包含：
(a)CDRH1包含氨基酸序列DX1YX2X3(SEQ ID NO:140)，其中
X1是T或N，
X2是I或M，且
X3是H、Y或D；和/或
(b)CDRH2包含氨基酸序列X1IDPANX2X3X4X5X6X7PX8X9QX10(SEQ ID NO:142)，其中
X1是E、R、S或K，
X2是D或G，
X3是N或H，
X4是T或S，
X5是K或H，
X6是Y或F，
X7是D或A，
X8是K或R，
X9是F或L，且
X10是G或D；和/或
(c)CDRH3包含氨基酸序列YX1X2X3YX4VGGX5DY(SEQ ID NO:144)，其中
X1是Y、F或S，
X2是Y或D，
X3是K或R，
X4是D或E，且
X5是F或C；和/或
(d)CDRL1包含氨基酸序列SVSSX1ISSSX2LX3(SEQ ID NO:147)，其中
X1是S或G，
X2是N或T，且
X3是H或Y；和/或
(e)CDRL2包含氨基酸序列GTSNLAS(SEQ ID NO:104)；和/或
(f)CDRL3包含氨基酸序列QQWX1X2YPX3T(SEQ ID NO:149)，其中
X1是S、N或R，
X2是S、T或R，且
X3是F、L、H或W。
在某些实施方案中，CDRH1包含氨基酸序列DX1YX2X3(SEQ ID NO:141)，其中：X1是T或N；X2是I或M；且X3是H或Y。在某些实施方案中，CDRH2包含氨基酸序列X1IDPANX2X3X4KX5X6PX7FQX8(SEQ ID NO:143)，其中：X1是E、R或S；X2是D或G；X3是N或H；X4是T或S；X5是Y或F；X6是D或A；X7是K或R；且X8是G或D。在某些实施方案中，CDRH3包含氨基酸序列YX1X2X3YDVGGX4DY(SEQ ID NO:145)，其中：X1是Y、F或S；X2是Y或D；X3是K或R；且X4是F或C。在某些实施方案中，CDRH3包含氨基酸序列YYYX1YX2VGGFDY(SEQ ID NO:146)，其中：X1是K或R；且X2是D或E。在某些实施方案中，CDRL1包含氨基酸序列SVSSSISSSNLX1(SEQ ID NO:148)，其中：X1是H或Y。在某些实施方案中，CDRL3包含氨基酸序列QQWX1SYPX2T(SEQ ID NO:150)，其中：X1是S、N或R；且X2是F、L或H。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包含：
(a)CDRH1包含氨基酸序列DTYIH(SEQ ID NO:79)；和/或
(b)CDRH2包含氨基酸序列EIDPANDNTKYDPKFQG(SEQ ID NO:90)；和/或
(c)CDRH3包含氨基酸序列YYYX1YX2VGGFDY(SEQ ID NO:146)，其中：X1是K或R；且X2是D或E；和/或
(d)CDRL1包含氨基酸序列SVSSSISSSNLH(SEQ ID NO:100)；和/或
(e)CDRL2包含氨基酸序列GTSNLAS(SEQ ID NO:104)；和/或
(f)CDRL3包含氨基酸序列QQWSSYPFT(SEQ ID NO:105)。
在某些实施方案中，CDRH1包含选自由SEQ ID NO:78-82组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDRH2包含选自由SEQ ID NO:83-93组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDRH3包含选自由SEQ ID NO:94-99组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDRL1包含选自由SEQ ID NO:100-103组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDRL3包含选自由SEQ ID NO:105-112组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括分别包含以下中陈述的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的VH结构域：SEQ ID NO:78、83和94；78、85和95；78、86和96；78、86和97；78、91和94；78、92和96；79、84和95；79、88和95；79、89和95；79、90和95；79、90和98；79、90和99；80、85和96；81、87和96；或82、93和95。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括分别包含SEQ ID NO:79、90和95中陈述的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的VH结构域。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括分别包含SEQ ID NO:79、90和98中陈述的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的VH结构域。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括分别包含以下中陈述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列的VL结构域：SEQ ID NO:100、104和105；100、104和106；100、104和107；100、104和109；100、104和110；101、104和108；102、104和105；102、104和112；或103、104和111。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括分别包含SEQ ID NO:100、104和105中陈述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列的VL结构域。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区，和包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包含以下中陈述的氨基酸序列：SEQ ID NO:78、83、94、100、104和105；78、85、95、100、104和105；78、86、96、100、104和105；78、86、96、100、104和109；78、86、96、100、104和110；78、86、96、101、104和108；78、86、96、103、104和111；78、86、97、102、104和112；78、91、94、100、104和107；78、92、96、100、104和105；78、92、96、100、104和109；79、84、95、100、104和105；79、84、95、100、104和106；79、84、95、102、104和105；79、88、95、100、104和105；79、89、95、100、104和105；79、90、95、100、104和105；79、90、98、100、104和105；79、90、99、100、104和105；80、85、96、100、104和105；81、87、96、100、104和105；81、87、96、100、104和107；或82、93、95、100、104和105。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区和包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包含SEQ ID NO:79、90、95、100、104和105中所陈述的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区和包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包含SEQ ID NO:79、90、98、100、104和105中所陈述的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)，其包含表1、2、6和7中所陈述的抗体的一个、两个或全部三个VH CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含本文所描述的VH框架区中的一个、两个、三个或全部四个。在具体实施方案中，所述抗体包含表4中所陈述的VH框架区(FR)中的一个、两个、三个或全部四个(例如，表4中一行中的一个、两个、三个或四个框架区)。在某些实施方案中，所述抗体包含重链可变区序列SEQ ID NO:151或222的一个、两个、三个或全部四个框架区。在某些实施方案中，所述抗体包含重链可变区序列SEQ ID NO:218或223的一个、两个、三个或全部四个框架区。在某些实施方案中，所述抗体包含与选自由SEQ IDNO:56-72和220组成的组的重链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的一个、两个、三个或四个重链可变区序列框架区。在某些实施方案中，所述抗体包含重链可变框架区，其是或来源于由人类基因编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选自由以下组成的组：IGHV1-46(例如IGHV1-46*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:153)、IGHV1-69-2(例如IGHV1-69-2*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:154)、IGHV1-3(例如IGHV1-3*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:155)、IGHV1-24(例如IGHV1-24*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:156)、IGHV1-2(例如IGHV1-2*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:157)、IGHV1-45(例如IGHV1-45*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:158)和IGHV1-18(例如IGHV1-18*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:159)。在具体实施方案中，来源于所述氨基酸序列的重链可变框架区由所述氨基酸序列组成但存在至多20个氨基酸取代、缺失和/或插入，优选至多20个氨基酸取代。在特定实施方案中，来源于所述氨基酸序列的重链可变框架区由所述氨基酸序列组成，且1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基被相应非人类重链可变框架区中类似位置所见的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体包含来源于氨基酸序列SEQID NO:153的重链可变框架区，其中氨基酸序列SEQ ID NO:153中至少一个氨基酸被相应非人类重链可变框架区中类似位置的氨基酸取代。在一个具体实施方案中，氨基酸取代是在选自由以下组成的组的氨基酸位置处：4、5、12、23、27、28、29、30、48、69、71、75、76、80、81和94，其中所述氨基酸位置是根据Kabat编号系统指示。在特定实施方案中，氨基酸取代选自由以下组成的组：4M、5K、12V、23T、27F、28N、29I、30K、48I、69I、71A、75S、76N、80L、81Q和94T，其中所述氨基酸取代的位置是根据Kabat编号系统指示。在另一个具体实施方案中，氨基酸取代是在选自由以下组成的组的氨基酸位置处：4、27、28、29、30、69、71和94，其中所述氨基酸位置是根据Kabat编号系统指示。在特定实施方案中，氨基酸取代选自由以下组成的组：4M、27F、28N、29I、30K、69I、71A和94T，其中所述氨基酸取代的位置是根据Kabat编号系统指示。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VH)，其包含表1、3、6和7中所陈述的抗体的一个、两个或全部三个VL CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含本文所描述的VL框架区中的一个、两个、三个或全部四个。在具体实施方案中，所述抗体包含表5中所陈述的VL框架区(FR)中的一个、两个、三个或全部四个(例如，表5中一行中的一个、两个、三个或四个框架区)。在某些实施方案中，所述抗体包含轻链可变区序列SEQ ID NO:152或224的一个、两个、三个或全部四个框架区。在某些实施方案中，所述抗体包含与选自由SEQ ID NO:73-77组成的组的轻链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的一个、两个、三个或四个轻链可变区序列框架区。在某些实施方案中，所述抗体包含轻链可变框架区，其是或来源于由人类基因编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选自由以下组成的组：IGKV3-20(例如IGKV3-20*01，例如具有氨基酸序列SEQ IDNO:160)、IGKV3D-15(例如IGKV3D-15*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:161)、IGKV3-15(例如IGKV3-15*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:161)、IGKV3D-20(例如IGKV3D-20*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:162)、IGKV3D-7(例如IGKV3D-7*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:163)、IGKV1-9(例如IGKV1-9*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:164)和IGKV3-11(例如IGKV3-11*01，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:165)。在具体实施方案中，来源于所述氨基酸序列的轻链可变框架区由所述氨基酸序列组成但存在至多20个氨基酸取代、缺失和/或插入，优选至多20个氨基酸取代。在特定实施方案中，来源于所述氨基酸序列的轻链可变框架区由所述氨基酸序列组成，且1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基被相应非人类轻链可变框架区中类似位置所见的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体包含来源于氨基酸序列SEQ ID NO:160的轻链可变框架区，其中氨基酸序列SEQ ID NO:160中至少一个氨基酸被相应非人类轻链可变框架区中类似位置的氨基酸取代。在一个具体实施方案中，氨基酸取代是在选自由以下组成的组的氨基酸位置处：3、22、36、43、47、58、70和71，其中所述氨基酸位置是根据Kabat编号系统指示。在特定实施方案中，氨基酸取代选自由以下组成的组：3L、22T、36F、43S、47W、58V、70S和71Y，其中所述氨基酸取代的位置是根据Kabat编号系统指示。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)，其包含表1、2、6和7中的抗体的一个、两个或全部三个VH CDR(例如，表2中一行中的VH CDR)；和轻链可变区(VL)，其包含表1、3、6和7中的抗体的一个、两个或全部三个VL CDR(例如表3中一行中的VL CDR)。在一些实施方案中，所述抗体包含本文所描述的VH框架区和VL框架区。在具体实施方案中，所述抗体包含表4中所陈述的VH框架区(FR)(例如表4中一行中的一个、两个、三个或四个框架区)和表5中所陈述的VL框架区(FR)(例如表5中一行中的一个、两个、三个或四个框架区)。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括分别包含SEQ ID NO:79、90和95；或79、90和98中陈述的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的VH结构域。在某些实施方案中，所述抗体包含来源于人类或灵长类动物抗体的VH的一个、两个、三个或全部四个VH框架区。在一些实施方案中，所述抗体包含表4中所陈述的抗体的VH框架区。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括分别包含SEQ ID NO:100、104和105中陈述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列的VL结构域。在某些实施方案中，所述抗体包含来源于人类或灵长类动物抗体的VL的一个、两个、三个或全部四个VL框架区。在一些实施方案中，所述抗体包含表5中所陈述的抗体的VL框架区。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区和包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包含SEQ ID NO:79、90、95、100、104和105；或79、90、98、100、104和105中所陈述的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包含来源于人类或灵长类动物抗体的VH的一个、两个、三个或全部四个VH框架区，和来源于人类或灵长类动物抗体的VL的一个、两个、三个或全部四个VL框架区。在一些实施方案中，所述抗体分别包含表4和表5中陈述的抗体的VH框架区和VL框架区。
在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:151或222的重链可变区。在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:218或223的重链可变区。在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其包括包含与SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、220、66、67、68、69、70、71或72中所陈述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、220、66、67、68、69、70、71或72中所陈述的氨基酸序列的重链可变区，任选地其中在重链可变区1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:65中所陈述的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:220中所陈述的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，SEQ ID NO:220中的X是Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:220中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:168、225、169、226、170、227、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185或186中所陈述的氨基酸序列的重链，任选地其中重链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:168中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:225中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:225中的X是Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:225中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:169中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:226中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:226中的X是Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:226中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:170中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:227中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:227中的X是Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:227中的X是焦谷氨酸。
在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:152或224的轻链可变区。在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其包括包含与SEQ ID NO:73、74、75、76或77中所陈述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:73、74、75、76或77中所陈述的氨基酸序列的轻链可变区，任选地其中轻链可变区1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:73中所陈述的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:221中所陈述的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，SEQ ID NO:221中的X是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:221中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:187、188、189、190或191中所陈述的氨基酸序列的轻链可变区，任选地其中轻链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:187中所陈述的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:228中所陈述的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，SEQ ID NO:228中的X是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。
在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:151或222的重链可变区，和包含氨基酸序列SEQ IDNO:152或224的轻链可变区。在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:218或223的重链可变区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:152或224的轻链可变区。在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，其包括包含与SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、220、66、67、68、69、70、71或72中所陈述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:73、221、74、75、76或77中所陈述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、220、66、67、68、69、70、71或72中所陈述的氨基酸序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO:73、221、74、75、76或77中所陈述的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有以下中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区：SEQ ID NO:56和73；56和74；56和75；56和76；56和77；57和73；57和74；57和75；57和76；57和77；58和73；58和74；58和75；58和76；58和77；59和73；59和74；59和75；59和76；59和77；60和73；60和74；60和75；60和76；60和77；61和77；62和77；63和73；64和73；65和73；220和73；65和221；220和221；66和73；67和73；68和73；69和73；70和73；71和73；或72和73。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:56和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ IDNO:220和221中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，SEQID NO:220中的X是Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:220中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO:221中的X是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:221中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO:220中的X是Q，且SEQ ID NO:221中的X是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:220中的X是Q，且SEQ ID NO:221中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，SEQ IDNO:220中的X是焦谷氨酸，且XSEQ ID NO:221中的是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:220中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:221中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:56和74中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:56和75中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:56和76中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQID NO:56和77中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:57和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:57和74中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:57和75中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:57和76中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:57和77中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:58和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQID NO:58和74中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:58和75中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:58和76中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:58和77中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:59和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:59和74中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:59和75中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQID NO:59和76中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:59和77中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:60和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:60和74中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:60和75中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:60和76中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:60和77中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQID NO:61和77中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:62和77中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:63和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:64和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:65和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:66和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:67和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQID NO:68和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:69和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:70和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:71和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗体包含分别具有SEQ ID NO:72和73中所陈述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，重链可变区1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，轻链可变区1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，重链可变区1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸，且轻链可变区1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。
在某些实施方案中，本公开提供一种与分别包含以下中陈述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体交叉竞争结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体：SEQ IDNO:1和2；3和4；5和6；7和8；9和10；11和12；13和10；14和10；15和16；17和18；19和8；20和21；22和23；24和10；9和25；9和26；20和2；27和28；29和30；31和32；33和34；35和10；36和37；38和21；39和40；9和2；9和41；42和43；9和44；45和32；46和47；48和10；20和49；33和50；51和52；53和8；38和2；或54和55。在某些实施方案中，本公开提供一种与分别包含以下中陈述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体交叉竞争结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体：SEQ ID NO:56和73；56和74；56和75；56和76；56和77；57和73；57和74；57和75；57和76；57和77；58和73；58和74；58和75；58和76；58和77；59和73；59和74；59和75；59和76；59和77；60和73；60和74；60和75；60和76；60和77；61和77；62和77；63和73；64和73；65和73；220和73；65和221；220和221；66和73；67和73；68和73；69和73；70和73；71和73；或72和73。
在某些实施方案中，本公开提供一种与本文所描述的抗体，例如分别包含以下中陈述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体结合至相同或重叠的LAG-3表位(例如人类LAG-3的表位)的分离的抗体：SEQ ID NO:1和2；3和4；5和6；7和8；9和10；11和12；13和10；14和10；15和16；17和18；19和8；20和21；22和23；24和10；9和25；9和26；20和2；27和28；29和30；31和32；33和34；35和10；36和37；38和21；39和40；9和2；9和41；42和43；9和44；45和32；46和47；48和10；20和49；33和50；51和52；53和8；38和2；或54和55。在某些实施方案中，本公开提供一种与本文所描述的抗体，例如分别包含以下中陈述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体结合至相同或重叠的LAG-3表位(例如人类LAG-3的表位)的分离的抗体：SEQ ID NO:56和73；56和74；56和75；56和76；56和77；57和73；57和74；57和75；57和76；57和77；58和73；58和74；58和75；58和76；58和77；59和73；59和74；59和75；59和76；59和77；60和73；60和74；60和75；60和76；60和77；61和77；62和77；63和73；64和73；65和73；220和73；65和221；220和221；66和73；67和73；68和73；69和73；70和73；71和73；或72和73。在某些实施方案中，抗体的表位可以通过例如NMR波谱法、表面等离子共振X射线衍射结晶学研究、ELISA检定、氢/氘交换联用质谱法(例如液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描检定和/或诱变定位(例如定点诱变定位)测定。对于X射线结晶学，结晶可以使用本领域中已知的任何方法实现(例如GiegéR等人(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50(第4部分):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303，其各自皆以引用的方式整体并入本文中)。可以使用熟知的X射线衍射技术对抗体:抗原晶体进行研究并且可以使用计算机软件进行精修，诸如X-PLOR(耶鲁大学，1992，由Molecular Simulations,Inc.发布；参见例如，Meth Enzymol(1985)第114和115卷，Wyckoff HW等人编；美国专利申请第2004/0014194号)，和BUSTER(Bricogne G(1993)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 49(第1部分):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol276A:361-423,Carter CW编；Roversi P等人(2000)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr56(第10部分):1316-1323，其全部以引用的方式整体并入本文中)。诱变定位研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法实现。有关诱变技术(包括丙氨酸扫描诱变技术)的描述，参见例如Champe M等人(1995)，同上文以及Cunningham BC和Wells JA(1989)，同上文。在一个具体实施方案中，抗体的表位是使用丙氨酸扫描诱变研究测定。此外，识别并结合至相同或重叠的LAG-3(例如人类LAG-3)的表位的抗体可以使用常规技术，诸如免疫检定，例如通过显示一种抗体阻断另一种抗体结合至目标抗原的能力，即，竞争性结合检定来鉴别。竞争结合检定还可用于确定两种抗体对于表位是否具有相似的结合特异性。可以在受测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原，诸如LAG-3(例如人类LAG-3)的特异性结合的检定中测定竞争性结合。已知多种类型的竞争性结合检定，例如：直接或间接固相放射免疫检定(RIA)、直接或间接固相酶免疫检定(EIA)、夹心竞争检定(参见Stahli C等人(1983)Methods Enzymol 9:242-253)；直接固相生物素-亲和素EIA(参见Kirkland TN等人(1986)J Immunol 137:3614-9)；直接固相标记的检定、直接固相标记的夹心检定(参见Harlow E和Lane D,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress)；使用I-125标记的直接固相标记的RIA(参见Morel GA等人(1988)Mol Immunol 25(1):7-15)；直接固相生物素-亲和素EIA(参见Cheung RC等人(1990)Virology 176:546-52)；和直接标记的RIA(参见Moldenhauer G等人(1990)Scand J Immunol 32:77-82)，其全部以引用的方式整体并入本文中。典型地，此类检定涉及使用结合至带有这些即未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中任一者的固体表面或细胞的纯化抗原(例如，LAG-3，诸如人类LAG-3)。竞争性抑制可以通过在测试免疫球蛋白存在下测定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，其将使参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更高。竞争结合检定可以使用标记的抗原或标记的抗体按众多种不同的形式配置。在此检定的一种常见形式中，将抗原固定于96孔盘上。接着使用放射性标记或酶标记测量未标记的抗体阻断标记的抗体结合至抗原的能力。更多细节，参见例如Wagener C等人(1983)J Immunol 130:2308-2315；Wagener C等人(1984)J Immunol Methods 68:269-274；Kuroki M等人(1990)Cancer Res 50:4872-4879；Kuroki M等人(1992)ImmunolInvest 21:523-538；Kuroki M等人(1992)Hybridoma 11:391-407；以及Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow E和Lane D编辑，同上文，第386页至第389页，其全部以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:168、225、169、226、170、227、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185或186中所陈述的氨基酸序列的重链，任选地其中所述重链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:168中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQID NO:225中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:225中的X是Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:225中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:169中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQID NO:226中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:226中的X是Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:226中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:170中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQID NO:227中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:227中的X是Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:227中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:171中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQID NO:172中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ IDNO:173中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:174中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:175中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:176中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:177中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:178中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:179中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:180中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:181中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:182中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:183中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:184中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:185中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:186中所陈述的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述重链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:187、228、188、189、190或191中所陈述的氨基酸序列的轻链，任选地其中所述轻链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:187中所陈述的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:228中所陈述的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:228中的X是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:188中所陈述的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:189中所陈述的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:190中所陈述的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗体包括包含SEQ ID NO:191中所陈述的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述轻链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:168的重链和包含氨基酸序列SEQ IDNO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的重链和包含氨基酸序列SEQID NO:228的轻链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:225中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO:225中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:225中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:169的重链和包含氨基酸序列SEQ IDNO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:226的重链和包含氨基酸序列SEQID NO:228的轻链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:226中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO:226中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:226中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:170的重链和包含氨基酸序列SEQ IDNO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的重链和包含氨基酸序列SEQID NO:228的轻链。在某些实施方案中，SEQ ID NO:227中的X是Q，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO:227中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:227中的X是焦谷氨酸，且SEQ ID NO:228中的X是焦谷氨酸。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:171的重链；和包含氨基酸序列SEQ IDNO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:172的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:173的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:174的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:175的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:176的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:177的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:178的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:179的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:180的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:181的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:182的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:183的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:184的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:185的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:187的轻链。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:186的重链；和包含氨基酸序列SEQ IDNO:187的轻链。在某些实施方案中，所述重链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述轻链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述重链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸，且所述轻链1位的氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。
任何Ig恒定区均可用于本文所公开的抗体中。在某些实施方案中，Ig区是人类IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:192、193、194、195、196、197、208或209的重链恒定区。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:194的重链恒定区。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链恒定区。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链恒定区。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:219的轻链恒定区。
在某些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述抗体的Fc区(例如，CH2结构域(人类IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人类IgG1的残基341-447)和/或铰链区，根据EU编号系统编号)中以改变所述抗体的一种或多种功能特性，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。
在某些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入Fc区(CH1结构域)的铰链区中，以使铰链区中半胱氨酸残基的数量改变(例如增加或减小)，如例如美国专利第5,677,425号中所述。可以改变CH1结构域的铰链区中半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链与重链的组装，或改变(例如增加或降低)抗体的稳定性。
在一个具体实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、缺失或插入)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选为Fc或铰链区-Fc结构域片段)中以改变(例如减小或增加)抗体的体内半衰期。有关改变(例如减小或增加)抗体的体内半衰期的实例，参见例如，国际公开第WO 02/060919号、第WO 98/23289号和第WO 97/34631号；以及美国专利第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号和第6,165,745号，其全部以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、缺失或插入)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选为Fc或铰链区-Fc结构域片段)中以减小抗体的体内半衰期。在其它实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、缺失或插入)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选为Fc或铰链区-Fc结构域片段)中以增加抗体的体内半衰期。在一个具体实施方案中，所述抗体可以在第二恒定(CH2)结构域(人类IgG1的残基231-340)和/或第三恒定(CH3)结构域(人类IgG1的残基341-447)中具有一个或多个氨基酸突变(例如取代)(根据EU编号系统编号)。在一个具体实施方案中，本文所述的抗体IgG1的恒定区包含在252位甲硫氨酸(M)变为酪氨酸(Y)的取代、在254位丝氨酸(S)变为苏氨酸(T)的取代；和在256位苏氨酸(T)变为谷氨酸(E)的取代(根据EU编号系统编号)。参见美国专利第7,658,921号，其以引用的方式整体并入本文中。已证明此类突变IgG(称为“YTE突变体”)的半衰期相较于相同抗体的野生型形式展示增加四倍(参见Dall'Acqua WF等人(2006)J Biol Chem 281:23514-24，其以引用的方式整体并入本文中)。在某些实施方案中，抗体包含在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处包含一个、两个、三个或更多个氨基酸残基的氨基酸取代的IgG恒定结构域(根据EU编号系统编号)。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述抗体的Fc区(例如，CH2结构域(人类IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人类IgG1的残基341-447)和/或铰链区，根据EU编号系统编号)中以增加或减小所述抗体对效应细胞表面上的Fc受体(例如活化的Fc受体)的亲和力。抗体Fc区中减小或增加抗体对Fc受体的亲和力的突变和用于将此类突变引入Fc受体或其片段中的技术是本领域技术人员已知的。可以改变抗体对Fc受体的亲和力的抗体Fc受体中突变的实例描述于例如Smith P等人(2012)PNAS109:6181-6186；美国专利第6,737,056号，以及国际公开第WO02/060919号、第WO 98/23289号和第WO 97/34631号中，其全部以引用的方式整体并入本文中。
在另一个实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸取代引入IgG恒定结构域Fc区中以改变抗体的效应子功能。举例来说，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322(根据EU编号系统编号)的一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基置换，以使得所述抗体对效应配体的亲和力改变，但保持亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应配体可为例如Fc受体或补体的C1组分。此方法更详细地描述于美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中，其各自以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，恒定区结构域的缺失或失活(经由点突变或其它手段达成)可以降低循环抗体的Fc受体结合，由此增加肿瘤定位。有关使恒定结构域缺失或失活并由此增加肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利第5,585,097号和第8,591,886号，其各自以引用的方式整体并入本文中。在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸取代引入本文所述抗体的Fc区中以移除Fc区上的潜在糖基化位点，由此可减少Fc受体结合(参见例如，Shields RL等人(2001)J Biol Chem 276:6591-604，其以引用的方式整体并入本文中)。在各种实施方案中，可以在本文所述抗体的恒定区中进行以下突变中的一个或多个：N297A取代；N297Q取代；L235A取代和L237A取代；L234A取代和L235A取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；D265A取代；A327Q取代；或P329A取代(根据EU编号系统编号)。在某些实施方案中，可以在本文所述抗体的恒定区中进行选自由D265A、P329A及其组合组成的组的突变。
在一个具体实施方案中，本文所述的抗体包含具有N297Q或N297A氨基酸取代的IgG1的恒定结构域(根据EU编号系统编号)。在一个实施方案中，本文所述的抗体包含具有选自由D265A、P329A及其组合组成的组的突变的IgG1的恒定结构域(根据EU编号系统编号)。在另一个实施方案中，本文所述的抗体包含具有选自由L234A、L235A及其组合组成的组的突变的IgG1的恒定结构域(根据EU编号系统编号)。在某些实施方案中，本文所述的抗体的恒定区中对应于人类IgG1重链中位置L234、L235和D265的氨基酸残基(根据EU编号索引编号)分别不为L、L和D。此方法详细描述于国际公开第WO14/108483号中，其以引用的方式整体并入本文中。在特定实施方案中，对应于人类IgG1重链中位置L234、L235和D265的氨基酸分别不为F、E和A；或A、A和A。
在某些实施方案中，本文所述抗体的恒定区中选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸残基可以被不同氨基酸残基置换(根据EU编号系统编号)，使得所述抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法更详细地描述于美国专利第6,194,551号(Idusogie等人)中，该专利以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，改变本文所述抗体的CH2结构域的N末端区中氨基酸位置231至238内的一个或多个氨基酸残基以改变抗体固定补体的能力。此方法进一步描述于国际公开第WO 94/29351号中，该专利以引用的方式整体并入本文中。在某些实施方案中，本文所述抗体的Fc区通过使以下位置处一个或多个氨基酸发生突变(例如引入氨基酸取代)进行修饰以增加抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439(根据EU编号系统编号)。此方法进一步描述于国际公开第WO 00/42072号中，该专利以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施方案中，本文所述的抗体包含IgG4抗体的恒定区且在重链的氨基酸残基228处的丝氨酸被脯氨酸取代(根据EU编号系统编号)。在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:196的重链恒定区。在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体，所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链恒定区。
在某些实施方案中，可以将本文所述的恒定区突变或修饰中的任一者引入具有两个重链恒定区的本文所述抗体的一个或两个重链恒定区中。
在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且充当拮抗剂的分离的抗体。
在某些实施方案中，本公开提供一种分离的抗体，其特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且如通过本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体存在下或在不相关抗体(例如不特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体)存在下的LAG-3(例如人类LAG-3)活性，使LAG-3(例如人类LAG-3)活性降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施方案中，本公开提供一种分离的抗体，其特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且如通过本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体存在下或在不相关抗体(例如不特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体)存在下的LAG-3(例如人类LAG-3)活性，使LAG-3(例如人类LAG-3)活性降低至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。LAG-3(例如人类LAG-3)活性的非限制性实例可以包括LAG-3(例如人类LAG-3)信号传导、LAG-3(例如人类LAG-3)与LAG-3(例如人类LAG-3)配体(例如II类MHC)的结合，以及对细胞因子产生(例如IL-2和/或TNF-α)的抑制。在某些实施方案中，本公开提供一种特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且减活、降低或抑制LAG-3(例如人类LAG-3)活性的分离的抗体。在具体实施方案中，LAG-3(例如人类LAG-3)活性降低是如下文实施例中所描述进行评估。
在具体实施方案中，本公开提供一种分离的抗体，其特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且如通过本文所述(参见下文实施例)或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体存在下或在不相关抗体(例如不特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体)存在下LAG-3(例如人类LAG-3)与其配体(例如II类MHC)的结合，使LAG-3(例如人类LAG-3)与其配体(例如II类MHC)的结合减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在具体实施方案中，本公开提供一种分离的抗体，其特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且如通过本文所述(参见下文实施例)或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体存在下或在不相关抗体(例如不特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体)存在下LAG-3(例如人类LAG-3)与其配体(例如II类MHC)的结合，使LAG-3(例如人类LAG-3)与其配体(例如II类MHC)的结合降低至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在具体实施方案中，本公开提供一种分离的抗体，其特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且如通过本文所述(参见下文实施例)或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体存在下或在不相关抗体(例如不特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体)存在下细胞因子的产生，使细胞因子的产生(例如IL-2和/或TNF-α)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在具体实施方案中，本公开提供一种分离的抗体，其特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且如通过本文所述(参见下文实施例)或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体存在下或在不相关抗体(例如不特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体)存在下细胞因子的产生，使细胞因子的产生(例如IL-2和/或TNF-α)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在具体实施方案中，本公开提供一种分离的抗体，其特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且如通过本文所述(参见下文实施例)或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体存在下或在不相关抗体(例如不特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体)存在下IL-2的产生，单独或与抗PD-1抗体(例如派姆单抗或纳武单抗)、抗PD-L1抗体(例如阿维鲁单抗(avelumab)、度伐单抗(durvalumab)或阿特珠单抗(atezolizumab))或抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗)的组合使响应于葡萄球菌内毒素A(SEA)刺激的人类外周血单核细胞(PBMC)中IL-2的产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在某些实施方案中，如通过本文所述(参见下文实施例)或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体存在下或在不相关抗体(例如不特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体)存在下仅用葡萄球菌内毒素A(SEA)刺激的外周血单核细胞(PBMC)，在本文所描述的特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体存在下，用SEA刺激的PBMC中IL-2的产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在具体实施方案中，本公开提供一种分离的抗体，其特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)且如通过本文所述(参见下文实施例)或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体存在下TNFα的产生，单独或与抗PD-1抗体(例如派姆单抗或纳武单抗)的组合使响应于抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中TNFα的产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一个实施方案中，TIL是来自肾细胞癌肿瘤。在另一个实施方案中，TIL是来自结肠直肠癌肿瘤。
在某些实施方案中，如通过本文所述(参见下文实施例)或本领域技术人员已知的方法所评估，相对于在无特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体存在下仅用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，在本文所描述的特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体存在下，用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激的TIL中TNFα的产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一个实施方案中，TIL是来自肾细胞癌肿瘤。在另一个实施方案中，TIL是来自结肠直肠癌肿瘤。
6.3药物组合物
本文提供包含具有所需纯度的本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体于生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co.,Easton,PA)中的组合物(例如药物组合物)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)；苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠离子；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型界面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种如本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体，其中在所述抗体的一部分中，重链和/或轻链的N末端氨基酸残基已转变成焦谷氨酸(例如，由N末端E或Q残基的游离氨基翻译后环化产生)。在某些实施方案中，所述组合物中重链至少50％(例如至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的N末端氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述组合物中轻链不超过50％(例如不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％)的N末端氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。在某些实施方案中，所述组合物中重链至少50％(例如至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的N末端氨基酸残基已转变成焦谷氨酸，且所述组合物中轻链不超过50％(例如不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％)的N末端氨基酸残基已转变成焦谷氨酸。
在一个具体实施方案中，药物组合物包含于药学上可接受的载剂中的本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体和任选地的一种或多种额外预防剂或治疗剂。在一个具体实施方案中，药物组合物包含于药学上可接受的载剂中的有效量的本文所述抗体和任选地的一种或多种额外预防剂或治疗剂。在一些实施方案中，所述抗体是所述药物组合物中所包括的唯一活性剂。本文所述的药物组合物可用于抑制LAG-3(例如人类LAG-3)活性且治疗病况，诸如癌症或感染性疾病。
用于肠胃外制剂中的药学上可接受的载剂包括水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂，及其它药学上可接受的物质。水性媒剂的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液(RingersInjection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸化林格氏注射液。非水性肠胃外媒剂包括植物来源的不挥发性油，棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以对包装于多剂量容器中的肠胃外制剂添加细菌抑制或真菌抑制浓度的抗微生物剂，包括酚类或甲酚类、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞钠(thimerosal)、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因(procainehydrochloride)。助悬剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酸酯80(80)。金属离子掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药物载剂还包括用于水混溶性媒剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
药物组合物可配制成用于向受试者施用的任何途径。施用途径的具体实例包括鼻内、经口、肺、经皮、皮内和肠胃外。本文还涵盖以皮下、肌内或静脉内注射为特征的肠胃外施用。可注射剂可以按常规形式制备为液体溶液或悬浮液、适于在注射前于液体中形成溶液或悬浮液的固体形式，或乳液。可注射剂、溶液和乳液还含有一种或多种赋形剂。适合赋形剂是例如水、生理食盐水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，必要时，待施用的药物组合物还可含有微量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂，以及其它此类试剂，诸如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
用于肠胃外施用抗体的制剂包括准备用于注射的无菌溶液；准备在即将使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品，诸如冻干粉剂，包括皮下注射片剂；准备用于注射的无菌悬浮液；准备在即将使用前与媒剂组合的无菌干燥不溶性产品；和无菌乳液。所述溶液可为水性或非水性的。
如果静脉内施用，则适合载剂包括生理食盐水或磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂，诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇以及其混合物的溶液。
包含抗体的表面用混合物是如关于局部和全身施用所描述制备。所得混合物可以为溶液、悬浮液、乳液或类似物，且可以配制为乳膏、凝胶、油膏、乳液、溶液、酏剂、洗液、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或任何其它适于表面施用的制剂形式。
本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以配制成供表面应用，诸如通过吸入施用的气雾剂形式(参见例如，美国专利第4,044,126号、第4,414,209号和第4,364,923号，它们描述了用于递送可用于治疗发炎性疾病，特别是哮喘的类固醇的气雾剂且以引用的方式整体并入本文中)。这些供施用至呼吸道的制剂可以单独或与诸如乳糖的惰性载剂组合而呈用于喷雾器的气雾剂或溶液的形式，或呈供吹入的微细粉末形式。在这样的情形中，所述制剂颗粒的直径在一个实施方案中将小于50微米，在一个实施方案中小于10微米。
本文所描述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以被配制成用于局部或表面应用，诸如用于表面应用至皮肤和粘膜，诸如眼中的粘膜，呈凝胶、乳膏和洗液形式；和用于应用至眼睛或用于池内或脊髓内应用。预期表面施用用于经皮递送以及用于施用至眼睛或粘膜，或用于吸入疗法。还可施用单独或与其它药学上可接受的赋形剂组合的抗体的鼻用溶液。
经皮贴片(包括离子电渗和电泳装置)是本领域技术人员熟知的且可以用于施用抗体。举例来说，此类贴片公开于美国专利第6,267,983号、第6,261,595号、第6,256,533号、第6,167,301号、第6,024,975号、第6,010,715号、第5,985,317号、第5,983,134号、第5,948,433号和第5,860,957号中，其全部以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施方案中，包含本文所述的抗体的药物组合物是冻干粉剂，其可以复原成溶液、乳液及其它混合物形式供施用。其还可被复原且配制成固体或凝胶形式。冻干粉剂是通过将本文所述的抗体或其药学上可接受的衍生物溶解于适合溶剂中来制备。在一些实施方案中，冻干粉剂是无菌的。溶剂可以含有改善粉剂或由粉剂制备的复原溶液的稳定性或其它药理学组分的赋形剂。可以使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它适合的试剂。溶剂还可含有缓冲剂，诸如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾，或本领域技术人员已知的在一个实施方案中呈大致中性pH的其它此类缓冲剂。随后对溶液进行无菌过滤，接着在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，得到所需制剂。在一个实施方案中，将所得溶液分配至小瓶中用于冻干。每个小瓶将含有单个剂量或多个剂量的化合物。冻干粉剂可以在适当条件下，诸如在约4℃或室温下储存。用注射用水使此冻干粉剂复原，得到用于肠胃外施用的制剂。将冻干粉剂添加至无菌水或其它适合载剂中来进行复原。精确量取决于所选化合物。此量可以凭经验确定。
本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体和本文所述的其它组合物还可配制为靶向待治疗受试者的特定组织、受体或其它身体区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员熟知的。预期所有此类靶向方法在本文中均可用于本发明组合物中。关于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利第6,316,652号、第6,274,552号、第6,271,359号、第6,253,872号、第6,139,865号、第6,131,570号、第6,120,751号、第6,071,495号、第6,060,082号、第6,048,736号、第6,039,975号、第6,004,534号、第5,985,307号、第5,972,366号、第5,900,252号、第5,840,674号、第5,759,542号和第5,709,874号，其全部以引用的方式整体并入本文中。在一个具体实施方案中，使本文所述的抗体靶向肿瘤。
欲用于体内施用的组合物可以为无菌的。此易于通过经过例如无菌滤膜过滤来实现。
6.4使用方法和用途
在另一方面，本公开提供一种使用本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体治疗受试者的方法。将受益于LAG-3(例如人类LAG-3)功能抑制的受试者的任何疾病或病状均可以使用本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体进行治疗。本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体特别适用于抑制免疫系统对肿瘤的耐受性且因此可用作患有癌症的受试者的免疫疗法。举例来说，在某些实施方案中，本公开提供一种在受试者中响应于抗原来增加T细胞活化的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其药物组合物。在某些实施方案中，本公开提供一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。
可以用本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或药物组合物治疗的癌症包括但不限于实体肿瘤、血液癌症、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、肾移行细胞癌、膀胱癌、维尔姆氏癌(Wilm's cancer)、卵巢癌、胰脏癌、乳癌(例如，以BRCA1和/或BRCA2突变为特征)、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、胃癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤(Ewing'ssarcoma)、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红血球增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌、肝癌、上皮癌和腹膜癌。在某些实施方案中，癌症是例如以上所述种类的转移性癌症。
在某些实施方案中，癌症是实体肿瘤、血液癌症(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)及其转移性病变。在一个实施方案中，癌症是实体肿瘤。实体肿瘤的实例包括恶性肿瘤，例如各器官系统的肉瘤和癌瘤(例如腺癌)，诸如影响下列的恶性肿瘤：肺、乳房、淋巴、胃肠或结肠直肠、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、尿道上皮、膀胱细胞)、咽、CNS(例如脑、神经或胶质细胞)、皮肤(例如黑素瘤)、头颈部(例如头颈鳞状细胞癌(HNCC))和胰脏。例如，黑素瘤、胃癌、直肠癌、肾细胞癌、乳癌(例如不表达一种、两种或全部三种雌激素受体、孕酮受体或Her2/neu的乳癌，例如三阴性乳癌)、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)(例如具有鳞状和/或非鳞状组织学的NSCLC)或小细胞肺癌)、前列腺癌、头颈癌(例如HPV+鳞状细胞癌)、小肠癌和食道癌。
在一个实施方案中，癌症是血液癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一个实施方案中，癌症是白血病，例如急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性髓母细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或毛细胞白血病。在一个实施方案中，癌症是淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞样(ABC)弥漫性大B细胞淋巴瘤、生发中心B细胞(GCB)弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、复发性非霍奇金氏淋巴瘤、难治性非霍奇金氏淋巴瘤、复发性滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkittlymphoma)、小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤或结外边缘区淋巴瘤。在一个实施方案中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
在某些实施方案中，本公开提供一种预防或治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其药物组合物。在一个实施方案中，本文提供用于预防和/或治疗感染(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、原虫感染或寄生虫感染)的方法。根据所述方法预防和/或治疗的感染可以由本文所确认的感染源引起。在一个具体实施方案中，本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其组合物是施用给受试者的唯一活性剂。在一些实施方案中，本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其组合物是与抗感染干预措施(例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂或抗虫剂)组合用于治疗感染性疾病。
可以用本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其药物组合物治疗和/或预防的感染性疾病是由包括但不限于细菌、寄生虫、真菌、原虫和病毒的感染源引起。在一个具体实施方案中，用本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其药物组合物治疗和/或预防的感染性疾病是由病毒引起。可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的病毒性疾病或病毒感染包括但不限于由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒(例如甲型流感病毒或乙型流感病毒)、水痘病毒、腺病毒、I型单纯疱疹病毒(HSV-I)、II型单纯疱疹病毒(HSV-II)、牛瘟病毒、鼻病毒、艾柯病毒(echovirus)、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、乳突病毒、巨细胞病毒、棘状病毒、虫媒病毒、汉坦病毒(huntavirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)、I型人类免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人类免疫缺陷病毒(HIV-II)，和诸如病毒性脑膜炎、脑炎、登革热或天花的病毒性疾病的致病源引起的感染。
可以预防和/或治疗的细菌感染包括由大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、草绿色葡萄球菌(Staphylococcus viridans)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的感染。可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的由细菌(例如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、草绿色葡萄球菌和绿脓杆菌)引起的细菌性疾病包括但不限于分枝杆菌立克次氏体(Mycobacteria rickettsia)病、支原体(Mycoplasma)病、奈瑟菌属(Neisseria)病、肺炎链球菌(S.pneumonia)病、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)病(莱姆病(Lyme disease))、炭疽杆菌(Bacillus antracis)病(炭疽)、破伤风、链球菌(Streptococcus)病、葡萄球菌(Staphylococcus)病、分枝杆菌(mycobacterium)病、百日咳(pertissus)、霍乱、瘟疫、白喉、衣原体病、金黄色葡萄球菌病和军团杆菌病。
可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的由原虫引起的原虫疾病或原虫感染包括但不限于利什曼原虫(leishmania)病、球虫病、锥体虫病、血吸虫病或疟疾。可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的由寄生虫引起的寄生虫疾病或寄生虫感染包括但不限于衣原体病和立克次氏体病。
可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的真菌性疾病或真菌性感染包括但不限于由念珠菌(Candida)引起的疾病或感染、接合菌病、念珠菌乳腺炎、伴随潜伏性毛孢子血症(trichosporonemia)的进行性播散性毛孢子菌病、播散性念珠菌病、肺副球孢子菌病、肺曲菌病、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)肺炎、隐球菌性脑膜炎、球孢子菌性脑膜脑炎(coccidioidal meningoencephalitis)和脑脊髓血管炎、黑曲霉(Aspergillus niger)感染、镰胞菌(Fusarium keratitis)病、副鼻窦真菌病、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)心内膜炎、胫骨软骨发育不良、光滑念珠菌(Candida glabrata)阴道炎、口咽念珠菌病、X联锁慢性肉芽肿病、足癣、皮肤念珠菌病、霉菌性胎盘炎、播散性毛孢子菌病、变应性支气管肺曲霉病、霉菌性角膜炎、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)感染、真菌性腹膜炎、曲弯孢霉(Curvularia geniculata)感染、葡萄球菌眼内炎、孢子丝菌病和皮肤真菌病。
在某些实施方案中，本公开提供一种预防或治疗受试者的神经系统疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其药物组合物。在一些实施方案中，所述神经系统疾病或病症是突触核蛋白病。在一些实施方案中，所述神经系统疾病或病症是帕金森氏病(Parkinson's disease)。
在某些实施方案中，这些方法还包括向受试者施用额外治疗剂。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是化学治疗剂、放射治疗剂或检查点靶向剂。在某些实施方案中，所述化学治疗剂是去甲基化剂(例如阿扎胞苷(azacitidine))。在某些实施方案中，所述检查点靶向剂选自由以下组成的组：拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗剂抗PD-L1抗体、拮抗剂抗PD-L2抗体、拮抗剂抗PD-1抗体、拮抗剂抗TIM-3抗体、拮抗剂抗LAG-3抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、激动剂抗GITR抗体、激动剂抗OX40抗体、拮抗剂抗TIGIT抗体、激动剂抗CD137抗体、拮抗剂抗VISTA抗体、拮抗剂抗CD73抗体和拮抗剂抗CD96抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及用于本发明方法中的本发明抗体和/或药物组合物，其中所述方法另外包括向受试者施用额外治疗剂。在一个实施方案中，本发明涉及用作药物的(a)本发明的抗体和/或药物组合物，以及(b)额外治疗剂。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症的方法中的(a)本发明的抗体和/或药物组合物，以及(b)额外治疗剂。在另一个实施方案中，本发明涉及药物组合物、药盒或多部件药盒，其包含(a)本发明的抗体和/或药物组合物，以及(b)额外治疗剂。在一个实施方案中，所述额外治疗剂是化学治疗剂、放射治疗剂或检查点靶向剂。
在某些实施方案中，将抗PD-1抗体用于本文所公开的方法中。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是Bristol-Myers Squibb开发的纳武单抗，又称BMS-936558或MDX1106。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是Merck&Co.开发的派姆单抗，又称兰罗利珠单抗(lambrolizumab)或MK-3475。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是CureTech开发的匹迪珠单抗(pidilizumab)，又称CT-011。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是Medimmune开发的MEDI0680，又称AMP-514。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是NovartisPharmaceuticals开发的PDR001。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是RegeneronPharmaceuticals开发的REGN2810。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是Pfizer开发的PF-06801591。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是BeiGene开发的BGB-A317。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是AnaptysBio和Tesaro开发的TSR-042。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体是Hengrui开发的SHR-1210。
可以用于本文所公开的治疗方法中的抗PD-1抗体的其它非限制性实例公开于以下专利和专利申请中，其全部以引用的方式整体并入本文中：美国专利第6,808,710号；美国专利第7,332,582号；美国专利第7,488,802号；美国专利第8,008,449号；美国专利第8,114,845号；美国专利第8,168,757号；美国专利第8,354,509号；美国专利第8,686,119号；美国专利第8,735,553号；美国专利第8,747,847号；美国专利第8,779,105号；美国专利第8,927,697号；美国专利第8,993,731号；美国专利第9,102,727号；美国专利第9,205,148号；美国公开第US 2013/0202623 A1号；美国公开第US 2013/0291136 A1号；美国公开第US2014/0044738 A1号；美国公开第US 2014/0356363 A1号；美国公开第US 2016/0075783 A1号；以及PCT公开第WO 2013/033091 A1号；PCT公开第WO 2015/036394 A1号；PCT公开第WO2014/179664 A2号；PCT公开第WO 2014/209804 A1号；PCT公开第WO 2014/206107 A1号；PCT公开第WO 2015/058573 A1号；PCT公开第WO 2015/085847 A1号；PCT公开第WO 2015/200119 A1号；PCT公开第WO 2016/015685 A1号；和PCT公开第WO 2016/020856 A1号。
在某些实施方案中，将抗PD-L1抗体用于本文所公开的方法中。在某些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是Genentech开发的阿特珠单抗。在某些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是AstraZeneca、Celgene和Medimmune开发的度伐单抗。在某些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是Merck Serono和Pfizer开发的阿维鲁单抗，又称MSB0010718C。在某些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是Bristol-Myers Squibb开发的MDX-1105。在某些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是Amplimmune和GSK开发的AMP-224。
可以用于本文所公开的治疗方法中的抗PD-L1抗体的非限制性实例公开于以下专利和专利申请中，其全部以引用的方式整体并入本文中：美国专利第7,943,743号；美国专利第8,168,179号；美国专利第8,217,149号；美国专利第8,552,154号；美国专利第8,779,108号；美国专利第8,981,063号；美国专利第9,175,082号；美国公开第US 2010/0203056A1号；美国公开第US2003/0232323 A1号；美国公开第US 2013/0323249 A1号；美国公开第US2014/0341917 A1号；美国公开第US 2014/0044738 A1号；美国公开第US2015/0203580A1号；美国公开第US 2015/0225483 A1号；美国公开第US2015/0346208 A1号；美国公开第US 2015/0355184 A1号；以及PCT公开第WO 2014/100079 A1号；PCT公开第WO 2014/022758A1号；PCT公开第WO 2014/055897 A2号；PCT公开第WO 2015/061668 A1号；PCT公开第WO2015/109124 A1号；PCT公开第WO 2015/195163 A1号；PCT公开第WO 2016/000619 A1号；和PCT公开第WO 2016/030350 A1号。
在某些实施方案中，将抗CTLA-4抗体用于本文所公开的方法中。在某些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是Bristol-Myers Squibb开发的伊匹单抗。在某些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是Bristol-Myers Squibb开发的伊匹单抗。在某些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是Pfizer和Medimmune开发的曲美木单抗(tremelimumab)。
可以用于本文所公开的治疗方法中的抗CTLA-4抗体的非限制性实例公开于以下专利和专利申请中，其全部以引用的方式整体并入本文中：美国专利第6,984,720号；美国专利第7,411,057号；美国专利第7,034,121号；美国专利第8,697,845号；美国公开第US2009/0123477 A1号；美国公开第US2014/0105914 A1号；美国公开第US 2013/0267688 A1号；美国公开第US2016/0145355 A1号；PCT公开第WO 2014/207064 A1号；和PCT公开第WO2016/015675 A1号。
在某些实施方案中，本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体是与靶向免疫调节酶，诸如IDO(吲哚胺-(2,3)-双加氧酶)和/或TDO(色氨酸2,3-双加氧酶)的化合物组合施用至受试者。在某些实施方案中，此类化合物选自由以下组成的组：艾卡哚司他(IncyteCorp；参见例如WO 2010/005958，其以引用的方式整体并入本文中)、BMS-986205(FlexusBiosciences/Bristol-Myers Squibb)、吲哚莫德(NewLink Genetics)和NLG919(NewLinkGenetics)。在一个实施方案中，所述化合物是艾卡哚司他。在另一个实施方案中，所述化合物是BMS-986205。在另一个实施方案中，所述化合物是吲哚莫德。在另一个实施方案中，所述化合物是NLG919。在一个具体实施方案中，本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体是与用于治疗癌症的IDO抑制剂组合施用至受试者。如本文所述的用于治疗癌症的IDO抑制剂以固体药物组合物剂型提供，诸如片剂、丸剂或胶囊，其中所述药物组合物包括IDO抑制剂和药学上可接受的赋形剂。因此，如本文所述的抗体和如本文所述的IDO抑制剂可以呈独立剂型分开、依序或同时施用。在一个实施方案中，所述抗体是肠胃外施用，且IDO抑制剂是经口施用。在特定实施方案中，所述抑制剂选自由以下组成的组：艾卡哚司他(IncyteCorporation)、BMS-986205(FlexusBiosciences/Bristol-Myers Squibb)、吲哚莫德(NewLink Genetics)和NLG919(NewLink Genetics)。艾卡哚司他描述于国PCT公开第WO2010/005958号中，该专利以引用的方式整体并入本文中。在一个实施方案中，所述抑制剂是艾卡哚司他。在另一个实施方案中，所述抑制剂是BMS-986205。在另一个实施方案中，所述抑制剂是吲哚莫德。在另一个实施方案中，所述抑制剂是NLG919。
在某些实施方案中，本公开提供特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的分离的抗体与抗PD-1抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)和吲哚胺-2,3-加双氧酶(IDO)的抑制剂的组合。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是派姆单抗。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗。在某些实施方案中，IDO抑制剂选自由艾卡哚司他、BMS-986205、吲哚莫德和NLG919组成的组。在某些实施方案中，IDO抑制剂是艾卡哚司他。在某些实施方案中，IDO抑制剂是BMS-986205。在某些实施方案中，IDO抑制剂是吲哚莫德。
在某些实施方案中，本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体是与另一抗癌剂组合施用至受试者。例示性抗癌剂包括抗体治疗剂，诸如曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin)、针对诸如CTLA-4、CD137和PD-1的共刺激或共抑制分子的抗体，以及针对诸如IL-10和TGF-β的细胞因子的抗体。
在某些实施方案中，额外治疗剂是JAK、PI3Kδ、BRD、PI3Kγ或Axl/Mer的抑制剂。在某些实施方案中，额外治疗剂是JAK(包括JAK1和/或JAK2)的抑制剂。在某些实施方案中，额外治疗剂是PI3Kδ的抑制剂。在某些实施方案中，额外治疗剂是BRD的抑制剂。在某些实施方案中，额外治疗剂是PI3Kγ的抑制剂。在某些实施方案中，额外治疗剂是Axl/Mer的抑制剂。
抗癌剂的其它实例包括阻止免疫细胞迁移的药剂，诸如针对趋化因子受体(包括CCR2和CCR4)的拮抗剂，以及增强免疫系统诸如助剂或过继性T细胞转移的药剂。
一种或多种额外免疫检查点调节剂可以与本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体组合用于治疗本文所述的任何疾病、病症或病况，例如TAM相关疾病、病症或病况。例示性免疫检查点调节剂包括针对免疫检查点分子，诸如CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、CD96、CD137、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137(又称为4-1BB)、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、VISTA、PD-1、PD-L1和PD-L2的调节剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子是选自CD27、CD28、CD40、ICOS、OX40、GITR和CD137的共刺激检查点分子。在一些实施方案中，免疫检查点分子是选自A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、PD-1、TIM-3和VISTA的共抑制检查点分子。在一些实施方案中，本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以与一种或多种选自KIR抑制剂、TIGIT抑制剂、LAIR1抑制剂、CD160抑制剂、2B4抑制剂和TGFRβ抑制剂的药剂组合使用。
在一些实施方案中，针对免疫检查点分子的调节剂是拮抗性抗PD1抗体、拮抗性抗PD-L1抗体或拮抗性抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，针对免疫检查点分子的调节剂是GITR激动剂，例如激动性抗GITR抗体。在一些实施方案中，激动性抗GITR抗体是TRX518或MK-4166。
在一些实施方案中，针对免疫检查点分子的调节剂是OX40激动剂，例如激动性抗OX40抗体或OX40L融合蛋白。在一些实施方案中，激动性抗OX40抗体是MEDI0562。在一些实施方案中，OX40L融合蛋白是MEDI6383。
本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以与一种或多种用于治疗诸如癌症的疾病的药剂组合使用。在一些实施方案中，所述药剂是烷化剂、蛋白酶体抑制剂、皮质类固醇或免疫调节剂。烷化剂的实例包括环磷酰胺(CY)、美法仑(melphalan，MEL)和苯达莫司汀(bendamustine)。在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂是卡非佐米(carfilzomib)。在一些实施方案中，皮质类固醇是地塞米松(dexamethasone，DEX)。在一些实施方案中，免疫调节剂是来那度胺(lenalidomide，LEN)或泊马度胺(pomalidomide，POM)。
在某些实施方案中，本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体是与疫苗组合施用至受试者。所述疫苗可以为例如肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗。在某些实施方案中，所述疫苗是基于热休克蛋白的肿瘤疫苗或基于热休克蛋白的病原体疫苗。在一个具体实施方案中，本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体是与基于热休克蛋白的肿瘤疫苗组合施用至受试者。热休克蛋白(HSP)是在所有物种中普遍存在的高度保守的蛋白质家族。由于热休克或其它形式的应激(包括暴露于毒素、氧化应激或葡萄糖剥夺)的结果，可以将其表达有效诱导至远远更高的水平。根据分子量，将其归类为五个家族：HSP-110、HSP-90、HSP-70、HSP-60和HSP-28。HSP通过抗原呈递细胞(APC)(诸如巨噬细胞和树突状细胞(DC))中的交叉呈递路径递送免疫原性肽，引起T细胞活化。HSP充当肿瘤相关抗原肽的伴侣载体，形成能够诱导肿瘤特异性免疫性的复合物。在从濒死的肿瘤细胞释放之后，HSP-抗原复合物被抗原呈递细胞(APC)吸收，抗原在APC中被加工成肽，所述肽结合I类和II类MHC分子，由此引起抗肿瘤CD8+和CD4+T细胞的活化。由来源于肿瘤制备物的HSP复合物引起的免疫性特异性针对由每位受试者的癌症所表达的独特抗原肽谱系。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用作药物，例如用于治疗癌症的方法中的(a)本发明的抗体和/或药物组合物，以及(b)疫苗。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物、药盒或多部件药盒，其包含(a)本发明的抗体和/或药物组合物，以及(b)疫苗。在一个实施方案中，所述疫苗是基于热休克蛋白的肿瘤疫苗。在一个实施方案中，所述疫苗是基于热休克蛋白的病原体疫苗。
热休克蛋白肽复合物(HSPPC)是由热休克蛋白与抗原肽的非共价复合物形成的蛋白质肽复合物。HSPPC引起先天性免疫反应和适应性免疫反应二者。在一个具体实施方案中，抗原肽呈现对所治疗癌症的抗原性。HSPPC是经由膜受体(主要为CD91)或通过结合至Toll样受体而被APC有效地摄取。HSPPC内化引起APC的功能成熟并产生趋化因子和细胞因子，从而导致引起自然杀伤细胞(NK)、单核细胞以及Th1与Th-2介导的免疫反应的活化。在某些实施方案中，本文所公开的方法中使用的HSPPC包含一种或多种选自hsp60、hsp70或hsp90家族的应激蛋白的热休克蛋白与抗原肽的复合物。在某些实施方案中，HSPPC包含hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、钙网蛋白，或其中两者或两者以上的组合。
在一个具体实施方案中，热休克蛋白肽复合物(HSPPC)包含重组热休克蛋白(例如hsp70或hsc70)或其肽结合结构域与重组抗原肽的复合物。重组热休克蛋白可以通过重组DNA技术，例如，使用如Dworniczak和Mirault,Nucleic Acids Res.15:5181-5197(1987)以及GenBank登录号P11142和/或Y00371(其各自以引用的方式整体并入本文中)中所描述的人类hsc70序列来制备。在某些实施方案中，Hsp70序列是如Hunt和MorimotoProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82(19),6455-6459(1985)以及GenBank登录号P0DMV8和/或M11717(其各自以引用的方式整体并入本文中)中所描述。抗原肽还可通过本领域中已知的重组DNA方法制备。
在某些实施方案中，抗原肽包含经修饰氨基酸。在某些实施方案中，经修饰氨基酸包含翻译后修饰。在某些实施方案中，经修饰氨基酸包含翻译后修饰的模拟物。在某些实施方案中，经修饰氨基酸是侧链羟基或胺经磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His。在某些实施方案中，经修饰氨基酸是侧链羟基或胺经磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His氨基酸的模拟物。
在一个具体实施方案中，本文所公开的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体是与热休克蛋白肽复合物(HSPPC)，例如热休克蛋白肽复合物-96(HSPPC-96)组合施用至受试者以治疗癌症。HSPPC-96包含96kDa热休克蛋白(Hsp)gp96与抗原肽的复合物。HSPPC-96是由受试者的肿瘤制造的癌症免疫治疗剂且含有癌症的抗原“指纹”。在某些实施方案中，此指纹含有仅出现在该特定受试者的特定癌细胞中的独特抗原且预期注射疫苗可刺激受试者的免疫系统识别并攻击具有所述特异性癌症指纹的任何细胞。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用作药物和/或用于治疗癌症的方法中的本发明的抗体和/或药物组合物以及热休克蛋白肽复合物(HSPPC)。
在某些实施方案中，HSPPC，例如HSPPC-96是由受试者的肿瘤组织产生。在一个具体实施方案中，HSPPC(例如HSPPC-96)是由所治疗癌症类型或其转移的肿瘤产生。在另一个具体实施方案中，HSPPC(例如HSPPC-96)是所治疗受试者自体的。在某些实施方案中，肿瘤组织是非坏死性肿瘤组织。在某些实施方案中，使用至少1克(例如至少1克、至少2克、至少3克、至少4克、至少5克、至少6克、至少7克、至少8克、至少9克或至少10克)非坏死性肿瘤组织来产生疫苗方案。在某些实施方案中，在手术切除之后，将非坏死性肿瘤组织冷冻，随后用于疫苗制备。在一些实施方案中，通过纯化技术从肿瘤组织中分离HSPPC(例如HSPPC-96)，过滤并制备为可注射疫苗。在某些实施方案中，向受试者施用6个至12个剂量的HSPPC(例如HSPCC-96)。在此类实施方案中，HSPPC(例如HSPPC-96)的剂量可每周施用一次(对于前4个剂量)，且接着每两周施用一次(对于另外2个至8个剂量)。
可以根据本文所述的方法使用的HSPPC的其它实例公开于以下专利和专利申请中(其全部以引用的方式整体并入本文中)：美国专利第6,391,306号、第6,383,492号、第6,403,095号、第6,410,026号、第6,436,404号、第6,447,780号、第6,447,781号和第6,610,659号，其全部以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施方案中，本文所公开的抗LAG-3抗体是与佐剂组合施用至受试者。可根据治疗情况使用不同的佐剂。适当佐剂的非限制性实例包括但不限于完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、montanide ISA(不完全Seppic佐剂)、Ribi佐剂系统(RAS)、TiterMax、胞壁酰肽、Syntex佐剂制剂(SAF)、明矾(氢氧化铝和/或磷酸铝)、铝盐佐剂、佐剂、被硝基纤维素吸附的抗原、被囊封或被截留的抗原、3脱-O-酰基化单磷脂酰脂质A(3D-MPL)、免疫刺激性寡核苷酸、toll样受体(TLR)配体、甘露聚糖结合凝集素(MBL)配体、STING激动剂、免疫刺激性复合物，诸如皂素、Quil A、QS-21、QS-7、ISCOMATRIX等。其它佐剂包括CpG寡核苷酸和双链RNA分子，诸如poly(A)和poly(U)。还可使用以上佐剂的组合。参见例如，美国专利第6,645,495号、第7,029,678号和第7,858,589号，其全部以引用的方式整体并入本文中。在一个实施方案中，本文所使用的佐剂是QS-21STIMULON。
在某些实施方案中，本文所公开的抗LAG-3抗体是与包含TCR的额外治疗剂组合施用至受试者。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是可溶性TCR。在某些实施方案中，所述额外治疗剂是表达TCR的细胞。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用作药物和/或用于治疗癌症的方法中的本发明的抗体和/或药物组合物以及包含TCR的额外治疗剂。
在某些实施方案中，本文所公开的抗LAG-3抗体是与表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞组合施用至受试者。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞。
在某些实施方案中，本文所公开的抗LAG-3抗体是与TCR模拟抗体组合施用至受试者。在某些实施方案中，TCR模拟抗体是特异性结合至肽-MHC复合物的抗体。有关TCR模拟抗体的非限制性实例，参见例如美国专利第9,074,000号和美国公开第US 2009/0304679 A1号和第US 2014/0134191 A1号，其全部以引用的方式整体并入本文中。
抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体和额外治疗剂(例如化学治疗剂、放射治疗剂、检查点靶向剂、IDO抑制剂、疫苗、佐剂、可溶性TCR、表达TCR的细胞、表达嵌合抗原受体的细胞和/或TCR模拟抗体)可以呈独立剂型分开、连续或同时施用。在一个实施方案中，抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体是肠胃外施用，且IDO抑制剂是经口施用。
本文所述的抗体或药物组合物可通过多种途径递送给受试者。所述途径包括但不限于肠胃外、鼻内、气管内、经口、皮内、表面、肌内、腹膜内、经皮、静脉内、肿瘤内、经结膜、动脉内和皮下途径。还可采用肺施用，例如通过使用吸入器或雾化器并与气雾剂一起配制以喷雾剂形式使用。在某些实施方案中，本文所述的抗体或药物组合物是经皮下或静脉内递送。在某些实施方案中，本文所述的抗体或药物组合物是瘤内递送。在某些实施方案中，本文所述的抗体或药物组合物是经动脉内递送。在某些实施方案中，本文所述的抗体或药物组合物是递送至肿瘤引流淋巴结中。在某些实施方案中，本文所述的抗体或药物组合物是经鼻内递送。
有效治疗和/或预防病况的抗体或组合物的量将取决于疾病的性质，且可以由标准临床技术确定。
组合物中采用的精确剂量还将根据施用途径，以及由其引起的感染或疾病的严重性，且应当根据从业人员的判断和每位受试者的情况决定。举例来说，有效剂量还可取决于施用手段、目标部位、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、患者是人抑或动物、施用的其它药物，或治疗是预防性抑或治疗性而变化。通常，患者是人，但还可治疗非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物。调整治疗剂量以使安全性和功效最优化。
还可使用本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体，使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法，包括免疫检定，诸如酶联免疫吸附剂检定(ELISA)、免疫沉淀或蛋白质印记法(Western blotting)检定生物样品中LAG-3(例如人类LAG-3)的蛋白质水平。适合的抗体检定标记是本领域中已知的且包括酶标记，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)。此类标记还可用于标记本文所述的抗体。或者，可以标记识别本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体的第二抗体并与抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体组合使用以检测LAG-3(例如人类LAG-3)蛋白质水平。因此，在一个实施方案中，本发明涉及使用本发明的抗体在体外检测生物样品中的LAG-3(例如人类LAG-3)蛋白质。在另一个实施方案中，本发明涉及使用本发明的抗LAG-3抗体在体外检定和/或检测生物样品中的LAG-3(例如人类LAG-3)蛋白质水平，任选地其中所述抗LAG-3抗体与放射性核素或可检测标记缀合，和/或携带本文所述的标记，和/或其中使用免疫组织学方法。
预期有关LAG-3(例如人类LAG-3)蛋白质表达的检定包括直接(例如通过测定或估计绝对蛋白质水平)或相对地(例如通过与第二生物样品中疾病相关蛋白质的水平相比较)定性或定量地测量或估计第一生物样品中的LAG-3(例如人类LAG-3)蛋白质水平。可以测量或估计第一生物样品中的LAG-3(例如人类LAG-3)多肽表达水平并与标准LAG-3(例如人类LAG-3)蛋白质水平相比较，所述标准是由从未患病症的个体获得的第二生物样品取得或通过对来自一群未患病症的个体的水平求平均水平测定。如本领域中所了解，在获知“标准”LAG-3(例如人类LAG-3)多肽水平后，将其反复用作比较标准。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于检定和/或检测生物样品中的LAG-3蛋白质水平，例如人类LAG-3蛋白质水平的体外方法，所述方法包括通过免疫组织学方法定性地或定量地测量或估计生物样品中LAG-3蛋白质，例如人类LAG-3蛋白质的水平。
如本文所使用，术语“生物样品”是指从受试者、细胞系、组织或可能表达LAG-3(例如人类LAG-3)的细胞的其它来源。从动物(例如人类)获得组织活检样品和体液的方法是本领域中熟知的。生物样品包括外周血单核细胞。
本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以用于预测、诊断、监测和筛查应用，包括本领域技术人员熟知的和标准的以及基于本说明书的体外和体内应用。用于体外评估和评价免疫系统状态和/或免疫反应的预测、诊断、监测和筛查检定以及药盒可用于预测、诊断和监测以对患者样品，包括已知具有或怀疑具有免疫系统功能异常的患者样品，或针对预期或所需的免疫系统反应、抗原反应或疫苗反应进行评价。免疫系统状态和/或免疫反应的评估和评价还可用于确定患者进行临床药物试验或施用特定化学治疗剂、放射治疗剂或抗体，包括其组合，相对于不同药剂或抗体的适应性。实际上，在利用针对乳癌中的HER2蛋白的抗体(HercepTestTM,Dako)中已进行此类预测和诊断性监测和评估，其中所述检定还用于评价进行使用的抗体疗法的患者。体内应用包括定向细胞疗法和免疫系统调节，以及免疫反应的放射成像。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种用作诊断剂的本发明的抗LAG-3抗体和/或药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的抗LAG-3抗体和/或药物组合物，其是用于对具有或怀疑具有免疫系统功能异常的受试者和/或针对预期或所需免疫系统反应、抗原反应或疫苗反应进行预测、诊断和/或监测的方法中。在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的抗LAG-3抗体的用途，其是通过在体外检定和/或检测受试者的生物样品中人类LAG-3蛋白质水平而用于对具有或怀疑具有免疫系统功能异常的受试者和/或针对预期或所需免疫系统反应、抗原反应或疫苗反应进行预测、诊断和/或监测。
在一个实施方案中，抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以用于活检样品的免疫组织化学分析中。在另一个实施方案中，抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以用于检测LAG-3(例如人类LAG-3)的水平，或在膜表面上含有LAG-3(例如人类LAG-3)的细胞的水平，所述水平则可能与某些疾病症状有联系。本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以携带可检测标记或功能性标记。当使用荧光标记时，可以利用本领域中已知的当前可用显微镜检术和荧光活化细胞分选仪分析(FACS)或两种方法程序的组合鉴别并定量具体结合成员。本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以携带荧光标记。例示性荧光标记包括例如反应性和缀合探针，例如氨基香豆素、荧光素以及Texas红、Alexa Fluor染料、Cy染料和DyLight染料。抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体可以携带放射性标记，诸如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。当使用放射性标记时，可以利用本领域中已知的当前可用计数程序鉴别并定量抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体与LAG-3(例如人类LAG-3)的特异性结合。在所述标记是酶的情况下，可以通过本领域中所知的目前所用的比色技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、安培检测技术或气体定量技术进行检测。此可通过使样品或对照样品与抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体在允许所述抗体与LAG-3(例如人类LAG-3)之间形成复合物的条件下接触来实现。检测并比较样品与对照样品中抗体与LAG-3(例如人类LAG-3)之间形成的任何复合物。鉴于本文所述的抗体特异性结合LAG-3(例如人类LAG-3)，可以使用所述抗体特异性检测细胞表面上的LAG-3(例如人类LAG-3)表达。还可使用本文所述的抗体，经由免疫亲和纯化法纯化LAG-3(例如人类LAG-3)。本文还包括一种检定系统，所述系统可以制备呈测试药盒形式以定量分析例如LAG-3(例如人类LAG-3)或LAG-3(例如人类LAG-3)/LAG-3(例如人类LAG-3)配体复合物的存在情况。所述系统或测试药盒、药盒或多部件药盒包含标记的组分，例如标记的抗体，和一种或多种额外免疫化学试剂。
6.5多核苷酸、载体和产生抗LAG-3抗体的方法
在另一方面，本文提供包含编码特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)抗原的本文所述抗体或其片段(例如轻链可变区和/或重链可变区)的核苷酸序列的多核苷酸，以及用于在宿主细胞(例如大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达的载体，例如包含此类多核苷酸的载体。本文提供包含编码任何本文所提供的抗体的重链和/或轻链的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸序列的载体，例如用于在宿主细胞(例如哺乳动物细胞)中高效表达所述多核苷酸序列的表达载体。
如本文所使用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与所述核酸分子的天然来源中(例如，小鼠或人类中)存在的其它核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(诸如cDNA分子)当通过重组技术产生时可以基本上不含其它细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。举例来说，表述“基本上不含”包括具有低于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特定来说，低于约10％)的其它物质(例如细胞物质、培养基、其它核酸分子、化学前体和/或其它化学物质)的多核苷酸或核酸分子制剂。在一个具体实施方案中，编码本文所述的抗体的核酸分子是分离的或纯化的。
在特定方面，本文提供包含编码特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)多肽且包含如本文所述的氨基酸序列的抗体以及与此类抗体竞争结合至LAG-3(例如人类LAG-3)多肽(例如以剂量依赖性方式)或与此类抗体结合至相同的表位的抗体的核苷酸序列的多核苷酸。
在某些方面，本文提供包含编码本文所述抗体的轻链或重链的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸可包含编码包含本文所述抗体的VL FR和CDR的轻链的核苷酸序列(参见例如，表1、3、5、6和7)，或编码包含本文所述抗体的VH FR和CDR的重链的核苷酸序列(参见例如，表1、2、4、6和7)。
本文还提供编码抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体的多核苷酸，所述多核苷酸例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列置换和消除mRNA不稳定元件进行优化。通过在mRNA中引入密码子变化和/或消除抑制性区域来产生编码抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段(例如轻链、重链、VH结构域或VL结构域)的经优化核酸以进行重组表达的方法因此可通过采用例如美国专利第5,965,726号、第6,174,666号、第6,291,664号、第6,414,132号和第6,794,498号(其全部以引用的方式整体并入本文中)中所描述的优化方法进行。举例来说，可使RNA内的潜在剪接位点和不稳定元件(例如富含A/T或A/U的元件)在不改变由核酸序列编码的氨基酸的情况下突变以提高用于重组表达的RNA的稳定性。所述改变利用遗传密码的简并性，例如使用同一氨基酸的替代性密码子。在一些实施方案中，可能需要改变一个或多个密码子以编码保守突变，例如与原始氨基酸具有类似化学结构和特性和/或功能的类似氨基酸。此类方法可以使抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段的表达相对于由未经优化的多核苷酸编码的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在某些实施方案中，编码本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段(例如VL结构域和/或VH结构域)的经优化多核苷酸序列可以与编码本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段(例如VL结构域和/或VH结构域)的未优化多核苷酸序列的反义(例如互补)多核苷酸杂交。在具体实施方案中，编码本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段的经优化核苷酸序列在高严格度条件下与编码本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段的未优化多核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在一个具体实施方案中，编码本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段的经优化核苷酸序列在高严格度、中等或较低严格度杂交条件下与编码本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段的未优化核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。有关杂交条件的信息已有描述，参见例如，美国专利申请公开第US 2005/0048549号(例如第72段至第73段)，所述专利以引用的方式整体并入本文中。
可以通过本领域中已知的任何方法获得所述多核苷酸并测定所述多核苷酸的核苷酸序列。编码本文所述的抗体(例如表1、6和7中所述的抗体)和这些抗体的修饰形式的核苷酸序列可以使用本领域中熟知的方法测定，即，以使得产生编码所述抗体的核酸的方式组装已知可编码特定氨基酸的核苷酸密码子。这样的编码所述抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装而成(例如，如Kutmeier G等人(1994),BioTechniques 17:242-6所述，所述文献以引用的方式整体并入本文中)，简单来说，其涉及合成含有编码所述抗体的序列的多个部分的重叠寡核苷酸，退火并连接那些寡核苷酸，且接着通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，可以使用本领域中熟知的方法(例如PCR及其它分子克隆方法)，由来自适合来源(例如杂交瘤)的核酸产生编码本文所述的抗体的多核苷酸。举例来说，可使用从产生所关注抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA来进行使用可与已知序列的3'端和5'端杂交的合成引物的PCR扩增。此等PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体轻链和/或重链的序列的核酸。此等PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。可将扩增的核酸克隆至载体中以在宿主细胞中表达并例如进一步克隆以产生嵌合抗体和人源化抗体。
如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但已知抗体分子的序列，则可以化学合成，或通过使用可与所述序列的3'端和5'端杂交的合成引物进行PCR扩增，或通过使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针鉴别例如cDNA文库中编码所述抗体的cDNA克隆来进行克隆，从适合来源(例如抗体cDNA文库或由表达所述抗体的任何组织或细胞，诸如经选择以表达本文所述的抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库，或从所述组织或细胞分离的核酸，优选为poly A+RNA)获得编码免疫球蛋白的核酸。接着可以使用本领域中熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆至可复制克隆载体中。
可以容易地分离编码本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体的DNA并使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合至编码所述抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)测序。杂交瘤细胞可用作此种DNA的来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，接着将所述表达载体转染至宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞)或不会另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以在所述重组宿主细胞中合成抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体。
为了产生完整抗体，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和用以保护所述限制性位点的侧接序列的PCR引物扩增scFv克隆中的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆至表达重链恒定区(例如人类γ4恒定区)的载体中，且可以将PCR扩增的VL结构域克隆至表达轻链恒定区(例如人类κ或λ恒定区)的载体中。在某些实施方案中，用于表达VH或VL结构域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号序列、可变区的克隆位点、恒定结构域和选择标记物(诸如新霉素)。还可将VH和VL结构域克隆至一个表达必要恒定区的载体中。接着，使用本领域技术人员已知的技术，将重链转化载体和轻链转化载体共转染至细胞系中以产生稳定的或暂存的表达全长抗体(例如IgG)的细胞系。
还可例如通过用人类重链和轻链恒定结构域的编码序列替代鼠类序列，或通过将全部或一部分非免疫球蛋白多肽编码序列共价接合至免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。
还提供在高严格度、中等或较低严格度杂交条件下与编码本文所述抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。在具体实施方案中，本文所述的多核苷酸在高严格度、中等或较低严格度杂交条件下与编码本文所提供的VH结构域和/或VL结构域的多核苷酸杂交。
杂交条件在本领域中已有描述且是本领域技术人员已知的。举例来说，在严格条件下杂交可涉及在约45℃下与滤膜结合的DNA在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，随后在约50℃至65℃下在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤一次或多次；在高严格度条件下杂交可涉及在约45℃下与滤膜结合的核酸在6xSSC中杂交，随后在约68℃下在0.1xSSC/0.2％SDS中洗涤一次或多次。在其它严格度杂交条件下的杂交是本领域技术人员已知的且已有描述，参见例如Ausubel FM等人编，(1989)Current Protocols in Molecular Biology，第I卷，GreenPublishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,New York，第6.3.1页至第6.3.6页和第2.10.3页，所述文献以引用的方式整体并入本文中。
在某些方面，本文提供表达(例如重组表达)本文所描述的特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体的细胞(例如宿主细胞)以及相关多核苷酸和表达载体。本文提供用于在宿主细胞中，优选在哺乳动物细胞中重组表达的载体(例如表达载体)，所述载体包括包含编码抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本文还提供包含此类用于重组表达本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体(例如人类或人源化抗体)的载体的宿主细胞。在一个特定方面，本文提供用于制备本文所述的抗体的方法，所述方法包括由宿主细胞表达此种抗体。
本文所述的特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体(例如本文所述的全长抗体、抗体的重链和/或轻链、或单链抗体)的重组表达涉及构建含有编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。获得编码本文所述的抗体分子、抗体的重链和/或轻链、或其片段(例如重链和/或轻链可变区)的多核苷酸后，可使用本领域中熟知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生所述抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有抗体或抗体片段(例如轻链或重链)编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可使用本领域技术人员熟知的方法构建含有抗体或抗体片段(例如轻链或重链)编码序列以及适当转录和翻译控制信号序列的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供可复制载体，所述载体包含可操作地连接至启动子的编码本文所述的抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变区或其片段、或者重链或轻链CDR的核苷酸序列。此类载体可例如包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际公开第WO 86/05807号和第WO 89/01036号；和美国专利第5,122,464号，其以引用的方式整体并入本文中)且可将抗体可变区克隆至这样的载体中以表达整个重链、整个轻链或整个重链与整个轻链二者。
表达载体可通过常规技术转移至细胞(例如宿主细胞)中且所得细胞可接着通过常规技术培养以产生本文所述的抗体或其片段。因此，本文提供含有编码本文所述的抗体或其片段、或其重链或轻链、或其片段、或本文所述的单链抗体的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操作地连接至用于在宿主细胞中表达此类序列的启动子。在某些实施方案中，对于双链抗体的表达，如下文详述，可在宿主细胞中共表达单独地编码重链和轻链的载体以表达整个免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，宿主细胞含有一种载体，所述载体包含编码本文所述抗体的重链和轻链、或其片段的多核苷酸。在具体实施方案中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一载体包含编码本文所述抗体的重链或重链可变区、或其片段的多核苷酸，且第二载体包含编码本文所述抗体的轻链或轻链可变区、或其片段的多核苷酸。在其它实施方案中，第一宿主细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码本文所述抗体的重链或重链可变区、或其片段的多核苷酸，且第二宿主细胞包含第二载体，所述第二载体包含编码本文所述抗体的轻链或轻链可变区的多核苷酸。在具体实施方案中，由第一细胞表达的重链/重链可变区与第二细胞的轻链/轻链可变区相连以形成本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体。在某些实施方案中，本文提供包含此种第一宿主细胞和此种第二宿主细胞的宿主细胞群体。
在特定实施方案中，本文提供载体群体，所述载体群体包括包含编码本文所述抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体的轻链/轻链可变区的多核苷酸的第一载体，和包含编码本文所述抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体的重链/重链可变区的多核苷酸的第二载体。
可利用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的抗体分子(参见例如美国专利第5,807,715号，其以引用的方式整体并入本文中)。此类宿主表达系统代表多种媒介物，利用所述媒介物，可以产生所关注编码序列且随后进行纯化，而且还代表细胞，所述细胞当用适当核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所述的抗体。这些表达系统包括但不限于用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，诸如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如绿藻，诸如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或带有含来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa以及NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)。在一个具体实施方案中，用于表达本文所述的抗体的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞。在某些实施方案中，由CHO细胞产生的抗体的重链和/或轻链的N末端谷氨酰胺或谷氨酸残基可被焦谷氨酸置换。在特定实施方案中，用于表达本文所述的抗体的细胞是人类细胞，例如人类细胞系。在一个具体实施方案中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在特定实施方案中，使用细菌细胞(诸如大肠杆菌)；或特别适于表达完全重组抗体分子的真核细胞(例如哺乳动物细胞)来表达重组抗体分子。举例来说，哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞与载体诸如来自人巨细胞病毒的主要即刻早期基因启动子元件的结合物是有效的抗体表达系统(Foecking MK和Hofstetter H(1986)Gene 45:101-5；和Cockett MI等人(1990)Biotechnology 8(7):662-7，其各自以引用的方式整体并入本文中)。在某些实施方案中，本文所述的抗体是由CHO细胞或NS0细胞产生。在一个具体实施方案中，编码本文所述的特异性结合LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异型启动子调控。
在细菌系统中，可根据所表达的抗体分子的预期用途有利地选择多种表达载体。举例来说，当欲产生大量此类抗体，用于产生抗体分子的药物组合物时，可能需要引导高水平表达易于纯化的融合蛋白产物的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U和Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2:1791-1794)，在所述载体中抗体编码序列可独立地连接至载体中与lac Z编码区同框，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S和Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13:3101-3109；Van Heeke G和Schuster SM(1989)J BiolChem24:5503-5509)；和类似载体，其以引用的方式整体并入本文中。举例来说，还可使用pGEX载体将外源性多肽与谷胱甘肽5-转移酶(GST)表达为融合蛋白。一般来说，此类融合蛋白是可溶的且可通过吸附和结合至底物谷胱甘肽琼脂糖珠粒，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱，从溶解的细胞中容易地纯化。pGEX被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而使克隆的靶基因产物能够从GST部分释放出来。
在昆虫系统中，举例来说，可使用银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外源性基因。所述病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列独立地克隆至所述病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中并置放于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可将所关注抗体编码序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。此嵌合基因接着可通过体外或体内重组插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组中的非必需区域(例如E1或E3区)将产生有活力且能够在感染宿主中表达抗体分子的重组病毒(参见例如，Logan J和Shenk T(1984)PNAS 81(12):3655-9，其以引用的方式整体并入本文中)。为了高效翻译插入的抗体编码序列，可能还需要特定起始信号序列。这些信号序列包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相以确保翻译整个插入序列。这些外源性翻译控制信号序列和起始密码子可具有多种来源(天然的和合成的)。通过包括适当转录增强子元件、转录终止子等可提高表达效率(参见例如，Bitter G等人(1987)Methods Enzymol.153:516-544，其以引用的方式整体并入本文中)。
此外，可选择调节插入序列的表达或者以所需特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞系。对蛋白质产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能而言是重要的。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特有的机制。可选择适当细胞系或宿主系统以确保所表达的外源性蛋白质的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和基因产物磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不能内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠类骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施方案中，本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体是在哺乳动物细胞，诸如CHO细胞中产生。
在一个具体实施方案中，本文所述的抗体具有减少的岩藻糖含量或不含岩藻糖。所述抗体可使用本领域技术人员已知的技术产生。举例来说，可使所述抗体在欠缺或缺少岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一个具体实施例中，可使用敲除两个α1,6-岩藻糖基转移酶等位基因的细胞系产生具有减少的岩藻糖含量的抗体。系统(Lonza)是可用于产生具有减少的岩藻糖含量的抗体的这样的系统的一个实例。
为了长期高产量地生产重组蛋白，可以产生稳定表达细胞。举例来说，可以对稳定表达本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体的细胞系进行工程改造。在具体实施方案中，本文所提供的细胞稳定表达可缔合形成本文所述抗体的轻链/轻链可变区和重链/重链可变区。
在某些方面，除使用含有病毒复制起点的表达载体外，可以用受适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记物控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源性DNA/多核苷酸之后，可使工程改造的细胞于加富培养基中生长1-2天，随后将其转入选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记物赋予对选择的抗性且允许细胞将质粒稳定地整合至其染色体中并生长形成转化灶(foci)，其继而可克隆至细胞系中并扩增。此方法适宜用于工程改造表达本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体或其片段的细胞系。此类工程改造的细胞系特别适用于筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的组合物。
可使用多种选择系统，包括但不限于分别在tk、hgprt或aprt细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人(1977)Cell 11(1):223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska EH和Szybalski W(1962)PNAS 48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy I等人(1980)Cell 22(3):817-23)基因，其全部以引用的方式整体并入本文中。另外，可使用抗代谢物抗性作为以下基因选择的基础：dhfr，其赋予对氨甲喋呤(methotrexate)的抗性(Wigler M等人(1980)PNAS 77(6):3567-70；O'Hare K等人(1981)PNAS 78:1527-31)；gpt，其赋予对霉芬酸的抗性(Mulligan RC和Berg P(1981)PNAS 78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu GY和Wu CH(1991)Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev P(1993)Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573-596；Mulligan RC(1993)Science 260:926-932；以及Morgan RA和Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62:191-217；Nabel GJ和Felgner PL(1993)Trends Biotechnol 11(5):211-5)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre RF等人(1984)Gene 30(1-3):147-56)，其全部以引用的方式整体并入本文中。通常可使用重组DNA技术中通常已知的方法选择所需重组克隆且此类方法描述于例如Ausubel FM等人(编),Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,NY(1993)；Kriegler M,Gene Transfer and Expression,A LaboratoryManual,Stockton Press,NY(1990)；和第12和13章中，Dracopoli NC等人(编)，CurrentProtocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colbère-Garapin F等人(1981)J Mol Biol 150:1-14，所述文献皆以引用的方式整体并入本文中。
可通过载体扩增来增加抗体分子的表达水平(关于综述，参见Bebbington CR和Hentschel CCG,The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(AcademicPress,New York,1987)，其以引用的方式整体并入本文中)。当表达抗体的载体系统中的标记物为可扩增的时，增加宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平将增加标记物基因拷贝的数量。由于扩增的区域与抗体基因相关联，故抗体的产量也将增加(Crouse GF等人(1983)Mol Cell Biol 3:257-66，其以引用的方式整体并入本文中)。
所述宿主细胞可以用两个或两个以上本文所述的表达载体共转染，第一载体编码重链衍生的多肽并且第二载体编码轻链衍生的多肽。所述两个载体可含有相同的选择性标记物，其能够同等地表达重链和轻链多肽。所述宿主细胞可用不同量的两个或两个以上表达载体共转染。举例来说，宿主细胞可以用以下比率中的任一者的第一表达载体和第二表达载体转染：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
或者，可使用单一载体，所述载体编码且能够表达重链和轻链多肽二者。在此类情况下，轻链应置放在重链之前以避开过量的有毒游离重链(Proudfoot NJ(1986)Nature322:562-565；和G(1980)PNAS 77:2197-2199，其各自以引用的方式整体并入本文中)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。所述表达载体可以为单顺反子或多顺反子的。多顺反子核酸构建体可编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，或在2-5个、5-10个或10-20个范围内的基因/核苷酸序列。举例来说，双顺反子核酸构建体按以下次序可包含启动子、第一基因(例如本文所述抗体的重链)以及第二基因(例如本文所述抗体的轻链)。在这样的表达载体中，两个基因的转录可由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可遵循戴帽依赖性扫描机制，且来自第二基因的mRNA的翻译可遵循不依赖于戴帽的机制，例如遵循IRES。
在通过重组表达产生本文所述的抗体分子后，通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通过色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是在蛋白质A后通过针对特定抗原的亲和色谱法，以及尺寸排阻色谱法)、离心、差示溶解度法或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术对其进行纯化。另外，本文所述的抗体可以与本文所述或本领域中另外已知有助于纯化的异源多肽序列融合。
在具体实施方案中，本文所述的抗体是分离的或纯化的。一般来说，分离的抗体是基本上不含具有与分离的抗体不同的抗原特异性的其它抗体的抗体。举例来说，在特定实施方案中，本文所述的抗体制剂基本上不含细胞物质和/或化学前体。表述“基本上不含细胞物质”包括将抗体与分离或重组产生所述抗体的细胞的细胞组分分开的抗体制剂。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有低于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白(在本文中又称为“污染蛋白”)和/或抗体变体，例如抗体的不同翻译后修饰形式或抗体的其它不同形式(例如抗体片段)的抗体制剂。当重组产生抗体时，其一般还基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制剂的体积不到约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成产生抗体时，其一般基本上不含化学前体或其它化学物质，即，其与蛋白质合成中所涉及的化学前体或其它化学物质分离。因此，此类抗体制剂具有低于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或除所关注抗体外的化合物。在一个具体实施方案中，本文所述的抗体是分离的或纯化的。
特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体或其片段可通过本领域中已知用于合成抗体的任何方法，例如通过化学合成或通过重组表达技术产生。除非另外指示，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交中的常规技术和在本领域技能内的相关技术。这些技术例如描述于本文所引用的参考文献中并于文献中完整地阐明。参见例如，Maniatis T等人(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Sambrook J等人(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)Gait(编)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；Eckstein(编)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press；Birren B等人(编)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press，其全部以引用的方式整体并入本文中。
在一个具体实施方案中，本文所述的抗体是通过涉及产生例如经由合成、DNA序列的遗传工程改造产生的任何方式制备、表达、产生或分离的抗体(例如重组抗体)。在某些实施方案中，此类抗体包含在体内并非天然存在于动物或哺乳动物(例如人)的抗体生殖细胞系谱系内的序列(例如DNA序列或氨基酸序列)。
在一个方面，本文提供一种制备特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体的方法，所述方法包括培养本文所述的细胞或宿主细胞。在一个实施方案中，所述方法是在体外进行。在某一方面，本文提供一种制备特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体的方法，所述方法包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如包含编码本文所述的抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如重组表达)所述抗体。在特定实施方案中，细胞是分离的细胞。在特定实施方案中，已将外源性多核苷酸引入细胞中。在特定实施方案中，所述方法还包括纯化从所述细胞或宿主细胞获得的抗体的步骤。
用于产生多克隆抗体的方法是本领域中已知的(参见例如，Short Protocols inMolecular Biology,(2002)第5版，第11章，Ausubel FM等人编，John Wiley and Sons,NewYork，其以引用的方式整体并入本文中)。
单克隆抗体可以使用本领域中已知的众多种技术制备，包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术，或其组合。举例来说，可使用杂交瘤技术，包括本领域中已知且例如于以下中教示的技术产生单克隆抗体：Harlow E和Lane D,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling GJ等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier,N.Y.,1981)，其各自以引用的方式整体并入本文中。如本文所使用，术语“单克隆抗体”不局限于经由杂交瘤技术产生的抗体。举例来说，可由外源性表达本文所述抗体或其片段，例如此抗体的轻链和/或重链的宿主细胞重组产生单克隆抗体。
在具体实施方案中，如本文所使用，“单克隆抗体”是由单一细胞(例如产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中如例如通过ELISA或本领域中已知或本文提供的实施例中的其它抗原结合或竞争性结合检定所测定，所述抗体特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)。在特定实施方案中，单克隆抗体可以为嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如二价)抗体。在特定实施方案中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。本文所述的单克隆抗体可例如通过如Kohler G和Milstein C(1975)Nature 256:495(其以引用的方式整体并入本文中)中所描述的杂交瘤方法制备，或者可以例如使用如例如本文所述的技术从噬菌体文库中分离得到。其它用于制备克隆细胞系和由其表达的单克隆抗体的方法是本领域中熟知的(参见例如，ShortProtocols in Molecular Biology,(2002)第5版，第11章，Ausubel FM等人，同上文)。
使用杂交瘤技术产生并筛选特定抗体的方法是本领域中常用且熟知的。举例来说，在杂交瘤方法中，对小鼠或其它适当的宿主动物，诸如绵羊、山羊、兔、大鼠、仓鼠或猕猴进行免疫接种以引发淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合于用于免疫接种的蛋白质(例如LAG-3(例如人类LAG-3))的抗体。或者，可以在体外免疫接种淋巴细胞。接着，使用适合融合剂，诸如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding JW(编),Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986)，其以引用的方式整体并入本文中)。另外，还可使用多部位重复免疫(RIMMS)技术对动物进行免疫接种(Kilpatrick KE等人(1997)Hybridoma16:381-9，其以引用的方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，可以用抗原(例如LAG-3(例如人类LAG-3))对小鼠(或其它动物，诸如大鼠、猴、驴、猪、绵羊、仓鼠或犬)进行免疫接种且在检测到免疫反应后，例如在小鼠血清中检测到抗原特异性抗体，收集小鼠脾脏并分离出脾细胞。接着，通过熟知技术将脾细胞与任何适合的骨髓瘤细胞，例如来自由美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，)(Manassas,VA)获得的细胞系SP20的细胞融合以形成杂交瘤。通过限制性稀释选择杂交瘤并克隆。在某些实施方案中，收集经免疫接种小鼠的淋巴结并与NS0骨髓瘤细胞融合。
将由此制备的杂交瘤细胞接种于适合培养基中并使其生长，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。举例来说，如果亲本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质防止HGPRT缺陷型细胞生长。
特定实施方案采用高效融合，支持所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体且对诸如HAT培养基的培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些骨髓瘤细胞系中有鼠类骨髓瘤细胞系，诸如NS0细胞系或来源于从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute CellDistribution Center)(San Diego,CA,USA)得到的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，以及从美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD,USA)得到的SP-2或X63-Ag8.653细胞。另外已描述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类杂合骨髓瘤细胞系(KozborD(1984)J Immunol 133:3001-5；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)，其各自以引用的方式整体并入本文中)。
检定生长杂交瘤细胞的培养基中针对LAG-3(例如人类LAG-3)的单克隆抗体的产生。通过本领域中已知的方法，例如免疫沉淀法或通过体外结合检定，诸如放射免疫检定(RIA)或酶联免疫吸附剂检定(ELISA)测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
在鉴别出产生具有所需特异性、亲和力和/或亲合力的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过限制性稀释程序亚克隆所述克隆并通过标准方法使其生长(Goding JW(编),Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，同上文)。适合此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在哺乳动物中以腹水肿瘤形式体内生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体宜通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如蛋白质A-琼脂糖色谱法、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、亲和色谱法从培养基、腹水或血清中分离。
本文所述的抗体包括特异性识别LAG-3(例如人类LAG-3)的抗体片段且可通过本领域技术人员已知的任何技术产生。举例来说，可通过使用酶，诸如木瓜蛋白酶(用以产生Fab片段)或胃蛋白酶(用以产生F(ab')2片段)蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生本文所述的Fab和F(ab')2片段。Fab片段对应于抗体分子的两个相同臂之一，且含有与重链VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab')2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原结合臂。
另外，还可使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生本文所述的抗体。在噬菌体展示方法中，将功能性抗体结构域显示于携带编码所述结构域的多核苷酸的噬菌体粒子的表面上。具体来说，由动物cDNA文库(例如受影响组织的人类或鼠类cDNA文库)扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA用scFv接头重组在一起并克隆至噬菌粒载体中。将所述载体通过电穿孔置入大肠杆菌中且用辅助噬菌体感染大肠杆菌。用于这些方法中的噬菌体典型地是丝状噬菌体，包括fd和M13，且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可用抗原，例如使用标记的抗原或者结合至或捕捉至固体表面或珠粒的抗原选择或鉴别表达结合至特定抗原的抗原结合结构域的噬菌体。可用于制备本文所述的抗体的噬菌体展示方法的实例包括以下中所公开的方法：Brinkman U等人(1995)J Immunol Methods 182:41-50；Ames RS等人(1995)J Immunol Methods 184:177-186；Kettleborough CA等人(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic L等人(1997)Gene 187:9-18；Burton DR和Barbas CF(1994)Advan Immunol 57:191-280；PCT申请第PCT/GB91/001134号；国际公开第WO 90/02809号、第WO 91/10737号、第WO 92/01047号、第WO 92/18619号、第WO 93/1 1236号、第WO 95/15982号、第WO 95/20401号和第WO 97/13844号；以及美国专利第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号和第5,969,108号，其全部以引用的方式整体并入本文中。
如以上参考文献中所描述，在噬菌体选择之后，可以从噬菌体中分离出抗体编码区并用于产生完整抗体，包括人类抗体，或任何其它所需的抗原结合片段，且在任何所需宿主，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中表达，例如，如下文所描述。还可使用本领域中已知的方法，诸如PCT公开第WO 92/22324号；Mullinax RL等人(1992)BioTechniques 12(6):864-9；Sawai H等人(1995)Am J Reprod Immunol 34:26-34；和Better M等人(1988)Science 240:1041-1043(其全部以引用的方式整体并入本文中)所述的方法，采用重组产生抗体片段(诸如Fab、Fab'和F(ab')2片段)的技术。
在某些实施方案中，为了产生完整抗体，可使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和用以保护所述限制性位点的侧接序列的PCR引物扩增来自模板(例如scFv克隆)的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆至表达VH恒定区的载体中，且可以将PCR扩增的VL结构域克隆至表达VL恒定区(例如人类κ或λ恒定区)的载体中。还可将VH和VL结构域克隆至一个表达所需恒定区的载体中。接着，使用本领域技术人员已知的技术，将重链转化载体和轻链转化载体共转染至细胞系中以产生稳定的或暂存的表达全长抗体(例如IgG)的细胞系。
嵌合抗体是抗体的不同部分来源于不同免疫球蛋白分子的一种分子。举例来说，嵌合抗体可以含有小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区与人类抗体恒定区的融合物。用于产生嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如，Morrison SL(1985)Science 229:1202-7；Oi VT和Morrison SL(1986)BioTechniques 4:214-221；Gillies SD等人(1989)J ImmunolMethods 125:191-202；以及美国专利第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号和第6,331,415号，其全部以引用的方式整体并入本文中。
人源化抗体能够结合至预定抗原且包含具有大体上人类免疫球蛋白氨基酸序列的框架区和具有大体上非人类免疫球蛋白(例如鼠类免疫球蛋白)氨基酸序列的CDR。在特定实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地为人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。所述抗体还可包括重链的CH1、铰链区、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可选自任何免疫球蛋白类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以使用本领域中已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(欧洲专利第EP 239400号；国际公开第WO91/09967号；以及美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)、镶饰或表面重塑(欧洲专利第EP 592106号和第EP519596号；Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5):489-498；Studnicka GM等人(1994)ProtEngineering 7(6):805-814；和Roguska MA等人(1994)PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利第5,565,332号)，以及例如美国专利第6,407,213号、美国专利第5,766,886号、国际公开第WO 93/17105号；Tan P等人(2002)J Immunol169:1119-25；Caldas C等人(2000)Protein Eng.13(5):353-60；Morea V等人(2000)Methods 20(3):267-79；Baca M等人(1997)J Biol Chem 272(16):10678-84；Roguska MA等人(1996)Protein Eng 9(10):895904；Couto JR等人(1995)Cancer Res.55(23增刊):5973s-5977s；Couto JR等人(1995)Cancer Res55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2):409-10和Pedersen JT等人(1994)J Mol Biol 235(3):959-73中所公开的技术，其全部以引用的方式整体并入本文中。另参见美国申请公开第US 2005/0042664 A1号(2005年2月24日)，其以引用的方式整体并入本文中。
用于制备多特异性抗体(例如双特异性抗体)的方法已有描述，参见例如美国专利第7,951,917号、第7,183,076号、第8,227,577号、第5,837,242号、第5,989,830号、第5,869,620号、第6,132,992号和第8,586,713号，其全部以引用的方式整体并入本文中。
单结构域抗体，例如缺少轻链的抗体，可通过本领域中熟知的方法制备。参见Riechmann L和Muyldermans S(1999)J Immunol 231:25-38；Nuttall SD等人(2000)CurrPharm Biotechnol 1(3):253-263；Muyldermans S,(2001)J Biotechnol 74(4):277-302；美国专利第6,005,079号；以及国际公开第WO94/04678号、第WO 94/25591号和第WO 01/44301号，其全部以引用的方式整体并入本文中。
另外，特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)抗原的抗体又可使用本领域技术人员熟知的技术，而用于产生“模拟”抗原的抗独特型抗体。参见例如，Greenspan NS和Bona CA(1989)FASEB J 7(5):437-444；和Nissinoff A(1991)J Immunol 147(8):2429-2438，其各自以引用的方式整体并入本文中。
在特定实施方案中，与本文所述的抗LAG-3(例如人类LAG-3)抗体结合至相同LAG-3(例如人类LAG-3)表位的本文所述的抗体是人类抗体。在特定实施方案中，竞争性阻断(例如以剂量依赖性方式)本文所述抗体中的任一种结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的本文所述的抗体是人类抗体。人类抗体可使用本领域中已知的任何方法产生。举例来说，可使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但能表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠。具体来说，可随机地或通过在小鼠胚胎干细胞中同源重组引入人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合物。替代地，除人类重链和轻链基因外，还可将人类可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞中。可利用同源重组，通过引入人类免疫球蛋白基因座使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别地或同时无功能。具体来说，JH区的纯合性缺失防止产生内源性抗体。使经修饰胚胎干细胞扩增且显微注射至胚泡中以产生嵌合小鼠。接着繁殖嵌合小鼠以产生表达人类抗体的纯合后代。用所选抗原，例如抗原(例如LAG-3(例如人类LAG-3))的全部或一部分，以标准方式对转基因小鼠进行免疫接种。可使用常规杂交瘤技术，由免疫转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所携带的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这样的技术，可产生在治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关此用于产生人类抗体的技术的综述，参见Lonberg N和HuszarD(1995)Int Rev Immunol 13:65-93，其以引用的方式整体并入本文中。有关此用于产生人类抗体和人类单克隆抗体的技术以及用于产生此类抗体的实验方案的详细论述，参见例如，国际公开第WO 98/24893号、第WO 96/34096号和第WO 96/33735号；以及美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号和第5,939,598号；其全部以引用的方式整体并入本文中。能够产生人类抗体的小鼠的实例包括XenomouseTM(Abgenix,Inc.；美国专利第6,075,181号和第6,150,184号)、HuAb-MouseTM(Mederex,Inc./Gen Pharm；美国专利第5,545,806号和第5,569,825号)、Trans Chromo MouseTM(Kirin)以及KM MouseTM(Medarex/Kirin)，其全部以引用的方式整体并入本文中。
特异性结合至LAG-3(例如人类LAG-3)的人类抗体可通过本领域中已知的多种方法制备，包括以上所描述的使用衍生自人类免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。另参见美国专利第4,444,887号、第4,716,111号和第5,885,793号；以及国际公开第WO 98/46645号、第WO 98/50433号、第WO 98/24893号、第WO 98/16654号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号和第WO 91/10741号，其全部以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，可使用小鼠-人类杂交瘤产生人类抗体。举例来说，可将用爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化的人类外周血淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合以产生分泌人类单克隆抗体的小鼠-人类杂交瘤，且可对这些小鼠-人类杂交瘤进行筛选以确定分泌特异性结合至目标抗原(例如LAG-3(例如人类LAG-3))的人类单克隆抗体的杂交瘤。此类方法是已知的且在本领域中有描述，参见例如Shinmoto H等人(2004)Cytotechnology 46:19-23；Naganawa Y等人(2005)Human Antibodies 14:27-31，其各自以引用的方式整体并入本文中。
6.6药盒
还提供包含一种或多种本文所述的抗体，或其药物组合物或缀合物的药盒。在一个具体实施方案中，本文提供一种药物包装或药盒，其包含一个或多个填充有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，诸如一种或多种本文所提供的抗体的容器。在一些实施方案中，所述药盒含有本文所述的药物组合物，和任何预防剂或治疗剂，诸如本文所述的预防剂或治疗剂。在某些实施方案中，所述药盒可含有T细胞促分裂原，诸如植物凝集素(PHA)和/或佛波醇棕榈酸酯乙酸酯(PMA)，或TCR复合物刺激抗体，诸如抗CD3抗体和抗CD28抗体。任选地此类容器可附带为管理药物或生物产品制造、使用或销售的政府机构规定形式的说明书，此说明书反映了由机构批准制造、使用或销售用于人类施用。
还提供可用于以上方法中的药盒。在一个实施方案中，药盒在一个或多个容器中包含本文所述抗体，优选为纯化的抗体。在一个具体实施方案中，本文所述的药盒含有实质上分离的LAG-3(例如人类LAG-3)抗原作为对照物。在另一个具体实施方案中，本文所述的药盒还包含不与LAG-3(例如人类LAG-3)抗原反应的对照抗体。在另一个具体实施方案中，本文所述的药盒含有一种或多种用于检测抗体与LAG-3(例如人类LAG-3)抗原的结合的要件(例如，所述抗体可与可检测底物，诸如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物缀合，或者识别第一抗体的第二抗体可与可检测底物缀合)。在具体实施方案中，本文所提供的药盒可包括重组产生或化学合成的LAG-3(例如人类LAG-3)抗原。药盒中所提供的LAG-3(例如人类LAG-3)抗原还可附接至固体支撑物。在一个更具体的实施方案中，上述药盒的检测构件包括附接有LAG-3(例如人类LAG-3)抗原的固体支撑物。这样的药盒还可包括未附接的报告基因标记的抗人类抗体或抗小鼠/大鼠抗体。在此实施方案中，可通过所述报告基因标记的抗体的结合来检测抗体与LAG-3(例如人类LAG-3)抗原的结合。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药盒在体外检定和/或检测生物样品中的LAG-3(例如人类LAG-3)抗原中的用途。
7.实施例
本节(即第6节)中的实施例是以说明方式而非以限制方式提供。
7.1实施例1：新颖抗人类LAG-3抗体的产生和表征
本实施例描述结合至人类淋巴细胞活化基因3(LAG-3)(又称CD223)的抗体的产生和表征。具体来说，本实施例描述特异性结合至人类LAG-3并抑制人类LAG-3功能的鼠类抗体的产生。
7.1.1抗LAG-3抗体的产生
通过产生和选择经免疫Fab噬菌体展示文库来鉴别抗LAG-3抗体。首先，由来自预先用重组人类LAG-3-Fc蛋白(R&D Systems，目录号2319-L3-050)和重组食蟹猕猴LAG-3-Fc蛋白(Evitria，客户定制)免疫接种的三只独立小鼠的脾细胞的单细胞悬浮液纯化出总RNA。接着对每只小鼠使用总RNA作为模板通过随机引发的cDNA扩增来自小鼠抗体基因的可变区来产生Fab文库。将重链和κ链扩增子组合并克隆至噬菌粒载体中。针对重组LAG-3蛋白(人类LAG-3-Fc、人类LAG-3-6His和/或30个氨基酸的人类LAG-3肽)和/或表达食蟹猕猴LAG-3的细胞进行三轮选择以鉴别LAG-3特异性Fab噬菌体克隆。所述30个氨基酸的人类LAG-3肽是包含氨基酸序列GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY(SEQ ID NO:199)的生物素化肽。接着通过ELISA或流式细胞术筛选所选Fab克隆的周质提取物。接着对抗LAG-3Fab进行抗体测序和解离速率分析。
鉴别出一组结合至人类LAG-3的鼠类抗体且命名为P01A12、P01C09、P05E01、P05E03、P13A04、P13A06、P13B01、P13B02、P13B03、P13B11、P13C06、P13C08、P13C10、P13D04、P13D05、P13E02、P13F01、P13F02、P13F06、P13F09、P13G01、P13G04、P13G05、P13H05、P14A04、P14B07、P14C04、P14F01、P14F06、P14G01、P14G03、P15B06、P15C02、P15E06、P15F06、P15G05、P16D04和P16H05。这些抗体的可变区的序列信息概述于表6中。
7.1.2抗LAG-3Fab与表达LAG-3的细胞的结合
使用流式细胞术测试来自周质提取物的抗LAG-3Fab与表达LAG-3的细胞的结合。简单来说，将野生型和表达人类LAG-3的Jurkat细胞于样品缓冲液(PBS(Gibco，目录号10010-015)+0.5％FBS(Gibco，目录号10270-106))中以2×105个细胞/孔涂铺于U形底96孔盘(Sarstedt)中。在室温下将22μl抗LAG-3Fab周质提取物和83μl经稀释的抗c-myc抗体(Gentaur，克隆编号9E10，目录号04-cmyc-9E10)孵育30分钟。将100μl周质提取物/抗c-myc混合物添加至细胞中且接着在冰上孵育一小时。洗涤细胞三次且接着在冰上将其与山羊抗小鼠APC(BD Biosciences，目录号550826)一起孵育30分钟。洗涤细胞三次且接着用FACS机器(BD Accuri6)进行分析。
如图1A-1C中所示，所有所测试抗LAG-3Fab均展现结合至表达人类LAG-3的Jurkat细胞。P05E01的结合程度明显较低可能是由于周质提取物中Fab浓度较低。P05E01的结合在稍后的实验中予以确定(数据未显示)。
7.1.3抗LAG-3Fab或抗体的配体阻断活性
测试抗LAG-3Fab阻断重组人类LAG-3与表达II类MHC的细胞的结合的能力。将10μg/ml的LAG-3-6His(Acro Biosystems，目录号LA3-H5222)与6μg/ml的抗His生物素(Genscript，克隆编号A00186，目录号A00613)在4℃下预孵育10分钟。接着将此混合物与10000ng/ml抗LAG-3Fab(图2A)或抗LAG-3Fab的连续稀释液(21170、7056.6、2352.2、784.0、261.3、87.1、29.0或9.7ng/ml)(图2B)或对LAG-3不具特异性的阴性对照Fab一起在4℃下孵育60分钟且接着与50,000个Raji细胞一起在4℃下再孵育60分钟。将培养物用样品缓冲液(PBS+2％FBS+0.09％叠氮化钠)洗涤两次且接着与链霉亲和素-PE(Biolegend，目录号405204)一起在样品缓冲液中在4℃下孵育30分钟。洗涤细胞两次且接着用FACS Fortessa细胞计数器(Becton Dickinson)进行分析。
如图2A和图2B中所示，所有所测试抗LAG-3Fab均阻断交联重组LAG-3-6His与II类MHC阳性Raji细胞的结合。
将所选Fab的可变区克隆至人类重链(Ch1、Ch2和Ch3)和轻链(CL)恒定区中并表达为全长IgG1嵌合抗体形式且在与上文所述类似的配体阻断检定中以各种浓度(96360、48180、24090、12045、6022、3011、1505、753、376、188或94ng/ml)进行测试。
所测试全长嵌合抗LAG-3抗体均阻断重组LAG-3与表达II类MHC的Raji细胞之间的相互作用(图3)。
7.1.4抗LAG-3抗体对葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激后的人类PBMC的影响
使用用葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的原代人类外周血单核细胞(PBMC)测试嵌合抗LAG-3抗体P13B02的功能活性。简单来说，将冷藏的人类PBMC(Research BloodComponents)于补充有NormocinTM(Invivogen，目录号ant-nr-1)和10％热灭活FBS(ThermoFisher Scientific，目录号26140079)的RPMI1640中以105个细胞/孔涂铺于96孔NUNCLONδ表面盘(NUNCTM)中。在37℃、5％CO2和97％湿度下将细胞与100ng/ml SEA(ToxinTechnologies，目录号at101red)和10μg/ml P13B02或同种型对照抗体一起培养5天。收集澄清的上清液且在-80℃下储存直至分析。使用AlphaLISA(Perkin Elmer，目录号AL221C)测定IL-2水平。
如图4中所示，抗LAG-3抗体P13B02增加用SEA超抗原刺激的人类PBMC中IL-2的产生。
7.2实施例2：人源化抗人类LAG-3抗体的产生和表征
本实施例描述鼠类抗体P13B02的人源化和所述人源化抗体的表征。
7.2.1鼠类抗体P13B02的人源化
使用同源匹配选择人类受体框架区以移植鼠类抗体P13B02的CDR。可使用数据库，例如来自人类和小鼠免疫球蛋白基因座的生殖细胞系可变基因的数据库(IMGT数据库(international ImMunoGeneTics information Lefranc MP等人(1999)Nucleic Acids Res 27(1):209-12；Ruiz M等人(2000)Nucleic Acids Res 28(1):219-21；Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res 29(1):207-9；Lefranc MP(2003)NucleicAcids Res 31(1):307-10；Lefranc MP等人(2005)Dev Compo Immunol 29(3):185-203；Kaas Q等人(2007)Briefings in Functional Genomics&Proteomics 6(4):253-64)或VBASE2(Retter I等人(2005)Nucleic Acids Res 33,Database issue D671-D674)或Kabat数据库(Johnson G等人(2000)Nucleic Acids Res 28:214-218))或出版物(例如Kabat EA等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国健康和人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242)(其全部以引用的方式整体并入本文中)鉴别鼠类重链可变区和轻链可变区所属人类亚家族且确定最佳拟合的人类生殖细胞系框架以用作受体分子。可基于序列同源性和/或CDR1区和CDR2区的结构匹配在这些亚家族内选择重链可变区和轻链可变区序列用作受体以帮助在移植后保持六个CDR的适当相对呈现。
使用BioEdit序列比对编辑器(Hall,T.A.1999.BioEdit:a user-friendlybiological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucl.Acids.Symp.Ser.41:95-98，其以引用的方式整体并入本文中)搜索从IMGT.org下载的IMGT数据库指示P13B02重链可变区框架与人类重链可变区亚组IGHV1的成员之间具有良好同源性。对以下生殖细胞系序列观察到CDR和框架序列的最高同源性和同一性：IGHV1-46*01(SEQ ID NO:153)(62％同一性；98个氨基酸残基中的61个)；IGHV1-69-2*01(SEQ IDNO:154)(63％同一性；62/98)；IGHV1-3*01(SEQ ID NO:155)(64％同一性；63/98)；IGHV1-24*01(SEQ ID NO:156)(61％同一性；60/98)；IGHV1-2*01(SEQ ID NO:157)(60％同一性；59/98)；IGHV1-45*01(SEQ ID NO:158)(59％同一性；58/98)；和IGHV1-18*01(SEQ ID NO:159)(60％同一性；59/98)。
使用相同方法，P13B02轻链可变区序列显示与人类轻链可变区κ亚组IGKV3和IGKV1的成员的良好同源性。对于以下生殖细胞系序列观察到CDR和框架序列的最高同源性和同一性：IGKV3-20*01(SEQ ID NO:160)(59％同一性；96个氨基酸残基中的57个)；IGKV3D-15*01和IGKV3-15*01(SEQ ID NO:161)(58％同一性；56/96)；IGKV3D-20*01(SEQID NO:162)(59％同一性；57/96)；IGKV3D-7*01(SEQ ID NO:163)(58％同一性；56/96)；IGKV1-9*01(SEQ ID NO:164)(63％同一性；61/96)；以及IGKV3-11*01(SEQ ID NO:165)(60％同一性；58/96)。
作为人源化过程的起点，使用人类IGHV1-46*01(SEQ ID NO:153)的框架区1、2和3以及人类IGHJ1*01(SEQ ID NO:200)的框架区4作为人类框架受体来产生小鼠P13B02VH的CDR移植形式。在可能影响CDR构型或可变区间堆积且因此可能在结构上对于维持抗体(H0-H4；分别为SEQ ID NO:56-60和220)的完整活性重要的位置处进行多次回复突变(图5A)。类似地，使用人类IGKV3-20*01(SEQ ID NO:160)的框架区1、2和3以及人类IGKJ1*01(SEQ IDNO:201)的框架4作为人类框架受体来产生小鼠P13B02VL的CDR移植形式(L0；SEQ ID NO:73)(图5B)。在各位置处产生回复突变(L1-L4；分别为SEQ ID NO:74-77)(图5B)。人源化VHH0-H4和人源化VL L0-L4的序列提供于表1中。表10显示小鼠抗体框架区与人类抗体框架区之间不同且在至少一个上述人源化VH或VL中经历回复突变的位置。表11显示小鼠抗体框架区与人类抗体框架区之间不同且在H1_R98K_L4M中经历回复突变的位置。
表10.在至少一个人源化VH或VL中框架回复突变的汇总。
表11.在H1_R98K_L4M中框架回复突变的汇总。
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此外，P13B02的HCDR3含有“RYD”基序，其先前已被证实为模拟整合素结合基序“RGD”。为了测试是否能移除“RYD”基序而不影响与LAG-3的结合，在重链中引入氨基酸取代R98K或D100E(根据Kabat定义编号)。
基于以上描述设计一组37种人源化抗体，命名为P13B02-01至P13B02-37且以全长IgG1抗体形式产生。产生三种形式的P13B02-30：含有IgG1 G1m17同种异型的全长抗体，称为P13B02-30(IgG1)；含有IgG1 G1m17同种异型和N297A突变的全长抗体，称为P13B02-30(IgG1G1m17 N297A)；和含有IgG1 G1m3同种异型和N297A突变的全长抗体，称为P13B02-30(IgG1G1m3 N297A)。P13B02-01至P13B02-37的可变区的序列信息概述于表7中。在生产细胞中检查两批P13B02-30(IgG1 G1m3 N297A)的翻译后加工。这37种人源化抗体在表面等离子共振分析中全部保持与重组人类LAG-3的结合(数据未显示)。
7.2.2人源化抗LAG-3抗体与人类LAG-3的结合
使用流式细胞术测试抗LAG-3抗体与原代人类T细胞的结合。在37℃、5％CO2和97％湿度下在100ng/ml SEA(Toxin Technologies，目录号at101red)存在下，将冷藏的人类PBMC(Research Blood Components)于补充有NormocinTM(Invivogen，目录号ant-nr-1)和10％热灭活FBS(Thermo Fisher Scientific，目录号26140079)的RPMI1640中以106个细胞/ml涂铺于T-75烧瓶(Corning)中，保持5天。接着将培养的PBMC以105个细胞/孔涂铺于U形底96孔盘(Nunc)中。在冰上将细胞与10μg/ml抗LAG-3抗体一起培养30分钟。洗涤细胞三次且接着将其与抗CD4-PE/Cy7(Biolegend，克隆编号OKT4，目录号317414)、抗CD8-FITC(Biolegend，克隆编号RPA-T8，目录号301060)、抗CD3-APC(BD Biosciences，克隆编号SP34-2，目录号557597)、固定化近红外死细胞染色剂(Fixable Near-IRDead Cell Stain)(Life Technologies，目录号L10119)、Fc阻断剂(Fc block)(BDBiosciences，目录号422302)和山羊抗人类IgG-PE(ThermoFisher，目录号PA1-74408)一起孵育。将细胞在冰上孵育细胞30分钟，洗涤并用FACS机器(BD Canto)进行分析。如图6A中所示，嵌合抗体P13B02和所有所测试人源化抗体均展现与经SEA超抗原刺激的原代CD4+人类T细胞的结合。
接下来，使用与上文所述类似的SEA超抗原活化人类PBMC，并与连续稀释(50000、15000、4500、1350、407、122、37或11ng/ml)的P13B02-16或同种型对照抗体一起孵育。用FACS Fortessa细胞计数器(Becton Dickinson)分析结合。人源化抗体P13B02-16以剂量依赖性方式结合至活化的原代人类CD4+T细胞(图6B)。
7.2.3人源化抗LAG-3抗体的配体阻断活性
接下来，如上文所述检查人源化抗LAG-3抗体阻断交联重组LAG-3-6His与表达II类MHC的Raji细胞之间的相互作用的能力。测试57820、28910、14455、7228、3613、1807、903、452、226、113和56ng/ml的人源化抗体P13B02-06、P13B02-07、P13B02-16、P13B02-26和P13B02-27，所述抗体均包括人类IgG1恒定区(图7A)。测试96360、48180、24090、12045、6022、3011、1505、753、376、188和94ng/ml的人源化抗体P13B02-30(IgG1 G1m17N297A)(图7B)。
如图7A和图7B中所示，所有所测试人源化抗体均有效地阻断LAG-3与II类MHC阳性Raji细胞的结合。
7.2.4人源化抗LAG-3抗体对葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激后的人类PBMC的影响
使用用葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的原代人类PBMC评估人源化抗体P13B02-30(IgG1)的功能活性。将冷藏的人类PBMC(Research Blood Components)于补充有NormocinTM(Invivogen，目录号ant-nr-1)和10％热灭活FBS(Thermo Fisher Scientific，目录号26140079)的RPMI1640中以105个细胞/孔涂铺于96孔NUNCLONδ表面盘(NUNCTM)中。在37℃、5％CO2和97％湿度下，将细胞与100ng/ml SEA(Toxin Technologies，目录号at101red)和10μg/ml P13B02-30(IgG1)或同种型对照抗体一起培养5天。收集澄清的上清液且在-80℃下储存直至分析。使用AlphaLISA(Perkin Elmer，目录号AL221C)测定IL-2水平。
如图8A中所示，抗LAG-3抗体P13B02-30(IgG1)增强经SEA超抗原刺激的人类PBMC中IL-2的产生。
在类似实验中，在37℃、5％CO2和97％湿度下，在存在或不存在5μg/ml抗PD-1抗体派姆单抗(Pembro)(Myoderm)、抗PD-1抗体纳武单抗(Nivo)(Myoderm)、三种不同的抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体伊匹单抗(Ipi)(Myoderm)情况下，将冷藏的人类PBMC与100ng/ml SEA(Toxin Technologies，目录号at101red)和10μg/ml P13B02-16(IgG1)或同种型对照抗体一起培养5天。收集澄清的上清液且在-80℃下储存直至分析。使用AlphaLISA(PerkinElmer，目录号AL221C)测定IL-2水平。基于美国申请公开第US2014/0341917号(其以引用的方式整体并入本文中)中所提供的抗体A09-246-2的可变区序列产生抗PD-L1抗体#1。基于美国专利第8,779,108号(其以引用的方式整体并入本文中)中所提供的抗体2.14H9OPT的可变区序列产生抗PD-L1抗体#2。基于美国专利第8,217,149号(其以引用的方式整体并入本文中)中所提供的序列产生抗PD-L1抗体#3。这三种抗PD-L1抗体的序列于表12中列出。
表12.抗PD-L1抗体的序列
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如图8B中所示，在SEA超抗原存在下，单独的P13B02-16(IgG1)或其与抗PD-1抗体派姆单抗或纳武单抗、抗PD-L1抗体#1、#2或#3，或抗CTLA-4抗体伊匹单抗的组合增强人类PBMC中IL-2的产生。
7.2.5人源化抗LAG-3抗体对肿瘤浸润性淋巴细胞的细胞因子产生的影响
进一步评估单独的抗LAG-3抗体P13B02-30(IgG1 G1m3 N297A)或其与抗PD-1抗体的组合刺激活化的原代肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的细胞因子产生的能力。经由机械显微切割分离出新鲜肾细胞癌(RCC)(I期)或结肠直肠癌(CRC)(II期)肿瘤(UMass MedicalSchool,Worcester,MA)的单细胞悬浮液。在一些情况下，取决于纤维化水平，需要酶消化(释放酶和DNA酶I，Roche)。将细胞于补充有NormocinTM(Invivogen，目录号ant-nr-1)、重组人类IL-2(20U/ml，R&D Systems，目录号202-IL-010)和10％热灭活FBS(Thermo FisherScientific，目录号26140079)的RPMI1640中以5×104个细胞/孔在96孔NUNCLONδ表面盘(NUNCTM，目录号143761)中静置1天。次日，对样品离心且添加含有20μg/ml所关注抗体P13B02-30(IgG1 G1m3 N297A)和5μg/ml抗PD-1抗体派姆单抗(Pembro)(Myoderm)以及抗CD3/CD28微珠(1:1珠粒:细胞比率)，最终体积为100μl，并使之在37℃和5％CO2下孵育3天。收集无细胞上清液且在-80℃下储存直至分析。使用AlphaLISA(Perkin Elmer，目录号AL208C)测定TNFα水平。
如图9A和图9B中所示，抗LAG-3抗体P13B02-30(IgG1 G1m3 N297A)增强来自RCC或CRC肿瘤的活化的原代TIL中TNFα的产生。
7.2.6在LAG-3介导的细胞抑制检定中抗LAG-3抗体增强T细胞活化
在本实施例中，使用NFAT-荧光素酶报告基因细胞系在细胞抑制检定中评估抗LAG-3抗体P13B02-30(IgG1 G1m3 N297A)对LAG-3的抑制作用。如下所述，进行两个实验。
在所述两个实验中的每一个中，将Jurkat-NFAT-LAG-3细胞悬浮于检定培养基(RPMI+10％热灭活FBS+1％Pen/Strep)中达到1×106个细胞/mL的2.5×工作浓度。将Raji细胞悬浮于检定培养基中达到1×106个细胞/mL的3.33×工作浓度。在检定培养基中制备0.04ng/mL的10×工作浓度的葡萄球菌肠毒素E(Toxin Technology)。在检定培养基中制备抗LAG-3抗体或同种型抗体的连续稀释液。在第一个实验中，抗体浓度在0.2-50μg/mL范围内。在第二个实验中，抗体浓度在0.1-100μg/mL范围内。在制备抗体的连续稀释液之后，在37℃和5％CO2下，在U形底96孔盘中将40μL Jurkat-NFAT-LAG-3细胞与20μL抗体溶液一起预孵育30分钟。将30μL Raji细胞和10μL葡萄球菌肠毒素E添加至96孔盘中并孵育5-6小时。接着将100μL Bio-Glo荧光素酶(Promega)添加至各孔中并在10-15分钟后使用EnVision读板仪记录发光度。
如图10A和图10B中所示，相对于同种型对照抗体，抗LAG-3抗体以剂量依赖性方式使NFAT-荧光素酶报告基因信号明显增加。
7.3实施例3：抗LAG-3抗体的表位定位
在本实施例中，如下所述表征抗LAG-3抗体P13B02-30的表位。
7.3.1使用氢-氘交换(HDX)质谱法进行抗LAG-3抗体的表位定位
使用FragIT试剂盒(Genovis，目录号A2-FR2-100)由P13B02-30(IgG4S228P)产生抗LAG-3F(ab')2。使用氢-氘交换(HDX)质谱法研究抗LAG-3F(ab')2与人类LAG-3的相互作用。
对于胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化，在125μl控制缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH 7.4)中的7.9μg重组his标记的人类LAG-3(Sino Biological，目录号16498-H08H)通过添加125μl的4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(最终pH 2.5)并在20℃下将所述混合物孵育5分钟进行变性。接着，使用室内填充的胃蛋白酶/蛋白酶XIII(w/w，1:1)柱使所述混合物经历柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化，并使用包括与Q ExactiveTM复合四极杆-轨道阱质谱仪(Thermo)联用的Waters Acquity UPLC的UPLC-MS系统分析所得肽。在50mm×1mm C8柱上用2-30％溶剂B(含0.2％甲酸的乙腈)的19分钟梯度分离所述肽。通过利用Mascot针对人类LAG-3序列搜索MS/MS数据来进行肽鉴别。前体和产物的质量容差分别为10ppm和0.05Da。
在20℃下将20μl人类LAG-3(7.9μg)或20μl人类LAG-3/F(ab')2混合物(7.9μg:15.8μg)与105μl氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pD 7.4)一起孵育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒和14400秒。通过添加125μl的4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(最终pH 2.5)淬灭氢/氘交换。随后，如上文所述对淬灭样品进行柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化和LC-MS分析。以仅MS模式记录质谱。使用分析H/D交换MS数据的软件HDX WorkBench处理原始MS数据(J.Am.Soc.Mass Spectrom.2012,23(9),1512-1521，其以引用的方式整体并入本文中)。使用氘化肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差来计算氘化水平。
对于人类LAG-3所达到的序列覆盖率为96.6％。尽管大多数人类LAG-3肽在具有和不具有抗LAG-3F(ab')2的情况下展示相同或类似的氘化水平，但发现若干肽区段在结合F(ab')2后具有明显降低的氘并入量。在由氨基酸序列SEQ ID NO:215(SPTIPLQDLSL)组成的区域观察到氘摄取量的大大降低。残基是根据SEQ ID NO:166编号。
本发明的范围不受本文所描述的具体实施方案限制。事实上，本领域技术人员从前述说明将明了除所描述的修改外的本发明的各种修改。此类修改意图在所附权利要求的范围内。
本文中引用的所有参考文献(例如出版物或者专利或专利申请)均均以引用的方式整体并入本文中且用于所有目的，其引用程度如同具体地且个别地指示每一个别参考文献(例如出版物或者专利或专利申请)以引用的方式整体并入本文中用于所有目的一般。
其它实施方案在以下权利要求书之内。

Claims (60)

1.一种特异性结合至人类LAG-3的分离的抗体，所述抗体包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别由SEQ ID NO:78、83、94、100、104和105；78、85、95、100、104和105；78、86、96、100、104和105；78、86、96、100、104和109；78、86、96、100、104和110；78、86、96、101、104和108；78、86、96、103、104和111；78、86、97、102、104和112；78、91、94、100、104和107；78、92、96、100、104和105；78、92、96、100、104和109；79、84、95、100、104和105；79、84、95、100、104和106；79、84、95、102、104和105；79、88、95、100、104和105；79、89、95、100、104和105；79、90、95、100、104和105；79、90、98、100、104和105；79、90、99、100、104和105；80、85、96、100、104和105；81、87、96、100、104和105；81、87、96、100、104和107；或82、93、95、100、104和105中陈述的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别由SEQ ID NO:79、90、98、100、104和105中陈述的氨基酸序列组成。
3.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:151、222、218或223。
4.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含与选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
5.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含与选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
6.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含与选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
7.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含与选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
8.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含与选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
9.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含与选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列具有至少100％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
10.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:56-72和220组成的组的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的分离的抗体，其中所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:65。
12.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:152或224。
13.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
14.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
15.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列具有至少85％一性的氨基酸序列。
16.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
18.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列具有至少100％同一性的氨基酸序列。
19.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:73-77和221组成的组的氨基酸序列。
20.如权利要求19所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:73。
21.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含SEQ ID NO:56和73；56和74；56和75；56和76；56和77；57和73；57和74；57和75；57和76；57和77；58和73；58和74；58和75；58和76；58和77；59和73；59和74；59和75；59和76；59和77；60和73；60和74；60和75；60和76；60和77；61和77；62和77；63和73；64和73；65和73；220和73；65和221；220和221；66和73；67和73；68和73；69和73；70和73；71和73；或72和73中所陈述的氨基酸序列。
22.如权利要求10所述的分离的抗体，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含SEQ ID NO:65和73中所陈述的氨基酸序列。
23.如权利要求1所述的分离的抗体，所述抗体包括包含选自SEQ ID NO:168-186和225-227的氨基酸序列的重链以及包含选自SEQ ID NO:187-191和228的氨基酸序列的轻链。
24.如权利要求23所述的分离的抗体，所述抗体包括重链以及轻链，其中所述重链和所述轻链分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:168和187；168和188；168和189；168和190；168和191；168和228；169和187；169和188；169和189；169和190；169和191；169和228；170和187；170和188；170和189；170和190；170和191；170和228；176和187；176和188；176和189；176和190；176和191；176和228；178和187；178和188；178和189；178和190；178和191；178和228；179和187；179和188；179和189；179和190；179和191；179和228；180和187；180和188；180和189；180和190；180和191；180和228；181和187；181和188；181和189；181和190；181和191；181和228；182和187；182和188；182和189；182和190；182和191；182和228；183和187；183和188；183和189；183和190；183和191；183和228；184和187；184和188；184和189；184和190；184和191；184和228；185和187；185和188；185和189；185和190；185和191；185和228；186和187；186和188；186和189；186和190；186和191；186和228；225和187；225和188；225和189；225和190；225和191；225和228；226和187；226和188；226和189；226和190；226和191；226和228；227和187；227和188；227和189；227和190；227和191；或227和228。
25.如权利要求24所述的分离的抗体，其中所述重链和所述轻链分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:169和187。
26.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含选自由人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2组成的组的重链恒定区。
27.如权利要求26所述的分离的抗体，其中所述重链恒定区是IgG1。
28.如权利要求27所述的分离的抗体，其中IgG1的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的N297A突变。
29.如权利要求28所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:194的重链恒定区。
30.如权利要求27所述的分离的抗体，其中IgG1的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的N297Q突变。
31.如权利要求27所述的分离的抗体，其中所述IgG1是无岩藻糖基化的IgG1。
32.如权利要求26所述的分离的抗体，其中所述重链恒定区是IgG4。
33.如权利要求32所述的分离的抗体，其中IgG4的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的S228P突变。
34.如权利要求33所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:196的重链恒定区。
35.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含选自由人类κ和人类λ组成的组的轻链恒定区。
36.如权利要求35所述的分离的抗体，其中所述轻链恒定区是人类κ。
37.如权利要求36所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:198或219的轻链恒定区。
38.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体与细胞毒性剂、细胞抑制剂、毒素、放射性核素或可检测标记的缀合物。
39.一种药物组合物，其包含如权利要求1至37中任一项所述的抗体和药学上可接受的载剂或赋形剂。
40.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码：
(a)如权利要求1至37中任一项所述的抗体的重链可变区和轻链可变区；
(b)如权利要求1至37中任一项所述的抗体的重链和轻链；
(c)选自SEQ ID NO:56-72和220的重链可变区的氨基酸序列，和选自SEQ ID NO:73-77和221的轻链可变区的氨基酸序列；或
(d)选自SEQ ID NO:168-186和225-227的重链的氨基酸序列，和选自SEQ ID NO:187-191和228的轻链的氨基酸序列。
41.一种载体，其包含如权利要求40所述的多核苷酸。
42.一种重组宿主细胞，其包含：
(a)如权利要求40所述的多核苷酸；
(b)如权利要求41所述的载体；
(c)编码如权利要求1-37中任一项所述的抗体的重链可变区或重链的第一多核苷酸和编码如权利要求1至37中任一项所述的抗体的轻链可变区或轻链的第二多核苷酸；或
(d)包含编码如权利要求1至37中任一项所述的抗体的重链可变区或重链的第一多核苷酸的第一载体和包含编码如权利要求1至37中任一项所述的抗体的轻链可变区或轻链的第二多核苷酸的第二载体，
其中所述重组宿主细胞不是植物细胞。
43.一种产生结合至人类LAG-3的抗体的方法，所述方法包括培养如权利要求42所述的宿主细胞，从而表达所述多核苷酸且产生所述抗体。
44.如权利要求1至39中任一项所述的抗体或药物组合物在制备在受试者中响应于抗原来增加T细胞活化的药物中的用途。
45.如权利要求1至39中任一项所述的抗体或药物组合物在制备治疗受试者的癌症的药物中的用途。
46.如权利要求44或45所述的用途，其中所述抗体或药物组合物被配制成为是经皮下或静脉内施用。
47.如权利要求44或45所述的用途，其中所述抗体或药物组合物被配制成为是瘤内施用。
48.如权利要求44或权利要求45所述的用途，所述药物另外包含额外治疗剂。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述额外治疗剂是化学治疗剂、放射治疗剂或检查点靶向剂。
50.如权利要求49所述的用途，其中所述检查点靶向剂选自由以下组成的组：拮抗剂抗PD-1抗体、拮抗剂抗PD-L1抗体、拮抗剂抗PD-L2抗体、拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗剂抗TIM-3抗体、拮抗剂抗LAG-3抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、激动剂抗GITR抗体和激动剂抗OX40抗体。
51.如权利要求48所述的用途，其中所述额外治疗剂是抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体是派姆单抗或纳武单抗。
52.如权利要求48所述的用途，其中所述额外治疗剂是抗PD-L1抗体。
53.如权利要求48所述的用途，其中所述额外治疗剂是抗CTLA-4抗体。
54.如权利要求48所述的用途，其中所述额外治疗剂是吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂。
55.如权利要求54所述的用途，其中所述抑制剂选自由以下组成的组：艾卡哚司他、BMS-986205、吲哚莫德和NLG919。
56.如权利要求55所述的用途，其中所述抑制剂是艾卡哚司他。
57.如权利要求48所述的用途，其中所述额外治疗剂是疫苗。
58.如权利要求57所述的用途，其中所述疫苗包含热休克蛋白肽复合物(HSPPC)，所述HSPPC包含热休克蛋白与抗原肽的复合物。
59.如权利要求58所述的用途，其中所述热休克蛋白是hsc70且与肿瘤相关抗原肽形成复合物。
60.如权利要求58所述的用途，其中所述热休克蛋白是gp96且与肿瘤相关抗原肽形成复合物，其中所述HSPPC来源于从受试者获得的肿瘤。
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