CN114617961B - 一种抗lag-3单克隆抗体的注射制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗LAG‑3单克隆抗体的注射制剂，其包括蛋白含量为10‑80mg/ml的抗LAG‑3单克隆抗体，还包括：5‑100mM的缓冲盐、0‑100mM的等渗调节剂、3‑10％w/v的蛋白保护剂、0.01‑0.05％w/v的非离子型表面活性剂，该注射制剂的pH值为5.0‑6.0。本发明中的抗体分子能够特异性结合LAG‑3，亲和力较高，且具有很好的生物学活性，能够用于治疗多种癌症或者免疫疾病；制剂中多种成分协同配合，为抗体提供了良好的存储环境，不仅能够保证抗体药物结构的稳定性，而且能有效降低制剂中抗体的聚集物的生成速率，保证了生物药物的疗效。

Description

一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂。
背景技术
随着免疫抗癌疗法的兴起，LAG-3逐渐被认为是一个颇有潜力的免疫检查点受体，据报道，LAG-3在促进调节性T细胞活性和下调T细胞活化和增殖中起重要作用(Workman CJ等人，J.Immunol.2005；174:688-695)，LAG-3为淋巴细胞活化基因-3，又称为CD223，其是一种表达在活化CD4+和CD8+T细胞以及NK和树突细胞亚群的细胞表面上的I型跨膜蛋白。LAG-3与CD4密切相关，与CD4分子在染色体上的定位和结构相似；CD4是一种辅助性T细胞活化的辅助受体。这两种分子都具有4个细胞外Ig样结构域，并且它们发挥功能活性都需要与它们的配体—II类主要组织相容性复合体(MHCII)结合。但与CD4相反，LAG-3仅表达于活化T细胞的细胞表面上，它从细胞表面分离可使LAG-3信号转导终止。LAG-3还可以可溶性蛋白的形式出现，但其不结合II类MHC，且其功能未知。
LAG-3在不同细胞中表达，例如T细胞、B细胞、NK细胞、浆细胞样DC等，在激活的T细胞中高表达，此外，LAG-3在CD4+效应T细胞上的异位表达可降低它们的增殖能力，并赋予它们针对第三方T细胞的调节潜能(Huang CT等人，Immunity.2004；21:503-513)。最近的研究表明，LAG-3在耗竭的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)特异性CD8+T细胞上的高表达，可促成它们的无反应状态，并限制CD8+T细胞抗肿瘤应答。事实上，在2个鼠模型中，LAG-3通过直接作用于CD8+T细胞可以维持对自身和肿瘤抗原的耐受(Grosso JF等人，J.Clin.Invest.2007；117:3383-3392)。总之，抑制LAG-3能够让T细胞重新获得细胞毒性，从而增强对肿瘤的杀伤效果，同时抑制LAG-3还能够降低调节T细胞抑制免疫反应的功能。因此，LAG-3被认为是一个比其它免疫检查点蛋白更吸引人的靶点。
众所周知，生物大分子具有复杂的结构如一级、二级、三级等高级结构，而蛋白质的结构特别是高级结构非常脆弱，容易发生构想变化，如变性、聚集和沉淀等，抗LAG-3单克隆抗体与所有单克隆抗体一样均具有不稳定性，会经历多种化学和物理降解。保持蛋白的高级结构是发挥它们生物学活性的最基本要求，这些降解及聚集的产物会对生物制药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡，此外，单抗类药物不仅仅需要在生产的时候能得到高纯度的产品，还要在运输、储存和使用过程中保持结构稳定，所以在研发抗LAG-3单抗药物的同时需要对其制剂进行条件摸索，从而研发一种更加适应抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂。
发明内容
为了解决现有技术中抗LAG-3单克隆抗体与现有的单抗相比均存在不稳定性，为此，为了保证其在运输、存储和使用过程中的稳定性，需要摸索专门针对抗LAG-3单抗所需要的制剂条件，为此，本发明公开了一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，所述注射制剂包括蛋白含量为10-80mg/ml的抗LAG-3单克隆抗体，所述注射制剂还包括以下含量的成分：
Figure GDA0003799374930000031
其中，所述注射制剂的pH值为5.0-6.0。
本发明提供的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂通过添加缓冲盐、等渗调节剂、蛋白保护剂和非离子型表面活性剂为抗LAG-3单克隆抗体提供了良好、适宜的存储环境，各成分之间协同配合，有效避免制剂在存储或运输过程中抗LAG-3单克隆抗体变性、聚集和沉淀，提高了抗体的物理稳定性，降低了抗体存放和运输过程中的安全性风险，有效保证了抗体的长期稳定性。
进一步的，所述抗LAG-3单克隆抗体的蛋白含量为10-40mg/ml；所述抗LAG-3单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个重链互补决定区，3个所述重链互补决定区分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，所述轻链可变区包括3个轻链互补决定区，3个所述轻链互补决定区分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，所述抗LAG-3单克隆抗体选自以下任意一种：
A-1:所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；
A-2：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列；
A-3：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:14所示的氨基酸序列；
A-4：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列。
本发明制剂中提供的上述抗LAG-3单克隆抗体能够与LAG-3特异性结合，结合活性更好，阻断LAG-3则可以逆转LAG-3对T细胞的抑制作用，增强T细胞活性，并减少调节性T细胞数量，还可以提高T细胞免疫应答的敏感度，从而用于治疗免疫或癌症疾病。
进一步的，所述抗LAG-3单克隆抗体为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括鼠源抗体可变区和人源抗体恒定区，所述鼠源抗体可变区选自以下任意一种：
MA-1：所述重链可变区包含如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列；
MA-2：所述重链可变区包含如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:23所示的氨基酸序列；
MA-3：所述重链可变区包含如SEQ ID No:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:25所示的氨基酸序列；
MA-4：所述重链可变区包含如SEQ ID No:26所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:27所示的氨基酸序列；
优选的，所述鼠源抗体可变区为MA-1。
进一步的，所述人源抗体恒定区包括人源抗体重链恒定区和人源抗体轻链恒定区，所述人源抗体重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型中的一种，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:39所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:40所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示；所述人源抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:42所示的人的Ck链；
优选的，所述人源抗体重链恒定区为人的IgG4型。
嵌合抗体分子包括鼠源抗体分子的可变区序列和人抗体恒定区，嵌合抗体分子的设计用于验证本发明人源化后没有改变CDR的功能，为人源化抗体分子的研究提供了进一步的研发基础。
进一步的，所述抗LAG-3单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
HA-1：所述重链可变区包含如SEQ ID No:33所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列；
HA-2：所述重链可变区包含如SEQ ID No:33所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:35所示的氨基酸序列；
HA-3：所述重链可变区包含如SEQ ID No:36所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:35所示的氨基酸序列；
HA-4：所述重链可变区包含如SEQ ID No:36所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列；
HA-5：所述重链可变区包含如SEQ ID No:37所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:38所示的氨基酸序列；
优选的，所述人源化抗体分子为HA-1。
本发明通过人源化筛选得到了人源化抗体分子，通过体内外的实验验证发现本发明中提供的5种人源化抗体分子中，HA-1的活性较高，药效最为显著，为此本发明优选HA-1。
进一步的，所述人源化抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型中的一种，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQID No:39所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:40所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示，所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:42所示的人的Ck链；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG4型。
进一步的，所述缓冲盐包括L-组氨酸盐酸盐、乙酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种组合；
优选的，所述缓冲盐为乙酸钠，所述缓冲盐的含量为10-20mM。
进一步的，所述蛋白保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘氨酸、山梨醇中的一种或多种组合；
所述等渗调节剂为氯化钠。
进一步的，当所述蛋白保护剂为3％w/v的山梨醇时，所述渗透压调节剂为50mM的氯化钠。
进一步的，所述非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆中的一种或多种组合；
优选的，所述非离子型表面活性剂为泊洛沙姆；
优选的，所述非离子型表面活性剂的含量为0.01-0.02％w/v。
本发明的有益效果如下：首先，本发明提供的注射制剂中抗LAG-3单克隆抗体能够特异性结合LAG-3，亲和力较高，且具有很好的生物学活性，能够用于治疗多种癌症或者免疫疾病，癌症包括但不限于白血病、肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌或膀胱癌，免疫疾病包括但不限于银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎；其次，本发明制剂中通过添加缓冲盐、等渗调节剂、蛋白保护剂和非离子型表面活性剂的协同配合，为抗LAG-3单克隆抗体提供了良好的存储环境，在贮存和运输过程中，不仅能够保证抗体药物结构的稳定性，而且能有效降低制剂中抗体聚集物的生成速率，保证了生物药物的疗效，此外，本发明提供的注射制剂的制备成本低廉，工艺简单，无需特殊设备和苛刻条件，易于规模化生产。
附图说明
图1为本发明实施例3中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例4中梯度稀释ELISA抗LAG-3噬菌体单克隆抗体相对亲和力的比较图；
图3为本发明实施例6中载体pTSE的图谱；
图4为本发明实施例6中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例7中鼠源抗体与LAG-3的结合能力比较图；
图6为本发明实施例8中鼠源抗体在混合淋巴细胞反应中对细胞因子IL-2分泌情况图；
图7为本发明实施例13中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图8为本发明实施例14中人源化抗体分子与LAG-3的结合能力比较图；
图9为本发明实施例15中混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗LAG-3人源化抗体分子活性；
图10为本发明实施例16中抗LAG-3单克隆抗体对小鼠体内MC38结直肠癌的抑制试验效果图；
图11为本发明实施例17中抗LAG-3单克隆抗体HA-1蛋白分子热稳定性评价图。
具体实施方式
为了更加容易理解本发明，描述实施例之前，先对本发明某些技术和科学术语作以下说明：
本文所使用的术语“LAG-3”是指淋巴细胞活化因子3，这里的LAG-3包括但不限于活化的T细胞、NK细胞和B细胞表面上的二聚物表达的LAG-3(例如本领域公知的CD223)和人血清中发现的LAG-3的可溶形式，在本文中均称为LAG-3。
本文所使用的术语“抗体”，包含全抗体及其任一抗原结合片段，抗体包括鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体，抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突变、缺失、置换等)的抗体。
本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”，即为抗体重链和轻链靠近N段的序列区为可变区(V区)，靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)，可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR)，每条轻链可变区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成，重链的3个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。
本文所使用的术语“鼠源抗体分子”，其来源是用LAG-3抗原免疫注射小鼠后得到的抗体。
本文所使用的术语“嵌合抗体分子”，是将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源抗体在人体内诱发的免疫应答反应。嵌合抗体是利用DNA重组技术，将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，这样表达的抗体分子中轻重链的可变区是鼠源的，而恒定区是人源的，整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了鼠源抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
本文所使用的术语“人源化抗体分子”，其是将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，注射制剂包括蛋白含量为10-80mg/ml的抗LAG-3单克隆抗体，注射制剂还包括以下含量的成分：
Figure GDA0003799374930000091
其中，注射制剂的pH值为5.0-6.0。
本发明进一步限定了缓冲盐包括L-组氨酸盐酸盐、乙酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种组合；
本发明进一步的限定了蛋白保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘氨酸、山梨醇中的一种或多种组合；
本发明进一步的还限定了等渗调节剂为氯化钠。
进一步的，非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆中的一种或多种组合。
实施例2
本发明在实施例1的基础上进一步的限定了，抗LAG-3单克隆抗体的蛋白含量为10-40mg/ml；抗LAG-3单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括3个重链互补决定区，3个重链互补决定区分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链可变区包括3个轻链互补决定区，3个轻链互补决定区分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，抗LAG-3单克隆抗体选自以下任意一种。
Figure GDA0003799374930000101
实施例3鼠源抗体分子筛选
本发明实施例3在实施例2的基础上进一步限定了抗LAG-3单克隆抗体为鼠源抗体分子，本发明通过用LAG-3抗原免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库，具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下：
步骤一：LAG-3抗原免疫小鼠
1、实验动物：
种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；
体重：18-20g；
实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、免疫过程：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人LAG-3(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二：噬菌体抗体库的构建
取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion,货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库(VH)及轻链可变区基因库(VL)，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，PscFv-DisB-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三：以LAG-3为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1M、pH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六：LAG-3噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃条件下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。4000rpm，4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，最终筛选得到四个亲和力较高的抗LAG-3的鼠源抗体分子，分别命名为MA-1，MA-2，MA-3和MA-4，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列，经过测序，上述筛选到的4个单克隆抗体序列如下：
Figure GDA0003799374930000111
Figure GDA0003799374930000121
具体的，SEQ ID No:21(MA-1和MA-2的重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGKIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCARDTTVGLDYWGQGTTLTVSS；
SEQ ID No:22(MA-1的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVITQSTAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASPKLWIYYTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPHTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:23(MA-2的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQTPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPSMTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:24(MA-3的重链可变区的氨基酸序列)：
EVKLEESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFPGTGNTRYNEKFKGKATLTADTSSSTVYMQLSGLTSEDSAVYFCARIGGRLTGDAMDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:25(MA-3的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSTASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPWTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:26(MA-4的重链可变区的氨基酸序列)：
QVKLEESGPGLVQPSQSLSITCTVSAFSLTTYAVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNTAFISRLNITKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCARLDGTFFDYWGQGTTLTVSS；
SEQ ID No:27(MA-4的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQTPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPPTFGGGTKLEIK。
实施例4梯度稀释ELISA比较抗LAG-3噬菌体单克隆抗体的亲和力
本发明实施例4将实施例3中获得的4个鼠源抗体分子(MA-1，MA-2，MA-3和MA-4)的可变区进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，对照抗体选择专利CN105992595A中的中提供的抗LAG-3的单克隆抗体，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAG-3，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例2中筛选得到的4个噬菌体单克隆抗体分别用PBST三倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 MA-1 MA-2 MA-3 MA-4 对照抗体
EC50 0.010 0.058 0.024 0.117 0.115
通过上述数据及如图2所示，实施例3筛选出的4不同的鼠源抗体分子均能够与LAG-3进行结合，本发明提供的单克隆抗体与LAG-3均具有较高的亲和力。
实施例5
本发明实施例5在实施例3基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区为鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型、IgG3型中的一种，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:29所示，IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:30所示，IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示；轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:28所示的鼠源Ck链；具体序列如下：
SEQ ID No:28(鼠源Ck链的轻链恒定区序列)：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；
SEQ ID No:29(鼠的IgG1型的重链恒定区序列)：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG；
SEQ ID No:30(鼠的IgG2a型的重链恒定区序列)：
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK；
SEQ ID No:31(鼠的IgG2b型的重链恒定区序列)：
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK；
SEQ ID No:32(鼠的IgG3型的重链恒定区序列)：
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA。
实施例6抗LAG-3鼠源抗体分子的制备
本发明实施例6在实施例5的基础上优选的限定了鼠源抗体分子的重链恒定区为鼠的IgG1型，IgG1型包含如SEQ ID No:29所示的氨基酸序列；轻链恒定区为鼠源Ck链，鼠源Ck链包含如SEQ ID No:28所示的氨基酸序列。抗体制备方法具体如下：
1、在将实施例3筛选出来的4个单克隆抗体的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，优选的重链恒定区为鼠的IgG1型恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:29所示)，轻链恒定区为鼠源Ck链(氨基酸序列如SEQID No:28所示)，pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
2、瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图4所示，从左侧到右侧依次为非还原MA-1，MA-2，MA-3和MA-4和蛋白质分子量Marker1、Marker2及还原MA-1，MA-2，MA-3和MA-4鼠源抗LAG-3单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例7鼠源抗体与LAG-3的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAG-3，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的MA-1，MA-2，MA-3和MA-4鼠源抗体，4种抗体的起始最高浓度均是5μg/ml，分别经过3倍稀释后每个抗体均做12个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:10000稀释的Anti-Mouse Fc-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，然后用2M H2SO4终止显色。在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 MA-1 MA-2 MA-3 MA-4
EC50(ng/ml) 10.08 25.99 255.9 22.12
通过上述数据及如图5所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体均能与LAG-3进行结合，此外，这4个鼠源抗体分子中MA-1的EC50值最低，说明其与LAG-3结合能力最好，亲和力最高。
实施例8鼠源抗体在混合淋巴细胞反应中对细胞因子IL-2分泌量的影响
按密度梯度离心法分离新鲜外周血PBMC，磁珠分选CD14+T细胞；用20ng/mL GM-CSF与10ng/mL IL-4的培养基培养CD14+T细胞，每2天换液，7-10天诱导成为树突状DC细胞。在DC使用前两天，加入25ng/mL的TNF-α诱导DC为成熟的DC细胞，收集成熟的DC细胞，配制成细胞密度为1x105个/mL细胞悬液。从新鲜外周血PBMC中磁珠分选出CD4+T细胞，计数，制成细胞密度为1x106个/mL细胞悬液。将CD4+T细胞与DC细胞各取100ul，按比例10：1加入96孔板。
将实施例6中制备的MA-2，MA-1，MA-3和MA-4鼠源抗体分别进行4倍梯度稀释，每个抗体均设置6个梯度，各取50ul加入到96孔板中，培养5天后检测IL-2的浓度，在450nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 MA-1 MA-2 MA-3 MA-4
EC50(ug/ml) 0.024 0.030 0.076 0.121
通过上述数据及如图6所示，本发明筛选出来的4个鼠源抗体分子均具有较好的活性，此外，通过上述数据还可以得出，本发明筛选出的4个单克隆抗体中MA-1的EC50值最低，所以其活性最好，为此，本发明可以针对鼠源抗体分子MA-1进行人源化处理。
实施例9
本发明实施例9进一步的限定了抗LAG-3单克隆抗体为嵌合抗体分子，嵌合抗体分子包括实施例3中鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区；人源抗体恒定区包括人源抗体重链恒定区和人源抗体轻链恒定区，人源抗体重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型中的一种，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:39所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:40所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示；人源抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:42所示的人的Ck链。
SEQ ID No:39(人的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:40(人的IgG2型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:41(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
SEQ ID No:42(人的Ck链的轻链恒定区氨基酸序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
实施例10嵌合抗体分子的制备
本发明实施例10在实施例9的基础上进一步限定了嵌合抗体分子的重链恒定区为人的IgG4型，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示；嵌合抗体的轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:42所示的人的Ck链。
具体的制备方法
将实施例3中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-1的重链可变区VH(SEQID No:21)和轻链可变区VL(SEQ ID No:22)保持鼠源序列不变，分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人的IgG4型(氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示)，轻链恒定区为人的Ck链(氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示)。瞬时转染HEK293E细胞(购买自：中国医学科学院基础医学研究所，货号为：GNHu43)，进行抗体表达，得到嵌合抗体CA-1。
实施例11鼠源抗体分子MA-1进行人源化
首先使用实施例3中鼠源抗体分子MA-1的序列和人抗体种系数据库(v-base)比较，寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列，然后将鼠源抗体分子MA-1的CDR的序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体轻、重链可变区分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，然后再连接到瞬时表达载体上，对人源化得到的轻重链组合分析，得到如下人源化抗体分子：HA-1，HA-2，HA-3，HA-4，HA-5，上述筛选到的5个单克隆抗体序列如下：
单克隆抗体 重链可变区 轻链可变区
HA-1 SEQ ID No:33 SEQ ID No:34
HA-2 SEQ ID No:33 SEQ ID No:35
HA-3 SEQ ID No:36 SEQ ID No:35
HA-4 SEQ ID No:36 SEQ ID No:34
HA-5 SEQ ID No:37 SEQ ID No:38
具体的，SEQ ID No:33(HA-1和HA-2的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDTYMHWVRQAPGQGLEWIGKIDPANGNTKYDPKFQGRATITADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTTVGLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:34(HA-1和HA-4的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVITQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVNYMYWYQQKPDASPKLWIYYTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLEAEDAATYYCQQWSSNPHTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:35(HA-2和HA-3的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVITQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVNYMYWYQQKPDQAPKLLIYYTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLEAEDAATYYCQQWSSNPHTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:36(HA-3和HA-4的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNITDTYMHWVRQAPGQGLEWIGKIDPANGNTKYDPKFQGRATITADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTTVGLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:37(HA-5的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNIKDTYMHWVKQAPGQGLEWIGKIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTTVGLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:38(HA-5的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVITQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVNYMYWYQQKPDASPKLWIYYTSKLASGVPARFSGSGSGTSYTFTISSLEAEDAATYYCQQWSSNPHTFGGGTKVEIK。
实施例12
本发明实施例12在实施例11的基础上进一步的限定了人源化抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型中的一种，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:39所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:40所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示，轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:42所示的人的Ck链。
实施例13人源化抗体分子的制备
本发明实施例13在实施例12的基础上进一步的限定了人源化抗体分子的重链恒定区为人的IgG4型，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示；轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:42所示的人的Ck链。
将上述实施例11人源化得到的5个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人的IgG4型(氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示)，轻链恒定区为Ck链(氨基酸序列如SEQ IDNO:42所示)。
将嵌合抗体CA-1和人源化抗体瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图7所示，从左侧到右侧依次为非还原蛋白质分子量Marker1、HA-1，HA-2，HA-3，HA-4，HA-5、实施例10中制备的嵌合抗体CA-1及核心专利CN105992595A提供的抗LAG-3单克隆抗体和还原蛋白质分子量Marker2，HA-1，HA-2，HA-3，HA-4，HA-5、嵌合抗体CA-1及核心专利CN105992595A提供的抗LAG-3单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例14人源化抗体分子与LAG-3结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAG-3，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBS在37℃温度条件下封闭2h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-1，HA-2，HA-3，HA-4，HA-5和实施例10中制备的嵌合抗体CA-1及专利CN105992595A中的抗LAG-3抗体，7个抗体的起始最高浓度均是5μg/ml，分别经过5倍稀释后每个抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBS1:10000稀释的Anti-Human Fc-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，然后用2M H2SO4终止显色。在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 HA-1 HA-2 HA-3 HA-4 HA-5 嵌合抗体CA-1 CN105992595A
EC50(ng/ml) 46.25 150.7 102.5 538.8 350.3 52.16 747.2
通过上述数据及实验结果如图8所示，5个不同的人源化抗体分子均能与LAG-3进行结合，本发明提供的5个不同的人源化抗体的EC50值均明显低于专利CN105992595A中的抗LAG-3抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与LAG-3的结合能力强，亲和力高。此外，从图8及上述数据中还可以得出，5个不同的单克隆抗体中HA-1的EC50值最低，说明其与LAG-3结合能力最好，亲和力最高，同时HA-1的EC50值与嵌合抗体CA-1相似，说明人源化后的HA-1保留了鼠源亲本抗体MA-1与LAG-3的高亲和力，亲和力没有下降。
实施例15混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗LAG-3人源化抗体分子活性
按密度梯度离心法分离新鲜外周血PBMC，磁珠分选CD14+T细胞；用20ng/ml GM-CSF与10ng/ml IL-4的培养基培养CD14+T细胞，每两天换液，7-10天诱导成为树突状DC细胞。在DC细胞使用前两天，加入25ng/ml的TNF-α诱导DC为成熟的DC细胞，收集成熟的DC细胞，配制成细胞密度为1×105个/ml细胞悬液。从新鲜PMBC中磁珠分选出CD14+T细胞，计数，制成细胞密度为1×106个/ml细胞悬液。将CD14+T细胞与DC细胞各取100μl，按比例10:1加入96孔板。
将实施例13制备的5个抗LAG-3人源化抗体分子、实施例10制备的嵌合抗体CA-1及专利CN105992595A提供的抗LAG-3抗体作为阳性对照，分别进行4倍梯度稀释，每个抗体均设置8个梯度，各取50μl加入到96孔板中，5天后，CCK8测试CD14+T细胞增殖，在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 HA-1 HA-2 HA-3 HA-4 HA-5 嵌合抗体CA-1 CN105992595A
EC50(ng/ml) 6.875 27.09 15.01 33.8 31.84 7.226 39.59
通过上述数据及如图9所示，本发明筛选出的5个不同的抗LAG-3抗体的EC50值均明显低于专利CN105992595A中提供的抗LAG-3的抗体，说明本发明提供的抗LAG-3抗体的活性均比较高，同时本发明筛选出的5个单克隆抗体中，抗LAG-3全抗体HA-1的EC50值最低，说明其活性最高，此外，从图9还可以看出，嵌合抗体CA-1的亲和力与抗LAG-3抗体HA-1的EC50值比较接近，说明人源化抗体HA-1保留了鼠源亲本抗体MA-1的生物活性，其生物活性没有下降。
实施例16抗LAG-3单克隆抗体HA-1对小鼠体内MC38结直肠癌的抑制试验
1、实验动物：
种属品系：Mus Musculus，NCG，小鼠；
周龄：6-8周；
实验动物提供商:江苏集萃药康生物科技有限公司。
2、细胞培养，MC38肿瘤细胞(YK-CL-256-02)(购自：普如汀生物技术(北京)有限公司(Biovector NTCC Inc.)，货号：NTCC-MC38)。用含有灭活的10％胎牛血清(ExCell Bio,货号：FND500)，100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素以及2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(购自：赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Gibco)，货号：10566-016)在37℃、5％CO2的培养箱中培养肿瘤细胞，每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。
3、肿瘤细胞的接种与分组：PBS重悬的MC38肿瘤细胞，浓度为1.0×107/ml，接种于实验动物的右侧胁肋部皮下，100μl/只，在肿瘤生长至61mm3左右时分组给药，共3组，每组8只，分别为溶媒对照组、HA-1(10mg/kg，i.p.，biw×3w)、HA-1(30mg/kg，i.p.，biw×3w)。
4、检测指标：每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次的测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径2；记录肿瘤体积的变化与给药时间的关系，实验结果如图10所示。
通过图10数据显示，抗LAG-3单克隆抗体HA-1能够抑制肿瘤的生长，且呈现剂量依赖性反应。
实施例17抗LAG-3单克隆抗体HA-1蛋白分子热稳定性评估
将抗LAG-3单克隆抗体HA-1蛋白分子超滤换液到PBS缓冲体系中，12000rpm，在4℃条件下，离心5min，使用多功能蛋白热稳定性分析系统(购买自Unchained Labs)对抗LAG-3单克隆抗体HA-1蛋白分子的热稳定性进行评估。通过监测蛋白内源性荧光随温度变化(从25℃开始，以0.3℃/min的升温速度升温至95℃)检测蛋白构象的变化，从而确定蛋白熔解温度Tm，评估蛋白构象稳定性。样品发生聚集时，会导致散射光波发生干涉，散射光信号增加，通过静态光散射测定蛋白的胶体稳定性(以Tagg进行表征)，结果参加如下表和附图11所示。
Figure GDA0003799374930000241
如上表和图11显示，抗LAG-3单克隆抗体HA-1蛋白分子的温度为66.6℃，平均Tagg为68.0℃，显示出较好的构象稳定性和胶体稳定性。
实施例18
本发明实施例18提供了一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂中优选的限定了，缓冲盐为乙酸钠，缓冲盐的含量为10-20mM。
实施例19
本发明实施例19提供了一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂中优选的限定了，当所述蛋白保护剂为3％w/v的山梨醇时，所述渗透压调节剂为50mM的氯化钠。
实施例20
本发明实施例20提供了一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂优选的限定了非离子型表面活性剂为泊洛沙姆；
进一步优选的，非离子型表面活性剂的含量为0.01-0.02％w/v。
实施例21稳定性实验测试
抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂的制备方法：首先通过实施例14-16中选择与LAG-3结合能力最高、活性最好的抗LAG-3单克隆抗体HA-1作为药效蛋白分子备用，通过超滤管将纯化后的抗LAG-3单克隆抗体换液至不同pH值的缓冲盐溶液体系中，并将浓缩后的样品稀释至10mg/ml，样品用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至2ml西林瓶中，装量为1.1ml/瓶。将西林瓶放置在40℃条件下进行加速稳定性试验，在规定的时间分别取出样品进行分析检测。
分析检测方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法检测(SEC-HPLC)；电荷异构体检测，采用阳离子交换色谱法检测(CEX-HPLC)。
(1)不同缓冲盐对制剂稳定性影响
通过上述方法配置成不同成分含量的15种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂作为对照例样品，不同实验例和对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
实验例 抗体分子 缓冲盐 等渗调节剂 蛋白保护剂 非离子型表面活性剂 pH值
1 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM的L-组氨酸盐酸盐 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 4.8
2 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM的L-组氨酸盐酸盐 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
3 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM的L-组氨酸盐酸盐 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 O.02％w/v聚山梨醇酯20 5.5
4 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM的L-组氨酸盐酸盐 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 6.0
5 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM的L-组氨酸盐酸盐 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 6.1
6 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 4.8
7 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
8 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.5
9 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 6.0
10 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 6.1
11 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM柠檬酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 4.8
12 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM柠檬酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
13 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM柠檬酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.5
14 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM柠檬酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 6.0
15 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM柠檬酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 6.1
对照例1 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM的磷酸钠 30mM氯化钠 5％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.5
将上述表中的实验例样品和对照例样品同时在40℃条件下放置，分别于第1周、第2周和第4周取出通过SEC-HPLC方法分析检测蛋白总聚集水平，同时于第2周和第4周取出通过CEX-HPLC方法检测主峰含量，从而确定该蛋白稳定的最适缓冲液和最佳pH值。分析检测方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法分析；电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量。
以试验起始(0w)、放置1w、2w和4w的蛋白总聚集体及主峰含量，计算主峰下降速率(％/周)；数据汇总如下表所示。
Figure GDA0003799374930000251
Figure GDA0003799374930000261
通过上述数据得知，抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂在40℃条件下加速4周，从总聚集体及电荷异构体主峰含量下降速率考察，本发明提供的抗LAG-3单克隆抗体在L-组氨酸盐酸盐、乙酸钠和柠檬酸钠中相对较为稳定，与对照例1相比，本发明提供的抗LAG-3单克隆抗体适宜的pH范围为5.0－5.5，任意超出该范围，蛋白稳定性将降低，与其他实验例相比，可以发现，本发明提供的缓冲盐为乙酸钠时更为稳定，而且最适宜pH范围在5.0～5.5之间最为稳定。
(2)不同蛋白稳定剂及等渗调节剂对制剂稳定性影响
在最佳pH值和缓冲盐组成确定后，进一步对需要添加的辅料进行研究比较，从而选出可使抗LAG-3单克隆抗体最为稳定的辅料添加物。
通过实施例14-16中选择与LAG-3结合能力最高、活性最好的抗LAG-3单克隆抗体HA-1作为药效蛋白分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的15种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
实验例 抗体分子 缓冲盐 等渗调节剂 蛋白保护剂 非离子型表面活性剂 pH值
1 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 - 5％w/v甘露醇 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
2 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 - 5％w/v山梨醇 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
3 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 - 5％w/v甘氨酸 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
4 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 - 10％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
5 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 - 10％w/v海藻糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
6 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v甘露醇 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
7 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
8 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v甘氨酸 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
9 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
10 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v海藻糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
11 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 100mM氯化钠 1％w/v甘露醇 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
12 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 100mM氯化钠 1％w/v山梨醇 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
13 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 100mM氯化钠 1％w/v甘氨酸 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
14 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 100mM氯化钠 1％w/v蔗糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
15 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 100mM氯化钠 1％w/v海藻糖 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
对照例1 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 - 5％w/v精氨酸 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
将上述表中的实验例样品和对照例样品同时在40℃条件下放置，分别于第1周、第2周和第4周取出通过SEC-HPLC方法分析检测蛋白总聚集水平，同时于第2周和第4周取出通过CEX-HPLC方法检测主峰含量，从而确定该蛋白稳定的最适等渗调节剂和蛋白保护剂。分析检测方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法分析；电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量。
以试验起始(0w)、放置1w、2w和4w的蛋白总聚集体及主峰含量，计算主峰下降速率(％/周)；数据汇总如下表所示。
Figure GDA0003799374930000271
Figure GDA0003799374930000281
从上述表中数据可以看出，综合SEC-HPLC和CEX-HPLC的结果，在乙酸钠缓冲液中，且pH5.0条件下，添加不同等渗调节剂和蛋白保护剂，通过对照例1与其他实验例相比，对照例1的纯度和主峰含量下降均较快，稳定性较差，尤其实验例7，其纯度和主峰含量的变化率较小，所以本发明提供的等渗调节剂含量不同和蛋白保护剂任意更换一种将有可能导致稳定性降低，而通过实验例1-15相比，实验例7提供的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂中，蛋白保护剂为含3％(w/v)山梨醇，等渗调节剂为含有50mM的氯化钠，其在放置4周后，纯度和主峰含量下降较少，说明其稳定性较高，为此，本发明优选的，蛋白保护剂优选为3％(w/v)山梨醇，等渗调节剂优选为50mM的氯化钠。
(3)不同非离子型表面活性剂对制剂稳定性影响
在最佳pH值、缓冲盐、等渗调节剂和蛋白保护剂组成确定后，进一步对需要添加的辅料进行研究比较，从而选出可使抗LAG-3单克隆抗体最为稳定的辅料添加物。
通过实施例14-16中选择与LAG-3结合能力最高、活性最好的抗LAG-3单克隆抗体HA-1作为药效蛋白分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的15种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
实验例 抗体分子 缓冲盐 等渗调节剂 蛋白保护剂 非离子型表面活性剂 pH值
1 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.008％w/v聚山梨醇酯20 5.0
2 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.01％w/v聚山梨醇酯20 5.0
3 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v聚山梨醇酯20 5.0
4 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.05％w/v聚山梨醇酯20 5.0
5 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.055％w/v聚山梨醇酯20 5.0
6 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.008％w/v聚山梨醇酯80 5.0
7 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.01％w/v聚山梨醇酯80 5.0
8 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v聚山梨醇酯80 5.0
9 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.05％w/v聚山梨醇酯80 5.0
10 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.055％w/v聚山梨醇酯80 5.0
11 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.008％w/v泊洛沙姆 5.0
12 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.01％w/v泊洛沙姆 5.0
13 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v泊洛沙姆 5.0
14 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.05％w/v泊洛沙姆 5.0
15 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.055％w/v泊洛沙姆 5.0
对照例1 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v聚山梨醇酯40 5.0
将上述表中的实验例样品和对照例样品同时在40℃条件下放置，分别于第1周、第2周和第4周取出通过SEC-HPLC方法分析检测蛋白总聚集水平，同时于第2周和第4周取出通过CEX-HPLC方法检测主峰含量，从而确定该蛋白稳定的最适等渗调节剂和蛋白保护剂。分析检测方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法分析；电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量。
以试验起始(0w)、放置1w、2w和4w的蛋白总聚集体及主峰含量，计算主峰下降速率(％/周)；数据汇总如下表所示。
Figure GDA0003799374930000291
Figure GDA0003799374930000301
通过上述表格数据可以看出，本发明提供的非离子型表面活性剂包含的吐温80、吐温20和泊洛沙姆均能够保证本发明提供的制剂的稳定性，通过上述实验例与对照例1相比，说明非离子型表面活性剂中任意选择其他一种将有可能导致制剂在4周后纯度和主峰含量下降，同时，实验例1-15相比，说明本发明优选的表面活性剂为泊洛沙姆时，其纯度和主峰含量在4周后下降较小，相对吐温80和吐温20较稳定，通过实施例1-17相比，说明实验例12和13中选择的表面活性剂为泊洛沙姆且含量为0.01-0.02％(w/v)时，抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂均具有很好的稳定性。非离子型表面活性剂含量太低起不到分散作用，含量太高可能产生副作用，影响制剂输注的安全性。
(4)不同抗体蛋白浓度对制剂的影响
在最佳pH值、缓冲盐、等渗调节剂、蛋白保护剂和非离子型表面活性剂组成确定后，进一步对抗LAG-3单克隆抗体的蛋白含量进行筛选。
通过实施例14-16中选择与LAG-3结合能力最高、活性最好的抗LAG-3单克隆抗体HA-1作为药效蛋白分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的15种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
实验例 抗体分子 缓冲盐 等渗调节剂 蛋白保护剂 非离子型表面活性剂 pH值
1 8mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v泊洛沙姆 5.0
2 10mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v泊洛沙姆 5.0
3 25mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v泊洛沙姆 5.0
4 40mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v泊洛沙姆 5.0
5 60mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v泊洛沙姆 5.0
6 80mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v泊洛沙姆 5.0
7 85mg/ml抗LAG-3单克隆抗体HA-1 20mM乙酸钠 50mM氯化钠 3％w/v山梨醇 0.02％w/v泊洛沙姆 5.0
将上述表中的实验例样品和对照例样品同时在40℃条件下放置，分别于第1周、第2周和第4周取出通过SEC-HPLC方法分析检测蛋白总聚集水平，同时于第2周和第4周取出通过CEX-HPLC方法检测主峰含量，从而确定该蛋白稳定的最适等渗调节剂和蛋白保护剂。分析检测方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法分析；电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量。
以试验起始(0w)、放置1w、2w和4w的蛋白总聚集体及主峰含量，计算主峰下降速率(％/周)；数据汇总如下表所示。
Figure GDA0003799374930000311
从上述表中数据可以看出，通过实验例1和7与实验例2-6相比，经过加速实验4周后，本发明提供的注射制剂中抗体分子浓度为10-80mg/ml的范围时，在纯度和电荷异构体主峰含量均有很好的稳定性。此外，通过实验例2-4与其他实验例相比，抗体分子的浓度范围为10-40mg/ml的稳定性最高，因此，本发明最优选择抗体蛋白浓度为10-40mg/ml。
通过实施例21，筛选出能够使抗LAG-3单克隆抗体结构最稳定的制剂成分和含量，通过上述制备方法制备成抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，该制剂包括蛋白含量为10-40mg/ml的抗LAG-3单克隆抗体，注射制剂还包括以下含量的成分：
Figure GDA0003799374930000312
其中，所述注射制剂的pH值为5.0-5.5。
实施例22处方验证实验
将实施例21中筛选得到的最优的辅料和药效成分制成的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂进行处方验证试验，处方验证试验包括冻融稳定性试验和振摇稳定性试验。
(1)冻融稳定性试验：
使用上述实施例21优选的制剂处方，将抗LAG-3单克隆抗体HA-1换液浓缩至10mg/ml、25mg/ml、40mg/ml、60mg/ml、80mg/ml，进行冻融稳定性试验，分别冻融1、2、3次。重点考察外观、蛋白总聚集体和电荷异构体主峰含量，结果汇总如下表所示。
Figure GDA0003799374930000321
(2)振摇稳定性试验：
将上述抗LAG-3单克隆抗体注射制剂浓缩至10mg/ml、25mg/ml、40mg/ml、60mg/ml、80mg/ml，进行振摇稳定性试验，分别进行室温水平振摇(80-120rpm)和圆周振摇(30rpm)3天。考察制剂外观、蛋白总聚集体和电荷异构体主峰含量，结果如下表所示。
Figure GDA0003799374930000331
由上述两个表格数据可以得出如下结论：从外观结果可以看出，不同浓度蛋白经过冻融试验及振摇试验均澄清透明，无可见异物，蛋白物理稳定性良好；从总聚集体结果可以看出，10-40mg/ml蛋白冻融相对较为稳定，聚集体未增加，但60mg/ml的蛋白聚集体有轻微的增长；振摇试验可以看出，10-40mg/ml较稳定，但随着浓度增加至60-80mg/ml，总聚集体产生越多；从电荷异构体主峰含量可以看出，10-40mg/ml蛋白组经过冻融试验及振摇试验均未有明显变化，60-80mg/ml蛋白经过冻融试验及振摇试验电荷异构体主峰含量略有下降趋势。
由以上实验证明，抗LAG-3单克隆抗体的蛋白浓度在10-40mg/ml，均很稳定，更优选为10-40mg/ml。经过冻融试验及振摇试验，进一步验证了抗LAG-3单克隆抗体在最终制剂处方中具有很好的稳定性。
综上所述，我们通过对不同缓冲体系、不同pH条件、不同蛋白保护剂、不同等渗调节剂、不同表面活性剂和不同抗体浓度等方面进行考察，探索研究并筛选出最适宜抗LAG-3单克隆抗体在存放、运输过程中能够保证其长期稳定性的注射制剂。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技股份有限公司
北京精益泰翔技术发展有限公司
<120> 一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Asp Thr Tyr Met His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Asp Thr Thr Val Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
Tyr Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro His Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Ser Met Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
Trp Ile Phe Pro Gly Thr Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
Ile Gly Gly Arg Leu Thr Gly Asp Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
Thr Tyr Ala Val His
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Thr Ala Phe Ile Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
Leu Asp Gly Thr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 19
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 20
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr
1 5
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 21
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Thr Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 22
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Tyr Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro His Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 23
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Ser Met
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 121
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 24
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Thr Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Gly Arg Leu Thr Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 111
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 25
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 26
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Ala Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Thr Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Asn Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Gly Thr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 27
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 28
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65 70 75 80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 29
<211> 323
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 29
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly
<210> 30
<211> 330
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 30
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 31
<211> 336
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 31
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys
85 90 95
Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
130 135 140
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
145 150 155 160
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
165 170 175
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val
180 185 190
Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
195 200 205
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
210 215 220
Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu
225 230 235 240
Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys
245 250 255
Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser
260 265 270
Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp
275 280 285
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser
290 295 300
Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly
305 310 315 320
Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 32
<211> 399
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 32
Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Lys Trp Asn Tyr Gly Ala Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val Arg Thr Val Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Leu Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys
100 105 110
Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu
165 170 175
Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln
225 230 235 240
Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe
245 250 255
Ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln
260 265 270
Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu
290 295 300
Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Asn Glu Thr Cys
325 330 335
Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr
340 345 350
Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ser Val
355 360 365
Thr Leu Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Gln Val Lys
370 375 380
Gln Thr Ala Ile Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
385 390 395
<210> 33
<211> 117
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Thr Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 106
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 34
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Tyr Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 35
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
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Tyr Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro His Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 117
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Thr Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Thr Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 38
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Tyr Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro His Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 330
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 40
<211> 326
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 41
<211> 327
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 42
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (16)

1.一种抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述注射制剂包括蛋白含量为10-80mg/ml的抗LAG-3单克隆抗体，所述注射制剂还包括以下含量的成分：
Figure FDA0003799374920000011
其中，所述注射制剂的pH值为5.0-6.0；
所述抗LAG-3单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个重链互补决定区，3个所述重链互补决定区分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，所述轻链可变区包括3个轻链互补决定区，3个所述轻链互补决定区分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
2.如权利要求1所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗LAG-3单克隆抗体的蛋白含量为10-40mg/ml。
3.如权利要求1所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗LAG-3单克隆抗体为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括鼠源抗体可变区和人源抗体恒定区，所述鼠源抗体可变区的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:21所示，所述鼠源抗体可变区的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:22所示。
4.如权利要求3所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述人源抗体恒定区包括人源抗体重链恒定区和人源抗体轻链恒定区，所述人源抗体重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型中的一种，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:39所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:40所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示；所述人源抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:42所示的人的Ck链。
5.如权利要求4所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述人源抗体重链恒定区为人的IgG4型。
6.如权利要求1所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗LAG-3单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
HA-1：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:33所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示；
HA-2：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:33所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示；
HA-3：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:36所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示；
HA-4：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:36所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示；
HA-5：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:37所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:38所示。
7.如权利要求6所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述人源化抗体分子为HA-1。
8.如权利要求6所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述人源化抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型中的一种，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:39所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:40所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:41所示，所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:42所示的人的Ck链。
9.如权利要求8所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述重链恒定区为人的IgG4型。
10.如权利要求1所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述缓冲盐包括L-组氨酸盐酸盐、乙酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种组合。
11.如权利要求10所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述缓冲盐为乙酸钠，所述缓冲盐的含量为10-20mM。
12.如权利要求1所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述蛋白保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘氨酸、山梨醇中的一种或多种组合；
所述等渗调节剂为氯化钠。
13.如权利要求12所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，当所述蛋白保护剂为3％w/v的山梨醇时，所述等渗调节剂为50mM的氯化钠。
14.如权利要求1所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆中的一种或多种组合。
15.如权利要求14所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为泊洛沙姆。
16.如权利要求14所述的抗LAG-3单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述非离子型表面活性剂的含量为0.01-0.02％w/v。
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