CN110655579B - 一种新型抗ctla-4单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种新型抗ctla-4单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体提供了一种新型抗CTLA‑4单克隆抗体，单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列选自以下序列中的一种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。本发明中单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与CTLA‑4抗原特异性结合，增强T细胞活性和增殖能力，用于治疗各种癌症疾病，开发前景广阔。

Description

一种新型抗CTLA-4单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种新型抗CTLA-4单克隆抗体及其应用。
背景技术
免疫调节在机体免疫应答过程中起着极其重要的作用，而免疫活性细胞的活化对整个免疫应答的调节极其关键。研究表明，T细胞活化和增殖依赖于双重信号途径。“协同刺激信号”的概念是1970年Bretscher和Cohn在T细胞活化双信号模型的基础上提出来的，即T细胞的活化不仅需要通过APC递呈MHC-抗原肽复合物给抗原特异性T细胞来提供第一信号外，还需要多种协同刺激分子参与提供辅助第二信号(即协同刺激信号)；随着研究的深入，协同刺激信号逐渐成为免疫学的热点领域；这些协同刺激信号分子主要包括CD28/B7和TNFR/TNF两大超家族。同源B7家族成员B7-1(也称B7、B7.1或CD80)和B7-2(也称B7.2或CD86)，两者都可以在与T细胞上CD28抗原结合时递送协同刺激信号，导致T细胞激活。CD28是免疫球蛋白(Ig)超家族的同源二聚体糖蛋白成员，其具有单个细胞外可变区，并且其存在于大多数成熟的人T细胞上。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen-4，简称为CTLA-4)又称为CD152，是CD28的同系物。CTLA-4发现于1987年，与CD28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达方面具有十分相近的关系，都是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活的T细胞表面。然而，作为淋巴细胞激活的共刺激信号，CTLA-4与CD28分子的功能是相反的，CTLA-4的作用主要是抑制T细胞激活，表现为CTLA-4在缺陷小鼠中有大规模淋巴增生组织。研究表明，CTLA-4中和抗体或外源性CTLA-4蛋白可以阻断CTLA-4与其天然配体结合，从而封闭CTLA-4对T细胞的负性调节信号并且增强T细胞对各种抗原的反应性，因此，阻断CTLA-4可以提供需要增强免疫刺激的相关人类疾病的新治疗方法，例如癌症和传染性疾病。
此外，在体外实验中，抗CTLA-4单克隆抗体可特异地解除CTLA-4抗原对机体的免疫抑制，激活T细胞，诱导IL-2产生，IL-2是调控免疫应答的重要因子，可促进B细胞增殖分化，参与抗体反应、造血和肿瘤监视。因此，抗CTLA-4单克隆抗体的研究在抗肿瘤及免疫性疾病中有广泛的应用前景，发展潜力巨大。
针对抗CTLA-4单克隆抗体的研究越来越多，但是仅百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb，BMS)研发的Ipilimumab获得了美国食品药品管理局(FDA)、欧洲药物管理局(EMA)、日本医药品与医疗器械综合机构(PMDA)等药监部门的批准并在市场上销售，商品名为Yervoy，该药物批准的适应症为黑色素瘤，同时百时美施贵宝于2000年8月24日申请了专利名称为Human CTLA-4antibodies and their uses的发明专利(CN201210037538.0)。为了满足国内市场的需求，急需研发新型且亲和力更高的抗CTLA-4单克隆抗体。
目前，全人源抗体是治疗性抗体发展的主要方向，抗体库技术的出现为全人源抗体的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。噬菌体抗体库展示技术是由Smith首先建立的一种将编码外源蛋白或多肽的基因插入噬菌体衣壳蛋白基因，使外源蛋白或多肽与噬菌体衣壳蛋白融合表达于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库利用了上述原理将不同特异性的抗体或其功能性片段(Fab、Fv、ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到特异性的高亲和力抗体。
发明内容
为了能够满足国内市场的需求，本发明利用噬菌体抗体库展示技术和高通量筛选的方法，筛选出亲和力更高，活性更好的抗CTLA-4全人源单克隆抗体。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种新型抗CTLA-4单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列选自以下序列中的一种：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
进一步的，所述单克隆抗体选自以下任意一种：
(N-1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-4)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-5)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-6)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-7)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-8)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
进一步的，所述单克隆抗体还包括重链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG1。
进一步的，所述单克隆抗体为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。所述ScFv为单链抗体(single-chain fragmentvariable)。
进一步的，所述单克隆抗体为全人源抗体。
本发明还提供了一种多肽或蛋白，所述多肽或所述蛋白包含所述的新型抗CTLA-4单克隆抗体。
本发明还提供了一种多核苷酸序列或组合，所述多核苷酸序列或组合编码所述的新型抗CTLA-4单克隆抗体的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体包含所述的多核苷酸序列或组合。
本发明还提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
所述HEK293E细胞为人胚肾293E细胞(human embryonic kidney293E cell)；CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；NS0细胞为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
本发明进一步的提供了一种药物或药物组合物，所述药物或药物组合物包含所述的新型抗CTLA-4单克隆抗体。
本发明进一步的提供了一种新型抗CTLA-4单克隆抗体在制备治疗癌症疾病药物中的应用；
优选的，所述癌症疾病包括黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌或肝癌。
本发明的有益效果如下：本发明提供的抗CTLA-4单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与CTLA-4抗原特异性结合，增强T细胞的活性，进而用于治疗癌症疾病，癌症疾病包括但不局限于下列肿瘤：黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌等，因此，本发明提供的抗体的开发前景广阔。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的抗体生物淘选方法中pScFvDisb-s的质粒图谱；
图2为本发明实施例3中梯度ELISA抗CTLA-4单链抗体相对亲和力的比较图；
图3为本发明实施例3提供的抗CTLA-4全抗体的表达质粒pTSE的图谱；
图4为本发明实施例5中抗CTLA-4单克隆抗体与CTLA-4抗原结合能力比较图；
图5为本发明实施例6中抗CTLA-4全抗体与细胞表面CTLA-4抗原的结合特异性分析图；
图6为本发明实施例7中混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗CTLA-4单克隆抗体活性比较图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种新型抗CTLA-4单克隆抗体，单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列选自以下序列中的一种：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
本发明利用全合成ScFv单链噬菌体抗体库获得特异性抗体的方法构建了一种新型抗CTLA-4单克隆抗体，这种全人源的特异性结合CTLA-4抗原的单克隆抗体是利用噬菌体抗体库技术筛选得到的，具体的抗CTLA-4单链抗体的生物淘选方法如下：
步骤一：采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库。
步骤二：以CTLA-4为抗原包被免疫管，抗原包被量为2μg/500μl/管，4℃包被过夜，将噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1M pH 2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH 7.0左右。
步骤三：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，同时计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤四：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13辅助噬菌体超感染，28℃培养过夜扩增噬菌体，PEG6000-NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。按照此方法共进行三轮噬菌体库富集筛选后备用。
步骤五：CTLA-4噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min后，在4000rpm且4℃温度条件下离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜，吸取扩增后的噬菌体上清液进行ELISA鉴定，筛选得到亲和力较高的单克隆抗体，分别命名为N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-7、N-8，将上述得到的单克隆抗体送至擎科生物科技有限公司进行基因测序确定为正确的抗体序列。
经过测序，上述筛选的8株单克隆抗体序列如下，而且本发明保护的单克隆抗体选自以下任意一种：
(N-1)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(N-2)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(N-3)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(N-4)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(N-5)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10；
(N-6)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10；
(N-7)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10；
(N-8)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10。
具体的，SEQ ID NO:1(N-1中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGYNGNWVRQAPGKGLEWVTFISYDGLNDVKADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:2(N-2中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSIFKRWVRQAPGKGLEWVTFISYDGLDHINGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:3(N-3中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGIFSSWVRQAPGKGLEWVTFISYDSLKQKDGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:4(N-4中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSAFYNPWVRQAPGKGLEWVTFISYDGVYFHFGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:5(N-5中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGFFNRWVRQAPGKGLEWVTFISYDALKDFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGPGTLVTVSS；
SEQ ID NO:6(N-6中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSNTLRWVRQAPGKGLEWVTFISYDSLFLDQGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:7(N-7中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGIYCNWVRQAPGKGLEWVTFISYDSILNVIADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:8(N-8中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGFSICWVRQAPGKGLEWVTFISYDGLLFLIADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:9(N-1～4中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSVIDSKGYTYLGWYLQKPGQSPQLLIYLGTQKSSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQRGHIPITFGQGTKLEIK；
SEQ ID NO:10(N-5～8中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTVFDSHGQTYLQWYLQKPGQSPQLLIYGASRQVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQVWHLPITFGQGTKLEIK。
进一步的，单克隆抗体还包括重链恒定区，重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；
优选的，重链恒定区为人的IgG1。
进一步的，单克隆抗体为全长抗体或抗体片段，抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
进一步的，单克隆抗体为全人源抗体。
实施例2
本发明实施例2还提供了一种多肽或蛋白，多肽或蛋白均包含新型抗CTLA-4单克隆抗体。
本发明还提供了一种多核苷酸序列或组合，多核苷酸序列或组合编码新型抗CTLA-4单克隆抗体的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含多核苷酸序列或组合。
本发明还提供了一种转染重组DNA表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
优选的，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明进一步的提供了一种药物或药物组合物，药物或药物组合物包含新型抗CTLA-4单克隆抗体。
本发明进一步的提供了一种新型抗CTLA-4单克隆抗体在制备治疗癌症疾病药物中的应用，所述癌症疾病包括黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌或肝癌。
实施例3梯度稀释噬菌体ELISA比较抗CTLA-4单克隆抗体的亲和力
将实施例1中获得的8株单克隆抗体(N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-7、N-8)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，选择上市产品Yervoy的核心专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体作为阳性对照，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被CTLA-4，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例1中筛选得到的8株单克隆抗体和专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体分别用PBST四倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，室温静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟。用2M H2SO4终止后，450nm/630nm读数。
如图2所示，筛选出的8株不同的单克隆抗体均能够与CTLA-4进行结合，而且相对专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体，本发明提供的单克隆抗体与CTLA-4结合能力更强，具有更高的亲和力。
实施例4抗CTLA-4全抗体的制备
将实施例1筛选出来的8株单克隆抗体的重链VH和轻链Vκ基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人IgG1恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:11)，轻链恒定区为κ链恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:12)，pTSE载体结构如图3所示，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段。
SEQ ID NO:11(人的IgG1的恒定区序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO：12(κ链的轻链恒定区序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得8株单克隆抗体的全抗体蛋白，同时使用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
实施例5全抗体与CTLA-4的结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被CTLA-4，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，用300μl/孔PBST洗涤三次，再加入不同稀释浓度的全抗体和专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体，所有抗体的起始最高浓度均是10μg/mL，分别经过5倍稀释后每个全抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育2-3h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用PBST 1∶5000稀释的anti-human IgG-HRP，在37℃的温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤八次，TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止。在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
NAME N-1 N-2 N-3 N-4 N-5 N-6 N-7 N-8 EP2829609A1
EC50(ng/ml) 162.7 109.6 263.6 92.24 68.86 127.4 86.53 164.4 689.0
通过上述数据及如图4所示，筛选出的8株不同的单克隆抗体的全抗体均能与CTLA-4进行结合，本发明提供的8株不同的单克隆抗体的EC50值均明显低于专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体的全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与CTLA-4结合的亲和力较高，具有较好的活性，此外，从图4还可以得出，这8株全抗体中N-5的全抗体的活性最好，而且EC50值最低，说明其与CTLA-4结合能力最好，亲和力最高，活性最好。
实施例6全抗体与细胞表面CTLA-4的结合特异性分析
本发明采用过表达CTLA-4抗原的CHO细胞来检测不同的抗CTLA-4单克隆抗体与细胞表面CTLA-4的结合情况，用人的IgG(hIgG)作为同型对照，选择上市产品Yervoy的核心专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体的全抗体作为阳性对照，具体方法如下：离心收集细胞。同时稀释各种抗体，最高浓度为20μg/mL，4倍梯度稀释。将收集的细胞用PBS+1％BSA洗三遍，再加PBS+1％BSA重悬细胞，然后铺细胞于96孔板中，每孔1×105个细胞，加入100μl稀释好的抗CTLA-4单克隆抗体和阳性对照、同型对照，室温孵育1小时；离心去上清液，用PBS洗涤细胞三遍，再用稀释好的Alexa488标记的抗人IgG FC抗体溶液重悬细胞，室温避光孵育1小时，再次使用PBS洗涤三遍，再用100ul PBS重悬，用流式细胞仪检测荧光强度。结果用Graphpad Prism分析，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
NAME N-1 N-2 N-3 N-4 N-5 N-6 N-7 N-8 EP2829609A1 hIgG
EC50(ng/ml) 7.095 8.946 8.963 11.12 6.118 7.047 7.925 6.492 92.65 ——
通过上述数据及如图5所示，本发明实施例4制备的8株全抗体的EC50值均明显低于专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体的全抗体，说明本发明提供的8株抗体均能结合细胞表达的CTLA-4，而且这8株全抗体中N-5的全抗体的EC50值最低，说明其与CTLA-4抗原特异性结合能力最好，亲和力最强，活性最好。
实施例7混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗CTLA-4单克隆抗体活性
按密度梯度离心法分离新鲜外周血PBMC，磁珠分选CD14+ T细胞；用20ng/mL GM-CSF与10ng/mL IL-4的培养基培养CD14+ T细胞，每2天换液，7-10d诱导成为树突状DC细胞。在DC使用前两天，加入25ng/mL的TNF-α诱导DC为成熟的DC细胞，收集成熟的DC细胞，配制成细胞密度为1x105个/mL细胞悬液。从新鲜PBMC中磁珠分选出CD4+ T细胞，计数，制成细胞密度为1x106个/mL细胞悬液。将CD4+ T细胞与DC细胞各取100ul，按比例10：1加入96孔板。
将实施例4制备的8株抗CTLA-4全抗体、专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4全抗体作为阳性对照和用人的IgG(hIgG)作为同型对照，分别进行4倍梯度稀释，每株全抗体均设置6个梯度，各取50ul加入到96孔板中，5天后，cck8测试CD4+ T细胞增殖，在450nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
NAME N-1 N-2 N-3 N-4 N-5 N-6 N-7 N-8 EP2829609A1 hIgG
EC50(mol/L) 7.343E-09 8.308E-09 1.418E-08 1.538E-08 4.946E-09 6.67E-09 6.307E-09 7.318E-09 8.513E-08 ——
通过上述数据及如图6所示，本发明筛选出的8株不同的抗CTLA-4全抗体的EC50值均明显低于专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4的全抗体，说明本发明提供的抗CTLA-4全抗体的活性均高于专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4全抗体。说明本发明提供的抗CTLA-4单克隆抗体的活性较好，亲和力较强。此外，从图6还可以看出，本发明筛选出的8株单克隆抗体中，N-5的活性最高。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种新型抗CTLA-4单克隆抗体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Asn Gly Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Leu Asn Asp Val Lys Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Phe Lys Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Leu Asp His Ile Asn Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ile
20 25 30
Phe Ser Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Ser Leu Lys Gln Lys Asp Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Phe
20 25 30
Tyr Asn Pro Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Val Tyr Phe His Phe Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20 25 30
Phe Asn Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Ala Leu Lys Asp Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Thr Leu Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Ser Leu Phe Leu Asp Gln Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ile
20 25 30
Tyr Cys Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Ser Ile Leu Asn Val Ile Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20 25 30
Ser Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Phe Leu Ile Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Ile Asp Ser
20 25 30
Lys Gly Tyr Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Thr Gln Lys Ser Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg
85 90 95
Gly His Ile Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Val Phe Asp Ser
20 25 30
His Gly Gln Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Gln Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Val
85 90 95
Trp His Leu Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (11)

1.一种抗CTLA-4单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述单克隆抗体选自以下任意一种：
(N-1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-4)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-5)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-6)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-7)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-8)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
2.如权利要求1所述的抗CTLA-4单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括重链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种。
3.如权利要求2所述的抗CTLA-4单克隆抗体，其特征在于，所述重链恒定区为人的IgG1。
4.如权利要求1所述的抗CTLA-4单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
5.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白为权利要求1-4任一项所述的抗CTLA-4单克隆抗体。
6.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1-4任一项所述的抗CTLA-4单克隆抗体。
7.一种重组DNA表达载体，其特征在于，所述重组DNA表达载体包含权利要求6所述的多核苷酸分子。
8.一种转染如权利要求7所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.一种转染如权利要求8所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
10.一种药物，其特征在于，所述药物包含如权利要求1-4任一项所述的抗CTLA-4单克隆抗体。
11.一种权利要求1-4任一项所述的抗CTLA-4单克隆抗体在制备治疗癌症疾病药物中的应用， 所述癌症疾病包括黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌或肝癌。
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