CN114456267B

CN114456267B - 一种抗cd73人源化单克隆抗体及其应用

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Publication number: CN114456267B
Application number: CN202011208987.8A
Authority: CN
Inventors: 黄建; 江舟; 朱永良; 吴敏瑾
Original assignee: Hangzhou Angkeniu Biotechnology Co ltd; Second Affiliated Hospital Zhejiang University College Of Medicine
Current assignee: Hangzhou Angkeniu Biotechnology Co ltd; Second Affiliated Hospital Zhejiang University College Of Medicine
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2040-11-03
Also published as: CN114456267A

Abstract

本发明涉及医药领域，公开了一种抗CD73人源化单克隆抗体及其应用。该抗CD73人源化单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。本发明的抗体具有高抗原亲和能力、高肿瘤靶向性、高酶活性抑制能力和高循环稳定性，且在有效剂量范围内无明显的毒副作用；具有良好的抗肿瘤疗效，与PD‑1和其他抗癌药物组合具有明显增敏作用；能在患者对某种或某些抗CD73抗体产生抗药性后，提供另一种选择。

Description

一种抗CD73人源化单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种抗CD73人源化单克隆抗体及其应用。

背景技术

免疫疗法即调控人体免疫系统来治疗疾病的策略与方法，随着现代免疫学的发展，人们对自身免疫系统的认识不断加深，免疫疗法的手段和成效也不断丰富和提升。肿瘤免疫治疗除了直接针对肿瘤细胞表面分子特异性抗体外，免疫检查点(Checkpoint)抗体在肿瘤临床治疗中显示出了优越的疗效，是目前肿瘤免疫治疗的热点。继2011年美国FDA首次批准CTLA-4全人抗体-Ipilimumab用于黑素瘤治疗，多种免疫检查点抗体研发如雨后春笋，在肿瘤治疗性抗体市场蓬勃发展。尽管目前对免疫检查点的抗体研发如火如荼，但该领域的进展收效甚微。CTLA-4基因敲除小鼠出现致命自身免疫症状，在10％-35％阻断CTLA-4的患者观察到严重的免疫相关不良事件。PD-1/PD-L1单抗在肺癌、黑色素瘤之外的肿瘤中治疗效果仍存在争议。由于严重的毒副作用以及瘤体种类应用的限制，使得免疫检查点抗体在临床中应用成为屠龙之技，难以发挥。因此发现新的免疫检查点靶点是目前抗肿瘤抗体药物研发的前提和关键。

CD73是一种分子量为70kDa的多功能跨膜糖蛋白，又被称为5’胞外核苷酸酶，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上。CD73最早被认定为淋巴细胞表面分化抗原，表达于多种淋巴细胞、内皮以及上皮细胞表面。组织受损时，细胞破裂产生大量ATP，细胞表面的CD39催化水解细胞外环境中的ATP与ADP生成AMP，在CD73协同下进一步分解为腺苷。CD73通过其水解酶活性发挥多种不同生理作用，如:上皮离子交换、预防组织缺血再灌注损伤、血小板功能、组织乏氧以及血管渗漏等。肿瘤微环境中腺苷浓度显著高于正常组织，可达10²-10⁵倍。高浓度的腺苷通过与肿瘤组织中细胞表面的腺苷受体A2AR/A2BR结合，发挥免疫抑制功能。

CD73是一个肿瘤免疫治疗新的潜在免疫检查点靶点。近年来许多报道指出CD73在结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌及人高侵袭性恶性黑色素瘤等多种恶性肿瘤组织细胞中高表达，并对不同瘤体均有一定程度的预后指导作用。近年来多项研究发现CD73不仅高表达于肿瘤细胞，在肿瘤微环境中的免疫细胞表达量也高于正常组织，尤其是T淋巴细胞，其可以通过腺苷通路发挥免疫抑制功能，还能促进CD4⁺T细胞向调节性T细胞(Treg)分化。多篇文献报道使用小鼠CD73单克隆抗体可以有效抑制肿瘤的生长和转移。不仅如此，CD73null小鼠可以有效消除移植瘤并获得长期无瘤生存的能力。有研究表明，在肠癌组织微环境中存在一群新型免疫抑制调节性细胞CD39+γδT细胞，且免疫抑制作用强于CD4⁺Treg。因此，抗CD73对免疫系统的功能恢复从而促进抗肿瘤的作用不言而喻。

相比于目前的靶向免疫检查点，CD73具有潜在的研发优越性。首先，体内实验证明CD73null小鼠并不会产生严重的自身免疫病，相较于CDLA-4，CD73抗体的研发具有更强的安全性基础。其次，既往研究针对Treg的靶向抗体多数表现为清除Treg，从而关闭免疫负向调控功能。Treg数量减少引起CD4⁺T细胞向Treg分化，从而维持T细胞功能平衡，因此靶向作用十分有限。抗CD73抗体通过CD39-CD73-腺苷途径发挥免疫抑制作用引起Treg的失活并不影响Treg数量变化。另一方面，抗CD25和靶向IL-2等单抗的问世，有效清除Treg同时也杀伤肿瘤效应性T细胞，抗肿瘤作用并不显著。而抗CD73能有效清除免疫抑制因素，不杀伤反而促进肿瘤效应T细胞的杀伤功能，抗肿瘤效果更加显著。

截止到目前靶向CD73药物主要为CD73抑制剂α,β-methylene ADP(APCP)和AB680。APCP是一种与ADP结构相似的非水解物质，能够竞争性结合CD73并抑制CD73酶活性，目前广泛应用于小鼠体内实验研究。经药物化学优化后的AB680是一种高度有效(Ki＝5pM)、可逆和选择性的CD73抑制剂，具有抗肿瘤活性。但此类小分子化合物在外周血中易被清除，半衰期短，稳定性较差，需要反复多次注射且相对剂量较大，副作用也更加明显。

目前国内外尚缺乏人源化CD73治疗性单克隆抗体产品上市。虽然已有文献报道关于抗CD73人源化抗体的成功研发和临床I期试验的开展，主要包括MEDI9447、NZV930和TJ004309单抗。但由于用于长期临床治疗后，患者体内会出现抗体药物的耐药性症，故需要提供多种针对不同表位的抗CD73人源化抗体选择，很可能当其他抗体药物失效时，某种抗体药物仍然有效。因此，研发更为高效、灵敏的人源化CD73特异性抗体具有较好的社会、经济效益和发展前景。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗CD73人源化单克隆抗体及其应用。本发明的抗体具有高抗原亲和能力、高肿瘤靶向性、高酶活性抑制能力和高循环稳定性，且在有效剂量范围内无明显的毒副作用；具有明显的抗肿瘤效应，与PD-1抗体和其他抗癌药物组合具有明显增敏作用；并能为患者对某种或某些抗CD73抗体产生抗药性后，提供另一种选择。

本发明的具体技术方案为：

第一，本发明公开了一种抗CD73人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

具有上述重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段能特异性结合CD73。基于肿瘤微环境中CD73在肿瘤细胞以及免疫抑制细胞中高表达，而且CD73又具有酶活性，可代谢ATP产生腺苷形成促肿瘤的代谢微环境，本发明研发的特异性抗CD73人源化单克隆抗体能通过与CD73特异性结合而有效阻断CD73通路，具有抗肿瘤和调控免疫抑制微环境的双重特性。

所述具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列是指序列相似度在95％以上的氨基酸序列。

作为优选，所述单克隆抗体或其抗原结合片段以小于1×10^-12M的亲和力结合CD73蛋白。

进一步地，所述亲和力通过酶联免疫吸附测定(ELISA)在全波长酶标仪中测得。

第二，本发明公开了一种编码前文所述抗体或抗原结合片段的核苷酸，包括编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列；所述编码重链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述编码轻链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

第三，本发明公开了一种克隆或表达载体，包含下述(a)和/或(b)：

(a)包含上述核苷酸中编码重链可变区的核苷酸序列；

(b)包含上述核苷酸中编码轻链可变区的核苷酸序列。

作为优选，克隆或表达载体中，所述编码重链可变区的核苷酸序列和/或编码轻链可变区的核苷酸序列与一种或多种调节元件可操作连接。

第四，本发明公开了一种包含前文所述核苷酸或载体的宿主细胞。

第五，本发明公开了一种制备前文所述抗体或抗原结合片段的方法，包括以下步骤：培养前文所述宿主细胞，使其表达抗CD73人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，并收集所表达的抗体或其抗原结合片段。

第六，本发明公开了前文所述抗体或抗原结合片段或核苷酸或载体或宿主细胞在制备药物中的应用，所述药物为降低CD73酶活性或水平的药物、解除CD73对机体免疫抑制的药物或引起Treg免疫细胞数量减少的药物。

所述药物任选含有药学上可接受的载体或赋形剂。

作为优选，所述药物用于预防肿瘤发生和/或治疗肿瘤。

通过上述药物，对患者给予有效量的抗CD73人源化单克隆抗体，用于降低CD73的活性或水平、解除CD73对机体的免疫抑制或引起Treg免疫细胞数量减少，以预防肿瘤发生和/或治疗肿瘤等与CD73相关的疾病。

进一步地，所述肿瘤为结直肠癌、乳腺癌或肺腺癌等CD73表达阳性的肿瘤细胞。

第八，本发明公开了前文所述抗体或抗原结合片段或核苷酸或载体或宿主细胞在制备诊断剂中的应用，所述诊断剂用于在体内诊断与CD73抗原有关的疾病或病症。

通过上述诊断剂，对患者给予有效量的抗CD73人源化单克隆抗体，用于诊断与CD73抗原有关的疾病和/或预测CD73抗体治疗反应性。

第九，本发明公开了一种含有前文所述抗体或抗原结合片段的组合物或试剂盒。

作为优选，所述组合物还包括PD-1抗体、奥沙利铂中的至少一种。

本发明通过以下方法制备上述抗CD73人源化单克隆抗体：

第一方面，本发明基于分子生物学方法建立CD73重组蛋白表达体系，表达和纯化CD73重组蛋白。

进一步地，本发明从人源细胞中扩增获取CD73编码cDNA，经DNA序列优化设计后克隆至大肠杆菌和/或棒状杆菌表达载体。

进一步地，本发明是通过结合酶活性测定和串联质谱分析方法对纯化的CD73重组蛋白进行生物学特性鉴定。

第二方面，本发明采用杂交瘤单克隆抗体法筛选先导抗体。

进一步地，杂交瘤单克隆抗体法筛选时，CD73重组蛋白免疫小鼠，通过细胞融合，筛选产生抗人CD73单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明采用杂交瘤单克隆抗体法筛选先导抗体。在杂交瘤单克隆抗体法筛选时，通过优化小鼠免疫方案，10次细胞融合并组合多种筛选手段和分别测定亲和力的方法，从中筛选产生高亲和力抗CD73抗体的细胞克隆。

第三方面，本发明通过对单抗的重链及轻链的CDR1、CDR2和CDR3构建突变抗体库进行亲和力筛选改造，获得人源化的单克隆抗体。

进一步地，本发明设计的改造抗体库是基于晶体结构模拟及生物信息学分析获得。

进一步地，本发明提供从上述抗CD73单克隆抗体产生细胞中扩增获取编码高亲和力可变区的基因序列和氨基酸序列。

发明人在研究中发现，本发明的抗CD73人源化单克隆抗体具有较高的亲和力和抗原抗体结合能力。进一步的实验结果表明本发明的抗CD73人源化单克隆抗体具有良好的抑瘤能力，说明本发明所述抗体具有抗肿瘤特性。

需要说明的是，经过研究发现，本发明制备的抗CD73人源化单克隆抗体在有效剂量范围内无明显的细胞毒性。在动物水平评价本发明的抗体对动物健康状况包括血清酶谱和白细胞等都没有明显不良影响，这说明该抗体使用的安全性。

在本发明的具体实验中，腺苷含量检测显示本发明的抗CD73人源化单克隆抗体使用后腺苷含量明显降低，说明其有效抑制了ATP水解；γ-干扰素(IFN-γ)检测显示T细胞分泌的IFN-γ含量与抗体浓度呈正相关，说明抗CD73人源化单克隆抗体能够有效刺激T细胞的功能。这进一步说明本发明的抗CD73人源化单克隆抗体具有良好的抗肿瘤效应。

可以理解，本发明的抗CD73人源化单克隆抗体完全可以制备成抗肿瘤药物以及诊断剂及CD73相关试剂盒，用于进行肿瘤的诊断、治疗或CD73相关研究。其中，药物中还可以包括其它药学上可以接受的辅助成份或活性成份，在此不做具体限定。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)本发明的编码抗CD73人源化单克隆抗体的核苷酸序列不同于文献或专利报道的抗CD73人源化单克隆抗体的核苷酸序列；

(2)本发明的抗CD73人源化单克隆抗体具有高亲和力、高酶活性抑制能力和高循环稳定性，能够发挥显著的抗肿瘤效应；

(3)本发明的抗CD73单克隆抗体为人源化抗体，动物实验显示在有效剂量范围内无明显的细胞毒性，安全性高；

(4)本发明的抗CD73人源化单克隆抗体与其他免疫检查点如PD-1抗体或抗癌药物如奥沙利铂等联合应用具有协同增强抗肿瘤效应，是潜在的临床新选择；

(5)本发明的抗CD73人源化单克隆抗体具有高肿瘤靶向性，不受血清中正常IgG的竞争抑制，弥补了该靶分子可能出现的耐药和无效情况。

(6)本发明的抗CD73人源化单克隆抗体能够有效降低肿瘤组织中Treg免疫细胞的数量减少。

附图说明

图1为小鼠实体瘤模型中使用抗CD73人源化单克隆抗体的不同治疗组合的肿瘤生长曲线；其中，图(a)为抗CD73人源化单克隆抗体与PD-1抗体组合治疗的肿瘤生长曲线，图(b)为抗CD73人源化单克隆抗体与抗癌药物奥沙利铂(Oxa)组合治疗的肿瘤生长曲线；图2为两株抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5的亲和力数据；

图3为两株抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5在浓度梯度稀释后抗原抗体结合率变化趋势；其中，图(a)为5A4在浓度梯度稀释后抗原抗体结合率变化的趋势，图(b)为8-5在浓度梯度稀释后抗原抗体结合率变化的趋势；

图4为抗CD73人源化单克隆抗体对动物移植瘤的体内肿瘤靶向情况；

图5为小鼠实体瘤模型中使用抗CD73人源化单克隆抗体的不同治疗组单位重量肿瘤组织中腺苷的含量；其中，图(a)为体外实验，图(b)为动物实验；

图6为不同浓度的抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5与混合淋巴细胞反应后对培养上清中IFN-γ释放的影响；

图7为5A4单抗与小分子化合物AB680对CD73酶活性的抑制率比较；

图8为5A4单抗与MEDI9447单抗、NZV930单抗、TJ004309单抗(抗体浓度均为5μg/mL)对CD73酶活性的抑制率比较；

图9为8-5单抗、MEDI9447单抗、NZV930单抗、TJ004309单抗(抗体浓度均为1μg/mL)对于混合淋巴细胞反应后培养上清中IFN-γ释放的影响；

图10为人源化5A4和8-5单抗在小鼠血循环中稳定性测定；

图11为5A4单抗与APCP(用量均为100μg/只)对健康动物的毒副作用比较；其中，图(a)为对外周血白细胞(WBC)数量的影响，图(b)为对血清尿素氮(BUN)的影响，图(c)为对血清谷丙转氨酶(ALT)活性的影响，图(d)为对血清谷草转氨酶(AST)活性的影响；

图12为人源化CD73抗体对Treg细胞的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：抗CD73单克隆抗体的产生

1人CD73重组蛋白制备

1.1CD73DNA序列获得

1.1.1从CD73表达的肿瘤细胞中获取CD73DNA序列

通过免疫印渍方法从肿瘤细胞中筛选CD73阳性细胞株，2×10⁶表达CD73的肿瘤细胞(如HCT116结直肠癌细胞和MCF7乳腺癌细胞系，本实施例选用MCF7乳腺癌细胞)用RNAeasy试剂盒(购自Qiagen)分离纯化总RNA，经Oligo dT15引物(购自Takara)将总RNA逆转录为cDNA，通过聚合酶链式反应(PCR)方法从中扩增获得CD73DNA序列(核苷酸序列号：X55740，氨基酸序列号：P21589)，DNA测序验证。

1.1.2化学合成人CD73DNA序列

根据Genbank提供的人CD73DNA序列，委托商业公司进行化学合成CD73DNA序列(核苷酸序列号：X55740，氨基酸序列号：P21589)，并克隆至适当的克隆性载体(如pUC19，pUC57等，本实施例选择pUC57)。

1.2通过原核细胞表达人CD73重组蛋白

以步骤1.1获得的CD73DNA为模板，用聚合酶链式反应(PCR)将CD73DNA开放阅读核苷酸序列(ORF)克隆到原核细胞表达载体pET15b或pET14b的NdeI/BamHI内切酶位点，DNA测序验证后，转化Rosetta DE3大肠杆菌，挑选高表达CD73的细菌克隆，扩大培养至OD值到0.4-0.8时，用1.0mM IPTG在37℃诱导4小时，10000rpm离心15min收集细菌沉淀。

CD73复性和纯化：以处理10g细菌沉淀为例进行说明。将10g细菌沉淀加入100mL包涵体裂解液I(pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mM EDTA和150mM NaCl)后进行高压破壁(压力70-90MPa)，离心，沉淀用50mL包涵体裂解液II(pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mMEDTA、100mM NaCl和0.5％Triton X-100)进行洗涤，洗涤3次，10000rpm离心30min，产生的沉淀用0.5M盐酸胍(用pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mM EDTA、100mM NaCl配制)洗涤1次，10000rpm离心15min。沉淀用20mL、6M盐酸胍(用pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mMEDTA、100mM NaCl配制)重悬，磁力搅拌30min后，10000rpm离心15min，上清(20mL)用pH10.7，50mM K₂HPO₄内含1mM EDTA和50mM NaCl溶液稀释10倍，用2M NaOH调pH10.7后静置30min，再用1M HCl调pH至8.0，10000rpm离心15min，将上清(200mL)装入透析袋中进行复性透析。透析液为pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mM EDTA、100mM NaCl、10mM还原型谷胱甘肽、2mM氧化型谷胱甘肽和1mM二硫苏糖醇(DTT)。4℃复性透析48h，然后用pH8.0,50mMTris-HCl缓冲液含100mM NaCl进行透析，透析3次后过硫酸镍柱(Bio-Rad公司)进行纯化，洗脱液为pH8.0，50mM Na₂HPO₄缓冲液内含500mM NaCl和250mM咪唑。进一步用AKTA纯化重组蛋白峰，Lorry’s酚试剂(Bio-Rad公司)进行蛋白质定量。

1.3真核细胞生产人CD73重组蛋白

以步骤1.1获得的CD73DNA为模板，克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.4(美国Invitrogen公司)，通过物理转染的方法(基因枪或脂质体)转染工程细胞CHO细胞(美国Invitrogen公司)，5％CO₂生物反应器中无血清培养液(美国Gibco公司)培养7-10天，收集上清液，浓缩，用AKTA纯化重组蛋白峰。Lorry’s酚试剂进行蛋白质定量。

2免疫和血清效价检测

以上述1.2或1.3制备的人CD73重组蛋白蛋白，以100μg/次/只人CD73重组蛋白与完全福氏佐剂等体积混匀，在近交系Balb/c小鼠皮下多点注射免疫。每3周1次，连续4次，注射第4次后用ELISA测定小鼠血清中抗体的效价。为了测量抗体的效价，将96孔反应板(美国Nunc公司)在4℃下以1μg/mL的重组人CD73蛋白包被过夜，用pH7.4，内含150mM NaCl和0.05％Tween-20的50mM Tris-盐酸缓冲液(TBS-T)冲洗3次，然后在室温下用封闭缓冲液(用上述TBS-T配置的5％小牛血清)封闭1小时，并用封闭缓冲液以1∶100开始稀释免疫小鼠血清，以100μL/孔加至封闭后的反应微孔，室温(18-25℃)温育1小时，然后洗涤微孔3-5次，随后以100μL/孔加入山羊抗小鼠IgG的HRP偶联物(1:3000，美国Jackson’sImmunotech公司)室温温育1小时。洗涤后，以100μL/孔加入四甲基联苯氨(TMB)底物，用2mol/L盐酸终止相互作用。使用酶标仪(美国Molecular Device公司)读取450nm处的吸光度。通过ELISA测定法测定血清中抗原特异性抗体的滴度。选择血清滴度>1:320000的小鼠进行杂交瘤融合。

3杂交瘤的产生

在无菌条件下从免疫小鼠收集脾脏，机械破碎，分离出单个淋巴细胞，然后使用电融合装置(BTX ECM2001)将分离的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以1∶1的比例进行电融合。融合后将细胞转移至次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)选择性培养基，每96孔板接种5×10⁵个细胞。按上述方案总进行10次重复融合，以提高特异性抗CD73抗体克隆的产生。

4抗体筛选

杂交瘤上清液用于初筛。然后通过ELISA测定筛选抗原特异性杂交瘤。

通过ELISA的结合测定：将微孔反应板(Nunc)在4℃下以1μg/mL的人CD73重组蛋白包被过夜。封闭和洗涤后，将杂交瘤上清液转移到微孔反应板中并在室温下温育1小时；然后洗涤平板，随后与山羊抗小鼠IgG-HRP一起温育1小时；洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止相互作用。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。

通过流式细胞检测术(FCM)进行分析：1×10⁵MDA231乳腺癌细胞/个测试与杂交瘤上清液100μL 4℃孵育30min，用含2％小牛血清的磷酸盐缓冲液(pH7.4)离心(1000rpm)洗涤3次，随后以100μL/孔，加入APC标记的山羊抗小鼠IgG的偶联物(1:3000，美国Jackson’sImmunotech公司)4℃孵育30min，用含2％小牛血清的磷酸盐缓冲液(pH7.4)离心(1000rpm)洗涤3次，用FACS cantoⅡ流式细胞仪测定各细胞荧光强度。

选择FCM结合强的抗人CD73活性的抗体用于进一步表征。从杂交瘤上清液中纯化具有结合的所选抗体。同时，亚克隆选择的杂交瘤系。通过结合ELISA测定验证杂交瘤亚克隆，并且检测它们的Ig同种亚型。

5亚克隆

将每个选择的细胞系的杂交瘤细胞以0.5-1个细胞/孔的密度接种在96孔板中。挑选单个克隆并在结合ELISA中测试。选择每个杂交瘤系的3个亚克隆并冷冻。

6抗体纯化

在将pH调节至7.0后，将收获的杂交瘤上清液加至蛋白G-Agarose柱(MabSelectSuRe，GE)。通过pH 2.8的0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱抗体，然后洗脱液立即使用pH8.0的1mol/LTris中和。通过Nano Drop(美国Thermal-Fisher公司)测定抗体蛋白浓度。通过SDS-PAGE(NuPAGE 4％-12％Bis-Tris Gel，Invitrogen)和HPLC-SEC(美国Agilent公司)评估蛋白质的纯度。

7抗体同种亚型

通过ELISA鉴定抗体同种型。将微孔反应板(Nunc)用1μg/mL的山羊抗小鼠IgG1/抗小鼠IgG2a/抗小鼠IgG2b/抗小鼠IgG3/抗小鼠IgG4/抗小鼠IgM抗体在4℃下包被过夜。封闭和洗涤后，将杂交瘤上清液转移到包被的板上并在室温下温育60min。然后将板与二抗山羊抗小鼠κ-HRP或山羊抗小鼠λ-HRP(Southern Biotech)一起温育30min。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止相互作用。使用酶标仪(美国Molecular Devices公司)读取450nm处的吸光度。

8编码抗体基因测序

使用Trizol试剂从杂交瘤细胞中提取RNA。使用5'-RACE试剂盒(日本Takara公司)扩增cDNA，然后使用3'-简并引物和3'-接头引物(日本Takara公司)进行PCR扩增。将PCR片段插入pMD18-T载体(日本Takara公司)中，进行DNA测序。

实施例2：人源化抗CD73单克隆抗体的产生

1人源化设计

根据CD73抗体重链和轻链的氨基酸序列信息进行人源化设计，基于分子生物学方法从上述单克隆抗体产生细胞中扩增获取编码高亲和力抗人CD73单克隆抗体可变区基因序列，基于晶体结构模拟及生物信息学分析，设计改造抗体库，对鼠源抗体基因分别通过链置换、框架区取代及CDR移植完成人源化改造，对单抗的重链及轻链的CDR1、CDR2和CDR3构建突变抗体库进行亲和力筛选改造。采用10¹¹的噬菌体展示全人Fab抗体库，根据germlinealignment的结果以及抗体结果模拟的结果，重链和轻链分别选择人源抗体模版，并在人源化之后的框架区进行回复突变(back mutation)，设计候选的人源化抗体序列。经上述噬菌体展示筛选后，得到的2个抗CD73人源化单克隆抗体：即人源化5A4和8-5。

2人源化抗体基因合成及表达载体构建

将上述设计的人源化单链抗体片段分别进行基因合成，作为模版，进行overlapPCR，组装VL-(G4S)3-VH的单链抗体，将组合后的单链抗体使用酶切位点EcoRI-BglII亚克隆至单链抗体表达载体中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒中抽试剂盒制备无内毒素质粒。

抗CD73人源化单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸和氨基酸序列如下：抗体8-5的重链可变区碱基序列和轻链可变区碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7所示；抗体5A4的重链可变区碱基序列和轻链可变区碱基序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4所示，重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:8所示。

3人源化抗体表达和纯化

从冰箱中取出ExpiFectamine^TM 293 Reagent转染试剂和人源化抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg pcDNA3.4-5A4/8-5-hIgG1-Fc重组质粒，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL ExpiFectamine^TM 293 Reagent，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10min。

将上述DNA/ExpiFectamine复合物加入到50mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130RPM培养6-8小时后，加入50mL新鲜的CD-293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。连续培养7天后，加入ExpiFectamine^TM 293Transfection Enhancer 1试剂1.2mL，再连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱纯化人源化抗体，得到抗CD73人源化单克隆抗体。

实施例3：ELISA比较抗CD73人源化单克隆抗体的亲和力

图2显示了两株抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5的亲和力数值。

将96孔反应板(美国Nunc公司)在4℃下以1μg/mL的重组人CD73蛋白包被过夜，用pH7.4，内含150mM NaCl和0.05％Tween-20的50mM Tris-盐酸缓冲液(TBS-T)冲洗3次，然后在室温下用封闭缓冲液(用上述TBS-T配置的5％小牛血清)封闭1小时，并用封闭缓冲液以1∶10000开始稀释的人源化抗CD73抗体，以100μL/孔加至封闭后的反应微孔，室温(18-25℃)温育1小时，然后洗涤微孔3-5次，随后以100μL/孔加入山羊抗人IgG的HRP偶联物(1:3000，美国Jackson’s Immunotech公司)室温温育1小时。洗涤后，以100μL/孔加入四甲基联苯氨(TMB)底物，用2mol/L盐酸终止相互作用。使用酶标仪(美国Molecular Device公司)读取450nm处的吸光度。

如图2可知，经过噬菌体库亲和成熟筛选后，得到的2个抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5均具有很高的亲和力，分别为0.83×10^-12mol/L和0.64×10^-12mol/L，5A4比8-5的亲和力更高。

实施例4：流式细胞检测术鉴定抗CD73人源化抗体与靶蛋白的结合

图3显示了抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5在浓度梯度稀释后抗原抗体结合率随浓度变化的趋势。

乳腺癌MDA-MB-231细胞，使用RPMI 1640、10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期。将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为1×10⁶个细胞，使用1mL PBS重悬细胞，分别加入浓度梯度稀释的纯化的抗CD73人源化单克隆抗体，充分混匀后，室温孵育半小时。800rpm室温离心5min，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；加入2μL PE标记的抗人IgG(Anti-human IgG)，充分混匀后，室温避光孵育30min；800rpm室温离心5min，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；使用500μL PBS重悬细胞，用FACS cantoⅡ流式细胞仪测定各细胞荧光强度。

如图3所示，本发明的抗CD73人源化抗体5A4和8-5均能与目标抗原特异性结合，且具有良好的抗原抗体结合能力。图中显示数据为平均值。

实施例5：抗CD73人源化单克隆抗体体内活性评价

图1显示了小鼠实体瘤模型中使用抗CD73人源化单克隆抗体的不同治疗组的肿瘤生长曲线。

乳腺癌细胞系MDA-MB-231于T175方瓶中培养，置于37℃、5％CO₂孵箱中，每三天左右进行一次传代。收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，于800rpm，离心3min，采用PBS重悬，以4×10⁶个细胞接种于SCID Beige小鼠皮下。待肿瘤体积长至约260mm³时，随机分为6组(即正常小鼠IgG、5A4、8-5、抗PD-1、5A4+8-5、5A4+抗PD-1)，每组8只，并分别给予抗CD73人源化单克隆抗体5A4，IgG和CD73抑制剂α,β-methylene ADP(APCP)，腹腔注射(i.p.)，每周两次(biw)，连续3周。

抗CD73人源化单克隆抗体与化疗药奥沙利铂联合治疗作用：收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，于800rpm，离心3min，采用PBS重悬，以4×10⁶个细胞接种于裸Balb/c小鼠皮下。待肿瘤体积长至约260mm³时，随机分为4组(即正常小鼠IgG、5A4、奥沙利铂和5A4+奥沙利铂组)并开始给药，给药方式均为腹腔注射。5A4及正常小鼠IgG共给药8次(第一次注射400mg/只，其余7次均为200mg/只；第4、7、10、13、16、19、22、25天分别给药)；奥沙利铂给药2次(10mg/kg；第5天及第14天)。

以上实验均每周测量肿瘤大小两次，计算肿瘤体积(V,mm³)：V(mm³)＝(L×W²)/2，L表示肿瘤长度，W表示肿瘤宽度，绘制肿瘤生长曲线。

如图1(a)所示，在接种细胞后1周左右抗CD73人源化单克隆抗体5A4和APCP都明显抑制了小鼠体内肿瘤的生长。而抗CD73人源化单克隆抗体5A4对小鼠体内肿瘤的生长抑制作用比APCP更为显著，小鼠肿瘤体积下降幅度更大。说明本发明的抗CD73人源化单克隆抗体具有良好的抗肿瘤效应。此外，相较于5A4抗体和8-5抗体单独使用而言，两者联合应用对小鼠体内肿瘤的生长抑制作用明显增强，说明发明的两种人源化单克隆抗体5A4和8-5之间具有协同效用；相较于5A4抗体和PD-1抗体单独使用而言，两者联合应用对小鼠体内肿瘤的生长抑制作用明显增强，说明本发明的人源化单克隆抗体5A4与PD-1抗体联合应用具有协同增强抗肿瘤效应。

如图1(b)所示，与正常小鼠IgG治疗组相比，抗CD73人源化单克隆抗体5A4单独治疗组可抑制肿瘤，但肿瘤消退不如奥沙利铂治疗组，但奥沙利铂和5A4联合治疗组可进一步增加抑制肿瘤生长的效应。

实施例6：抗CD73人源化单克隆抗体体内肿瘤靶向性评价

将抗CD73人源化单克隆抗体5A4蛋白浓度调整至1.0mg/mL，再加入1/10体积的1M碳酸氢钠溶液，加入100μL的Alexa-680荧光染料(美国Invitrogen公司)，混匀，室温孵育1h，加入反应混合物至1.5mL树脂中，离心1100g，静置5min收集标记抗体。即为荧光素偶联抗CD73人源化单克隆抗体5A4。另取培养的MDA-MB-231细胞，以4×10⁶个细胞接种于裸Balb/c小鼠皮下，共6只。待肿瘤体积长至约260mm³时，将标记好的抗体以150μL/只，尾静脉注射进入已成瘤的MDA-MB-231荷瘤Balb/c裸鼠体内。在小鼠尾静脉注射荧光标记抗体24h后，异氟烷吸入麻醉，进行活体成像。麻醉后的小鼠肿瘤面朝上置入暗室中，进行拍照(激发波长684nm，发射波长707nm)。(3)每隔24h重复麻醉拍照，直至其中有小鼠荧光完全消失为止。

如图4所示，将偶联了荧光素的抗CD73人源化单克隆抗体5A4通过尾静脉注射入小鼠体内后，用活体成像仪成像发现，抗CD73人源化单克隆抗体5A4均特异性聚集在皮下移植瘤区域，说明抗CD73人源化单克隆抗体具有高度的肿瘤靶向性。

实施例7：抗CD73人源化单克隆抗体5A4体内外抑制腺苷的作用评价

图5显示了小鼠实体瘤模型中使用抗CD73人源化单克隆抗体的不同治疗组单位重量肿瘤组织中腺苷的含量。

在实施例5连续3周腹腔注射抗体之后，以安乐死方式处死小鼠，取肿瘤进行腺苷含量测定，腺苷测定方法如下：

(1)肿瘤组织块处理：

(1.1)皮下移植瘤剥离下来后进行称重、拍照；

(1.2)加入1mL高氯酸后研钵进行反复研磨，研磨肿瘤组织至匀浆状态；

(1.3)15000g水平离心10min后吸取上清，40μm滤网过滤，滤液作为样本上机检测；

(2)HPLC检测组织研磨液腺苷含量：

(2.1)从滤液吸取100μL，与甲醇按1:1混合，震荡混匀(1min)；

(2.2)混匀后15000g×10min离心后吸取上清200μL加入内衬管中上机检测；

(2.3)配置腺苷标准品(高氯酸配置)，浓度梯度设置如下：200μg/mL；100μg/mL；50μg/mL；25μg/mL；12.5μg/mL；6.25μg/mL；3.125μg/mL；

(2.4)流动相配置：5.44mg KH₂PO₄溶于1L ddH₂O，超声10min去气泡后流动相过滤装置过滤；

(2.5)高效液相色谱检测条件：上样量：20μL；色谱柱：SunFireTM C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A：乙腈；B：0.04mol/L KH₂PO₄；A:B＝5:95；流速：0.5mL/min；甲醇冲洗色谱柱120min；检测波长：UV 260nm；柱温：30℃；

(2.6)计算方法：根据标准曲线算出每个样中腺苷含量(μM)，然后结合瘤体重量算出单位重量腺苷含量(μmol/g)。

抗CD73人源化单克隆抗体5A4体外抑制腺苷能力测定：将对数生长期的乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行消化计数铺板，以20000个/孔的密度铺入24孔板中，6h细胞贴壁培养后吸掉上清，加入由L-15培养基配制的不同5A4抗体，5A4单抗设置3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL六个浓度梯度。37℃孵育2h后，吸掉上清，PBS洗一遍后加入500μM AMP，37℃孵育30min后收集上清后，离心收集上清，进行腺苷含量测定，测定方法同上。

如图5所示，抗CD73人源化单克隆抗体5A4和APCP都降低了小鼠肿瘤中的腺苷含量。而抗CD73人源化单克隆抗体5A4对肿瘤中的腺苷明显具有比APCP更强的抑制作用。抗CD73人源化单克隆抗体5A4体外也具有强烈抑制腺苷能力，P<0.05代表统计学差异上有显著意义。说明本发明的抗CD73人源化单克隆抗体具有良好的腺苷抑制作用。

实施例8：抗CD73人源化单克隆抗体刺激T细胞的功能

图6显示了混合淋巴细胞反应后比较抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5对于培养上清中IFN-γ的含量的影响。

采集2个健康人新鲜血液，利用人外周血淋巴细胞分离液分离出PBMC后，计数后取等量细胞混合后铺于U形底96孔板(20万/100μL/孔)，6h细胞聚团后加入分别含有不同浓度抗体(5A4、8-5、5A4+8-5)的RPMI培养基，抗体最高浓度为50μg/mL，进行2倍稀释，设置5个浓度梯度。以正常小鼠IgG作为阴性对照，37℃孵育48h及72h后，离心(2000rpm，3min)小心吸取上清100μL作为待测样本。使用IFN-γELISA试剂盒(Biolegend)检测IFN-γ在培养基中的含量。如图5所示，混合淋巴细胞反应后抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5均明显促进了培养上清中IFN-γ含量的增加，且IFN-γ含量与抗CD73人源化单克隆抗体浓度呈正相关，5A4和8-5组合后促进IFN-γ含量增加的效果更加显著。说明本发明的抗CD73人源化单克隆抗体能有效刺激T细胞的功能。

实施例9：5A4单抗抑制CD73酶活性与小分子化合物AB680比较

图7显示了5A4单抗与小分子化合物AB680对CD73酶活性的抑制率。

将对数生长期的乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行消化计数铺板，以20000个/孔的密度铺入24孔板中，6h细胞贴壁培养后吸掉上清，加入由L-15培养基配制的不同5A4抗体和小分子化合物AB680样品，5A4单抗设置1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL三个浓度梯度，AB680设置10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL三个浓度梯度。37℃孵育2h后，吸掉上清，PBS洗一遍后加入500μMAMP，37℃孵育30min后收集上清后，离心收集上清，进行腺苷含量测定，腺苷测定方法如下：

(1)吸取100μL培养上清液，与甲醇按1:1混合，震荡混匀(1min)。

(2)混匀后15000g×10min离心后吸取上清200μL加入内衬管中上机检测。

(3)配置腺苷标准品(高氯酸配置)，浓度梯度设置如下：200μg/mL；100μg/mL；50μg/mL；25μg/mL；12.5μg/mL；6.25μg/mL；3.125μg/mL。

(4)流动相配置：5.44mg KH₂PO₄溶于1L ddH₂O，超声10min去气泡后流动相过滤装置过滤。

(5)高效液相色谱检测条件：上样量：20μL；色谱柱：SunFireTM C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A：乙腈；B：0.04mol/L KH₂PO₄；A:B＝5:95；流速：0.5mL/min；甲醇冲洗色谱柱120min；检测波长：UV 260nm；柱温：30℃。

(6)计算方法：根据标准曲线算出每个样中腺苷含量(μM)。

根据以下公式计算CD73酶活性抑制率：CD73酶活性抑制率等于＝(1-实验组腺苷量/对照组腺苷量)×100％。

如图7所示，当AB680的浓度为5A4的10倍时，其CD73酶活性抑制率仍显著低于5A4，说明相较于现有的小分子化合物AB680，本发明的5A4对CD73酶活性的抑制作用更佳。图中显示数据为平均值。

实施例10：5A4单抗抑制CD73酶活性能力与其他公司产品的比较

图8显示了5A4单抗和3种其他公司的抗CD73单抗产品(MEDI9447、NZV930、TJ004309)对CD73酶活性的抑制率。

将对数生长期的乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行消化计数铺板，以20000个/孔的密度铺入24孔板中，6h细胞贴壁培养后吸掉上清，加入由L-15培养基配制的不同抗体样品(5A4、MEDI9447、NZV930、TJ004309)，抗体浓度均为5μg/mL。37℃孵育2h后，吸掉上清，PBS洗一遍后加入500μM AMP，37℃孵育30min后收集上清后，离心收集上清，进行腺苷含量测定，腺苷测定方法如下：

(1)吸取100μL培养上清液，与甲醇按1:1混合，震荡混匀(1min)。

(6)计算方法：根据标准曲线算出每个样中腺苷含量(μM)。

如图8所示，5A4的CD73酶活性抑制率明显高于MEDI9447、NZV930、TJ004309，说明相较于其他公司的这三种产品而言，本发明的5A4对CD73酶活性的抑制作用更佳。图中显示数据为平均值。

实施例11：8-5单抗刺激T细胞的功能与其他公司产品的比较

图9显示了混合淋巴细胞反应后比较8-5单抗和3种其他公司的抗CD73单抗产品(MEDI9447、NZV930、TJ004309)对于培养上清中IFN-γ的含量的影响。

采集2个健康人新鲜血液，利用人外周血淋巴细胞分离液分离出PBMC后，计数后取等量细胞混合后铺于U形底96孔板(20万/100μL/孔)，6h细胞聚成团后加入分别含有1μg/mL的8-5单抗、MEDI9447单抗、NZV930单抗、TJ004309单抗的RPMI培养基，37℃孵育48h及72h后，离心(2000rpm，3min)小心吸取上清100μL作为待测样本。使用IFN-γELISA试剂盒(Biolegend)检测IFN-γ在培养基中的含量。

如图9所示，混合淋巴细胞反应后，8-5单抗处理的培养上清中IFN-γ含量明显高于MEDI9447、NZV930、TJ004309处理的培养上清，说明相较于其他公司的这三种产品而言，本发明的8-5单抗能更有效地刺激T细胞的功能。图中显示数据为平均值。

实施例12：人源化CD73抗体体内稳定性测定

正常Balb/c小鼠分2组，每组5只，并分别给予100μg/只抗CD73人源化单克隆抗体5A4，IgG和CD73抑制剂α,β-methylene ADP(APCP)，腹腔注射(i.p.)，共1次。分别在第1,3,5,7,9,11,13天取血。用ELISA法测定外周血中的抗体效价。即将96孔反应板(美国Nunc公司)在4℃下以1μg/mL的重组人CD73蛋白包被过夜，用pH7.4，内含150mM NaCl和0.05％Tween-20的50mM Tris-盐酸缓冲液(TBS-T)冲洗3次，然后在室温下用封闭缓冲液(用上述TBS-T配置的5％小牛血清)封闭1小时，并用封闭缓冲液以1∶100开始稀释的鼠血清，以100μL/孔加至封闭后的反应微孔，室温(18-25℃)温育1小时，然后洗涤微孔3-5次，随后以100μL/孔加入山羊抗人IgG的HRP偶联物(1:3000，美国Jackson’s Immunotech公司)室温温育1小时。洗涤后，以100μL/孔加入四甲基联苯氨(TMB)底物，用2mol/L盐酸终止相互作用。使用酶标仪(美国Molecular Device公司)读取450nm处的吸光度。

如图10可知，2个抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5在小鼠血循环中13天内均无明显的下降，而小分子抑制剂则在1天内就被清除，提示抗CD73人源化单克隆抗体5A4和8-5具有较好的稳定性。图中显示数据为平均值。

实施例13：人源化CD73抗体安全性评价

图11显示了本发明的抗单克隆抗体不会产生的致命免疫应答(HAMA)反应，在有效剂量范围内无明显的细胞毒性。

SCID Beige小鼠，每组8只，并分别给予100μg/只抗CD73人源化单克隆抗体5A4，IgG和CD73抑制剂α,β-methylene ADP(APCP)，腹腔注射(i.p.)，每周2次(biw)，连续3周。3周后取血对动物的血清酶和白细胞进行测定。

如图11所示，在小鼠水平评价了人源化CD73抗体对动物的血清酶和外周血白细胞数量等都没有明显不良影响，所有实验小鼠均存活，说明本发明的抗单克隆抗体不会产生的致命免疫应答(HAMA)反应，在有效剂量范围内无明显的细胞毒性。

实施例14：人源化CD73抗体对Treg细胞的影响

将10mL新鲜的正常人全血加至50mL离心管中，加入10mL PBS溶液稀释，混匀。另取两支15mL离心管，先加入5mL淋巴细胞分离液溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的淋巴细胞分离液上层，500g水平离心30min，吸取位于中间层的单个核细胞(PBMC)层，至另一干净的15mL离心管，加PBS至10-15mL，1500g，离心10min，再加入培养液再进行1次相同操作的洗涤；最后加入5-10mL培养液重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板。分组设置：PBMC+5A4(鼠源Fc端)，PBMC+人源化5A4-IgG1，PBMC+人源化5A4-IgG4，PBMC+人源化8-5-IgG1，PBMC+人源化8-5-IgG4，每组设置3个复孔。将分离的PBMC按2×10⁵个细胞/孔铺板，待细胞聚集成团后(约6h)，按分组设置加入4株人源化抗体(50μg/孔)。37℃孵育72h后小心吹打细胞收板，加入1mL PBS清洗后离心(1500g，3min)去掉上清。用1mL Staining Buffer(美国Biolegends公司)重悬沉淀，加入流式抗体anti-human CD45,anti-human CD4,anti-human CD25(美国Biolegends公司),4℃避光孵育30min后，按5mL/管加PBS液进行离心洗涤(1500g，3min)，去掉上清，细胞沉淀用1mL Staining Buffer重悬，用流式细胞仪进行检测CD4⁺CD25⁺的Treg细胞。

如图12所示，经人源化单克隆抗体5A4-IgG1和8-5-IgG1处理的外周血单个核细胞中Treg细胞数量或比例均出现了明显的减少。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学医学院附属第二医院

杭州昂可纽生物科技有限公司

<120> 一种抗CD73人源化单克隆抗体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列Hu-8-5(Artificial Sequence)

<400> 1

acctgcagct ggtttccggt gctgtataac catgaaccgt atagcagcgt gtgcccgctg 60

atttttatgc gcgaatgggg catttttagc tgggaattta cctgccagaa cgcgaccgaa 120

atgaaacagc atgcgggcac cccggtggcg aaacgcgatg aggtgcagct ggtggagagc 180

ggaggcggac tggtcaaacc cggcggctct ctgaggctga gctgtgctgc tagcggcttc 240

actttcagca gctacggcat gagctgggtg aggcaagccc ccggcaaggg actggagtgg 300

gtcgcctcca tcagcagcgg aggcagctac acttactacc cagattccgt caagggaagg 360

ttcacaatct ctagggacaa cgccaagaac tctctgtatc tgcagatgaa ctctctgagg 420

gccgaggata ctgccgtgta ctactgtgcc aatctgggct tcgcctactg gggacaaggc 480

actctggtga cagtgagcag cctgtttcag tggtgctttc atatttttct gatgaccttt 540

cagctgatgt ggtatgcgga agaatggagc tatgaacgct gctttgcggt ggatcgcgat 600

aaagcgatgg gcgaaccgga atgctgcctg cagctgtttg tgatgatgtg cccgcatctg 660

agcacccata gctggatgaa ccag 684

<210> 2

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列Hu-5A4(Artificial Sequence)

<400> 2

agcatttgct ttgaaggcaa accggatatg aaccagcgcg ataaagaaga tcatatgcgc 60

gtgtttatga acagctggga tgattggtat gatgtgaaac tgtggcattg cattgatttt 120

gaacgcgcgc atcgcccgca gcattatccg attatggcgc aagtgcagct ggtgcagagc 180

ggcgctgagg tgaagaagcc cggcgccagc gtgaaggtca gctgtaaggc cagcggctac 240

agcttcacag actacaacat gtactgggtg aggcaagccc ccggccaagg actggagtgg 300

atgggctaca tcgaccctta caacggcgat gctagctacg cccagaagtt ccaaggaagg 360

gtgactatga caagggacac tagcactagc actgtgtaca tggaactcag ctctctgagg 420

agcgaggata ctgccgtgta ctactgcgcc aagactgact actggggcca aggcactaca 480

ctgacagtga gcagctgcct ggcgaaactg ccgtgcggca gccatacctg ggtgtggtgg 540

caggaaatga ttcagaacgc gccgtggtgc gtgcagccga cccatgatca ttgggcgccg 600

gcgggctgga accatggctg ctgcattctg gcgcatgcgg aaaacattca gggcgcgcag 660

tggtttgcgt at 672

<210> 3

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列Hu-8-5(Artificial Sequence)

<400> 3

gatatccagc tgacacagag ccctagctct ctgagcgcta gcgtgggaga tagggtgaca 60

atgacatgta gggccggctc cagcgtcagc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120

aaggccccaa agaggtggat cttcgacact agcaagctcg atatccagct gacacagagc 180

cctagctctc tgagcgctag cgtgggagat agggtgacaa tgacatgtag ggccggctcc 240

agcgtcagct acatgcactg gtaccagcag aagcccggca aggccccaaa gaggtggatc 300

ttcgacacta gcaagctcgc tagcggcgtg ccttctaggt tcagcggaag cggcagcggc 360

actgacttca ctctgactat cagcagcatg cagccagagg acttcgccac ttactactgc 420

cagcagtggt ccagcaatcc acctttcaca ttcggccaag gcacaaagct ggagatcaag 480

gctagcggcg tgccttctag gttcagcgga agcggcagcg gcactgactt cactctgact 540

atcagcagca tgcagccaga ggacttcgcc acttactact gccagcagtg gtccagcaat 600

ccacctttca cattcggcca aggcacaaag ctggagatca ag 642

<210> 4

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列Hu-5A4(Artificial Sequence)

<400> 4

atgccgggcg atgcgcgcgt gctgagcccg tggcataact atcataacat tacctgccat 60

tggagccgcg cgatgcgccg cgcgcatgcg cagagcggca accaggatat gcgcaacccg 120

accgcgtgct gcgatcattg cagctttccg gatccgtatg atatcgtcat gacacagagc 180

cctctgtctc tgccagtgac tctgggccag ccagccagca tcagctgtag gagcagccag 240

tctctgctgg atagcgacgg aaggacatat ctgaattggc tgctgcagag acccggccag 300

agcccaagaa ggctgatcta tctggtgagc aatagggaca gcggcgtgcc agatagattc 360

agcggcagcg gaagcggcac agacttcaca ctgaagatct ctagggtgga ggccgaggat 420

gtgggcgtgt actactgttg gcaaggcact cacttcccaa ctttcggcca aggcacaaag 480

ctggagatca agcagtatga tcatagccag agcgaaaaca ccagccagca tcatctggtg 540

ctgcagtgca tgcgccagaa ctgcctgttt ggcctggtga gctggaacag ccgcatgcat 600

ctggtgtttt atagcattaa ccattgcgat aaccgcgcgg cgggctgggg cgcgaaaaaa 660

cgcacc 666

<210> 5

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列Hu-8-5(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Cys Ser Trp Phe Pro Val Leu Tyr Asn His Glu Pro Tyr Ser Ser

1 5 10 15

Val Cys Pro Leu Ile Phe Met Arg Glu Trp Gly Ile Phe Ser Trp Glu

20 25 30

Phe Thr Cys Gln Asn Ala Thr Glu Met Lys Gln His Ala Gly Thr Pro

35 40 45

Val Ala Lys Arg Asp Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

50 55 60

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

65 70 75 80

Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

85 90 95

Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr

100 105 110

Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

115 120 125

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

130 135 140

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

145 150 155 160

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Phe Gln Trp Cys Phe His Ile Phe

165 170 175

Leu Met Thr Phe Gln Leu Met Trp Tyr Ala Glu Glu Trp Ser Tyr Glu

180 185 190

Arg Cys Phe Ala Val Asp Arg Asp Lys Ala Met Gly Glu Pro Glu Cys

195 200 205

Cys Leu Gln Leu Phe Val Met Met Cys Pro His Leu Ser Thr His Ser

210 215 220

Trp Met Asn Gln

225

<210> 6

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列Hu-5A4(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Ile Cys Phe Glu Gly Lys Pro Asp Met Asn Gln Arg Asp Lys Glu

1 5 10 15

Asp His Met Arg Val Phe Met Asn Ser Trp Asp Asp Trp Tyr Asp Val

20 25 30

Lys Leu Trp His Cys Ile Asp Phe Glu Arg Ala His Arg Pro Gln His

35 40 45

Tyr Pro Ile Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

50 55 60

Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

65 70 75 80

Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Ala Ser

100 105 110

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser

115 120 125

Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

130 135 140

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

145 150 155 160

Leu Thr Val Ser Ser Cys Leu Ala Lys Leu Pro Cys Gly Ser His Thr

165 170 175

Trp Val Trp Trp Gln Glu Met Ile Gln Asn Ala Pro Trp Cys Val Gln

180 185 190

Pro Thr His Asp His Trp Ala Pro Ala Gly Trp Asn His Gly Cys Cys

195 200 205

Ile Leu Ala His Ala Glu Asn Ile Gln Gly Ala Gln Trp Phe Ala Tyr

210 215 220

<210> 7

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列Hu-8-5(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Gly Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Phe

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

50 55 60

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Gly Ser

65 70 75 80

Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

85 90 95

Lys Arg Trp Ile Phe Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

100 105 110

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

115 120 125

Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

130 135 140

Ser Asn Pro Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

145 150 155 160

Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

165 170 175

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

180 185 190

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly

195 200 205

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

210

<210> 8

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列Hu-5A4(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Pro Gly Asp Ala Arg Val Leu Ser Pro Trp His Asn Tyr His Asn

1 5 10 15

Ile Thr Cys His Trp Ser Arg Ala Met Arg Arg Ala His Ala Gln Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Asp Met Arg Asn Pro Thr Ala Cys Cys Asp His Cys Ser

35 40 45

Phe Pro Asp Pro Tyr Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu

50 55 60

Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln

65 70 75 80

Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln

85 90 95

Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg

100 105 110

Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

115 120 125

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

145 150 155 160

Leu Glu Ile Lys Gln Tyr Asp His Ser Gln Ser Glu Asn Thr Ser Gln

165 170 175

His His Leu Val Leu Gln Cys Met Arg Gln Asn Cys Leu Phe Gly Leu

180 185 190

Val Ser Trp Asn Ser Arg Met His Leu Val Phe Tyr Ser Ile Asn His

195 200 205

Cys Asp Asn Arg Ala Ala Gly Trp Gly Ala Lys Lys Arg Thr

210 215 220

Claims

1. 一种抗CD73人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:7，或者分别为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。

2. 一种编码如权利要求1所述抗体或抗原结合片段的核苷酸，其特征在于，包括编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列；所述编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，或者分别为SEQID NO:2和SEQ ID NO:4。

3.一种克隆或表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述核苷酸。

4.一种包含如权利要求2所述核苷酸或如权利要求3所述载体的宿主细胞。

5.一种制备如权利要求1所述抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养如权利要求4所述宿主细胞，使其表达抗CD73人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，并收集所表达的抗体或其抗原结合片段。

6.如权利要求1所述抗体或抗原结合片段或如权利要求2所述核苷酸或如权利要求3所述载体或如权利要求4所述宿主细胞在制备试剂中的应用，其特征在于，所述试剂用于预防乳腺癌发生和/或治疗乳腺癌。

7.如权利要求1所述抗体或抗原结合片段或如权利要求2所述核苷酸或如权利要求3所述载体或如权利要求4所述宿主细胞在制备非治疗用途的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂为降低CD73酶活性或水平的试剂、解除CD73对机体免疫抑制的试剂或引起外周血Treg免疫细胞数量减少的试剂。

8.一种含有如权利要求1所述抗体或抗原结合片段的组合物或试剂盒。

9.如权利要求8所述组合物，其特征在于，还包括PD-1抗体、奥沙利铂中的至少一种。