JP2022521958A - 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその応用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＰＤ－Ｌ１免疫阻害剤に関し、具体的には、ＰＤ－Ｌ１を標的とするモノクローナル抗体及びこれらの抗体をコードするヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター及び発現ベクターの組み合わせに関する。本発明は、さらに、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含むコンジュゲート又は医薬組成物を提供する。本発明は、さらに、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体のヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター、発現ベクターの組み合わせ、コンジュゲート又は医薬組成物の、がんを治療又は予防するための医薬品における用途を提供する。本発明で提供される抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１との良い親和性を有し、良好な特異性を示し、ヒトＰＤ－１に対してヒトＰＤ－Ｌ１に競合的に結合するの点で顕著な優位性を示す。本発明で提供される抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、非小細胞肺がん及び結腸直腸がんのインビトロ動物モデルにおいて良好な腫瘍阻害効果を示す。【選択図】なし

Description

本発明は、バイオ医薬品分野に関し、具体的には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント及びその医薬用途に関する。
近年、腫瘍治療の分野では、自己免疫系を利用して腫瘍を抵抗するための研究に専念する人が増え、このような自己免疫系を調節することにより腫瘍細胞を阻害して殺す方法は、がん免疫療法と呼ばれる。がん免疫療法は、現在の癌治療の分野で最も有望な研究の方向性であり、細胞免疫療法、腫瘍ワクチン、腫瘍を標的とする受動免疫療法、及び免疫チェックポイント阻害剤などの研究ホットスポットを含み、アプリケーションの見通しを持つ多くの研究結果を達成している。
免疫チェックポイントとは、共刺激シグナルと共抑制シグナルのバランスを取ることによりＴ細胞免疫応答の強度を制御するシグナル経路を指す（文献１）。生体の正常な状況下では、免疫チェックポイントは、自己免疫反応の強度を調節することにより免疫寛容を維持することができる。しかしながら、生体が腫瘍に侵されると、免疫チェックポイントの活性化は自己免疫を阻害する可能性があり、腫瘍細胞の成長と脱出を助長する。ＣＴＬＡ－４、プログラム細胞死受容体－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１、ＰＤ－１）／プログラム細胞死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ－１、ＰＤ－Ｌ１）、ＴＩＭ－３などは、免疫チェックポイントにおいて重要な負の調節因子であり、腫瘍免疫回避に重要な役割を果たす。特異的抗体を使用して免疫チェックポイントの負の調節経路を遮断し、腫瘍細胞への免疫系の認識・殺傷能を再構築し、がん免疫療法で良好な治療効果を奏する。既知の免疫チェックポイントでは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１は、がん免疫療法の研究及び治療で高い注目を集めている。
ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １、プログラム細胞死受容体１、ＣＤ２７９）は、重要な免疫抑制分子であり、ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ－１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球及び一部の腫瘍細胞に発現し、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされ、２８８個のアミノ酸からなる膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１の構造は、主に細胞外領域─免疫グロブリン可変ドメイン（ＩｇＶ）様ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインは、Ｃ末端及びＮ末端アミノ酸残基を含み、それぞれ免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｍｏｔｉｆ、ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅ－ｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＳＭ）である２つの独立したリン酸化部位を含む。ＰＤ－１の細胞外ＩｇＶ様構造は、そのリガンドに結合し、ＩＴＳＭが変化し、ＳＨＰ２シグナルを動員し、下流経路を活性化する（文献２）。
ＰＤ－１の天然リガンドは、それぞれＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方がある（文献３）。ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、ＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ１）は、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされる４０ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞、骨髄由来の肥満細胞及び非造血細胞に発現誘導され、インターフェロン及び他の炎症性サイトカインの刺激によって応答される腫瘍組織及び他の組織のいずれでも迅速にアップレギュレートされる可能性がある（文献４）。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路は活性化された後、癌、妊娠、組織移植、および自己免疫疾患において免疫系を抑制する。ＰＤ－Ｌ２（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、ＣＤ２７３、Ｂ７－ＤＣ ）の発現範囲は狭く、主に活性化されたマクロファージ、樹状細胞、肥満細胞での発現がアップレギュレートされる（文献５）。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２は、３７％の相同性配列を持つが、主な発現ベクターの違いにより、調節効果が異なる。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－Ｌ２と異なり、複数種の腫瘍細胞中に発現するため、ＰＤ－Ｌ１はがん免疫療法の分野におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ経路を研究するための主なリガンドとなる。
ＰＤ－Ｌ１はＣＤ８０（免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、そのリガンドは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４であり、自己免疫モニタリング、体液性免疫応答および移植応答において重要な役割を果たす）と結合することもできるため（文献６）、ＰＤ－Ｌ１を阻害するとＣＤ８０に対する妨害を解除できる可能性があり、Ｔ細胞活性を増強させる。医薬品の安全性の点から、ＰＤ－１は別の受容体ＰＤ－Ｌ２もあり、且つＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ２の親和性は、ＰＤ－Ｌ１の３倍であり（文献７）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＰＤ－Ｌ２と結合していない。理論的には、ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１やＰＤ－Ｌ２との関連を同時に遮断するが、ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との関連のみを遮断し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用を保持している。ＰＤ－Ｌ２は、肺や胃腸管の免疫寛容を維持するために非常に重要である。従って、ＰＤ－Ｌ１抗体は。ＰＤ－１抗体よりも、肺及び胃腸管への副作用が少ない可能性がある。ＰＤ－１阻害剤よりも、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、有効性及び安全性の点でより優れたパフォーマンスを発揮する可能性がある（文献８）。
現在、米国ＦＤＡでは、３つのＰＤ－Ｌ１抗体薬の販売を承認している（表１を参照）。
Figure 2022521958000002
その中、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂは、２０１６年５月に米国ＦＤＡによって最初に承認され、その後２年間で複数の適応症も承認されている（表２を参照）。
Figure 2022521958000003
２０１９年、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂは、欧州連合によって承認された、進行性非扁平上皮非小細胞肺がんのファーストライン治療に適されるＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ＋ベバシズマブ＋化学療法と、米国によって承認された、ＰＤ－Ｌ１陽性の進行性トリプルネガティブ乳がんのファーストライン治療及び進行性小細胞肺がんのファーストライン治療に適するＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ併用化学療法とを含む３つの難治性進行がんのファーストライン治療のための適応症もさらに承認されている。
他の市販されているＰＤ－Ｌ１抗体薬であるＡｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂは、さらに、転移性メルケル細胞がん、局所進行性又は転移性尿路上皮がん又は切除不能なステージＩＩＩ非小細胞肺がんなどの治療に承認されており、具体的には、表３－４に示す。
Figure 2022521958000004
Figure 2022521958000005
中国特許出願ＣＮ１０２２４５６４０Ａには、ＰＤ－Ｌ１抗体及びＴ細胞機能の増強による細胞媒介性免疫応答のアップレギュレートのためのその用途、並びにＴ細胞機能障害性疾患（感染症（例えば、急性および慢性）及び腫瘍免疫を含む）の処置におけるその用途を開示している。腫瘍免疫の標的となるガンは、乳がん（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、肺がん（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓がん（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓がん（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、唾液腺がん（ｓａｌｉｖａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａｓ）、甲状腺がん（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、胸腺がん（ｔｈｙｍｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、上皮がん（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒｓ）、胃がん及び膵臓がん（ｇａｓｔｒｉｃ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）を含む。
現在、各ＰＤ－Ｌ１抗体薬の承認された適応症及び既存の技術文献によると、同様のＰＤ－Ｌ１抗体であるが、対応する適応症にさまざまな面でまだ違いがあり、市販されている３つの抗体薬は、複数の第III相臨床試験の失敗、例えば、卵巣がんの適応症に関するＢａｖｅｎｃｉｏの３つの試験であるＪＡＶＥＬＩＮ Ｏｖａｒｉａｎ １００、ＪＡＶＥＬＩＮ Ｏｖａｒｉａｎ ２００及びＪＡＶＥＬＩＮ Ｏｖａｒｉａｎ ＰＡＲＰ １００もある。これは、満たされていない主要な臨床ニーズがまだ多数あることを示す。従って、より多くの薬効がさらに良く、より多い適応症に効果的なＰＤ－Ｌ１類阻害剤、特にＰＤ－Ｌ１を標的とするモノクローナル抗体を開発する緊急の必要性がある。
本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びこれらの抗体をコードするヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター及び発現ベクターの組み合わせを提供する。本発明は、さらに、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含むコンジュゲート又は医薬組成物を提供する。本発明は、さらに、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体のヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター、発現ベクターの組み合わせ、コンジュゲート又は医薬組成物の、がんを治療又は予防するための医薬品における用途を提供する。
本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、次の配列によって限定される抗体と同じＣＤＲ配列を持つか、又は次の配列によって限定される抗体のＣＤＲに１～２個のアミノ酸が置換され、前記配列によって限定される抗体は、
（１）重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示され、及び／又は
（２）軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示される単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント。
特定の実施形態では、異なる測定方法又は番号付けシステムに従って、対応する重鎖及び軽鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１～３は、表５に示す。
Figure 2022521958000006
さらに、本発明は、幾つかの具体的な実施形態において、以下の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、７、１３、１９又は２５で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、７、１３、１９又は２５に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ２アミノ酸配列配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、８、１４、２０又は２６で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、８、１４、２０又は２６に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、９、１５、２１又は２７で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、９、１５、２１又は２７に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は
（２）軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１０、１６、２２又は２８で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１０、１６、２２又は２８に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ２アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１１、１７、２３又は２９で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１１、１７、２３又は２９に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１２、１８、２４又は３０で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１２、１８、２４又は３０に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列である、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
さらに、幾つかの具体的な実施形態において、本発明で提供される単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、或いは
（２）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、或いは
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１５であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１５に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６～１８であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６～１８に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、或いは
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～２１であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～２１に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２～２４であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２～２４に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、或いは
（５）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２７であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２７に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３０であるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３０に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列である。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明で提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、その重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３であり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６である。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明で提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（１）重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１と同じＣＤＲ１～３を有し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に対して同一性が８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列、及び／又は
（２）軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２と同じＣＤＲ１～３を有し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に対して同一性が８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列から選ばれる１つの可変領域を含む。
本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）は、以下の通りである。
Figure 2022521958000007
本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）は、以下の通りである。
Figure 2022521958000008
幾つかの具体的な実施形態において、本発明で提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、（１）重鎖可変領域配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示され、及び／又は、（２）軽鎖可変領域配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示される。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明で提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、（１）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示され、及び／又は、（２）軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示される。
本発明で提供される抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体又はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂ、Ｆｄ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であることができる。さらに、前記抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。
本発明で提供される抗体は、さらに、ヒト又はマウス定常領域を含み、前記定常領域は、さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４から選ばれてもよい。前記ＩｇＧ２は、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂを含む。
本発明は、さらに、単離された、上記抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド、或いは上記抗体又は抗原結合フラグメント重鎖又は重鎖部分フラグメント及び軽鎖又は軽鎖部分フラグメントをコードするポリヌクレオチドの組み合わせを提供する。
本発明は、さらに、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸構築物又はベクターを提供する。
本発明は、さらに、上記核酸構築物又はベクターを含む宿主細胞であって、前記細胞は、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、大腸菌細胞又はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞であることができる宿主細胞を提供する。
本発明は、さらに、本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合部分及び薬物毒素を含む抗体－薬物コンジュゲートを提供する。前記薬物毒素は、細胞増殖を直接的または間接的に阻害するまたは細胞を殺すか、または体の免疫応答を活性化することによって細胞を阻害するまたは殺すことにより、腫瘍を治療することができる化学物質、毒素、ポリペプチド、酵素、同位体、サイトカイン、抗体又は他の生物学的活性を有する単体又は混合物から選ばれてもよく、好ましくは、インターロイキン、腫瘍壊死因子、ケモカイン、ナノ粒子、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアミシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、アドリアマイシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）である。
本発明は、さらに、本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント及び／又は上記コンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合フラグメントをコードするベクターを発現するのに適する条件下で上記宿主細胞を培養し、前記抗体又はフラグメントを回収することを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を作製する方法をさらに提供する。
本発明は、さらにＴ細胞機能を増強するための方法であって、有効量の本発明に係る上記医薬組成物を向機能不全のＴ細胞に投与することを含む、方法を提供する。
他の側面では、本発明は、がんを治療又は予防するための方法であって、治療有効量の本発明に係る抗体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター、コンジュゲート及び／又は医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
他の側面では、本発明は、本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、対応する核酸構築物又はベクター、抗体－薬物コンジュゲート、又は医薬組成物のがんを治療又は予防するための医薬品の調製における用途を提供する。
他の側面では、本発明は、本発明に係る抗体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター、コンジュゲート及び／又は医薬組成物のがんを治療又は予防するための用途を提供する。
さらに、前記がんは、固形腫瘍である。
さらに、前記固形腫瘍は、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫、膀胱がん、尿路上皮がん、腎臓がん、肝臓がん、唾液腺がん、胃がん、神経膠腫、甲状腺がん、胸腺がん、上皮がん、頭頸部がん、胃がん及び膵臓がんである。
さらに、前記肺がんは、非小細胞肺がんである。
さらに、前記卵巣がんは、トリプルネガティブ乳がんである。
他の側面では、本発明は、Ｔ細胞機能障害性疾患を治療するための方法であって、感染症、腫瘍免疫を含むＴ細胞機能障害性疾患を患っている患者に治療有効量の本発明に係る上記医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。前記腫瘍免疫は、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、唾液腺がん、胃がん、神経膠腫、甲状腺がん、胸腺がん、上皮がん、頭頸部がん、胃がん和膵臓がんから選ばれるの各がんによって引き起こされる。
本発明は、さらに本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、対応する核酸構築物又はベクター、抗体－薬物コンジュゲート、又は医薬組成物のがんを治療又は予防するための医薬品の調製における用途を提供する。
本発明で提供される抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、新たなＣＤＲ配列及びアミノ酸配列を有する、ＰＤ－Ｌ１を標的とする新規なモノクローナル抗体である。本発明で提供される抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１と驚くべき親和性及び特異性を有し、ヒトＰＤ－１に対してヒトＰＤ－Ｌ１に競合的に結合するの点で顕著な優位性を示す。本発明で提供される抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、非小細胞肺がん及び結腸直腸がんのインビトロ動物モデルでいずれも予想外の腫瘍阻害効果を示し、腫瘍進行を阻害するためのより良い選択を提供する。
図１は、ｈＡＡＧ５Ｄ８とヒトＰＤ－Ｌ１の親和性を示す結合解離曲線であり、ここで、番号１の曲線は、ｈＡＡＧ５Ｄ８の濃度が１００ｎＭであることを示し、番号２の曲線は、ｈＡＡＧ５Ｄ８の濃度が５０ｎＭであることを示し、番号３の曲線は、ｈＡＡＧ５Ｄ８の濃度が２５ｎＭであることを示す。 図２は、ｈＡＡＧ５Ｄ８とヒトＰＤ－１の競合的結合曲線を示す。 図３は、ｈＡＡＧ５Ｄ８と複数のＢ７ファミリータンパク質（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１及ＣＤ８０）との結合能力を示す。 図４は、ヒト非小細胞肺がん皮下異種移植腫瘍モデルにおけるｈＡＡＧ５Ｄ８（５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＰＤＬ３８２０Ａ（５ｍｇ／ｋｇ、陽性対照）、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（５ｍｇ／ｋｇ、陰性対照）の投与後の腫瘍増殖曲線を示す。 図５は、ヒト結腸直腸がん皮下異種移植腫瘍モデルにおけるｈＡＡＧ５Ｄ８（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ）、ＭＰＤＬ３８２０Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、陽性対照）、ＰＢＳ（陰性対照）の投与後の腫瘍体積変化の傾向を示す。
特に断りのない限り、本明細書で使用されるすべての科学的および技術的用語は、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。当分野の定義と用語については、当業者は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照することができる。アミノ酸残基の略語は、２０つの当分野で一般的に使用されているＬ－アミノ酸の１つである標準的な３文字及び／又は１文字のコードである。
本発明では、抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）測定または番号付け方法には、当技術分野で周知のＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔ法がある。
本発明では、２つの核酸又はアミノ酸配列間の「一致性」、「同一性」又は「類似性」とは、最良のアラインメント（最適なアラインメント）後に得られた比較対象の２つの配列間の同じヌクレオチド又は同じアミノ酸残基のパーセントを意味し、そのパーセントは、純粋に統計的であり、２つの配列間の違いがランダムに分布し、全長をカバーする。２つの核酸又はアミノ酸配列間の配列比較は、通常、これらの配列が最適な方法で一致した後に比較することによって実行され、前記比較は、セグメント又は「比較ウィンドウ」にて実行されることができる。手動で実行する以外は、配列を比較するための最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）［Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２］のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）［Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３］のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４）の検索法、それらのアルゴリズムを使用したコンピューターソフトウェア（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、又はＢＬＡＳＴ Ｎ ｏｒ ＢＬＡＳＴ Ｐ比較ソフトウェア）により実行することができる。
本明細書で使用される「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」とは、それが由来する抗体の重鎖または軽可変鎖の部分配列からなるか、それらを含む抗体フラグメントを指し、前記部分配列は、それが由来する抗体と同様の結合特異性及び十分な親和性を保持するのに十分であり、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の１／１００に少なくとも等しく、より好ましくは、１／１０に少なくとも等しい。このような機能的断片は、少なくとも５つのアミノ酸を含み、好ましくは、それが由来する抗体配列の１０、１５、２５、５０及び１００つの連続するアミノ酸を含む。（特に）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖抗体を含み、特異性抗原がポリペプチドに結合することを可能にするのに十分な少なくとも１つの免疫グロブリンフラグメントを含む。上記フラグメントは、合成、又は酵素法、又は無傷の免疫グロブリンの化学的切断によって作製することができ、或いは、組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学的に改良されることもできる。その製造方法は当技術分野でよく知られている。重鎖には、重鎖可変領域（ＶＨと略記）及び重鎖定常領域が含まれる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメイン（ｄｏｍａｉｎ）を含む。軽鎖には、軽鎖可変領域（ＶＬと略記）及び軽鎖定常領域が含まれる。その軽鎖定常領域は、ＣＬというドメインを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される可変性が高い複数の領域に細分することもでき、それらの相補性決定領域間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保守的な領域が点在してい。各ＶＨ及びＶＬは、いずれも３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（エフェクター細胞など）及び典型的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主の組織又は因子への結合を仲介することができる。キメラ又はヒト化抗体は、本発明に係る抗体にも含まれる。
「ヒト化抗体」という用語とは、非ヒト抗体に由来するＣＤＲ領域を含む抗体を指し、且つ、その抗体分子の他の部分は、１つ（又は複数）のヒト抗体に由来する。しかも、結合親和性を保持するために、フレームワーク（ＦＲと称される）領域のいくつかの残基を修飾することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２－５２５、１９８６、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４－１５３６、１９８８、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３－３２７、１９８８）。本発明に係るヒト化抗体又はそのフラグメントは、当業者に知られている技術によって作製されることができる（例えば、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４－２８５７、１９９２、Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１０：１－１４２、１９９２、又はＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９－１７５、１９９２を参照する）。
「キメラ抗体」という用語とは、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指し、例えば、可変領域配列はマウス抗体に由来し、定常領域配列はヒト抗体に由来する抗体である。本発明に係るキメラ抗体又はそのフラグメントは、遺伝子組換え技術を使用して作製されることができる。例えば、前記キメラ抗体は、前記組換えＤＮＡ包含プロモーター、本発明に係る非ヒト、特に、マウスモノクローナル抗体可変領域をコードする配列、及びヒト抗体定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより産生されることができる。このような組換え遺伝子によってコードされる本発明に係るキメラ抗体は、例えば、マウス－ヒトキメラ抗体であってもよく、該抗体の特異性は、マウスＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域によって決定される。キメラ抗体を作製する方法は、例えば、Ｖｅｒｈｏｅｙｎ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、８：７４、１９８８）を参照することができる。
「モノクローナル抗体」という用語とは、単一分子からなる抗体分子調製物である。モノクローナル抗体の組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
「単離された」核酸分子という用語とは、少なくとも１つの汚染核酸分子から識別および分離される核酸分子であり、それは、一般に、抗体核酸の天然の供給源においてその汚染核酸分子と関連している。単離された核酸分子は、その形態または環境の点で自然界に見られるものとは異なる。従って、単離された核酸分子は、天然細胞に存在する核酸分子とは異なる。しかしながら、単離された核酸分子は、通常は抗体を発現する細胞に含まれる核酸分子を含み、例えば、その細胞では、核酸分子は天然細胞とは異なる染色体位置に位置する。
通常、モノクローナル抗体又はその機能的断片、特に、マウス由来モノクローナル抗体又はその機能的断片を作製するために、特に、マニュアル「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」に記載の技術（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ、ｐｐ．７２６、１９８８）又はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって記述されたハイブリドーマ細胞による調製技術（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５－４９７、１９７５）を参照することができる。
以下、本発明の実施形態は、実施例と組み合わせて詳しく説明されるが、当業者は、以下の実施例が本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定していないことを理解すべきである。
実施例１ 抗ＰＤ－Ｌ１抗体の産生
マウスの免疫化後に得られた抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対する大量のスクリーニングを通して、候補マウス由来抗体ｍＡＡＧ５Ｄ８を決定した。さらに、抗体可変領域データベースで比較することにより、抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体ｍＡＡＧ５Ｄ８と高い相同性を持つヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を決定した。ｍＡＡＧ５Ｄ８については、複数のヒト化抗体をさらに設計し、その親和性を比較し、最終的に候補ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体ｈＡＡＧ５Ｄ８を決定した。
Figure 2022521958000009
抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化抗体ｈＡＡＧ５Ｄ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）：
Figure 2022521958000010
抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化抗体ｈＡＡＧ５Ｄ８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）：
Figure 2022521958000011
抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化抗体ｈＡＡＧ５Ｄ８の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）及び配列３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）に示された。
実施例２ ｈＡＡＧ５Ｄ８とヒトＰＤ－Ｌ１の親和性の比較
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）法を使用し、ヒトＰＤ－Ｌ１に対するｈＡＡＧ５Ｄ８の親和性を検出した。黒い９６ウェルプレートＡ～Ｄのカラム１、３、５には、それぞれ、ＰＢＳ溶液を加えてベースライン１、ベースライン２及び解離液とし、カラム２には、ＰＤ－Ｌ１溶液（Ｒ＆Ｄ公司）を加え、カラム４には、ｈＡＡＧ５Ｄ８溶液（濃度は、順に１００ｎＭ－５０ｎＭ－２５ｎＭ－０ｎＭである）、カラム１０には、イミダゾール溶液を加え、カラム１１には、水を加え、カラム１２には、硫酸ニッケル溶液を加えた。実験はＮｉ－ＮＴＡプローブ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ会社）を使用し、まず、プローブをＡ～Ｄのカラム１に浸入し、１８０ｓ保持してベースラインを安定させ、Ｎｉ－ＮＴＡプローブをＡ～Ｄのカラム２に浸入し、３００ｓ保持してＰＤ－Ｌ１をプローブに固定化させ、Ｎｉ－ＮＴＡプローブをＡ～Ｄのカラム３に浸入し、１２０ｓ保持してベースラインを安定させ、Ｎｉ－ＮＴＡプローブをＡ～Ｄのカラム４に浸入し、６００ｓ保持して異なる濃度のｈＡＡＧ５Ｄ８をプローブに固定化されたＰＤ－Ｌ１タンパク質と結合させ、Ｎｉ－ＮＴＡプローブをＡ～Ｄのカラム５に浸入し、６００ｓ保持し、抗体を自然に解離させた後、Ｎｉ－ＮＴＡプローブをＡ～Ｄのカラム１０、１１、１２に順に浸入し、プローブに固定化されたＰＤ－Ｌ１をプローブから強制的に解離させた。Ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０を使用してデータの解析を行い、結合解離平衡定数ＫＤを得た。
結果及び結論は、ｈＡＡＧ５Ｄ８とヒトＰＤ－Ｌ１の結合解離平衡定数ＫＤ値及び親和性結合解離曲線は、それぞれ表７及び図１に示した。実験結果は、ｈＡＡＧ５Ｄ８とヒトＰＤ－Ｌ１の親和性がＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の親和性（８．２μＭ）よりもはるかに高いことを示した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ａｎｄ ＣＴＬＡ－４ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｈｙｕｎ Ｔａｅ Ｌｅｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１９、２４、１１９０、 ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２４０６１１９０、２０１９年３月２６日、第４頁の最後の段落）。
Figure 2022521958000012
実施例３ ｈＡＡＧ５Ｄ８とヒトＰＤ－１の競合的結合
ＥＬＩＳＡ法によりｈＡＡＧ５Ｄ８がＰＤ－１と競合してＰＤ－Ｌ１に結合する能力を検出した。コーティングバッファー（６ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、１４ｍＭ ＮａＨＣＯ３）でＰＤ－Ｌ１（Ｆｃ Ｔａｇ）を１μｇ／ｍＬに希釈し、各ウェルに１００μＬ加え、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルにブロッキング溶液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ）２５０μＬを加えて２５℃で２ｈブロックし、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルに６μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬのヒトＰＤ－１を加え、同時に、段階的に希釈されたｈＡＡＧ５Ｄ８溶液（濃度が８０００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、３１．２５ｎｇ／ｍＬ、６．２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、均一に混合した後、２５℃で２ｈインキュベートし、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルに酵素標識二次抗体（１：５０００の比率で希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ）１００μＬを加え、２５℃でインキュベートし１ｈ、発色させ、４５０ｎｍで読み取り、４パラメーター方程式を使用してカーブフィッティングを行い、ＥＣ５０値を算出した。
結果及び結論は、ヒトＰＤ－Ｌ１に競合的に結合するｈＡＡＧ５Ｄ８のＥＣ５０値及び競合的結合曲線は、それぞれ表８及び図２に示した。実験結果は、ｈＡＡＧ５Ｄ８がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を効果的に阻害できることを示した。
Figure 2022521958000013
実施例４ ｈＡＡＧ５Ｄ８と複数の他のＢ７ファミリータンパク質の親和性
ｈＡＡＧ５Ｄ８と複数の他のＢ７ファミリータンパク質の親和性（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１及びＣＤ８０）をＥＬＩＳＡ法で検出した。コーティングバッファー（６ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、１４ｍＭ ＮａＨＣＯ３）でｈＡＡＧ５Ｄ８を１００ｎｇ／ｍＬに希釈し、各ウェルに１００μＬを加え、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルにブロッキング溶液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ）２５０μＬを加えて２５℃で２ｈブロックし、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルに濃度が５μｇ／ｍＬのタンパク質サンプル（ｒｈＰＤ－Ｌ１、ｒｈＰＤ－Ｌ２、ｒｈＢ７－Ｈ３、ｒｈＰＤ－１及びｒｈＣＤ８０）１００μＬを加え２５℃で２ｈインキュベートし、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルに酵素標識二次抗体（１：５０００の比率で希釈された二次抗体Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ）１００μＬを加え、２５℃で１ｈインキュベートし、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、発色させ、４５０ｎｍで読み取った。
結果及び結論は、ｈＡＡＧ５Ｄ８とＢ７ファミリータンパク質（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１及ＣＤ８０）の結合は、図３に示した。結果は、ｈＡＡＧ５Ｄ８がＰＤ－Ｌ１に特異的に結合できるが、ＰＤ－Ｌ２に結合していなく、関連する機能を持つ同じファミリーの他のタンパク質（Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１、ＣＤ８０）にも結合していないことを示し、それにより、ｈＡＡＧ５Ｄ８とＰＤ－Ｌ１の結合は、極に高い特異性を有することが分かった。
実施例５ ヒト非小細胞肺がんＨＣＣ８２７ ＮＣＧマウスの皮下移植腫瘍に対するｈＡＡＧ５Ｄ８の治療効果の研究
４～５週齢、体重２０～２６ｇ、高度免疫不全の雄性ＮＣＧ小マウス（南京大学のモデル動物研究センターから購入）１２匹を採取し、それぞれ尾静脈からヒト末梢血単核細胞ＰＢＭＣ（１×１０７ｃｅｌｌｓ／１００μｌ、健康なドナーの血液から単離）１００μｌを注射し、尾静脈注射の３日後、ヒト非小細胞肺がんＨＣＣ８２７細胞（ＡＴＣＣ）をマウスの右側に皮下接種し、接種の３日後（平均腫瘍体積は５７ｍｍ３）、マウスを３つの群（Ａ－１群、Ａ－２群、Ａ－３群）にランダムに分けし、各群あたり４匹であり、表９に示される投与スケジュールに従って投与した。実験では、同時に陽性対照及び陰性対照が設けられ、陽性対照は、ＭＰＤＬ３８２０Ａ（即ち、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）であり、陰性対照は、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（中美冠科（太倉）有限公司、バッチ番号はＡＢ１６００８３）である。４回目の投与の当日（即ち、腫瘍細胞接種後の１３日目）に、実験マウスをＣＯ２で安楽死させ、次に腫瘍を取り出し、それぞれ、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩＲＴＶ）及び腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ△ＴＶ）を算出して医薬品の有効性の評価を行った。
相対腫瘍阻害率の計算式は、ＴＧＩＲＴＶ＝１－ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ（％）である。（式中、ＴＲＴＶは、陽性対照群又は治療群の特定の時点における相対腫瘍体積（ＴＶ）であり、ＣＲＴＶは、陰性対照群の特定の時点における相対腫瘍体積であり、ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶは、陰性対照群に対する陽性対照群又は治療群の相対腫瘍体積の百分率であり、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０、Ｖ０は、群分けする時に該動物の腫瘍体積であり、Ｖｔは、治療後に該動物の腫瘍体積である。）
腫瘍増殖阻害率の計算式は、ＴＧＩ△ＴＶ％＝（１－ΔＴ／ΔＣ）×１００％である。（式中、ΔＴ＝陽性対照群又は治療群の特定の時点における平均腫瘍体積－陽性対照群又は治療群の投与開始時の平均腫瘍体積、ΔＣ＝陰性対照群の特定の時点における平均腫瘍体積－陰性対照群の投与開始時の平均腫瘍体積。）
結果及び結論は、ヒト非小細胞肺がんモデルに対するｈＡＡＧ５Ｄ８の腫瘍阻害効果をそれぞれ表１０及び図４に示し、ここで、表１０は、ヒト非小細胞肺がん細胞に対するｈＡＡＧ５Ｄ８の相対腫瘍阻害率及び腫瘍増殖阻害率を示し、図４は、投与後の腫瘍増殖曲線を示した。実験結果は、ｈＡＡＧ５Ｄ８がヒト非小細胞肺がん腫瘍に対して有意な阻害効果を示した。
Figure 2022521958000014
Figure 2022521958000015
実施例６ マウス結腸直腸がんＭＣ３８トランスジェニックマウスの皮下移植腫瘍に対するｈＡＡＧ５Ｄ８の治療効果の研究
ヒトＰＤ－１のトランスジェニック雌性Ｃ５７マウス３０匹（同済大学動物実験中心）を採取し、各マウスは、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する３×１０６個のマウス結腸直腸がん細胞（同済大学、細胞番号ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を左腹部に皮下移植し、腫瘍体積が約１００ｍｍ３程度に成長すると、上記マウスを、Ｃ－１群（陰性対照群、ＰＢＳ、６匹）、Ｃ－２群（陽性対照群、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、３ｍｇ／ｋｇ、６匹）、Ｃ－３群（投与群、ｈＡＡＧ５Ｄ８、１ｍｇ／ｋｇ、６匹）、Ｃ－４群（投与群、ｈＡＡＧ５Ｄ８、３ｍｇ／ｋｇ、６匹）、Ｃ－５群（投与群、ｈＡＡＧ５Ｄ８、９ｍｇ／ｋｇ、６匹））という５つの群にランダムに分け、週２回、合計５回腹腔内投与した。腫瘍体積を投与開始後１６日目まで週２回測定した。
計算式：
腫瘍体積：ＴＶ＝Ｄ１×Ｄ２２／２、（式中、Ｄ１、Ｄ２は、それぞれ腫瘍の長径、腫瘍の短径を示す。）
相対腫瘍体積：ＲＴＶ＝ＴＶＴ／ＴＶ１、（式中、ＴＶ１は、投与前の腫瘍体積であり、ＴＶＴは、各測定時の腫瘍体積である。）
相対腫瘍増殖率：Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％、（式中、ＴＲＴＶは、投与群又は陽性対照群のＲＴＶを示し、ＣＲＴＶは、陰性対照群のＲＴＶを示す。）
相対腫瘍阻害率：ＴＧＩＲＴＶ（％）＝（１－ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ）×１００％。
結果及び結論は、マウス結腸直腸がんに対するｈＡＡＧ５Ｄ８の腫瘍阻害効果をそれぞれ表１１及び図５に示し、結果は、濃度が３ｍｇ／ｋｇ及びそれ以上の用量のｈＡＡＧ５Ｄ８がマウス結腸直腸がんの皮下移植腫瘍に対して有意な阻害効果を有することが分かった。同様の３ｍｇ／ｋｇの用量では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の腫瘍阻害効果は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂよりも有意に優れた。
Figure 2022521958000016
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Claims (30)

  1. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、次の配列によって限定される抗体と同じＣＤＲ配列を有するか、又は次の配列によって限定される抗体のＣＤＲに１～２個のアミノ酸が置換され、前記配列によって限定される抗体は、
    （１）重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示され、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示される、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. （１）重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、７、１３、１９又は２５で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、７、１３、１９又は２５に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ２アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、８、１４、２０又は２６で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、８、１４、２０又は２６に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、９、１５、２１又は２７で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、９、１５、２１又は２７に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１０、１６、２２又は２８で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１０、１６、２２又は２８に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ２アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１１、１７、２３又は２９で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１１、１７、２３又は２９に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１２、１８、２４又は３０で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１２、１８、２４又は３０に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. （１）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、又は
    （２）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、又は
    （３）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１５で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１５に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６～１８で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６～１８に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、又は
    （４）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～２１で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～２１に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２～２４で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２～２４に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、又は
    （５）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２７で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２７に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であり、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３０で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３０に１つ又は２つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列である、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 重鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３で示され、及び／又は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６で示される、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. （１）重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１と同じＣＤＲ１～３を有し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に対して同一性が８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列であり、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２と同じＣＤＲ１～３を有し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に対して同一性が８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列である、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. （１）重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示され、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示される、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. （１）重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示され、及び／又は
    （２）軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示される、請求項６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  8. 前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体又はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂ、Ｆｄ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. 前記抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  10. さらに、ヒト又はマウス定常領域を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  11. 前記定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４から選ばれる、請求項１０に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  12. 前記定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂである、請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  14. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドと、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む、単離されたポリヌクレオチドの組み合わせ。
  15. 請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
  16. 前記核酸構築物は、ベクターである、請求項１５に記載の核酸構築物。
  17. 請求項１５に記載の核酸構築物又は請求項１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  18. 前記細胞は、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、大腸菌細胞又はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
  19. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分及び薬物毒素を含む、抗体－薬物コンジュゲート。
  20. 前記薬物毒素は、細胞増殖を直接的または間接的に阻害するまたは細胞を殺すか、または体の免疫応答を活性化することによって細胞を阻害するまたは殺すことにより、腫瘍を治療することができる化学物質、毒素、ポリペプチド、酵素、同位体、サイトカイン、抗体又は他の生物学的活性を有する単体又は混合物から選ばれ、好ましくは、インターロイキン、腫瘍壊死因子、ケモカイン、ナノ粒子、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアミシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、アドリアマイシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）である、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  21. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント及び／又は請求項１９又は２０に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  22. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体を作製する方法において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合フラグメントをコードするベクターを発現するのに適する条件下で、請求項１７又は１８に記載の宿主細胞を培養し、前記抗体又はフラグメントを回収することを含む、方法。
  23. 機能不全のＴ細胞に有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含む、Ｔ細胞機能を増強するための方法。
  24. Ｔ細胞機能障害性疾患を治療するための方法であって、感染症、腫瘍免疫を含むＴ細胞機能障害性疾患を患っている患者に治療有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  25. 前記腫瘍免疫は、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、唾液腺がん、胃がん、神経膠腫、甲状腺がん、胸腺がん、上皮がん、頭頸部がん、胃がん及び膵臓がんから選ばれる各がんによって引き起こされる、請求項２４に記載の方法。
  26. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載のポリヌクレオチドの組み合わせ、請求項１５に記載の核酸構築物、請求項１６に記載のベクター、請求項１９又は２０に記載の抗体－薬物コンジュゲート、或いは請求項２１に記載の医薬組成物の、がんを治療又は予防するための医薬品の調製における用途。
  27. 前記がんは、固形腫瘍である、請求項２６に記載の用途。
  28. 前記固形腫瘍は、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫、膀胱がん、尿路上皮がん、腎臓がん、肝臓がん、唾液腺がん、胃がん、神経膠腫、甲状腺がん、胸腺がん、上皮がん、頭頸部がん、胃がん、膵臓がん、メルケル細胞がんである、請求項２７に記載の用途。
  29. 前記肺がんは、非小細胞肺がんである、請求項２８に記載の用途。
  30. 前記卵巣がんは、トリプルネガティブ乳がんである、請求項２９に記載の用途。
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