JP2018536401A - 抗pd−l1抗体、その抗原結合フラグメントおよびその医療用途 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
現在、PD-L1に対するモノクローナル抗体の研究に関与する多国籍製薬会社がいくつかある。この抗体は、PD-1とPD-L1との結合をブロックすることにより、腫瘍に対する患者の自己免疫反応を最大化し、その結果として腫瘍細胞に対する殺傷目的を達成する。関連する特許は、例えば、特許文献1〜13である。
重鎖可変領域HCDR配列は、配列番号10〜12、配列番号16〜18に示され、軽鎖可変領域LCDR配列は、配列番号13〜15、配列番号19〜21に示される;
具体的には以下の通りである:
HCDR1は、NDYWX1(配列番号10)またはSYWMH(配列番号16)から選ばれ;
HCDR2は、YISYTGSTYYNPSLKS(配列番号11)またはRI X4PNSG X5TSYNEKFKN(配列番号17)から選ばれ;
HCDR3は、SGGWLAPFDY(配列番号12)またはGGSSYDYFDY(配列番号18)から選ばれ;
LCDR1は、KSSQSLFYX2SNQKX3SLA(配列番号13)またはRASESVSIHGTHLMH(配列番号19)から選ばれ;
LCDR2は、GASTRES(配列番号14)またはAASNLES(配列番号20)から選ばれ;
LCDR3は、QQYYGYPYT(配列番号15)またはQQSFEDPLT(配列番号21)から選ばれ;
X1は、NまたはTから選ばれ、X2は、RまたはHから選ばれ、X3は、NまたはHから選ばれ、X4は、HまたはGから選ばれ、X5は、GまたはFから選ばれる。
ヒト化抗体9-2の重鎖可変領域配列は、配列番号26で示され、ヒト化抗体9-2の軽鎖可変領域配列は、配列番号27で示される;
ヒト化抗体24D5の重鎖可変領域配列は、配列番号28で示され、ヒト化抗体24D5の軽鎖可変領域配列は、配列番号29で示される。
本発明は、さらに、前記の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするDNA分子を含む発現ベクターを提供する。
本発明は、さらに、前記の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。ここで、宿主細胞は、細菌、酵母および哺乳類細胞からなる群より選ばれ、好ましくは、哺乳類細胞である。
本発明の他の好ましい実施態様において、本明細書に記載される宿主細胞は酵母であり、好ましくはピキア・パストリス(Pichia pastoris)である。
本発明の他の好ましい実施態様において、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントが本明細書で提供され、抗原結合フラグメントはFab、Fv、scFvまたはF(ab’)2である。
本発明をより理解しやすくするため、専門用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の場所で具体的に定義される場合を除き、本明細書で使用される他のすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般に理解される意味を持つ。
タンパク質の設計と発現
Sino Biological Inc.からの全長ヒトPD-L1遺伝子(UniProt Programmed Cell Death1 Ligand1(PD-L1)アイソフォーム1(配列番号1)(HG10084-M))を、本発明のPD-L1に対する鋳型として使用し、本発明の抗原および検出タンパク質をコードする遺伝子配列を得た。任意に、抗体重鎖Fcフラグメント(例えば、ヒトIgG1)を組み換え、pTT5ベクター(Biovector、カタログ番号102762)またはpTargeTベクター(promega、A1410)にそれぞれクローン化し、293F細胞(Invitrogen、R79007)に一過性に発現させ、またはCHO-S細胞(Invitrogen、k9000-20)に安定的に発現させ、精製して、本発明の抗原および検出タンパク質を得た。ヒトPD-1遺伝子は、ORIGENEから購入した(番号SC117011、NCBI参照配列:NM_005018.1)。
MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERTH LVILGAILLC LGVALTFIFR LRKGRMMDVK KCGIQDTNSK KQSDTHLEET
配列番号1
(注記)
二重下線部分はシグナルペプチド(シグナルペプチド:1〜18)を示し;
下線部分は、PD-L1の細胞外ドメイン(細胞外ドメイン:19〜238)を示し、ここで、19〜127はIg-like V-type Domainを示し、133〜225はIg-like C2-type Domainを示し;
点線部分は膜貫通領域(膜貫通領域:239〜259)を示し;
イタリック体部分は細胞質領域(細胞質領域:260〜290)を示す。
FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERGS GAKFVAAWTL KAAAHHHHHH
配列番号2
(注記)
下線部分はPD-L1の細胞外ドメインを示し;
点線部分はPADREタグを示示し;
イタリック体部分はHis6タグを示す。
FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERDY KDDDDKHHHH HH
配列番号3
(注記)
下線部分はPD-L1の細胞外ドメインを示し;
点線部分はFlag-Tagを示し;
イタリック体部分はHis6-tagを示す。
VKL-PD-L1 (ECD)-Fc (human IgG1)
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号4
(注記)
下線部分はPD-L1の細胞外ドメインを示し;
イタリック体部分はヒトIgG Fcを示す。
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号5
(注記)
下線部分はPD-1の細胞外ドメインを示し;
イタリック体部分はhFc(ヒトIgG1)を示す。
1.HisおよびPADREを持つ組換えタンパク質PD-L1:PD-L1 (ECD)-PADRE-His6(配列番号2)の精製手順
発現細胞を含む上清サンプルを高速遠心分離して混入物を除去し、緩衝液をPBSに交換して、イミダゾールを終濃度5 mMで添加した。ニッケルカラムは、5 mMイミダゾールを含むPBS溶液で平衡化し、カラム体積の2〜5倍量で洗浄した。その後、上清サンプルをNiカラム(GE、17-5318-01)に添加した。カラムは、A280測定値がベースラインに戻るまで、5 mMのイミダゾールを含むPBS溶液で洗浄した。次に、カラムを、10 mMイミダゾールを加えたPBSで洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去し、溶出液を集めた。標的タンパク質は、300 mMイミダゾールを含むPBS溶液を用いて溶出させ、溶出ピークを集めた。集められた溶出液を濃縮し、クロマトグラフィーゲル・スーパーデックス(Superdex)200(GE)によりさらに精製した。移動相はPBSとした。不適正なピークを除去し、溶出ピークを集めた。得られたタンパク質は、電気泳動、ペプチドマッピング(Agilent、6530 Q-TOF)およびLC-MS(Agilent、6530-TOF)により同定し、誤りのないサンプルを使用のために分取した。HisおよびPADREタグを持つPD-L1タンパク質((PD-L1 (ECD)-PADRE-His6 E(配列番号2))を取得し、本発明の抗体のための免疫源として使用した。
サンプルは、高速遠心分離して混入物を除去し、適当な量まで濃縮した。前述の通り、IMACカラムから溶出されたタンパク質は、0.5×PBSで平衡化したflagアフィニティーカラム(Sigma、A2220)に添加し、カラムは、カラム体積の2〜5倍量で洗浄した。上清サンプルは、混入物を除去した後、カラムに添加した。カラムは、A280測定値がベースラインに低下するまで、0.5×PBSで洗浄した。次に、カラムを0.3 M NaClを含むPBSで洗浄し、不純物のタンパク質を洗い流し、集めた。標的タンパク質は、0.1 M 酢酸(pH 3.5〜4.0)で溶出し、集め、pHを中性に調整した。集めた溶出液を濃縮し、クロマトグラフィーゲル・スーパーデックス(Superdex)200(GE)によりさらに精製した。移動相はPBSとした。不適正なピークを除去し、溶出ピークを集めた。得られたタンパク質は、電気泳動、ペプチドマッピング(Agilent、6530 Q-TOF)およびLC-MS(Agilent、6530-TOF)により同定し、誤りのないサンプルを使用のために分取した。HisおよびFlagタグを持つPD-L1タンパク質(PD-L1 (ECD)-Flag-His6(配列番号3)を取得し、本発明の抗体の性能試験に使用した。
発現細胞を含む上清サンプルを高速遠心分離して混入物を除去し、適当な量まで濃縮した後、Protein Aカラム(GE、17-5438-01)に添加した。カラムは、A280測定値がベースラインに低下するまで、0.5×PBSで洗浄した。標的タンパク質は、100 mM酢酸ナトリウム(pH 3.0)で溶出させた。標的タンパク質を中和するために、1 M Tris HClを用いた。次に、中和したタンパク質を、PBSで平衡化したゲルクロマトグラフィースーパーデックス(Superdex)200(GE)によりさらに精製した。不適正なピークを除去し、溶出ピークを集めた後、誤りのないサンプルを使用のために分取した。この方法は、PD-L1 (ECD)-Fc(配列番号4)およびPD-1 (ECD)-Fc(配列番号5)の精製に使用した。PD-1 (ECD)-Fcは、本発明の免疫抗原または検出試薬として使用することができ、またPD-1 (ECD)-Fcは、本発明の抗体の性能試験に使用する。
1.免疫化
抗ヒトPD-L1モノクローナル抗体を、マウスを免疫することにより製造した。実験用のSJL白色マウス、雌性、6週齢(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.、動物生産許可番号:SCXK (Beijing) 2012-0001)。飼育環境:SPFレベル。
マウスを購入した後、この動物を実験室で、12/12時間の明暗サイクル、温度20〜25℃、湿度40〜60%で1週間飼育した。環境に馴化したマウスを、2種のスキーム(AおよびB)に従って免疫した。各グループは6〜10匹とした。免疫抗原は、HisおよびPADREタグを持つPD-L1(PD-L1 (ECD)-PADRE-His6(配列番号2))であった。
高い血清抗体力価および構築基盤(試験例1に記載されたELISA試験を参照)に役立つ力価を有するマウスを、脾細胞融合のために選抜した。ショック免疫化は、脾細胞融合の72時間までに、10 μg/マウスのPD-L1-Hisをi.p.投与することにより行った。ハイブリドーマ細胞は、最適化されたPEG介在融合手順を用いて、脾臓リンパ細胞をミエローマSp2/0細胞(ATCC(登録商標)、CRL-8287TM)と融合することにより得た。ハイブリドーマ細胞は、HAT完全培地(20%FBS、1×HATおよび1×OPIを含むRPMI-1640培養液)に再懸濁し、96ウェル細胞培養プレート(1×105/150 μL/ウェル)で、37℃、5%CO2でインキュベートした。融合後第5日に、HAT完全培地を、50 μL/ウェルで細胞に添加した後、5%CO2および37℃でインキュベートした。融合後7〜8日に、増殖細胞の密度に従って、すべての培養液を、200 μL/ウェルでHT完全培地(20%FBS、1×HTおよび1×OPIを含むRPMI-1640培養液)に交換した後、5%CO2および37℃でインキュベートした。
融合後第10〜11日に、増殖細胞の密度に従って、PD-L1結合についてELISAアッセイを行った(試験例1を参照)。ELISAアッセイ(試験例1)で検出された陽性細胞について、PD-L1/PD-1結合の遮断を、ELISA分析(試験例2を参照)により検出した。陽性ウェル中の培養液を交換し、陽性細胞を、細胞密度に応じて24ウェルプレートで増やした。再試験後、24ウェルプレートに移された細胞を、育種保存および初回サブクローニング用とした。初回サブクローンスクリーニング(試験例1を参照)間の陽性細胞は育種保存用であり、2回目のサブクローニングを行った。2回目のサブクローニング(試験例1を参照)間の陽性細胞は、育種保存およびタンパク質発現用とした。PD-L1とPD-1との結合に対する遮断効果(試験例2を参照)を有するハイブリドーマ細胞は、複数の細胞融合により得られた。
>9-2 mVH:ハイブリドーマクローン9-2のマウス抗体重鎖可変領域配列
EVQLQESGPGLAKPSQTLSLTCSVAGYSITNDYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYTGSTYYNPSLKSRLSITRDTSKNQYYLQLNSVTAEDTAIYYCARSGGWLAPFDYWGRGTTLTVSS
配列番号6
>9-2 mVL:ハイブリドーマクローン9-2のマウス抗体軽鎖可変領域配列
DIVMSQSPSSLVVSVGEKVIMSCKSSQSLFYRSNQKNSLAWYQQKPGQSPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTVTISSVKAEDLAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKLEIK
配列番号7
(注記)
順序は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、イタリック体部分はFR配列を示し、また下線部分はCDR配列を示す。
24D5-VH:ハイブリドーマクローン24D5のマウス抗体重鎖可変領域配列
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVQQRPGQGLEWIGRIHPNSGGTSYNEKFKNRATLTVDKSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYSARGGSSYDYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号8
24D5-VL:ハイブリドーマクローン24D5のマウス抗体軽鎖可変領域配列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDATTYFCQQSFEDPLTFGAGTKLELK
配列番号9
(注記)
順序は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、イタリック体部分はFR配列を示し、また下線部分はCDR配列を示す。
ここで、配列番号10のX1がNである場合、配列は、配列番号38と名付けられ;
配列番号17のX4がHであり、配列番号17のX5がGである場合、配列は、配列番号39と名付けられ;
配列番号13のX2がRであり、配列番号13のX3がNである場合、配列は、配列番号40と名付けられる。
1.ハイブリドーマクローン9-2に対するヒト化フレームワーク配列の選択
IMGTヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子データベースおよびMOEソフトウェアを用いて整列した後、9-2および24D5に高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を鋳型として選択し、この2つのマウス抗体のCDRを、対応するヒト由来鋳型に移植して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順序で可変領域配列を形成した。
>9-2 hVH-CDRグラフト
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWNWIRQHPGKGLEWIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS
配列番号22
>9-2 hVL CDRグラフト
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYRSNQKNSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK
配列番号23
(注記)
順序は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、イタリック体部分はFR配列を示し、また下線部分はCDR配列を示す。
例えば、P49Sは、Kabat付番方式に従う49位での、PからSへの復帰突然変異を示す。
「Grafted」は、マウス抗体CDRが、ヒト生殖細胞系列FR配列中に移植されたことを示す。
この表は、種々の変異についての様々な配列組み合わせを示す。例えば、9_2-2は、ヒト化マウス抗体9-2に、2箇所の変異(軽鎖h9_2_VL1および重鎖h9_2-VH.1A)があることなどを示す。
PD-L1ハイブリドーマモノクローナル抗体24D5の96位にセリンが位置しており、一方で、保存されたシステインが生殖細胞系列遺伝子のFR3に位置している。このことと、22位のシステインから、鎖内ジスルフィド結合が形成される。発明者らは、96位でセリンからシステインへの復帰突然変異を有する24D5キメラ抗体および24D5の他のキメラ抗体を構築した。2つの形式のキメラ抗体の親和性は、ハイブリドーマ抗体の親和性と一致する。24D5の96位での変異は骨格で生じ、設計スキームに影響を与えないため、ヒト化抗体はCDR移植戦略により仕上げた。
>24D5 ヒト化重鎖可変領域VH.1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIHPNSGGTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS
配列番号24
>24D5 ヒト化軽鎖可変領域VL.1
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
配列番号25
(注記)
順序は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、イタリック体部分はFR配列を示し、また下線部分はCDR配列を示す。
例えば、Y91Fは、Kabat付番方式に従う91位での、YからFへの復帰突然変異を示す。
「Grafted」は、マウス抗体CDRが、ヒト生殖細胞系列FR配列中に移植されたことを示す。
この表は、種々の変異についての様々な配列組み合わせを示す。例えば、5は、ヒト化マウス抗体5に、2箇所の変異(重鎖h24D5_VH.1Aおよび軽鎖h24D5_VL.1)があることなどを示す。
プライマーを設計し、また各ヒト化抗体のVH/VK遺伝子フラグメントをPCRにより構築した後、相同組換えによって発現ベクターpHr(シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子(CH1-FC/CL)フラグメントを有する)中に挿入し、抗体発現ベクター:VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHrの全長を構築した。
オンラインソフトウェアアDNAWorks(バージョン3.2.2)(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)を用いて、組換えに必要なVH/VK遺伝子フラグメント:5’-30bpシグナルペプチド+VH/VK+30bp CH1/CL-3’を合成するための複数のプライマーを設計する。プライマー設計の規則:標的遺伝子2と標的遺伝子1との間に2つの異なるaaがある場合、図1に示されるように、変異部位を含む他のプライマーを設計した。
2.フラグメントスプライシング:
TaKaRa社プライマーSTAR GXLからのDNAポリメラーゼに対する操作説明書に従い、上記で設計されたプライマーを使用して、必要な組換え遺伝子を含むVH/VK遺伝子フラグメントを、二段階PCRにより増幅した。
3.発現ベクターpHr(シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子(CH1-FC/L)フラグメントを有する)の構築および酵素消化:
発現ベクターpHr(シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子(CH1-FC/CL)フラグメントを有する)を設計し、図2に示されるように、認識する配列が制限酵素部位とは異なるBsmBIなどの特殊な制限エンドヌクレアーゼを用いることにより構築した。BsmBIでベクターを消化し、ゲルは抽出して、使用のために保存した。
4.発現ベクターVH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHrの組換え構築:
BsmBI により消化された組換え発現ベクターpHr(シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子(CH1-FC/CL)フラグメントを有する)に必要である遺伝子フラグメントを含むVH/VKを、3:1の比率でDH5Hコンピテント細胞に添加し、氷上0℃で30分間インキュベートし、42℃で90秒間熱ショックを与え、5倍量のLB培養液を加え、37℃で45分間インキュベートし、LB-Ampプレート上にコートし、そして37℃で一晩培養した。単一のクローンを配列決定のために拾い上げ、興味の持てるクローンを取得した。
5.プラスミドを本実施例の設計に従って構築した後、純化タンパク質を実施例2に従って発現させた。得られたタンパク質の親和性は、検出例SPRにより測定した。
6.結果:
9_2-2の親和性をBIACORE(試験例4)により測定した。その親和性はキメラ抗体と類似しており、さらに復帰突然変異が増えると親和性のわずかの増加が観察された。良好な親和性は、抗体24D5のCDRをヒト化鋳型に直接組み込むことにより得られたが、キメラ抗体自体の親和性は、ハイブリドーマ抗体より弱かった。脱グリコシル化のためのN85Eの軽鎖への導入は、産生物の均一性を改善し、親和性には影響を与えなかった。
最終的に、ヒトPD-L1-hisまたはハイブリドーマ抗体への復帰突然変異を有するヒト化変異体の親和性を検査するために、BIACOREを使用した。ヒト化復帰突然変異部位および配列組み合わせは、表5に示されるように選択した。
1.ヒト化9-2-2および24D5ファージミドベクターの構築
ヒト化9-2-2および24D5は、野生型配列(すなわち、親和性増強スクリーニングから得られた変異配列と比較して本来または最初の配列)として、scFv型のファージミドベクター(VH-3 (GGGGS)-VL)中にそれぞれ構築した。オーバーラップPCRを用いて、VH, 3リンカー(GGGGS)およびVLをスプライスした後、NcoIおよびNotI切断部位を用いてファージミドベクター中に連結した。
2.ファージディスプレイライブラリーの構築
変異体ライブラリーを、構築された野生型scFvを鋳型として用い、またコドンに基づくプライマーを用いて構築した。プライマー合成の過程において、変異領域における各コドンは、野生型コドンの50%を、また50%のNNK(逆方向プライマーに対するMNN)を持ち、すべてのCDR領域に導入した。PCRフラグメントは、NcoIおよびNotIを用いて消化し、ファージミドベクター中に連結して、最終的には、E.coli TG1に電気的に形質転換した。コドンに基づく各プライマーは、独立したライブラリーとして確立し、その中で、9-2-2は7ライブラリーに分けられ、24D5は8ライブラリーに分けられた。
3.ライブラリーパニング
ビオチン標識ヒトPD-L1 (ECD) 抗原およびストレプトアビジン磁気ビーズを、液相パニングに対して使用した。ライブラリーの救済によって、スクリーニングで使用された相粒子をまとめた後、スクリーニングの各ラウンドにおいて、抗原濃度をその前ラウンドに対して下げた。3ラウンドのパニング後、9-2-2抗体および24D5抗体の250クローンをそれぞれ拾い上げ、次に、ファージELISAを行って結合活性を検知し、陽性クローンを配列決定した。
4.親和性の検出のための表面プラズモン共鳴法(SPR)
配列決定するクローンに関して配列分析後、非重複配列を、重複性配列の除去後、哺乳類細胞発現のために全長IG(γ1、κ)中に形質転換した。アフィニティー精製後、全長IGを、親和性アッセイ用のBIAcore(登録商標)X-100装置(GE Life Sciences)により測定した。
>9-2 hVH (T)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS
配列番号26
ここで、X1がTの場合、CDR1は配列番号10である。
>9-2 hVL (H)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK
配列番号27
ここで、X2がTであり、X3がHである場合、CDR1は配列番号13である。
親和性増強:
>24-D5 hVH (GF)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS
配列番号28
ここで、X4がGであり、X5がFである場合、CDR2は配列番号17である。
>24-D5 hVL
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
配列番号29
(注記)
順序は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、イタリック体部分はFR配列を示し、また下線部分はCDR配列を示す。二重下線部位は、スクリーニング後、親和性増強により得られた。
PD-L1は活性化T細胞にも発現するため、野生型IgG1定常領域の使用は、ADCCやCDCなどのFc介在性作用を誘導し、活性化T細胞の減少に至る。D265A、N297A、L234A/L235AまたはL234F/L235AなどのIgG1 Fcにおける変異はADCCを低下させ、またP331Sまたは331位付近の変異はCDCを低下させる。IgG2およびIgG2/4 Fcハイブリダイゼーション抗体の変異も、ADCCやCDC効果を低下させる。本明細書においては、IgG4変異体を選択し、ADCCおよびCDCのない抗体を取得した。従って、親和性増強により得られたクローンはIgG4型に変換され、IgG4のコアヒンジ領域は、S228P変異を含む。この変異は、コアヒンジ領域におけるジスルフィド結合の結鎖を強化し、それによって、IgG4 Fabアームの交換を防止し、半分子抗体の形成を大幅に減らす。また、F234AおよびL235Aの変異(mAbs 4: 3, 310-318; 2012年5月/6月)をさらに導入した。IgG4変異抗体のこの型は、CH2ドメインを変え、Fc受容体との相互作用を減らして、ADCC活性の低下効果を実現する。本実施例によれば、純化された9-2 H2L10抗体が発現され、HRP00049と命名された。また、発現された24D5 29H1 GFは、HRP00052と命名された。これらのタンパク質は、試験例においてさらに確認される。
HRP00049:9-2 (H2/L10) IgG4 (AA) (S228P)
重鎖:HRP00049抗体の重鎖配列
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号30
CAGGTGCAACTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTCGTGAAACCCTCCCAGACCCTGAGCCTGACCTGTACCGTGAGCGGCGGCAGCATCAGCAACGACTACTGGACTTGGATCAGGCAGCACCCCGGCAAAGGCCTGGAGTACATCGGCTACATCAGCTACACCGGCTCCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGGGTGACCATCAGCCGGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCTGCCGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCAGAAGCGGCGGATGGCTGGCCCCTTTCGACTACTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
配列番号31
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号32
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATAGCCTGGCTGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGTTCTACCATAGCAACCAGAAGCACAGCCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAACCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCACAAGAGAGAGCGGAGTGCCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACGGCTACCCTTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号33
重鎖:HRP00052抗体の重鎖配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号34
CAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGTGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCAAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGGGCCCAACAGTGGTTTCACTAGCTACAATGAAAAGTTCAAGAACAGGGTAACCATGACCAGGGACACCTCCACCAGCACAGTGTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCAGCAGCTACGACTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
配列番号35
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号36
GACATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCCTCACTTGCCGTGAGCCCCGGTCAGAGGGCCACCATCACCTGTAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACTATCAACCCCGTGGAGGCCGAGGACACCGCCAACTACTACTGCCAGCAGAGCTTCGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号37
(注記)
下線部分は、抗体重鎖もしくは軽鎖の可変領域配列または同一のものをコードするヌクレオチド配列である;無線部分は、抗体定常領域配列およびそれに対応するコードされたヌクレオチド配列である。
マイクロタイトレーションプレートを、1 μg/mL(100 μg/ウェル)のPD-L1 (ECD)-Fc(配列番号4)で直接コートし、4℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを、150 μL/ウェルの5%スキムミルク(BD、232100)を含むPBSでブロックし、4℃で一晩インキュベートした;プレートは2回洗浄し、細胞上清を50 μL/ウェルで各ウェルに添加した。プレートは、37℃で2時間インキュベートした;プレートを3回洗浄し、KPLミルク(KPL、50-82-01)で1:5000の比率で希釈したペルオキシダーゼ-AffiniPureヤギ抗ヒトIgG(Jackson、115-035-003)を、50 μL/ウェルで各ウェルに添加した。プレートは、37℃で1時間インキュベートした;プレートを4回洗浄し、TMBを50 μL/ウェルで各ウェルに添加して、プレートを37℃で10分間インキュベートした。反応は、1 M H2SO4を50 μL/ウェルで各ウェルに添加することにより停止した;波長450 nmでのOD値を、ELISAマイクロプレートリーダー(BMG Labtech、NOVOStar)で読み取った。
ビオチン(同仁化学、LK03:3サンプル)およびアビジン(Sigma、S2438-250UG)の希釈は、6%BSA(0.1%ツイーン20を含むPBSで希釈)で行い、PBSはコーティング溶液として使用した;マイクロタイトレーションプレートを、1 μg/mL(100 μg/ウェル)のPD-L1 (ECD)-Fc(配列番号4)で直接コートし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを3回洗浄し、3%BSA(0.1%ツイーン20を含むPBSで希釈)を用いて37℃で2時間ブロックした。プレートを3回洗浄し、細胞上清を50 μL/ウェルで各ウェルに添加した。次に、bio-PD-1-Fc(ビオチン標識PD-1-Fc、配列番号5、2 μg/mL、PD-1-FCは、同仁化学キットであるビオチン標識キット-NH2、LK03:3サンプルの方法に準じて標識した。)を、50 μL/ウェルで各ウェルに添加した。これをボルテックスにより十分に混合し、37℃で1時間インキュベートした;プレートを6回洗浄した後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼポリマー(S2438-250UG、Sigma、本品は1:400の比率で希釈した。)を50 μL/ウェルで添加し、室温で50分間、シェーカー上でインキュベートした。プレートを6回洗浄した後、TMBを100 μL/ウェルで添加し、37℃で5〜10分間展開させた。次に、反応を、1 M H2SO4を100 μL/ウェルで添加することにより停止した。450 nmの吸光度値を、マイクロプレートリーダー(BMG Labtech、NOVOStar)で読み取り、PD-1抗体とリガンドPD-L1との結合を遮断するIC50値を算出した。PD-L1/PD-1結合における本発明のヒト化抗体の遮断活性は、以下の表6に示される。
同様の一点遮断アッセイは、ハイブリドーマ抗体の選抜においても使用した。
このアッセイは、PD-L1とPD-1との結合に関する抗PD-L1抗体の遮断アッセイ(試験例2)と同類であった。試験例2でのBio-ヒトPD-1 (ECD)-FCを、bio-ヒト-B7.1(ヒトB7.1、Sino Biological、10698-H03H-200)と置き換え、他の手順は同一であった。さらに、発明者らは、PD-L2-Fc(Q9BQ51、細胞外ドメイン(aa20〜aa220))における抗PD-L1抗体の特異的な遮断および抗PD-1抗体結合を同様に検出した。また、被験抗体は、PD-L2とPD-1との結合は遮断しないことを見い出した。
同様の一点遮断アッセイは、ハイブリドーマ抗体の選抜においても使用した。
PD-L1とB7.1との結合およびPD-L2とPD-1との結合に対する本発明のヒト化抗体の遮断活性は、以下の表6に示される。
抗ヒト捕捉抗体は、本発明の抗PD-L1抗体を親和性捕捉するために、抗ヒトトラッピングキット(GE、BR-1008-39)使用説明書に記載された方法に従って、CM5バイオチップ(GE、BR-1000-12)に共有結合させた。次に、一連の濃度のヒトPD-L1抗原(Sino biological、10084-H08H-200)をバイオチップ表面に流し、ビアコア装置(GE、BiacoreX100)を用いて、リアルタイムで反応シグナルを検出し、結合解離曲線を得た。最終的に、フィッティングにより親和性値を得た。実験における解離の各サイクルが終了した後、バイオチップを洗浄し、抗ヒト捕獲キット(GE)の再生溶液を用いて再生した。得られたデータは、GEのBIA評価ソフトウェアにより、1:1(ラングミュア)結合モデルを用いて分析した。Ka値(kon)、kd値(koff)およびKD値をアッセイにより決定した。ハイブリドーマ抗体およびヒト化抗体の親和性は、他の実施例において要約した。以下の表7は、ヒトPD-L1抗原(huPD-L1-his、Sino biological、10084-H08H-200)、カニクイザルPD-L1抗原(Cyno PD-L1-his、Sino biological、90251-C08H-100)およびマウスPD-L1抗原(Mouse PD-L1-his、Sino biological、50010-M08H-100)に対する、親和性増強を行った抗体および対照抗体の親和性を示す。
抗体により影響を受ける新鮮ヒト末梢血単核球(PBMC)増殖アッセイを行い、抗PD-L1抗体に関する細胞活性を検出した。
新鮮ヒトPBMC(健康人から無作為に採取した)を2×106/mLの密度に調整し、6ウェルプレートに2 mL/ウェルで播種して、5%CO2、37℃で6時間インキュベートした。懸濁細胞を捨てた後、各ウェルの接着細胞を、100 ng/mLのGM-CSF(顆粒球コロニー刺激生物学的因子、Peprotech、AF-300-03)および100 ng/mLのIL-4(Peprotech、AF-200-04)を含むRPMIl640培養液2 mLと混合した。インキュベーション後2日で、100 ng/mLのGM-CSF および100 ng/mLのIL-4を含むRPMIl640培養液1 mLをさらに添加し、その後細胞を継続して2日間培養した後、100 ng/mLのTNF-α(腫瘍壊死因子-α、Peprotech、AF-300-01A)を各ウェルに添加し、さらに2日間培養して成熟樹状細胞を得た。樹状細胞および同種T細胞を遠心分離し、それぞれ1×106/mLおよび1×105/mLの濃度で再懸濁し、100 μL/ウェルで96ウェルプレートに分注した。次に、PBSで種々の濃度に連続的に希釈した抗体を、20 μL/ウェルで添加した後、5%CO2、37℃、インキュベーター中で培養した。その後、CellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存率アッセイキットを用いる細胞増殖の検出のために100 μLを採取した。同時に、サイトカインIFN-γ(インターフェロン-γ)の分泌を測定した。
ツベルクリン刺激PBMC増殖に対する被験抗体HRP00052およびHRP00049ならびに参照抗体の活性を、インビトロで測定した。
15 mLの新鮮PBMC、約3×107を、20 μLのツベルクリン(Shanghai Biyou Biotechnology、カタログ番号97-8800)に添加し、混合物をインキュベーター中で、5%CO2、37℃で5日間インキュベートした。第6日に、培養した細胞を遠心分離し、5×105細胞/mLに調整した密度で、新鮮培養液に再懸濁した。190 μLの再懸濁した細胞を96ウェルプレートに添加し、また、ヒト化抗体HRP00052またはHRP00049を10 μL/ウェルで96ウェル細胞培養プレートの対応するウェルに添加し、10 μLのPBSを対照およびブランク群にそれぞれ添加した。次に、細胞培養プレートを、インキュベーター中で、5%CO2、37℃でインキュベートし、72時間後に、PBMC増殖(Promega、カタログ番号G7571)およびIFN-γ分泌(Neo Bioscience、カタログ番号EHC102g)を測定した。結果は以下の表9に示される。
本試験では、ヒト神経膠芽腫U87MG細胞を、免疫不全マウスに播種した。腫瘍が形成された後、抗CD3抗体により活性化したヒトPBMCを腫瘍組織に注入し、神経膠芽腫U87MG腫瘍を皮下注射したマウスの治療における、抗PD-L1抗体の効果を評価した。
PBMCは、二人の志願者から提供された血液から単離し、培養し、抗CD3抗体(Miltenyi Biotec、130-093-387)により活性化した。U87MG細胞は、SCIDマウス(Vital River 11400700081219)の右肋骨部皮下に播種し、2週間後、腫瘍体積≧40 mm3となったときに、体重または腫瘍サイズが過大または過少となったマウスを除外した。残りのマウスを、腫瘍体積に従って無作為に群分けした。二人の志願者に由来するPBMCを、抗CD3抗体で刺激した後、1:1の比率で混合し、腫瘍組織に注入した。これと同時に、抗体またはブランクベクター(5%グルコース溶液)の皮下注射を開始した。投与は、第0、7、14および21日に、それぞれ1回、合計で4回行った。
結果を表10に示すが、投与量3 mg/kgの抗PD-L1抗体HRP00052は、ヒト悪性神経膠腫U87MGの皮下腫瘍の増殖を、有意に抑制することが示された。
Claims (25)
- 下記から選ばれるCDR領域配列またはその変異配列のいずれか1つを含む、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント:
重鎖可変領域HCDR配列は、配列番号10〜12、配列番号16〜18に示され;軽鎖可変領域LCDR配列は、配列番号13〜15、配列番号19〜21に示される;
具体的には以下の通りである:
HCDR1は、NDYWX1(配列番号10)またはSYWMH(配列番号16)から選ばれ;
HCDR2は、YISYTGSTYYNPSLKS(配列番号11)またはRI X4PNSG X5TSYNEKFKN(配列番号17)から選ばれ;
HCDR3は、SGGWLAPFDY(配列番号12)またはGGSSYDYFDY(配列番号18)から選ばれ;
LCDR1は、KSSQSLFYX2SNQKX3SLA(配列番号13)またはRASESVSIHGTHLMH(配列番号19)から選ばれ;
LCDR2は、GASTRES(配列番号14)またはAASNLES(配列番号20)から選ばれ;
LCDR3は、QQYYGYPYT(配列番号15)またはQQSFEDPLT(配列番号21)から選ばれ;
X1は、NまたはTから選ばれ、X2は、RまたはHから選ばれ、X3は、NまたはHから選ばれ、X4は、HまたはGから選ばれ、X5は、GまたはFから選ばれる。 - 配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれる重鎖可変領域HCDR配列またはその変異配列を含む、請求項1に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号19、配列番号20および配列番号21からなる群より選ばれる軽鎖可変領域LCDR配列またはその変異配列を含む、請求項1に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 抗体軽鎖可変領域が、マウスκ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖FR領域、またはマウスλ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖FR領域をさらに含み;抗体重鎖可変領域が、マウスIgG1もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域、マウスIgG2もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域、またはマウスIgG3もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- マウス由来FR領域を含む抗体重鎖可変領域が、配列番号6および8ならびにそれらの変異配列からなる群より選ばれ;マウス由来FR領域を含む抗体軽鎖可変領域が、配列番号7および9ならびにそれらの変異配列からなる群より選ばれる、請求項4に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 抗体軽鎖が、マウスκ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖定常領域、またはマウスλ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖定常領域をさらに含み;抗体重鎖が、マウスIgG1もしくはその変異体に由来する重鎖定常領域、マウスIgG2もしくはその変異体に由来する重鎖定常領域、またはマウスIgG3もしくはその変異体に由来する重鎖定常領域をさらに含む、請求項4に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ抗体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト化抗体またはそのフラグメントである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体が、ヒト化抗体9-2またはヒト化抗体24D5であり、ヒト化抗体の重鎖可変領域上の重鎖FR配列が、ヒト生殖細胞系列重鎖に由来し:
ヒト化抗体9-2の重鎖可変領域上の重鎖FR配列は、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV4-30-4*01とhjh2との組み合わせ配列に由来し、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV4-30-4*01からのFR1、FR2およびFR3ならびにhjh2からのFR4を含み;または、
ヒト化抗体24D5の重鎖可変領域上の重鎖FR配列は、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV1-46*01とhjh6.1との組み合わせ配列に由来し、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV1-46*01からのFR1、FR2およびFR3ならびにhjh6.1からのFR4を含む、
請求項8に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒト化抗体9-2の重鎖FR配列は、0〜10個のアミノ酸復帰突然変異を有し、好ましくは、W47Y、V71R、G27Y、I48M、V67L、F78Y、S30TおよびQ39Kからなる群より選ばれる1つ以上のアミノ酸復帰突然変異を有し、より好ましくは、W47YおよびV71Rのアミノ酸復帰突然変異を有し;
ヒト化抗体24D5の重鎖FR配列は、0〜10個のアミノ酸復帰突然変異を有し、好ましくは、T74K、R72V、M48I、M70L、R38Q、L83F、V68AおよびV79Aからなる群より選ばれる1つ以上のアミノ酸復帰突然変異を有する、
請求項9に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が以下に示される、請求項9に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント:
ヒト化抗体9-2の重鎖可変領域配列が、配列番号22またはその変異体で示され;または、ヒト化抗体24D5の重鎖可変領域配列が、配列番号24またはその変異体で示される。 - ヒト化抗体が、ヒト化抗体9-2またはヒト化抗体24D5であり、ヒト化抗体の軽鎖可変領域上の軽鎖FR配列が、ヒト生殖細胞系列軽鎖に由来し:
ヒト化抗体9-2の軽鎖可変領域上の軽鎖FR配列が、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV4-1*01とhjk4.1との組み合わせ配列に由来し、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV4-1*01からのFR1、FR2およびFR3ならびにhjk4.1からのFR4を含み;
ヒト化抗体24D5の軽鎖可変領域上の軽鎖FR配列が、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV7-3*01とhjh2.1との組み合わせ配列に由来し、IGKV7-3*01からのFR1、FR2およびFR3ならびにhjk2.1からのFR4を含む、
請求項8に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒト化抗体9-2の軽鎖FR配列が、0〜10個のアミノ酸復帰突然変異を有し、好ましくは、P49Sアミノ酸復帰突然変異を有し;
ヒト化抗体24D5の軽鎖FR配列が、0〜10個のアミノ酸復帰突然変異を有し、好ましくは、Y91F、T22SおよびG72E、ならびにN85Eに脱グリコシル化変異を導入したものからなる群より選ばれる1つ以上のアミノ酸復帰突然変異を有する、
請求項12に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が以下に示される、請求項12に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント:
ヒト化抗体9-2の軽鎖可変領域配列が、配列番号23またはその変異体で示され;または、ヒト化抗体24D5の軽鎖可変領域配列が、配列番号25またはその変異体で示される。 - ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが、親和性増強設計を受ける、請求項8〜14のいずれか1項に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- X1がTであり、X2がHであり、X3がHであり、X4がGであり、X5がFである、請求項15に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体が、ヒト化抗体9-2またはヒト化抗体24D5であって、ヒト化抗体の可変領域配列が以下に示される、請求項15または16に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント:
ヒト化抗体9-2の重鎖可変領域配列が、配列番号26で示され;ヒト化抗体9-2の軽鎖可変領域配列が、配列番号27で示され;
ヒト化抗体24D5の重鎖可変領域配列が、配列番号28で示され、ヒト化抗体24D5の軽鎖可変領域配列が、配列番号29で示される。 - ヒト化抗体の重鎖が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4またはそれらの変異体に由来する重鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、ヒトIgG2またはIgG4に由来する重鎖定常領域を含み、より好ましくは、F234AおよびL235A変異を伴うIgG4重鎖定常領域を含み;
ヒト化抗体の軽鎖が、ヒトκ鎖、ヒトλ鎖またはそれらの変異体に由来する軽鎖定常領域をさらに含む、
請求項17に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒト化抗体9-2が、配列番号30で示される重鎖抗体配列および配列番号32で示される軽鎖抗体配列を含み;ヒト化抗体24D5が、配列番号34で示される重鎖抗体配列および配列番号36で示される軽鎖抗体配列を含む、請求項17に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントの治療的有効量、および1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするDNA分子。
- 請求項21に記載のDNA分子を含む発現ベクター。
- 宿主細胞が、細菌、酵母および哺乳類細胞からなる群より選ばれ、好ましくは、哺乳類細胞である、請求項22に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
- PD-L1介在性の疾患または障害が、好ましくは、がんであり;より好ましくは、PD-Llを発現しているがんであり;最も好ましくは、乳がん、肺がん、胃がん、腸がん、腎がん、メラノーマおよび非小細胞肺がんからなる群より選ばれ;さらに好ましくは、非小細胞肺がん、メラノーマ、膀胱がんおよび腎がんからなる群より選ばれる、PD-L1介在性の疾患または障害を治療するための薬物の製造における、請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗PD-L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または、請求項20に記載の医薬組成物の使用。
- PD-l介在性の疾患または障害を治療または予防する方法であって、
疾患または障害が、好ましくは、がんであり、より好ましくは、PD-Llを発現しているがんであり;がんが、好ましくは、乳がん、肺がん、胃がん、腸がん、腎がん、メラノーマ、非小細胞肺がんおよび膀胱がんからなる群より選ばれ;最も好ましくは、非小細胞肺がん、メラノーマ、膀胱がんおよび腎がんからなる群より選ばれ、
請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントの治療的有効量を、それが必要な患者に投与すること、または、請求項20に記載の医薬組成物の治療的有効量を、それが必要な患者に投与することを含む、
方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113795510A (zh) * | 2019-08-29 | 2021-12-14 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | 抗pd-l1抗体及其应用 |
JP2022511311A (ja) * | 2019-04-26 | 2022-01-31 | アイ-エムエービー バイオファーマ ユーエス リミテッド | ヒトpd‐l1抗体 |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112017019559B1 (pt) | 2015-03-13 | 2020-08-04 | Cytomx Therapeutics, Inc | Anticorpos anti-pdl1, anticorpos anti-pdl1 ativáveis, e métodos de uso destes |
KR102623679B1 (ko) * | 2017-05-16 | 2024-01-11 | 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 | Pd-l1 항체 약학 조성물 및 이의 용도 |
KR20200016899A (ko) | 2017-06-01 | 2020-02-17 | 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. | 활성화가능 항-pdl1 항체, 및 이의 이용 방법 |
CN111542543B (zh) * | 2017-12-28 | 2023-12-22 | 南京传奇生物科技有限公司 | 针对pd-l1的抗体及其变体 |
CA3087105A1 (en) * | 2018-01-10 | 2019-07-18 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Pd-l1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof |
US11795206B2 (en) * | 2018-06-24 | 2023-10-24 | Yunbiao Lu | Specific bifunctional BY-001 (active composition of homomultimer of chimeric protein pd-L1 / fc-gamma1) down regulates the activation of human immune cells and the use thereof |
TW202029964A (zh) * | 2018-10-25 | 2020-08-16 | 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 | 伊立替康聯合免疫檢查點抑制劑和5-fu在製備治療腫瘤疾病的藥物中的用途 |
US20220017601A1 (en) * | 2018-11-09 | 2022-01-20 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | TGF-beta RECEPTOR FUSION PROTEIN PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF |
KR20210102917A (ko) * | 2018-12-13 | 2021-08-20 | 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 | 종양 질환을 치료하기 위한 il-15 단백질 복합체 연합 pd-l1 항체의 용도 |
BR112021013415A2 (pt) * | 2019-01-07 | 2021-12-28 | Univ Jefferson | Proteínas de fusão multifuncionais e usos das mesmas |
CN116239698A (zh) * | 2019-03-06 | 2023-06-09 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双功能融合蛋白及其医药用途 |
CN113874036A (zh) | 2019-05-24 | 2021-12-31 | 辉瑞公司 | 使用cdk抑制剂的联合治疗 |
EP3983450A4 (en) * | 2019-06-12 | 2023-07-05 | Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. | ANTI-PD-L1/ANTI-LAG-3 PROTEINS WITH MULTIPLE ANTIGEN BINDING AND METHODS FOR THEIR USE |
CN112125975B (zh) * | 2019-06-25 | 2024-03-01 | 上海翰森生物医药科技有限公司 | Pd-l1和cd47双特异性融合蛋白及其医药用途 |
WO2021013142A1 (zh) * | 2019-07-22 | 2021-01-28 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗4-1bb抗体、其抗原结合片段及双特异性抗体 |
CN110478472B (zh) * | 2019-09-29 | 2020-08-28 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | Pd-1封闭剂及其应用 |
CN112574308A (zh) | 2019-09-30 | 2021-03-30 | 和铂医药(苏州)有限公司 | 靶向bcma的抗体、双特异性抗体及其用途 |
CN112759647B (zh) * | 2019-10-21 | 2024-03-26 | 上海宏成药业有限公司 | 一种抗pd-l1的抗体及其制药用途 |
CN113637075B (zh) * | 2020-04-27 | 2024-04-16 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双特异性抗原结合分子及其医药用途 |
TW202219069A (zh) * | 2020-09-04 | 2022-05-16 | 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 | SIRPγ變體及其融合蛋白 |
CN115466329A (zh) * | 2021-06-11 | 2022-12-13 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | 一种抗pd-1人源化抗体及其应用 |
CN113773401B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-06-20 | 宜明昂科生物医药技术(上海)股份有限公司 | 靶向cd47和pd-l1的重组融合蛋白及其制备和用途 |
TW202327649A (zh) * | 2021-09-15 | 2023-07-16 | 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 | Pvrig/tigit結合蛋白聯合免疫檢查點抑制劑用於治療癌症 |
TW202327595A (zh) | 2021-10-05 | 2023-07-16 | 美商輝瑞大藥廠 | 用於治療癌症之氮雜內醯胺化合物的組合 |
WO2023079428A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | Pfizer Inc. | Combination therapies using tlr7/8 agonist |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008544755A (ja) * | 2005-07-01 | 2008-12-11 | メダレックス インコーポレーティッド | プログラム死リガンド1(pd−l1)に対するヒトモノクローナル抗体 |
JP2012511329A (ja) * | 2008-12-09 | 2012-05-24 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗pd−l1抗体およびt細胞機能を増強するためのそれらの使用 |
JP2013511959A (ja) * | 2009-11-24 | 2013-04-11 | メディミューン リミテッド | B7−h1に対する標的結合剤 |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001039722A2 (en) | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | B7-h1, a novel immunoregulatory molecule |
US6803192B1 (en) | 1999-11-30 | 2004-10-12 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | B7-H1, a novel immunoregulatory molecule |
US8444973B2 (en) * | 2005-02-15 | 2013-05-21 | Duke University | Anti-CD19 antibodies and uses in B cell disorders |
EP1910550A4 (en) * | 2005-07-21 | 2009-11-04 | Abbott Lab | MULTIGENIC EXPRESSION COMPRISING SORF CONSTRUCTS AND METHODS USING POLYPROTEINS, PRO-PROTEINS, AND PROTEOLYSIS |
CN101104640A (zh) * | 2006-07-10 | 2008-01-16 | 苏州大学 | 抗人pd-l1单克隆抗体制备及应用 |
NZ589434A (en) * | 2008-06-03 | 2012-11-30 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
KR101050829B1 (ko) | 2008-10-02 | 2011-07-20 | 서울대학교산학협력단 | 항 pd-1 항체 또는 항 pd-l1 항체를 포함하는 항암제 |
JP5844159B2 (ja) | 2009-02-09 | 2016-01-13 | ユニヴェルシテ デクス−マルセイユUniversite D’Aix−Marseille | Pd−1抗体およびpd−l1抗体ならびにその使用 |
US20120034224A1 (en) * | 2010-08-03 | 2012-02-09 | National Cheng Kung University | Treating Rheumatoid Arthritis with Anti-IL-19 Antibody |
EP2644698B1 (en) * | 2010-11-17 | 2018-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii |
LT2699264T (lt) * | 2011-04-20 | 2018-07-10 | Medimmune, Llc | Antikūnai ir kitos molekulės, kurios jungiasi prie b7-h1 ir pd-1 |
US8790651B2 (en) * | 2011-07-21 | 2014-07-29 | Zoetis Llc | Interleukin-31 monoclonal antibody |
KR101981873B1 (ko) * | 2011-11-28 | 2019-05-23 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 항-pd-l1 항체 및 그의 용도 |
CN104470949A (zh) * | 2012-05-15 | 2015-03-25 | 百时美施贵宝公司 | 通过破坏pd-1/pd-l1信号传输的免疫治疗 |
KR20220084444A (ko) * | 2012-05-31 | 2022-06-21 | 소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | Pd-l1에 결합하는 항원 결합 단백질 |
CN111499755A (zh) | 2012-08-03 | 2020-08-07 | 丹娜法伯癌症研究院 | 抗-pd-l1和pd-l2双结合抗体单一试剂及其使用方法 |
BR112015007672A2 (pt) * | 2012-10-04 | 2017-08-08 | Dana Farber Cancer Inst Inc | anticorpos anti-pd-l1 monoclonais humanos e métodos de uso |
AR093984A1 (es) * | 2012-12-21 | 2015-07-01 | Merck Sharp & Dohme | Anticuerpos que se unen a ligando 1 de muerte programada (pd-l1) humano |
CA2905798C (en) | 2013-03-15 | 2023-01-24 | Genentech, Inc. | Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions |
US20160089434A1 (en) | 2013-06-03 | 2016-03-31 | Novartis Ag | Combinations of an anti-pd-l1 antibody and a mek inhibitor and/or a braf inhibitor |
AR097584A1 (es) | 2013-09-12 | 2016-03-23 | Hoffmann La Roche | Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano |
SG11201602283UA (en) | 2013-09-27 | 2016-04-28 | Genentech Inc | Anti-pdl1 antibody formulations |
PL3081576T3 (pl) * | 2013-12-12 | 2020-03-31 | Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. | Przeciwciało anty pd-1, jego fragment wiążący antygen i ich zastosowanie medyczne |
RU2701434C2 (ru) * | 2014-01-24 | 2019-09-26 | Нгм Биофармасьютикалс, Инк. | Связывающие белки и способы их применения |
KR102623679B1 (ko) * | 2017-05-16 | 2024-01-11 | 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 | Pd-l1 항체 약학 조성물 및 이의 용도 |
CA3087105A1 (en) * | 2018-01-10 | 2019-07-18 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Pd-l1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof |
CN116239698A (zh) * | 2019-03-06 | 2023-06-09 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双功能融合蛋白及其医药用途 |
JP2022544405A (ja) * | 2019-08-15 | 2022-10-18 | アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | 免疫刺激性多量体型結合分子 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008544755A (ja) * | 2005-07-01 | 2008-12-11 | メダレックス インコーポレーティッド | プログラム死リガンド1(pd−l1)に対するヒトモノクローナル抗体 |
JP2012511329A (ja) * | 2008-12-09 | 2012-05-24 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗pd−l1抗体およびt細胞機能を増強するためのそれらの使用 |
JP2013511959A (ja) * | 2009-11-24 | 2013-04-11 | メディミューン リミテッド | B7−h1に対する標的結合剤 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022511311A (ja) * | 2019-04-26 | 2022-01-31 | アイ-エムエービー バイオファーマ ユーエス リミテッド | ヒトpd‐l1抗体 |
JP7212990B2 (ja) | 2019-04-26 | 2023-01-26 | アイ-エムエービー バイオファーマ ユーエス リミテッド | ヒトpd‐l1抗体 |
CN113795510A (zh) * | 2019-08-29 | 2021-12-14 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | 抗pd-l1抗体及其应用 |
JP2022521958A (ja) * | 2019-08-29 | 2022-04-13 | 榮昌生物制薬(烟台)股▲フン▼有限公司 | 抗pd-l1抗体及びその応用 |
Also Published As
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