CN104470949A - 通过破坏pd-1/pd-l1信号传输的免疫治疗 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于癌症患者的免疫治疗的方法，包括对患者施用抑制PD-1/PD-L1信号传输途径的抗体，或施用这种抗体与抗CTLA-4抗体的组合。此公开也提供了用于癌症患者的免疫治疗的方法，所述方法包括基于评估而选择患者以及对选择的受试者施用抗PD-1抗体，所述患者是免疫治疗的适合候选者，所述评估为来自患者的测试组织样品中在细胞表面上表达PD-1的细胞的比例超过了预定阈值水平。本公开另外还提供了在FFPE组织样品中特异地结合细胞表面表达的PD-L1抗原的单克隆抗体，以及用于在FFPE组织中用提供的抗PD-L1抗体来评估细胞表面表达的自动化IHC方法。

Description

通过破坏PD-1/PD-L1信号传输的免疫治疗
本申请要求美国临时专利申请No.61/647,442(2012年5月15日提交)和美国临时专利申请No.61/790,747(2013年5月15日提交)的权益，所述两项申请的内容在此通过提述以其整体并入。
在本申请中，通过作者名和日期、或通过专利号或专利公布号在括号里参考了各种其他出版物。对这些出版物的全部引用可在说明书末尾处权利要求之前找到。这些出版物的公开在此通过提述以其整体并入本申请，以更完整地描述本文描述并要求保护的发明的日期为止，本领域技术人员已知的现有技术水平。然而，本文参考的引用不应被解读为认同这些参考对本发明是现有技术。
发明领域
本发明涉及用于癌症患者的免疫治疗的方法，包括对所述患者施用破坏PD-1/PD-L1信号传输途径的抗体。能用生物标记物作为此治疗的一部分，以鉴定适于免疫治疗的患者，以及预测抗PD-1治疗的效力。
发明背景
人的癌症包纳了很多的遗传学和表观遗传学的改变，产生潜在可被免疫系统识别的新抗原(Sjoblom等,2006)。适应性免疫系统包含T和B淋巴细胞，具有很强的抗癌潜力，有广阔的容量和敏锐的特异性来响应不同的肿瘤抗原。进一步地，免疫系统呈现出了相当的可塑性和记忆组分。对所有这些适应性免疫系统属性的成功利用使免疫疗法在所有癌症治疗形式中独一无二。然而，虽然在临床前的模型和患者中观察到了对癌症的外源性免疫响应，但这种响应是无效的，并且既成的(established)癌症被看作是“自身”且是被免疫系统所容忍的。有助于这种容忍状态的是，肿瘤可以利用一些独特的机制来主动地破坏抗肿瘤免疫性。这些机制包括功能障碍的T细胞信号传输(Mizoguchi等,1992)、抑制的调节细胞(Facciabene等,2012)、以及指派(op-opt)内源性“免疫检验点(immune checkpoints)”，其用来下调适应性免疫响应的强度并保护正常组织免受肿瘤的间接损伤，以逃避免疫毁灭(Topalian等,2011；Mellman等,2011)。
直到最近，癌症免疫治疗将实质努力聚焦在了通过采用性转移(adoptive-transfer)激活的效应细胞、针对相关抗原的免疫、或提供非特异性的免疫刺激剂如细胞因子来增强抗肿瘤免疫响应的手段上。然而在过去十年里，为了发展特异性的免疫检验点途径抑制剂的密集努力已经开始提供新的用于治疗癌症的免疫治疗手段，包括新的抗体(Ab)ipilimumab()的开发，ipilimumab结合并抑制细胞毒素T-淋巴细胞抗原-1(CTLA-4)，用于患有晚期的(advanced)黑色素瘤的患者的治疗(Hodi等,2010)，以及，如本申请所述，对阻碍PD-1抑制途径的抗体的开发。
程序性死亡-1(PD-1)是由激活的T和B细胞表达的一种关键的免疫检验点受体，并介导免疫抑制。PD-1是受体的CD28家族的成员，其包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。已鉴定出PD-1的2种细胞表面糖蛋白配体，程序性死亡配体-1(PD-L1)和程序性死亡配体-2(PD-L2)，所述两种配体在抗原呈递细胞上以及很多人癌症上表达，并已显示出在结合PD-1后下调T细胞的激活和细胞因子的分泌(Freeman等,2000；Latchman等,2001)。与CTLA-4不同，PD-1在主要外周组织中发挥功能，激活的T细胞在所述外周组织中可遭遇免疫抑制性的PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)配体，所述配体由肿瘤和/或间质细胞(stromal cells)表达(Flies等,2011；Topalian等,2012a)。对PD-1/PD-L1相互作用的抑制在临床前模型中介导强力的抗肿瘤活性(美国专利Nos.8,008,449和7,943,743)，而对PD-1/PD-L1相互作用的抗体抑制剂用于治疗癌症的用途已进入临床试验(Brahmer等,2010；Topalian等,2012b；Brahmer等,2012；Flies等,2011；Pardoll,2012；Hamid和Carvajal,2013)。
新兴的个体化医疗领域的希望是药物基因组学的进步会越来越多地用于量身定制(tailor)针对限定的亚群体、以及最终为个体患者的治疗剂，以便增强效力并使不良作用最小化。最近的成功包括：例如，对甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate,)的开发以治疗费城染色体阳性的(Philadelphia chromosome-positive)慢性髓细胞性白血病(CML)，所述甲磺酸伊马替尼是一种抑制bcr-abl酪氨酸激酶的蛋白酪氨酸激酶抑制剂；对克唑替尼(crizotinib，)的开发以治疗5％的患有晚期非小细胞肺癌的、表达突变的间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的患者；以及对威罗菲尼(vemurafenib,)的开发，所述威罗菲尼是突变的B-RAF蛋白(V600E-BRAF)的抑制剂，其在约一半的黑色素瘤肿瘤中表达。然而，与靶向离散的(discrete)激活突变的小分子剂的临床开发不同(所述激活突变是在选择的癌症人群中找到的)，癌症免疫治疗中一个特别的挑战是对于基于机制的预测性生物标记物的鉴定，以能够进行患者的选择并指导治疗过程中(on-treatment)的管理。本文描述了在验证PD-L1的表达作为用于筛选抗PD-1免疫治疗的患者的生物标记物的进展。
发明概述
本公开提供用于罹患癌症的受试者的免疫治疗的方法，该方法包含对受试者施用组合物，所述组合物包含治疗上有效量的破坏、降低或抑制来自抑制性免疫调节物的信号传输的作用剂。在优选的实施方案中，所述作用剂是抗体。在其他优选的实施方案中，所述抑制性免疫调节物是PD-1/PD-L1信号传输途径的组分。在进一步优选的实施方案中，所述抗体破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用。在一些实施方案中，所述抗体是本发明的抗PD-1抗体或本发明的抗PD-L1抗体。在优选的实施方案中，本发明的抗PD-1抗体是nivolumab(BMS-936558)，而本发明的抗PD-L1抗体是BMS-936559。在一些实施方案中，受试者已提前进行过癌症治疗。在其他实施方案中，所述癌症是晚期的、转移性的和/或难治愈的癌症。在优选的实施方案中，将抗体或其抗原结合部分施用于其受试者在受试者中诱导持久的临床响应。
本公开还提供了用于罹患癌症的受试者的免疫治疗的方法，其方法包括：(a)选择受试者，所述受试者对于免疫治疗是合适的候选者，所述选择包括(i)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞(tumor-infiltrating inflammatorycells)；(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(iii)基于评估结果而选择受试者作为合适的候选者，所述评估结果为在测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例超过预定的阈值水平；以及(b)对选择的受试者施用包含治疗上有效量的作用剂的组合物，所述作用剂破坏来自PD-1/PD-L1途径的信号传输，例如抗PD-1或抗PD-L1抗体。
本公开进一步提供了用于罹患癌症的受试者的治疗的方法，该方法包括：(a)用一种破坏来自PD-1/PD-L1途径的信号传输的作用剂，例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体选择不适合抗PD-1抗体免疫治疗的受试者，所述选择包括：(i)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(iii)基于评估结果而选择不适合所述免疫治疗的受试者，所述评估结果为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例低于预定的阈值水平；以及(b)对选择的受试者施用除了破坏来自PD-1/PD-L1途径的信号传输的作用剂之外的治疗标准(standard-of-care)的治疗剂。
此外，本公开提供了用于选择免疫治疗的癌症患者的方法，所述免疫治疗是用破坏来自PD-1/PD-L1途径的信号传输的作用剂，所述作用剂例如抗PD-1或抗PD-L1抗体，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)测定测试组织样品以确定其中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；(c)比较在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例与预定的阈值比例；以及(d)基于评估结果而为免疫治疗选择患者，所述评估结果为PD-L1在测试组织样品的细胞中表达。
本公开进一步提供了用于预测破坏来自PD-1/PD-L1途径的信号传输的作用剂的治疗有效性的方法，例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体，所述方法用于治疗癌症患者，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)测定测试组织样品以确定其中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；(c)比较在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例与预定的阈值；以及(d)预测所述作用剂的治疗有效性，其中如果在细胞表面上表达PD-L1的细胞比例超过阈值比例则预测作用剂对治疗患者是有效的，而其中如果在细胞表面上表达PD-L1的细胞比例低于阈值比例则预测作用剂对治疗患者是无效的。
本公开还提供了用于确定免疫治疗性疗法的方法，其包含破坏来自PD-1/PD-L1途径的信号传输的作用剂，例如抗PD-1或抗PD-L1抗体，用于治疗癌症患者，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)测定测试组织样品以确定其中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；(c)比较在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例与预定的阈值比例；以及(d)确定免疫治疗性疗法，所述疗法包含基于对在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例超过了预定阈值比例的确定的作用剂。
在一些本文所述方法的实施方案中，测试组织样品是福尔马林固定且石蜡包埋的(FFPE)样品。在一些其他实施方案中，评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例是通过FFPE样品的免疫组化(IHC)染色来实现的。在优选的实施方案中，将单克隆抗体28-8或5H1用于自动化IHC测定法中以结合测试组织样品中细胞表面上的PD-L1。在本文公开的任何方法的优选实施方案中，所述癌症是黑色素瘤(MEL)、肾细胞瘤(RCC)、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结肠直肠癌(CRC)、去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)、肝细胞癌(HCC)、头部与颈部的鳞状细胞癌、食管、卵巢、胃肠道及乳腺癌、或血液的恶性肿瘤(hematologicmalignancy)如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)/原发性纵隔B-细胞淋巴瘤(primary mediastinal B-celllymphoma)，和慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)。
本发明此外还提供了在FFPE组织样品中特异性地结合到细胞表面表达的人PD-L1抗原的单克隆抗体或其抗原结合部分。在优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合部分不结合到FFPE组织样品中的细胞质PD-L1抗原。在其他优选的实施方案中，所述单克隆抗体(mAb)是指定为28-8、28-1、28-12、29-8或20-12的兔单克隆抗体，或指定为5H1的小鼠单克隆抗体。
此发明的其他特征和优点从如下的详述和实施例中是明显的，所述详述和实施例不应被解读为限制性的。所有引用参考文件的内容，包括在整个本申请中引用的科学论文、报纸报道、GenBank条目、专利及专利申请，在此通过提述明确并入。
附图简述
图1A-1C：5C4与其他HuMab抗PD-1单克隆抗体之间的交叉竞争，所述交叉竞争是为结合到在CHO细胞上表达的人PD-1(hPD-1)。A，5C4Fab片段基本上阻碍了单克隆抗体5C4自身的结合、以及2D3、7D3的结合；B，5C4Fab片段基本上阻碍了单克隆抗体4H1的结合；C，5C4单克隆抗体基本上阻碍了单克隆抗体17D8的结合。
图2A-2F：FITC-缀合的人抗-hPD-L1单克隆抗体为结合到在CHO细胞上表达的人PD-L1(hPD-L1)的交叉竞争。A，标志的10H10的结合被10A5、11E6和13G4部分阻碍，并被自身显著地阻碍；B，标志的3G10的结合被除10H10外的每个测试的抗PD-L1抗体显著地阻碍；C，标志的10A5的结合被除10H10外的每个测试的抗PD-L1抗体显著地阻碍；D，标志的11E6的结合被除10H10外的每个测试的抗PD-L1抗体显著地阻碍；和E，标志的12A4的结合被除10H10外的每个测试的抗PD-L1抗体显著地阻碍；和F，标志的13G4的结合被除10H10外的每个测试的抗PD-L1抗体显著地阻碍。
图3：通过人抗-hPD-L1单克隆抗体对生物素酰化的单克隆抗体12A4结合ES-2细胞的交叉竞争性抑制。结合的生物素-12A4的荧光针对未标志的hPD-L1HuMabs的浓度来作图。
图4：在治疗难愈的黑色素瘤(MEL)患者中显示抗PD-1单克隆抗体活性的蜘蛛图(Spider plot)。肿瘤负荷随时间变化的代表图(representative plot)展示了在27例MEL用5C4以1.0mg/kg剂量治疗的患者中靶病损(target lesion)的最长直径与基线相比的变化的时间进程。在大多数达到客观响应(objectiveresponse,OR)的患者中，到治疗的循环3的结束(6个月)时响应是持久且明显的(垂直虚线)。肿瘤的消退遵循常规的以及“免疫相关的”响应模式，如在新病损存在下的肿瘤负荷减少被延长。
图5：抗PD-1单克隆抗体在患转移性RCC的患者中的活性。图示了用5C4以1mg/kg治疗的57岁患者中转移性RCC的局部消退。这例患者此前经历过根治性手术并在接受舒尼替尼(sunitinib)、坦罗莫司(temsirolimus)、索拉非尼(sorafenib)、和帕唑帕尼(pazopanib)后患上了进展性的疾病。箭头显示可操作域(operative field)中复发肿瘤的消退。
图6：抗PD-1单克隆抗体在患有转移性MEL的患者中的活性。图示了用5C4以3mg/kg治疗的62岁患者中转移性MEL的完全响应，与白癜风有关。(i)治疗前(Pretreatment)的CT扫描，腹股沟淋巴结转移(箭头)；(ii)治疗13个月后。皮下组织和腹膜后腔中的很多转移也完全消退了(未显示)。治疗后6个月患上白癜风；照片在9个月时于可见光(iii)以及紫外线下拍摄(iv)。对小眼畸形相关的转录因子(MITF)用免疫组化进行的皮肤活组织检查显示了正常皮肤(v)中在表皮-真皮接合处的黑色素细胞(箭头)，以及被白癜风部分或全部影响的皮肤中稀少的(vi)或没有(vii)黑色素细胞。
图7：抗PD-1单克隆抗体在患有转移性NSCLC的患者中的活性。图示了用5C4以10mg/kg治疗的患有转移性NSCLC(非鳞状组织结构)的患者中的部分响应。箭头显示肺病损中的初始进展，然后是消退(“免疫相关的”响应模式)。
图8A和8B：肿瘤PD-L1表达和抗PD-1临床响应之间的相关性。治疗前PD-L1的肿瘤细胞表面表达通过在福尔马林固定的、石蜡包埋的样本上的IHC来确定，所述表达与对PD-1阻碍的OR是相关的。研究了42个患有晚期癌症的受试者，所述癌症包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、和去势抵抗性前列腺癌(n分别为18、10、7、5和2)。A，肿瘤表面PD-L1表达与客观临床响应具有显著相关性。患有PD-L1阴性肿瘤的患者未经历OR。B，显示了在黑色素瘤淋巴结转移(顶部)、在肾细胞癌肾切除术样本(中部)、以及肺腺癌脑转移(底部)中的用抗PD-L1单克隆抗体5H1的IHC分析的例子。均为原始的400X放大。箭头表示表面膜被PD-L1染色的每个样本中许多肿瘤细胞中的一个。星号表示肾切除术样本中正常的肾小球，其为PD-L1染色阴性的。
图9：通过组织评分(histoscore)分析比较单克隆抗体28-8和5H1在肿瘤组织中对PD-L1抗原的结合的图示。兔单克隆抗体28-8在10个测试样本中的7个里显示出更高的组织评分。
图10A-10D：蜘蛛图显示了抗PD-L1单克隆抗体在患有治疗难愈的MEL和NSCLC的患者中的活性。代表图展示了患MEL的患者和患NSCLC的患者中随时间的靶病损肿瘤负荷的时间进程，所述患MEL的患者是用BMS-936559以1(A)、3(B)、10mg/kg(C)的剂量治疗的，所述患NSCLC的患者是以10mg/kg(D)的剂量治疗的。在大多数达到客观响应的患者中，响应是持久的并且到治疗的循环2(3个月)结束前是明显的，无论是什么剂量或肿瘤类型。肿瘤消退遵循常规的以及“免疫相关的”响应模式。
图11：患有黑色素瘤、用3mg/kg的BMS-936559治疗的患者中的完全响应。圈表示肺结节(pulmonary nodules)大小在6周和3个月时的初始增长，以及10个月时的完全消退(“免疫相关的”响应模式)。
图12：患有黑色素瘤、用1mg/kg的BMS-936559治疗的患者中的完全响应。此患者在治疗起始后3个月时患上了单独的脑转移，其中所述治疗成功地用立体定向放射手术(stereotactic radiosurgery)来治疗患者。在8个月时注意到了腹部疾病(圈出)中的一部分响应，而在15个月时没有疾病的证据。
图13：患有NSCLC(非鳞状组织结构)、用10mg/kg的BMS-936559来治疗的患者中的部分响应。注意右肺胸膜(right lung pleura)和肝脏中疾病中的响应。
图14A和14B：接受nivolumab和ipilimumab并行疗法的MEL患者的临床活性。A，代表性的蜘蛛图显示了肿瘤负荷中从基线的变化，以所有靶病损的垂直直径的积和(sum of products)来测量，所述测量是在接受1mg/kgnivolumab+3mg/kg ipilimumab的并行疗法(最大耐受剂量(MTD))的患者中进行的。三角形表示新病损的第一次发生。B，代表性的瀑布图(waterfall plot)显示了在接受并行疗法的患者中的基线靶病损中最大的百分率响应。
图15：一例接受1mg/kg nivolumab+3mg/kg ipilimumab的并行疗法的52岁的MEL患者的肿瘤消退。此患者呈现出大范围的颈部、纵膈、腋下(axillary)、腹部和骨盆淋巴结病、双侧肺结节(bilateral pulmonary nodules)、小肠转移、腹膜种植物(peritoneal implants)和弥漫性皮下结节(diffuse subcutaneousnodules)。基线乳酸脱氢酶(LDH)为2.25x正常上限，血红蛋白为9.7g/dL，而症状包括恶心和呕吐。4周的治疗内，LDH正常化了，症状改善了(食欲增加、恶心减少)，并且皮肤的病损在消退。在第12周的扫描时，疾病的所有区中都出现了显著的减少。箭头指明转移性疾病的位置。
图16A-16C：接受多种nivolumab和ipilimumab的并行疗法的MEL患者的临床活性。代表性的蜘蛛图显示了了肿瘤负荷中从基线的变化，以所有靶病损的垂直直径的积和来测量，所述测量是在接受0.3mg/kg nivolumab+3mg/kg ipilimumab(A)、3mg/kg nivolumab+1mg/kg ipilimumab(B)、或3mg/kg nivolumab+3mg/kg ipilimumab(C)的并行疗法的患者中进行的。三角形表示新病损的第一次发生。
图17：一例接受0.3mg/kg nivolumab+3mg/kg ipilimumab的并行疗法的61岁的MEL患者的肿瘤消退。该患者呈现出未知的原发位点的IV期(M1c)MEL，其向胃和肠系膜转移。近期一次输液后乳酸脱氢酶为225而血红蛋白为9.6g/dL。在研究治疗起始12周后，CT扫描显示在大体积疾病负荷上有86％的减少。
图18A-18C：接受nivolumab和ipilimumab序贯疗法的MEL患者的临床活性。代表性的蜘蛛图显示了肿瘤负荷中从基线的变化，以所有靶病损的垂直直径的积和来测量，所述测量是在接受序贯疗法的患者中进行的，所述序贯疗法是在先ipilimumab治疗后，接受1mg/kg nivolumab(A)或3mg/kgipilimumab(B)。三角形表示新病损的第一次发生。C，代表性的瀑布图显示了在接受序贯疗法的患者中的基线靶病损中最大的百分率响应；“*”号指明了接受在先ipilimumab的有放射影像的晚期患者。
发明详述
本发明涉及用于罹患疾病患者的免疫治疗的方法，所述疾病如癌症或感染性疾病的，该方法包括对受试者施用包含治疗上有效量的化合物或作用剂的组合物，所述化合物或作用剂加强内源性免疫响应，或是刺激内源性响应的激活或是抑制对内源性响应的压抑。更具体地说，此公开提供了用于在罹患癌症的受试者中加强内源性免疫响应的方法，以便由此治疗患者，该方法包括对受试者施用治疗上有效量的作用剂，例如破坏或抑制来自破坏性免疫调节物的信号传输的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，破坏性免疫调节物是PD-1/PD-L1信号传输途径的组分。因此，本发明的一些实施方案提供用于罹患癌症的受试者的免疫治疗的方法，该方法包括对受试者施用治疗上有效量的破坏PD-1受体与其配体PD-L1之间相互作用的抗体或其抗原结合部分。在一些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合到PD-1。在其他优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合到PD-L1。一些实施方案包括对抗PD-1抗体与另一种抗癌剂组合的使用来治疗癌症，所述另一种抗癌剂优选为抗CTLA-4抗体。在一些其他的实施方案中，选择出适合免疫治疗的受试者，所述选择是以包括测量获取自患者的测试组织样品中PD-L1的表面表达的方法来进行的，所述患者罹患该组织的癌症，所述方法例如确定测试样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例，并基于评估结果来选择免疫治疗的患者，所述评估结果为PD-L1在测试组织样品中的细胞表面上表达。
术语
为了使本公开能够更易于理解，先定义一些术语。如此申请中所用，除本文另行明确提供的之外，下列每个术语应当有下述的含义。另外的定义在整个申请中陈述。
“施用”指的是将包含治疗剂的组合物用本领域技术人员所知的任何各种方法和运送系统物质性地引入受试者。优选的本发明的抗体施用途径包括静脉内的、肌肉内的、皮下的、腹膜内的、脊椎的(spinal)或其他非消化道的施用途径，例如通过注射或输注。短语“非消化道的施用”如本申请所用，意为除了肠道内和局部外用(topical)施用以外的施用模式，通常通过注射，并且无限制地包括：静脉内的、肌肉内的、动脉内的(intraarterial)、鞘膜内的(intrathecal)、淋巴管内的、病损内的、囊内的(intracapsular)、眼眶内的(intraorbital)、心内的、皮内的(intradermal)、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的(subcuticular)、关节内的、囊下的(subcapsular)、蛛网膜下的、脊椎内的(intraspinal)、硬脑膜外的(epidural)和胸骨内的注射和输注，以及体内电穿孔。或者，本发明的抗体可以经非-非消化道的途径来施用，如局部外用的、表皮的或粘膜的施用途径，例如鼻内地、口服地、经阴道地(vaginally)、经直肠地(rectally)、舌下地或局部外用地。施用也可以进行例如一次、多次、和/或一个或多个延长期以上。
如本申请所用，“不良事件”(AE)是任何不利的且通常是无意或不想要的、与药物治疗的使用相关的征候(包括异常的实验室发现)、症状、或疾病。例如，不良事件可以与响应于治疗的免疫系统激活或免疫系统细胞(例如T细胞)膨胀相关。药物治疗可能有一种或多种相关的不良事件，并且每个不良事件可能具有相同或不同水平的严重程度。对能够“改变不良事件”的方法的提述意为将一种或多种与不同的治疗疗法相关的不良事件的发病和/或严重程度降低的治疗疗法。
“抗体”(Ab)应包括而不限于：特异性地结合到抗原且包含至少2个重(H)链和2个轻(L)链的糖蛋白免疫球蛋白或其抗原结合部分，所述重链和轻链通过二硫键互相连接。每个H链包含一个重链可变区(本文缩写为VH)和一个重链恒定区(heavy chain constant region)。所述重链恒定区包含三个恒定域，CH1、CH2和CH3。每个轻链包含一个轻链可变区(本文缩写为VL)和一个轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个恒定域，CL。VH和VL区可以进一步细分为高度变异区(regions of hypervariability)，称为互补决定区(complementaritydetermining region,CDRs)，其散布着更保守的区，称为框架区(frameworkregions,FR)。每个VH和VL包含三个互补决定区和四个框架区，按如下顺序从氨基末端排到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合到宿主组织或因子，包括多种免疫系统的细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
典型地，抗体以高亲和性特异性地结合到其同族(cognate)抗原，所述亲和性通过离解常数(KD)为10-5-10-11M-1或更低来反映。任何高于约10-4M-1的KD通常被认为表示非特异性的结合。如本申请所用，“特异性地结合”到抗原的抗体指的是以高亲和性结合到抗原或基本相同的抗原的抗体，所述亲和性意为具有10-7M或更低的KD，优选为10-8M或更低，更为优选的是5x 10-9M或更低，而最优选的是10-8M-10-10M或更低，但所述抗体不以高亲和性结合到无关的抗原。如果抗原展现出与给定的抗原高度的序列同一性，例如，如果其展现出与给定抗原的序列至少80％、至少90％、优选地为至少95％、或更优选地为至少97％、或甚至更优选地为至少99％的序列同一性，则该抗原与给定抗原是“基本相同的”。举例来说，特异性地结合到人PD-1的抗体可能也与来自一些灵长类种的PD-1抗原具有交叉反应性(cross-reactivity)，但可能不与来自一些啮齿类种的PD-1抗原或除PD-1之外的抗原交叉作用(cross-react)，例如人PD-L1抗原。
免疫球蛋白可以来源于任何通常所知的同种型(isotypes)，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类是本领域技术人员所熟知的，并包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同型体”指的是由重链恒定区基因编码的抗体种类或亚类(例如IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括自然生成的和非自然生成的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人或非人抗体；完全合成抗体；以及单链抗体。非人抗体可通过减少其在人体内免疫原性的重组方法来进行人源化。若无明确记载，且除非上下文另有表示，则术语“抗体”也包括前述免疫球蛋白种任一种的抗原结合片段或抗原结合部分，且包括单价(monovalent)和二价(divalent)片段或部分，以及单链抗体。
“分离抗体”指的是基本去除了其他具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如特异性地结合到PD-1的分离抗体，其基本去除了特异性地结合到除PD-1外的抗原的抗体)。然而，特异性地结合到PD-1的分离抗体可能与其他抗原具有交叉反应性，如来自不同物种的PD-1分子。此外，分离抗体可以是基本去除了其他细胞物质和/或化学物质的。相较而言，“分离的”核酸指的是与自然中存在的核酸显著不同的物质的核酸组合物，即具有与众不同的化学特性、性质和功用。例如，与天然DNA不同，分离DNA是天然DNA的独立部分，并且不是自然中发现的更大的结构复合物——染色体的不可分割的部分。进一步地，与天然基因组DNA不同，分离DNA能典型地在天然基因组DNA不适宜的应用或方法中使用，例如，如除了其他之外，PCR引物或杂交探针用于测量基因表达和检测生物标记物基因或突变以诊断疾病或评估治疗剂的效力。可以用本领域所熟知的标准技术来纯化分离核酸，以便于基本去除其他细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白。分离核酸的例子包括基因组DNA片段、PCR扩增的DNA、cDNA和RNA。
术语“单克隆抗体”(“mAb”)指的是单分子组合物的抗体分子制备物，即呈现出单一结合特异性和对特定表位(epitope)的亲和性且其一级序列基本相同的抗体分子。单克隆抗体是分离抗体的例子。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或其他本领域已知技术来生产。
“人”抗体(HuMAb)指的是具有可变区的抗体，所述可变区中的框架区和CDR区都来源于人种系(germline)的免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系的免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包含不是由人种系的免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变形成(mutagenesis)或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本申请所用，术语“人抗体”并非意在包括这样的抗体，所述抗体中来源于其他哺乳动物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被接到人的框架序列上。术语“人”抗体和“完全人”抗体是同义使用的。
“人源化”抗体指的是这样的抗体，所述抗体中非人抗体的CDR域外的一些、大部分或全部氨基酸被对应的来源于人免疫球蛋白的氨基酸所替代。在一个抗体的人源化形式的实施方案中，CDR域外的大部分或全部氨基酸被来自人免疫球蛋白的氨基酸所替代，但是一个或多个CDR区内的一些、大部分或全部氨基酸不变。对氨基酸小的添加、删除、插入、替换或修饰是允许的，只要它们没有消除抗体结合到特定抗原的能力。“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。
“嵌合抗体”指的是这样的抗体，所述抗体中的可变区来源于一个物种而恒定区来源于另一个物种；如这样的抗体，所述抗体中可变区来源于小鼠抗体而恒定区来源于人抗体。
抗体的“抗原结合部分”(也称作“抗体结合片段”)指的是一个或多个抗体的片段，所述片段保留了特异性地结合到与整个抗体结合的抗原的能力。
“癌症”指的是特征为体内异常细胞不受控制的生长的多种疾病的广域组群。不受调节的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织并可能还通过淋巴系统或血流向身体的远处部位转移。
“免疫响应”指的是免疫系统细胞的活动(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞(eosinophils)、肥大细胞、树突细胞和中性粒细胞(neutrophils))和任何这些细胞或肝脏提供的可溶大分子(包括抗体、细胞因子、和补体)，所述可溶大分子导致从脊椎动物的身体选择性地靶向、结合、损害、摧毁、和/或清除入侵的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞、或者，在自身免疫或病理性炎症的案例中的正常细胞或组织。
“免疫调节物”指的是调节免疫响应的物质、作用剂、信号传输途径或其组分。“调节”、“修饰”或“调整”免疫响应指的是免疫系统细胞中或这些细胞的活性中的任何修改。这些调节包括刺激或抑制免疫系统，其可以通过多种细胞类型的数量增长或减少、这些细胞的活性的增长或减少、或是任何其他能在免疫系统内发生的变化来显现。抑制性和刺激性的免疫调节物已被鉴定，其中一些可能在癌症微环境中具有增强的功能。
术语“免疫治疗”指的是对罹患癌症或有感染(contracting)或经受疾病复发风险的受试者的治疗，所述治疗是通过包括对免疫响应诱导、增强、抑制或其他修饰的方式来进行的。患者的“治疗处理”或“治疗”指的是对受试者进行的任何类型的干预或处理或积极作用剂(active agent)的施用，所述干预或处理或施用的目标在于扭转、缓解、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症、病况或与疾病相关的生化指标的发病(onset)、进展、发展、严重程度、或复发。
“增强内源性免疫响应”意为增加受试者中现有免疫响应的有效性或效能。这种有效性和效能的增加可以通过例如克服抑制内源性宿主免疫响应的机制或通过刺激增强内源性宿主免疫响应的机制来实现。
涉及细胞表面PD-L1表达的“预定的阈值”指的是包含上述肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞的测试组织样品中的细胞比例，所述样品被评分为细胞表面PD-L1表达阳性。对于用单克隆抗体28-8通过IHC测定法的细胞表面表达，细胞表面PD-L1表达的预定的阈值范围为细胞总数的至少约0.01％到至少约20％。在优选的实施方案中，细胞表面PD-L1表达的预定的阈值范围为细胞总数的至少约0.1％到至少约10％。更加优选的是，预定的阈值为至少约5％。还要更优选的是，预定的阈值为至少约1％，或在1-5％的范围中。
“程序性死亡-1(PD-1)”受体指的是属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1主导地在之前激活的体内T细胞上表达，并结合到两种抗体，PD-1和PD-2。如本申请所用，术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同型体和物种同源体，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-1序列可以GenBank登录号No.U64863找到。
“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体中的一种(另一种是PD-L2)，所述配体在结合PD-1时下调T细胞的激活和细胞因子的分泌。如本申请所用，术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同型体和物种同源体，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-L1序列可以GenBank登录号No.Q9NZQ7找到。
“信号转导途径”或“信号传输途径”指的是多种信号转导分子之间的生化关系，所述信号转导分子在信号从细胞的一个部分到细胞的另一个部分的传输中起作用。“细胞表面受体”包括，例如位于细胞表面且能够接收信号并将这种信号传输穿过细胞质膜的分子和分子复合物。本发明的细胞表面受体的一个例子是PD-1受体，其位于激活的T细胞、激活的B细胞和骨髓细胞的表面，并传输信号，所述信号导致肿瘤浸润性的淋巴细胞减少和T细胞增殖的降低。信号传输“抑制剂”指的是通过信号传输途径的任何组分如受体或其配体来对抗(antagonize)或减少信号的抑制、接收或传输的化合物或作用剂，所述信号是刺激性或抑制性的。
“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于：脊椎动物如非人的灵长类，羊(sheep)，狗，猫，兔和白鼬(ferret)，啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠，鸟类物种如鸡，两栖类，以及爬行类。在优选的实施方案中，受试者是哺乳动物如非人类的灵长类、羊、狗、猫、兔、白鼬或啮齿类。在更为优选的实施方案中，受试者为人。术语“受试者”、“患者”和“个体”本文是可交换地使用的。
“治疗上有效量”或“治疗上有效剂量”的药物或治疗剂，如本发明的抗体，是任何这样的剂量的药物，所述剂量当单独使用或于其他治疗剂组合使用时，保护受试者抵抗疾病的发病或促进疾病的消退，所述消退通过疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率和持续期增加、或对因罹患疾病所致的损伤或残疾的预防来证明。治疗剂促进疾病消退的能力能用多种技术人员所知的方法来评估，如在临床试验期间的人受试者中、在对人类中的效力有预测性的动物模型系统中、或通过在体外测定法中测定所述作用剂的活性。
举例来说，抗癌剂在受试者中促进癌症的消退。在优选的实施方案中，治疗上有效量的药物促进癌症消退至清除癌症的程度。“促进癌症消退”意为单独或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物导致了肿瘤生长或大小上的降低、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度减低、疾病无症状期的频率和持续期增加、或对因罹患疾病所致的损伤或残疾的预防。另外，术语关于治疗的“有效”和“有效性”包括药学上的有效性和生理学上的安全性。药学上的有效性指的是药物在患者中促进癌症消退的能力。生理学上的安全性指的是药物施用引起的毒性的等级，或细胞、器官和/或组织层面的其他不良生理作用(不良作用)。
对肿瘤的治疗举例来说，优选的治疗上有效量的药物相对于未治疗的受试者抑制至少约20％的细胞生长或肿瘤生长，更优选的抑制至少约40％、更优选的抑制至少约60％、更优选的抑制至少约80％的细胞生长或肿瘤生长。在本发明其他优选的实施方案中，肿瘤消退可能被观察到并持续至少约20天的时期，更优选的是至少约40天，或更优选的是至少约60天。尽管有这些最终的治疗有效性测量，对于免疫治疗药物的评估也必须考虑到“免疫相关的”响应模式。
“免疫相关的”响应模式指的是在用免疫治疗剂治疗的患者中观察到的临床响应模式，所述免疫治疗剂通过引入癌症特异性的免疫响应或通过修饰天然免疫进程来产生抗肿瘤效果。这种响应模式的特征是有益的治疗效果，所述治疗效果是在肿瘤负荷的初始增长或新病损的出现之后的，所述新病损在传统的化疗剂评估中被归类为疾病进展，并且与药物失败同义。因此，免疫治疗剂的适当评估需要对这些作用剂对靶标疾病的效果的长期监测。
治疗上有效量的药物包括“预防上的有效量”，其是任何这样的量的药物，所述的量的药物在单独或与抗肿瘤剂组合对有患上癌症(例如具有恶化前病况的患者)或罹患癌症复发风险的患者施用时，抑制癌症的患病或复发。在优选的实施方案中，预防上的有效量完全预防癌症的患病或复发。“抑制”癌症的患病或复发意为或是降低癌症患病或复发的可能性，或是完全预防预防癌症的患病或复发。
“肿瘤浸润性的炎症细胞”是在受试者中典型地参与炎症响应且浸润肿瘤组织的任何类型的细胞。这些细胞包括肿瘤浸润性的淋巴细胞(TILs)、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、组织细胞(histiocyte)和树突细胞。
提供选择性的用法(例如“或”)应理解为意指可选项中任何一个、全都、或任何其组合。如本申请所用，不定冠词“一个”或“一种”应理解为指“一个/种或更多”的任何记载或枚举的成分。
术语“约”或“基本上包含”指的是值或组成是在特定值或组成的可接受误差范围内的，所述范围如本领域普通技术人员所确定，其部分取决于所述值或组成的测量或确定方式，即对测量系统的限制。例如，“约”或“基本上包含”可以意指本领域中每次实践有1或1以上的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可以意指多至20％的范围。此外，特别相对于生物系统或进程，所述术语可以意指多至一个数量级或多至5倍的值。当在申请或权利要求中提供了特定的值或组成，除非另有说明，“约”或“基本上包含”的含义应假设为在所述特定的值或组成的可接受误差范围内。
如本申请所述，任何浓度范围、百分率范围、比率范围或整数(integer)范围理解为包含任何记载范围内的整数的值，以及，当合适时，包含其分数(fractions)(如整数的十分之一或百分之一)，除非另有指明。
本发明的各种方面在如下的段落中进一步详细描述。
本发明的抗体
本发明的抗体包括各种具有本申请描述的结构和功能特性的抗体，包括分别与PD-1或PD-L1高亲和性的结合。这些抗体可以用作例如治疗性抗体，以治疗罹患疾病的受试者或用作检测它们的同类抗原的诊断测定法中的试剂。以高亲和性特异性地结合到PD-1的人单克隆抗体(HuMAbs)(例如结合到人PD-1且可能与来自其他物种如食蟹猴(cynomolgus monkey)的PD-1交叉反应)在美国专利No.8,008,449中公开，而以高亲和性特异性地结合到PD-L1的人单克隆抗体在美国专利No.7,943,743中公开。本发明的抗体包括但不限于美国专利No.8,008,449和No.7,943,743中分别公开的所有的抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。其他抗PD-1单克隆抗体已在例如美国专利No.6,808,710、No.7,488,802和No.8,168,757以及PCT公开号WO 2012/145493中描述，而抗PD-L1单克隆抗体则在例如美国专利No.7,635,757和No.8,217,149、美国公开号2009/0317368、以及PCT公开号WO 2011/066389和WO 2012/145493中描述。这些抗PD-1和抗PD-L1单克隆抗体对于本申请公开的本发明的抗体结构和功能上的特性的呈现程度，它们也被包括为本发明的抗体。
本发明的抗PD-1抗体
每个在美国专利No.8,008,449中公开的抗PD-1人单克隆抗体已表明呈现一种或多种下列特征：(a)以1x 10-7M或更低的KD(如用Biacore生物感应器系统通过表面等离子体共振所确定的)结合到人PD-1；(b)基本上不结合到人CD28、CTLA-4或ICOS；(c)在混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)测定法中增加T细胞增殖；(d)在MLR测定法中增加干扰素γ的产生；(e)在MLR测定法中增加IL-2分泌；(f)结合到人PD-1和食蟹猴PD-1；(g)抑制PD-L1和/或PD-L2对PD-1的结合；(h)刺激抗原特异性的记忆响应；(i)刺激抗体响应；以及(j)抑制体内肿瘤细胞生长。本发明的抗PD-1抗体包括特异性地结合到人PD-1并呈现出至少一种、优选为至少五种前述特征的单克隆抗体。
美国专利No.8,008,449例示了7种抗PD-1人单克隆抗体：17D8、2D3、4H1、5C4(本文也称为nivolumab或BMS-936558)、4A11、7D3和5F4。编码这些抗体的重链和轻链可变区的分离DNA分子经过测序，可变区的氨基酸序列从其中推导出来。本文将17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VH氨基酸序列分别以SEQ ID NOs:1、2、3、4、5、6和7提供。本文将17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5H4的VL氨基酸序列分别以SEQ ID NOs:8、9、10、11、12、13和14提供。
本发明优选的抗PD-1抗体包括抗PD-1人单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4。这些优选的抗体特异性地结合到人PD-1并且包含：(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQID NO:1中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:8中所示的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:2中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:9中所示的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:3中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:10中所示的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:4中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:11中所示的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:5中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:12中所示的序列；(f)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:6中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:13中所示的序列；或(g)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:7中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:14中所示的序列。
考虑到这些抗体每个都能结合到PD-1，VH和VL序列能够进行“混合和搭配”以生成本发明的其他抗PD-1抗体。这些“混合和搭配”的抗体的PD-1结合能够用结合测定法来测试，例如本领域所熟知的酶联免疫吸附测定法(ELISAs)、蛋白质印迹、放射免疫测定法和Biacore分析(参见例如美国专利No.8,008,449)。优选地，当将VH和VL链混合和搭配时，来自特定的VH/VL配对的VH序列用结构上相似的VH序列来替代。同样地，优选地，来自特定的VH/VL配对的VL序列用结构上相似的VL序列来替代。因此，本发明的抗PD-1抗体包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括：(a)重链可变区，所述重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1、2、3、4、5、6和7，以及(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NOs:8、9、10、11、12、13和14，其中所述抗体特异性地结合PD-1，优选为人PD-1。
上述抗体的CDR域已用Kabat系统来绘制，并且这些抗体还可以通过它们3个重链和3个轻链CDR的组合来定义(参见美国专利No.8,008,449)。因为这些抗体每个都能结合到PD-1并且抗原结合特异性主要是通过CDR1、CDR2和CDR3区提供的，VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VκCDR1、CDR2和CDR3序列可以进行“混合和搭配”(即来自不同抗体的CDR可以进行混合和搭配，虽然每个抗体必须包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VκCDR1、CDR2和CDR3)，以生成同样构成本发明抗体的其他抗PD-1抗体。这些“混合和搭配”的抗体的PD-1结合可以用上述的结合测定法来测试(例如ELISA、蛋白质印迹、放射免疫测定法和Biacore分析)。
本发明的抗体还包括特异性地结合到PD-1且包含来源于具体种系重链免疫球蛋白的重链可变区和/或来源于具体种系轻链免疫球蛋白的轻链可变区的分离抗体。具体来说，在一些实施方案中，本发明的抗体包括分离抗体，其包含：(a)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 3-33或4-39种系序列的序列；和/或包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL6或L15种系序列的序列。VH 3-33、VH 4-39、VκL6和VκL15种系基因编码的VH和Vκ区的氨基酸序列在美国专利No.8,008,449中提供。
如本申请所用，通过比较的人抗体的氨基酸序列和人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列以及选择在序列上最接近(即序列同一性的百分率最高)人抗体序列的人种系免疫球蛋白序列，能将抗体鉴定为包含“来源于”具体的人种系免疫球蛋白的重链或轻链可变区。与种系序列相比，“来源于”特定人种系免疫球蛋白的人抗体可以包含氨基酸差异，所述差异是由于例如自然发生的体细胞突变或目的性地引入定点突变(site-directed mutation)。然而，选择出的人抗体通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90％相同，且含有将人抗体识别为人源的氨基酸残基，所述识别是与其他物质的种系免疫球蛋白(例如鼠种系序列)氨基酸序列比较时进行的。在一些案例中，人抗体在氨基酸序列上可能与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％，或甚至至少96％、97％、98％、或99％相同。
在一些实施方案中，来源于特定人种系序列的人抗体的序列呈现出与人种系免疫球蛋白编码的氨基酸序列不多于10个氨基酸的差异。在其他实施方案中，人抗体可能呈现出与人种系免疫球蛋白编码的氨基酸序列不多于5个，或甚至不多于4、3、2、或1个个氨基酸的差异。
本发明优选的抗体也包括这样的分离抗体或其抗原结合部分，其含有：(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 3-33种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL6种系序列的序列；或(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 4-39种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL15种系序列的序列。分别具有来源于VH 3-33和VκL6种系序列的VH和Vκ的例子包括17D8、2D3、4H1、5C4、和7D3。分别具有来源于VH 4-39和VκL15种系序列的VH和Vκ的例子包括4A11和5F4。
在其他的实施方案中，本发明的抗PD-1抗体包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区具有与本申请描述的优选的抗PD-1抗体的氨基酸序列是高度相似或同源的氨基酸序列，其中所述抗体保留了本发明优选的抗PD-1抗体的功能特性。例如，本发明的抗体包括这样的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含具有与选自下组的氨基酸序列至少80％相同的连续连接的氨基酸：SEQ ID NOs.1、2、3、4、5、6和7，而轻链可变区包含具有与选自下组的氨基酸序列至少80％相同的连续连接的氨基酸：SEQ ID NOs.8、9、10、11、12、13和14。在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可能展现出与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
如本申请所用，两个序列(氨基酸或核苷酸序列)之间的百分率序列同一性(也称为百分率序列同源性)是序列共有的相同位置数相对于比较的序列长度的函数(function)(即％同一性＝相同位置数/比较的位置总数x100)，要考虑到任何间隔(gaps)数和每个间隔的长度，引入所述间隔是为了将两个序列之间的序列同一性最大化。序列的比较和两个序列之间百分率同一性的确定能用数学算法来完成，所述数学算法是本领域普通技术人员已知的(参见美国专利No.8,008,449)。
当序列差异是保守修饰时，具有非常相似的氨基酸序列的抗体可能具有本质上相同的功能特性。如本申请所用，“保守的序列修饰”指的是对含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征没有显著影响的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。保守的氨基酸替换是这样的替换，在所述替换中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基来替代。因而，例如本发明抗体CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自同一个侧链家族的其他氨基酸残基来替代，并且修改后的抗体可以用本领域所熟知的功能性测定法来测试其保留的功能。因此，本发明的抗PD-1抗体的一些实施方案包含各自包含CDR1、CDR2和CDR3域的重链和轻链可变区，其中一个或多个这些CDR域包含连续连接的氨基酸或其保守修饰，所述连续连接的氨基酸具有与本文所述的优选的抗PD-1抗体(例如17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4)的CDR序列同样的序列，而其中所述抗体保留着本发明优选的抗PD-1抗体所需的功能特性。
进一步地，本领域已熟知，重链CDR3是抗体的结合特异性和亲和性的主要决定因素，并且基于共同的CDR3序列能可预测地产生具有同样的结合特征的多种抗体(参见例如Klimka等.,2000；Beiboer等,2000；Rader等,1998；Barbas等,1994；Barbas等,1995；Ditzel等,1996；Berezov等,2001；Igarashi等,1995；Bourgeois等,1998；Levi等,1993；Polymenis和Stoller,1994；以及Xu andDavis,2000)。上述出版物表明，通常而言，一旦限定了(defined)给定抗体的重链CDR3序列，则其他5个CDR序列中的可变性对此抗体的结合特异性没有很大的影响。因而，本发明的包含6个CDR的抗体能通过详细说明(specifying)重链CDR3域的序列来限定。
本发明的抗PD-1抗体还包括特异性地结合到人PD-1的并与人单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4中任一种交叉竞争结合到人PD-1的分离抗体。因而，本发明的抗PD-1抗体包括与参考抗体(reference Ab)或其参考抗原结合部分(reference antigen-binding portion)交叉竞争结合到PD-1的分离抗体或其抗原结合部分，所述参考抗体或其参考抗原结合部分包括：(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:1中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:8中所示的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:2中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQID NO:9中所示的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:3中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:10中所示的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQID NO:4中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:11中所示的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:5中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:12中所示的序列；(f)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:6中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:13中所示的序列；或(g)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:7中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:14中所示的序列。
抗体交叉竞争结合到抗原的能力表示这些抗体结合到抗原的同一(same)表位区(即同一表位，或者重叠的或邻近的表位)，并对其他对这个具体表位区交叉竞争的抗体产生空间位阻(sterically hinder)。因而，测试抗体竞争性抑制例如17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4结合到人PD-1的能力表明，测试抗体分别与17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4结合到相同的人PD-1的表位区。在本发明的抗体中，包括了所有结合到人PD-1的与人单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4同一表位区的分离抗体。这些交叉竞争的抗体据预计具有非常相似的功能特性，作出所述预计是由于它们结合到PD-1的同一表位区。例如，交叉竞争的抗PD-1单克隆抗体5C4、2D3、7D3、4H1和17D8已显示具有相似的功能特性(参见美国专利No.8,008,449的实施例3-7)。交叉竞争的程度越高，其功能特性越相似。进一步地，交叉竞争的抗体可以很容易基于它们在标准PD-1结合测定法中与17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4交叉竞争的能力来鉴定。例如，可以用Biacore分析、ELISA测定法或流式细胞术来证明与本发明的抗体的交叉竞争(参见例如，实施例1和2)。
在一些实施方案中，所述与17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4交叉竞争结合到PD-1的，或是与它们结合到PD-1的同一表位区的抗体是单克隆抗体。为了对人患者施用，这些交叉竞争的抗体优选为嵌合抗体、或更优选的为人源化或人抗体。这些人单克隆抗体能够如美国专利No.8,008,449中所述来制备和分离。实施例1中提供的数据显示5C4或其Fab片段与2D3、7D3、4H1或17D8交叉竞争结合到细胞表面表达的hPD-1，这表示所有5个抗PD-1单克隆抗体全都结合到hPD-1的同一表位区(图1A-1C)。
本发明的一种抗PD-1抗体进一步能够用具有一个或多个本申请公开的VH和/或VL序列来制备，所述VH和/或VL序列作为起始物料来构造(engineer)修饰的抗体，其修饰抗体可以具有从起始抗体修改过的特性。抗体能通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内的一个或多个残基来进行构造，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内。额外地或供选择地，抗体能通过修饰恒定区内的残基来进行构造，例如修改抗体效应功能(effectorfunction)。对抗体的具体的修饰包括：CDR移接(grafting)、VH和/或VκCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基位点特异性突变(site-specific mutation)从而提高抗体的一个或更多结合特性(例如亲和性)、VH和/或Vκ框架区内的氨基酸残基位点特异性突变从而降低抗体的免疫原性、Fc区内的修饰(典型地修改抗体的一个或多个功能特性，如血清半衰期、补体固定(complementfixation)、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性)、以及化学修饰例如聚乙二醇化或糖基化模式的改变以增加或减少抗体的生物(例如血清)半衰期。这些修饰的具体例子和构造抗体的方法在美国专利No.8,008,449中有详细描述。本发明的抗PD-1抗体包括所有这种构造的抗体，所述构造的抗体特异性地结合到人PD-1，并通过对任何上述抗PD-1抗体的修饰而获得。
本发明的抗PD-1抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。已充分证明，抗体的抗原结合功能能够通过全长抗体的片段来发挥。抗体的术语“抗原结合部分”内涵盖的(encompassed)结合片段包括：(i)Fab片段，由VL,VH,CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含两个在铰链区(hinge region)通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)包含VH和CH1域的Fd片段；以及(iv)包含抗体单臂的VL和VH域的Fv片段。
这些片段最初是通过用酶(如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)蛋白质水解来获得的，所述片段随后被构建为单价和多价的抗原结合片段。例如，虽然Fv片段的两个域VL和VH是由分开的基因指定编码的(coded for)，但它们能用重组方法通过合成的连接肽(linker peptide)来连结(joined)，所述连接肽使它们能制成单蛋白链，在其中VL和VH区配对形成单价分子(被称为单链可变片段(scFv))。二价(divalent)或二价体(bivalent)scFvs(di-scFvs或bi-scFvs)能够通过连接两个scFvs在单肽链内构建，被称为串联的scFv，包含两个VH和两个VL区。ScFv二聚体(dimers)和更高的多聚体也可以用少于10个氨基酸的连接肽来构建，所述连接肽太短而不足以使两个可变区叠合起来，这迫使scFv二聚化并产生双体(diabodies)或形成其他多聚体。已显示双体以比对应的scFv更高的亲和性结合到它们的同族抗原，且具有比scFvs的KD值低至40倍的离解常数(dissociation constants)。非常短的接头(linkers)(≤3个氨基酸)导致三价三体(trivalent triabodies)或四价四体(tetravalent tetrabodies)的形成，所述三价三体和四价四体对它们的抗原展现出比双体还要更高的亲和性。其他变体包括微型抗体(minibodies)，其为scFv-CH3二聚体、和更大的scFv-Fc片段(scFv-CH2-CH3二聚体)，而即使是分离的CDR也可能展现出抗原结合功能。这些抗体片段是用本领域技术人员所知的常规的重组技术来构造的，并且这些片段以与完整抗体相同的方式进行实用性筛选。所有上述的蛋白水解的和构造的抗体片段和变体(更多详情参见Hollinger和Hudson,2005；Olafsen和Wu,2010)是意在包含于抗体的术语“抗原结合部分”之内的。
本发明的抗PD-L1抗体
每个在美国专利No.7,943,743中公开的抗PD-L1人单克隆抗体均已表明了呈现出一种或多种如下特征：(a)以1x 10-7M或更低的KD(如用Biacore生物感应器系统通过表面等离子体共振所确定的)结合到人PD-1；(b)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中增加T细胞增殖；(c)在MLR测定法中增加干扰素γ的产生；(d)在MLR测定法中增加IL-2分泌；(e)刺激抗体响应；(f)抑制PD-L1对PD-1的结合；以及(g)逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的抑制作用。本发明的抗PD-1抗体包括特异性地结合到人PD-1并呈现出至少一种、优选为至少四种前述特征的单克隆抗体。
美国专利No.7,943,743例示了10种抗PD-L1人单克隆抗体：3G10、12A4(本文也称为BMS-936559)、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4。编码这些抗体的重链和轻链可变区的分离DNA分子经过测序，可变区的氨基酸序列从其中推导出来。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VH氨基酸序列分别在SEQ ID NOs.15,16,17,18,19,20,21,22,23和24中显示，而他们的VL氨基酸序列分别在SEQ ID NOs.25,26,27,28,29,30,31,32,33和34中显示。
本发明优选的抗PD-L1抗体包括抗PD-L1人单克隆抗体3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4。这些优选的抗体特异性地结合到人PD-L1并且包含：
(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:15中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:25中所示的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:16中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:26中所示的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:17中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:27中所示的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:18中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:28中所示的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:19中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:29中所示的序列；(f)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:20中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:30中所示的序列；(g)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:21中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:31中所示的序列；(h)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:22中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:32中所示的序列；(i)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:23中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:33中所示的序列；或(j)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:24中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:34中所示的序列。
考虑到这些抗体每个都能结合到PD-L1，VH和VL序列能够进行“混合和搭配”以生成本发明的其他抗PD-L1抗体。这些“混合和搭配”的抗体的PD-L1结合能够用结合测定法来测试，例如本领域所熟知的ELISAs、蛋白质印迹、放射免疫测定法和Biacore分析(参见例如美国专利No.7,943,743)。优选地，当将VH和VL链混合和搭配时，来自特定的VH/VL配对的VH序列用结构上相似的VH序列来替代。同样地，优选地，来自特定的VH/VL配对的VL序列用结构上相似的VL序列来替代。因此，本发明的抗PD-L1抗体包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NOs:15,16,17,18,19,20,21,22,23或24中任一项所述序列的连续连接的氨基酸，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NOs:25,26,27,28,29,30,31,32,33或34中任一项所述序列的连续连接的氨基酸，其中所述抗体特异性地结合PD-L1，优选为人PD-L1。
上述抗PD-L1人单克隆抗体的CDR域已用Kabat系统来绘制，并且这些抗体还可以通过它们3个重链和3个轻链CDR的组合来定义(参见美国专利No.7,943,743)。因为这些抗体每个都能结合到PD-L1并且抗原结合特异性主要是通过CDR1、CDR2和CDR3区提供的，VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VκCDR1、CDR2和CDR3序列可以进行“混合和搭配”(即来自不同抗体的CDR可以进行混合和搭配，虽然每个抗体必须包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VκCDR1、CDR2和CDR3)，以生成同样构成本发明抗体的其他抗PD-L1抗体。这些“混合和搭配”的抗体的PD-L1结合可以用例如ELISA、蛋白质印迹、放射免疫测定法和Biacore分析来测试。
本发明的抗体还包括特异性地结合到PD-L1且包含来源于具体种系重链免疫球蛋白的重链可变区和/或来源于具体种系轻链免疫球蛋白的轻链可变区的分离抗体。具体来说，在一些实施方案中，本发明的抗体包括分离抗体，其包含：(a)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-18、1-69、1-3或3-9的种系序列的序列；和/或包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL6、L15、A27或L18种系序列的序列。VH 1-18、VH 1-3、VH 1-69、VH 3-9、VκL6、VκL15和VκA27种系基因编码的VH和Vκ区的氨基酸序列在美国专利No.7,943,743中提供。
本发明优选的抗体包括这样的分离抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-18种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL6种系序列的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-69种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL6种系序列的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-3种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL15种系序列的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-69种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκA27种系序列的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 3-9种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL15种系序列的序列；或(f)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 3-9种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL18种系序列的序列。
分别具有来源于VH 1-18和VκL6种系序列的VH和Vκ的抗体的例子是3G10。分别具有来源于VH 1-69和VκL6种系序列的VH和Vκ的抗体的例子包括12A4,1B12,7H1和12B7。分别具有来源于VH 1-3和VκL15种系序列的VH和Vκ的抗体的例子是10A5。分别具有来源于VH 1-69和VκA27种系序列的VH和Vκ的抗体的例子包括5F8,11E6和11E6a。分别具有来源于VH 3-9和VκL15种系序列的VH和Vκ的抗体的例子是10H10。分别具有来源于VH 1-3和VκL15种系序列的VH和Vκ的抗体的例子是10A5。分别具有来源于VH 3-9和VκL18种系序列的VH和Vκ的抗体的例子是13G4。
在一些实施方案中，本发明的抗PD-L1抗体包含重链和轻链可变区，其具有与本文所述优选的抗PD-L1抗体的氨基酸序列高度相似或同源的氨基酸序列，其中所述抗体保留前述本发明抗PD-L1抗体的功能特性。例如，本发明的抗体包括包含重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链可变区包含具有与选自下组的氨基酸序列至少80％相同的连续连接的氨基酸：SEQ ID NOs.15、16、17、18、19、20、21、22、23和24，而轻链可变区包含具有与选自下组的氨基酸序列至少80％相同的连续连接的氨基酸：SEQ IDNOs.25、26、27、28、29、30、31、32、33和34。在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可能展现出与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明的抗PD-L1抗体的一些实施方案包含各自包含CDR1、CDR2和CDR3域的重链和轻链可变区，其中一个或多个这些CDR域包含连续连接的氨基酸或其保守修饰，所述连续连接的氨基酸具有与本文所述的优选的抗PD-L1抗体(例如3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4)的CDR序列同样的序列，而其中所述抗体保留着本发明优选的抗PD-L1抗体所需的功能特性。
基于重链CDR3是抗体的结合特异性和亲和性的主要的决定因素的证据，通常当给定抗体的重链CDR3序列被限定时，其他5个CDR序列的变异性(variability)不会对抗体的结合特异性有大的影响。因此，本发明的抗PD-L1抗体包括包含6个CDR的分离抗体，其中所述抗体是通过详细说明重链CDR3域序列来限定的。
本发明的抗PD-L1抗体还包括特异性地结合到人PD-L1的并与人单克隆抗体3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4中任一种交叉竞争结合到人PD-L1的分离抗体。因而，本发明的抗PD-L1抗体包括与参考抗体或其参考抗原结合部分交叉竞争结合到人PD-L1的分离抗体或其抗原结合部分，所述参考抗体或其参考抗原结合部分包括：(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:15中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:25中所示的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:16中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:26中所示的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:17中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:27中所示的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:18中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:28中所示的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:19中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:29中所示的序列；(f)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:20中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:30中所示的序列；(g)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:21中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:31中所示的序列；(h)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:22中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:32中所示的序列；(i)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:23中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:33中所示的序列；或(j)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:24中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:34中所示的序列。
抗体与3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4中任一个交叉竞争结合到人PD-L1的能力表明这种抗体分别与3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4结合到相同的人PD-1的表位区。在本发明的抗体中，包括了所有结合到人PD-L1的与3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4同一表位区的分离抗体。这些交叉竞争的抗体据预计具有非常相似的功能特性，作出所述预计是由于它们结合到PD-L1的相同表位区。例如，交叉竞争的抗PD-L1单克隆抗体3G10、1B12、13G4、12A4(BMS-936559)、10A5、12B7、11E6和5F8已显示具有相似的功能特性(参见美国专利No.7,943,743的实施例3-11)，但结合到不同的表位区的单克隆抗体10H10表现有所不同(参见美国专利No.7,943,743的实施例11)。交叉竞争的程度越高，其功能特性越相似。进一步地，交叉竞争的抗体能用例如Biacore分析、ELISA测定法或流式细胞术来鉴定，这是本领域所熟知的。在优选的实施方案中，与3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4交叉竞争结合到人PD-L1/PD-1或与其结合到人PD-L1相同表位区的抗体是单克隆抗体，优选为嵌合抗体，或更优选地为人源化或人抗体。这些人单克隆抗体能按照美国专利No.7,943,743中所述来制备和分离。
实施例2中提供的数据显示，抗PD-L1人单克隆抗体5F8、7H1、1B12、3G10、10A5、11E6、12A4、12B7和13G4的每一个，即除10H10以外的所有测试的人单克隆抗体，基本上阻碍了单克隆抗体3G10、10A5、11E6、12A4和13G4对表达PD-L1细胞的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的结合。人单克隆抗体10H10仅是基本上阻碍了自身与CHO/PD-L1细胞的结合。这些数据显示3G10、10A5、11E6、12A4和13G4与除10H10以外所有测试的人单克隆抗体交叉竞争结合到人PD-L1的相同的表位区(图2A-F)。
实施例3提供的数据显示，人单克隆抗体12A4与表达PD-L1细胞的ES-2卵巢癌细胞的结合被12A4自身以及1B12和12B7基本上阻碍了，并且被5F8、10A5、13G4和3G10中等至显著地阻碍，但不被单克隆抗体10H10阻碍。这些数据与实施例2中的数据大部分一致，显示了12A4自身和另外2种人单克隆抗体1B12和12B7，与12A4交叉竞争结合到人PD-L1的相同的表位区，可能是相同的表位；5F8、10A5、13G4和3G10展示出显著但较低水平的与12A4的交叉竞争，说明这些单克隆抗体可能结合到与12A4表位有重叠的表位上；然而10H10与12A4完全没有交叉竞争(图3)，说明这个单克隆抗体结合到与12A4不同的表位区。
本发明的抗PD-L1抗体还包括从具有一个或多个本申请公开的VH和/或VL序列的抗体起始来构造的抗体，该构造抗体可能具有与起始抗体相比改变了的特性。抗PD-L1抗体可以通过多种修饰来构造，所述修饰是如上述用于构造修饰的本发明的抗PD-L1抗体的修饰。
本发明的抗PD-L1抗体还包括由其在福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织样本中结合到PD-L1的能力而选出的分离抗体。FFPE样品的使用对于PD-L1在肿瘤中的表达与疾病预后或进展之间的关联的长期后续分析是非常重要的。但是，因为分离抗-人PD-L1抗体、以及特别是在这些组织中特异性地结合到膜(membranous)PD-L1的抗体是困难的，所以对于测量PD-L1表达的研究经常在冷冻的样本上进行，其中所述抗-人PD-L1抗体通常可以用于在FFPE样本中通过IHC进行PD-L1染色(Hamanishi等,2007)。在认为PD-L1表达与疾病预后有关联的文献中报道的一些迥然不同的数据，其原因可能是使用不同的抗体在冷冻对比FFPE样本(frozen versus FFPE tissues)中对PD-L1进行染色，以及一些抗体区分膜和/或胞质型的PD-L1的能力(Hamanishi等,2007；Gadiot等,2011)。本公开提供了一些在FFPE组织样品中以高亲和性特异性地结合到膜人PD-L1的兔单克隆抗体，所述FFPE组织样品包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞。
兔与小鼠抗hPD-L1单克隆抗体如实施例9所述生产。在筛选的近200种多克隆抗体中，仅发现10种兔多克隆抗体特异性地检测膜型的PD-L1，并且前五位的多克隆(指定号：13、20、28、29和49)是后来被亚克隆的。对膜PD-L1特异性地产生最强劲检测的克隆是兔克隆28-8，其被选出用于IHC测定法。单克隆抗体28-8的可变区序列分别在SEQ ID NOs.35和36中列出。单克隆抗体28-8的重链和轻链CDR域的序列，如Kabat系统所绘制，在SEQ ID NOs.37-42中列出。在对FFPE组织中的膜PD-L1的稳固(robust)检测方面，次好的单克隆抗体是兔克隆28-1、28-12、29-8和20-12。
本发明的抗PD-L1抗体还包括上述抗体的抗原结合部分，包括Fab、F(ab’)2Fd、Fv、和scFv、di-scFv或bi-scFv、和scFv-Fc片段、双体、三体、四体、以及分离CDR(更详细信息请参见Hollinger和Hudson,2005；Olafsen和Wu,2010,)。
编码本发明抗体的核酸分子
本公开的另一个方面是关于编码本发明的任一种抗体的分离核酸分子。这些核酸分子可能存在于整个细胞中、细胞裂解产物中、或以部分纯化或基本纯化的形式纯在。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可包含或不包含基因内(intronic)序列。在优选的实施方案中，所述核酸是cDNA。
本发明的核酸可以用标准分子生物学技术获得。对于通过杂交瘤(例如从携带下述人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码所述通过杂交瘤制成的抗体的重链和轻链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术来获得。编码从免疫球蛋白基因文库(例如用噬菌体展示技术)获得的抗体的核酸可以从文库回收(recovered)。
本发明优选的核酸分子是编码抗PD-1人单克隆抗体VH和Vκ序列的那些，以及编码抗PD-L1人单克隆抗体VH和Vκ序列的那些；所述抗PD-1人单克隆抗体为17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4(参见美国专利No.8,008,449)；所述抗PD-L1人单克隆抗体为3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4(参见美国专利No.7,943,743)。编码VH区的分离DNA可以通过将VH编码DNA操作性地连接到另一个编码重链恒定区(CH1,CH2和CH3)的DNA分子上，而转换为全长重链基因；其中所述重链恒定区的序列是本领域已知的且能通过标准PCR扩增而获得。所述重链恒定区可以是IgG1,IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但优选为IgG1或IgG4恒定区。相似地，编码VL区的分离DNA可以通过将VL编码DNA操作性地连接到另一个编码轻链恒定区(CL)的DNA分子上，而转换为全长轻链基因；其中所述轻链恒定区的序列是本领域已知的且能通过标准PCR扩增而获得。所述轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选的是κ恒定区。
药物组合物
本发明的抗体可以组成组合物，例如药物组合物，所述药物组合物包含一种抗体或抗体的组合，或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载剂(carrier)。如本申请所用，“药学上可接受的载剂”包括任何及全部生理学上可相容的溶剂、分散介质(dispersion media)、包衣(coatings)、抗菌剂和抗真菌剂、等渗(isotonic)及吸收延缓剂等等。优选的载剂是适合于静脉内的、肌肉内的、皮下的、非消化道的、脊椎的或表皮施用(例如通过注射或输注)。本发明的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐、抗氧化剂、水和非水的载剂、和/或佐剂(adjuvants)如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
调整给药方案以提供最佳的所需响应，例如治疗响应或最小的不良反应。对于抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的施用，其剂量范围为约0.0001-约100mg/kg，通常从约0.001-约20mg/kg，而更通常从约0.01-约10mg/kg受试者的体重。优选的剂量在0.1-10mg/kg体重的范围内。例如，剂量可以是0.1、0.3、1、3、5或10mg/kg体重，且更优选0.3、1、3、或10mg/kg体重。给药方案的典型目的在于达到暴露度(exposures)，所述暴露度导致持续的受体占用率(receptoroccupancy,RO)，所述受体占用是基于抗体典型的药代动力学特性。代表性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3到6个月一次的施用。其剂量和方案安排可能在一个疗程中有变化。例如，给药方案可能包含这样来施用抗体：(i)每两周施用，六周为一个周期；(ii)每四周施用6个剂量，然后每3个月施用；(iii)每三周施用；(iv)3-10mg/kg体重一次，然后是每2-3周施用1mg/kg体重。考虑到IgG4抗体典型地具有2-3周的半衰期，本发明优选的抗PD-1或抗PD-L1抗体给药方案包括0.3-10mg/kg体重，优选为3-10mg/kg体重，更优选为3mg/kg体重通过静脉内施用，所述抗体每14天给予多至6周或12周的周期，直至完全响应或确认疾病进展。
在一些方法中，同时施用了具有不同结合特异性的两种或更多的单克隆抗体，在该案例中每种抗体施用的剂量落在指定的范围内。抗体通常在多重情形下(multiple occasions)施用。单个剂量之间的间隔可以是，例如每周、每2周、每3周、每月、每3个月或每年。间隔也可以是不规律的，其如患者体内抗体的血液水平测量所示，所述抗体是针对(to)靶抗原的抗体。在一些方法中，调整了剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，而在一些方法中该浓度为约25-300μg/ml。
或者，可以将抗体作为缓释作用剂来施用，在该案例中需要的施用频率较低。剂量和频率根据抗体在患者体内的半衰期而变化。一般来说，人抗体显示出最长的半衰期，然后是人源化抗体，以及非人抗体。其施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性的应用中，以相对低频的间隔、相对低的剂量典型施用长的时期。一些患者在他们的余生中继续接受治疗。在治疗性的应用中，需要相对短的间隔、相对高的剂量，直到进步的进展减少或终止，而优选的是直到患者显示部分或完全的疾病症状改善。其后，可以对施用预防性疗法。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以有变化，以便获得一定量的活性成分，所述活性成分对于为为具体的患者、组合物、以及施用模式达到所需的治疗响应是有效的，且对患者没有过度的毒性。选定的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括本发明具体采用的组合物的活性、施用途径、施用时间、采用的具体化合物的分泌速度、治疗持续时间、与采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、接受治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、总体健康度及既往病史、以及医疗领域所熟知的其他等等因素。本发明的组合物可以通过一种或多种施用途径，用一种或多种各种本领域所熟知的方法来施用。如本领域的熟练技术人员所知，施用的途径和/或模式根据所需的结果而变化。
本发明的用途和方法
本发明的抗体、抗体组合物、核酸及方法具有许多体内和体外的实用用途，包括例如确定及对PD-1或PD-L1的表达定量的方法，包括抗体对靶多肽的结合或测量编码这些多肽的核酸的量；以及用于罹患疾病的受试者的免疫治疗的方法，包括对受试者施用包含治疗上有效量的治疗剂，所述治疗剂抑制来自抑制性免疫调节物的信号传输。在后一个方法的优选实施方案中，所述抑制性免疫调节物是PD-1/PD-L1信号传输途径的组分，而所述治疗剂破坏这条途径的信号传输。更优选的是，所述治疗剂是破坏PD-1和PD-L1之间相互作用的抗体。在这个方法的一些优选的实施方案中，所述抗体特异性地结合到PD-1并阻碍PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用。在其他优选的实施方案中，所述治疗剂是特异性地结合到PD-L1并阻碍PD-L1与PD-1和/或B7-1(CD80)相互作用的抗体。因而，本公开提供了用于在受试者中加强免疫响应的方法，包括施用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体以破坏PD-L1与PD-1之间的相互作用；以及由这种对免疫响应的加强介导的治疗疾病的方法。当针对PD-L1和PD-1的抗体共同施用时，二者可以同时施用或是以任一顺序来序贯施用。在一些方面，本公开提供了在受试者中修饰免疫响应的方法，包括对受试者施用本发明的抗PD-1和/或抗PD-L1抗体，货期抗原结合部分，以修饰受试者中的免疫响应。优选的是，免疫响应得到了加强、增强、刺激或上调。在优选的实施方案中，本发明的抗体是人抗体。
优选的受试者包括需要增强免疫响应的人患者。本申请公开的免疫治疗方法尤其适合治疗有紊乱的人患者，所述紊乱能通过加强T细胞介导的免疫响应来治疗。在一些实施方案中，采用所述方法用于治疗罹患癌症或有罹患癌症风险的受试者。
癌症免疫治疗
据显示，对PD-1/PD-L1相互作用的阻碍在体外加强免疫响应(美国专利Nos.8,008,449和7,943,743；Fife等,2009)并介导临床前的抗肿瘤活性(Dong等,2002；Iwai等,2002)。然而，这两种抗体潜在阻碍的分子相互作用并不完全相同，本发明的抗PD-1抗体破坏PD-1/PD-L1相互作用并潜在可能破坏PD-1/PD-L2相互作用；相比之下，本发明的抗PD-L1抗体也破坏PD-1/PD-L1相互作用，但它们不阻碍PD-1/PD-L2相互作用而可能代之以破坏不依赖PD-1的PD-L1/CD80相互作用，所述PD-L1/CD80相互作用也在体内和体外显示出下调T细胞响应(Park等,2010；Paterson等,2011；Yang等,2011；Butte等,2007；Butte等,2008)。因而，在这些种类繁多的配体-受体配对物中，不同的相互作用不可能在不同的癌症类型中占据主要地位，这为两种抗体提供了不同的活性谱(activity profiles)。
拮抗的抗体对PD-1/PD-L1相互作用的破坏使患者中对癌细胞的免疫响应增强。PD-L1不在正常人细胞中表达，但在多种人癌症中大量存在(Dong等,2002)。PD-1和PD-L1之间的相互作用损害T细胞的响应，其显示为肿瘤浸润淋巴细胞的减少(TILs)和T细胞受体介导的增殖减少，导致T细胞失效、衰竭或凋亡、以及癌细胞的免疫逃逸(immune evasion)(Zou和Chen,2008；Blank等,2005；Konishi等,2004；Dong等,2003；Iwai等,2002)。可以通过用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体抑制PD-1和PD-L1之间的局部(local)相互作用，来扭转免疫抑制。这些抗体可以单独或组合使用来抑制癌症肿瘤的生长。此外，这些抗体中的一种或二者都可以用于与其他免疫原性(immunogenic)的和/或抗癌剂的连结，包括细胞因子、标准癌症化疗、疫苗、辐射、手术、或其他抗体。
使用抗PD-1抗体对癌症患者的免疫治疗
本公开提供了用于对罹患癌症的受试者的免疫治疗的方法，该方法包括对受试者施用包含治疗上有效量的抗体或其抗原结合部分的组合物，所述抗体或其抗原结合部分破坏PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用。本公开还提供了在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，包括对受试者施用有效抑制肿瘤细胞生长的量的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分破坏PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用。在优选的实施方案中，受试者是人。在其他优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是IgG1或IgG4同种型。在其他实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体或其抗原结合部分。在进一步的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是嵌合的、人源化的或人抗体或其抗原结合部分。在优选的用于治疗人患者的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是人抗体或其抗原结合部分。
实施例中所述的临床试验采用了抗PD-1人单克隆抗体，nivolumab(在美国专利No.8,008,449中名为5C4)，来治疗癌症。当5C4被选为进入临床的主导抗体，值得注意的是，对5C4的治疗活性很重要的功能特性是一些本发明的抗PD-1抗体与5C4所都具有的，所述功能特性包括以高亲和性特异性地结合到人PD-1、增加T细胞增殖、在MLR测定法中分泌IL-2和生成干扰素γ、抑制PD-L1和/或PD-L2对PD-1的结合、以及在体内抑制肿瘤细胞生长。并且，部分的一些抗PD-1抗体，17D8、2D3、4H1和7D3在包含VH和Vκ区中与5C4在结构上有关联，所述VH和Vκ区分别具有来源于VH 3-33和VκL6种系序列的序列。此外，5C4、2D3、7D3、4H1和17D8都交叉竞争结合到hPD-1的相同表位区(实施例1)。因而，nivolumab和其他抗PD-1抗体临床前特征表示本文提供的治疗癌症的方法可用选自本发明的抗PD-1抗体的更广类属(genus)的不同的抗体来进行。
因此，本申请公开的免疫治疗方法的一些实施方案包括对患者施用抗PD-1抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：(a)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 3-33种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL6种系序列的序列；或(b)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 4-39种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL15种系序列的序列。
在一些其他的实施方案中，施用于患者的抗体或其抗原结合部分与参考抗体或其参考抗原结合部分交叉竞争结合到PD-1，所述参考抗体或其参考抗原结合部分包含：(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:1中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:8中所示的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:2中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:9中所示的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:3中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:10中所示的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:4中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:11中所示的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:5中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:12中所示的序列；(f)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:6中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:13中所示的序列；或(g)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:7中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQID NO:14中所示的序列。在优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分与nivolumab交叉竞争结合到PD-1。
在本申请公开的免疫治疗方法的一些实施方案中，施用于患者的抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含：(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:1中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:8中所示的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:2中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:9中所示的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:3中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:10中所示的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:4中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:11中所示的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:5中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:12中所示的序列；(f)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:6中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:13中所示的序列；或(g)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:7中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:14中所示的序列。在优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含人重链可变区和人轻链可变区，所述人重链可变区包含具有SEQ ID NO:4中所示序列的连续连接的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含具有SEQ ID NO:11中所示序列的连续连接的氨基酸序列。在其他优选的实施方案中，所述抗PD-1抗体是nivolumab。
在本发明的一些实施方案中，抗PD-1抗体经配制用于静脉内施用。在优选的实施方案中，抗体以3mg/kg的剂量每2周静脉内施用超过60分钟。典型地，只要观察到临床获益就继续治疗，或治疗持续直到出现难处理的毒性或疾病进展。
在下述实施例中描述的抗PD-1免疫治疗的临床试验中，甚至在重度既往治疗过的(heavily pretreated)患者里也观察到了的引人注目的OR与持久的临床响应，所述观察结果跨越多种肿瘤类型，包括相当大比例的NSCLC、MEL、和RCC患者，也跨越各种转移的部位，包括肝、肺、淋巴结、以及骨骼。MEL和RCC被认为是免疫原性的肿瘤，曾经证明对癌症免疫治疗是敏感的，例如MEL和RCC中都有的干扰素α和白细胞介素-2(Eton等,2002；Coppin等,2005；McDermott和Atkins,2006)以及MEL中的抗CTLA-4抗体(Hodi等,2010)。在MEL患者中，观察到nivolumab伴随着显著的ORR，所述观察跨越0.1、0.3、1、3、或10mg/kg的不同剂量，其总体响应率约31％，而在用nivolumab以1或10mg/kg的剂量治疗的RCC患者中观察到了类似的相当的约30％的ORR。相比之下，免疫治疗过去在肺癌方面的成就最小。缺乏成就的原因是NSCLC是“非免疫原性的”(参见例如Holt和Disis,2008；Holt等,2011)。肺癌对免疫系统的妨碍能力是由多种因子造成的，包括免疫抑制性细胞因子的分泌、主要组织相容性复合物抗原表达减少、以及对T细胞抑制性途径的指派(co-opting)(Dasanu等,2012；Marincola等,2000；Brahmer等,2012)。
尽管过去在肺癌中观察到过免疫治疗的效力的限制以及肺癌细胞利用多种机制来逃避免疫系统的攻击，但临床试验中正在评估很多种增大抗原特异性抗肿瘤免疫力的肿瘤细胞疫苗(例如belagenpumatucel-L，一种基于全细胞的疫苗，阻碍TGF-β2的作用)和基于抗原的疫苗(例如体液EGF疫苗和整合了MAGE-A3融合蛋白或肿瘤相关的MUC1抗原部分的疫苗)(Holt等,2011；Shepherd等,2011；Dasanu等,2012；Brahmer等,2012)。然而，当这种抗原特异性疫苗显示出一些治疗NSCLC的希望时，Holt等(2011)注意到涉及到非特异性免疫治疗干预的试验无法改善NSCLC的结局，这表示需要把它们和抗原特异性的疫苗组合。这些作者表达了这样的观点，即只有实施既增大抗肿瘤免疫力也抵消肿瘤介导的免疫抑制的方案时才会得到真正有效的NSCLC免疫治疗，所述作者还总结，NSCLC患者中不存在初期免疫响应或初期免疫响应虚弱使对免疫系统的非特异性刺激或对免疫抑制的移除不太可能产生临床结局上的变化。
因而，本文报道的伴随NSCLC的结果是特别引人关注的、难以预料而令人吃惊的。在NSCLC患者中，在1、3、或10mg/kg剂量的nivolumab观察到OR，其响应率分别为3％、24％、和20％(参见实施例7)。在各种NSCLC组织形态(histology)中都观察到OR：54例鳞状中有9例响应者(17％)，以及74例非鳞状中有13例响应者(18％)。在有过显著的既往治疗(54％有过3线的既往治疗)的NSCLC患者中以及各种组织形态中观测到的伴随nivolumab的这个水平的活性是无先例的，尤其是在鳞状组织形态的患者中(参见Gridelli等,2008；Miller,2006)，并且为相比于现存的治疗标准的效力和安全性提供了非常良好的获益/风险动力学(dynamic)。
在本发明免疫治疗方法的一些实施方案中，指示抗PD-1抗体在基于铂治疗(不管其维持如何)和一个其他治疗后作为局部进展或转移性的鳞状或非鳞状的NSCLC单药治疗。在其他实施方案中，指示抗PD-1抗体在基于铂的治疗和一个其他既往化疗疗法失败后作为局部进展或转移性的鳞状或非鳞状的NSCLC单药治疗。在进一步的实施方案中，指示抗PD-1抗体在两线治疗失败后作为局部进展或转移性的鳞状或非鳞状的NSCLC单药治疗，所述两线治疗其中一个必须包含基于铂的疗法。再更进一步的实施方案中，指示抗PD-1抗体在至少一个既往化疗后、在至少一个基于铂的既往治疗失败后、或在至少一个铂双药治疗(platinum doublet therapy)中出现进展后，作为局部进展或转移性的鳞状或非鳞状的NSCLC单药治疗。在本申请公开的所有的免疫治疗方法中，只要观察到临床获益就可以继续治疗，或继续治疗直到出现难处理的毒性或疾病进展。
在重度既往治疗过的癌症患者中对于抗PD-1的临床响应的持久性
PD-1途径在抑制抗肿瘤免疫力中的关键作用最早在实验室模型中揭示，而现在已在临床研究中验证。如本申请所述，用阻碍PD-1(nivolumab)或其主要配体PD-L1(BMS-936559)的药物的单药治疗能够在治疗难愈的进展性癌症患者中介导衰退。重度既往治疗过的NSCLC患者(包括有鳞状组织形态的患者)接受了抗PD-1抗体，其客观响应率(objective response rate,ORR)令人惊讶且难以预料，正如标准的挽救疗法过去曾经在这些患者中显示了适中的获益(Scagliotti等,2011)。如这项研究中通过标准RECIST所测量的，OR长期持续，而在129例响应者的22例中，中位响应持续时间约为18个月(参见实施例7)。此外，观察到肿瘤衰退的模式与免疫相关的响应模式一致。
这些发现将PD-1途径确立为肿瘤学中一个新的治疗焦点(Pardoll,2012；Topalian等,2012c；Hamid和Carvajal,2013)。在目前的研究中，其中54％的患者在3个或更多既往全身性疗法后有了进展性的疾病，初步分析一直进行到2013年3月。这项更新分析(updated analysis)支持并加强了从早前2012年2月的分析获得的数据和达成的结论。因而，在患有NSCLC(分别为17％和10％)、MEL(31％、7％)、和RCC(29％、27％)的患者中证明(documented)了所有剂量中的常规的OR或延长的疾病稳定(参见实施例7)。此外，13例患者(4％)显示出非常规的，“免疫相关的”响应模式(如此前与抗CTLA-4治疗一起描述的)，其中一些得以维持(Sharma等,2011)。
在各种癌症类型中，用抗PD-1抗体治疗的患者体内的OR的持久性尤其显著。更新分析再一次强调了nivolumab治疗的患者中的临床活性的持久性，这在迄今为止的化疗或小分子抑制剂中并不常见，但在一些有晚期黑色素瘤且接受免疫治疗的患者中观察到了，所述免疫治疗包括ipilimumab和高剂量的白细胞介素-2(Topalian等,2011；Hodi等,2010)。药物中止后接着出现局部肿瘤进展的持续，表明PD-1阻碍重置了肿瘤和宿主之间的免疫均势(equilibrium)，并且OS获益可能最终证明比迄今为止测量的显著更长。需要进一步的随访来确定这些临床试验里患者中最终的肿瘤衰退和疾病稳定的持久性。
值得注意地，通过nivolumab在重度既往治疗过的患者中诱导的持久的目标肿瘤衰退和疾病稳定转化为生存结局(survival outcomes)，所述患者患有晚期NSCLC、MEL和RCC，所述生存结局超越了过去的这些接受常规化疗和/或酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的患者人群的数据。在NSCLC中，1年和2年生存率分别为42％和14％，而在患有鳞状和非鳞状癌症的患者里中位OS分别为9.2和10.1个月(参见实施例7)。这个高水平的效力是非常令人印象深刻的，因为这些患者中的54％接受过3种或以上的既往治疗。而且，因为对许多肺癌患者的随访是相对受限的，所以这些图可能在数据成熟后有变化。过去，肺癌的2L化疗剂(即多西他赛和培美曲塞)已达到了7.5-8.3个月的中位OS，而一年生存率为约30％(Shepherd等,2000；Hanna等,2004)。在2L/3L人群中，厄洛替尼(erlotinib)治疗的患者具有6.7个月的中位生存期，对比安慰剂处理的患者的4.7个月(Shepherd等,2005)。目前没有治疗被批准用于的超过3L位置(setting)的肺癌用途，而测定这例患者人群中生存期基准(benchmark)的数据存量极低，除了在回顾性综述中报道了5.8-6.5个月的中位生存期和25％的1年生存率(Girard等,2009；Scartozi等,2010)。
在nivolumab治疗的MEL患者中，达到了16.8个月的中位OS，以及里程碑式的(landmark)62％(一年)和43％(两年)生存率(参见实施例7)。既往治疗过的黑色素瘤患者中的生存结局支持了最近FDA对ipilimumab和威罗菲尼的批准。在一项招入了至少有过一项既往转移性疾病治疗的黑色素瘤患者的近期的三期试验中，相比于gp100肽疫苗，ipilimumab使中位OS从6.4增加至10.1个月(Hodi等,2010)。在既往治疗过的患者中进行的ipilimumab的二期试验中，两年生存率范围为24.2-32.8％(Lebbe等,2012)。在一项大规模二期vemurafenib中招入的、既往治疗过的、有BRAF突变的黑色素瘤的患者中的中位OS为15.9个月，而一年生存率为58％(Sosman等,2012)。
因此，在一些实施方案中，指示用抗PD-1抗体的免疫治疗在用达卡巴嗪(dacarbazine)治疗和一个其他治疗后(不管其维持如何)作为局部晚期或转移性的MEL单药治疗。在其他实施方案中，指示用抗PD-1抗体的免疫治疗在基于达卡巴嗪的治疗失败后作为局部晚期或转移性的MEL单药治疗。在进一步的实施方案中，指示用抗PD-1抗体的免疫治疗在两线治疗失败后作为局部晚期或转移性的MEL单药治疗，所述两线治疗中的一个必须包括基于达卡巴嗪的疗法。在更进一步的实施方案中，指示用抗PD-1抗体的免疫治疗在至少一个既往化疗后、在至少一个基于达卡巴嗪的既往治疗失败后、或在至少一个达卡巴嗪治疗中出现进展后，作为局部晚期或转移性的MEL单药治疗。在本申请公开的所有的免疫治疗方法中，只要观察到临床获益就可以继续治疗，或继续治疗直到出现难处理的毒性或疾病进展。
在nivolumab处理的RCC患者中(所述患者有45％接受过3项或更多的既往治疗，有71％接受过既往抗血管生成治疗)，达到了22个月的中位OS(到2013年3月分析日为止)。观察到了里程碑式的70％(一年)和50％(两年)的生存率(参见实施例7)。在一项招入了肾病患者的最近的三期试验中，所述肾病患者的疾病随着抗血管生成治疗而进展，在这项试验中将依维莫司(everolimus)与安慰剂进行比较：中位OS分别为14.8个月对比14.4个月(Motzer等,2008；Motzer等,2010)。一项最近的三期试验将索拉非尼与坦罗莫司在舒尼替尼难愈的肾癌人群中进行比较，分别得到了16.6个月和12.3个月的中位OS(Hutson等,2012)。因而，就NSCLC和MEL而言，重度既往治疗过的RCC患者人群的用nivolumab的治疗得到了比难愈性较低的人群的治疗长出很多的OS(>22个月)，所述难愈性较低的人群用的是治疗标准治疗。有预期生存终点的对照的三期试验正在进行中，所述试验在NSCLC、MEL、和RCC中进行(NCT01673867、NCT01721772、NCT01642004,NCT01668784和NCT01721746(参见Clinical Trials Website,http://www.clinicaltrials.gov))。预计这些试验的结果进一步证明这些癌症中对nivolumab响应与治疗标准治疗相比的高效力和持久性。
在一些实施方案中，指示抗PD-1抗体在用抗血管生成的TKI或mTOR抑制剂的治疗(不管其维持如何)和一个其他治疗后作为局部晚期或转移性的RCC单药治疗。在其他实施方案中，指示用抗PD-1抗体的免疫治疗在在用抗血管生成的TKI或mTOR抑制剂的治疗失败后作为局部晚期或转移性的RCC单药治疗。在进一步的实施方案中，指示用抗PD-1抗体的免疫治疗在两线治疗失败后作为局部晚期或转移性的RCC单药治疗，所述两线治疗中的一个必须包括抗血管生成的TKI或mTOR抑制剂。在更进一步的实施方案中，指示用抗PD-1抗体的免疫治疗在至少一个既往化疗后、在至少一个基于抗血管生成的TKI或mTOR抑制剂的既往治疗失败后、或在至少一个抗血管生成的TKI或mTOR抑制剂的治疗中出现进展后，作为局部晚期或转移性的RCC单药治疗。只要观察到临床获益就可以继续抗PD-1抗体的免疫治疗，或继续所述治疗直到出现难处理的毒性或疾病进展。
值得注意的是，接受nivolumab的肺癌、黑色素瘤和肾癌患者中的OS比PFS长出很多。这些结果反映了为ipilimumab报道的那些(Hodi等,2010)，并且反映了观察到一些患者中早期肿瘤扩大或新病损的出现能发展到疾病稳定或衰退，所述患者受到免疫检验点阻断。这些发现表明无进展生存期可不是确定nivolumab和此类中其他作用剂效力的最佳的终点。
本申请公开的数据证明了抗PD-1抗体免疫治疗对治疗癌症的高效力、持久性和广适用性，导致nivolumab被测试用于额外的癌症类型。例如，PD-L1表达增长已同许多血液恶性肿瘤一同报道，并可能阻止宿主免疫响应对恶性肿瘤细胞发挥有益作用，在上述的基础上，启动了一项确证nivolumab在血液恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、和慢性骨髓性白血病)患者中介导抗肿瘤活性的能力的试验(NCT01592370)。Nivolumab也在晚期肝细胞癌中作为单药治疗测试(NCT01658878)。
总之，本申请公开的抗PD-1免疫治疗的结果至少在以下三方面是值得注目的。第一，已显示抗PD-1的效力超过了过去的用治疗标准治疗癌症的患者的效力数据。值得注意的是，此效力已在重度既往治疗过的人群的患者中证实，所述人群中约一半的患者在3项或更多既往全身性疗法后有了进展性的疾病。众所周知，这些罹患晚期、转移性的和/或难愈(refractory)的癌症的患者非常难以治疗。因此，本公开提供了用于罹患晚期、转移性的和/或难愈的癌症的患者的免疫治疗的方法，该方法包括对患者施用治疗上有效量的破坏PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用的抗体或其抗原结合部分。在本申请公开的治疗方法中任一项的一些实施方案中，受试者有过既往的癌症治疗，例如，受试者经历过至少一项、两项或三项既往的某线癌症治疗(lines of therapy for cancer)。
第二，本治疗方法已显示出可应用于广阔的不同癌症类属。甚至“非免疫原性的”癌症如NSCLC(Holt等,2011)和难以治疗的癌症如卵巢和胃癌(以及其他测试的癌症，包括MEL、RCC、和CRC)都可以用抗PD-1和/或抗PD-L1修正来治疗(参见实施例7和14)，在上述的基础上，本公开广泛提供了用于罹患了非常广的范围的癌症中的几乎任一种的患者的免疫治疗的方法。
第三，用抗PD-1或抗PD-L1抗体的治疗在癌症患者中已显示出产生了突出的持久临床活性。因此，本公开提供在癌症患者中诱导持久临床响应的免疫治疗方法，包括对患者施用治疗上有效量的破坏PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用的抗体及其抗原结合部分。在本申请描述的治疗方法中的任一种的优选实施方案中，所述临床响应是持久的响应。
如本申请所用，“持久的”响应是患者人群中超过预期中位OS率的治疗的或临床的响应。预期的中位OS率随不同的癌症和不同的患者人群而变化。在一些实施方案中，持续的响应在相关的患者人群中超过了预期的中位OS率至少10％，优选为至少20％，更优选为至少30％，而更优选的为至少50％。基于PD-1途径阻碍的免疫治疗手段的主要获益可能是用长期产生记忆T细胞来功能性地恢复耗竭的(exhausted)T细胞，所述记忆T细胞甚至在不继续治疗下也维持抗肿瘤的免疫监控(immune surveillance)并抑制肿瘤长时期地生长，所述长时期被延长至数年(Kim和Ahmed,2010)。确实，对中止nivolumab后的患者的长期随访研究证实了患有CRC的患者经历了完全响应，所述完全响应在3年后还在进行中；患有RCC的患者经历了结束治疗后持续3年部分响应(partial response)，所述部分响应转化为在12个月时进行中的完全响应；而患有黑色素瘤的患者达到了结束治疗后16个月稳定的部分响应，而复发的疾病用再诱导抗PD-1治疗成功地治疗(Lipson等,2013)。
免疫相关的临床响应
变得明显的是，常规的响应标准可能不足以评估免疫治疗剂的活性，因为进展性疾病(通过最初的放射成像评估(initial radiographic evaluation))不一定反映治疗的失败。例如，用抗CTLA-4抗体ipilimumab的治疗显示产生了4种不同的响应模式，所述4种模式全都与良好的生存有关：(a)基线病损收缩，而没有新病损；(b)持久的疾病稳定(在一些患者中随后是总肿瘤负荷的缓慢平稳下降)；(c)总肿瘤负荷增加后的响应；和(d)对新病损的响应。因此，为了适当地评估免疫治疗剂，必须也捕获(captured)对靶标疾病的长期作用。在这一点上，提出了全身性的免疫相关响应标准(irRC)，所述标准考虑到肿瘤负荷中的早期增长和/或新病损的出现，以及力图增强免疫相关响应模式的表征(characterization)(Wolchok等,2009)。当这些非常规响应模式的完全影响在有生存终点的随机化的nivolumab试验中依然保持是确定的，本观察令人想起在ipilimumab的发现，其中在治疗的患者中观察到显著的OS延长(Hodi等,2010；Robert等,2011)。
抗PD-1免疫治疗的整体风险/获益(overall risk/benefit)概图也是良好的，其更严重的药物相关不良事件的发病率低(不良事件；>3级)，迄今为止观察到的具体事件与其他免疫治疗一致。这表明抗PD-1免疫治疗可以在采用的最低支持性护理(minimal supportive care)的门诊患者中递送(delivered)。
能通过抗PD-1免疫治疗来治疗的癌症的广谱(Broad spectrum)
本文呈现的临床数据表明，基于PD-1阻碍的免疫疗法不限于“免疫原性的”肿瘤类型，例如MEL和RCC，而是延伸至通常认为并非免疫响应性的肿瘤类型，包括NSCLC。在治疗难愈的转移性NSCLC上预料不到的成功强调了这样的可能性，所述可能性为任何赘生物(neoplasm)在适当免疫调节的情况下都可以是“免疫原性的”；并表明PD-1阻碍能作为免疫治疗手段广泛应用于非常多样的范围的肿瘤类型。因而，可以用本发明的抗PD-1抗体来治疗的癌症包括典型响应于免疫治疗的癌症以及传统上被视为非免疫原性的癌症。治疗的优选的肿瘤的非限制性例子包括NSCLC、MEL、RCC、CRC、CRPC、HCC、头部与颈部的鳞状细胞癌、食管、卵巢、胃肠道及乳腺癌、以及血液的恶性肿瘤。虽然通常认为NSCLC不响应于免疫治疗，但本申请公开的数据出乎预料地表明了鳞状和非鳞状的NSCLC都是响应于用抗PD-1抗体的治疗的。此外，本公开供用于(provides for)难愈或复发的恶性肿瘤的治疗，所述恶性肿瘤的生长可以用本发明的抗PD-1抗体来抑制。
基于本文提供的抗PD-1抗体免疫治疗的非常广阔的适应症适用性，可以用本发明的方法中的抗PD-1抗体来治疗的癌症的例子包括肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤(cutaneousor intraocular malignant melanoma)、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛区癌(cancer of the anal region)、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌(carcinoma of the vulva)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤(sarcoma)、尿道癌、阴茎癌、儿童实体肿瘤(solid tumors of childhood)、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌(cancer of the bladder)、肾脏或输尿管癌(cancer of the kidney or ureter)、肾盂癌、中枢神经系统赘生物(neoplasm of the central nervous system,CNS)、原发性CNS淋巴瘤(primary CNS lymphoma)、肿瘤血管生成(tumor angiogenesis)、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干胶质瘤(brain stem glioma)、垂体腺瘤(pituitary adenoma)、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、表皮样癌(epidermoidcancer)、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的那些)、血液的恶性肿瘤(包括例如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、急性骨髓淋巴瘤(acute myeloid lymphoma)、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴样白血病(chronic lymphoid leukemia)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤(immunoblastic large celllymphoma)、前体B淋巴母细胞淋巴瘤(precursor B-lymphoblastic lymphoma)、外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、急性淋巴母细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia)、蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)、间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)、T细胞淋巴瘤、以及前体T淋巴母细胞淋巴瘤(precursor T-lymphoblastic lymphoma))、以及任何上述癌症的组合。本发明也适用于转移性癌症的治疗。
抗PD-1抗体的医疗用途
本发明的一个方面是本发明的任何抗PD-1抗体或其抗原结合部分用于制备药物的用途，所述药物是用于抑制来自PD-1/PD-L1途径的信号传输从而在罹患癌症的受试者中加强内源性免疫响应。另一个方面是本发明的任何抗PD-1抗体或其抗原结合部分用于制备用于罹患癌症的受试者的免疫治疗的药物，包括破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用。这些用于制备药物的用途广泛适用于本申请公开的全范围的癌症。在这些用途的优选实施方案中，癌症包括鳞状的NSCLC、非鳞状的NSCLC、MEL、RCC、CRC、CRPC、HCC、头部与颈部的鳞状细胞癌、食管、卵巢、胃肠道及乳腺癌、以及血液的恶性肿瘤。本公开还提供本发明的任何抗PD-1抗体或其抗原结合部分相对于所有实施方案的治疗方法的医疗用途，所述治疗方法采用本文所述抗PD-1抗体。
本公开也提供了本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分用于罹患癌症的受试者的治疗中的用途，其包括通过抑制来自PD-1/PD-L1途径的信号传输在受试者中加强内源性免疫响应。本公开进一步提供了本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分用于罹患癌症的受试者的免疫治疗中的用途，其包括破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用。这些抗体可以用于加强针对本申请公开的全范围的癌症的内源性免疫响应，或是加强本申请公开的全范围的癌症的免疫治疗中的内源性免疫响应。在优选的实施方案中，所述癌症包括鳞状的NSCLC、非鳞状的NSCLC、MEL(例如转移性恶性MEL)、RCC、CRC、CRPC、HCC、头部与颈部的鳞状细胞癌、食管、卵巢、胃肠道及乳腺癌、以及血液的恶性肿瘤。
包含抗PD-1抗体的组合治疗
鉴于本文已显示用抗PD-1和抗PD-L1抗体的单药治疗显著提高患有肺癌、黑色素瘤、肾癌、以及其他潜在恶性肿瘤的患者的生存，临床前数据表示基于PD-1途径阻碍的协同治疗组合能具有更强效的作用。对nivolumab组合ipilimumab(抗CTLA-4)的临床评估正在进行之中，并在本文提供一期试验的结果(同样参见NCT01024231；NCT01844505；NCT01783938；Wolchok等,2013a；Wolchok等,2013b；Hodi等,2013)，所述ipilimumab的作用机制与nivolumab的相似但不同(Parry等,2005；Mellman等,2011；Topalian等,2012c)。涉及nivolumab与黑色素瘤疫苗(NCT01176461,NCT01176474；Weber等,2013)、与lirilumab(BMS-986015)，一种人IgG4抗KIR抗体在晚期实体瘤患者中(NCT01714739；Sanborn等,2013)的组合施用的临床研究也已启动。涉及nivolumab在晚期或转移的实体瘤患者中与细胞因子例如IL-21组合施用(NCT01629758；Chow等,2013)、在未接受过化疗的()NSCLC患者中与基于铂的双药化疗组合施用(NCT01454102；Rizvi等,2013)、以及在转移性的RCC患者中与小分子靶向治疗组合施用(NCT01472081；Amin等,2013)的临床研究也已启动。
在一些方面，本公开涉及抗PD-1抗体与不同癌症治疗的组合用于多种癌症，所述不同癌症治疗包括化疗的疗法、放射、手术、激素阻断(hormonedeprivation)和血管生成抑制剂。PD-1阻碍也可以有效地与免疫原性剂组合，例如癌细胞制备物、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽、以及碳水化合物分子)、抗原呈递细胞(antigen-presenting cells)如承载(bearing)肿瘤相关抗原的树突细胞、用编码免疫刺激性细胞因子转染的细胞(He等,2004)、和/或其他免疫治疗的抗体(例如抗CTLA-4、抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)。可用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原的肽、如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽、或经转染以表达GM-CSF细胞因子的肿瘤细胞。
抗PD-1与抗CTLA-4抗体组合治疗晚期黑色素瘤
考虑到免疫学检验点是非冗余(non-redundant)的，且能够抑制T细胞的激活、增殖和淋巴结和/或肿瘤微环境内的效应功能，并基于临床前数据，所述临床前数据为抗PD-1与抗CTLA-4的组合在小鼠肿瘤模型中比两种抗体各自单独使用具有更强的抗肿瘤作用(参见美国专利8,008,449)，在MEL患者的临床试验中测试了CTLA-4和PD-1的组合阻碍能够提供比单剂更强的抗肿瘤活性这一假设(实施例15)。
虽然在这项研究中没有正式比较，但nivolumab/ipilimumab并行疗法包含达到了比无论单用nivolumab(实施例7)还是单用ipilimumab(Hodi等,2010)都更高的ORRs。最重要的是，在大部分治疗的患者中达到了迅速而深入的响应，“深入的”肿瘤响应指的是特征为通过放射影像评估的自基线测量值80％或以上的靶病损上的减少的响应。在本研究中，大部分的响应的患者，包括一些有大面积和大体积(extensive and bulky)肿瘤负荷的患者，在肿瘤评估初始时达到了>80％的肿瘤衰退。尤其突出的是，观察到用并行疗法(其包含(i)一种组合施用抗PD-1与抗CTLA-4抗体，然后单独施用抗PD-1抗体的诱导给药方案，以及(ii)包含较低频率组合施用抗PD-1与抗CTLA-4抗体的维持给药方案)治疗的可评估响应的患者中有31％在12周时显示了>80％的肿瘤衰退。在并行疗法的MTD处，所有9例响应的患者显示了>80％的肿瘤衰退，其中3例CRs。相比之下，在迄今为止的临床经验中，接受3mg/kg的nivolumab或ipilimumab治疗的MEL患者有<3％达到了CR(实施例7；Hodi等，2010)。因而，在这项初步的一期试验中这种免疫治疗的组合的总活性与其他批准的或正在开发的用于晚期黑色素瘤的作用剂相比非常有利，所述作用剂包括激活的激酶的靶向抑制剂(Chapman等,2011)。如本研究以及长期的用nivolumab(如本文所描述)和ipilimumab(Wolchok等,2013d)的免疫治疗试验所证明的，这种组合的另外一个优势是响应的持久性。
这些初始数据表明在用nivolumab/ipilimumab组合治疗的患者中可以达到与过去单独使用二者之一的经验相比更大量级的快速响应。如甚至在因毒性而早期终止治疗的患者中所观察到的，响应通常是持久的。响应的患者包括升高的LDH、M1c疾病和大体积多病灶肿瘤负荷的那些。与此前关于ipilimumab或nivolumab单药治疗的报道相似，常规的ORRs可能不完全占据(capture)临床活性谱和在用nivolumab/ipilimumab并行疗法的患者中潜在获益，因为一些患者经历了或是长期SD或是非常规的免疫相关响应模式。确实，诊治在7例最佳响应为SD≥24周或irSD≥24周的并行疗法的患者中，有6例呈示了至少19％的有意义肿瘤衰退，而第7例患者在延长的SD后肿瘤负荷下降。此前的检验点阻碍单药治疗经验支持对于一些患者的观察，所述患者可能生存更长的时期，其最佳OR为SD，让人相信称心的结果是免疫监控平衡相(equilibrium phase)的重建这个假设(Screiber等,2011)。
患者在接受治疗(所述治疗为先用ipilimumab，之后用nivolumab序贯地治疗)时能够达到OR，上述观察表示对CTLA-4阻碍的响应的缺乏不妨碍来自PD-1阻碍的临床获益，并支持这些共抑制(co-inhibitory)途径的非冗余性质。值得注意的是，本申请公开的数据(实施例8)表明了接受nivolumab的患者中响应的出现与肿瘤PD-L1表达之间的联系，而此前的数据揭示了用ipilimumab治疗的患者中OS与外周(peripheral)ALC之间的关联(Berman等,2009；Ku等,2010；Postow等,2012；Delyon等,2013)。在nivolumab/ipilimumab组合的本研究中，不管淋巴细胞计数或基线肿瘤PD-L1表达，在患者中都观察到了临床响应(实施例17)，这表明组合治疗产生的免疫响应与其中任一单药治疗相比具有独特的特征。虽然数据支持基线肿瘤PD-L1表达与淋巴细胞计数在能够诱导快速和显著肿瘤衰退的活性(active)组合疗法的配置(setting)中可能关联较低，但同样值得注意的是在不同的IHC测定法中使用了不同的抗PD-L1抗体(兔单克隆抗体28-8对比小鼠5H1单克隆抗体)，以测量PD-L1在组合治疗研究中与在nivolumab单药治疗中相比的表达。除了IHC测定法和抗体上的变化以外，不同的结果可能还反映了活组织检查样品与肿瘤异质性(heterogeneity)中的差别。PD-L1作为抗PD-L1效力的生物标记物的效用将在随机三期试验中期望进一步评估(参见例如NCT01721772、NCT01668784、和NCT01721746)。
在用并行疗法治疗的患者中观察到所经历的不良事件谱(spectrum)与nivolumab或ipilimumab单药治疗在性质上是相似的，尽管用组合治疗的患者中的不良事件率增加了。在用nivolumab/ipilimumab并行疗法的患者中有53％观察到了3-4级治疗相关的不良事件，与之相比过去用ipilimumab单药治疗的患者中有20％的比率(Hodi等,2010)而以3mg/kg的剂量单用nivolumab治疗的患者中有17％(实施例5)。在序贯疗法的群体中，18％的患者经历了3-4级治疗相关的不良事件。用并行和序贯疗法治疗的患者经历的不良事件是可管控的和/或可用现存的治疗法则基本消除的。
这些结果共同表明nivolumab和ipilimumab能够与并行施用，其安全谱(safety profile)是可管控的，并导致持久的临床响应。与二者中任一单剂获得的响应相比，在用组合治疗的患者中观测到了更快速和更深入的临床肿瘤响应。
从实施例15所述的2013年2月的研究临床截止日期起，52例接受可评估响应的并行疗法的受试者中，有21例(40％)具有由改良的(modified)世界卫生组织(modified World Health Organization,mWHO))标准的OR(Wolchok等,2009)。在另外2例受试者(4％)中有未证实的OR。在群体1(0.3mg/kgnivolumab加3mg/kg ipilimumab)中，14例可评估的受试者中有3例具有mWHO的OR(ORR：21％,包括1例CR和2例PR)。在群体2(1mg/kg nivolumab加3mg/kg ipilimumab)中，17例可评估的受试者中有9例具有mWHO的OR(ORR：53％；包括3例CR和6例PR)。在群体2a(3mg/kg nivolumab加1mg/kgipilimumab)中，15例可评估的受试者中有6例具有mWHO的OR(ORR：40％；包括1例CR和5例PR)。在群体3(3mg/kg nivolumab加3mg/kg ipilimumab)中，6例可评估的受试者中有3例具有mWHO的OR(ORR：50％；包括3例PR)。在这些数据的基础上，本申请公开的发明包含用于治疗罹患癌症的受试者的方法，包括对受试者施用：(a)特异性地结合并抑制PD-1的抗体及其抗原结合部分；以及(b)特异性地结合并抑制CTLA-4的抗体及其抗原结合部分；每种抗体以范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量在并行疗法中施用，所述并行疗法包括：(i)一种诱导给药方案，其包括以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体至少2、4、6、8或10个剂量，然后是以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率单独施用抗PD-1至少2、4、6、8或12个剂量；然后是(ii)一种维持给药方案，包括以至少每8、12、或16周一次或每季度至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体至少4、6、8、10、12或16个剂量，或施用至观察到临床获益或直到出现不可管控的毒性或疾病进展。
在这个方法的一些实施方案中，维持给药方案包括组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体多至4、6、8、10、12或16个剂量。在其他实施方案中，所述并行疗法包括：(i)一种诱导给药方案，其包括以每2、3、或4周一次或每月一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体至少2、4、6、或8个剂量，然后是以每2、3、或4周一次或每月一次的给药频率单独施用抗PD-1抗体2、4、6、8或12个剂量；然后是(ii)一种维持给药方案，包括以每8、12、或16周一次或每季度一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体4、6、8、10、12或16个剂量，或施用至观察到临床获益或直到出现不可管控的毒性或疾病进展。在另一些实施方案中，每个抗PD-1和抗CTLA-4抗体以0.1、0.3、0.5、1、3、5、10或20mg/kg的剂量单独施用。在其他实施方案中，每个抗PD-1和抗CTLA-4抗体在诱导给药方案及维持给药方案期间保持恒定。在又一些实验方案中，抗PD-1和抗CTLA-4抗体以如下剂量来施用：(a)0.1mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；(b)0.3mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；(c)1mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；(d)3mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；(e)5mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；(f)10mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；(g)0.1mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；(h)0.3mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；(i)1mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；(j)3mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；(k)5mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；或(l)10mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体。
在实施例15中所述的试验方案中，3mg/kg nivolumab加3mg/kgipilimumab的给药方案超过了MTD(通过ipilimumab与其他抗PD-1抗体组合可能有更高或更低的MTD)，然而群体2(1mg/kg nivolumab加3mg/kg ipilimumab)和群体2a(3mg/kg nivolumab加1mg/kg ipilimumab)都具有相似地临床活性。此外，大部分对nivolumab和ipilimumab组合的响应出现在头12周。考虑到过去第12周施用的ipilimumab是否有助于临床获益是不确定的，以及美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)和欧洲药品管理局(EuropeanMedicines Agency,EMA)批准的ipilimumab方案为每3周共4个剂量的事实，在优选的实施方案中，抗CTLA-4抗体在诱导给药方案期间每3周施用一次，共4个剂量。每两周3mg/kg直至进展的nivolumab单药治疗显示出与持久的响应有关(实施例4-7)，而包括每12周施用nivolumab的维持给药方案已显示是有效力的(实施例15)。因而，从第12周开始(在nivolumab和ipilimumab组合的4个剂量完成后)，可以每2到至少12周以3mg/kg施用nivolumab直到进展。因此，在并行疗法方法的优选实施方案中，抗PD-1和抗CTLA-4抗体以如下剂量施用：(a)1mg/kg抗PD-1抗体和3mg/kg抗CTLA-4抗体，或(b)3mg/kg抗PD-1抗体和1mg/kg抗CTLA-4抗体，并且所述并行疗法进一步包括：(i)一种诱导给药方案，其包括以每3周一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体4个剂量；然后是(ii)一种维持给药方案，其包括以每2-12周或更多周一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体多至8个剂量，或施用至观察到临床获益或直到出现不可管控的毒性或疾病进展。
跨越1mg/kg-10mg/kg剂量范围的nivolumab单药治疗的暴露-响应分析(Exposure-response analysis)解释了相似的临床活性(实施例7)，而在二期试验中的0.3mg/kg、3mg/kg、和10mg/kg ipilimumab单药治疗的暴露-响应分析证明了剂量上的增加伴随着活性的增加(Wolchok等,2010)。因此，3mg/kg的剂量的ipilimumab(群体2)可能在临床上比选择3mg/kg的nivolumab(群体2a)更有效。因而，在更优选的并行疗法方法的实施方案中，抗PD-1和抗CTLA-4抗体是以1mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体的剂量来施用的。
在本方法的一些实施方案中，所述抗PD-1和抗CTLA-4抗体经配制用于静脉施用。在一些其他实施方案中，当抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合施用时，它们在彼此的30分钟内施用。可以先施用二者中任一抗体，也就是说，在一些实施方案中，抗PD-1抗体在抗CTLA-4抗体之前施用，而在其他实施方案中，抗CTLA-4抗体在抗PD-1抗体之前施用。典型地，每个抗体在60分钟的时间(over a period of 60minutes)静脉内施用。在进一步的实施方案中，抗PD-1和抗CTLA-4抗体并行地施用，二者或是在药学上可接受的配制物中混合为一种单一组合物(a single composition)用于并行施用，或是作为含有各自抗体的分开的组合物(separate compositions)而并行地施用，所述各自的抗体在药学上可接受的配制物中。
实施例7中公开的数据证明了用nivolumab的免疫治疗在对既往ipilimumab治疗无反应的MEL患者中产生了显著的治疗活性。因此，本公开提供了用于治疗罹患癌症的受试者的序贯疗法方法，所述受试者之前用抗CTLA-4抗体治疗过，该方法包括对受试者施用特异性地结合并抑制PD-1的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分以范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量并以每周至少一次、每2、3或4周至少一次、或每月至少1次的给药频率施用多至6个到多至72个剂量，或施用至观察到临床获益或直到出现不可管控的毒性或疾病进展。在这个方法的一些实施方案中，对受试者施用抗PD-1抗体是在最后一次用抗CTLA-4抗体的治疗后1-24周内起始的。在其他实施方案中，对受试者施用抗PD-1抗体是在最后一次用抗CTLA-4抗体的治疗后1、2、4、8、12、16、20或24周内起始的。在优选的实施方案中，抗PD-1抗体的施用是在最后一次用抗CTLA-4抗体的治疗后4、8或12周内起始的。所述方法的一些实施方案包括以0.1-20mg/kg，例如0.1、0.3、0.5、1、3、5、10或20mg/kg的剂量施用抗PD-1抗体。在优选的实施方案中，抗PD-1抗体以1或3mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，序贯疗法包括对受试者以每周一次、每2、3或4周一次、或每月一次的给药频率施用抗PD-1抗体6至72个剂量，或施用至观察到临床获益或直到出现不可管控的毒性或疾病进展。在优选的实施方案中，抗PD-1抗体以1或3mg/kg的剂量、每2周一次的给药频率施用多至48个剂量。在其他优选的实施方案中，所述抗PD-1抗体经配制用于静脉施用。
在任一种本并行或序贯疗法方法的一些方面，治疗产生至少一项选自如下项的治疗效果：肿瘤大小和/或生长上的减少、肿瘤消除、转移性病损随时间在数量上的减少、完全响应、部分响应、以及疾病稳定。Nivolumab在广谱的癌症中显示了临床响应，在此基础上，本组合治疗方法也适用于多种的癌症。可以用这些方法治疗的癌症的例子包括肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、非何杰金氏淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体肿瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌、CNS赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的那些)、血液的恶性肿瘤(包括例如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、急性骨髓淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴样白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、蕈样肉芽肿病、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、以及前体T淋巴母细胞淋巴瘤)、以及任何上述癌症的组合。本发明也适用于转移性的、难愈的或复发的癌症的治疗。在优选的实施方案中，治疗的癌症是选自MEL、RCC、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、CRC、CRPC、OV、GC、HCC、PC、头部与颈部的鳞状细胞癌、食管、卵巢、胃肠道及乳腺癌、和血液的恶性肿瘤(hematologicalmalignancy)。在更优选的实施方案中，所述癌症为MEL。
在一些实施方案中，受试者是既往接受过癌症治疗的。例如，所述患者可能之前用1或2项或更多的全身疗法治疗过，所述全身疗法的类型在本文描述为治疗标准的疗法。在一些其他实施方案中，癌症是晚期的、复发的、转移性的和/或难愈的癌症。在优选的实施方案中，并行或序贯疗法治疗在受试者中诱导持久的临床响应。在优选的实施方案中，受试者是人，抗PD-1抗体抑制人PD-1，而抗CTLA-4抗体抑制人CTLA-4。
本方法所用的抗PD-1抗体可以是本发明的治疗性的抗PD-1抗体。在优选的实施方案中，所述抗PD-1抗体是单克隆抗体，其可以是嵌合的、人源化的或人抗体。在一些实施方案中，如美国专利No.8,008,449中所描述和表征的，所述抗PD-1抗体分别包含17D8、2D3、4Hl、5C4(nivolumab)、4A11、7D3或5F4的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3域和轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3域。在进一步的实施方案中，所述抗PD-1抗体分别包含17D8、2D3、4Hl、5C4(nivolumab)、4A11、7D3或5F4的重链和轻链可变区。在另一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是17D8、2D3、4Hl、5C4(nivolumab)、4A11、7D3或5F4。在优选的实施方案中，所述抗PD-1抗体是nivolumab。
本发明的抗CTLA-4抗体结合到人CTLA-4以破坏CTLA-4与人B7受体的相互作用。因为CTLA-4与B7的相互作用转导使承载CTLA-4受体的T细胞失活的信号，因此对相互作用的破坏有效地诱导、增强或延长了这种T细胞的激活，从而诱导、增强或延长了免疫响应。抗CTLA-4抗体在例如PCT申请公开号WO 00/37504和WO 01/14424的美国专利Nos.6,051,227、7,034,121中描述。如美国专利No.6,984,720所描述的，一种代表性的临床抗CTLA-4抗体是人单克隆抗体10D1(现称为ipilimumab且商用名为)。在任何本发明的方法的一些方面，所述抗CTLA-4抗体是单克隆抗体。在一些其他实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是嵌合的、人源化的或人抗体。在优选的实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是ipilimumab。
本公开还提供了抗PD-1抗体或其抗原结合部分与抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分组合用于制备共施用的(co-administered)药物，所述药物用于在并行疗法中治疗罹患癌症的受试者，其中所述抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体分别以范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量施用；而进一步地，其中所述并行疗法包括：(i)一种诱导给药方案，其包括以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体至少2、4、6、8或12个剂量，然后是以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率单独施用抗PD-1至少2、4、6、8、或10个剂量；然后是(ii)一种维持给药方案，包括以每8、12、或16周至少一次或每季度至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体多至4、6、8、10、12或16个剂量，或施用至观察到临床获益或直到出现不可管控的毒性或疾病进展。本公开提供抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体组合用于制备协同施用的药物的用途，所述药物对应于采用本申请公开的这些抗体的治疗方法的所有实施方案，并且广泛地适用于本申请公开的全范围的癌症。
本公开还提供抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其用于与抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分组合用于在并行疗法中治疗罹患癌症的受试者的用途，其中所述抗PD-1和抗CTLA-4抗体分别以范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量施用，并且进一步地，其中所述并行疗法包括：(i)一种诱导给药方案，其包括以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体至少2、4、6、8或12个剂量，然后是以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率单独施用抗PD-1至少2、4、6、8或10个剂量；然后是(ii)一种维持给药方案，包括以每8、12、或16周至少一次或每季度至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体多至4、6、8、10、12或16个剂量，或施用至观察到临床获益或直到出现不可管控的毒性或疾病进展。
基于PD-L1生物标记物测定法，用于筛选和选择适合使用并行疗法或序贯疗法、用抗PD-1和抗CTLA-4组合进行免疫治疗的患者人群和患者的方法，以及预测抗体组合的效力的方法，是如抗PD-1单药治疗的描述来进行的，进行至此生物标记物适用于用抗PD-1和抗CTLA-4组合治疗的程度。
所述公开还提供了用于治疗罹患癌症的受试者的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量的抗体或其抗原结合部分，其特异性地结合并抑制PD-1；(b)范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量的抗体或其抗原结合部分，其特异地结合并抑制CTLA-4；以及(c)用于在任何并行疗法方法中使用抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合的说明书。在一些实施方案中，将一些剂量的抗PD-1和抗CTLA-4抗体混合在单种药物配制物内用于并行施用。在其他实施方案中，将所述剂量的抗PD-1和抗CTLA-4抗体配制为具有各自抗体的分开的组合物，所述各自的抗体在药学上可接受的配制物中。
本公开进一步提供了用于治疗罹患癌症的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量的抗体或其抗原结合部分，其特异地结合并抑制PD-1；以及(b)用于在任何序贯疗法方法中使用抗PD-1抗体的说明书。
组合的PD-1和CTLA-4阻碍还可以进一步与标准癌症治疗组合。例如，组合的PD-1和CTLA-4阻碍可以有效地与化疗疗法组合，例如进一步与达卡巴嗪或IL-2组合，用于MEL的治疗。在这些情况下，它可能减少化疗试剂的剂量。组合使用PD-1和CTLA-4阻碍与化疗背后的科学原理在于，细胞死亡应导致肿瘤抗原水平以抗原呈递途径上升，所述细胞死亡是由大多数化疗化合物的细胞毒性作用所致。其他可能导致协同作用的具有组合的PD-1和CTLA-4阻碍的组合治疗包括放射、手术或激素阻断。这些试验方案的每一个都在宿主中产生肿瘤抗原源。血管生成抑制剂也可以与组合的PD-1和CTLA-4阻碍进行组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，这也可以成为注入宿主抗原呈递途径的肿瘤抗原源。
用抗PD-L1抗体对癌症患者的免疫治疗
PD-L1是实体瘤内主要的上调性的PD-1配体，在实体瘤中其能够分别抑制PD-1阳性的、肿瘤浸润CD4+和CD8+T细胞的细胞因子的产生和细胞溶解(cytolytic)活性(Dong等,2002；Hino等,2010；Taube等,2012)。这些特性使PD-L1成为癌症免疫治疗的极有前途的靶点。实施例中描述的抗PD-L1免疫治疗的临床试验首次证明了对于免疫抑制性配体PD-L1的单克隆抗体阻碍在转移性的NSCLC、MEL、RCC和OV患者中产生持久的肿瘤衰退和延长的(≥24周)疾病稳定，所述患者包括有过广泛的既往治疗的那些。人抗PD-L1人单克隆抗体，BMS-936559，在总的多至及含有10mg/kg的剂量处具有有利的安全谱，这从其3-4级药物相关不良事件的低发生率来看是明显的。这些发现与PD-L1-/-小鼠中观察到的轻微的自身免疫表型(Dong等,2004)以及在CTLA-4-/-小鼠中观察到的相对于PD-L1-/-小鼠而言更严重的过度增殖(hyperproliferation)(Phan等,2003；Tivol等,1995；Nishimura等,1999)。大多数与在患者中施用抗PD-L1有关联的毒性是免疫相关的，表明其精确的(on-target)作用。抗PD-L1和抗CTLA-4之间的特别关注的不良事件(adverseevents of special interest,AEOSIs)的频率和范围有所不同，强调了这些途径的生物学区别(Ribas等,2005)。在BMS-936559观察到了输注反应，尽管它们在大多数患者中是轻微的。在抗PD-L1很少注意到严重的大肠炎，一种在ipilimumab治疗的患者中观察到的药物相关的AE(Beck等,2006)。
如上面所看到的，对于抗PD-1免疫治疗，另一个重要的抗PD-L1治疗特征是跨越多种肿瘤类型的响应的持久性。考虑到当前研究中的患者的进展疾病和既往治疗，这是尤其值得注意的。虽然没有直接比较，这种持久性显得比在大多数用于治疗这些癌症的化学疗法和激酶抑制剂所观察到的那些更强。
因为外周血T细胞表达PD-L1，所以不可能在体内通过BMS-963559作为药效学测量物来评估RO。测试的剂量中位RO为65.8％、66.2％和72.4％。鉴于这些研究在用BMS-936559治疗的患者中提供直接的评估和靶点接合(engagement)的证据，肿瘤微环境与外周血中的RO之间的关系依然理解甚少。
基于本申请公开的临床数据，本公开提供用于罹患癌症的受试者的免疫治疗的方法，该方法包括对收拾则施用包含治疗上有效量的本发明抗PD-L1抗体或其抗原结合部分的组合物。在优选的实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是IgG1或IgG4同种型。在其他实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体或其抗原结合部分。在进一步的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是嵌合的、人源化的或人抗体或其抗原结合部分。在优选的用于治疗人患者的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是人抗体或其抗原结合部分。
实施例中所述的临床试验采用了抗PD-L1人单克隆抗体BMS-936559来治疗癌症。当BMS-936559(美国专利No.7,943,743中定名为人单克隆抗体12A4)被选为进入临床的主导抗体，值得注意的是，对12A4的治疗活性很重要的功能特性是一些本发明的抗PD-L1抗体与12A4所都具有的，所述功能特性包括以高亲和性特异性地结合到人PD-L1、增加T细胞增殖、在MLR测定法中分泌IL-2和生成干扰素γ、抑制PD-L1对PD-1的结合、以及逆转调节T细胞对于效应T细胞和/或树突细胞的抑制作用。并且，一些抗PD-L1抗体，即1B12、7H1和12B7在包含VH和Vκ区中与12A4在结构上相关的，所述VH和Vκ区分别具有来源于VH 1-69和VκL6种系序列的序列。此外，至少12B7、3G10、1B12和13G4与12A4交叉竞争结合到hPD-L1上的相同表位区，而5F8和10A5可能结合到与12A4相同或重叠的表位区(实施例2和3)。因而，12A4和其他抗PD-L1人单克隆抗体的临床前表征表示本文提供的治疗癌症的方法可以用任何广阔的类属的本发明的抗PD-L1抗体来进行。
因此，本公开提供包括对患者施用抗PD-L1抗体及其抗原结合部分的免疫治疗方法，所述抗PD-L1抗体及其抗原结合部分包含：(a)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-18种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL6种系序列的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-69种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL6种系序列的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-3种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL15种系序列的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 1-69种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκA27种系序列的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 3-9种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL15种系序列的序列；或(f)包含连续连接的氨基酸的重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VH 3-9种系序列的序列；以及包含连续连接的氨基酸的轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有来源于人VκL18种系序列的序列。
在一些实施方案中，施用于患者的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分与参考抗体或其参考抗原结合部分交叉竞争结合到PD-L1，所述参考抗体或其参考抗原结合部分包含：(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:15中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:25中所示的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:16中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:26中所示的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:17中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:27中所示的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:18中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:28中所示的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:19中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:29中所示的序列；(f)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:20中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:30中所示的序列；(g)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:21中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:31中所示的序列；(h)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:22中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:32中所示的序列；(i)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:23中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:33中所示的序列；或(j)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:24中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:34中所示的序列。在优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分与PD-1交叉竞争结合到参考抗体或其参考抗原结合部分，所述参考抗体或其参考抗原结合部分包含人重链可变区和人轻链可变区，所述人重链可变区包含具有SEQ ID NO:16中所示序列的连续连接的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含具有SEQ ID NO:26中所示序列的连续连接的氨基酸序列。
在一些本申请公开的免疫治疗方法的优选实施方案中，施用于受试者的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分包含：(a)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:15中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:25中所示的序列；(b)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:16中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:26中所示的序列；(c)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:17中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:27中所示的序列；(d)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:18中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:28中所示的序列；(e)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:19中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:29中所示的序列；(f)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:20中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:30中所示的序列；(g)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ IDNO:21中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:31中所示的序列；(h)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:22中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:32中所示的序列；(i)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:23中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:33中所示的序列；或(j)包含连续连接的氨基酸的人重链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:24中所示的序列；以及包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:34中所示的序列。在更优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含人重链可变区和人轻链可变区，所述人重链可变区包含具有SEQ ID NO:16中所示序列的连续连接的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含具有SEQ ID NO:26中所示序列的连续连接的氨基酸序列。
能通过抗PD-L1免疫治疗来治疗的癌症的广谱
晚期NSCLC患者中抗PD-L1的临床活性与这些患者中的抗PD-1的活性相似，是惊人的和意料之外的，因为NSCLC已被认为对基于免疫的疗法缺乏响应(Holt和Disis,2008；Holt等,2011)。用BMS-936559(本发明的抗PD-L1抗体)所获得本临床数据证实并扩展了用抗PD-1抗体获得的证据，所述证据为基于PD-1阻碍的免疫治疗不仅适用于“免疫原性的”肿瘤类型如MEL和RCC，也对广范围的癌症有效，包括通常认为缺乏免疫响应的治疗难愈的转移性NSCLC。优选的可用本发明的抗PD-L1抗体治疗的癌症包括MEL(即转移性恶性黑色素瘤)、RCC、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、CRC、卵巢癌(OV)、胃癌(CG)、乳腺癌(BC)、胰腺癌(PC)和食管癌。此外，本发明包括难愈的或复发的恶性肿瘤，其生长可以用本发明的抗PD-L1抗体来抑制。
因此，基于本文提供的抗PD-L1免疫治疗的非常广阔的适用性，可以用本发明的方法中的抗PD-L1抗体来治疗的癌症的例子包括：骨癌、皮肤癌头或颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤肾癌、肾癌、子宫癌、去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer)、结肠癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、卵巢、胃肠道和乳腺癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、儿童实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的那些)、转移性癌症、以及任何所述癌症的组合。本发明还适用于转移性癌症的治疗。
用抗PD-L1抗体的组合治疗
任选地，抗PD-L1的抗体可以与免疫原性剂组合，例如癌细胞制备物、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽、以及碳水化合物分子)、抗原呈递细胞如承载肿瘤相关抗原的树突细胞、用编码免疫刺激性细胞因子转染的细胞(He等,2004)。可用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原的肽、如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽、或经转染以表达GM-CSF细胞因子的肿瘤细胞。PD-L1阻碍还可有效地与标准癌症治疗组合，包括化疗疗法、放射、手术、激素阻断和血管生成抑制剂、以及其他免疫治疗的抗体(例如抗PD-1、抗CTLA-4或抗LAG-3抗体)。
抗体PD-L1抗体的用途
本公开提供本发明的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合部分用于制备这样的药物的用途，所述药物是用于抑制来自PD-1/PD-L1途径的信号传输从而在罹患癌症的受试者中加强内源性免疫响应。本公开也提供发明的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合部分用于制备这样的药物的用途，所述药物是用于对罹患癌症的受试者的免疫治疗，包括破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用。本公开提供本发明的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合部分对应于所有实施方案的医疗用途，所述实施方案是利用本文所述的抗PD-L1抗体的治疗方法的实施方案。
本公开还提供本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其用于治疗罹患癌症的受试者中的用途，包括通过抑制来自PD-1/PD-L1途径的信号传输而在罹患癌症的受试者中加强内源性免疫响应。本公开进一步提供了本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其用于治疗罹患癌症的受试者中的用途，包括破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用。这些抗体可用于针对本申请公开的全范围的癌症来加强内源性免疫响应，或用于上述全范围的癌症的免疫治疗。在优选的实施方案中，所述癌症包括MEL(即转移性恶性黑色素瘤)、RCC、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、CRC、卵巢癌(OV)、胃癌(CG)、乳腺癌(BC)、胰腺癌(PC)和食管癌。
对于通过免疫检验点阻碍的癌症免疫治疗的确证
免疫检验点阻碍的临床活性的一个主要含义是对肿瘤抗原产生显著的内源性免疫响应，并且这些响应可以在治疗上利用来介导检验点抑制时的临床肿瘤衰退。实际上，有证据显示抑制性配体如PD-L1响应于免疫攻击而被诱导，所述免疫攻击是一种称为适应抵抗(adaptive resistance)的机制(Gajewski等,2010；Taube等,2012)。肿瘤的免疫抵抗的潜在机制说明PD-1/PD-L1定向(directed)的治疗可以与其他增强内源性抗肿瘤免疫力的治疗进行协同作用。跟进研究证实了患者在PD-1/PD-L1途径阻碍停止后继续显示出肿瘤控制(Lipson等,2013)。这种肿瘤控制可能反应了持续的抗肿瘤免疫响应及产生有效的免疫记忆以实现对肿瘤生长的持续控制。
本申请公开的抗体的临床测试数据是前所未有的，所述抗体是阻碍免疫调节性受体PD-1的抗体，以及阻碍它的一种配体PD-L1的抗体。这些数据构成了PD-1途径定向的癌症免疫治疗迄今为止最大的临床经验，并且构成了第一个具体描述抗PD-L1定向剂的安全性、耐受性、和初始临床活性的报道。这些发现显示了抗PD-1和抗PD-L1都具有良好的总体安全谱并提供临床活性的清楚证据，所述证据跨越多种的癌症，包括NSCLC这种过去认为对免疫治疗无响应的肿瘤，以及已知响应于免疫治疗的肿瘤，包括MEL、RCC和OV。因而，这些数据有力地确证了PD-1/PD-L1途径作为在癌症中用于治疗性干预的重要靶点。
在用抗PD-1和抗PD-L1单克隆抗体获得的临床活性模式之间、以及在迄今为止分析的肿瘤类型中观察到的显著的相似性，确证了PD-1/PD-L1信号传输途径在肿瘤免疫抵抗中的普遍重要性，以及作为治疗干预的靶点的重要性。虽然通过这两种抗体来阻碍的分子相互作用不完全相同，但本文已清楚地证明，不管其机制的(mechanistic)细节如何，本发明的抗PD-1和抗PD-L1抗体在治疗罹患多种多样的癌症的患者的治疗中都是有效的。
传染性疾病
本发明的其他方法是用于治疗已暴露于具体毒素或病原体的患者。例如本公开的另一个方面提供在受试者中治疗感染性疾病的方法，包括对受试者施用本发明的抗PD-1或抗PD-L1抗体，或其抗原结合部分，从而治疗受试者的传染性疾病。优选的是，所述抗体是人抗人PD-1或PD-L1抗体(例如本申请描述的任何人抗体)。或者，所述抗体是嵌合的或人源化的抗体。
与其对肿瘤的如上所述的适用性相似，抗体介导的PD-1或PD-L1阻碍可以单独使用，或作为佐剂(adjuvant)与疫苗组合使用，以加强对病原体、毒素和/或自身抗原的免疫响应。这种治疗手段可能对其非常有用的病原体的例子包括，当前无对其有效疫苗的病原体、或常规疫苗对其低于完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、肝炎(甲型、乙型、和丙型)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫(Giardia)、疟疾、利什曼原虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。PD-1和/或PD-L1阻碍通过作用剂对于对抗已确立的(established)感染非常有效，如HIV，在一次感染进程中呈现出改变的病原体。这些抗原上的新表位在施用抗人PD-1或PD-L1时被识别为异质(foreign)，因而激发强烈的T细胞响应，所述响应不被通过PD-1/PD-L1途径的消极信号所抑制。
在上述方法中，PD-1或PD-L1阻碍能与其他形式的免疫治疗，如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF或IL-2的施用)组合。
试剂盒
同样在本发明范围内的还有试剂盒，包括药学试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗PD-1和/或抗PD-L1抗体，或抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合，用于治疗用途；以及包括诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含本发明的抗PD-L1抗体，用于测定作为筛选患者的生物标记物的膜PD-L1的表达，所述患者是筛选用于免疫治疗或用于预测免疫治疗剂的效力的。典型地，试剂盒含有说明试剂盒内容物目的用途的标签及使用说明书。术语“标签”包括随试剂盒或在试剂盒上提供的任何书面的或记录的材料，或其他伴随所述试剂盒的那些。在药物试剂盒的一些实施方案中，所述抗PD-1和/或抗PD-L1抗体可以与其他治疗剂以单位剂量形式共同包装。在诊断试剂盒的一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体可以与其他试剂共同包装用于进行测定以检测PD-L1的表达和/或对其定量。
在一些实施方案中，所述药物试剂盒包含抗人PD-1人单克隆抗体，nivolumab。在其他优选的实施方案中，所述药物试剂盒包含抗人PD-L1人单克隆抗体，BMS-936559。在其他优选的实施方案中，所述药物试剂盒包含抗人CTLA-4人单克隆抗体，ipilimumab。在一些优选的实施方案中，所述诊断试剂盒包含抗人兔抗人PD-L1单克隆抗体，28-8，其包含VH和Vκ区，所述VH和Vκ区的氨基酸序列分别在SEQ ID NOs.35和36中显示。在其他优选的实施方案中，所述诊断试剂盒包含鼠抗人PD-L1单克隆抗体，5H1(Dong等,2002)。
用于预测抗PD-1效力的PD-L1生物标记物
癌症免疫治疗中特定的挑战是鉴定基于机制的预测性生物标记物以实现患者选择及指导治疗中的管理。下述实施例所公开的数据表明肿瘤中细胞表面的PD-L1表达是有用的分子标记物，所述标记物用于预测用抗PD-1和潜在其他免疫检验点抑制剂的免疫治疗的效力，以及为所述免疫治疗选择患者。
在关于肿瘤中表达PD-L1的临床意义的文献中有不一致的报道。一些研究已得出结论认为肿瘤中的PD-L1表达与患者的不良预后有关联(参见Hino等(2010)(MEL)；Hamanishi等(2007)(OV)；Thompson等(2006)(RCC))。这些发现在“肿瘤细胞上PD-L1和T细胞上的PD-1有助于的消除针对肿瘤定位的免疫响应，导致对肿瘤特异性的T细胞的免疫逃逸”的基础上可能是合理的(Blank等,2005)。然而，与这些前述研究相对比的是，Gadiot等(2011)和Taube等(2012)最近报道了PD-L1在黑色素瘤肿瘤中的表达与对倾向于更好的生存的趋势有关联。这些看似矛盾的数据可能反映了相对患者的数量相对较小、研究的组织学亚型不同、或使用的方法不同，例如使用不同抗体来给PD-L1染色、用冰冻的对比石蜡包埋的材料用于IHC，以及检测膜和/或细胞质的PD-L1染色。Taube等(2012)注意到PD-L1是一种I型跨膜分子(type I transmembranemolecule)，并推测虽然PD-L1的细胞质存在可能代表这种多肽在细胞内的储存，所述多肽可能在适当的刺激下配置(deployed)于细胞表面，但是细胞表面PD-L1表达的那种才是作为潜在的预测对PD-1阻碍的临床响应的生物标记物而在生物学上相关的。参见Brahme等(2010)，其描述了膜PD-L1表达和抗PD-1效力之间关联的初步证据，所述证据是在仅9例患者的小样本上获得的。下述实施例所公开的膜PD-L1表达作为抗PD-1效力的生物标记物的数据证实了PD-L1表达可以用作预测抗PD-1临床响应和筛选患者以鉴定用抗PD-1抗体的免疫治疗的合适候选者的生物标记物，所述数据是从大出很多的样本的分析所获得的。虽然证明了这种生物标记物用于筛选抗PD-1治疗的患者或预测抗PD-1治疗的临床响应的实用性，但PD-L1表达的潜在适用可能还更广，作为其他种类的抑制性免疫调节物的抑制剂的伴随生物标记物。
具体而言，膜PD-L1表达是用自动化IHC实验方案及兔抗hPD-L1抗体来测定的。引人注目的是，在分析的初始组数据中(参见实施例8)，细胞表面PD-L1阴性的肿瘤(MEL、NSCLC、CRC、RCC和CRPC)的患者在用抗PD-1抗体nivolumab治疗后没有经历OR。相比之下，治疗前(pretreatment)活组织检查中肿瘤细胞上的PD-L1的细胞表面表达可能与用nivolumab治疗的患者中OR率的增长相关。虽然PD-L1的肿瘤细胞表达可能是通过基本水平的(constitutive)致癌途径来驱动的，但其可能也反映了响应于内源性抗肿瘤免疫响应的“适应性免疫抵抗”，所述内源性抗肿瘤免疫响应是宿主炎症响应的一部分，其可能保持受抑制状态，除非通过PD-1/PD-L1途径的阻碍而释放(Taube等,2012)。在癌症免疫学中新出现的适应性免疫抵抗概念表明了抑制性配体如PD-L1响应于免疫攻击而被诱导(Gajewski等,2010；Taube等,2012)。免疫检验点阻碍的临床活性的重大含义如本申请所述，是对肿瘤抗原产生显著的内源性免疫响应，并且这些响应可以在治疗上利用来介导检验点抑制时的临床肿瘤衰退。肿瘤的免疫抵抗的潜在机制表明PD-1/PD-L1定向的治疗可以与其他增强内源性抗肿瘤免疫力的治疗进行协同作用。
通过自动化IHC测定细胞表面PD-L1表达
如实施例中所描述，开发了一种自动化IHC方法用于测定FFPE组织样本中PD-L1在细胞表面的表达。本公开提供用于检测测试组织样品中人PD-L1抗原的存在的方法，或对人PD-L1抗原水平或样品中表达所述抗原的细胞比例进行定量的方法，这些方法包括将测试样品以及阴性对照样品与特异性结合到人PD-L1的单克隆抗体在允许抗体或其抗原结合部分与人PD-L1之间形成复合物的条件下接触。优选的是，所述测试和对照组织样品是FFPE样品。随后检测复合物的形成，其中测试样品和阴性对照样品之间在复合物形成上的差异表明了人PD-L1抗原在样品中的存在。用多种方法来对PD-L1表达定量。
在具体的实施方案中，自动化IHC方法包括：(a)在自动染色机中对贴好的组织切片进行脱蜡和复水；(b)用修复仪(decloaking chamber)和pH 6的缓冲液加热至110℃，10分钟，以修复抗原；(c)将试剂装入自动染色机；以及(d)运行自动染色机以包括中和组织样本中的内源性过氧化物酶；封闭载玻片上非特异性的蛋白结合位点；将载玻片与一级抗体(primary Ab)温育；与一级抗体后封闭剂温育；与NovoLink Polymer温育；添加色原体基质(chromogensubstrate)并显色；以及用苏木精(hematoxylin)复染。
为评估肿瘤组织样品中的PD-L1表达，病理学家在显微镜下诊查了各视野(fields)中的膜PD-L1+肿瘤细胞的数目，并脑中估算了阳性细胞的比例，然后将其平均分配以得到最终的比例。将不同的染色强度定义为0/阴性、1+/弱、2+/中等、和3+/强。典型地，百分率值首先分配至0和3+桶(buckets)，然后考虑中间的1+和2+强度。对于高度异质性的组织，样本被分成区，并且每个区分开评分然后合成单个的百分率值的套组。不同染色强度的阴性和阳性细胞的百分率从各区来确定，并且给出每个区的中位值。给到组织的最终的百分率值时根据各自的染色强度类别：阴性、1+、2+、和3+。所有染色强度的总和需为100％。
在肿瘤浸润性的炎症细胞如巨噬细胞和淋巴细胞中也评估了染色。在大多数情况下巨噬细胞是作为内部阳性对照的，因为染色是在高比例的巨噬细胞中观察的。虽然不需要染色3+的强度，但巨噬细胞无染色是应当考虑的，以排除任何技术故障。评估巨噬细胞和淋巴细胞的质膜染色，并且在所有样品的每个细胞类别中仅记录为呈阳性或阴性。染色还通过内部/外部肿瘤免疫细胞的指明(designation)来表征。“内部”意为免疫细胞是在肿瘤组织内部和/或在肿瘤区的边界上而没有在物理上进入肿瘤细胞之间的。“外部”意为与肿瘤没有物理关联，发现免疫细胞在与接头相连的外周中，或是在任何相连的邻近组织中。
在这些评分方法的一些实施方案中，两位病理学家对样品独立操作地进行评分，并且随后合并分数。在一些其他实施方案中，对阳性和阴性细胞的鉴定是用适当的软件来评分的。
组织评分被用作IHC数据的更为定量的测量法。所述组织评分按照如下来计算：
组织评分＝[(％肿瘤x1(低强度))+(％肿瘤x2(中等强度))+(％肿瘤x3(高强度)]
为了确定组织评分，病理学家估计了样本内每个强度类别的染色细胞的百分率。因为大多数生物标记物的表达是异质性的，所以组织评分是总体表达量的更真实的呈现。最终的组织评分范围为0(无表达)-300(最大表达)。
在测试组织样品IHC中对PD-L1表达定量的另一个方法是确定调整的炎症评分(adjusted inflammation score,AIS)，其定义为肿瘤浸润性炎症细胞的PD-L1表达百分数乘以炎症的密度(density)(Taub等,2012)。
用抗PD-1的癌症免疫治疗所包括的患者筛选步骤
本公开还提供用于罹患癌症的受试者的免疫治疗的方法，该方法包括：(a)筛选患者，所述患者对于免疫治疗是合适的候选者，所述免疫治疗例如使用抗PD-1抗体，所述筛选包括：(i)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(iii)基于评估结果而选择受试者作为合适候选者，所述评估结果为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例超过预定的阈值水平；以及(b)对选择的受试者施用包含治疗上有效量的作用剂的组合物，所述作用剂(例如抗PD-1抗体)破坏来自抑制性免疫调节物的信号传输。
有证据显示，膜PD-L1表达是内源性抗肿瘤免疫响应的替代者(surrogate)，所述响应是宿主炎症响应的一部分(Gajewski等,2010；Taube等,2012)。因此，肿瘤微环境中的肿瘤和/或炎症细胞中PD-L1的细胞表面表达可能不仅是用于选择癌症患者的标记物，所述患者从用抗PD-1抗体的治疗获益，还是用于用抗PD-L1抗体的治疗以及靶向除PD-1/PD-L1途径之外的抑制性免疫调节途径的治疗的标记物。例如，肿瘤和/或肿瘤浸润性炎症细胞中的PD-L1的细胞表面表达可以用作鉴定或筛选适合的癌症患者的标记物，所述患者从用作用剂的免疫治疗获益，所述作用剂包括靶向并破坏或抑制来自免疫检验点的信号传输的抗体，所述抗体如PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CytotoxicT-Lymphocyte Antigen-4,CTLA-4)、B和T淋巴细胞弱化剂(B and TLymphocyte Attenuator,BTLA)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白域-3(T cellImmunoglobulin and Mucin domain-3,TIM-3)、淋巴细胞激活基因-3(Lymphocyte Activation Gene-3,LAG-3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KillerImmunoglobulin-like Receptor,KIR)、杀伤细胞凝集素样受体(G1Killer cellLectin-like Receptor G1,KLRG-1)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)以及CD160(Pardoll,2012；Baitsch等,2012)。在一些优选的实施方案中，抑制性免疫调节物是PD-1/PD-L1信号传输途径的组分。在其他优选的实施方案中，所述抑制性免疫调节物是本发明的抗PD-1抗体。在另一些其他优选实施方案中，所述抑制性免疫调节物是本发明的抗PD-L1抗体。
当任何包括测定PD-L1表达(例如利用PD-L1生物标记物)的免疫治疗方法被如下描述为包括对患者的选择，所述患者适合或不适合抗PD-1免疫治疗的，或是描述为包括施用抗PD-1抗体用于免疫治疗目的时，应当了解这些方法更广阔地适用于选择适合或不适合免疫治疗的患者，所述免疫治疗是用对抑制性免疫调节物的抑制剂例如CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3或KIR)或其组分或配体的施用。进一步地，在任何包括在测试组织样品中测量PD-L1表达量的方法中，应当了解，包括对获取自患者测试组织样品的规定的步骤是一项任选步骤。也就是说，在包括这项步骤的方法的一些实施方案中，以及在其他实施方案中，这项步骤并没有包括在所述方法中。应当了解，在一些优选的实施方案中，为了鉴定或确定测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞数量或比例的所述“评估”步骤是通过变化的(transformative)测定PD-L1表达的方法进行的，例如通过进行逆转录酶链式反应(RT-PCR)测定法或IHC测定法。在一些其他实施方案中，不涉及变化的步骤，且PD-L1表达是通过例如回顾来自实验室的测试结果的报告来测定的。在一些实施方案中，所述方法的步骤多至且包括评估PD-L1表达，所述步骤提供了中间结果，所述中间结果可能被提供给医师或其他医疗从业者，用于选择免疫治疗的合适候选者和/或对患者施用免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，提供所述中间结果的步骤可以通过医疗从业者或在医疗从业者指导下行动的人来进行。在一些实施方案中，这些步骤是通过独立的实验室或通过独立个人如实验室技师来进行的。
本公开还提供用于罹患癌症的受试者的治疗的方法，该方法包括：(a)选择不适合用抑制抑制性免疫调剂物治疗(例如抗PD-1抗体免疫治疗)的受试者，所述选择包括：(i)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(iii)基于评估结果而选择不适合用抑制抑制性免疫调剂物治疗(例如抗PD-1抗体免疫治疗)的受试者，所述评估结果为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例低于预定的阈值水平；和(b)对选择的受试者施用除抑制性免疫调节物的抑制剂(例如抗PD-1抗体)之外的治疗标准治疗剂。
PD-L1的测量
在本方法的任一种的一些实施方案中，表达PD-L1的细胞比例是通过进行确定PD-L1RNA的存在的测定法来评估的。在进一步的实施方案中，PD-L1RNA的存在是通过RT-PCR、原位杂交或RNA酶保护来确定的。在其他实施方案中，表达PD-L1的细胞比例是通过进行确定PD-L1多肽的存在的测定法来评估的。在进一步的实施方案中，PD-L1多肽的存在是通过免疫组化(IHC)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、体内成像、或流式细胞术来确定的。在优选的实施方案中，PD-L1表达是通过IHC来测定的。流式细胞仪可能特别适合用于测定PD-L1在血液肿瘤的细胞中的表达。在所有这些方法的优选实施方案中，PD-L1的细胞表面表达是用例如IHC或体内成像来测定的。
成像技术提供了癌症研究和治疗中的重要工具。最近的在分子成像系统中的发展包括正电子发射断层摄影术(positron emission tomography,PET)、单光子发射计算体层摄影术(single-photon emission computed tomography,SPECT)、荧光反射率成像(fluorescence reflectance imaging,FRI)、荧光介导的断层摄影术(fluorescence-mediated tomography,FMT)、生物发光成像(bioluminescence imaging,BLI)、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和多光子显微镜(MPM)，可能通报这些技术在癌症研究中甚至更大的用途。这些分子成像系统的一些不仅允许临床医师观察肿瘤在体内的位置，还允许对影响肿瘤活动和/或对治疗药物响应能力的具体分子、细胞和生物学过程进行可视化(Condeelis和Weissleder,2010)。抗体特异性，与PET的灵敏度和分辨率相结合，使得免疫PET成像对于在组织样品中监控和测定抗原的表达特别有吸引力(McCabe和Wu,2010；Olafsen等,2010)。在本方法的任一种的一些实施方案中，PD-L1表达是通过免疫PET成像来测定的。
在本方法的任一种的一些实施方案中，测试组织样品中表达PD-L1的细胞比例通过进行确定所述测试组织样品中细胞表面PD-L1多肽的存在的测定法来评估。在一些实施方案中，所述测试组织样品是FFPE组织样品。在一些优选的实施方案中，PD-L1多肽的存在通过IHC测定法来确定。在进一步的实施方案中，所述IHC测定法用自动化方法进行。在进一步的实施方案中，所述IHC测定法用抗PD-L1单克隆抗体结合到PD-L1多肽来进行。
在FFPE组织中特异性结合到细胞表面表达的PD-L1的抗体
抗体可能在新鲜组织中结合到抗原但完全无法在FFPE组织样品中识别抗原。这种本领域所熟知的现象被认为主要是由于福尔马林固定而诱导的多肽的分子内和分子间交联(cross-linking)，所述交联改变了抗体识别的表位(Sompuram等,2006)。此外，已知一些因素影响FFPE组织中的染色，包括到固定的时间的变化、固定时间不足、使用的固定剂、组织处理、抗体克隆和稀释的不同、使用不同阈值点的抗原修复、检测系统、以及结果分析，都是能够影响组织抗原性和IHC测量的重要变量(Bordeaux等,2010)。具体而言，本领域中注意到了对FFPE样本中染色PD-L1的抗人PD-L1抗体的缺乏(Hamanishi等,2007)。Taube等(2012)和Gadiot等(2011)也报道了鉴定特异性地结合到FFPE组织中的PD-L1的抗PD-L1抗体中的困难，以及对同一抗体不一致的测试结果。我们自己的5种可商购的抗hPD-L1抗体显示，这些抗体无法区分表达PD-L1的FFPE细胞与不表达PD-L1的细胞(参见实施例9，表7)。因而，不同小组针对PD-L1表达用于肿瘤预后的关联而报道的矛盾的结果可部分地反映抗PD-L1抗体的区别的能力，所述抗体用于检测FFPE组织样品中的PD-L1多肽。因此，为了用FFPE组织上的IHC测定法来检测细胞表面的hPD-L1，需要在FFPE组织样品中特异性地结合到细胞表面表达的PD-L1的抗hPD-L1抗体。
本公开提供在FFPE组织样品中特异性地结合到细胞表面表达的PD-L1抗原的单克隆抗体或其抗原结合部分。在优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合部分不结合到FFPE组织样品中的细胞质PD-L1多肽或展示出非常低水平的背景结合。在一些其他的实施方案中，对细胞表面表达的或细胞质的PD-L1多肽的特异性结合是通过免疫组化染色来检测的。在本发明的一些优选实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合部分是兔抗体或其部分。在其他优选的实施方案中，所述单克隆抗体是指定为28-8、28-1、28-12、29-8或20-12的兔单克隆抗体。在更优选的实施方案中，所述单克隆抗体是指定为28-8的单克隆抗体或其抗原结合部分。在进一步的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，所述抗体包含续连接的氨基酸的人重链可变区(VH)，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:35中所示的序列；并且包含连续连接的氨基酸的人轻链可变区(Vκ)，所述连续连接的氨基酸具有SEQ ID NO:36中所示的序列。在其他实施方案中，所述单克隆抗体在VH中包含CDR1、CDR2和CDR3域，其具有SEQ ID NO:35中所示序列；以及在Vκ中包含CDR1、CDR2和CDR3域，其具有SEQ ID NO:36中所示序列。
本领域已知，兔抗体相比鼠抗体具有一定的优势。例如兔抗体通常展示出更多种的表位识别，对小尺寸表位的提高的免疫响应，以及与鼠抗体相比更高的特异性和亲和性(参见例如Fischer等,2008；Cheang等,2006；Rossi等,2005)。例如，与鼠抗体相比，兔较低的免疫显性(dominance)和更大的B细胞全部能力(repertoire)产生了更好的表位识别。进一步地，兔抗体的高亲和性和新表位识别转化为识别翻译后修饰上的成功(Epitomics,2013)。此外，许多与信号转导和疾病相关的蛋白靶点在小鼠、大鼠和人之间是高度保守的，并且因此小鼠或大鼠宿主被识别为自身抗原，这使它们免疫原性更低。通过在兔中生产抗体而避免了这个问题。另外，在需要两种抗原特异性抗体的应用中，让抗体来自两种不同物种是更加方便的。因而，例如，用其他能标记免疫细胞并同时表达PD-L1(例如巨噬细胞和淋巴细胞)的抗体(可能是鼠抗体，因为最好的免疫标记抗体是鼠抗体)使兔抗体如28-8多重化(multiplex)是更容易的。因此，兔抗hPD-L1单克隆抗体，例如28-8，特别适于在FFPE组织样品中检测表面表达的PD-L1的IHC测定法，并潜在相比于鼠抗体如5H1具有独特的优势。
如实施例9所述，筛选到了大量的(185种)来自兔和小鼠的免疫的抗体多克隆，而仅有10种兔抗体，但没有小鼠抗体，多克隆特异性地检测膜形式的hPD-L1。在进一步的通过多次IHC的大范围筛选后，15种纯化的兔亚克隆基于它们染色的特异性和亲和性而被选出(参见表5)。随着对抗体进一步的表征以检测它们的结合亲和性及交叉竞争(所述表征是通过表明等离子体共振进行的)，以及通过对FFPE的IHC筛选，选出了单克隆抗体28-8为兼具以高亲和性和特异性结合到膜PD-L1和低背景染色(low background staining)的最佳组合的抗体。
在本发明的一些方面，所述单克隆抗体或其抗原结合部分与小鼠单克隆抗体5H1交叉竞争结合到PD-L1，这表示这些抗体结合到PD-L1的同一表位区。在一些其他方面，所述单克隆抗体或其抗原结合部分不与小鼠单克隆抗体5H1交叉竞争结合到PD-L1，表示他们不结合到PD-L1的同一表位区。
本公开还提供编码本申请描述的所有所述兔抗hPD-L1抗体或其抗原结合部分的核酸。
包括测量细胞表面PD-L1表达的免疫治疗方法
在FFPE组织样本中以高亲和力特异性地结合到膜PD-L1的兔抗体的有效性(availability)促进了这样的方法，所述方法包括在FFPE组织样品中检测细胞表面的PD-L1多肽的步骤。因此，本公开还提供用于罹患癌症的受试者的免疫治疗的方法，该方法包括：(a)选择患者，所述患者对于免疫治疗是合适的候选者，所述选择包括：(i)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(ii)通过用兔抗人PD-L1抗体(例如单克隆抗体28-8)去结合PD-L1的IHC来评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(iii)基于评估结果而选择受试者作为合适候选者，所述评估结果为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例超过预定的阈值水平；以及(b)对选择的受试者施用包含治疗上有效量的作用剂的组合物，所述作用剂(例如抗PD-1抗体)抑制抑制性免疫调节物。
在利用IHC来测定FFPE组织中PD-L1表达的方法的一些实施方案中，使用了自动化IHC测定法。所述自动化IHC方法是在自动染色机上进行的，并包括：(a)用二甲苯对FFPE样品进行脱蜡并对样品进行复水；(b)用修复仪来修复抗原；(c)通过与Protein Block温育来封闭载玻片上非特异性的蛋白结合位点；(d)将样品与一级抗PD-L1抗体温育；(e)加入聚合的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二级抗体；(f)检测结合的二级抗体，包括用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)色原体进行染色；和/或(g)用苏木精复染。这种自动化IHC方法已通过如下方法来最优化：将步骤数最小化、最优化温育时间、以及选择产生强特异性染色及低水平背景染色的一级抗体、封闭和检测试剂。在这种自动化IHC测定法的优选实施方案中，所述一级抗PD-L1抗体是兔单克隆抗体28-8或鼠单克隆抗体5H1。在本发明的一些实施方案中，这种IHC测定法和本申请描述的任何其他测量PD-L1表达的IHC测定法可以用作免疫治疗方法的一部分。在其他实施方案中，任何本申请描述的IHC方法是独立于任何施用治疗剂的治疗方法而使用的，即单独作为一种诊断方法来测定PD-L1表达。
在本申请描述的免疫治疗方法的一些实施方案中，对选择的受试者施用的抗体是任何本发明的抗PD-1或抗PD-L1抗体或其抗原结合部分。在一些优选的实施方案中，受试者是人。在其他优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是人抗体或其抗原结合部分。在更优选的实施方案中，所述抗PD-1抗体是nivolumab而抗PD-L1抗体是BMS-936559。在一些其他实施方案中，所述抗PD-1抗体是与nivolumab交叉竞争结合到PD-1的抗体或其抗原结合部分，而抗PD-L1抗体是与BMS-936559交叉竞争结合到PD-L1的抗体或其抗原结合部分。在一些优选的实施方案中，治疗的癌症选自下组：MEL、RCC、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、CRC、去势抵抗性前列腺癌CRPC、HCC、头部与颈部的鳞状细胞癌、食管、卵巢、胃肠道及乳腺癌、和血液的恶性肿瘤。
在所述公开的方法的一些实施方案中，预定的阈值是基于(a)肿瘤细胞、(b)肿瘤浸润性的炎症细胞、(c)特定的肿瘤浸润性的炎症细胞例如TILs或巨噬细胞、或(d)肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞的组合在测试组织样品中的比例，所述测试组织样品在细胞表面上表达PD-L1。在一些实施方案中，所述预定的阈值为通过IHC确定的表达膜PD-L1的肿瘤细胞的至少0.001％。在其他实施方案中，所述预定的阈值为通过IHC确定的表达膜PD-L1的肿瘤细胞的至少0.01％，优选为至少0.1％，更优选为至少1％。在一些实施方案中，所述预定的阈值为通过IHC确定的表达膜PD-L1的肿瘤细胞的至少5％。在一些实施方案中，所述预定的阈值为通过IHC确定的表达膜PD-L1的肿瘤细胞的至少0.01％、至少0.1％、至少1％或至少5％，和/或通过IHC确定的表达膜PD-L1的单个肿瘤浸润性的炎症细胞。在一些其他的实施方案中，所述预定的阈值为通过IHC确定的表达膜PD-L1的肿瘤浸润性的炎症细胞的至少0.01％、至少0.1％、至少1％或至少5％。在一些其他的实施方案中，所述预定的阈值为通过IHC确定的表达膜PD-L1的肿瘤浸润性的淋巴细胞的至少0.01％、至少0.1％、至少1％或至少5％。在一些其他的实施方案中，所述预定的阈值为通过IHC确定的表达膜PD-L1的肿瘤浸润性的巨噬细胞的至少0.01％、至少0.1％、至少1％或至少5％。在另一些其他的实施方案中，所述预定的阈值为通过IHC确定的表达膜PD-L1的至少单个肿瘤细胞或单个肿瘤浸润性的炎症细胞。优选的是，PD-L1表达是通过自动化IHC用单克隆抗体28-8或5H1作为一级抗体来测定的。
本公开还提供用于罹患癌症的受试者的治疗的方法，该方法包括：(a)筛选多数受试者以鉴定不对于免疫治疗是合适的候选者的受试者，所述免疫治疗包括对受试者施用抑制抑制性免疫调节物的作用剂，例如抗PD-1抗体，所述筛选包括：(i)任选地提供来自多数受试者的测试组织样品，所述测试组织样品包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(iii)基于评估结果而选择受试者作为不适合免疫治疗的候选者，所述评估结果为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例低于预定的阈值水平；以及(b)对选择的受试者施用除抑制性免疫调节物的抑制剂(例如抗PD-1抗体)之外的治疗标准治疗剂。
本公开进一步提供用于罹患癌症的受试者的治疗的方法，该方法包括：(a)筛选多数受试者以鉴定对于免疫治疗是合适的候选者的受试者，所述筛选包括：(i)任选地提供来自多数受试者的测试组织样品，所述测试组织样品包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(iii)基于评估结果而选择受试者作为合适的候选者，所述免疫治疗是用抑制抑制性免疫调节物的作用剂(例如抗PD-1抗体)进行的，所述评估结果为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例超过预定的阈值水平；以及(b)对选择的受试者施用包含治疗上有效量的所述作用剂。
本公开另外还提供用于罹患癌症的受试者的治疗的方法，该方法包括：(a)筛选多数受试者以鉴定是所述治疗的合适候选者的受试者，所述筛选包括：(i)任选地提供来自多数受试者的测试组织样品，所述测试组织样品包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例，其中若测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例超过预定的阈值水平，则所述受试者被鉴定为抗PD-1抗体免疫治疗的合适候选者；而若测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例低于预定的阈值水平，则所述受试者被鉴定为不是抗PD-1抗体免疫治疗的合适候选者；以及(b)对鉴定为抗PD-1抗体免疫治疗的合适候选者的受试者施用包含治疗上有效量的作用剂的组合物，所述作用剂(例如抗PD-1抗体)抑制抑制性免疫调节物；或(c)对鉴定为不是抗PD-1抗体免疫治疗的合适候选者的受试者施用除所述作用剂之外的治疗标准治疗剂。
本发明的一个方面是用于罹患癌症的受试者的免疫治疗方法，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的受试者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)确定测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例是高于预定阈值水平的；以及(c)基于此确定结果(determination)而对受试者施用包含治疗上有效量的作用剂的组合物，所述作用剂(例如抗PD-1抗体)抑制抑制性免疫调节物。本发明的另一个方面是用于罹患癌症的受试者的免疫治疗方法，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的受试者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)确定测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例是低于预定阈值水平的；以及(c)基于此确定结果而对受试者施用除了抑制抑制性免疫调节物的作用剂(例如抗PD-1抗体)之外的治疗标准的疗法。
本发明的又一个方面是用于罹患癌症的受试者的免疫治疗方法，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的受试者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)确定测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(c)选择抑制抑制性免疫调节物的作用剂(例如抗PD-1抗体)作为用于患者的治疗，这是基于识别了抗PD-1抗体在患者中是有效的，所述患者的测试组织样品含有一定比例的在细胞表面上表达PD-L1高于预定阈值水平的细胞；以及(d)对受试者施用包含治疗上有效量的所述作用剂的组合物。在其他实施方案中，本公开提供了用于罹患癌症的受试者的方法，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)确定测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及(c)选择除了抑制抑制性免疫调节物的作用剂(例如抗PD-1抗体)之外的治疗标准的疗法作为用于受试者的治疗，这是基于识别了所述试剂在患者中是有效的，所述患者体内含有一定比例的在细胞表面上表达PD-L1低于预定阈值水平的细胞；以及(d)对受试者施用治疗标准的疗法。
本公开还提供用于罹患癌症的免疫治疗的选择方法，该方法包括：(a)测定包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞的测试组织样品的细胞，以评估测试组织样品中表达PD-L1的细胞；以及(b)基于评估结果为受试者选择包含治疗上有效量的作用剂(例如抗PD-1抗体)的免疫治疗，所述作用剂抑制抑制性免疫调节物，所述评估结果为表达膜PD-L1的细胞比例高于预定的阈值水平。本公开还进一步提供用于罹患癌症的免疫治疗的选择方法，该方法包括：(a)测定包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞的测试组织样品的细胞，以评估测试组织样品中表达PD-L1的细胞；以及(b)基于评估结果为受试者选择除了抑制抑制性免疫调节物的作用剂(例如抗PD-1抗体)之外的治疗标准的治疗，所述作用剂抑制抑制性免疫调节物，所述评估结果为表达膜PD-L1的细胞比例低于预定的阈值水平。
此外，本公开提供用于罹患癌症的受试者的治疗方法，该方法包括对受试者施用包含治疗上有效量的作用剂(例如抗PD-1抗体)的组合物，所述作用剂抑制抑制性免疫调节物，所述受试者是基于如下确定结果而选出的：来自受试者的测试组织样品中表达PD-L1的细胞比例被确定为超过了预定的阈值水平；其中所述组织样品包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞。本公开还提供用于罹患癌症的受试者的治疗方法，该方法包括对受试者施用除了抑制抑制性免疫调节物的作用剂(例如抗PD-1抗体)之外的治疗标准的治疗，所述受试者是基于如下确定结果而选出的：来自受试者的测试组织样品中表达PD-L1的细胞比例被确定为低于预定的阈值水平；其中所述组织样品包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞。
本公开进一步提供用于选择免疫治疗的癌症患者的方法，所述免疫治疗是用抑制抑制性免疫调节物的作用剂(例如抗PD-1抗体)的，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的受试者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)测定测试组织样品以确定其中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；(c)比较在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例与预定的阈值比例；以及(d)基于评估结果而选择免疫治疗的患者，所述评估结果为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例高于预定的阈值水平。
在本文所述的包括测定PD-L1表达的步骤的方法的任一种中，测试组织样品可以是FFPE组织样品，而细胞表面的PD-L1多肽是用抗PD-L1抗体(例如单克隆抗体28-8或5H1)通过IHC来检测的。
此外，在选择免疫治疗或基于来自受试者的测试组织样品中表达PD-L1的细胞比例高于预定阈值水平的测定法结果来施用的任何方法中，可以得出结论，可实施补充治疗方法，其中基于来自受试者的测试组织样品中表达PD-L1的细胞比例低于预定阈值水平的测定法结果而选择或施用除免疫治疗之外的治疗标准治疗。
本公开进一步提供用于预测抑制抑制性免疫调节物的作用剂(例如抗PD-1抗体)治疗癌症患者的治疗有效性的方法，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)测定测试组织样品以确定其中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；(c)比较在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例与预定的阈值比例；以及(d)预测所述作用剂的治疗有效性，其中如果在细胞表面上表达PD-L1的细胞比例超过阈值比例，则预测所述作用剂对于治疗患者是有效的；而其中如果在细胞表面上表达PD-L1的细胞比例低于阈值比例，则预测所述作用剂对于治疗患者不是有效的。
本公开还提供用于确定免疫治疗疗法的方法，所述疗法包含抑制抑制性免疫调剂物的用于治疗癌症患者的作用剂(例如抗PD-1抗体)，该方法包括：(a)任选地提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得的，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；(b)测定测试组织样品以确定其中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；(c)比较在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例与预定的阈值比例；以及(d)基于确定结果而确定包含所述作用剂的免疫治疗疗法，所述确定结果为细胞表面表达PD-L1的细胞的比例超过预定的阈值比例。
治疗标准的疗法
本申请描述的治疗的一些方法包括对患者施用治疗标准的疗法。如本申请所用，“治疗标准的疗法”是一种治疗方法，包括药物或药物的组合，放射治疗(RT)、手术、或执业医师认为合适的、所接受的、和/或广泛用于某一类患者、疾病或临床情况的其他医疗干预。不同癌症类型的治疗标准的治疗是本领域技术人员所熟知的。例如，美国国立综合癌症网络(NationalComprehensive Cancer Network，NCCN)，美国21所主要的癌症中心的联盟，出版了NCCN肿瘤学临床实践指南(NCCN)，提供了关于多种癌症的治疗标准治疗的详细最新信息(参见NCCN2013)。举例来说，MEL、RCC和NSCLC的治疗标准治疗总结如下。
黑色素瘤
MEL是一种黑色素母细胞的恶性肿瘤，产黑色素的细胞主要在皮肤中发现。虽然相比其他皮肤癌症较不常见，但如果没有早期诊断出，它是皮肤癌症中最危险的，并引起大多数的(75％)皮肤癌症死亡。MEL的发病率在全世界的白种人群中正在上升，特别是在人们皮肤色素沉着量低而接受过量来自太阳的紫外线照射的人群中。在欧洲，发病率为<10-20例每百万人口；在美国为20-30例每百万人口；而在观察到最高发病率的澳大利亚则为50-60例每百万人口(Garbe等,2012)。MEL占了美国(U.S.)所有新癌症病例中的约5％，而其发病率每年持续上升约3％。这在2013年在美国转化为76690个预计的新病例以及9480例相关死亡(Siegel等(2013)。
对于原位(0期)或早期MEL(I-II期)而言，主要的治疗是手术切除。通常，局部性疾病和肿瘤1.0mm或更低厚度的患者的预后是良好的，其5年生存率超过90％(NCCN2013-黑色素瘤)。当由于共病(comorbidity)或美观上敏感的肿瘤位置而导致手术切除对于原位黑色素瘤不可行时，局部咪喹莫特和放疗则成为新的治疗，尤其是恶性雀斑样痣。用于治疗MEL的化疗剂包括达卡巴嗪、用于有c-KIT突变的黑色素瘤的替莫唑胺(temozolomide)和伊马替尼、高剂量白细胞介素-2、以及紫杉醇组合或不组合卡铂。然而，这些治疗具有适度的成功，其在一线(1L)和二线(2L)条件(settings)下响应率低于20％。
对于局部黑色素瘤在厚度上高于1.0mm的患者，生存率范围为50-90％。区性淋巴结转移(regional nodal involvement)的可能性随肿瘤厚度的增加而增加。III期MEL(临床阳性淋巴结(positive nodes)和/或转移疾病)的5年生存期范围为20-70％。目前为止，最致命的是IV期MEL，其具有远处转移性黑色素瘤的患者中的长期生存率低于10％(NCCN2013-黑色素瘤)。
尽管在研究多种治疗，包括切除至干净边缘(clear margins)、病损内注射、激光消融术、放射或生物化疗(组合化疗与生物作用剂如干扰素α和IL-2)，但对于转移性MEL的最佳治疗尚未有共识。转移性MEL的治疗前景在近期随着新药物如威罗菲尼和ipilimumab的开发而大幅提高。威罗菲尼抑制突变的BRAF(一种细胞内激酶)的信号传输，所述突变的BRAF在约50％的转移性MEL患者中存在。在临床试验中，威罗菲尼在BRAF突变阳性的患者中提供估计5.3个月的无进展生存期(PFS)，相比之下达卡巴嗪仅1.6个月；而威罗菲尼的中位OS为15.9个月，对比达卡巴嗪的5.6-7.8个月(Chapman等,2011；Sosman等,2012)。Ipilimumab是一种抑制免疫检验点受体CTLA-4的人单克隆抗体，并进而刺激T细胞免疫响应。Ipilimumab组合或不组合糖蛋白100(gp100)多肽疫苗，在转移性MEL既往治疗过的患者中将中位OS提高至10.0-10.1个月，相比之下单独接受gp100的患者中则为6.4个月(Hodi等,2010)。除了这两种作用剂之外，再没有其他作用剂在三期随机化研究中被证明有OS获益。达卡巴嗪被FDA和EMA批准用于治疗转移性MEL，其报道的客观响应率为5-20％，而中位OS为约6.4个月，但这些响应是短暂的。其他药物如替莫唑胺和福莫司汀(fotemustine)与达卡巴嗪相比并没有显著的生存期提高。IL-2也被FDA批准用于治疗转移性MEL，如其与15-20％的响应率有关，包括4-6％的可以持久的完全响应，但它也与显著毒性有关，包括低血压、心律失常、和肺水肿。关于黑色素的治疗标准治疗的进一步细节由Garbe等(2012)和《NCCN2013-黑色素瘤》提供。尽管最近批准ipilimumab和威罗菲尼的用于晚期MEL，但仍有大量患者需求未被满足，所述患者在BRAF抑制剂(取决于BRAF状态)和抗CTLA-4治疗中进展，或是患有既往未治疗过的、不可切除或转移性的BRAF野生型MEL。晚期MEL目前的5年生存率仅为15％。
肾细胞癌
RCC在成人中是最常见的肾癌类型，其是约90％的肾肿瘤的原因，而这些中的80-90％是透明细胞肿瘤(clear cell tumors)(NCCN2013-肾癌)。它也是所有泌尿生殖器肿瘤中最致命的。2013年美国预计有65150例患者会诊断出肾癌，而13680例会死于此疾病(Siegel等(2013)。
对于临床上的局部RCC(IA期和IB期)，手术切除是有效地治疗，包括根治性肾切除术和肾单位保留手术(nephron-sparing surgery)。局部肾切除术通常不适合局部晚期肿瘤患者(II和III期)，在该情况下优选根治性肾切除术。当肿瘤限于肾实质时，其5年生存率为60-70％，但这在IV期疾病中相当地降低了，所述IV期疾病中转移已扩散。虽然患者可能从手术获益，并且推荐具有潜在手术可切除的原发转移或多发可切除转移的患者在全身治疗前接受减瘤性肾切除术(cytoreductive nephrectomy)，但IV期RCC是相对耐RT和化疗的。
直到最近，细胞因子IL-2和IFNα是仅有的晚期或转移性RCC的积极全身性治疗，二者都提供了5-27％的报道的ORRs。然而，由于这些作用剂各自的有限的临床获益和大量的毒性谱，更新的靶向作用剂在晚期或转移性肾细胞癌中很大程度上替代了细胞因子。对透明细胞RCC的发病机理中低氧诱导因子α(HIFα)信号传输的重要性的认识，引起了对两类靶向治疗(酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)抑制剂)在1L和2L治疗中的广泛研究(Mulders,2009)。将血管生成作为靶标是合理的，因为基本水平的HIFα激活导致一些蛋白的上调或激活，所述蛋白包括血管内皮生长因子(VEGF)，VEGF能随后导致肿瘤增殖和新生血管系统的形成。将mTOR途径作为靶标是重要的，因为上游PI3K/Akt/mTOR信号传输途径的激活是基本水平的HIFα激活或上调的一种方法(Mulders,2009)。靶向血管生成的作用剂包括VEGF受体(VEGFr)酪氨酸激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、和tivozanib)以及VEGF结合单抗(例如贝伐珠单抗)，而靶向mTOR途径的作用剂包括mTOR抑制剂(例如依维莫司和坦罗莫司)(Mulders,2009；NCCN2013-肾癌)。然而，大多数患者发展出耐药性，并且仅在一项三期试验的高风险(poor-risk)患者中显示出OS的提高：坦罗莫司在晚期RCC患者中显示出与IFNα相比统计学上显著的OS获益(10.9个月对比7.3个月)(Hudes等,2007)。依维莫司也在中位PFS中显示出相比安慰剂2.1个月的提高(Motzer等,2008)。在批准的5种抗血管生成剂(索拉非尼、舒尼替尼、贝伐珠单抗、帕唑帕尼、和阿昔替尼)以及批准的2种mTOR抑制剂(坦罗莫司、依维莫司)中，仅有依维莫司被明确批准在抗血管生成疗法的治疗失败后使用。在美国，依维莫司适用于在舒尼替尼或索拉非尼治疗失败后的晚期RCC治疗，而在欧洲，依维莫司更为广泛地适用于患有晚期RCC的患者，其疾病在用VEGF靶向疗法的治疗中或治疗后出现进展。
非小细胞肺癌
在美国和全世界，NSCLC是癌症死亡主要的病因，超过了乳腺、结肠和前列腺癌的组合。在美国，预计将诊断出228190例肺和支气管新病例以及大约159480例因这种疾病的死亡发生(Siegel等,2013)。大多数患者(约78％)被诊断患有晚期/复发的或转移性的疾病。经常发生从肺癌转移到肾上腺，约33％的患者有这种转移。NSCLC治疗增进地改善OS，但其获益达到了一个平台期(晚期患者的中位OS仅为1年)。1L治疗后在几乎所有受试者中都出现进展，而在难愈的条件下5年生存率仅为3.6％。从2005年至2009年，在美国肺癌的总体5年相对生存率为15.9％(NCCN2013–非小细胞肺癌)。
手术、RT和化疗是三种常用于治疗NSCLC患者的方式。作为一类，NSCLCs与小细胞癌相比对化疗和RT相对敏感。通常，对于患有I期和II期疾病的患者，手术切除提供了最佳的治愈机会，而化疗则在术前和术后都越来越多地使用。RT也被用作可切除的NSCLC患者的辅助治疗、主要的局部治疗、或作为不可治愈的NSCLC患者的姑息治疗。
患有IV期疾病且具有良好体能状态(performance status,PS)的患者从化疗获益。许多药物，包括铂作用剂(例如顺铂、卡铂)、紫杉烷作用剂(例如紫杉醇、白蛋白结合紫杉醇、多西他赛)、长春瑞滨、长春花碱、依托泊苷、培美曲塞和吉西他滨对于IV期NSCLC是有用的。使用多种这些药物的组合提供30％-40％的1年生存率并且优于单剂。用于治疗晚期肺癌的特异性的靶向治疗也已开发出来。例如，贝伐珠单抗()是阻碍血管内皮生长因子A(VEGF-A)的单克隆抗体。厄洛替尼()是表皮生长因子受体(EGFR)的小分子TKI。克唑替尼(Crizotinib,)是靶向ALK和MET的小分子TKI，并用于治疗携带突变的ALK融合基因的患者中的NSCLC。西妥昔单抗()是靶向EGFR的单克隆抗体。
患有鳞状细胞NSCLC(代表了所有NSCLC的多达25％)的患者中有特别的需求没有得到满足，因为1L治疗后的治疗选择很少。单剂化疗是用基于铂的双药化疗(Pt-doublet)进展后的治疗标准，结果是约7个月的中位OS。多西他赛仍然是这一线治疗的基准治疗，尽管也可能以低频率使用厄洛替尼。培美曲塞也显示出产生临床上等同的效力结局，而与多西他赛相比在晚期NSCLC患者的2L治疗中副作用显著更少(Hanna等,2004)。目前没有治疗被批准在超过3L的条件下的肺癌中使用。培美曲塞和贝伐珠单抗没有在鳞状NSCLC中批准，而分子靶向治疗的适用性是有限的。在晚期肺癌中需求的未满足，与近期Oncothyreon和Merck KgaA的在3期试验中提高OS的失败、ArQule和Daiichi Sankyo的c-Met激酶抑制剂tivantinib无法达到生存终点、Eli Lilly的与Roche的组合在晚期研究中改善OS的失败、以及Amgen和Takeda Pharmaceutical用小分子VEGF-R拮抗剂莫特塞尼(motesanib)在晚期试验中达到临床终点的失败交织在一起。
进一步通过如下实施例阐述本发明，所述实施例不应被理解为进一步的限定。本申请中引用的所有参考文件的内容通过提述明确并入本文。
实施例1
抗PD-1人单克隆抗体之间对于结合到表达人PD-1的CHO细胞的交叉竞争
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被转染以表达人PD-1(CHO/PD-1细胞)，所述细胞与10μg/ml的抗PD-1人单克隆抗体5C4的Fab片段或人IgG1(hIgG1)同种型对照抗体在4℃温育30分钟，然后加入浓度为0.2μg/ml的抗PD-1人单克隆抗体2D3、7D3或4H1。D3、7D3或4H1对CHO/PD-1细胞的结合通过异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的山羊抗hIgG，Fc-γ特异性的抗体来检测。对于5C4和17D8的交叉竞争测定法，CHO/PD-1细胞与5C4的整体分子(whole molecule)进行温育，然后加入FITC标志的17D8。2D3、7D3、4H1或17D8对CHO/PD-1细胞的结合通过流式细胞分析用FACScalibur流式细胞仪进行测量(BectonDickinson,San Jose,CA)。
结果在图1中描述。数据显示，5C4Fab片段基本上阻碍了单克隆抗体5C4自身以及2D3、7D3(图1A)和4H1(图1B)的结合，而5C4整体单克隆抗体基本上阻碍了17D8(图1C)对CHO/PD-1细胞的结合，如通过染色的平均荧光强度(MFI)所测量的那样。
实施例2
抗PD-L1人单克隆抗体之间对于结合到表达人PD-L1的CHO细胞的交叉竞争
CHO细胞被转染以表达人PD-L1(CHO/PD-L1细胞)，所述细胞分别与10μg/ml的10种未缀合的人抗PD-L1单克隆抗体(5F8、7H1、10H10、1B12、3G10、10A5、11E6、12A4、12B7和13G4)的每一种或人IgG1(hIgG1)同种型对照抗体在4℃温育20分钟。将FITC缀合的10H10(A)、3G10(B)、10A5(C)、11E6(D)、12A4(E)或13G4(F)加入细胞至终浓度0.09μg/ml(B、D)、0.27μg/ml(A、C)、0.91μg/ml(F)、或2.73μg/ml(E)，不洗脱未结合、未缀合的抗体在4℃再20分钟。大量的各种FITC缀合的人单克隆抗体由于其按照标志(following labeling)在结合效力上的差异而使用，而这些FITC缀合的人单克隆抗体的最佳量预先通过结合到CHO/PD-L1细胞的剂量滴定分析来确定。FITC缀合的10H10、3G10、10A5、11E6、12A4或13G4对CHO/PD-L1细胞的结合通过流式细胞术来测量。
结果在图2中描述。标志的10H10的结合被10A5、11E6和13G4部分地阻碍，但只被其自身基本上阻碍(图2A)。相反地，10H10只基本上阻碍了其自身对CHO/PD-L1细胞的结合。抗PD-L1人单克隆抗体5F8、7H1、1B12、3G10、10A5、11E6、12A4、12B7和13G4各自基本上阻碍了被标志的单克隆抗体3G10(图2B)、10A5(图2C)、11E6(图2D)、12A4(图2E)和13G4(图2F)对CHO/PD-L1细胞的结合，如通过MFI所测量的那样，尽管单克隆抗体5F8和13G4通常对被标志的单克隆抗体结合的阻碍程度稍微较低。
实施例3
抗PD-L1人单克隆抗体之间对于结合到表达人PD-L1的卵巢癌细胞的交叉竞争
将抗PD-L1人单克隆抗体5F8、12B7、3G10、1B12、13G4、10H10、10A5和12A4，以及人IgG1(huIgG1)同型体对照抗体从10μg/ml连续稀释并与表达hPD-L1的ES-2卵巢癌细胞在4℃温育20分钟。不洗涤，将生物素酰化的12A4抗体加入至终浓度0.4μg/ml，4℃再20分钟。洗涤后，结合的生物素-12A4用荧光链霉亲和素-PE二级试剂检测，并通过流式细胞术测量。图3显示了结合的生物素-12A4的荧光针对未标志的hPD-L1人单克隆抗体的浓度作图。生物素-12A4对ES-2细胞的结合被12A4自身以及B12和12B7基本上阻碍，并且被单克隆抗体5F8、10A5、13G4和3G10中等至显著地阻碍，但不被单克隆抗体10H10阻碍。
实施例4
抗PD-1抗体的一期临床研究设计
进行了一项一期研究以评估抗PD-1在患有选出的进展实体瘤的患者中的安全性、抗肿瘤活性和药代动力学。人抗PD-1单克隆抗体BMS-936558(本文也称为nivolumab，而在美国专利No.8,008,449中称为5C4)作为静脉内输注在每8周的治疗周期的每2周施用。每个周期后重新评估肿瘤状态。患者持续治疗多达2年(12个周期)，直到他们经历完全缓解、不可接受的毒性、疾病进展、或撤回同意书。在另外的临床稳定的患者中，研究治疗持续超过明显的初始疾病进展，直到注意到进一步进展，如提出的免疫响应标准所推荐的那样(Wolchok等,2009)。疾病稳定(SD)的患者或正处于客观响应(OR:完全响应[CR]或部分响应[PR])的患者在治疗结束时进行1年的随访，并另外提供1年的再治疗，倘若发生进展的话。
剂量递增
患有晚期黑色素瘤(MEL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、和结肠直肠癌(CRC)的患者符合招入条件。以1.0、3.0和10.0mg/kg序贯地在每个剂量水平招入3-6例患者的群体(Cohorts)。当最少3例患者在给定的剂量水平完成安全性评估期(56天)，且低于三分之一的患者中出现剂量限制性毒性，则继续剂量递增。患者内剂量递增是不允许的。
群体扩大
未达到最大耐受剂量。最初，以0mg/kg分别招入了5个MEL、NSCLC、RCC、CRPC和CRC的约16例患者的扩大群体。基于初始的活性信号，并且为方案修改而遵循6.5个月的间隙，分别招入了MEL(按1.0和3.0mg/kg，然后群体随机化至0.1、0.3、或1.0mg/kg)、NSCLC(鳞状或非鳞状组织学群体随机化至1、3、或10mg/kg)、和RCC(按1.0mg/kg)的约16例患者的扩大群体。对于患有进展性疾病的MEL患者，在接受0.1或0.3mg/kg后允许患者内剂量递增至1mg/kg。
患者
合格的患者记录有晚期实体瘤；年龄>18岁；预期寿命>12周；东部肿瘤协作组织(Eastern Cooperative Oncology Group)体能状况为≤2；通过实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)，修订v1.0，可测的疾病(参见Topalian等,2012b)；足够的血液、肝、和肾功能；以及接受过1-5次既往的全身性治疗疗法。招入了接受过稳定的脑转移治疗的患者。排除标准包括慢性自身免疫疾病史、用T细胞调节性抗体(例如抗CTLA-4、抗PD-L1)的既往治疗、需要免疫抑制性药物治疗的病况、以及慢性感染(例如HIV、乙型或丙型肝炎)。
总数为296例的晚期实体瘤患者用BMS-936558治疗40个月直到2012年2月，所述实体瘤包括MEL(n＝104)、NSCLC(n＝122)、RCC(n＝34)、CRPC(n＝17)、和CRC(n＝19)。到2013年3月，有306例患者从2008年10月经2012年1月接受了BMS-936558的治疗，所述患者包括非小细胞肺癌(n＝129)、黑色素瘤(n＝107)、RCC(n＝34)、CRPC(n＝17)、和CRC(n＝19)的患者，所有的观察期均为至少1年。2例患者没有接受全周期的治疗，并且认为其是不可评估响应的。中位年龄为63岁(范围为29-85)。98％的患者中ECOG体能评分为0或1。大多数患者有过重度既往治疗，其47％之前接受过至少3种疗法。值得注意的既往治疗包括MEL患者中的免疫治疗(64％)和B-RAF抑制剂(8％)；NSCLC患者中的基于铂的化疗(94％)和酪氨酸激酶抑制剂(TKIs,34％)；以及RCC患者中的肾切除术(94％)、免疫治疗(59％)、以及抗血管生成治疗(74％)。治疗的总人群(N＝306)的基线特征与有效力人群(可评估响应的患者,N＝270)的基线特征相似。患者的既往治疗的详细信息在Topalian等(2012b)中提供。
统计学分析
所有治疗的患者(N＝306)的基线特征和不良事件以及270例患有肺癌、黑色素瘤和肾癌的患者的效力结果报道至2013年3月为止。药代动力学和分子标记物的人群由有可用数据的治疗的患者组成，所述可用数据是到2012年2月初步分析日为止的数据。由可评估响应的患者组成的有效力人群在分析前至少8周时开始治疗。肿瘤的测量值在每个治疗周期(4个剂量)后由研究者收集。基于肿瘤测量值的个体最佳客观响应由主办者按照修订的RECIST v1.0来评估。客观响应率是通过至少一种序贯肿瘤评估来证实的。客观响应率和疾病稳定率是以用Clopper-Pearson方法的置信区间来估算的。到事件的时间(Time-to-event)的终点包括PFS、OS、生存率和响应期用Kaplan-Meier方法来估算。不良事件用ICH国际医学用语词典(Medical Dictionary for RegulatoryActivities,MedDRA)第15.1版来编译。选择的具有潜在免疫学病因的不良事件，也称为“免疫相关的不良事件”或“特别关注的不良事件(AEOSIs)”，其定义为需要更频繁的监测和/或特别干预的不良事件，所述不良事件用预先定义的MeDRA术语列表来鉴定。个体最佳OR来源于研究者按照修订的RECIST v1.0报道的数据。通过至少一种序贯肿瘤评估来确认OR，并计算OR率(ORR＝{[CR+PR]÷n}×100)。
实施例5
对用抗PD-1抗体的患者的安全性评估
在所有治疗的患者中于基线处以及最近一次药物施用后多至100天的定期进行安全性评估，包括临床检查和实验室评估。不良事件的严重性基于NCI不良事件术语标准(NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events,NCI CTCAE)v3.0来分级。在基线处和每次治疗周期后进行计算机断层扫描(CT)或核磁共振成像用于肿瘤测定。
在这项研究中的所有测试的BMS-936558的剂量中没有定义MTD，最高的计划剂量高达10mg/kg。在87％的患者中达到了90％或更高的相对BMS-936558剂量强度(详情参见Topalian等,2012b；Topalian等,2013)。不良事件用ICH国际医学用语词典(Medical Dictionary for Regulatory Activities,MedDRA)第14.1版来编译。AEOSIs用预先定义的MeDRA术语列表来鉴定。296例中的15例(5％)患者由于BMS-936558相关的不良事件而没有继续治疗。截至2012年2月的初步分析日，62例(21％)患者死亡，而到2013年3月，195例(64％)患者死亡，最常见的死因是疾病进展(Topalian等,2012b；Topalian等,2013)。
不管因果关系的话，最常见的不良事件包括疲劳、食欲减退、腹泻、恶心、呼吸困难、便秘、呕吐、皮疹、发热和瘙痒(Topalian等,2012b；Topalian等,2013)。常见的BMS-936558相关不良事件包括疲劳、皮疹、腹泻、食欲减退、和恶心。大多数的事件是低等级的，在296例患者中的41例(14％)中观察到3-4级药物相关的不良事件。在306例患者中的230例(75％)中观察到治疗相关的不良事件(任何等级)，最常见的是疲劳、皮疹、腹泻和瘙痒(Topalian等,2013)。BMS-936558相关的不良事件谱、频率、和严重性在所有测试的剂量水平中普遍相似，并与治疗持续时间没有明确联系。306例患者中的52例(17％)经历了3-4级治疗相关的不良事件，其中疲劳(2％)、肺炎、淋巴细胞减少、腹泻、腹部疼痛、以及低磷酸盐血症(各1％)是最常见的。306例患者中的42例(14％)中发生了治疗相关的严重不良事件(Topalian等,2013)。
药物相关的AEOSIs具有潜在的免疫相关病因，所述药物相关的AEOSIs通过器官受侵(organ involvement)来分类以提供对频率更精确的估计，并且其中包括肺炎、白癜风、结肠炎、肝炎、下垂体炎、以及甲状腺炎等。任何等级的治疗相关的选择的不良事件在306例患者中的140例(46％)中观察到，最常见的是皮疹(15％)、腹泻(13％)、和瘙痒(11％)(表2)。3-4剂级治疗相关的选择的事件见于19例(6％)患者中。
230例有治疗相关的不良事件的患者中有52例(23％)需要全身性糖皮质激素和/或其他免疫抑制剂处理。肝或胃肠的AEOSIs用治疗中断来处理，以及如果必要的话以施用皮质类固醇来处理。在至今为止治疗的患者中，这些不良事件在所有案例中都是可逆转的。内分泌的AEOSIs用替代疗法处理。306例患者中的32例(11％)由于治疗相关的不良事件而没有继续治疗。按照主治医师的决定，患者成功地重启BMS-936558治疗。21例(40％)能够在毒性解决后重启nivolumab治疗。
在306例患者中的12例(4％)中发生了药物相关的肺炎(任何等级)(Topalian等,2013)。临床表现从无症状患者的放射摄影畸形到进展的、弥散的与症状相关的肺浸润之间波动(咳嗽、发烧、呼吸困难)。4例患者患上3-4级肺炎，其中3例致死(2例NSCLC患者，1例CRC)。肺炎的发生与肿瘤类型、剂量水平或接受的剂量数之间没有发现明确联系。在12例患者中的9例中，肺炎可以用中止治疗和/或免疫抑制(糖皮质激素、英夫利昔单抗(infliximab)、麦考酚酯)来逆转。在2011年11月最近的肺炎相关死亡之后，79例患者继续接受nivolumab(中位29周，范围为2-69周)，没有进一步的来自于此或其他治疗相关原因的死亡。
实施例6
对抗PD-1抗体的药代动力学/药效学分析
为了进行药代动力学(PK)的分析，收集了连续的血液样品，并用ELISA量化了BMS-936558血清浓度。为了进行药效学(PD)分析，在基线处和1个周期后从患者分离了外周血单核细胞，以通过BMS-936558在循环的CD3+T细胞上经流式细胞术评估PD-1受体占有率(receptor occupancy,RO)(Brahmer等,2010)。
在输注开始后1-4小时的中位的T最大处观察到BMS-936558的最大浓度。BMS-936558的PK与C最大和AUC(0-14d)中的剂量比例增长成线性关系，其剂量范围为0.1-10mg/kg(n＝35)。BMS-936558的PD通过循环的T细胞上的PD-1RO来测定。来自65例MEL患者的PBMC证明PD-1分子通过BMS-936558在循环的CD3+T细胞上的中位占有率范围为64％-70％，所述MEL患者用每两周一次、0.1-10mg/kg的BMS-936558的1个周期来治疗(详情参见Topalian等,2012b)。
实施例7
抗PD-1抗体展现出的抗肿瘤效力
数据分析截止于2012年2月
在所有测试的BMS-936558剂量处观察了临床抗肿瘤活性。在大部分的NSCLC、MEL和RCC患者中观察到了ORs(证实的CR或PR)(表1和2；图4)。肿瘤衰退遵循常规的以及“免疫相关的”响应模式，如在新病损中存在下在肿瘤负荷上持久的减少。个体最佳总体响应来源于研究者根据修订的RECIST v1.0报道的数据。通过至少一种序贯肿瘤评估来证实OR。在数据分析时，2例用10mg/kg治疗的NSCLC患者有未证实的响应，而另外8例患者(患有MEL、NSCLC或RCC)在新病损存在下其基线靶病损有持久的减少(即“免疫相关的”响应模式)。这些患者都不是出于计算OR率的目的而被归类为响应者的。在不响应于既往接受过的治疗的患者中观察到了抗肿瘤响应和/或延长的疾病稳定(参见Topalian等,2012b的补充附件4中的，具有OR和SD的患者的无进展间隔期的总结)。
在NSCLC患者中，在1、3或10mg/kg的BMS-936558剂量处观察到了14例OR，响应率分别为6％、32％和18％。在NSCLC组织形态中观察到了OR：18例鳞状的有6例响应者(33％)、56例非鳞状的有7例响应者(13％)、而2例未知的有1例响应者。具有OR的所有14例患者在数据分析前≥24周时开始治疗，而他们中有8例的响应持续时间≥24周(表1)。在5例(7％)NSCLC患者中观察到疾病稳定(SD)持续≥24周，其全部具有非鳞状的组织形态。在MEL患者中，在范围为0.1-10mg/kg的剂量处观察到了26例OR，其每个剂量水平的响应率范围为19％-41％。在3mg/kg的剂量水平处，17例患者中有7例(41％)出现OR。在26例达到OR的MEL患者中，17例在数据分析前≥1年开始治疗，而他们中有13例患者的OR持续时间≥1年。剩下的8例有OR的患者接受研究<1年，且6例具有范围为1.9-5.6个月的响应。在6例(6％)患者中观察到SD持续≥24周。在RCC患者中，用1mg/kg的BMS-936558剂量治疗的17例患者中有4例(24％)出现OR，而用10mg/kg治疗的16例患者中有5例(31％)出现OR。在8例有OR且在数据分析前≥1年开始治疗的RCC患者中，5例(63％)的OR持续时间≥1年。在另外9例(27％)患者中观察到SD持续≥24周。
表1.BMS-936558在有效力人群*中的临床活性，评估至2012年2月
*有效力人群由2012年2月的数据分析前至少8个月开始治疗的、且疾病在基线处可测的、且具有以下条件之一的可评估响应的患者组成：至少一次治疗中的扫描(on-treatmentscan)或疾病进展或死亡的临床证据。
CR表示完全响应，MEL：黑色素瘤，NSCLC：非小细胞肺癌，ORR：客观响应率，PFSR：无进展生存率，PR：部分响应，RCC：肾细胞癌，SD：疾病稳定，n：患者数。
客观响应率({[CR+PR]÷n}×100)基于证实的响应来计算，置信区间用Clopper-Pearson方法来计算。个体患者响应按照有修订的RECIST v1.0来判定(参见Topalian等,2012b)。
§无进展生存率是指没有进展并在24周时生存的患者的比例，其通过Kaplan-Meier方法来计算，置信区间用Greenwood方法。
一例CR.
**1例以3mg/kg的剂量水平治疗的NSCLC患者初始评估具有进展性疾病，随后出现PR，并被归类为响应者。
表2.对BMS-936558*客观响应的持续时间，评估至2012年2月
*MEL指黑色素瘤，NA：不适用的，NSCLC：非小细胞肺癌，RCC：肾细胞癌。
自第一次响应至有记录的进展、死亡时的时间，或对于删失(censored)的数据则是至最后一次肿瘤评估时。
1例患者治疗超过初始进展性疾病的评估并随后出现PR；出于通过RECIST v1.0计算响应率的目的，该患者被归类为响应者，但在响应持续时间的计算上并不合格。
截至2013年3月的分析的数据
在NSCLC(17％)、MEL(31％)和RCC(29％)患者中观察到了客观响应，但在CRC或CRPC中没有。在测试的所有nivolumab剂量中观察到响应；在接受1mg/kg对比3或10mg/kg的NSCLC患者中的响应率表现出下降(分别为3％对比24％和20％)(表3和4)。270例具有响应的组织形态的患者中有13例(4.8％)具有不符合RECIST标准的非常规的响应模式(即在新病损的存在下靶病损持久的减少，或初始进展后的衰退)(Wolchok等,2009)。其他患者显示出24周或更长的SD(10％NSCLC、7％MEL、27％RCC)。在各响应人群中注意到如下的持续生存，所述持续生存是通过1年或2年界标(landmark)OS率来反映的：NSCLC，42％和14％；MEL，62％和43％；以及RCC，70％和50％(表3)。据观察，肺癌中位OS为9.6个月(鳞状和非鳞状NSCLC组织形态分别为9.2和10.1个月)、MEL为16.8个月、而RCC为超过22个月；NSCLC的中位PFS为2.3个月，MEL为3.7个月，而RCC为7.3个月；并且中位响应持续时间分别为74、104和56周(表4)。在16例因非疾病进展原因而中断治疗、且被随访至少24周的响应者中，有13例(81％)在分析时保持有响应(图8)。
实施例8
膜PD-L1表达与抗PD-L1响应之间的相关性
PD-L1的IHC染色用鼠抗人PD-L1单克隆抗体5H1(Dong等,2002)在福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)治疗前肿瘤样本上以标准IHC实验方案进行(Taube等,2012；补充材料)。简言之，将贴到载玻片上的5μm的FFPE切片置于二甲苯中脱蜡，并用Tris-EDTA缓冲液、pH 9.0、120℃在Decloaking Chamber(Biocare Medical)中修复10分钟。封闭了内源性的过氧化物酶、生物素和蛋白(CAS系统K1500,Dako；亲和素/生物素封闭试剂盒,SP-2001,VectorLaboratories；Serotec Block ACE)，并以2μg/ml的浓度加入一级5H1抗体并允许其在4℃温育20h。将二级抗体(生物素酰化的抗小鼠IgG1,553441BD)以1μg/ml的浓度在室温(RT)温育30min。根据制造商的实验方案(CAS系统K1500,Dako)，信号随后被放大。切片用苏木精复染，在酒精中脱水并在二甲苯中透明，并将盖玻片贴上。
表现出细胞PD-L1表面染色的肿瘤细胞的百分比由两位独立的病理学家来记分，所述病理学家不知道治疗结局。PD-L1阳性定义为每个样本5％的表达阈值(Taube等,2012；Thompson等,2006)，以及在多重样本的情况中定义，如果任何样本满足此标准的话。使用Fisher确切概率法(Fisher's exact test)来评估PD-L1表达与OR之间的相关性，然而发现，这项试验是部分基于来自人群非随机子集的任选的活组织检查的，并且对统计学假设的检验是没有预先指定的(pre-specified).
对来自42例(18例MEL、10例NSCLC、7例CRC、5例RCC、和2例CRPC)患者的61个治疗前的肿瘤样本分析了肿瘤细胞表面PD-L1表达(图8)。来自42例患者中有25例的活组织检查样本对于IHC是PD-L1表达阳性的。在因果关系分析中使用Fisher确切概率法来评估PD-L1表达与OR之间的相关性。在42例表面PD-L1+的患者中，9例(36％)达到OR，然而在17例患有PD-L1–肿瘤的患者中，没有人达到OR(图8A)。因而，在一个患者子集中，在治疗前的活检中肿瘤细胞的细胞表面PD-L1表达与用BMS-936558治疗的患者中增长的OR率相关，而具有记录的PD-L1阴性肿瘤的患者没有经历OR。这些数据表明肿瘤PD-L1表达是使得抗PD-1免疫治疗的患者选择能够进行的分子标记物。
实施例9
在FFPE组织中检测膜hPD-L1抗原的兔单克隆抗体的分离
针对人PD-L1多肽的兔抗体由Epitomics Inc.(Burlingame,CA)通过用重组人PD-L1融合蛋白来免疫兔而制备。抗血清滴定度用hPD-L1抗原的标准直接ELISA、以及细胞ELISA来评估，所述细胞ELISA是用转染的过表达hPD-L1的细胞来进行的。这些抗体也以其结合到PD-L1的能力进行筛选，所述能力是通过FFPE组织切片的IHC来测定的。选择具有最高抗体滴定度的兔进行脾脏切除。从脾脏分离的淋巴细胞在40x 96孔板中被融合到黑色素瘤细胞，并通过针对免疫的PD-L1抗原的ELISA和通过针对过表达hPD-L1的细胞的细胞ELISA来筛选。将阳性克隆扩大进入24孔板，并通过ELISA和细胞ELISA进行验证性筛选。对筛选的抗原特异的克隆的上清(sups)通过IHC重筛。
通过用与上述兔单克隆抗体相似的实验方案免疫小鼠，也提供了一套小鼠抗hPD-L1单克隆抗体。
在总共185个来自兔和小鼠筛选免疫的多克隆中，只有10个兔多克隆抗体特异性地检测到膜形式的hPD-L1。没有发现特异性地检测到细胞表面hPD-L1的纯化的小鼠亚克隆。来自前五位兔多克隆(指Nos.13,20,28,29和49，各自包含12个亚克隆)的60个亚克隆最初通过在FFPE低强度组织微阵列(TMAs)上的IHC来筛选。然后是证实以及在范围缩小的25个亚克隆中的特异性验证。用兔IgG作为阴性同种型对照，并用单克隆抗体5H1(Dong等,2002)作为阳性对照。进一步通过抗原预吸收测定法来验证特异性。经过两轮IHC后，以下15种纯化的亚克隆被选为在特异性和染色强度方面最有前途的抗体：13-1,13-3,13-7,13-8；20-5,20-7,20-12,20-6；28-1,28-8,28-12；29-8；49-5,49-7和49-9。这些选出的抗体的免疫活性数据总结在表5中。
表5.兔抗hPD-L1单克隆抗体的免疫活性
*PD-L1稳定转染的CHO细胞对比CHO-S对照；
PD-L1阳性组织包括胎盘和一个非小细胞肺癌；检测直到“非常高”的表达表明检测PD-L1的灵敏度更佳。
进行了其他测定以进一步表征纯化的抗体克隆，包括通过表明等离子体共振来确定抗体中的结合亲和性和交叉竞争(识别重叠的对比不同的表位区)。所有抗体都显示出高结合亲和性(KD<10-9M)。这15种纯化的克隆也通过在FFPE低强度TMA上的IHC或定期切片来针对多种已知对PD-L1的细胞表面表达阳性或阴性的细胞和组织类型进行重筛。兔IgG被用作同种型对照，而单克隆抗体5H1被用作阳性对照。在高浓度(10μg/ml)，克隆28-x和49-x在组织中表现出低或中等水平的背景染色，而克隆13-x未显示出背景染色，这表明13-x克隆具有更广的动态范围。20-x克隆表现出不同程度的背景染色，其主要是细胞质的弥散的。特异性检测膜PD-L1最强劲的克隆，兔克隆28-8(KD＝100pM,由SPR确定)，被选为用于随后的IHC测定法的主要抗体。单克隆抗体28-1、28-12、20-12和29-8分别具有130pM、94pM、160pM和1200pM的KD值。单克隆抗体28-8的重链可变区(VH)和轻链(κ)可变区(Vκ)的序列分别在SEQ ID NOs.35和36中展示。基于SPR分析显示，28-8抗体识别与小鼠单克隆抗体5H1不同的表位。在对FFPE组织中的膜PD-L1的强劲检测方面，克隆28-1、28-12、29-8和20-12是次好的抗体。虽然单克隆抗体13-1在检测膜PD-L1方面具有最好的特异性，但其最大的检测水平低于其他主要抗体。还用+/-抗原竞争进行了Western印迹以验证为PD-L1选出的最佳抗体的特异性。
在来自不同类型肿瘤的包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞的FFPE测试组织样品中，单克隆抗体5H1和28-8对膜PD-L1的结合进行了对比。膜PD-L1表达用组织评分方法由2位独立病理学家评估。4例NSCLC、2例MEL以及2例RCC肿瘤用2mg/ml的28-8和5mg/ml的5H1来染色。数据在表6中列出，并在图9中图示。兔单克隆抗体28-8显示出更好地检测10个样品中的7个，所述样品施用2.5分之一的抗体(2.5-fold less Ab)，而仅有1个样品是5H1组织评分高于单克隆抗体28-8的。
表6.通过组织评分分析对单克隆抗体28-8和5H1的比较
组织 样品I.D. 平均组织评分(5H1) 平均组织评分(28-8)
NSCLC 1080754B 245 261
NSCLC 1080766B 103 130
NSCLC 1080790 40 37
NSCLC 1080993B 12 16
Mel T030668 98 113
Mel T980744 98 123
Mel 1168657B 0 0
Mel T980747 1 9
RCC 1164619B 4 4
RCC 1167809B 108 125
Taube等(2012)通过在培养的细胞流式细胞术证明单克隆抗体5H1结合到细胞表面，并且用PD-L1融合蛋白竞争性阻碍5H1单克隆抗体对组织切片的结合来证实了结合对PD-L1的结合特异性。这些作者还比较了5H1与兔抗多克隆抗hPD-L1抗体—4059，之前曾由Gadiot等(2011)描述，作者还发现尽管5H1在FFPE样品上显示了细胞表面染色模式，pAb 4059显示出弥散的细胞质染色。进一步地，当5H1与pAb 4059通过Western印迹分析来比较时，抗体4059除了结合到50kDa蛋白之外，还结合到黑色素瘤细胞裂解产物的多种蛋白，所述50kDa蛋白与预期的糖基化PD-L1的质量一致；相比之下5H1则特异性地检测到糖基化PD-L1的50kDa条带(Taube等,2012)。与Taube等(2012)和本申请公开的结果(总结在表7中)相反，Gadiot等(2011)报道单克隆抗体5H1在FFPE组织样品中产生高水平的背景染色，而他们发现pAb 4059在FFPE组织样品中产生令人满意的特异性PD-L1染色。Gadiot等(2011)测试的13种其他抗体或是不染色FFPE组织而出现高背景染色，或是不被PD-L1融合蛋白竞争阻碍，这凸显了获取在FFPE组织样品中特异性地结合到PD-L1的抗PD-L1抗体的困难。
在本研究中，用自动化IHC测定法(参见实施例10)来评估一些可商购的抗PD-L1抗体和5H1与FFPE组织样品的结合(Dong等,2002)，所述样品包含多种表达PD-L1的细胞。表7中总结的结果显示，测试的可商购的抗体在已知表达PD-L1的人组织中特异性地识别膜PD-L1表达，或明确区分表达PD-L1的CHO细胞对比不表达PD-L1的未转染的亲代CHO细胞。多克隆抗体(pAb)4059无法特异性识别膜PD-L1，这与Taube等(2012)的发现一致。在这项测定法中28-8的结合与5H1的结合相似，尽管组织评分分析表明28-8表现优于5H1。
表7.mAbs对含有表达PD-L1的细胞的FFPE样品的结合
*PD-L1稳定转染的CHO细胞对比亲本CHO-S阴性对照；
PD-L1阳性组织包括扁桃体和/或胸腺；
mAb：小鼠单克隆抗体；pAb：兔多克隆抗体。
实施例10
用于测定PD-L1表达的自动化IHC实验方案的开发
开发了自动化IHC实验方案以测定PD-L1在FFPE样本中的表达。将组织切片(4μm)贴在载玻片上，于自动染色机(Leica)中，通过在二甲苯中浸透两次5分钟而脱蜡，并通过在100％酒精中浸透两次每次2分钟、95％(v/v)酒精两次，70％(v/v)酒精一次，以及去离子水(dH2O)中一次而复水。用修复仪(Biocare Medical Decloaking Chamber Plus)和Dako pH 6缓冲液、加热至110℃(P1)10分钟，然后移至下一步骤(于98℃处P2FAN ON；于90℃处FAN OFF)进行抗原修复。室温(RT)冷却载玻片15min并用水漂洗1min。
将试剂装入自动染色机(BioGenex i6000)，然后用Pap笔限定组织区。用自动染色机以研究模式运行IHC测定法，所述IHC测定法包括如下步骤：用Peroxidase Block(Leica)中和内源性过氧化物酶10min，然后用IHC洗涤缓冲液(Dako)漂洗3次；向载玻片敷用Protein Block(Leica)，并室温温育10min，然后用洗涤缓冲液洗涤3次；向载玻片敷用一级抗体(2μg/ml)并在室温温育1h，然后用洗涤缓冲液洗涤6次；向载玻片加入Post Primary Block(NovoLinkKit)并温育30min，然后用洗涤缓冲液洗涤6次；向载玻片加入NovoLinkPolymer(NovoLink Kit)并温育30min，然后用洗涤缓冲液洗涤6次；加入DAB色原体基质(NovoLink Kit)并显色3min，然后用dH2O在室温漂洗5次；用苏木精(NovoLink Kit)在室温复染1分钟，然后在室温用5次dH2O洗涤3次。选自兔抗PD-L1抗体的一级抗体在表4中显示，单克隆抗体28-8是优选的抗体。使用兔IgG(Dako)作为阴性对照。用Leica自动染色机通过在70％酒精中洗涤一次2分钟、95％酒精中两次2分钟、然后70％酒精中三次2分钟，对组织切片脱水，然后通过在二甲苯中洗涤3次5分钟来透明。切片用封片剂(permount)永久贴在载玻片上，用盖玻片覆盖，并转移至化学通风橱干燥。
实施例11
抗PD-L1抗体的一期临床研究设计
研究设计
进行了一期临床研究以评估BMS-936559(本文及美国专利No.7,943,743中也称为12A4)在有选出的晚期的实体瘤患者中的安全性和耐受性。次要目标包括药代动力学评价及BMS-936559和抗肿瘤活性的初步评估。在探索目标下，包括了药效学的测量。患者接受以6周为周期的BMS-936559治疗，施用是在每个周期的第1、15、和29天、每2周进行60分钟的静脉内输注。患者持续治疗多达16个周期，除非他们经历不可接受的毒性、疾病进展或撤回同意书。在一些临床稳定的患者中，允许治疗超过首次疾病进展，直到证实进一步的疾病进展。
剂量递增
患有晚期NSCLC、MEL、CRC、RCC、卵巢(OV)、胃(GC)、乳腺(BC)、和胰腺(PC)癌症的患者符合招入条件。用加速滴定设计，评估在0.3、1、3和10mg/kg的剂量的安全性。一例患者被招入每个成功的群体直到在第1周期期间出现≥2级药物相关的AE。随后招入另外2例在那个剂量水平的患者，而研究转化为标准的3+3设计。患者内剂量递增或递减是不允许的。最大耐受剂量(MTD)定义为当少于三分之一的患者出现剂量限制性毒性时的最高剂量。
群体扩大
最初，以10mg/kg招入了5个扩大群体(n＝16/群体)，用于NSCLC、MEL、RCC、OV、和CRC患者。基于初始的活性信号，为MEL(以1.0和3.0mg/kg)、NSCLC(随机化至1、3或10mg/kg的鳞状或非鳞状组织形态群体)、以及为PC、BC和GC以10mg/kg招入了额外的扩大群体(多至n＝16/群体)。
患者
需要患者具有有记录的晚期NSCLC、MEL、RCC、OV、CRC、PC、GC、或BC，并至少有过一次既往的适合肿瘤的治疗失败，所述治疗用于晚期/转移性疾病(除了可以是未接受过治疗的PC或GC患者)。另一个入选标准包括年龄≥18岁、预期寿命≥12周、东部肿瘤协作组织体能状况≤2、通过RECIST v1.0定义可测的疾病、以及足够的血液、肝、和肾功能。主要的排除标准包括自身免疫疾病史或其他需要类固醇或免疫抑制性药物治疗的疾病、用T细胞调节性抗体(包括抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4)的既往治疗、HIV史、或活动性乙型或丙型肝炎。
在这项进行中的研究里，207例NSCLC(n＝75)、MEL(n＝55)、CRC(n＝18)、RCC(n＝17)、OV(n＝17)、PC(n＝14)、GC(n＝7)、或BC(n＝4)患者用BMS-936559治疗持续34个月的时期，并被包括在安全数据中。在160例可评估响应的患者中表征了效力。总的和可评估响应的患者人群中的基线人群背景特征非常相似(Brahmer等,2012)。在治疗的患者中，有86％既往接受过化疗，而28％接受过免疫或生物学治疗。既往治疗按照肿瘤类型包括MEL患者中的免疫治疗(56％)和B-RAF抑制剂(9％)；NSCLC患者中的基于铂的化疗(95％)和酪氨酸激酶抑制剂(TKIs,34％)；以及RCC患者中的肾切除术(94％)、抗血管生成治疗(82％)、以及免疫治疗(41％)(更多患者既往治疗详情参见Brahmer等,2012)。
统计学分析
截至分析日，所有207例开始治疗的患者被用于基线特征和不良事件的总结。有效力人群由160例可评估响应的、在分析日前至少7个月开始治疗的患者组成。不良事件用MedDRA v14.1编译。个体最佳总体响应来源于放射射线扫描测量、根据修订的RECIST v1.0。OR通过至少一种序贯治疗评估来确认。关于统计学方法的其他细节在Brahmer等(2012)中提供。
实施例12
用抗PD-L1抗体治疗的患者的安全性评估
在所有治疗的患者中于基线处以及定期(第1周期中每周以及之后每两周)进行安全性评估(临床检查和实验室评估)。不良事件是基于NCI CTCAE,v3.0来评级的。通过计算机断层(CT)扫描或核磁共振成像的疾病评估在基线处和每次治疗周期之前进行。
在多至10mg/kg BMS-936559的最高测试剂量处未达到MTD。中位治疗持续时间为12周(范围为2.0-111.1周)。在86％的患者中达到了≥90％的相对剂量强度。207例患者中有12例(6％)由于BMS-936559相关的不良事件而未继续治疗(详情参见Brahmer等,2012)。
不管因果关系的话，207例患者中有188例报道了不良事件(任何等级)。在207例患者中的126例(61％)中发现了研究者评估的BMS-936559相关的不良事件。常见的药物相关不良事件包括疲劳、输液反应、腹泻、关节痛、皮疹、恶心、瘙痒和头痛。大多数的事件是低等级的，3-4级的BMS-936559相关的不良事件在207例患者中观察到19例(9％)(Brahmer等,2012)。BMS-936559相关的不良事件谱、频率和严重性在所有剂量水平都相似，除了输液反应以外。在207例患者中的81例(36％)中观察到了具有潜在免疫相关病因的药物相关的AEOSI，包括皮疹、甲状腺功能减退、肝炎、以及各有一个单案例的结节病、眼内炎、糖尿病、以及重症肌无力(Brahmer等,2012)。这些不良事件主要是1-2级，并且通常是可以用治疗中断或中止逆转的。显著地，用皮质类固醇来治疗9例患者以管控不良事件。所有患者中的不良事件都改善或解决了。此外，尽管用了皮质类固醇治疗，但这9例患者有4例维持了疾病控制。内分泌的不良事件用替代疗法来管控，并且患者按照主治医师决定来重启BMS-936559的治疗。207例患者中21例(10％)观察到输液反应，主要是在10mg/kg。他们是1-2级的，除了10mg/kg处的1例3级事件。输液反应通常是能用抗组胺剂和退热剂来快速逆转的，在一些情况下是用皮质类固醇。用在研究期间实施了抗组胺剂和退热剂的预防疗法。1-2级输液反应的患者用预防性的抗组胺剂和退热剂、并以减少的输液率能够继续BMS-936559的治疗。207例患者中有11例(5％)发生了BMS-936559相关的严重不良事件。截至分析日，45例患者(22％)已死亡(Brahmer等,2012)；未观察到药物相关的死亡。
实施例13
抗PD-L1抗体的药代动力学/药效学分析
收集了连续的血样且通过ELISA对BMS-936559的浓度定量，用于PK分析。在基线处和一次治疗周期后从患者分离外周血单核细胞，从而用BMS-936559通过流式细胞术在循环的CD3阳性T细胞上测定PD-L1RO(Brahmer等,2010)。
BMS-936559的血清浓度以剂量依赖性方式增长，从1-10mg/kg(n＝131)。1、3和10mg/kg剂量水平的曲线下的几何平均面积(0-14天)分别为2210、7750和36620μg/mL·hr(变异系数[CV]34-59％)；在这些剂量水平的几何平均峰值浓度分别为27、83和272μg/mL(CV 30-34％)，在第一剂量后。从人群药代动力学数据估算出BMS-936559的半衰期为约15天。在治疗第1周期结束时，在29例MEL患者中评估了CD3阳性的外周血淋巴细胞的PD-L1RO，所述评估的BMS-936559浓度从1-10mg/kg。所有组的中位RO均超过65％(Brahmer等,2012)。
实施例14
抗PD-L1抗体展现出的抗肿瘤效力
到2012年2月为止，207例治疗的患者中有160例是可评估响应的，并且包括患有NSCLC、MEL、CRC、RCC、OV、和PC的那些，但不包括GC或BC患者。在所有≥1mg/kg的剂量处观察了临床活性(Brahmer等,2012)。在患有MEL、NSCLC、RCC和OV的患者中观察到了OR(证实的完全[CR]或部分[PR]响应)(表8)，如代表性的蜘蛛图和CT扫描所示(图10-13)，并且许多OR还是持久的(表9)。另有4例患者在新病损存在下具有在靶病损上的持久减少，与“免疫相关的”响应模式一致；然而，出于计算响应率的目的，他们没有被归类为响应者。在接受过各种既往治疗的患者中观察到了抗肿瘤响应和/或延长的疾病稳定(SD)。甚至在有广泛转移性疾病负荷的患者中也观察到了OR。
在MEL患者中，在1、3和10mg/kg剂量水平共有9例OR，其响应率分别为6％、29％和19％。3例MEL患者达到CR。所有9例经历OR的MEL患者都是在数据分析前≥1年开始治疗的；他们中的5例具有≥1年的响应持续时间。另有14例MEL患者(27％)具有持续≥24周的SD。在NSCLC患者中，在3和10mg/kg剂量水平中有5例OR，其响应率分别为8％和16％。非鳞状(n＝4)或鳞状组织学(n＝1)的患者中有OR。所有5例NSCLC响应者的是在数据分析前≥24周开始治疗；他们中有3例响应持续≥24周。另有6例NSCLC患者SD持续≥24周。
17例OV患者中有1例PR(响应率6％)，并且3例患者(18％)SD持续≥24周，所有患者均在10mg/kg剂量。在RCC患者中，17例以10mg/kg治疗的患者有2例OR，2例的响应率分别持续了4和18个月。另有7例RCC患者SD持续≥24周。
表8.160例可分析响应的患者中的BMS-936559临床活性*
CI指置信区间，MEL：黑色素瘤，RCC：肾细胞瘤，NSCLC：非小细胞肺癌，OV：卵巢癌，RCC肾细胞癌，N/A：不适用的，ORR：客观响应率(完全响应+部分响应)，SD：疾病稳定，以及PFSR：无进展生存率。
*有效力人群由数据分析前至少7个月开始治疗的、并且疾病在基线肿瘤评估处可测的、并具有以下条件之一的可评估响应的患者组成：至少一次研究中的肿瘤评估、疾病进展或死亡。
包括2例CR。
包括1例CR。
§客观响应率({[CR+PR]÷n}×100)是仅基于证实的响应的，置信区间用Clopper-Pearson方法计算。
**无进展生存率是未进展且在24周时活着的患者的比例，通过Kaplan-Meier方法计算，用Greenwood计算置信区间。
个体患者响应按照修订的RECIST v1.0来判定(其他信息参见Brahmer et al.(2012)N Engl JMed中的研究方案(已提交))。
表9.BMS-936559客观响应持续时间*
*MEL指黑色素瘤，RCC：肾细胞瘤，NSCLC：非小细胞肺癌，OV：卵巢癌。
自第一次响应至有记录的进展、死亡时的时间，或对于删失的数据(用“+”表示)则是至最后一次肿瘤评估时。
实施例15
晚期MEL研究设计中抗PD-1加抗CTLA-4上的一期临床研究设计
在这项一期研究中，成功的患者群体用递增剂量的静脉内nivolumab和ipilimumab并行施用(并行疗法)来治疗，而分开地，既往用ipilimumab治疗过的2个患者群体单独接受nivolumab(序贯疗法)。
对于并行疗法，患者在诱导期间每三周接受4个剂量的nivolumab和ipilimumab，然后是单独nivolumab每3周4个剂量。在随后的维持期继续组合疗法每12周多达8个剂量。当两种药物一起施用时，nivolumab在先施用。在一个群体内，nivolumab和ipilimumab剂量在诱导和维持期间保持恒定。剂量限制性毒性评估期贯穿第9周。肿瘤评估是在第12、18、24和36周，然后其后每12周进行。
序贯疗法中，在进入研究前既往用ipilimumab治疗过的患者每2周接受nivolumab多达48个剂量。Nivolumab治疗是在ipilimumab单药治疗后4-12周内起始的。肿瘤评估是在第8周，然后其后每8周进行。两种疗法的肿瘤响应用mWHO和免疫相关的mWHO标准来判定。
在完成治疗后，无证实的疾病进展的患者被随访多达2.5年。有CR、PR或SD≥24周并随后出现疾病进展的患者可以用原疗法再次治疗。安全性评估按照实验方案进行。不良事件的严重性根据美国国立癌症研究所不良事件通用术语标准3.0版(National Cancer Institute Common Terminology Criteria forAdverse Events,version 3.0)来分级。疾病评估用CT和/或MRI酌情按照实验方案来进行。
剂量递增和群体扩大
研究最初是计划用标准的3+3设计来评估并行疗法的剂量递增阶段，然后在最大耐受剂量或最大施用剂量处将群体扩大至多达16例患者的总数。剂量递增的剂量限制性毒性(DLT)评估期为9周。患者内剂量递增是不允许的，并且经历了DLT的患者被中止治疗。在DLT评估期间因药物相关毒性以外的原因从研究退出的患者可以被替换。修改了实验方案以允许剂量递增期间任何并行疗法群体扩大至N＝多达12例患者。后来添加了2个序贯疗法群体(各6-16例患者)；患者在接受了在先的ipilimumab之后用nivolumab(1mg/kg或3mg/kg)治疗。
患者
合格的患者为18岁且诊断出可测的、不可切除的III或IV期黑色素瘤；东部肿瘤协作组织体能状况为0-1，其中0是无症状的而1是轻微症状的；充分的器官功能；以及预期寿命≥4个月。有活跃的、未治疗的中枢神经系统转移的；自身免疫病史的；之前用T细胞调节抗体(不包括用于序贯疗法群体的ipilimumab)的；HIV的；或乙型或丙型肝炎的患者被排除。
在序贯疗法群体中，需要患者已经接受过3个在先剂量的ipilimumab，其中最后一次剂量是在开始nivolumab 4-12周内施用的。出现CR、有临床恶化证据的进展、或有ipilimumab相关的高等级不良事件史的患者被排除(实验方案详情参见Wolchok等2013a)。
在2009年12月到2013年2月之间治疗了86例患者，53例用并行疗法，33例用序贯疗法。基线患者特征在Wolchok等(2013a)中详述。在并行疗法和序贯疗法中，分别有38％和100％的患者接受过之前的全身性治疗。大多数患者有M1c疾病，而有>30％血清乳酸脱氢酶(LDH)升高。之前有过ipilimumab治疗的招入序贯疗法群体的多数患者显示出放射成像的进展(73％)。
PD-L1免疫组化
治疗前PD-L1的表达通过FFPE肿瘤样本中的IHC用兔抗PD-L1单克隆抗体28-8来测量，并通过Dako(Carpinteria,CA)开发出自动化测定法。通过针对重组PD-L1蛋白和来自表达PD-L1和不表达PD-L1的细胞系的裂解产物的Western印迹来测定抗体特异性。在正常人组织中进行有或无抗原竞争的IHC测定法和染色模式的评估。免疫组化测定法的分析灵敏度、特异性、可重复性、再现性、以及强劲度都进行了测试并符合所有预先规定的接受标准。2位对结局不知情的病理学家独立地审阅所有临床样本并评分。如果在一个有100个可评估细胞的切片中有5％的肿瘤细胞出现任何强度的膜PD-L1染色，则样品被定义为PD-L1阳性。
统计学分析
截至2013年2月，所有治疗的患者(N＝86)都被用于描述基线特征、安全性和绝对淋巴细胞计数(absolute lymphocyte count,ALC)，以及PD-L1染色的分析。有效力人群由接受了至少一个研究治疗的剂量的、并且疾病在基线处可测的、并具有以下条件之一的82例可评估响应的患者组成：>1次研究中的肿瘤评估、临床进展或第一次治疗中肿瘤评估前死亡。不良事件用MedDRA第15.1版来编译。选择的有潜在免疫学病因的不良事件用预先定义的MedDRA术语列表来鉴定。最佳总体响应程序性地来源于肿瘤测量，所述肿瘤测量通过研究地点的放射科医师和研究者按照修订的WHO(mWHO)或免疫相关的响应标准来提供(Wolchok等,2009)。完全和部分响应通过至少一次随后的肿瘤评估来证实。还通过放射成像评估进行了一项分析来评估的靶病损减少的量级。如果发现从基线测量值有80％的减少，则将响应表征为深度的。截至这项分析之日，总计的临床活性的评估还包括了未证实的响应。
实施例16
用抗PD-1加抗CTLA-4治疗的MEL患者的安全性评估
对于并行疗法(n＝53)，不论原因的话，在98％的患者中观察到了不良事件，所述不良事件为任何等级的。在93％的患者中观察到了治疗相关的不良事件，最常见的是皮疹(55％)、瘙痒(47％)、疲劳(38％)和腹泻(34％)。不论原因的话，在72％的患者中观察到了3-4级不良事件，而在53％中发现了3-4级治疗相关的事件，最常见的是脂肪酶(13％)、天冬氨酸转氨酶(13％)和丙氨酸氨基转移酶(11％)的升高。28例患者中有6例(21％)有3-4级剂量限制性治疗相关的事件。在49％的患者中报道了治疗相关的严重不良事件。通常的3-4级治疗相关的选择的不良事件包括肝(15％)、胃肠(9％)和肾(6％)的事件。见到肺炎和葡萄膜的孤案，与过去的单药治疗经验一致。11例(21％)患者由于治疗相关的不良事件而中止。
群体3(3mg/kg nivolumab+3mg/kg ipilimumab)超过了MTD(6例患者中3例经历了无症状的3-4级脂肪酶升高，持续3周)。群体2(1mg/kg nivolumab+3mg/kg ipilimumab)被鉴定为MTD(各有1例患者中出现3级葡萄膜炎、3级AST/ALT升高)。
对于序贯疗法(n＝33)，不论原因的话，在29例(88％)患者中观察到了不良事件，所述不良事件为任何等级的。在24例(73％)患者中观察到了治疗相关的不良事件，最常见包括皮疹(18％)和脂肪酶升高(12％)。不论原因的话，在11例(33％)患者中观察到了3-4级不良事件，而6例(18％)患者中观察到了3-4级治疗相关的不良事件，最常见的事件是脂肪酶升高(6％)。在7例(21％)患者中报道了治疗相关的严重不良事件。在2例患者中发现3-4级内分泌的事件是治疗相关的选择的不良事件。1例患者有2级肺炎。3例患者(9％)由于治疗相关的不良事件而中止。
对于并行和序贯疗法，治疗相关的不良事件都是可管控的并且通常可以用免疫抑制剂和/或替代疗法(对于内分泌病)按照既往制定的ipilimumab方案来逆转(参见包装说明书)。在研究中治疗的86例患者中，有药物相关的不良事件的73例患者中28例(38％)需要用全身性的糖皮质激素来管控。3例患者另需用英夫利昔(2例患者)或霉酚酸酯(1例患者)的免疫抑制性治疗。未报道治疗相关的死亡。不良事件的其他细节及其管控在(Wolchok等,2013a)中提供。
实施例17
MEL患者中抗PD-1和抗CTLA-4的组合展示出的效力
在并行和序贯疗法中都观察到了临床活性(表10和11)。在并行疗法群体中，在所有剂量的52例可评估响应的患者中有21例(40％；95％CI:27-55)里观察到通过mWHO标准证实的客观响应(OR)。在发现了一些显示出主要响应(接近CR)的患者后，测量了具有80％肿瘤减少的患者数量，所述80％肿瘤减少是选出的经验性的阈值，因为其代表了接近完全响应的肿瘤衰退的水平。这个响应深度在公开的检验点阻碍研究中是罕见的(Hodi等,2010；Topalian等,2012b)。16例患者在12周具有≥80％的肿瘤减少，包括5例CR(表10，图14A和15-17)。除了21例有通过mWHO标准的OR的患者外，4例患者经历了通过免疫相关的响应标准的客观响应，并且2例患者有未证实的响应。这些患者未被包括在ORR的计算中。对于并行疗法，在65％(95％CI:51-78；表10)的患者中观察到总的临床活性证据(常规的、未证实的、或免疫相关的响应后SD≥24周)。并行组合的深远影响可以在瀑布图中最佳地了解(图14B)。在数据分析日时，21例响应者中有19例中正在响应，持续时间范围为6.1+至72.1+周(表12)。对于以MTD治疗的患者(群体2，1mg/kg nivolumab+3mg/kg ipilimumab)，17例患者中9例(53％；95％CI:28-77)发生OR，包括3例CR。所有9例响应者均在他们第一次治疗中评估时达到≥80％的肿瘤减少(表10和图14A)。
对于序贯疗法群体中的患者，30例患者有6例达到OR(20％；95％CI:8-39)，包括1例CR。在8周时4例(13％)患者达到80％肿瘤减少(表11和图18)。另有一些患者有免疫相关的(n＝3)或未证实的(n＝3)响应。当考虑观察到客观、免疫相关的、或未证实的响应或SD≥24周时，在43％(95％CI:26-63)中观察到序贯疗法的临床活性证据。瀑布图揭示，不响应于在先ipilimumab的患者能响应于随后的nivolumab(图18C)。
肿瘤PD-L1表达和绝对淋巴细胞计数的分析
肿瘤PD-L1表达和外周血ALC中的改变已被分别开发为nivolumab和ipilimumab单药治疗的生物标记物(Topalian等,2012b；Berman等,2009；Ku等,2010；Postow等,2012；Delyon等,2013)。通过IHC染色来表征肿瘤PD-L1表达，并分析外周血ALC中的药效学变化。用≥5％的截留(cut off)来定义PD-L1阳性，来自56例患者中的21例(38％)肿瘤样本是PD-L1阳性的。在用并行疗法治疗的患者之中，在PD-L1阳性(6/13)或PD-L1阴性(9/22)的肿瘤中观察到OR(post-hoc P值>0.99；Fisher确切概率法)。在序贯疗法群体中，相比有PD-L1阴性肿瘤样品的患者(1/13)，在有PD-L1阳性肿瘤样品的患者中(4/8)观察到数字上更高的数目的总体响应，但数目小。
与ipilimumab单药治疗的观察相比，在用并行组合治疗的患者或用nivolumab然后ipilimumab治疗的患者中检测到了ALC从基线的持续上升。在序贯疗法群体中，在5-7周时ALC低(<1000细胞/μL)的患者(Ku等,2010)与5-7周时ALC正常的患者相比有相似的OR(43％)。同样的，在序贯疗法群体中，ALC低的患者有17％具有OR，而ALC正常或高的患者有23％具有OR。
序列表总结
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Claims (21)

1.一种治疗罹患癌症的受试者的方法，所述方法包括对受试者施用治疗上有效量的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分破坏程序性死亡-1(PD-1)和程序性死亡受体-1(PD-L1)之间的相互作用，其中所述抗体或其抗原结合部分特异地结合PD-1或PD-L1。
2.权利要求1的方法，其中所述癌症选自下组：黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结肠直肠癌、去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer)、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头部与颈部的鳞状细胞癌、食管、胃肠道及乳癌(carcinomas of the esophagus,gastrointestinal tract and breast)、以及血液的恶性肿瘤(hematologicalmalignancy)。
3.权利要求1的方法，其中所述治疗上有效量的抗体或其抗原结合部分包含范围为0.1-10.0mg/kg体重的剂量，其是以每周一次、每两周一次、或每月一次的给药方案施用的。
4.一种用于罹患癌症的受试者的免疫治疗的方法，其方法包括：
(a)选择受试者，所述受试者对于免疫治疗是合适的候选者，所述选择包括：
(i)提供测试组织样品，所述测试组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞(tumor-infiltratinginflammatory cells)；
(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及
(iii)基于评估而选择受试者作为合适的候选者，所述评估为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例超过预定的阈值水平；以及
(b)对选择的受试者施用包含治疗上有效量的抗PD-1抗体的组合物。
5.权利要求4的方法，其中所述表达PD-L1的细胞的比例是通过进行测定法来评估的，所述测定法是为了确定测试组织样品中细胞表面上PD-L1多肽的存在。
6.权利要求5的方法，其中所述测试组织样品是福尔马林固定的、石蜡包埋(FFPE)的组织样品。
7.权利要求6的方法，其中PD-L1多肽的存在是用自动化的IHC测定法来确定的。
8.权利要求12的方法，其中所述IHC测定法是用抗PD-L1单克隆抗体来结合到PD-L1多肽而进行的，其中所述抗PD-L1单克隆抗体选自28-8、28-1、28-12、29-8和5H1。
9.权利要求4的方法，其中所述预定的阈值水平是如用mAb 28-8通过自动化的IHC确定的表达细胞表面PD-L1的肿瘤细胞或单个肿瘤浸润性的炎症细胞的1％。
10.一种用于治疗罹患癌症的受试者的方法，其方法包括：
(a)选择受试者，所述受试者不适于抗PD-1抗体免疫治疗，所述选择包括：
(i)提供测试组织样品，所述组织样品是从患有该组织的癌症的患者获得，并包含肿瘤细胞和肿瘤浸润性的炎症细胞；
(ii)评估测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例；以及
(iii)基于评估而选择受试者作为不合于抗PD-1抗体免疫治疗，所述评估为测试组织样品中在细胞表面上表达PD-L1的细胞的比例低于预定的阈值水平；以及
(b)对选择的受试者施用除了抗PD-1抗体之外的疗护标准(standard-of-care)治疗剂。
11.一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其在福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织样品中特异性地结合到细胞表面表达的PD-L1多肽。
12.权利要求16的单克隆抗体或其抗原结合部分，其抗体或其部分在重链可变区中包含CDR1、CDR2和CDR3区，所述重链可变区包含具有SEQ IDNO:35中所述序列的连续连接的氨基酸；并在轻链可变区中包含CDR1、CDR2和CDR3区，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:36中所述序列的连续连接的氨基酸。
13.权利要求16的单克隆抗体或其抗原结合部分，其抗体或其部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:35中所述序列的连续连接的氨基酸，而所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:36中所述序列的连续连接的氨基酸。
14.一种治疗罹患癌症的受试者的方法，所述方法包括对受试者施用：
(a)特异地结合并抑制程序性死亡-1(PD-1)的抗体或其抗原结合部分；和
(b)特异地结合并抑制细胞毒素T-淋巴细胞抗原-1(CTLA-4)的抗体或其抗原结合部分；
每种抗体以范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量在并行疗法(concurrentregimen)中施用，所述并行疗法包括：
(i)一种诱导给药方案，其包括以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体至少2、4、6、8或10个剂量，然后是以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率单独施用抗PD-1至少2、4、6、8、或12个剂量；然后是
(ii)一种维持给药方案，包括以每8、12、或16周至少一次或每季度至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体至少4、6、8、10、12或16个剂量。
15.权利要求14的方法，其中所述抗PD-1和抗CTLA-4抗体是以如下剂量施用的：
(a)0.1mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(b)0.3mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(c)1mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(d)3mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(e)5mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(f)10mg/kg的抗PD-1抗体和3mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(g)0.1mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(h)0.3mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(i)1mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(j)3mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；
(k)5mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体；或
(l)10mg/kg的抗PD-1抗体和1mg/kg的抗CTLA-4抗体。
16.一种治疗罹患癌症的受试者的方法，所述受试者是之前用抗CTLA-4抗体治疗的，所述方法包括在序贯疗法(sequenced regimen)中对所述受试者施用特异地结合并抑制PD-1的抗体或其抗原结合部分，所述施用的方式是以范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量和每周至少一次、每2、3、或4周至少一次、或每月至少一次的给药频率施用直到6个至直到72个剂量。
17.权利要求15或16的方法，其中所述抗PD-1抗体是nivolumab。
18.权利要求15或16的方法，其中所述抗CTLA-4抗体是ipilimumab。
19.一种抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其用于在并行疗法中治疗罹患癌症的受试者，所述并行疗法包括与抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分组合施用，其中所述抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体各以范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量来施用，并且其中所述并行疗法进一步包括：
(i)一种诱导给药方案，其包括以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体至少2、4、6、8或12个剂量，然后是以每2、3、或4周至少一次或每月至少一次的给药频率单独施用抗PD-1至少2、4、6、8或10个剂量；然后是
(ii)一种维持给药方案，包括以每8、12、或16周至少一次或每季度至少一次的给药频率组合施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体多至4、6、8、10、12或16个剂量。
20.一种用于治疗罹患癌症的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量的抗体或其抗原结合部分，其特异地结合并抑制PD-1；
(b)范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量的抗体或其抗原结合部分，其特异地结合并抑制CTLA-4；以及
(c)用于在权利要求14的并行疗法方法中使用抗PD-1和抗CTLA-4抗体的说明书。
21.一种用于治疗罹患癌症的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)范围为0.1-20.0mg/kg体重的剂量的抗体或其抗原结合部分，其特异地结合并抑制PD-1；以及
(b)用于在权利要求16的序贯疗法方法中使用抗PD-1抗体的说明书。
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