JP7016323B2 - Ｐｄ－ｌ１結合ポリペプチドを用いるｐｅｔ造影 - Google Patents

Ｐｄ－ｌ１結合ポリペプチドを用いるｐｅｔ造影 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月１日出願の米国仮出願６２／３４４,２５８に基づく優先権を主張する。前記出願の内容を、引用により本明細書に包含させる。
背景
計画細胞死リガンド－１(ＰＤ－Ｌ１)は、活性化ＴおよびＢ細胞により発現され、免疫抑制を仲介する重要な免疫チェックポイント受容体であるＰＤ－１の表面糖タンパク質リガンドであり、抗原提示細胞およびヒト癌の両者で見られ、ＰＤ－１への結合によりＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する(Freeman et al., 2000; Latchman et al, 2001)。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用の阻害は、前臨床モデルで強力な抗腫瘍活性を可能とし、この相互作用を妨害する抗体が、癌処置に関する治験に入っている(米国特許８,００８,４４９および７,９４３,７４３；Brahmer et al., 2010; Topalian et al., 2012b; Brahmer et al., 2012; Flies et al., 2011; Pardoll, 2012; Hamid and Carvajal, 2013)。
ＰＥＴまたは陽電子放出断層撮影は、体内の種々の分子過程のまたは疾患病理に関連するタンパク質の位置の三次元画像を取得する非侵襲的核医学技術である。この方法は、体内に導入された生物学的活性分子のポジトロン放出放射性核種(トレーサー)により間接的に放出されるガンマ線の対を検出する。ＰＥＴ造影ツールは、医薬品開発で広範な用途を有し、同じツールが前臨床および臨床の両段階で使用し得るという、特有のトランスレーショナル医療上の利点を有する。その例は、インビボ標的の飽和化；毒性または患者間変動予測のための、正常組織取り込み追跡；罹病組織の定量化；腫瘍転移；経時的薬効または経時的耐性追跡などの直接的可視化を含む。
本明細書で説明するのは、例えば、陽電子放出断層撮影において、診断／造影剤としての使用に適する新規抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンである。
概要
本発明は、少なくとも一部、例えば、陽電子放出断層撮影において、診断／造影剤として有用である新規抗ヒトＰＤ－Ｌ１アドネクチンおよびその対象への投与方法の発見に基づく。これらの薬剤は、例えば、ＰＤ－Ｌ１発現細胞と非ＰＤ－Ｌ１発現細胞、例えば、腫瘍細胞または腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)の区別およびＰＤ－Ｌ１発現組織と非ＰＤ－Ｌ１発現組織、例えば、癌組織の区別に有用である。
ある態様において、ここに提供されるのは、フィブロネクチンIII型第１０ドメイン(１０Ｆｎ３)を含むポリペプチドであり、ここで、(ａ)１０Ｆｎ３ドメインはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含み、(ｂ)該１０Ｆｎ３は、ヒト１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１)の対応するループの配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、そして(ｃ)該ポリペプチドはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。ある実施態様において、このポリペプチドはＰＤ－Ｌ１に５００mMまたはそれ未満、例えば、１００mMまたはそれ未満のＫＤで結合する。
ある実施態様において、１０Ｆｎ３ドメインは、次のアミノ酸配列からなるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
(１)それぞれ配列番号６、７および８；
(２)それぞれ配列番号２１、２２および２３；
(３)それぞれ配列番号３６、３７および３８；
(４)それぞれ配列番号５１、５２および５３；
(５)それぞれ配列番号６６、６７および６８；
(６)それぞれ配列番号８１、８２および８３；
(７)それぞれ配列番号９７、９８および９９；
(８)それぞれ配列番号１１３、１１４および１１５；
(９)それぞれ配列番号１２４、１２５および１２６；
(１０)それぞれ配列番号１３５、１３６および１３７；
(１１)それぞれ配列番号１４６、１４７および１４８；
(１２)それぞれ配列番号１５７、１５８および１５９；
(１３)それぞれ配列番号１６８、１６９および１７０；
(１４)それぞれ配列番号１７９、１８０および１８１；
(１５)それぞれ配列番号１９０、１９１および１９２；
(１６)それぞれ配列番号２０１、２０２および２０３；
(１７)それぞれ配列番号２１２、２１３および２１４；
(１８)それぞれ配列番号２２３、２２４および２２５；
(１９)それぞれ配列番号２３４、２３５および２３６；
(２０)それぞれ配列番号２４５、２４６および２４７；
(２１)それぞれ配列番号２５６、２５７および２５８；
(２２)それぞれ配列番号２６７、２６８および２６９；
(２３)それぞれ配列番号２７８、２７９および２８０；
(２４)それぞれ配列番号２８９、２９０および２９１；
(２５)それぞれ配列番号３００、３０１および３０２；
(２６)それぞれ配列番号３１１、３１２および３１３；
(２７)それぞれ配列番号３２２、３２３および３２４；
(２８)それぞれ配列番号３３３、３３４および３３５；
(２９)それぞれ配列番号３４４、３４５および３４６；
(３０)それぞれ配列番号３５５、３５６および３５７；
(３１)それぞれ配列番号３６６、３６７および３６８；
(３２)それぞれ配列番号３７７、３７８および３７９；
(３３)それぞれ配列番号３８８、３８９および３９０；
(３４)それぞれ配列番号３９９、４００および４０１；
(３５)それぞれ配列番号４１０、４１１および４１２；
(３６)それぞれ配列番号４２１、４２２および４２３；
(３７)それぞれ配列番号４３２、４３３および４３４；
(３８)それぞれ配列番号４４３、４４４および４４５；
(３９)それぞれ配列番号４５４、４５５および４５６；
(４０)それぞれ配列番号４６５、４６６および４６７；
(４１)それぞれ配列番号４７６、４７７および４７８；
(４２)それぞれ配列番号４８７、４８８および４８９；
(４３)それぞれ配列番号４９８、４９９および５００；
(４４)それぞれ配列番号５０９、５１０および５１１；
(４５)それぞれ配列番号５２０、５２１および５２２；
(４６)それぞれ配列番号５３１、５３０および５３１；
(４７)それぞれ配列番号５４２、５４３および５４４；
(４８)それぞれ配列番号５５３、５５４および５５５；または
(４９)それぞれ配列番号５６４、５６５および５６６。
ある実施態様において、ポリペプチドは、表３に示す配列、例えば、配列番号５、２０、３５、５０、６５、８０,９６、１１２、１２３、１３４、１４５、１５６、１６７、１７８、１８９、２００、２１１、２２２、２３３、２４４、２５５、２６６、２７７、２８８、２９９、３１０、３２１、３３２、３４３、３５４、３６５、３７６、３８７、３９８、４０９、４２０、４３１、４４２、４５３、４６４、４７５、４８６、４９７、５０８、５１９、５３０、５４１、５５２および５６３の何れかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号５、２０、３５、５０、６５、８０、９６、１１２、１２３、１３４、１４５、１５６、１６７、１７８、１８９、２００、２１１、２２２、２３３、２４４、２５５、２６６、２７７、２８８、２９９、３１０、３２１、３３２、３４３、３５４、３６５、３７６、３８７、３９８、４０９、４２０、４３１、４４２、４５３、４６４、４７５、４８６、４９７、５０８、５１９、５３０、５４１、５５２または５６３の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号９～１５、２４～３０、３９～４５、５４～６０、６９～７５、８４～９１、１００～１０７、１１６～１２２、１２７～１３３、１３８～１４４、１５０～１５５、１６０～１６６、１７１～１７７、１８２～１８８、１９３～１９９、２０４～２１０、２１５～２２１、２２７～２３２、２３７～２４３、２４８～２５４、２５９～２６５、２７１～２７６、２９１～２８７、２９２～２９８、３０３～３０９、３１４～３２０、３２５～３３１、３３７～３４２、３４７～３５３、３５８～３６４、３６９～３７５、３８０～３８６、３９１～３９７、４０２～４０８、４１３～４１９、４２４～４３０、４３５～４４１、４４６～４５２、４５７～４６３、４６８～４７４、４７９～４８５、４９０～４９６、５０１～５０７、５１２～５１８、５２３～５２９、５３４～５４０、５４５～５５１および５５６～５６２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号９～１５、２４～３０、３９～４５、５４～６０、６９～７５、８４～９１、１００～１０７、１１６～１２２、１２７～１３３、１３８～１４４、１５０～１５５、１６０～１６６、１７１～１７７、１８２～１８８、１９３～１９９、２０４～２１０、２１５～２２１、２２７～２３２、２３７～２４３、２４８～２５４、２５９～２６５、２７１～２７６、２９１～２８７、２９２～２９８、３０３～３０９、３１４～３２０、３２５～３３１、３３７～３４２、３４７～３５３、３５８～３６４、３６９～３７５、３８０～３８６、３９１～３９７、４０２～４０８、４１３～４１９、４２４～４３０、４３５～４４１、４４６～４５２、４５７～４６３、４６８～４７４、４７９～４８５、４９０～４９６、５０１～５０７、５１２～５１８、５２３～５２９、５３４～５４０、５４５～５５１および５５６～５６２からなる群から選択されるアミノ酸配列の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ポリペプチドは配列番号５７４～５８３からなる群から選択されるＮ末端リーダーおよび／または配列番号５８４～６１８からなる群から選択されるＣ末端テイルまたはＰｍＣｎを含み、ここで、Ｐはプロリンであり、ｍは少なくとも０である整数(例えば、０、１または２)であり、ｎは少なくとも１である整数(例えば、１または２)である。
ある実施態様において、ポリペプチドは、ポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される１以上の薬物動態(ＰＫ)部分を含む。ある実施態様において、ＰＫ部分とポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖またはポリエチレングリコール部分を介して結合される。ある実施態様において、ＰＫ部分とポリペプチドは、配列番号６２９～６７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して結合される。
ここに提供されるのは、ここに記載する、ポリペプチドをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクターおよび細胞である。ある実施態様において、核酸は、配列番号１６～１９、３１～３４、４６～４９、６１～６４、７６～７９、９２～９５および１０８～１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
ここに提供されるのは、ここに記載するポリペプチドおよび担体を含む組成物である。例えば、ここに記載する組成物は、配列番号５、９～１５、２０、２４～３０、３５、３９～４５、５０、５４～６０、６５、６９～７５、８０、８４～９１、９６、１００～１０７、１１２、１１６～１２２、１２３、１２７～１３３、１３４、１３８～１４４、１４５、１５０～１５５、１５６、１６０～１６６、１６７、１７１～１７７、１７８、１８２～１８８、１８９、１９３～１９９、２００、２０４～２１０、２１１、２１５～２２１、２２２、２２７～２３２、２３３、２３７～２４３、２４４、２４８～２５４、２５５、２５９～２６５、２６６、２７１～２７６、２７７、２９１～２８７、２８８、２９２～２９８、２９９、３０３～３０９、３１０、３１４～３２０、３２１、３２５～３３１、３３２、３３７～３４２、３４３、３４７～３５３、３５４、３５８～３６４、３６５、３６９～３７５、３７６、３８０～３８６、３８７、３９１～３９７、３９８、４０２～４０８、４０９、４１３～４１９、４２０、４２４～４３０、４３１、４３５～４４１、４４２、４４６～４５２、４５３、４５７～４６３、４６４、４６８～４７４、４７５、４７９～４８５、４８６、４９０～４９６、４９７、５０１～５０７、５０８、５１２～５１８、５１９、５２３～５２９、５３０、５３４～５４０、５４１、５４５～５５１、５５２および５５６～５６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび担体を含む。
ここに提供されるのは、ここに記載するポリペプチドを含む造影剤である。ある実施態様において、造影剤は、配列番号５、９～１５、２０、２４～３０、３５、３９～４５、５０、５４～６０、６５、６９～７５、８０、８４～９１、９６、１００～１０７、１１２、１１６～１２２、１２３、１２７～１３３、１３４、１３８～１４４、１４５、１５０～１５５、１５６、１６０～１６６、１６７、１７１～１７７、１７８、１８２～１８８、１８９、１９３～１９９、２００、２０４～２１０、２１１、２１５～２２１、２２２、２２７～２３２、２３３、２３７～２４３、２４４、２４８～２５４、２５５、２５９～２６５、２６６、２７１～２７６、２７７、２９１～２８７、２８８、２９２～２９８、２９９、３０３～３０９、３１０、３１４～３２０、３２１、３２５～３３１、３３２、３３７～３４２、３４３、３４７～３５３、３５４、３５８～３６４、３６５、３６９～３７５、３７６、３８０～３８６、３８７、３９１～３９７、３９８、４０２～４０８、４０９、４１３～４１９、４２０、４２４～４３０、４３１、４３５～４４１、４４２、４４６～４５２、４５３、４５７～４６３、４６４、４６８～４７４、４７５、４７９～４８５、４８６、４９０～４９６、４９７、５０１～５０７、５０８、５１２～５１８、５１９、５２３～５２９、５３０、５３４～５４０、５４１、５４５～５５１、５５２および５５６～５６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
ある実施態様において、造影剤は、検出可能標識を含む。ある実施態様において、造影剤は、ここに記載するポリペプチド、キレート剤および検出可能標識を含む。ある実施態様において、造影剤はここに記載するポリペプチド、二機能性キレーターまたは接合(ＢＦＣ)部分および検出可能標識を含む。ある実施態様において、検出可能標識は、放射性核種を含む補欠分子族である。ある実施態様において、検出可能標識は、陽電子放出断層撮影により検出可能である。
ある実施態様において、キレート剤および／または二機能性キレーターまたは接合(ＢＦＣ)部分は、ＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＣＢ－ＤＯ２Ａ、３ｐ－Ｃ－ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯ、ＢＡＲＡＣ、ＤＩＭＡＣ、Ｏｘｏ－ＤＯ３Ａ、ＴＥ２Ａ、ＣＢ－ＴＥ２Ａ、ＣＢ－ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ－ＴＥ２Ｐ、ＭＭ－ＴＥ２Ａ、ＤＭ－ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒ、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ－ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ－ＤＴＰＡ、ＣＨＸ－Ａ’’－ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡ、ＤＡＴＡ、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡからなる群から選択される。
ある実施態様において、検出可能標識は、放射性核種、例えば、６４Ｃｕ、１２４Ｉ、７６／７７Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１１Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、６８Ｇａ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、８９Ｚｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃまたは１５３Ｓｍである。
ある実施態様において、キレート剤はＮＯＤＡＧＡであり、放射性核種は６４Ｃｕである。ある実施態様において、造影剤は抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド(例えば、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、配列番号８０または９６に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン)、キレート剤ＮＯＤＡＧＡおよび放射性核種６４Ｃｕを含む。
ある実施態様において、造影剤は、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド(例えば、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、配列番号８０または９６に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン)、二機能性キレーターまたは接合(ＢＦＣ)部分および放射性核種１８Ｆを含む補欠分子族を含む。ある実施態様において、造影剤は、次の構造
Figure 0007016323000001
 を有するかまたはその薬学的に許容される塩である。
ある実施態様において、造影剤は、次の構造
Figure 0007016323000002
 を有する。
ある実施態様において、ＢＦＣは、タンパク質のアミン、カルボキシル、カルボニルまたはチオール官能基と共有結合を形成する反応性基を含むシクロオクチンである。ある実施態様において、シクロオクチンは、ジベンゾシクロオクチン(ＤＩＢＯ)、ビアリールアザシクロオクチノン(ＢＡＲＡＣ)、ジメトキシアザシクロオクチン(ＤＩＭＡＣ)およびジベンゾシクロオクチン(ＤＢＣＯ)からなる群から選択される。ある実施態様において、シクロオクチンはＤＢＣＯである。
ある実施態様において、ＢＦＣはＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ－エステル、ＤＢＣＯ－スルホ－ＮＨＳ－エステル、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－酸、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－アミンまたはＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドである。ある実施態様において、ＢＦＣはＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドである。
ある実施態様において、造影剤は次の構造を有する。
Figure 0007016323000003
ここで、Ｘは配列番号１３、２８、４３、５８、７３、８８、１０４、１２０、１３１、１４２、１５３、１６４、１７５、１８６、１９７、２０８、２１９、２３０、２４１、２５２、２６３、２７４、２８５、２９６、３０７、３１８、３２９、３４０、３５１、３６２、３７３、３８４、３９５、４０６、４１７、４２８、４３９、４５０、４６１、４７２、４８３、４９４、５０５、５１６、５２７、５３８、５４９、５６０および５７１の何れかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号１０４に示すアミノ酸配列を含む。
ここに提供されるのは、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン組成物および／または造影剤および使用指示を含むキットである。
ここに提供されるのは、サンプルにおけるＰＤ－Ｌ１を検出する方法であって、方法は、サンプルと抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを接触させ、ＰＤ－Ｌ１を検出することを含む。
ここに提供されるのは、対象に抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤を投与し、造影剤を検出することを含み、検出された造影剤が対象におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の位置を規定する、対象におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞を検出する方法である。
ここに提供されるのは、対象に抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤を投与し、造影剤を検出することを含み、検出された造影剤が対象における腫瘍の位置を規定する、対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を検出する方法である。ある実施態様において、造影剤は陽電子放出断層撮影により検出される。
ここに提供されるのは、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤の画像を得る方法であって、
ａ)対象に造影剤を投与し；そして
ｂ)陽電子放出断層撮影により造影剤の分布をインビボで造影する
ことを含む、方法である。
ここに提供されるのは、ＰＤ－Ｌ１を発現する組織または細胞の定量的画像を得る方法てあって、方法は、細胞または組織と抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤を接触させ、陽電子放出断層撮影を使用してＰＤ－Ｌ１発現組織を検出または定量することを含む。
ここに提供されるのは、造影有効量の抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤をＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を有する対象に投与し、該造影剤の腫瘍における放射線放出を陽電子放出断層撮影を使用して検出することを含む、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を検出する方法であって、ここで、放射線放出が腫瘍において検出される。
ここに提供されるのは、対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍の存在を診断する方法であって、方法は、
(ａ)それを必要とする対象に抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤を投与し；そして
(ｂ)造影剤の存在または非存在を検出するために、対象の少なくとも一部の放射線画像を得る；
ことを含み、ここで、背景を超える造影剤の存在および位置が、対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍の存在および位置の指標である。
ここに提供されるのは、癌を有する対象を処置する方法であって、
(ａ)それを必要とする対象に抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤を投与し、そして１っ以上の腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の存在を決定するために対象の少なくとも一部の画像を得て；そして、ＰＤ－Ｌ１が１っ以上の腫瘍で検出されたならば、
(ｂ)対象に抗腫瘍治療、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害する薬剤(ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)を投与する
ことを含む、方法である。
ここに提供されるのは、対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の進行をモニタリングする方法であって、
(ａ)それを必要とする対象に、第一の時点で抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤を投与し、腫瘍のサイズを決定するために対象の少なくとも一部の画像を得て；
(ｂ)対象に抗腫瘍治療剤を投与し；
(ｃ)対象に造影剤をその後１以上の時点で投与し、各時点で対象の少なくとも一部の画像を得ることを含み；ここで、各時点の腫瘍の寸法および位置が、疾患進行の指標である、
方法である。
ここに記載する例示抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのコアアミノ酸配列の模式図である。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに下線を付す。野生型(ＷＴ)(配列番号２)、ＡＴＩ－９６８(配列番号５)、ＡＴＩ－９６４(配列番号２０)、ＡＴＩ－９６７(配列番号６５)、Ａ０２(配列番号８０)、Ｅ０１(配列番号９６)、ＡＴＩ－９６５(配列番号３５)およびＡＴＩ－９６６(配列番号５０)。
[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡの化学合成の模式図である。分子のＥ０１部分は、配列番号１０４に示す配列を有する。
は、６４Ｃｕ－Ｅ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン(ＮＯＤＡＧＡキレーター有り)でのｈＰＤ－Ｌ１陽性Ｌ２９８７細胞とｈＰＤ－Ｌ１陰性ＨＴ－２９細胞の鑑別を示すグラフである。特異性は、過剰の冷(非標識)Ｅ０１アドネクチンと共インキュベートしたときの細胞関連６４Ｃｕ－Ｅ０１の減少により確認した。
ＮＯＤＡＧＡ－６４Ｃｕ標識Ａ０２抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンでの両側性異種移植マウスにおけるｈＰＤ－Ｌ１(＋)とｈＰＤ－Ｌ１(－)腫瘍の鑑別を示すＰＥＴ画像である。プローブ滞留面積を示す積算０～２時間画像を示す。明るい領域は暴露中最大占拠の組織である。
ｈＰＤ－Ｌ１(＋)[Ｌ２９８７]腫瘍における腫瘍標識の時間経過を示すグラフである。ｈＰＤ－Ｌ１(－)[ＨＴ２９]腫瘍およびｈＰＤ－Ｌ１(＋)系[Ｌ２９８７遮断]におけるパルスチェイス実験は、標識の特異性を示す。
ガンマカウンターによりエクスビボで測定した両側性ｈＰＤ－Ｌ１(＋)Ｌ２９８７およびｈＰＤ－Ｌ１(－)ＨＴ－２９異種移植変担持マウスにおける１８Ｆ標識Ａ０２抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン放射性トレーサーの組織分布を示すグラフである。
カニクイザルにおける１８Ｆ標識Ｅ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン分布の多層画像である。
記載する濃度の冷Ａ０２アドネクチンと共インキュベートした０.２５nM １８Ｆ－ＤＢＣＯ－Ａ０２抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンで標識した異種移植およびヒト肺組織のインビトロオートラジオグラフィーを示す画像である。
ｈＰＤ－Ｌ１の腫瘍発現を示すために抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンで標識した異種移植およびヒト肺腫瘍検体の免疫組織化学画像を示す。
[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ合成の反応スキームを示す。同じ反応スキームを使用して、Ｅ０１アドネクチンを標識した。
[１８Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡの自動化合成のためのGE TRACERlab FX2 N合成モジュールの模式図である。
[１８Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡの自動化合成のためのSynthera合成モジュール(ＩＢＡ)の模式図である。
抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの例示的競合曲線を記載する。
詳細な記載
定義
異なる定義がされない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、一般に当業者により理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載するものに類するまたは等価なあらゆる方法および組成物を、本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および組成物は、ここに記載される。
“計画細胞死リガンド－１(ＰＤ－Ｌ１)”は、ＰＤ－１への結合によりＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、ＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの一方である(他方はＰＤ－Ｌ２)。ここで使用する用語“ＰＤ－Ｌ１”は、ヒトＰＤ－Ｌ１(ｈＰＤ－Ｌｌ)、ｈＰＤ－Ｌｌのバリアント、アイソフォームおよび種ホモログおよびｈＰＤ－Ｌｌと少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全ｈＰＤ－Ｌｌ配列は、GenBank Accession No. Q9NZQ7下に見られる。ＰＤ－Ｌ１はＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ、Ｂ７Ｈ１、ＰＤＣＤ１Ｌ１およびＰＤＣＤ１ＬＧ１とも称される。
ここで使用する“ポリペプチド”は、長さ、翻訳後修飾または機能に関わらず、２以上のアミノ酸のあらゆる配列をいう。ポリペプチドは、天然アミノ酸および米国特許６,５５９,１２６(引用により本明細書に包含させる)に記載のものなどの非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた種々の標準的化学方法で修飾もされ得る(例えば、アミノ酸を保護基で修飾でき；カルボキシ末端アミノ酸を末端アミド基に修飾でき；アミノ末端残基を、例えば、親油性を増加するために修飾でき；またはポリペプチドを化学的にグリコシル化または他に修飾して、安定性またはインビボ半減期を延長し得る)。ポリペプチド修飾は、環状化合物または他の分子ポリペプチドなどの他の構造の結合を含み、立体配置が変えられた(すなわち、ＲまたはＳ；または、ＬまたはＤ)１以上のアミノ酸を含むポリペプチドも含む。ここに記載するペプチドは、フィブロネクチンIII型第１０ドメイン由来のタンパク質であり、これは、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ここで、“抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン”または“ＰＤ－Ｌ１アドネクチン”と称する。
ここで使用する“ポリペプチド鎖”は、そのドメインの各々が、他のドメインと非共有結合相互作用またはジスルフィド結合ではなく、ペプチド結合により結合される、ポリペプチドをいう。
“単離”ポリペプチドは、その天然環境の成分から同定、分離および／または取得されたものである。その天然環境の夾雑成分は、該ポリペプチドの診断または治療使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質的または非タンパク質的溶質であり得る。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)ローリー法で測定して、９５重量％を超える、最も好ましく９９重量％を超えるポリペプチドまで、(２)スピニングカップシークエネーターの使用により少なくともＮ末端または内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度までまたは(３)クマシブルーまたは、好ましくは、銀染色を使用して、還元または非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより均一まで精製される。単離ポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１成分が存在しないため、組み換え細胞内の生体内でのポリペプチドを含む。しかしながら、単離ポリペプチドは、通常、少なくとも１精製工程により調製される。
ここで使用する１０Ｆｎ３ドメインの“領域”は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインのループ(ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧ)、β鎖(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ)、Ｎ末端(配列番号１のアミノ酸残基１～７に対応)またはＣ末端(配列番号１のアミノ酸残基９３～９４に対応)の何れかをいう。
“足場領域”は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの非ループ領域の何れかをいう。足場領域は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ β鎖ならびにＮ末端領域(配列番号１の残基１～７に対応するアミノ酸)およびＣ末端領域(配列番号１の残基９３～９４に対応するアミノ酸および所望によりヒトフィブロネクチンにおけるＦｎ３ドメインの第１０と第１１間の反復天然リンカーを構成する７アミノ酸を含む)を含む。
ここでの“パーセント(％)アミノ酸配列同一性”は、配列を整列させ、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要であれば、ギャップを挿入した後の、配列同一性の一部として保存的置換を何ら考慮せず、選択配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして決定される。パーセントアミノ酸配列同一性決定の目的でのアラインメントは当分野の技術の範囲内である種々の方法により、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalign(DNASTARTM)ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成できる。当業者は、比較する配列の完全長にわたり最大アラインメントを達成するための何らかのアルゴリズムを含む、アラインメント測定のための適切なパラメータを容易に決定できる。例えば、あるアミノ酸配列Ａとあるアミノ酸配列Ｂについての、それとのまたはそれに対する％アミノ酸配列同一性(これは、あるアミノ酸配列Ｂについての、それとのまたはそれに対する％アミノ酸配列同一性を有するまたは含むあるアミノ酸配列Ａと言い換えることができる)は、次のとおり計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ(式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２において、そのプログラムのＡおよびＢのアラインメントにより同一マッチとして点数化されたアミノ酸残基数であり、ＹはＢの総アミノ酸残基数である)。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくないならば、Ａ対Ｂの％アミノ酸配列同一性は、Ｂ対Ａの％アミノ酸配列同一性と同一でないことが理解される。
ここで使用する用語“アドネクチン結合部位”は、特定のアドネクチンと相互作用または結合するタンパク質(例えば、ＰＤ－Ｌ１)の部位または部分をいう。アドネクチン結合部位は、隣接アミノ酸またはタンパク質の三次元折りたたみにより並置される非隣接アミノ酸から形成され得る。隣接アミノ酸により形成されるアドネクチン結合部位は、一般に変性溶媒暴露に際して保持されるが、一方三次元折りたたみにより形成されたアドネクチン結合部位は、一般に変性溶媒処理により喪失する。
ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのアドネクチン結合部位は、プロテアーゼマッピングおよび変異解析を含むが、これらに限定されない、抗体のエピトープマッピングに一般に使用される標準的技法の適用により決定され得る。あるいは、アドネクチン結合部位を、同一ポリペプチド、例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合する対照アドネクチンまたは抗体を使用する競合アッセイにより決定できる(下記“交差競合アドネクチンおよび／または同一アドネクチン結合部位に結合するアドネクチン”なる表題の章でさらに説明される)。試験アドネクチンおよび対照分子(例えば、他のアドネクチンまたは抗体)が競合するならば、それらは同一アドネクチン結合部位または一方の分子の結合が他方により妨害されるのに十分に近位のアドネクチン結合部位に結合する。アドネクチン結合部位は、それを同定するために使用する方法により定義される。例えば、アドネクチンは、ＨＤＸにより決定される、ある結合部位に結合し得る；アドネクチンは、結晶学により決定される、ある結合部位に結合し得る；またはアドネクチンは、定方向変異解析により決定したある結合部位に結合し得る。
ここでＰＤ－Ｌ１へのアドネクチン結合に関連して相互交換可能に使用する用語“特異的に結合する”、“特異的結合”、“選択的結合”および“選択的に結合する”は、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ(例えば、競合ＥＬＩＳＡ、BIACOREアッセイ)を含むが、これらに限定されない当分野で利用可能な技法により測定して、ＰＤ－Ｌ１に親和性を示すが、異なるポリペプチドには顕著に結合しない(例えば、約１０％未満の結合)アドネクチンをいう。本用語はまた例えば、ここに記載するアドネクチンの結合ドメインがＰＤ－Ｌ１に特異的であるときも適用可能である。
ＰＤ－Ｌ１へのアドネクチン結合に関連して使用する用語“優先的に結合する”は、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ(例えば、競合ＥＬＩＳＡ、BIACOREアッセイ)を含むが、これらに限定されない当分野で利用可能な技法により測定して、ここに記載するアドネクチンがＰＤ－Ｌ１に異なるポリペプチドより少なくとも約２０％多く結合する状況をいう。
アドネクチンに関連してここで使用する、用語“交差反応性”は、同一または極めて類似するアドネクチン結合部位を有する１を超える異なるタンパク質に結合する、アドネクチンをいう。
ＰＤ－Ｌ１へのアドネクチン結合に関連して使用する用語“ＫＤ”は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを使用して測定して、特定のアドネクチン－タンパク質(例えば、ＰＤ－Ｌ１)相互作用またはアドネクチンのタンパク質(例えば、ＰＤ－Ｌ１)への親和性の解離平衡定数をいう。ここで使用する“所望のＫＤ”は、意図する目的に十分であるアドネクチンのＫＤをいう。例えば、所望のＫＤは、インビトロアッセイ、例えば、細胞ベースのルシフェラーゼアッセイにおいて、機能的効果を発揮するのに必要なアドネクチンのＫＤをいう。
タンパク質のアドネクチン結合に関連してここで使用する用語“ｋａ”は、アドネクチンのアドネクチン／タンパク質複合体への会合についての会合速度定数をいうことを意図する。
タンパク質のアドネクチン結合に関連してここで使用する用語“ｋｄ”は、アドネクチン／タンパク質複合体からのアドネクチンの解離についての解離速度定数をいうことを意図する。
アドネクチンに関連してここで使用する用語“ＩＣ５０”は、インビトロまたはインビボアッセイの何れかで、最大阻害応答の５０％であるレベルまで、すなわち、最大阻害応答と未処置応答の半分まで応答を阻害するアドネクチンの濃度をいう。
用語“ＰＫ”は、“薬物動態(pharmacokinetic)”の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝および排せつを含む、化合物の性質を包含する。ここで使用する“ＰＫ調節タンパク質”または“ＰＫ部分(moiety)”は、生物学的活性分子に融合したときまたはそれと共に投与したとき、該生物学的活性分子の薬物動態性質に影響するあらゆるタンパク質、ペプチドまたは部分をいう。ＰＫ調節タンパク質またはＰＫ部分の例は、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)結合剤(米国公報２００５／０２８７１５３および２００７／０００３５４９、ＰＣＴ公報ＷＯ２００９／０８３８０４およびＷＯ２００９／１３３２０８に開示のとおり)、ヒト血清アルブミンおよびそのバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアント、ＦｃまたはＦｃフラグメントおよびそのバリアントおよび糖(例えば、シアル酸)を含む。
タンパク質または化合物の“血清半減期”は、例えば、天然機構による配列または化合物の分解および／または配列または化合物のクリアランスまたは隔離による、インビボでの、ポリペプチドの血清濃度が５０％減少するまでにかかる時間である。半減期は、薬物動態分析などの、それ自体知られる任意の方法で決定され得る。適当な技法は当業者に明らかであり、例えば一般に対象に適当な用量のここに記載するアミノ酸配列または化合物を投与し、対象から一定間隔で血液サンプルまたは他のサンプルを得て、該血液サンプルにおけるここに記載するアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定し、そして、こうして得たデータ(のプロット)から、ここに記載するアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が、投与の初期レベルと比較して５０％まで減少する時間を計算することを含む。例えば、Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996)などの標準的ハンドブックを参照のこと。Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)もまた参照のこと。
半減期は、ｔ１／２－アルファ、ｔ１／２－ベータ、ＨＬ＿ラムダ＿ｚおよび曲線下面積(ＡＵＣ)などのパラメータを使用して表し得る。
用語“検出可能”は、背景シグナルを超えてシグナルを検出する能力をいう。用語“検出可能シグナル”は、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)などの、しかし、これに限定されない非侵襲性造影技法由来のシグナルである。検出可能シグナルは、検出可能であり、対象から生じ得る他の背景シグナルと区別可能である。換言すると、検出可能シグナルと背景との間に測定可能かつ統計的有意差がある(例えば、統計的有意差は、検出可能シグナルと背景の間の約０.１％、１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％または４０％またはそれ以上の差などの検出可能シグナルと背景の区別に十分な差異である)。標準および／または検量曲線を使用して、検出可能シグナルおよび／または背景の相対強度を決定し得る。
ここに記載する造影剤を含む組成物の“検出可能有効量”は、臨床使用で利用可能な装置を使用して、許容される画像を作成するのに十分な量として定義する。ここに提供する造影剤の検出可能有効量を、１回を超える注射で投与し得る。検出可能有効量は、個体の感受性の程度、個体の年齢、性別および体重、個体の特異な応答などの因子により変わり得る。造影組成物の検出可能有効量は、また使用する装置および方法によっても変わり得る。このような因子の最適化は、十分に当分野の技術レベルの範囲内である。ある実施態様において、ＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、ここに記載するものは、２またはそれ以上、例えば、３、４、５またはそれ以上の識別係数(すなわち、特異的シグナル対背景シグナル)を有する。
用語“生体直交型化学”は、天然生化学的過程を妨害せずに、生存系内で生じ得るあらゆる化学反応をいう。本用語は、水中でまたは水の存在下、インビトロで生理学的ｐＨで生じる化学反応である化学反応を含む。生体直交型と見なされるには、反応は選択的であり、出発化合物で見られる他の官能基との副反応を回避する。さらに、これら反応パートナー間の得られた共有結合は、強く、生物学的反応に化学的に不活性でなければならず、所望の分子の生物学的活性に影響してはならない。
用語“クリック化学”は、新規化合物およびコンビナトリアルライブラリの迅速な合成のための一連の信頼でき、かつ選択的な生体直交型反応をいう。クリック反応の性質は、生理学的条件下で安定な化合物を産生するための、モジュール性、範囲の広さ、高い収率、立体特異性および単純生成物単離(非クロマトグラフ法による不活性副産物からの分離)を含む。放射化学および放射薬品において、クリック化学は、選択的およびモジュラー構成要素を利用し、触媒なしで、生物学的に関連する化合物への放射標識の化学選択的結合を可能とする、一連の標識反応についての一般的用語である。“クリック反応”は銅を用いてよくまたは無銅クリック反応であり得る。
用語“補欠分子族”または“二機能性標識剤”は、ペプチドまたはタンパク質に結合され得る、放射性核種(例えば、１８Ｆ)を含む小有機分子をいう。
放射性医薬品化学に関連してここで使用する用語“キレーターリガンド”は、放射標識補欠分子族を生物活性ターゲティング分子(例えば、ペプチドまたはタンパク質)に共有結合により結合する、二機能性キレーターまたは接合(ＢＦＣ)部分(これらは、ここで相互交換可能に使用する)をいう。ＢＦＣは、アミドカップリングについてはカルボン酸または活性化エステル、チオ尿素カップリングについてはイソチオシアネートおよびチオールカップリングについてはマレイミドなどの官能基を使用する。
ここで相互交換可能に使用する用語“個体”、“対象”および“患者”は、ヒトをいう。
“癌”は、体内の非制御の異常細胞増殖により特徴付けられる、種々の疾患の広い一群をいう。非制御の細胞分裂および増殖分裂および増殖は、隣接組織を侵襲し、リンパ系または血流をとおって体の離れた場所に転移もし得る、悪性腫瘍の形成をもたらす。
“免疫応答”は、脊椎動物体内で、侵入病原体、病原体に感染された細胞もしくは組織、癌細胞もしくは他の異常細胞、またのは、自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織の選択的ターゲティング、結合、損傷、破壊および／または排出をもたらす、細胞または肝臓(Ａｂ、サイトカインおよび補体を含む)の何れかにより産生される、免疫系細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞および好中球)および可溶性巨大分子の作用をいう。
“免疫調節因子”は、免疫応答を制御する物質、薬剤、シグナル伝達経路またはその成分をいう。免疫応答の“制御”、“修飾”または“調節”は、免疫系の細胞またはそのような細胞の活性の何らかの変化をいう。このような制御は、種々の細胞型の数の増加または減少、これらの細胞の活性の向上または低下または免疫系内で生じ得る他の何らかの変化により顕在化し得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両方の免疫調節因子が同定されており、そのいくつかは、癌微小環境で機能が増強され得る。
用語“免疫療法”は、免疫応答の誘発、増強、抑制または他の修飾を含む方法による、疾患を有する、発症するもしくは再発するリスクにある対象の処置をいう。
対象の“処置”または“治療”は、疾患と関連する症状、合併症、状態もしくは生化学的徴候の発症、進行、発生、重症度もしくは再発の回復、軽減、寛解、阻止、遅延もしくは阻止を目的とする、対象へのあらゆるタイプの介入または実施される過程または活性剤の投与をいう。
抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンと関連してここで使用する“投与”または“投与する”は、ここに記載するＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはＰＤ－Ｌ１アドネクチンベースのプローブまたは標識プローブ(ここでは“造影剤”とも称する)の対象への導入をいう。あらゆる投与経路が適当であり、例えば、静脈内、経口、局所、皮下、腹腔、動脈内、吸入、膣、直腸、鼻腔、脳脊髄液への導入または体区画への注入が使用され得る。
用語“治療有効量”は、対象に治療的利益を与えるのに必要である、薬剤の少なくとも最小用量であるが、毒性用量未満をいう。
ここで使用する“有効量”は、所望の結果を達成するのに、必要な投与量および時間で、少なくとも有効である量をいう。
ここで使用する“十分量”は、所望の結果の達成に十分である量をいう。
ここで使用する“陽電子放出断層撮影”または“ＰＥＴ”は、トレーサーの体内位置の三次元画像を作成する、非侵襲性、核医学技術をいう。方法は、生物学的活性分子上に体内に導入されたポジトロン放出放射性核種(トレーサー)により間接的に放出されるガンマ線の対を検出する。ＰＥＴ造影ツールは、医薬品開発で広範な用途を有し、同じツールが前臨床および臨床の両方で使用し得るとの、特有のトランスレーショナル医療上の利点を有する。適用例は、標的のインビボ飽和の直接可視化；毒性または患者間変動予測のための、正常組織取り込みモニタリング；疾患組織定量；腫瘍転移；経時的薬物効果または経時的抵抗性モニタリングを含む。
概要
ここに提供されるのは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、放射標識などの異種分子にカップリングできる、ポリペプチドである。このようなポリペプチドは、例えば、診断アッセイのために、例えば、サンプルまたは組織、例えば、対象(例えば、ＰＤ－Ｌ１を選択的に発現する癌組織などの組織)における、ＰＤ－Ｌ１の検出に有用である。
本発明は、患者のＰＤ－Ｌ１発現の全身可視化を可能にする、非侵襲性臨床的造影剤の開発に基づく。ある実施態様において、患者の全身の一日“仮想的生検”が、ＰＤ－Ｌ１発現レベルのモニターおよび局在化のために実施される。ここに記載するＰＤ－Ｌ１造影剤は、一日で高コントラスト全身仮想的生検を提供するために使用され得る。
Ｉ. フィブロネクチンベースの足場
Ｆｎ３は、フィブロネクチンからのIII型ドメインをいう。Ｆｎ３ドメインは、小さく、単量体であり、可溶性であり、かつ安定である。ジスルフィド結合を欠き、それ故に、還元条件下安定である。Ｆｎ３は、全体的構造は免疫グロブリンフォールドに類する。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順で、ベータまたはベータ様鎖、Ａ；ループ、ＡＢ；ベータまたはベータ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；ベータまたはベータ様鎖、Ｃ；ループ、ＣＤ；ベータまたはベータ様鎖、Ｄ；ループ、ＤＥ；ベータまたはベータ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；ベータまたはベータ様鎖、Ｆ；ループ、ＦＧ；およびベータまたはベータ様鎖、Ｇを含む。７逆平行β鎖が２ベータシートとして配置され、これが安定なコアを形成し、同時にベータまたはベータ様鎖を接続するループからなる２“面”を作る。ループＡＢ、ＣＤおよびＥＦは一面に位置し(“南極”)、ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧは逆面に位置する(“北極”)。少なくとも１５の異なるＦｎ３モジュールがヒトフィブロネクチンにあり、モジュール間の配列相同性は低いが、全て三次構造で高度の類似性を共有する。
ここに記載するのは、溶媒到達可能ループの１以上が無作為化または変異されている、Ｆｎ３ドメインを含む抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンである。ある実施態様において、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンIII型ドメインの野生型第１０モジュール(１０Ｆｎ３)由来のＦｎ３ドメインである。
Figure 0007016323000004
 (配列番号１)(９４アミノ酸；ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループは下線を付す；コア１０Ｆｎ３ドメインはアミノ酸９(“Ｅ”)から始まり、アミノ酸９４(“Ｔ”)で終わり、８６アミノ酸ポリペプチドに対応する)。コア野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２に示す。
バリアントおよび野生型両方の１０Ｆｎ３タンパク質は、同一構造、すなわちＡ～Ｇと指定された７ベータ鎖ドメイン配列および７ベータ鎖ドメイン配列を接続する６ループ領域(ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧループ)により特徴付けられる。Ｎ末端およびＣ末端に最も近く位置するベータ鎖は、溶液でベータ様コンフォメーションをとり得る。配列番号１において、ＡＢループは残基１４～１７に対応し、ＢＣループは残基２３～３１に対応し、ＣＤループは残基３７～４７に対応し、ＤＥループは残基５１～５６に対応し、ＥＦループは残基６３～６７に対応し、ＦＧループは残基７５～８７に対応する。
従って、ある実施態様において、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、配列番号１に示すヒト１０Ｆｎ３ドメインまたは配列番号２に示すそのコア配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一である１０Ｆｎ３ポリペプチドである。ばらつきのほとんどは、一般にループの１以上またはベータ鎖の１以上またはＮ末端もしくはＣ末端領域で生じる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのベータ鎖またはベータ様鎖の各々は、本質的に配列番号１または２のベータ鎖またはベータ様鎖に対応する配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列からなるが、但しこのような多様性は生理学的条件でポリペプチドの安定性を妨害しない。
ある実施態様において、本発明は、フィブロネクチンIII型第１０(１０Ｆｎ３)ドメインを含む抗ヒトＰＤ－Ｌ１アドネクチンを提供し、ここで、１０Ｆｎ３ドメイはループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み；ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１ループを有する。“アドネクチン”は、非修飾ヒト１０Ｆｎ３ドメインにより結合されない標的に結合する修飾ヒト１０Ｆｎ３ドメインである。ある実施態様において、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、配列番号１または２の非ループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも1っのループが改変されている。ある実施態様において、ＢＣおよびＦＧループが改変されており、ある実施態様において、ＢＣおよびＤＥループが改変されており、ある実施態様において、ＤＥおよびＦＧループが改変されておりおよびある実施態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが改変されており、すなわち、１０Ｆｎ３ドメインは、天然に存在しないループを含む。ある実施態様において、ＡＢ、ＣＤおよび／またはＥＦループが改変されている。“改変”により、鋳型配列(対応するヒトフィブロネクチンドメイン)に対する１以上のアミノ酸配列改変を意味し、アミノ酸付加、欠失、置換またはそれらの組み合わせを含む。アミノ酸配列改変は、一般に、核酸コード配列の意図的、盲検的または自然配列変動により達成でき、あらゆる技法、例えば、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲまたは化学ＤＮＡ合成により生じ得る。
ある実施態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択された１以上のループが対応するヒトフィブロネクチンループと比較して長さが長くても、短くてもよい。ある実施態様において、ループ長は２～２５アミノ酸延長され得る。ある実施態様において、ループ長は１～１１アミノ酸減少され得る。抗原結合を最適化するために、それ故に、１０Ｆｎ３のループ長を、抗原結合において可能性のある最大の柔軟性および親和性を得るために、長さにおよび配列で改変し得る。
ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号１または２の非ループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である非ループ領域のアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインを含み、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１ループが改変されている。ある実施態様において、改変ＢＣループは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０までのアミノ酸置換、１、２、３または４までのアミノ酸欠失、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０までのアミノ酸挿入またはそれらの組み合わせを有する。
ある実施態様において、インテグリン結合モチーフ“アルギニン－グリシン－アスパラギン酸”(ＲＧＤ)(配列番号１のアミノ酸７８～８０)の１以上の残基は、インテグリン結合を破壊するために置換され得る。ある実施態様において、ここに提供するポリペプチドのＦＧループは、ＲＧＤインテグリン結合部位を含まない。ある実施態様において、ＲＧＤ配列は、極性アミノ酸－中性アミノ酸－酸性アミノ酸配列(Ｎ末端からＣ末端方向で)に置き換えられる。ある実施態様において、ＲＧＤ配列はＳＧＥに置き換えられる。ある実施態様において、ＲＧＤ配列はＲＧＥに置き換えられる。
ある実施態様において、フィブロネクチンベースの足場タンパク質は、一般に次の配列により定義される１０Ｆｎ３ドメインを含む。
Figure 0007016323000005
 ここで、ＡＢループは(Ｚ)ａにより表され、ＣＤループは(Ｚ)ｂにより表され、ＥＦループは(Ｚ)ｃにより表され、ＢＣループは(Ｚ)ｘにより表され、ＤＥループは(Ｚ)ｙにより表され、そしてＦＧループは(Ｚ)ｚにより表される。Ｚは任意のアミノ酸を表し、Ｚの後の下付き文字は、アミノ酸数の整数を表す。特に、ａは１～１５、２～１５、１～１０、２～１０、１～８、２～８、１～５、２～５、１～４、２～４、１～３、２～３または１～２アミノ酸のどこかであってよく；そしてｂ、ｃ、ｘ、ｙおよびｚは各々独立して２～２０、２～１５、２～１０、２～８、５～２０、５～１５、５～１０、５～８、６～２０、６～１５、６～１０、６～８、２～７、５～７または６～７アミノ酸のどこかであってよい。ベータ鎖の配列は、配列番号１または２に示す対応するアミノ酸に対して、全７足場領域にわたり、０～１０、０～８、０～６、０～５、０～４、０～３、０～２または０～１のどこかの置換、欠失または付加を有し得る。ある実施態様において、ベータ鎖の配列は、配列番号１または２に示す対応するアミノ酸に対して、全７足場領域にわたり、０～１０、０～８、０～６、０～５、０～４、０～３、０～２または０～１のどこかの保存的置換を有し得る。ある実施態様において、コアアミノ酸残基は固定され、あらゆる置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは１０Ｆｎ３足場に基づき、一般に次の配列により定義される。
EVVAATPTSLLISW(Z)xYRITYGETGGNSPVQEFTV(Z)yATISGLKPGVDYTITVYA(Z)zISINYRT(配列番号４)
ここで、ＢＣループは(Ｚ)ｘにより表され、ＤＥループは(Ｚ)ｙにより表され、そしてＦＧループは(Ｚ)ｚにより表される。Ｚは任意のアミノ酸を表し、Ｚの後の下付き文字は、アミノ酸数の整数を表す。特に、ｘ、ｙおよびｚは各々独立して２～２０、２～１５、２～１０、２～８、５～２０、５～１５、５～１０、５～８、６～２０、６～１５、６～１０、６～８、２～７、５～７または６～７アミノ酸のどこかであってよい。好ましい実施態様において、ｘは１１アミノ酸であり、ｙは６アミノ酸であり、そしてｚは１２アミノ酸である。ベータ鎖の配列は、配列番号１または２に示す対応するアミノ酸に対して、全７足場領域にわたり、０～１０、０～８、０～６、０～５、０～４、０～３、０～２または０～１のどこかの置換、欠失または付加を有し得る。ある実施態様において、ベータ鎖の配列は、配列番号１または２に示す対応するアミノ酸に対して、全７足場領域にわたり、０～１０、０～８、０～６、０～５、０～４、０～３、０～２または０～１のどこかの保存的置換を有し得る。ある実施態様において、コアアミノ酸残基、例えば、１以上のループの外は固定され、あらゆる置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み得て、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの少なくとも１つが改変されている。上記のとおり、配列番号１の残基２３～３１、５１～５６および７５～８７に対応するアミノ酸残基は、それぞれＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを規定する。しかしながら、所望の標的(例えば、ＰＤ－Ｌ１)に対する強い親和性を有する１０Ｆｎ３バインダーを達成するために、ループ領域内の全ての残基の修飾を必要とするわけではないことが理解されるべきである。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号２１、２２および２３に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号２１、２２および２３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号３６、３７および３８に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号３６、３７および３８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号５１、５２および５３に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号５１、５２および５３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号６６、６７および６８に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号６６、６７および６８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号６、７および８に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号８１、８２および８３に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号８１、８２および８３のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９７、９８および９９に示すＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号９７、９８および９９のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは配列番号３または４に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより表されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、それぞれ配列番号１１３、１１４および１１５；それぞれ配列番号１２４、１２５および１２６；それぞれ配列番号１３５、１３６および１３７；それぞれ配列番号１４６、１４７および１４８；それぞれ配列番号１５７、１５８および１５９；それぞれ配列番号１６８、１６９および１７０；それぞれ配列番号１７９、１８０および１８１；それぞれ配列番号１９０、１９１および１９２；それぞれ配列番号２０１、２０２および２０３；それぞれ配列番号２１２、２１３および２１４；それぞれ配列番号２２３、２２４および２２５；それぞれ配列番号２３４、２３５および２３６；それぞれ配列番号２４５、２４６および２４７；それぞれ配列番号２５６、２５７および２５８；それぞれ配列番号２６７、２６８および２６９；それぞれ配列番号２７８、２７９および２８０；それぞれ配列番号２８９、２９０および２９１；それぞれ配列番号３００、３０１および３０２；それぞれ配列番号３１１、３１２および３１３；それぞれ配列番号３２２、３２３および３２４；それぞれ配列番号３３３、３３４および３３５；それぞれ配列番号３４４、３４５および３４６；それぞれ配列番号３５５、３５６および３５７；それぞれ配列番号３６６、３６７および３６８；それぞれ配列番号３７７、３７８および３７９；それぞれ配列番号３８８、３８９および３９０；それぞれ配列番号３９９、４００および４０１；それぞれ配列番号４１０、４１１および４１２；それぞれ配列番号４２１、４２２および４２３；それぞれ配列番号４３２、４３３および４３４；それぞれ配列番号４４３、４４４および４４５；それぞれ配列番号４５４、４５５および４５６；それぞれ配列番号４６５、４６６および４６７；それぞれ配列番号４７６、４７７および４７８；それぞれ配列番号４８７、４８８および４８９；それぞれ配列番号４９８、４９９および５００；それぞれ配列番号５０９、５１０および５１１；それぞれ配列番号５２０、５２１および５２２；それぞれ配列番号５３１、５３０および５３１；それぞれ配列番号５４２、５４３および５４４；それぞれ配列番号５５３、５５４および５５５；またはそれぞれ配列番号５６４、５６５および５６６のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。このような抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの足場領域は、配列番号４の足場アミノ酸残基と比較して、０～２０、０～１５、０～１０、０～８、０～６、０～５、０～４、０～３、０～２または０～１のどこかの置換、保存的置換、欠失または付加を含み得る。このような足場修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンが所望のＫＤでＰＤ－Ｌ１に結合できる限り、製造し得る。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＢＣループは、６、２１、３６、５１、６６、８１および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＤＥループは、７、２２、３７、５２、６７、８２および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＦＧループは、８、２３、３８、５３、６８、８３および９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、それぞれ配列番号６、２１、３６、５１、６６、８１および９７；配列番号７、２２、３７、５２、６７、８２および９８；および配列番号８、２３、３８、５３、６８、８３および９９の何れかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、配列番号５、２０、３５、５０、６５、８０、９６、１１２、１２３、１３４、１４５、１５６、１６７、１７８、１８９、２００、２１１、２２２、２３３、２４４、２５５、２６６、２７７、２８８、２９９、３１０、３２１、３３２、３４３、３５４、３６５、３７６、３８７、３９８、４０９、４２０、４３１、４４２、４５３、４６４、４７５、４８６、４９７、５０８、５１９、５３０、５４１、５５２および５６３の何れかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、５、２０、３５、５０、６５、８０または９６の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、配列番号９～１５、２４～３０、３９～４５、５４～６０、６９７５、８４～９１、１００～１０７、１１６～１２２、１２７～１３３、１３８～１４４、１５０～１５５、１６０～１６６、１７１～１７７、１８２～１８８、１９３～１９９、２０４～２１０、２１５～２２１、２２７～２３２、２３７～２４３、２４８～２５４、２５９～２６５、２７１～２７６、２９１～２８７、２９２～２９８、３０３～３０９、３１４～３２０、３２５～３３１、３３７～３４２、３４７～３５３、３５８～３６４、３６９～３７５、３８０～３８６、３９１～３９７、４０２～４０８、４１３～４１９、４２４～４３０、４３５～４４１、４４６～４５２、４５７～４６３、４６８～４７４、４７９～４８５、４９０～４９６、５０１～５０７、５１２～５１８、５２３～５２９、５３４～５４０、５４５～５５１および５５６－５６２の何れかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、配列番号９～１５、２４～３０、３９～４５、５４～６０、６９～７５、８４～９１および１００～１０７の何れかの非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、それぞれ配列番号６、７および８に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、それぞれ配列番号２１、２２および２３に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、それぞれ配列番号３６、３７および３８に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、それぞれ配列番号５１、５２および５３に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、それぞれ配列番号６６、６７および６８に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、それぞれ配列番号８１、８２および８３に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、それぞれ配列番号９７、９８および９９に示すＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、ここに記載するＢＣ、ＤＥおよび／またはＦＧループアミノ酸配列(例えば、それぞれ配列番号６、２１、３６、５１、６６、８１および９７；配列番号７、２２、３７、５２、６７、８２および９８；および配列番号８、２３、３８、５３、６８、８３および９９)を、非１０Ｆｎ３ドメインタンパク質足場に移植する。例えば、１以上のループアミノ酸配列を、抗体重鎖または軽鎖またはそのフラグメントの１以上のＣＤＲループと交換するかまたはそれに挿入する。ある実施態様において、１以上のアミノ酸ループ配列が交換または挿入されたタンパク質ドメインは、コンセンサスＦｎ３ドメイン(Centocor, US)、アンキリン反復タンパク質(Molecular Partners AG, Zurich Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd, Cambridge, MA)、単一ドメインラクダ類ナノボディ(Ablynx, Belgium)、リポカリン(例えば、アンチカリン；Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、アビマー(Amgen, CA)、アフィボディ(Affibody AG, Sweden)、ユビキチン(例えば、アフィリン；Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)、タンパク質エピトープ模倣物(Polyphor Ltd, Allschwil, Switzerland)、ヘリックス束足場(例えばアルファボディ、Complix, Belgium)、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメイン(Covagen AG, Switzerland)またはアトリマー(Anaphor, Inc., CA)を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、ここに提供するポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端領域のアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応する領域のアミノ酸配列(配列番号１または２)と比較して、欠失、置換または挿入により修飾され得る。１０Ｆｎ３ドメインは、一般に配列番号１アミノ酸番号１から始まる。しかしながら、アミノ酸欠失を有するドメインも本発明により包含される。さらなる配列も、配列番号１または２のアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端またはＣ末端に付加し得る。例えば、ある実施態様において、Ｎ末端伸長は、Ｍ、ＭＧおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。ある実施態様において、ＭＧ配列は、配列番号１により定義される１０Ｆｎ３のＮ末端に配置され得る。Ｍは通常開裂され、Ｎ末端にＧが残る。さらに、Ｍ、ＧまたはＭＧは、表３に示すＮ末端伸長の何れかのＮ末端にも配置され得る。
実施態様の例示において、１～２０、１～１５、１～１０、１～８、１～５、１～４、１～３、１～２または１アミノ酸長を有する改変Ｎ末端領域を配列番号１または２のＮ末端領域または表３に示す任意のアドネクチンに付加し得る。例示的改変Ｎ末端領域は、(１文字アミノ酸コードにより表す)Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ(配列番号５７４)およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ(配列番号５７５)を含む。例えば、アドネクチンコア配列のＮ末端に結合し得る他の適当な改変Ｎ末端領域は、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ(配列番号５７６)、ＸｎＤＶＰＲＤＬ(配列番号５７７)、ＸｎＶＰＲＤＬ(配列番号５７８)、ＸｎＰＲＤＬ(配列番号５７９)、ＸｎＲＤＬ(配列番号５８０)、ＸｎＤＬ(配列番号５８１)またはＸｎＬを含み、ここで、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ここで、ｎ＝１であるとき、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２であるとき、ＸはＭｅｔ－Ｇｌｙである。１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端にＭｅｔ－Ｇｌｙ配列が添加されたとき、Ｍは通常開裂され、Ｎ末端にＧが残る。ある実施態様において、改変Ｎ末端領域はアミノ酸配列ＭＡＳＴＳＧ(配列番号５８２)を含む。
実施態様の例示において、１～２０、１～１５、１～１０、１～８、１～５、１～４、１～３、１～２または１アミノ酸長を有する改変Ｃ末端領域が、配列番号１または２のＣ末端領域または表３に示す任意のアドネクチンに付加され得る。改変Ｃ末端領域配列具体例は、例えば、ＥＩＥＫ(配列番号５８４)、ＥＧＳＧＣ(配列番号５８５)、ＥＩＥＫＰＣＱ(配列番号５８６)、ＥＩＥＫＰＳＱ(配列番号５８７)、ＥＩＥＫＰ(配列番号５８８)、ＥＩＥＫＰＳ(配列番号５８９)またはＥＩＥＫＰＣ(配列番号５９０)を含む、本質的にこれからなるまたはこれからなる、ポリペプチドを含む。ある実施態様において、改変Ｃ末端領域はＥＩＤＫ(配列番号５９１)を含み、特定の実施態様において、改変Ｃ末端領域はＥＩＤＫＰＣＱ(配列番号５９２)またはＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号５９３)である。さらなる適当な改変Ｃ末端領域は、配列番号５９４～６１８に示す。
ある実施態様において、アドネクチンは、ＥおよびＤ残基を含み、８～５０、１０～３０、１０～２０、５～１０～２～４アミノ酸長であり得るＣ末端伸長配列に結合される。ある実施態様において、テイル配列は、配列がＥＤのタンデム反復を含むＥＤベースのリンカーを含む。実施態様の例示において、テイル配列は、２～１０、２～７、２～５、３～１０、３～７、３～５、３、４または５ ＥＤ反復を含む。ある実施態様において、ＥＤベースのテイル配列は、さらに、例えば、ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳおよびＥＧＣなどのさらなるアミノ酸残基を含み得る。このような配列は、一部、残基ＤおよびＫが除去されているＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号５９３)などの既知アドネクチンテイル配列に基づく。実施態様の例示において、ＥＤベースのテイルは、ＥＤ反復前にＥ、ＩまたはＥ１残基を含む。
ある実施態様において、Ｎ末端またはＣ末端伸長配列を、既知リンカー配列(例えば、表３における配列番号６２９～６７８)で抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン配列に結合する。ある実施態様において、配列は、薬物動態部分の結合を促進するために、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に位置し得る。例えば、ＧＳＧＣ(配列番号６３８)などのシステイン含有リンカーを、システイン残基の部位特異的ペグ化を促進するために、Ｃ末端に付加し得る。
ある実施態様において、Ｃ末端アミノ酸ＲＴ(すなわち、アミノ酸９４)に結合し得る改変Ｃ末端部分は、アミノ酸ＰｍＸｎを含み、ここで、Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１の整数であり、ｎは０または少なくとも１の整数である。ある実施態様において、改変Ｃ末端部分は、アミノ酸ＰＣを含む。ある実施態様において、改変Ｃ末端部分は、アミノ酸ＰＩ、ＰＣ、ＰＩＤ、ＰＩＥ、ＰＩＤＫ(配列番号６０５)、ＰＩＥＫ(配列番号６０６)、ＰＩＤＫＰ(配列番号６０７)、ＰＩＥＫＰ(配列番号６０８)、ＰＩＤＫＰＳ(配列番号６０９)、ＰＩＥＫＰＳ(配列番号６１０)、ＰＩＤＫＰＣ(配列番号６１１)、ＰＩＥＫＰＣ(配列番号６１２)、ＰＩＤＫＰＳＱ(配列番号６１３)、ＰＩＥＫＰＳＱ(配列番号６１４)、ＰＩＤＫＰＣＱ(配列番号６１５)、ＰＩＥＫＰＣＱ(配列番号６１６)、ＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号６１７)およびＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号６１８)を含む。Ｃ末端にＰＣを有する例示的抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、実施例および表３に提供する。
ある実施態様において、ここに記載するアドネクチンは、６×ｈｉｓテイル(配列番号６１９)を有する。
ある実施態様において、フィブロネクチンベースの足場タンパク質は、改変Ｎ末端領域配列および改変Ｃ末端領域配列の両方を有する１０Ｆｎ３ドメインおよび所望により６×ｈｉｓテイルを含む。
ＩＩ. 抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの生物学的性質
ここに提供されるのは、例えば、ＳＰＲ(Biacore)により決定して、１０nM、１nM、０.５nM、０.１nMまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、次の性質の１以上を示すアドネクチンである。
１. 例えば、ヒトＰＤ－１Ｆｃタンパク質およびＬ２９８７細胞などのヒトＰＤ－Ｌ１陽性細胞を使用する、例えば、フローサイトメトリーにより決定して、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１の相互作用を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
２. 例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定して、ヒトＣＤ８０(Ｂ７－１)のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
３. 例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１２Ａ４(例えば、米国特許７,９４３,７４３に記載)のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；および
４. 混合リンパ球反応(ＭＬＲ)における細胞増殖を阻害する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは１nMまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、性質１～４の何れか１つを示す。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは０.１nMまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、性質１～４の何れか１つを示す。
ここに提供されるのは、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその一部(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、ＳＰＲ(Biacore)により決定して、１０nM、１nM、０.５nM、０.１nMまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、次の性質の１以上を示すアドネクチンである。
１. 例えば、ヒトＰＤ－１Ｆｃタンパク質およびＬ２９８７細胞などのヒトＰＤ－Ｌ１陽性細胞を使用する、例えば、フローサイトメトリーにより決定して、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１の相互作用を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
２. 例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定して、ヒトＣＤ８０(Ｂ７－１)のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
３. 例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１２Ａ４のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；および
４. 混合リンパ球反応(ＭＬＲ)における細胞増殖を阻害する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンはここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその一部(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、１nM以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、性質１～４の何れか１つを示す。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンはここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその一部(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、０.１nM以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、性質１～４の何れか１つを示す。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、特定のここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンと、ＰＤ－Ｌ１への結合について競合(例えば、交差競合)する。このような競合アドネクチンは、標準ＰＤ－Ｌ１結合アッセイにおいてここに記載するアドネクチンのＰＤ－Ｌ１への結合を競合的に阻害するその能力に基づき、同定され得る。例えば、組み換えＰＤ－Ｌ１タンパク質がプレートに固定化され、アドネクチンの一方が蛍光標識され、非標識アドネクチンが標識アドネクチンの結合を競合して阻害する能力を評価する、標準ＥＬＩＳＡアッセイが使用され得る。
ある実施態様において、競合的ＥＬＩＳＡ形式を実施して、２抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンがＰＤ－Ｌ１の重複するアドネクチン結合部位に結合するか否かを決定できる。ある形式において、アドネクチン＃１はプレート上に被覆され、これが次いで遮断および洗浄される。このプレートにＰＤ－Ｌ１単独または飽和濃度のアドネクチン＃２とプレインキュベートしたＰＤ－Ｌ１が添加される。適当なインキュベーション時間後、プレートを洗浄し、ビオチニル化抗ＰＤ－Ｌ１ポリクローナル抗体などのポリクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体でプローブし、続いてストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲートおよび標準テトラメチルベンジジン発色法で検出する。アドネクチン＃２とプレインキュベーションしてもしなくてもＯＤシグナルが同一であるならば、それら２アドネクチンは互いに独立して結合し、それらのアドネクチン結合部位は重複しない。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１／アドネクチン＃２混合物を入れたウェルのＯＤシグナルがＰＤ－Ｌ１単独を入れたウェルより低いならば、アドネクチン＃２の結合は、アドネクチン＃１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断すると確認される。
あるいは、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ、例えば、BIACORE)により、類似の実験を行う。アドネクチン＃１をＳＰＲチップ表面に固定化し、続いて、ＰＤ－Ｌ１単独または飽和濃度のアドネクチン＃２とプレインキュベートしたＰＤ－Ｌ１を注入する。ＰＤ－Ｌ１／アドネクチン＃２混合物の結合シグナルがＰＤ－Ｌ１単独と同一かそれより高いならば、それら２アドネクチンは互いに独立して結合し、それらのアドネクチン結合部位は重複しない。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１／アドネクチン＃２混合物の結合シグナルがＰＤ－Ｌ１単独の結合シグナルより低いならばアドネクチン＃２の結合は、アドネクチン＃１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断すると確認される。これらの実験の特色は、飽和濃度のアドネクチン＃２の使用である。ＰＤ－Ｌ１がアドネクチン＃２で飽和されていないならば、上記結論は維持されない。類似実験を使用して、あらゆる２ＰＤ－Ｌ１結合タンパク質が重複アドネクチン結合部位に結合するか否かを決定できる。
上に例示した両アッセイとも、アドネクチン＃２を固定化し、ＰＤ－Ｌ１－アドネクチン＃１がプレートに添加される逆順でも実施し得る。あるいは、アドネクチン＃１および／または＃２を、モノクローナル抗体および／または可溶性受容体－Ｆｃ融合タンパク質と置き換え得る。
ある実施態様において、ＨＴＲＦサンドイッチアッセイを使用して、競合を決定し得る。
ある実施態様において、競合アドネクチンは、特定のここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンとＰＤ－Ｌ１上の同一アドネクチン結合部位に結合するアドネクチンである。プロテアーゼマッピング、変異解析、ＨＤＸ－ＭＳ、ｘ線晶学および２次元核磁気共鳴などの標準マッピング技法を使用して、アドネクチンが対照アドネクチンと同一アドネクチン結合部位またはエピトープに結合するか否かを決定し得る(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。エピトープは、それを配置させるための方法により規定される。例えば、ある実施態様において、ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたは抗体は、ＨＤＸ－ＭＳにより決定してまたはＸ線晶学により決定して、ＰＤ－Ｌ１ここに記載するアドネクチンの１つと同一エピトープに結合する。
候補競合抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％阻害できおよび／またはその結合が抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンにより少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％阻害される。％競合は、上記方法を使用して決定され得る。
ここに提供されるのは、例えば、ＳＰＲ(Biacore)により決定して、１０nM、１nM、０.５nM、０.１nMまたはそれ以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、次の性質の１以上を示すアドネクチンである：
１. 例えば、ヒトＰＤ－１Ｆｃタンパク質およびＬ２９８７細胞などのヒトＰＤ－Ｌ１陽性細胞を使用する、例えば、フローサイトメトリーにより決定して、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１の相互作用を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
２. 例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定して、ヒトＣＤ８０(Ｂ７－１)のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
３. 例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１２Ａ４のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
４. 混合リンパ球反応(ＭＬＲ)における細胞増殖を阻害する；および
５. ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１抗体と、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合について競合する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、ヒトＰＤ－Ｌ１に１nM以下のＫＤで結合し、性質１～５の何れか１つを示す。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは０.１nMまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、性質１～５の何れか１つを示す。
ここに提供されるのは、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその一部(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、ＳＰＲ(Biacore)により決定して、１０nM、１nM、０.５nM、０.１nMまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、次の性質の１以上を示すアドネクチン：
１. 例えば、ヒトＰＤ－１Ｆｃタンパク質およびＬ２９８７細胞などのヒトＰＤ－Ｌ１陽性細胞を使用する、例えば、フローサイトメトリーにより決定して、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１の相互作用を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
２. 例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定して、ヒトＣＤ８０(Ｂ７－１)のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
３. 例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１２Ａ４のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害する；
４. 混合リンパ球反応(ＭＬＲ)における細胞増殖を阻害する；および
５. ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１抗体と、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合について競合する。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその一部(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ヒトＰＤ－Ｌ１に１nMまたはそれ未満のＫＤで結合し、性質１～５の何れか１つを示す。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンはここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその一部(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、０.１nMまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、性質１～５の何れか１つを示す。
III. 薬物動態部分を含む融合物
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、望ましくは例えば、ＰＥＴ造影に使用するとき、短半減期を有する。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、３０分～３時間、３０分～１２０分、６０分～１２０分または８０分～１００分の血中または血清半減期を有する。ある実施態様において、ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの半減期は、それに結合した標識、例えば、１８Ｆに類似する。
ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、薬物動態(ＰＫ)部分を含み得る。薬物動態改善は、認知される治療必要性により評価し得る。抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを、非修飾抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンと比較して、ヒトにおけるポリペプチドのクリアランス速度を２倍以上、３倍以上、４倍以上または５倍以上減少させる部分と結合させ得る。薬物動態改善の他の測定値は、しばしばアルファ相およびベータ相に分けられる、血清半減期を含む。相の何れかまたは両方が、適切な部分の添加により顕著に改善され得る。例えば、ＰＫ部分は、ポリペプチドの血清半減期を、Ｆｎ３ドメイン(またはアドネクチン)単独と比較して、１０％、２０％、５０％、２倍、３倍または５倍延長し得る。
ここでは“ＰＫ部分”と称するタンパク質の血中からのクリアランスを遅延させる部分は、ポリオキシアルキレン部分(例えば、ポリエチレングリコール)、糖(例えば、シアル酸)および耐容性良好であるタンパク質部分(例えば、Ｆｃおよびそのフラグメントおよびバリアント、トランスフェリンまたは血清アルブミン)を含む。本発明で使用し得る他のＰＫ部分は、Kontermann et al., (Current Opinion in Biotechnology 2011;22:868-76)引用により本明細書に包含させる)に記載されるものを含む。このようなＰＫ部分は、ＰＡＳ融合物(すなわち、３アミノ酸プロリン、アラニンおよびセリンに基づく組み換えＰＥＧ模倣物)、炭水化物コンジュゲート(例えば、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ))、グリコシル化、ポリシアル酸コンジュゲートおよび脂肪酸コンジュゲートを含むが、これらに限定されない。
IV. 核酸－タンパク質融合テクノロジー
ある態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に結合するフィブロネクチンIII型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特定の結合性質を有するＦｎ３ドメインを迅速に製造し、試験する１つの方法は、Adnexus、Bristol-Myers Squibb R&D Companyの核酸－タンパク質融合テクノロジーである。この開示は、‘PROfusion’と称されるインビトロ発現およびタグ付けテクノロジーを使用し、これは、タンパク質の結合に重要な新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフの同定のために、核酸－タンパク質融合物(ＲＮＡ－およびＤＮＡ－タンパク質融合物)を利用する。核酸－タンパク質融合テクノロジーは、タンパク質をそのコード化遺伝子情報と共有結合的に結合させるテクノロジーである。ＲＮＡ－タンパク質融合テクノロジーおよびフィブロネクチンベースの足場タンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細について、Szostak et al.、米国特許,２５８,５５８、６,２６１,８０４、６,２１４,５５３、６,２８１,３４４、６,２０７,４４６、６,５１８,０１８および６,８１８,４１８；Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997;94:12297-12302; およびKurz et al., Molecules, 2000;5:1259-64を参照のこと(これら全て引用により本明細書に包含させる)。
Ｖ. ベクターおよびポリヌクレオチド
本発明にまた包含されるのは、ここに記載するタンパク質の何れかをコードする核酸配列である。当業者には明らかなとおり、第三塩基縮重のため、コードヌクレオチド配列においてほとんど全てのアミノ酸が１を超えるトリプレットコドンにより表され得る。さらに、微小な塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列の保存的置換をもたらし得るが、遺伝子産物の生物学的活性を実質的に変えることは期待されない。それ故に、ここに記載するタンパク質をコードする核酸配列において、配列をわずかに修飾し、なお、その各遺伝子産物をコードさせ得る。ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンおよびその融合物をコードするある例示的核酸は、配列番号１６～１９、３１～３４、４６～４９、６１～６４、７６～７９、９２～９５および１０８～１１１に示す配列を有する核酸を含む。
また企図されるのは、配列番号１６～１９、３１～３４、４６～４９、６１～６４、７６～７９、９２～９５および１０８～１１１と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、ＰＤ－Ｌ１に結合するタンパク質をコードする核酸配列である。ある実施態様において、得られた翻訳アミノ酸配列を変えないように、ヌクレオチド置換が導入される。
ここに記載する種々のタンパク質またはポリペプチドの何れかをコードする核酸を化学合成し得る。細胞における発現を改善するために、コドン使用頻度を選択し得る。このようなコドン使用頻度は細胞型選択による。特定化コドン使用頻度パターンは、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞について検討されている。例えばMayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (October 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (October 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (September 1996); and Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (October 1991)参照。
核酸操作の一般的技法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), or Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)および定期的最新版(引用により本明細書に包含させる)に記載されている。一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節エレメントと操作可能に結合させる。このような調節エレメントは、転写プロモーター、任意の転写を制御するためのオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の停止を制御する配列を含む。通常複製起点により付与される宿主で複製する能力および形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子がさらに取り込まれる。
ここに記載するタンパク質を、直接的だけでなく、また、好ましくは成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的開裂部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組み換えにより産生できる。選択異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識および処理(すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂)されるものである。哺乳動物系でのポリペプチド産生のための例示的Ｎ末端リーダー配列は、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ(配列番号５８３)であり、これは、発現後宿主細胞により除去される。
天然シグナル配列を認識および処理しない原核宿主細胞について、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ ｐｐまたは熱安定エンテロトキシンIIリーダーから選択される、原核シグナル配列に置き換える。
酵母分泌について、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー(サッカロミセスおよびクリベロマイセスアルファ－因子リーダーを含む)または酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンスグルコアミラーゼリーダーまたは米国特許５,６３１,１４４に記載のシグナル配列に置き換える。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域についてのＤＮＡを、リーディングフレーム内で、タンパク質をコードするＤＮＡにライゲートし得る。
発現およびクローニング両方のベクターは、ベクターを１以上の選択宿主細胞で複製可能とする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主染色体ＤＮＡと無関係にベクターの複製を可能とするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適し、２ミクロンプラスミド起点は酵母に適し、種々のウイルス起点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターに必要ではない(ＳＶ４０起点は、それが初期プロモーターを含むことのみを理由として、一般に使用される)。
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的選択遺伝子は、(ａ)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに耐性を与える、(ｂ)栄養要求欠損を補うまたは(ｃ)複合体媒体から利用可能ではない必須栄養素を提供するタンパク質をコードする、例えば、桿菌についてはＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
発現およびクローニングベクターは、通常宿主生物により認識され、ここに記載するタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースの足場タンパク質をコードする核酸に操作可能に結合される、プロモーターを含む。原核宿主での使用に適するプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ－ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系およびｔａｎプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、他の既知細菌プロモーターが適する。細菌系で使用するプロモーターは、ここに記載するタンパク質をコードするＤＮＡに操作可能に結合したシャイン・ダルガノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含む。真核生物についてのプロモーター配列は知られる。事実上全真核生物遺伝子は、転写が開始される位置から約２５～３０塩基上流にＡＴ富領域を有する。多くの遺伝子の転写が開始される位置から７０～８０塩基上流に見られる他の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域(ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る)である。大部分の真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これら配列の全ては、真核生物発現ベクターに好適に挿入される。
酵母宿主で使用するための適当な促進配列の例は、３－ホスホグリセラートキナーゼまたはエノラーゼ、グリセロアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－ホスフェートイソメラーゼ、３－ホスホグリセラートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のプロモーターを含む。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス４０(ＳＶ４０)などのウイルスのゲノムから得たプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターにより制御され得るが、ただし、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。
高等真核生物によるここに記載するタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより、増加される。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から知られる(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトタンパク質およびインスリン)。一般に、しかしながら、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例は、複製起点遅発側のＳＶ４０エンハンサー(ｂｐ １００～２７０)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点遅発側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーター活性化のための増強要素について、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)も参照のこと。エンハンサーは、ペプチドコード化配列に対して５’位または３’位でベクターにスプライスされるが、好ましくはプロモーターから５’位に位置する。
真核生物宿主細胞(例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞)で使用する発現ベクターはまた転写停止およびｍＲＮＡに必要な配列も含む。このような配列は、一般に真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡからの５’、そして時折３’、非翻訳領域から入手可能である。これら領域は、ここに記載するタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写停止成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそれに開示の発現ベクター参照。
組み換えＤＮＡはまた、タンパク質精製に有用であり得る、あらゆるタイプのタンパク質タグ配列も含み得る。タンパク質タグの例は、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグを含むが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985))に見ることができ、その関連する開示は、引用により本明細書に包含させる
発現構築物を、当業者に明らかなとおり、宿主細胞に適する方法を使用して、宿主細胞に導入する。宿主細胞に核酸を導入するための種々の方法は当分野で知られ、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染(ベクターが感染因子であるとき)を含むが、これらに限定されない。
適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞を含む。適当な細菌は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または桿菌属を含む。好ましくはサッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロミセス属からの酵母もポリペプチドの産生に使用し得る。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系も、組み換えタンパク質発現のために用い得る。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988))によりレビューされている。適当な哺乳動物宿主細胞株の例は、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)、ヒト胚腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株を含む。精製ポリペプチドを、組み換えタンパク質の発現のために、適当な宿主／ベクター系を培養することにより製造する。多くの適用について、ここに記載するポリペプチドの多くの小さいサイズが、発現の好ましい方法として、大腸菌で発現される。次いで、タンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製する。
VI. タンパク質産生
またここに記載するのは、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその融合ポリペプチドを発現する細胞株である。抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを産生する細胞株の創生および単離は、ここに記載のような、当分野で知られる標準技法を使用して達成され得る。
宿主細胞を、タンパク質産生のためにここに記載する発現またはクローニングベクターでトランスフォームし、誘発プロモーターに適するように修飾した慣用の栄養培地で培養し、形質転換体を選択するかまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。
本発明のアドネクチンはまた、例えば、原核細胞(例えば、大腸菌)におけるアドネクチンの産生により、非グリコシル化形態でも得られる。注目すべきことに、ここに記載するアドネクチンの非グリコシル化形態は、インビトロで試験したとき、グリコシル化アドネクチンと同一の親和性、効力および作用機序を示す。
本発明のタンパク質の産生に使用する宿主細胞は、種々の培地で培養し得る。ハムＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)(Sigma)、ＲＰＭＩ－１６４０(Sigma)およびダルベッコ改変イーグル培地((ＤＭＥＭ)(Sigma))などの市販の培地が。宿主細胞培養に適する。さらに、Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980)、米国特許４,７６７,７０４、４,６５７,８６６、４,９２７,７６２、４,５６０,６５５、５,１２２,４６９、６,０４８,７２８、５,６７２,５０２または米国特許ＲＥ３０,９８５に記載の多くの培地が、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地の何れも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子)、塩(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩)、緩衝液(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシン薬物)、微量元素(通常マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)およびグルコースまたは同等のエネルギー源を添加し得る。任意の他の必要な添加物も適切な濃度で包含され得て、これは当業者に知られる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のための宿主細胞選択について先に用いたものであり、当業者に知られる。
ここに記載するタンパク質は、無細胞翻訳系を使用しても産生され得る。このような目的で、ポリペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡを産生するためにインビトロ転写を可能とするためにおよび利用する特定の無細胞系(哺乳動物または酵母無細胞翻訳系などの真核生物または細菌無細胞翻訳系などの原核生物)におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能とするために、修飾されなければならない。
ここに記載するタンパク質は、化学合成によっても産生できる(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)に記載の方法により)。タンパク質への修飾も、化学合成により実施され得る。
本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られるタンパク質の単離／精製方法により精製され得る。非限定的例は、抽出、再結晶、塩析(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムで)、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組み合わせを含む。精製後、ポリペプチドを、濾過および透析を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる種々の方法の何れかによる異なる緩衝液への交換および／または濃縮をすることができる。
精製ポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％純度または好ましくは少なくとも９５％純度および最も好ましくは少なくとも９８％純度である。純度の正確な数値とは無関係に、ポリペプチドは、医薬品として使用するのに十分に純粋である。
ハイスループットタンパク質産生(ＨＴＰＰ)
選択結合剤を、ＨＩＳ６タグの上流にＰＥＴ９ｄベクターにクローン化し、大腸菌BL21 DE3 plysS細胞にトランスフォームし、５０μg／mL カナマイシン含有５ml ＬＢ培地に、２４ウェル形式で接種し、３７℃で一夜インキュベートする。新鮮５ml ＬＢ培地(５０μg／mL カナマイシン)培養物を、一夜培養物から２００μlの吸引により、誘導性発現のために調製し、適切なウェルに分配する。培養物を、３７℃でＡ６００ ０.６～０.９まで増殖させる。１mMイソプロピル－β－チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)で誘導後、培養物を、６時間、３０℃で発現させ、４℃で、１０分、２７５０ｇの遠心分離により取得する。
細胞ペレット(２４ウェル形式)を、４５０μlの溶解緩衝液(５０mM ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、１×CompleteTMプロテアーゼ阻害剤カクテル－無ＥＤＴＡ(Roche)、１mM ＰＭＳＦ、１０mM ＣＨＡＰＳ、４０mMイミダゾール、１mg／ml リゾチーム、３０μg／ml ＤＮＡｓｅ、２μg／ml アプロチニン、ｐＨ８.０)に再懸濁し、室温で１～３時間振盪することにより溶解させる。溶解液を浄化し、９６ウェル、１.２ml 捕捉板8(catch plate)を備えた９６ウェルWhatman GF/D Unifilterに移すことにより、９６ウェル形式に再枠付加(re-rack)し、陽圧で濾過する。浄化した溶解液を、平衡緩衝液(５０mM ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、４０mMイミダゾール、ｐＨ８.０)で平衡化した９６ウェルニッケルまたはコバルトキレーティングプレートに移し、５分インキュベートする。未結合物質を陽圧で除去する。樹脂を０.３ml／ウェルで、洗浄緩衝液＃１(５０mM ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、５mM ＣＨＡＰＳ、４０mMイミダゾール、ｐＨ８.０)で２回洗浄する。各洗液を陽圧により除去する。溶出前、各ウェルを５０μl 溶出緩衝液(ＰＢＳ＋２０mM ＥＤＴＡ)で洗浄し、５分インキュベートし、この洗液を陽圧により廃棄する。タンパク質を、さらに１００μlの溶出緩衝液を各ウェルに適用することにより溶出させる。室温で３０分インキュベーション後、プレートを、５分、２００ｇで遠心分離し、溶出タンパク質を、溶出前に溶出捕捉板の底に添加した５μlの０.５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む９６ウェル捕捉板に捕捉する。溶出タンパク質を、タンパク質標品として野生型１０Ｆｎ３ドメインを用いて、総タンパク質アッセイを使用して定量する。
不溶性フィブロネクチンベースの足場タンパク質結合剤の中規模発現および精製
不溶性クローンの発現のために、クローンを、ＨＩＳ６タグ後、ｐＥＴ９ｄ(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローン化し、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞で発現させる。２０mlの接種培養(単一平板培養コロニーから産生)を、５０μg／ml カルベニシリンおよび３４μg／mlクロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地の接種に使用する。培養物を、３７℃でＡ６００ ０.６～１.０まで増殖させる。１mMイソプロピル－β－チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)で誘導後、培養物を４時間、３０℃で増殖させ、３０分、＞１０,０００ｇ、４℃での遠心分離により取得する。細胞ペレットを－８０℃で凍結させる。細胞ペレットを、２５mlの溶解緩衝液(２０mM ａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル－無ＥＤＴＡ(Roche)、１mM ＰＭＳＦ、ｐＨ７.４)に、ULTRA-TURRAX(登録商標)ホモジナイザー(IKA works)を使用して、氷上で再懸濁させる。細胞溶解を、モデルM-l 10S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する、高圧均一化(＞１８,０００psi)により達成する。不溶性フラクションを、３０分、２３,３００ｇ、４℃での遠心分離により分離する。溶解物から遠心分離により取得した不溶性ペレットを、２０mM リン酸ナトリウム／５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７.４で洗浄する。ペレットを６.０Ｍ 塩酸グアニジンの２０mM リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７.４溶液に、超音波処理により再溶解し、３７℃で１～２時間インキュベートする。再可溶化ペレットを０.４５μmで濾過し、２０mM リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／６.０Ｍ グアニジン ｐＨ７.４緩衝液で平衡化したHistrapカラムに載せる。充填後、カラムを、さらに２５ＣＶの同一緩衝液で洗浄する。結合タンパク質を、５０mMイミダゾールの２０mM リン酸ナトリウム／５００mM ＮａＣｌ／６.０Ｍ ｇｕａｎ－ＨＣｌ ｐＨ７.４溶液で溶出する。精製タンパク質を、５０mM 酢酸ナトリウム／１５０mM ＮａＣｌ ｐＨ４.５に対して透析する。
可溶性フィブロネクチンベースの足場タンパク質結合剤の中規模発現および精製
可溶性クローン発現のために、クローンを、ＨＩＳ６タグ後、ｐＥＴ９ｄ(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローン化し、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞で発現させる。２０mlの接種培養(単一平板培養コロニーから産生)を、５０μg／ml カルベニシリンおよび３４μg／mlクロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地の接種に使用する。培養物を、３７℃でＡ６００ ０.６～１.０まで増殖させる。１mMイソプロピル－β－チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)で誘導後、培養物を４時間、３０℃で増殖させ、３０分、＞１０,０００ｇ、４℃での遠心分離により取得する。細胞ペレットを－８０℃で凍結させる。細胞ペレットを、２５mlの溶解緩衝液(２０mM ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル－無ＥＤＴＡ(Roche)、１mM ＰＭＳＦ、ｐＨ７.４)に、ULTRA-TURRAX(登録商標)ホモジナイザー(IKA works)を使用して、氷上で再懸濁させる。細胞溶解を、モデルM-1 10S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する、高圧均一化(＞１８,０００psi)により達成する。可溶性フラクションを、３０分、２３,３００ｇ、４℃での遠心分離により分離する。上清を０.４５μmフィルターで浄化する。浄化溶解物を、２０mM リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７.４で予め平衡化したHistrapカラム(ＧＥ)に載せる。次いで、カラムを２５カラム体積の同一緩衝液、続いて２０カラム体積の２０mM リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／２５mMイミダゾール、ｐＨ７.４、次いで３５カラム体積の２０mM リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／４０mMイミダゾール、ｐＨ７.４で洗浄する。タンパク質を、１５カラム体積の２０mM リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／５００mMイミダゾール、ｐＨ７.４で溶出し、フラクションをＡ２ｓｏでの吸光度に基づきプールし、１×ＰＢＳ、５０mM Ｔｒｉｓ、１５０mM ＮａＣｌ； ｐＨ８.５または５０mM ＮａＯＡｃ；１５０mM ＮａＣｌ；ｐＨ４.５に対して透析する。何らかの沈殿を０.２２μmでの濾過により除去する。
VII. 組成物
本発明は、さらに、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその融合タンパク質を含む、医薬組成物および放射性医薬組成物などの組成物を提供し、ここで、組成物は本質的に無エンドトキシンであるかまたは少なくとも適切な規制当局(例えば、ＦＤＡ)により決定されるエンドトキシンの許容されるレベルを超えて含まない。
組成物を製造する当分野で周知の方法は、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に見ることができる。非経腸投与用組成物は、例えば、添加物、無菌水、食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油または水素化ナフタレンを含み得る。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマーを、化合物の溶出制御のために使用し得る。ナノ粒子組成物(例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム)を、化合物の生体分布の制御に使用し得る。他の有用な可能性のある非経腸送達は、エチレン－ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型溶出系およびリポソームを含む。組成物中の化合物濃度は、投与すべき薬物の投与量、投与経路および組成物の目的(例えば、予防、治療、診断)を含む、多数の因子により変わる。
許容される担体、添加物または安定化剤は、用いる濃度でレシピエンドに非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストランを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体)；および／またはＴｗｅｅｎ、ＰＬＵＲＯＮＩＣTMまたはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤を含む。
本発明のポリペプチドは、所望により、製薬業界で一般的に使用される非毒性酸付加塩などの薬学的に許容される塩または金属錯体として投与され得る。酸付加塩の例は、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどの重合酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸リン酸などの無機酸を含む。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。一例において、ポリペプチドは、熱安定性を高めるために、酢酸ナトリウム存在下で製剤化される。
活性成分を、例えば、コアセルベーション技法または界面重合化により、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－(メチルメタシレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ－粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョンに、マイクロカプセル封入してよい。このような技法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
インビボ投与に使用するための医薬組成物は、一般に無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜での濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥されるならば、この方法を使用する滅菌を、凍結乾燥および再構成の前または後に実施し得る。非経腸投与用組成物を、凍結乾燥形態でまたは溶液で保存し得る。さらに、非経腸組成物は、一般に無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
医薬組成物が製剤化されたら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体または脱水または凍結乾燥粉末として無菌バイアルで保存され得る。このような製剤を、即時使用型形態でまたは投与前に再構成を必要とする形態(例えば、凍結乾燥)で保存し得る。
VIII. 生物物理学および生物化学的特徴付け
ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＰＤ－Ｌ１、例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合を、平衡定数(例えば、解離、ＫＤ)の観点で、および速度定数(例えば、結合速度定数、ｋｏｎおよび解離速度定数、ｋｏｆｆ)により評価し得る。アドネクチンは、一般に標的分子に５００nM、１００nM、１０nM、１nM、５００pM、２００pMまたは１００pM未満のＫＤで結合するが、高いＫＤ値も、ｋｏｆｆが十分に低いかまたはｋｏｎが十分に高いならば、許容され得る。
結合親和性についてのインビトロアッセイ
ＰＤ－Ｌ１に結合し、拮抗する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを、種々のインビトロアッセイを使用して、同定し得る。ある実施態様において、アッセイは、複数候補アドネクチンの同時のスクリーニングを可能とするハイスループットアッセイである。
抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの結合親和性決定のための例示的アッセイは、結合平衡除外アッセイ(KinExA)(Blake et al., JBC 1996; 271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004; 328:35-43)、Biacore系(Uppsala, Sweden)での表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)(Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991; 23:1; Morton and Myszka, Methods in Enzymology 1998; 295:268)および均一性時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)アッセイ(Newton et al., J Biomol Screen 2008; 13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008; 6:55-68)などの液相方法を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、生体分子相互作用を、Biacore系を用いてリアルタイムにモニターでき、これは、３００nmまで離れた表面の屈折指数の変化により、ガラス支持体上の薄金フィルムの表面での光の共鳴角の変化を検出するための、ＳＰＲを使用する。Biacore分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数および親和性定数をもたらす。結合親和性は、Biacore表面プラズモン共鳴系(Biacore, Inc.)を使用する会合および解離速度定数の評価により得る。バイオセンサーチップは、標的の共有結合カップリングのために活性化される。次いで、標的を希釈し、チップ上に注入して、固定化物質の応答単位でシグナルを得る。共鳴単位(ＲＵ)でのシグナルが固定化物質の質量に比例するため、これは、マトリックス上の固定化標的密度を表す。会合および解離データを、１：１二分子相互作用についての正味速度発現を解決するための大域解析に同時に適合させ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＲｍａｘ(飽和での最大応答)での最適フィット値を得る。結合についての平衡解離定数ＫＤを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてのＳＰＲ測定値から計算する。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、実施例２に記載のＳＰＲ親和性アッセイで、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合について５００nM以下、４００nM以下、３００nM以下、２００nM以下、１５０nM以下、１００nM以下、９０nM以下、８０nM以下、７０nM以下、６０nM以下、５０nM以下、４０nM以下、３０nM以下、２０nM以下、１５nM以下、１０nM以下、５nM以下または１nM以下のＫＤを示す。
上記アッセイは例であり、タンパク質間の結合親和性決定について当分野で知られるあらゆる方法(例えば、蛍光ベース移動(ＦＲＥＴ)、酵素結合免疫吸着アッセイおよび競合的結合アッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ))を、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの結合親和性評価に使用できることが理解されるべきである。
IX. 抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンでのインビボ造影
造影剤
ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンはまた種々の診断および造影適用に有用である。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンをインビボで検出可能である部分で標識し、このような標識アドネクチンをインビボ造影剤として、例えば、全身造影のために使用し得る。例えば、ある実施態様において、対象におけるＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍を検出する方法は、対象に、検出可能標識に結合した抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを投与し、適切な時間後、対象における該標識を検出することを含む。
抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を、ＰＤ－Ｌ１のレベル増加と関連する障害または疾患、例えば、腫瘍が選択的にＰＤ－Ｌ１を過発現する癌の診断に使用し得る。類似する方法で、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを、対象、例えば、ＰＤ－Ｌ１レベルおよび／またはＰＤ－Ｌ１陽性細胞(例えば、腫瘍細胞または腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ))を減少させる処置中の対象または免疫療法、例えば、ＰＤ－１アンタゴニストで処置された対象における、ＰＤ－Ｌ１レベルのモニターに使用できる。抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を、使用して、対象がＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト処置などのＰＤ－Ｌ１の存在を必要とする療法、例えば、免疫療法に応答する可能性があるか否かを決定し得る。抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを修飾してまたはせずに使用でき、検出可能部分を共有結合または非共有結合により標識し得る。
使用し得る検出可能部分は、放射性薬剤、例えば、鉄キレートなどの放射性重金属、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子放射体、１８Ｆ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１２４Ｉ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、１１Ｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１４Ｉｎ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、８９Ｚｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃまたは１５３Ｓｍを含む。
ある実施態様において、放射性薬剤は、１以上のアミノ酸残基でアドネクチンとコンジュゲートされる。ある実施態様において、１以上、例えば２以上、３以上、４以上またはそれより多い数の放射性核種が標識プローブに存在し得る。ある実施態様において、放射性核種を、キレート剤によりアドネクチンに直接結合する(例えば、米国特許８,８０８,６６５参照)。ある実施態様において、放射性核種は、二機能性キレーターまたは接合(ＢＦＣ)部分によりアドネクチンにコンジュゲートした補欠分子族に存在する。ある実施態様において、放射性核種キレート剤および／またはコンジュゲート部分は、ＤＦＯ、ＤＯＴＡおよびその誘導体(ＣＢ－ＤＯ２Ａ、３ｐ－Ｃ－ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、Ｏｘｏ－ＤＯ３Ａ)、ＤＢＣＯ、ＴＥ２Ａ、ＣＢ－ＴＥ２Ａ、ＣＢ－ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ－ＴＥ２Ｐ、ＭＭ－ＴＥ２Ａ、ＤＭ－ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒおよび誘導体、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ－ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ－ＤＴＰＡ、ＣＨＸ－Ａ’’－ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ(ＰＲＰ９)、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡおよび誘導体(ＤＡＴＡ)、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡベースのキレート剤およびその近似アナログおよび誘導体である。
ある実施態様において、放射性核種キレートまたは接合(ＢＦＣ)部分は、マレアミド－ＮＯＤＡＧＡまたはマレアミド－ＤＢＣＯであり、これは、ポリペプチドのＣ末端に近いａシステイン残基により、ポリペプチドに共有結合により結合し得る。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、システイン付加によりそのＣ末端を修飾される。例えば、ＰｘＣｙは、Ｃ末端にアミノ酸残基ＮＹＲＴ(ここで、Ｐはプロリンであり、Ｃはシステインであり、ｘおよびｙは、少なくとも１である整数である)に結合し得る。Ｃ末端にアミノ酸残基ＰＣを有する例示的抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、実施例に示す。マレイミド－ＮＯＤＡＧＡまたはマレイミド－ＤＢＣＯをシステインと反応させ、それぞれアドネクチン－ＮＯＤＡＧＡまたはアドネクチン－ＤＢＣＯを生じさせ得る。
ある実施態様において、放射性核種キレート剤はＤＦＯであり、これは、例えば、無作為に表面リシンに結合し得る。
ある実施態様において、６４ＣｕのキレーターはＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＥＤＴＡ、Ｄｆ、ＤＴＰＡまたはＴＥＴＡである。キレート剤および放射性核種の適当な組み合わせは、Price et al., Chem Soc Rev 2014;43:260-90に広くレビューされている。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、ＰＥＴトレーサー１８Ｆで標識される。１８Ｆは、１.８時間放射性半減期を有する魅力的ＰＥＴ放射性核種であり、これは、ＰＥＴ放射性核種がアドネクチンの生物学的半減期と良好に適合する、同日造影ツールの提供を可能とし、患者への低放射線暴露で、優れた画像をもたらす。ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、実施例および図２および９にさらに記載するとおり、[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジン([１８Ｆ]－ＦＦＰＥＧＡ)などの補欠分子族で標識し得る。実施例にさらに示すとおり、１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、特異的かつ効率的にマウスにおけるヒトＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍、カニクイザルにおけるＰＤ－Ｌ１陽性ヒト肺癌組織およびＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍を標識した。標識方法の具体的詳細は下におよび実施例に提供する。
ある実施態様において、ＰＤ－Ｌ１造影剤は、例えば、実施例に記載するとおり、６４Ｃｕで標識された抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンである。６４Ｃｕは、ＮＯＤＡＧＡなどのキレート剤によりアドネクチンに結合され得る。実施例にさらに示すとおり、６４Ｃｕ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、特異的かつ効率的にマウスにおけるヒトＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍およびカニクイザルにおけるＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍を標識した。
ここにおよびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／６２４８５およびＰＣＴ／ＵＳ１５／６２５０２に記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンベースの造影剤の合成のための、６４Ｃｕおよび１８Ｆなどの放射性核種でポリペプチドを標識するための他の当分野で認識される方法も使用し得る。例えば、ＵＳ２０１４／０２７１４６７；Gill et al., Nature Protocols 2011;6:1718-25; Berndt et al. Nuclear Medicine and Biology 2007;34:5-15, Inkster et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013;23:3920-6(これらの内容を全体として引用により本明細書に包含させる)参照のこと。
ある実施態様において、ＰＤ－Ｌ１造影剤は、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンベースの造影剤の造影コントラスト増強またはアビディティ増加のために、わずかな増分で造影剤の血中ＰＫを増加させるために、ＰＥＧ分子(例えば、５KDa ＰＥＧ、６KDa ＰＥＧ、７KDa ＰＥＧ、８KDa ＰＥＧ、９KDa ＰＥＧまたは１０KDa ＰＥＧ)を含む。
投与および造影
ある実施態様において、標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞または組織、例えば、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍の造影に使用できる。例えば、標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを、目的の組織(例えば、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍)への標識アドネクチンの取り込みに十分な量で対象に投与する。次いで、対象を、使用する特定の放射性核種に適する時間、ＰＥＴなどの造影系を使用して造影する。標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－結合ＰＤ－Ｌ１発現細胞または組織、例えば、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍が、こうして、造影系により検出される。
ＰＤ－Ｌ１造影剤を用いるＰＥＴ造影は、定性的または定量的にＰＤ－Ｌ１を検出するために使用し得る。ＰＤ－Ｌ１造影剤を、バイオマーカーとして使用でき、対象におけるＰＤ－Ｌ１陽性シグナルの存在または不在が、例えば、対象がある治療、例えば、癌治療に応答するか否かまたは対象が治療に応答しつつあるか否かの指標であり得る。
ある実施態様において、疾患(例えば、腫瘍)の進行または退行を、時間または処置の関数として造影し得る。例えば、腫瘍のサイズを、癌治療(例えば、化学療法、放射線療法)を受けている対象でモニターし、腫瘍退行の程度を、標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン検出に基づき、リアルタイムでモニターし得る。１以上の腫瘍または健常細胞内のＰＤ－Ｌ１分布も、処置および／または疾患の前および／または途中に可視化およびモニターし得る。
目的の細胞または組織(例えば、腫瘍)への造影剤(例えば,１８Ｆ－アドネクチン造影剤、６４Ｃｕ－アドネクチン造影剤)の取り込みをもたらす有効量は、例えば、宿主の年齢、体重、一般的健康、性別および食習慣；投与の時間；投与経路；用いる特定のプローブの排泄速度；処置の期間；用いる特定の組成物と組み合わせるまたは併存する他の薬物の存在；およびその他の因子を含む、種々の因子による。
ある実施態様において、ＰＤ－Ｌ１発現組織の造影を、対象に対する標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの投与前、投与中および投与後に行う。
ある実施態様において、ＰＤ－Ｌ１造影剤を受けている対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、霊長類、サル、ラットまたはマウスである。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚および他の臓器またはＰＤ－Ｌ１を発現するこれら臓器と関連する腫瘍のＰＥＴ造影に有用である。
ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１造影剤は、少なくとも５０％、７５％、２、３、４、５またはそれ以上のコントラストを提供する。複数の実施例で、使用した全抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンが、２以上のＰＥＴコントラストを示し、アドネクチンの親和性は重要ではなかったことを示す。
短半減期放射性核種(例えば、１８Ｆ)で造影(例えば、ＰＥＴ)に使用したとき、放射標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを、好ましくは静脈内に、例えば、ボーラス注射により投与する。他の投与経路も適当であり、使用する放射性核種の半減期による。
ある実施態様において、対象にここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１造影剤を投与し、該造影剤を検出し、検出された造影剤が対象におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の位置を規定する、対象におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞を検出する方法に使用する。ある実施態様において、造影剤は陽電子放出断層撮影により検出される。
ある実施態様において、抗ここに記載するＰＤ－Ｌ１造影剤を、対象にここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１造影剤を投与し、該造影剤を検出し、検出された造影剤が対象における腫瘍の位置を規定する、対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を検出する方法に使用する。ある実施態様において、造影剤は陽電子放出断層撮影により検出される。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１造影剤の画像を、対象に造影剤を投与し、陽電子放出断層撮影により造影剤の分布をインビボで造影することにより、得る。
ここに開示するのは、ＰＤ－Ｌ１を発現する組織または細胞の定量的画像を得る方法であって、方法は、細胞または組織とここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１造影剤を接触させ、ＰＤ－Ｌ１発現組織を、陽電子放出断層撮影を使用して検出または定量することを含む。
またここに開示するのは、造影有効量のここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１造影剤を対象、例えば、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を有するまたは有することが疑われる対象に投与し、陽電子放出断層撮影を使用して、腫瘍における該造影剤の放射性放出を検出することを含み、ここで、放射性放出が腫瘍において検出されるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を検出する方法である。
またここに開示するのは、対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍の存在を診断する方法であって、方法は
(ａ)それを必要とする対象にここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１造影剤を投与し；そして
(ｂ)造影剤の存在または不在を検出するために、対象の少なくとも一部の放射線画像を得ることを含み；
ここで、背景を超える造影剤の存在および位置が、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１発現腫瘍の存在および位置の指標である。
またここに提供されるのは、癌を有する対象が例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの免疫療法に応答する可能性があるか否かを決定する方法であって、方法は、(ａ)癌を有する対象に、例えば、ここに記載する、ＰＤ－Ｌ１造影剤を投与し；そして(ｂ)段階(ａ)後、対象の少なくとも一部の画像(静的または動的)を得て、対象が、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト(例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭ)での処置を必要とするレベルと同等またはそれ以上のＰＤ－Ｌ１レベルを１腫瘍または数腫瘍にわたり有するならば、対象を、抗腫瘍治療、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭで処置することを含む。
またここに提供されるのは、癌を有する対象を処置する方法であって、
(ａ)それを必要とする対象に、例えば、ここに記載する、ＰＤ－Ｌ１造影剤を含む造影剤を投与し、１以上の腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の存在の決定のために対象の少なくとも一部の画像(静的または動的)を得て；対象がＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト(例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭ)での処置を必要とするレベルと同等またはそれ以上のＰＤ－Ｌ１レベルを１腫瘍または数腫瘍にわたり有するならば、(ａ)対象に抗腫瘍治療、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害する薬剤(ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)、例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭを投与することを含む、方法である。またここに開示するのは、対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の進行をモニタリングする方法であって、方法は、
(ａ)それを必要とする対象にここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１造影剤を第一の時点で投与し、対象の少なくとも一部の画像を得て、腫瘍サイズを決定し；
(ｂ)対象に抗腫瘍治療剤を投与し；
(ｃ)対象に造影剤をその後１以上の時点で投与し、各時点で対象の少なくとも一部の画像を得ることを含み；
ここで、各時点での腫瘍の寸法および位置が疾患進行の指標である。
ＰＥＴ造影
一般に、ＰＥＴ造影目的で、レシピエントに単回静脈内点滴として約０.１mg～２００mg範囲の投与のアドネクチンを提供することが望ましが、低または高投与量も、状況に応じて投与し得る。レシピエントに約０.１mg～１０mg／体表面積平方メートルの投与量範囲のタンパク質またはペプチドを、典型的成人について提供するのが望ましいが、低または高投与量も、状況に応じて投与し得る。造影目的でヒト対象に投与し得るタンパク質またはペプチドの投与量の例は、１０μg～１０００μg、１００μg～１０００μg、１００μg～５００μg、２００μg～５００μgおよび３００μg～４００μgであるが、低または高投与量を使用し得る。例えば、１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ造影剤を、１０μg～１０００μg、１００μg～１０００μg、１００μg～５００μg、２００μg～５００μgおよび３００μg～４００μg範囲の量で、ヒトに、例えば、ボーラス注射として、投与し得る。ある実施態様において、１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ造影剤を、ヒト対象に、８０kg対象で約４.４μg／kgに対応する約３５０μgの量で投与する。
ある実施態様において、投与を、放射標識アドネクチン、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、０.００５μｇ／kg体重～５０μｇ／kg体重／日、例えば、１日あたり、例えば、０.０２μｇ／kg体重～１０μｇ／kg、例えば、１日あたり、０.１μｇ／kg体重～１０μｇ／体重kg、例えば、１日あたり、例えば、１μｇ／kg体重～１０μｇ／体重kg、例えば、１日あたり、例えば、２μｇ／kg体重～６μｇ／体重kg、例えば、１日あたり、例えば、４μｇ／kg体重～５μg／体重kgで行う。ＰＥＴトレーサーに関連する質量は、天然同位体(例えば、１８Ｆ ＰＥＴトレーサーについて１９Ｆ)のものである。ある実施態様において、１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ造影剤を、ヒト対象に例えば、１日あたり、０.１μｇ／kg体重～１０μｇ／体重kg、例えば、例えば、１日あたり、１μｇ／kg体重～１０μｇ／体重kg、例えば、例えば、１日あたり、２μｇ／kg体重～６μｇ／体重kg、例えば、例えば、１日あたり、４μｇ／kg体重～５μg／体重kgの量で投与する。
投与量レジメンを、放射標識アドネクチンを取り込む組織または細胞のクリアな画像を得るための最適検出可能量を提供するために調節する。投与の容易さおよび投与量均一性のために、投与量単位形態で非経腸組成物を製剤化するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、放射標識アドネクチンを投与する対象のための単位投与量として適する、物理的に区別された単位をいう。ここに記載する投与量単位形態の仕様は、(ａ)放射標識アドネクチンのターゲティング部分の特有の特徴；(ｂ)標的となる組織または細胞；(ｃ)使用する造影テクノロジー固有の制限について示され、それらに直接依存する。
放射標識アドネクチン投与のために、使用する投与量は疾患タイプ、使用するターゲティング化合物、対象の年齢、身体的状態および性別、疾患の程度、試験部位およびその他による。特に、対象の被爆についての十分な配慮をしなければならない。飽和用量の放射標識(例えば、１８Ｆまたは６４Ｃｕ)を患者に投与し得る。例えば、１８Ｆ標識アドネクチンの放射活性量は、３.７メガベクレル(MBq)～３.７ギガベクレル(GBq)、１８MBq～７４０MBq、１００MBq～５００MBq、１００MBq～４００MBq、１００MBq～３３３MBq、１００MBq～２５０MBq、１５０MBq～２５０MBq、２００MBq～２５０MBqまたは２００MBq～２２５MBqの範囲であり得る。あるいは、投与量を、例えばミリキューリーで測定し得る。ある実施態様において、造影検査のために投与する１８Ｆ造影剤の量は、１～１０mCi、３～１０mCi、３～８mCi、４～７mCiまたは５～６mCiである。ある実施態様において、有効量は、１～１０mCi、３～１０mCi、３～８mCi、４～７mCiまたは５～６mCi範囲の放出を生じるのに十分な化合物の量である。ある実施態様において、１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ造影剤を、ヒト対象に１～１０mCi、３～１０mCi、３～８mCi、４～７mCiまたは５～６mCiの量で投与する。
ある実施態様において、１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ造影剤を、１～５％の１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡおよびそれぞれ９５～９９％の非放射標識アドネクチン前駆体、例えば、ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯを含む組成物として投与する。ある実施態様において、比は、２％の１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、例えば、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡおよび９８％の非放射標識アドネクチン前駆体、例えば、ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯである。比は変わってよいが、ただし、好ましくは、造影のために対象に投与するタンパク質の総量はマイクロドーズ、すなわち、≦３０nMのままである。
ここに記載する医薬組成物の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者に、組成物および投与方式での細胞または組織における放射標識アドネクチンの所望の取り込みを達成するのに有効な活性成分の量を得るために変わり得る。しかしながら、本発明の放射標識アドネクチンの総１日使用は、処置医または他の担当専門家により、合理的医学的判断の範囲内で決定されることが理解される。ある特定の対象に対する特定の有効用量レベルは、例えば、用いる特定の組成物の活性；用いる特定の組成物；宿主の年齢、体重、一般的健康、性別および食習慣；投与の時間；投与経路；用いる特定の化合物の排泄速度；処置の期間；用いる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および病歴および医学分野で周知の同様の因子を含む、種々の因子による。ある実施態様において、造影を必要とするヒト対象に投与する放射標識アドネクチンの量は、処方医により決定され、投与量は、一般に放射性核種から放出される量により変わる。
ある実施態様において、ここに記載する放射標識アドネクチンを、インビボでの適切な分布を確実にするために、製剤化し得る。例えば、血液－脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度親水性化合物を排除する。例えば、リポソームに製剤化することにより、薬剤はＢＢＢを通過し得る。リポソームの製造方法について、例えば、米国特許４,５２２,８１１；５,３７４,５４８；および５,３９９,３３１を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１以上の部分を含み得て、こうして、標的化薬物送達を促進する(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。例示的ターゲティング部分は、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許５,４１６,０１６参照)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤タンパク質Ａ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含み；またK. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994)も参照のこと。
ＰＥＴ操作の例示
次の説明的操作を、クリニックで患者のＰＥＴ造影検査をするとき使用し得る。静脈カテーテル、例えば、２０Ｇ ２インチ静脈カテーテルを放射性トレーサー投与の対側尺骨静脈に挿入する。ＰＥＴトレーサーの投与は、血中の抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン濃度の最大(Ｔ ｍａｘ)または最小(Ｔ ｍｉｎ)の時間と同時になるようにしばしば時間調整される。
患者をＰＥＴカメラに位置させ、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ(＜２０mCi)などの放射標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＰＥＴトレーサーのトレーサー用量を、ｉ.ｖ.カテーテルにより投与する。対象は、ＰＥＴトレーサーの投与前、シグナル対背景比を増加させるために、循環から未結合トレーサーの腎臓クリアランスを促進するために１リットルの水を飲むおよび／または膀胱を空にすることができる。例えば、血漿中の非代謝ＰＥＴトレーサーの分画を分析および定量するために、ＰＥＴ走査中、動脈血または静脈血サンプルを、１５の適切な時間間隔で採り得る。画像を１２０分まで獲得し得る。放射性トレーサー注射１０分以内および造影セッションの最後に、１ml 血液サンプルを、例えば、何らかの標識または非標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの血漿濃度を決定するために、得てよい。
２タイプのＰＥＴ操作を使用し得る。一つのタイプは、単一時点での局所トレーサー取込の推定の取得を含むかまたは局所のトレーサー濃度の空間的マップを提供する。静的造影で、平均値のみ測定される(例えば標準化取り込み値、ＳＵＶ)。第二のタイプは、動的トレーサー造影と称され、これは、トレーサー取り込みの時間的および空間的パターンの両方を表示することにより、インビボ生物学に関して相当多くの情報を提供できる。例えば、Muzi et al. Magn Reson Imaging. 2012 30(9): 1203-1215参照。[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡおよび[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡなどのＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を、静的トレーサー造影または動的トレーサー造影で使用し得る。
トレーサー取り込みの提供のために、医師は、ＰＥＴまたはＣＴ走査で腫瘍病変を目視により決定し、これらの病変周囲に注目画像領域(ＲＯＩ)を決定し得る。これらのＲＯＩにおける[１８Ｆ]ＰＤ－Ｌ１－取り込みを、体重および注射用量と相関させ、標準化取り込み値(ＳＵＶｍａｘおよびＳＵＶ平均)として定量し得る。
断層撮影画像を、画像再構築により得る。放射性トレーサーの分布を決定するために、ＲＯＩを、肺、肝臓、心臓、腎臓、皮膚または他の臓器および組織(例えば、癌組織)を含むが、これらに限定されない、再構築画像に引き得る。これらの領域での経時的放射性トレーサー取り込みを使用して、あらゆる介入の非存在または試験した種々の投与パラダイムでの非標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン存在下に得た時間活性曲線(ＴＡＣ)を作成する。データを放射活性／単位時間／単位体積(μci／cc／mCi注射用量)として表し得る。
ＰＥＴを、解剖学的基準点目的で低用量または診断的ＣＴ走査に付随させ得る。
IX. １８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンでのＰＥＴ操作の例示
ＰＤ－Ｌ１結合剤をフルオライド－１８(１８Ｆ)で標識することにより、連続[１８Ｆ]ＰＤ－Ｌ１－ＰＥＴ走査を使用して、全身分布、薬物動態(ＰＫ)および薬力学(ＰＤ)を評価し、処置効果の知見と関連付け得る。これは、患者選択を助け、おそらく、将来のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤に対する応答の(早期)バイオマーカーとして働く。
１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤、例えば、[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡなどの１８Ｆ標識造影剤での例示的ＰＥＴ操作は次の通りである。
ある実施態様において、方法は、(ａ)対象、例えば、ヒトに、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ)操作(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行うことを含む。ＰＥＴ走査は静的ＰＥＴ走査または動的ＰＥＴ走査であり得る。ＰＥＴ走査が静的ＰＥＴ走査であるならば、ＰＥＴ走査を、ＰＤ－Ｌ１造影剤投与後３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分行ってよく、ＰＥＴ走査が動的ＰＥＴ走査であるならば、ＰＤ－Ｌ１造影剤投与後１～１２０分、３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分、例えば、注射後１分、３５分、７０分および１０５分に行い得る。動的ＰＥＴ走査を、３０～１２０分、例えば、３０～６０分、例えば、３０分または６０分の総時間、種々のフレーム長で行い得る。走査は全身走査または身体部分走査、例えば、単一腫瘍の走査であり得る。例えば、動的ＰＥＴ走査は単一腫瘍の走査であってよく、静的ＰＥＴ走査は全身走査であってよい。ある実施態様において、投与する用量は約２００～２２５MBq(すなわち、±１０％)または約６mCi(すなわち、±１０％)であり得る。
ある実施態様において、対象は癌を有する対象であり、方法は、(ａ)対象に、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ)段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行うことを含み、ここで、段階(ａ)および(ｂ)を癌処置開始前に行う。ある実施態様において、対象は癌を有する対象であり、方法は、(ａ)対象に、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ) 段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行うことを含み、ここで、段階(ａ)および(ｂ)は、少なくとも２時点で実際され、例えば、一方は癌処置開始前であり、もう一方は癌処置中でありまたは両時点とも癌処置中である。２時点は、例えば、１～１０週、例えば２～８週、例えば５～７週、例えば６週の時間離れる。ある実施態様において、段階(ａ)および(ｂ)は少なくとも３、４、５またはそれ以上の時点で実施され、ここで、連続する時点は、例えば、１～１０週、例えば２～８週、例えば５～７週、例えば６週の時間を置く。
ある実施態様において、対象は癌を有する対象であり、対象は免疫療法、例えば、ＰＤ－１アンタゴニストおよび／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストで処置されており、方法は、(ａ)対象に、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ) 段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行うことを含み、ここで、段階(ａ)および(ｂ)は少なくとも２、３、４または５時点実施され、例えば、その一方は免疫療法処置開始前であり、もう一方は免疫療法処置中でありまたは両時点とも免疫療法処置中である。
ある実施態様において、対象は癌を有する対象であり、対象は免疫療法、例えば、ＰＤ－１アンタゴニストおよび／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストで処置されており、方法は、(ａ)対象に、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ)段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行うことを含み、ここで、段階(ａ)および(ｂ)は少なくとも１、２、３、４または５時点で実施され、例えば、その一方は免疫療法処置開始前であり、段階(ａ)および(ｂ)を１回を超えて反復するならば、その一方は免疫療法処置中でありまたは全ての時点は免疫療法処置中であり、ＰＥＴ走査の結果は対象のさらなる処置の情報を与える。例えば、ＰＥＴ走査の結果は処置中に対象の腫瘍のサイズが小さくなっていないことを示めし得て、これは、処置が成功していないことを示し、処置を変更するか中止すべきことを示す。
あるいは、処置前、第一走査が、対象の腫瘍の大部分はＰＤ－Ｌ１を発現しておらず、ＰＤ－１アンタゴニストおよび／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの処置は成功していないことを示し得る。従って、ここに提供されるのは、癌を有する対象を処置する方法であり、
(ａ)それを必要とする対象に抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤を投与し、そして１以上の腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の存在の決定のために対象の少なくとも一部の画像(静的または動的)を得て；そして、ＰＤ－Ｌ１が１以上の腫瘍で検出されたならば、
(ｂ)対象に、抗腫瘍治療、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害する薬剤(ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)、例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭを投与する
ことを含む、方法である。
また提供されるのは、癌を有する対象がＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの治療に応答する可能性があるか否かを予測する方法であって、(ａ)それを必要とする対象に抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを含む造影剤を投与し、そして１以上の腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の存在の決定のために対象の少なくとも一部の画像(静的または動的)を得ることを含み；そして、ＰＤ－Ｌ１が１以上の腫瘍で検出されたならば、対象は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの治療に応答する可能性がある、方法である。
方法は、腫瘍試料におけるまたは数腫瘍にわたる平均で細胞の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％がＰＤ－Ｌ１陽性であるとき、抗腫瘍治療を行うことを含む。ある実施態様において、対象が腫瘍試料におけるまたは数腫瘍にわたる平均で細胞の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％がＰＤ－Ｌ１陽性でない限り、対象に抗腫瘍治療、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストを投与しない。ある実施態様において、１以上の腫瘍で検出されるＰＤ－Ｌ１レベルがＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト治療での処置を受ける必要があるＰＤ－Ｌ１レベルと少なくとも同等であるならば、抗腫瘍治療を行う。
段階(ａ)および(ｂ)を１回を超えて反復する方法は、第一時点で実施したＰＥＴ走査と第二時点および／またはその後の時点で実施したＰＥＴ走査を比較することを含み得る。このような比較は、患者の疾患進行、患者の処置に対する応答、患者の有害反応の可能性またはその他の情報を与え得る。
ある実施態様において、対象は癌を有する対象であり、対象は免疫療法、例えば、ＰＤ－１アンタゴニストおよび／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストで処置されており、方法は、(ａ)対象に、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ)段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行うことを含み、ここで、段階(ａ)および(ｂ)は少なくとも１、２、３、４または５時点で実施され、例えば、その一つは免疫療法処置開始前であり、段階(ａ)および(ｂ)を１回を超えて反復するならば、その一方は免疫療法処置中でありまたは全時点は免疫療法処置中であり、ここで、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤は、次の１つを含む：
Ａ０２アドネクチン(すなわち、配列番号８１、８２および８３)の修飾ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧ；またはＡ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの１つが１アミノ酸欠失、付加または置換で異なる；Ａ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの２つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的アミノ酸置換)で異なる；またはＡ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの３つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換で異なるおよびアドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；
Ｅ０１アドネクチン(すなわち、配列番号９７、９８および９９))の修飾ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧ；またはＥ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの１つが１アミノ酸欠失、付加または置換で異なる；Ｅ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの２つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的アミノ酸置換)で異なる；またはＥ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの３つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換で異なるおよびアドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；
Ａ０２アドネクチン(例えば、配列番号８０および８４～９１の何れか)またはＥ０１アドネクチン(例えば、配列番号９６、１００～１０７の何れか)のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、ここで、置換は保存的置換であり得て、アドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；および／または
例えば、配列番号８０および８４～９１の何れかを含むＡ０２アドネクチンまたは例えば、配列番号９６、１００～１０７の何れかを含むＥ０１アドネクチンのアミノ酸配列と１～１０アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的置換)で異なるアミノ酸配列、ここで、置換は保存的置換であり得て、アドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。
ある実施態様において、対象は癌を有する対象であり、対象は免疫療法、例えば、ＰＤ－１アンタゴニストおよび／またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストで処置されており、方法は、(ａ)対象に、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ)段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行うことを含み、ここで、段階(ａ)および(ｂ)は少なくとも１、２、３、４または５時点で実施され、例えば、その１つは免疫療法処置開始前であり、段階(ａ)および(ｂ)を１回を超えて反復するならば、その一方は免疫療法処置中でありまたは全時点は免疫療法処置中であり、ここで、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤は[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡであり、ここで、Ａ０２アドネクチンは配列番号８０および８４～９１の何れかを含みまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡであり、ここで、Ｅ０１アドネクチンは配列番号９６および１００～１０７の何れかを含み、４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡの構造は図２または９に提供する構造である。対象に投与する組成物は、分子の２％が[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡおよび分子の９８％がそれぞれＡ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯまたはＥ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯである組成物であってよく、好ましくは、３０nMまたはそれ未満以下の総タンパク質が１トレーサー投与で対象に投与される。
またここに提供されるのは、癌を有する対象が例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの免疫療法に応答する可能性があるか否かを決定する方法であり、方法は、(ａ)癌を有する対象に約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ)段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行うおよび対象が、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト(例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭ)での処置を必要とするレベルと同等またはそれ以上のＰＤ－Ｌ１レベルを１腫瘍または数腫瘍にわたり有するならば、対象は抗腫瘍治療、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭに応答する可能性があり、ここで、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤は、次の１つを含む：
Ａ０２アドネクチン(すなわち、配列番号８１、８２および８３)の修飾ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧ；またはＡ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの１つが１アミノ酸欠失、付加または置換で異なる；Ａ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの２つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的アミノ酸置換)で異なる；またはＡ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの３つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換で異なるおよびアドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；
Ｅ０１アドネクチン(すなわち、配列番号９７、９８および９９))の修飾ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧ；またはＥ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの１つが１アミノ酸欠失、付加または置換で異なる；Ｅ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの２つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的アミノ酸置換)で異なる；またはＥ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの３つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換で異なるおよびアドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；
Ａ０２アドネクチン(例えば、配列番号８０および８４～９１の何れか)またはＥ０１アドネクチン(例えば、配列番号９６、１００～１０７の何れか)のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、ここで、置換は保存的置換であり得て、アドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；および／または
例えば、配列番号８０および８４～９１の何れかを含むＡ０２アドネクチンまたは例えば、配列番号９６、１００～１０７の何れかを含むＥ０１アドネクチンのアミノ酸配列と１～１０アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的置換)で異なるアミノ酸配列、ここで、置換は保存的置換であり得て、アドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。
ここに提供されるのは、癌を有する対象を処置する方法であって、(ａ)対象に、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ)段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行い、対象が、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト(例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭ)での処置を必要とするレベルと同等またはそれ以上のＰＤ－Ｌ１レベルを１腫瘍または数腫瘍にわたり有するならば、対象に抗腫瘍治療、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭを投与することを含み、ここで、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤は、次の１つを含む：
Ａ０２アドネクチン(すなわち、配列番号８１、８２および８３)の修飾ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧ；またはＡ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの１つが１アミノ酸欠失、付加または置換で異なる；Ａ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの２つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的アミノ酸置換)で異なる；またはＡ０２アドネクチンにおける対応するループとこれらループの３つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換で異なるおよびアドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；
Ｅ０１アドネクチン(すなわち、配列番号９７、９８および９９))の修飾ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧ；またはＥ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの１つが１アミノ酸欠失、付加または置換で異なる；Ｅ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの２つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的アミノ酸置換)で異なる；またはＥ０１アドネクチンにおける対応するループとこれらループの３つの各々が１アミノ酸欠失、付加または置換で異なるおよびアドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；
Ａ０２アドネクチン(例えば、配列番号８０および８４～９１の何れか)またはＥ０１アドネクチン(例えば、配列番号９６、１００～１０７の何れか)のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、ここで、置換は保存的置換であり得て、アドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；および／または
例えば、配列番号８０および８４～９１の何れかを含むＡ０２アドネクチンまたは例えば、配列番号９６、１００～１０７の何れかを含むＥ０１アドネクチンのアミノ酸配列と１～１０アミノ酸欠失、付加または置換(例えば、保存的置換)で異なるアミノ酸配列、ここで、置換は保存的置換であり得て、アドネクチンはBiacoreで決定してヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。
ここに提供されるのは、癌を有する対象を処置する方法であり、(ａ)対象に、約３～１０mCi(１００～３３３MBq)の用量でＰＤ－Ｌ１造影剤、例えば、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を投与し；そして(ｂ)段階(ａ)の後、約１～１２０分(例えば３０～１２０分、３０～６０分または６０～１２０分)対象のＰＥＴ走査を行い、対象が、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト(例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭ)での処置を必要とするレベルと同等またはそれ以上のＰＤ－Ｌ１レベルを１腫瘍または数腫瘍にわたり有するならば、対象に抗腫瘍治療、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト例えば、オプジーボＴＭ、キイトルーダＴＭまたはTECENTRIQＴＭを投与し、１８Ｆ標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤は[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡであり、ここで、Ａ０２アドネクチンは配列番号８０および８４～９１の何れかを含みまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ、ここで、Ｅ０１アドネクチンは配列番号９６および１００～１０７の何れかを含み、４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡの構造は図２または９に提供する構造である。対象に投与する組成物は、分子の２％が[１８Ｆ]－Ａ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡまたは[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡおよび分子の９８％がそれぞれＡ０２－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯまたはＥ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯである組成物であってよく、ここで、好ましくは、３０nMまたはそれ未満の総タンパク質が１トレーサー投与で対象に投与される。
Ｘ. 抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンでのＰＤ－Ｌ１の検出
ＰＤ－Ｌ１のインビボでの検出に加えて、ここに記載するもののような抗ＰＤＬ１アドネクチンを、サンプル中の標的分子の検出に使用し得る。方法は、サンプルとここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを接触させ、ここで、該接触は、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－標的複合体形成を可能とする条件下で行われ；そして、該複合体を検出し、それにより、該サンプル中の該標的を検出することを含む。検出は、例えば、Ｘ線検査、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析または表面プラズモン共鳴などの、任意の当分野で認識される技法を使用して実施し得る。サンプルはヒトまたは他の哺乳動物からであり得る。診断目的で、適切な薬剤は、全身造影のための放射性同位体ならびにサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む、検出可能標識である。
検出可能標識は、コロイド金などの金属ゾル、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４タイプのペプチド性キレート剤と提示されるＩ１２５またはＴｃ９９などの同位体、蛍光マーカー、ビオチン、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団を含む粒子標識ならびにある基質を検出可能マーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ連鎖反応によるなどの増幅後明らかにされるポリヌクレオチドタグを含む、インビトロ診断分野で現在使用されている種々のタイプの何れでもよい。次いで、ビオチニル化抗体は、アビジンまたはストレプトアビジン結合により検出可能となる。適当な酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３－(４－(メトキシスピロ{１,２－ジオキセタン－３,２’－(５’－クロロ)トリシクロ{３.３.１.１ ３,７}デカン}－４－イル)フェニルホスフェート(ＣＳＰＤ)の変換後化学発光の存在または形成の測定により検出される酵素アルカリホスファターゼならびにＣＤＰおよびＣＤＰ－ｓｔａｒ(登録商標)などの１,２－ジオキセタン基質または他の当業者に周知の発光基質、例えばテルビウム(III)およびユーロピウム(III)などの適当なランタニドのキレートであり得る。他の標識は、造影セクジョンにおいて上記したものを含む。検出手段は、選択標識により決定される。標識またはその反応産物の出現を、標識が粒子であり、適切なレベルで蓄積する場合、裸眼でまたは分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などの装置を使用して達成でき、全て慣行に従う。
ある実施態様において、コンジュゲーション方法は、実質的に(またはほぼ)非免疫原性である結合、例えば、ペプチド－(すなわちアミド－)、スルフィド－、(立体障害)、ジスルフィド－、ヒドラゾン－およびエーテル結合をもたらす。これらの結合はほぼ非免疫原性であり、血清内で妥当な安定性を示す(例えばSenter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO2009/059278; WO95/17886参照)。
部分およびアドネクチンの生物化学的性質によって、種々のコンジュゲーション戦略を用い得る。部分が５０～５００アミノ酸の天然に存在するまたは組み換えポリペプチドである場合、タンパク質コンジュゲートの合成の化学を記載する教科書に標準操作があり、これは当業者が容易に従い得る(例えばHackenberger, C. P. R.およびSchwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074)。ある実施態様において、マレインイミド部分と、アドネクチンまたは部分内のシステイン残基の反応が使用される。あるいは、アドネクチンのＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質のＣ末端修飾は、例えば、Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)にキシのとおり、実施され得る。部分がペプチドまたはポリペプチドであるとき、アドネクチンおよび部分を、所望によりここに開示するリンカーと共に、標準遺伝子融合で融合させ得る。
一般に、部位特異的反応および共有結合カップリングは、存在する他の官能基の反応性と直交的である、反応性を有するアミノ酸への天然アミノ酸の変換に基づく。例えば、稀な配列構成内の特定のシステインを、アルデヒドに酵素的に変換し得る(Frese, M. A. and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427参照)。所望のアミノ酸修飾を、ある酵素とある配列構成の天然アミノ酸の特異的酵素反応性を利用して得ることも可能である(例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136参照)。Ｃ－Ｎ結合のプロテアーゼ触媒形成は、Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403に記載される。
部位特異的反応および共有結合カップリングはまた末端アミノ酸と適切な修飾試薬の選択的反応によっても達成され得る。Ｎ末端システインとベンゾニトリルの反応性(Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662参照)を使用して、部位特異的共有結合カップリングを達成できる。天然の化学的ライゲーションはまたＣ末端システイン残基に依存する(Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96)。ＥＰ１０７４５６３は、正に荷電したアミノ酸のストレッチに位置するシステインより負に荷電したアミノ酸のストレッチ内のシステインの反応が速いことを利用するコンジュゲーション方法を記載する。
部分はまた合成ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ポリペプチドが化学的に合成されているとき、直交的化学反応性を有するアミノ酸を、このような合成中に取り込み得る(例えばde Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295参照)。広範な種々の直交性官能基が議論されており、合成ペプチドに導入され得るため、このようなペプチドのリンカーへのコンジュゲーションは標準的化学である。
単標識ポリペプチドを得るために、１：１化学量論のコンジュゲートを、他のコンジュゲーション副産物からクロマトグラフィーで分離する。この操作は、色素標識結合対メンバーおよび荷電リンカーの使用により促進され得る。この種の標識および高度に負に荷電した結合対メンバーの使用により、単コンジュゲートポリペプチドは、荷電および分子量の違いを分離に使用できるため、非標識ポリペプチドおよび１を超えるリンカーを担持するポリペプチドから、容易に分離される。蛍光色素は、複合体を標識一価バインダーなどの非結合成分から精製するのに有用であり得る。
XI. １８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの合成
１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを、まず１８Ｆ放射標識補欠分子族を製造し、アドネクチンを二機能性キレート剤に結合させ、次いで、これら２試薬を合わせることにより、製造できる(例えば、図９参照)。
１８Ｆ放射標識補欠分子族
ある態様において、ここに提供されるのは、水耐性条件下、選択的に進むアジドおよびシクロオクチン間の１,３－二極性シクロ付加を含む、生体直交型反応に使用するための、補欠分子族を含む１８Ｆ放射標識化合物である。ここに開示する１８Ｆ放射標識補欠分子族は、１００％水溶液に可溶性であり、補欠分子族のここに開示する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンへの結合に有機相は必要ない。分解および凝集問題を考えると、少量の有機溶媒でさえ耐えられない抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンに補欠分子族を結合させるのに有機相が必要ないため、この性質は特に有利である。
さらに、脂肪族補欠分子族と異なり、１８Ｆフッ素付加反応はＵＶによりモニターでき、ここに記載する１８Ｆ放射標識補欠分子族は揮発性ではない。さらに、１８Ｆ放射標識補欠分子族は、例えば、実施例に記載するとおり、無銅クリック化学を使用して抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンに取り込まれ得て、それ故に、銅介在クリック化学を使用したときに一部生物製剤で見られる安定性問題を回避する。
ある態様において、ここに提供されるのは、次の構造
Figure 0007016323000006
 〔式中、ｘは１～８の整数である〕
でアジドに共有結合したペグ化１８Ｆ－ピリジンである。ある実施態様において、ｘは２～６の整数である。ある実施態様において、ｘは３～５の整数である。ある実施態様において、ｘは４であるある実施態様において、１８Ｆは、Ｎ原子に対してオルトでピリジンに結合する。ある実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分は、ピリジン環の窒素に対して１－３配置で存在する。ある実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分は、ピリジン環の窒素に対して１－２配置で存在する。ある実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分は、ピリジン環の窒素に対して１－４配置で存在する。
ある実施態様において、１８Ｆ放射標識化合物は構造
Figure 0007016323000007
 〔式中、ｘは１～８の整数である〕
を有する。ある実施態様において、ｘは２～６の整数である。ある実施態様において、ｘは３～５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。
ある実施態様において、１８Ｆ放射標識化合物は構造
Figure 0007016323000008
 〔式中、ｘは１～８の整数である〕
を有する。ある実施態様において、ｘは２～６の整数である。ある実施態様において、ｘは３～５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。
ある実施態様において、１８Ｆ放射標識化合物は[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジン(１８Ｆ－ＦＰＰＥＧＡ)であり、構造
Figure 0007016323000009
 を有する。
ある実施態様において、１８Ｆ放射標識補欠分子族は、フッ素付加反応を妨害しないさらなる基をピリジン環上に含み得る。ある実施態様において、ピリジン環へのピリジン環は、Ｃ１－６アルキル基、例えばメチル、エチルおよびプロピルを含む。
ある実施態様において、１８Ｆ放射標識補欠分子族は、次の構造
Figure 0007016323000010
 〔式中、“ＯＰＥＧ”は[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘであり、ｘは１～８の整数である〕
を有する縮合環系である。ある実施態様において、ｘは２～６の整数である。ある実施態様において、ｘは３～５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。
ここに記載する１８Ｆ放射標識補欠分子族は、ここでの実施例に記載する化学反応を使用して製造し得る。
またここに提供されるのは、次の構造
Figure 0007016323000011
 〔式中、ｘは１～８の整数である〕
でアジドに共有結合したペグ化１８Ｆ－ピリジンを製造する方法であり、方法は、
(ａ)次の構造
Figure 0007016323000012
 〔式中、ｘは１～８の整数であり、ＲはＮＯ２、Ｂｒ、Ｆまたは
Figure 0007016323000013
 であり、ピリジン環のＮ原子に対してオルトである〕
を有する化合物ａを準備し；
(ｂ)１８Ｆの１８Ｏ水、４,７,１３,１６,２１,２４－ヘキサオキサ－１,１０－ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサンおよび弱塩基中の混合物を準備し；
(ｃ)工程ｂ)からの混合物を乾燥させて、固体を形成させ；そして
(ｄ)工程ａ)の溶液と工程c)の固体を反応させて、１８Ｆ標識化合物を形成させる
ことを含む。
ある実施態様において、方法は、次の構造ｂ
Figure 0007016323000014
 (ここで、１８ＦはＮ原子に対してオルトである)
を有する１８Ｆ－ピリジン補欠分子族を製造し、
(ａ)構造
Figure 0007016323000015
 (ここで、ＸはＮ原子に対してオルトである)〔式中、ＸはＮＯ２、Ｂｒまたは
Figure 0007016323000016
 である〕
の化合物の溶液を準備し；
(ｂ)１８Ｆの１８Ｏ水、４,７,１３,１６,２１,２４－ヘキサオキサ－１,１０－ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサンおよびＫ２ＣＯ３などの弱塩基中有の混合物を提供し；
(ｃ)工程ｂ)からの混合物を乾燥させて、固体を形成させ；そして
(ｄ)工程ａ)の溶液と工程c)の固体を反応させて、１８Ｆ標識化合物を形成させる
工程を含む。
ある実施態様において、方法は、さらに次の構造ａ
Figure 0007016323000017
 の化合物を、次のスキームＩに従い製造する工程を含む。
Figure 0007016323000018
ある実施態様において、方法は、次の反応条件により、ｄから１８Ｆ－ピリジン補欠分子族[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジン(１８Ｆ－ＦＰＰＥＧＡ)ｅを製造することを含む。
Figure 0007016323000019
１８Ｆ放射標識ＰＤ－Ｌ１アドネクチン
ある態様において、ここに提供されるのは、次の構造を有する１８Ｆ放射標識プローブまたは薬剤である。
Figure 0007016323000020
 (式中、タンパク質はＰＤ－Ｌ１アドネクチンであり、ｘは１～８の整数である)。ある実施態様において、ｘは２～６の整数である。ある実施態様において、ｘは３～５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。
ＢＦＣ
ここに開示する１８Ｆ放射標識組成物で使用し得る二機能性キレートまたは接合(ＢＦＣ)部分は、市販されている(例えば、Sigma Aldrich；クリック化学ツール)または周知化学反応により合成し得る。
ある実施態様において、ＢＦＣは、シクロオクチンベースのキレート剤(例えば、ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯ)、ＤＦＯ、ＤＯＴＡおよびその誘導体(ＣＢ－ＤＯ２Ａ、３ｐ－Ｃ－ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、Ｏｘｏ－ＤＯ３Ａ)、ＴＥ２Ａ、ＣＢ－ＴＥ２Ａ、ＣＢ－ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ－ＴＥ２Ｐ、ＭＭ－ＴＥ２Ａ、ＤＭ－ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒおよび誘導体、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ－ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ－ＤＴＰＡ、ＣＨＸ－Ａ’’－ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ(ＰＲＰ９)、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡおよび誘導体(ＤＡＴＡ)、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡベースのキレート剤およびその近似アナログおよび誘導体から選択される。キレート剤と放射性核種の適当な組み合わせは、Price et al., Chem Soc Rev 2014;43:260-90に広く記載される。
ある実施態様において、ＢＦＣは、ターゲティングタンパク質またはペプチド上のアミン、カルボキシル、カルボニルまたはチオール官能基と共有結合を形成する反応性を含むシクロオクチンである。シクロオクチン上の反応性着は、エステル、酸、ヒドロキシル基、アミノオキシ基、マレイミド、α－ハロゲンケトンおよびα－ハロゲンアセトアミドを含む。
ある実施態様において、ＢＦＣは、ジベンゾシクロオクチン(ＤＩＢＯ)、ビアリールアザシクロオクチノン(ＢＡＲＡＣ)、ジメトキシアザシクロオクチン(ＤＩＭＡＣ)およびジベンゾシクロオクチン(ＤＢＣＯ)であるシクロオクチンである。ある実施態様において、シクロオクチンはＤＢＣＯである。
ある実施態様において、シクロオクチンは、親水性ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ｙスペーサーアームを含み、ここで、ｙは１～８の整数である。ある実施態様において、ｙは２～６の整数である。ある実施態様において、ｙは４または５である。
ある実施態様において、ＢＦＣは、１級アミンと特異的かつ効率的に反応するＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ－エステルまたはＤＢＣＯ－スルホ－ＮＨＳ－エステルである(例えば、リシン残基の側鎖またはアミノシラン被覆表面)。ある実施態様において、ＢＦＣは、安定なアミド結合を形成する、アクティベーター(例えばＥＤＣ)存在下で１級または２級アミン基と反応できる、末端カルボン酸(－ＣＯＯＨ)を有するＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－酸である。ある実施態様において、ＢＦＣは、アクティベーター(例えばＥＤＣまたはＤＣＣ)存在下カルボキシル基とまたは安定なアミド結合を形成する活性化エステル(例えばＮＨＳエステル)と反応する、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－アミンである。
ある実施態様において、ＢＦＣは、例えば、ポリペプチドのＣ末端またはその近辺で、システイン残基上のスルフヒドリル基と反応するＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドである。
ある実施態様において、ポリペプチドは、システイン付加により、そのＣ末端を修飾される。例えば、ＰｍＣｎを、ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基に結合でき、ここで、Ｐはプロリンであり、Ｃはシステインであり、ｍは少なくとも０の整数であり、ｎは少なくとも１の整数である。このような修飾を行う方法は、当分野で周知である。
ある実施態様において、１８Ｆ放射標識プローブまたは薬剤は、次の構造ａ、
Figure 0007016323000021
 を有し、ここで、ＢＦＣは、システイン残基でタンパク質(例えば、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン)にコンジュゲートする。
ここに記載する１８Ｆ放射標識ターゲティング薬剤は、ここに記載する操作により、インビボでの直接使用に適する媒体(例えば、食塩水)中、生体直交型、無金属クリック化学を使用して製造される。
XIII. キットおよび製品
ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、予定量の薬剤と、ここに記載する方法の使用指示の組み合わせ包装物である、キットで提供され得る。
例えば、ある実施態様において、ここに記載する障害または状態の処置または予防またはここに記載する検出方法に有用な物質を含む製品が提供される。製品は、容器およびラベルを含む。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から製造され得る。容器は、インビボ造影用のここに記載する組成物を含み、無菌アクセスポートを有し得る(例えば容器は皮下注射針により穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルである)。組成物中の活性剤は、例えば、ここに記載の、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンまたはその誘導体もしくは前駆体である。製品は、さｒない、リン酸緩衝化食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む、第二容器を含み得る。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用指示を含む添付文書を含む、商業的および使用者観点から望ましい他の物もさらに含み得る。
ある実施態様において、キットは、ここにさらに記載するとおり、[１８Ｆ]－ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－４－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡなどの、１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンインビボ造影剤の形成に必要な１以上の試薬を含む。例えば、キットは、ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－４－ＰＥＧ－ＤＢＣＯを含む第一バイアルおよび[１８Ｆ]ＦＰＰＥＧＡを含む第二バイアルを含み得る。キットは、ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－４－ＰＥＧ－ＤＢＣＯを含む第一バイアル、[１８Ｆ]ＦＰＰＥＧＡの非放射標識前駆体、例えば、４－ＰＥＧ－トシル－アジドを含む第二バイアルおよび所望により、１８Ｆ(例えば、Ｏ１８水中に)を含む第三バイアルを含み得る。キットは、さらに[１８Ｆ]－ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－４－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡの製造に必要なバイアル、溶液および所望によりさらなる試薬を含み得る。キットは、実施例に記載の方法に従い、[１８Ｆ]－ＰＤ－Ｌ１アドネクチン－４－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡを完全合成するための指示を含み得る。
同様に、キットは、ここに記載する試薬のような、６４Ｃｕ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン形成に必要な試薬を含み得る。
XIV.実施態様の例示
１. フィブロネクチンIII型第１０ドメイン(１０Ｆｎ３)を含むポリペプチドであり、ここで、(ａ)１０Ｆｎ３ドメインがＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含み、(ｂ)該１０Ｆｎ３が、ヒト１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１)の対応するループの配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、そして(ｃ)そのポリペプチドはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、ポリペプチド。
２. ポリペプチドが５００mMまたはそれ未満のＫＤでＰＤ－Ｌ１に結合する、実施態様１のポリペプチド。
３. ポリペプチドが１００mMまたはそれ未満のＫＤでＰＤ－Ｌ１に結合する、実施態様２のポリペプチド。
４. ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが
(ａ)それぞれ配列番号６、７および８；
(ｂ)それぞれ配列番号２１、２２および２３；
(ｃ)それぞれ配列番号３６、３７および３８；
(ｄ)それぞれ配列番号５１、５２および５３；
(ｅ)それぞれ配列番号６６、６７および６８；
(ｆ)それぞれ配列番号８１、８２および８３；または
(ｇ)それぞれ配列番号９７、９８および９９である、
アミノ酸配列を含む、実施態様１～３の何れかのポリペプチド。
５. ポリペプチドが配列番号５、２０、３５、５０、６５、８０または９６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～４の何れかのポリペプチド。
６. ポリペプチドが配列番号８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様５のポリペプチド。
７. ポリペプチドが配列番号９６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様５のポリペプチド。
８. ポリペプチドが配列番号５、２０、３５、５０、６５、８０または９６の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～７の何れかのポリペプチド。
９. ポリペプチドが配列番号９～１５、２４～３０、３９～４５、５４～６０、６９～７５、８４～９１および１００～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～７の何れかのポリペプチド。
１０. ポリペプチドが配列番号９～１５、２４～３０、３９～４５、５４～６０、６９～７５、８４～９１および１００～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～７および９の何れかのポリペプチド。
１１. ポリペプチドが配列番号１１２～１２１からなる群から選択されるＮ末端リーダーおよび／または配列番号１２２～１５６からなる群から選択されるＣ末端テイルを含む、実施態様１～１０の何れかのポリペプチド。
１２. ポリペプチドがポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される１つまたはそれを超える薬物動態(ＰＫ)部分を含む、実施態様１～１１の何れかのポリペプチド。
１３. ＰＫ部分およびポリペプチドが少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖またはポリエチレングリコール部分を介して結合される、実施態様１２のポリペプチド。
１４. ＰＫ部分とポリペプチドが配列番号１６７～２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリンカーで結合される、実施態様１３のポリペプチド。
１５. 実施態様１～１４の何れかのポリペプチドをコードする核酸。
１６. 核酸が配列番号１６～１９、３１～３４、４６～４９、６１～６４、７６～７９、９２～９５および１０８～１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施態様１５の核酸。
１７. 実施態様１５の核酸を含む、ベクター。
１８. 実施態様１５の核酸を含む、細胞。
１９. 実施態様１～１４の何れかのポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
２０. 実施態様１～１４の何れかのポリペプチドおよび検出可能標識を含む、造影剤。
２１. 検出可能標識が陽電子放出断層撮影により検出可能である、実施態様２０の造影剤。
２２. ポリペプチドがＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＣＢ－ＤＯ２Ａ、３ｐ－Ｃ－ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯ、ＢＡＲＡＣ、ＤＩＭＡＣ、Ｏｘｏ－ＤＯ３Ａ、ＴＥ２Ａ、ＣＢ－ＴＥ２Ａ、ＣＢ－ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ－ＴＥ２Ｐ、ＭＭ－ＴＥ２Ａ、ＤＭ－ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒ、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ－ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ－ＤＴＰＡ、ＣＨＸ－Ａ’’－ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡ、データ、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡからなる群から選択される部分により検出可能標識にコンジュゲートする、実施態様２０または２１の造影剤。
２３. コンジュゲート部分がＮＯＤＡＧＡである、実施態様２２の造影剤。
２４. 検出可能標識が放射性核種である、実施態様２０～２３の何れかの造影剤。
２５. 放射性核種が６４Ｃｕ、１２４Ｉ、７６／７７Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１１Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、６８Ｇａ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、８９Ｚｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃまたは１５３Ｓｍからなる群から選択される、実施態様２４の造影剤。
２６. 放射性核種が１８Ｆである、実施態様２５の造影剤。
２７. 放射性核種が６４Ｃｕである、実施態様２５の造影剤。
２８. キレート剤がＮＯＤＡＧＡであり、放射性核種が６４Ｃｕである、実施態様２４の造影剤。
２９. 造影剤が実施態様６のポリペプチド、ＮＯＤＡＧＡおよび放射性核種６４Ｃｕを含む、実施態様２４の造影剤
３０. 造影剤が実施態様７のポリペプチド、ＮＯＤＡＧＡおよび放射性核種６４Ｃｕをｐ含む、実施態様２４の造影剤
３１. 実施態様１～１４の何れかのポリペプチド、１８Ｆ放射標識補欠分子族および二機能性接合(ＢＦＣ)部分を含む造影剤であって、該造影剤が次の構造
Figure 0007016323000022
 を有し、ここで、１８ＦがＮ原子に対してオルトであり、ｘが１～８の整数であるものであるかまたはその薬学的に許容される塩である、造影剤。
３２. １８Ｆ放射標識補欠分子族が次の構造
Figure 0007016323000023
 を有する、実施態様３１の造影剤
３３. [Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分がピリジン環の窒素に対して１－３配置で存在する、実施態様３１または３２の造影剤。
３４. [Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分がピリジン環の窒素に対して１－２配置で存在する、実施態様３１または３２の造影剤。
３５. [Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分がピリジン環の窒素に対して１－４配置で存在する、実施態様３１または３２の造影剤。
３６. １８Ｆ放射標識補欠分子族が次の構造
Figure 0007016323000024
 を有する、実施態様３１に記載の造影剤。
３７. ｘが２～６の整数である、実施態様３１～３６の何れかに記載の造影剤。
３８. ｘが３～５の整数である、実施態様３７の造影剤。
３９. ｘが４である、実施態様３７の造影剤。
４０. [Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分がピリジン環の窒素に対して１－３配置で存在する、実施態様３１～３９の何れかの造影剤。
４１. ピリジン環がフッ素化反応を妨害しないさらなる置換基を含む、実施態様３１～４０の何れかの造影剤。
４２. ピリジン環の置換基がＣ１－６アルキルである、実施態様４１の造影剤。
４３. 置換基がメチル、エチルまたはプロピルである、実施態様４２の造影剤。
４４. 、１８Ｆ放射標識補欠分子族が構造
Figure 0007016323000025
 を有する、実施態様３１の造影剤。
４５. 実施態様１～１４の何れかのポリペプチド、１８Ｆ放射標識補欠分子族および二機能性接合(ＢＦＣ)部分を含む造影剤であって、造影剤が次の構造
Figure 0007016323000026
 を有し、ここで、“ＯＰＥＧ”が[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘであり、ｘが１～８の整数であるものであるまたはその薬学的に許容される塩であり、ここで、“タンパク質”が実施態様１～１４の何れかに記載の造影剤に含まれるポリペプチドである、造影剤。
４６. ｘが２～６の整数である、実施態様４５の造影剤またはその薬学的に許容される塩。
４７. ｘが３～５の整数である、実施態様４５の造影剤またはその薬学的に許容される塩。
４８. ｘが４である、実施態様４５の造影剤またはその薬学的に許容される塩。
４９. ＢＦＣがタンパク質のアミン、カルボキシル、カルボニルまたはチオール官能基と共有結合を形成する反応性基を含むシクロオクチンである、実施態様３１～４８の何れかの造影剤。
５０. シクロオクチンがジベンゾシクロオクチン(ＤＩＢＯ)、ビアリールアザシクロオクチノン(ＢＡＲＡＣ)、ジメトキシアザシクロオクチン(ＤＩＭＡＣ)およびジベンゾシクロオクチン(ＤＢＣＯ)からなる群から選択される、実施態様４９の造影剤。
５１. シクロオクチンがＤＢＣＯである、実施態様５０の造影剤。
５２. ＢＦＣがさらにポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ｙスペーサーアームを含み、ここで、ｙが１～８の整数である、実施態様３１～５１の何れかの造影剤。
５３. ｙが２～６の整数である、実施態様５２の造影剤。
５４. ｙが４または５である、実施態様５２の造影剤。
５５. ＢＦＣがＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ－エステル、ＤＢＣＯ－スルホ－ＮＨＳ－エステル、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－酸、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－アミンまたはＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドである、実施態様５２の造影剤。
５６. ＢＦＣがＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドである、実施態様５５の造影剤。
５７. 造影剤が次の構造
Figure 0007016323000027
 〔ここで、Ｘは配列番号１３、２８、４３、５８、７３、８８および１０４の何れかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである〕
を有する、実施態様３１の造影剤。
５８. ポリペプチドが配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む、実施態様５７の造影剤。
５９. ポリペプチドが配列番号１０４に示すアミノ酸配列を含む、実施態様５７の造影剤。
６０. 実施態様１～１４および１９～５９の何れかのポリペプチド、組成物または造影剤および使用指示を含む、キット。
６１. サンプルと実施態様１～１４の何れかのポリペプチドを接触させ、ＰＤ－Ｌ１を検出することを含む、サンプルにおけるＰＤ－Ｌ１を検出する方法。
６２. 対象に実施態様３１～５９の何れかの造影剤を投与し、造影剤を検出することを含み、検出された造影剤が対象におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の位置を規定する、対象におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞を検出する方法。
６３. 対象に実施態様３１～５９の何れかの造影剤を投与し、造影剤を検出することを含み、検出された造影剤が対象における腫瘍の位置を規定する、対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を検出する方法。
６４. 造影剤が陽電子放出断層撮影により検出される、実施態様６２または６３の方法。
６５. 実施態様３１～５９の何れかの造影剤の画像を得る方法であって、
ａ)対象に造影剤を投与し；そして
ｂ)陽電子放出断層撮影により造影剤の分布をインビボで造影する
ことを含む、方法。
６６. ＰＤ－Ｌ１を発現する組織または細胞の定量的画像を得る方法であって、細胞または組織と実施態様３１～５９の何れかの造影剤を接触させ、ＰＤ－Ｌ１発現組織を、陽電子放出断層撮影を使用して検出または定量することを含む、方法。
６７. 造影有効量の実施態様３１～５９の何れかの造影剤をＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を有する対象に投与し、陽電子放出断層撮影を使用して、腫瘍における該造影剤の放射性放出を検出することを含み、ここで、放射性放出が腫瘍において検出される、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍を検出する方法。
６８. 対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍の存在を診断する方法であって、
(ａ)実施態様３１～５９の何れかの造影剤をそれを必要とする対象に投与し；そして
(ｂ)造影剤の存在または不存在を検出するために、対象の少なくとも一部の放射線画像を得ることを含み；
ここで、背景を超える造影剤の存在および位置が疾患の存在および位置の指標である、方法。
６９. 対象におけるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の進行をモニタリングする方法であって、
(ａ)それを必要とする対象に実施態様３１～５９の何れかの造影剤を第一時点で投与し、腫瘍のサイズを決定するために、対象の少なくとも一部の画像を得て；
(ｂ)対象に抗腫瘍治療剤を投与し；
(ｃ)対象に造影剤をその後１以上の時点で投与し、各時点で対象の少なくとも一部の画像を得ることを含み；
ここで、各時点での腫瘍の寸法および位置が疾患進行の指標である、方法。
引用による取り込み
ここに記載する、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１５／６２４８５およびＰＣＴ／ＵＳ１５／６２５０２およびウェブサイトを含む全ての文献および引用は、本明細書に完全にまたは一部記載されているのと同程度に、本明細書に引用により包含させる。
ここで、本発明を次の実施例を引用して説明し、これは単に説明であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本発明は詳細に、そしてその具体的実施態様を引用して説明されるが、当業者には種々の変化および修飾を、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなし得ることが認識される。
実施例１：ＰＤ－Ｌ１結合アドネクチンの同定
抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンをヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を用いてスクリーニングしたアドネクチンライブラリーから単離するかまたはライブラリーから同定されたクローンからPROfusionにより親和性成熟させた。これらのアドネクチンの完全長配列、コア配列、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列ならびに“ＰＣ”修飾Ｃ末端を有するバリアントを図１および表３に示す。
例えば、高親和性、抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン、ＡＤＸ＿５３２２＿Ａ０２(“Ａ０２”)を、ＡＴＩ－９６４アドネクチンの親和性成熟により得た。ＡＴＩ－９６４をコードする遺伝子を、ループＢＣ、ＤＥまたはＦＧにおける残基をコードする各ヌクレオチド位置で非野生型ヌクレオチドの小フラクションを導入することにより、再多様化させた。次いで、ＡＴＩ－９６４に関連する得られたアドネクチン配列のライブラリーを、高ストリンジェンシー条件下、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合についてPROfusion(ｍＲＮＡディスプレイ)によりインビトロ選択した。完了した選択を配列決定後クローンを富化し、ＨＴＰＰ形式で発現させ、ＰＤ－Ｌ１に結合する能力および単量体性のフラクションについてスクリーニングした。ＰＤ－Ｌ１に対する親和性および強固な生物物理学的性質の最良の組み合わせを有するクローンを、まずＣ末端配列ＮＹＲＴＰＣＨ６(ＡＤＸ＿５３２２＿Ａ０２として同定された形態)および後にＣ末端配列ＮＹＲＴＰＣで変異させてＣ末端システイ 親和性成熟ＡＴＩ－９６７で同じ方法を行い、アドネクチンＡＤＸ＿５４１７＿Ｅ０１を得た。同様に、親和性成熟ＡＴＩ＿１７６０＿Ｃ０２、ＡＴＩ＿１７６０＿Ｅ０１(“Ｅ０１”)およびＡＴＩ＿１７６０＿Ｆ０１を、ＡＴＩ＿１４２２＿Ｇ０５の親和性成熟により得た。
さらなる抗ヒトＰＤ－Ｌ１アドネクチンを単離した。その配列を表３に示す。
ｈｉｓタグ付抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの発現および精製
全ＤＮＡ構築物は、Ｎ末端ｈｉｓタグと、続くＴＶＭＶ認識配列を含んだ。上記抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのための発現プラスミド(ｐＥＴ－２８ ＮＭベクター)をＢＬ２１(ＤＥ３)細胞(New England Biolabs)にトランスフォームした。細胞を、１Ｌ振盪フラスコで、一夜発現自動誘導(Overnight Express Autoinduction)培地(Novagen)で３７℃で６時間、続いて２０℃で１６時間、２２０RPMで増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳ ｐＨ７.２に懸濁した。細胞を機械的に溶解し、次いで遠心分離により浄化した。可溶性フラクションを、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂(Qiagen)に重力送りにより結合させ、２０mM Ｔｒｉｓ＋１０mMイミダゾールｐＨ８.０、続いて２０mM Ｔｒｉｓ＋４０mMイミダゾールｐＨ８.０で洗浄し、２０mM Ｔｒｉｓ＋４００mMイミダゾールｐＨ８.０で溶出した。ニッケル溶離液にＴＶＭＶプロテアーゼを１：２３倍モル過剰のアドネクチンと添加した。ＴＶＭＶ－アドネクチン溶離液混合物を、２０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０に対して、４℃で１６時間透析した。ＴＶＭＶプロテアーゼおよび開裂ｈｉｓタグフラグメントを分離するために、サンプルを１０mL Histrap ＦＦカラム(GE Healthcare)に載せ、フォロースルーフラクションを回収した。
実施例２：ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの生物物理学評価
ＡＴＩ－１４２０Ｄ０５、ＡＴＩ－１４２０Ｄ０５、ＡＴ１－１４２１Ｅ０４およびＡＴＩ－１４２２Ｇ０５、ＡＴＩ＿１７６０＿Ｃ０２、ＡＴＩ＿１７６０＿Ｅ０１およびＡＴＩ＿１７６０＿Ｅ０１の結合性を評価した。
Figure 0007016323000028
Biacoreにより決定した精製ＡＴＩ－９６４、ＡＴＩ－９６７、ＡＴＩ－９６８、ＡＤＸ＿５３２２＿Ａ０２およびＡＤＸ＿５４１７＿Ｅ０１アドネクチンのヒトまたはカニクイザルＰＤ－Ｌ１への結合性質を表２に示す。細胞結合を、ヒトＰＤ－Ｌ１陽性細胞Ｌ２９８７への結合により決定した。
Figure 0007016323000029
 結合データは、親和性成熟抗ヒトＰＤ－Ｌ１アドネクチンが、１nM未満または０.１nM未満の親和性でヒトＰＤ－Ｌ１に結合することを示す。例示的阻害曲線を図１２に示す。
抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、次のさらなる特徴を有する：
－ フローサイトメトリーによりヒトＰＤ－１ＦｃのＰＤ－Ｌ１陽性細胞Ｌ２９８７への結合阻害の測定により決定して、ヒトＰＤ－１のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を阻害し、例えば、アドネクチンＡＴＩ－９６４、ＡＴＩ－９６５、ＡＴＩ－９６６、ＡＴＩ－９６７、ＡＴＩ－９６８、Ａ０２およびＥ０１について示す；
－ ＥＬＩＳＡにより決定して、ヒトＣＤ８０(Ｂ７－１)のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する。例えば、ＡＴＩ－９６４は４１ｐＭのＥＣ５０で結合を阻害する；ＡＴＩ－９６５は２１０pMのＥＣ５０で結合を阻害する；ＡＴＩ－９６６は２８pMのＥＣ５０で結合を阻害する；およびＡＴＩ－９６８は５６pMのＥＣ５０で結合を阻害する；
－ ＥＬＩＳＡにより決定して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１２Ａ４のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体を混合リンパ球反応(ＭＬＲ)でも試験した：ＡＴＩ－９６４、ＡＴＩ－９６５およびＡＴＩ－９６８はＭＬＲで活性であり、ＡＴＩ－９６６およびＡＴＩ－９６７はＭＬＲで活性ではなかった。
次の実施例は、１８Ｆおよび６４Ｃｕでの抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの標識に関する。
実施例３：２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル４－メチルベンゼンスルホネートの製造
Figure 0007016323000030
Figure 0007016323000031
 ((オキシビス(エタン－２,１－ジイル))ビス(オキシ))ビス(エタン－２,１－ジイル)ビス(４－メチルベンゼンスルホネート)(５ｇ、９.９５mmol)およびナトリウムアジド(０.６４７ｇ、９.９５mmol)の混合物をエタノール(５０mL)に溶解し、反応物を９０℃で１７時間にわたり還流した。溶媒を部分真空で除去し、次いで４０グラムシリカカートリッジに載せ、フラッシュクロマトグラフィー(IscoCombiFlash － ４５分にわたり１０％酢酸エチルのヘキサン溶液から開始して、９０％酢酸エチルのヘキサン溶液までの直線勾配方法を使用して溶出)を使用して精製した。プールしたフラクションをＴＬＣで確認し、合わせて、２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル４－メチルベンゼンスルホネートを無色油状物として得た。２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル４－メチルベンゼンスルホネート生成物の易反応性のため、この物質をさらに特徴付けすることなく“そのまま”次工程で使用した。
実施例４：３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンの製造
Figure 0007016323000032
 水素化ナトリウム(０.１２９ｇ、３.２１mmol)のＤＭＦ(１０mL)懸濁液に、０℃で撹拌中の２－フルオロピリジン－３－オール(０.３６３ｇ、３.２１mmol)のＤＭＦ(５mL)を滴下し、次いで続いて２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル４－メチルベンゼンスルホネート(１.００ｇ、２.６８mmol)のＤＭＦ(５mL)溶液を滴下した。懸濁液を０℃で１０分維持し、次いで１時間で環境温度にし、続いてさらに６０℃で４時間加熱した。溶媒を減圧下除去した。１００mlの酢酸エチルを添加し、続いて濃塩水溶液で３の別の洗浄抽出をした。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィー(IscoCombiFlash － １０～５０％ＥｔＯＡｃのＨｅｘ溶液で抽出)を使用して精製して、無色油状物を得た。３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジン(７０２mg、２.２３３mmol、８３％収率)を油状物として単離した。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ 7.75 (dt, J=4.9, 1.6 Hz, 1H), 7.33 (ddd, J=10.0, 8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.10 (ddd, J=7.9, 4.9, 0.7 Hz, 1H), 4.30 - 4.16 (m, 2H), 3.95 - 3.83 (m, 2H), 3.80 - 3.61 (m, 10H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H) 13C NMR (101MHz, クロロホルム-d) d 142.3, 137.7, 137.5, 123.4, 123.4, 121.7, 121.6, 77.3, 76.7, 70.9, 70.7, 70.6, 70.0, 69.4, 69.0, 50.6 19F NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ -83.55. HRMS (ESI)理論値:C13H20FN4O4+m/z 315.464;実測値315.1463
実施例５：３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－ニトロピリジンの製造
Figure 0007016323000033
Figure 0007016323000034
 水素化ナトリウム(０.１２１ｇ、３.０１mmol)(油中６０％懸濁液)をＤＭＦ(７.０mL)に溶解し、得られた懸濁液を０℃に冷却した。２－ニトロピリジン－３－オール(０.３８４ｇ、２.７４mmol)のＤＭＦ(１.５mL)溶液をゆっくり添加し、続いて２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル４－メチルベンゼンスルホネート(１.０２３ｇ、２.７４mmol)のＤＭＦ(１.５mL)溶液を滴下した。懸濁液を０℃で１０分維持し、次いで２時間で環境温度にし、続いて６０℃で７２時間加熱した。１０mlのＤＩ水で反応停止させ、続いて酢酸エチル抽出した(３×１０mL)。プールしたＥｔＯＡｃ抽出物を濃塩水溶液(１０mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下蒸発させて、淡黄色油状物を得た。粗製物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。２４ｇシリカカートリッジ、２５mL／分、１０％酢酸エチルのヘキサン溶液で開始、続いて２５分かけて５０％酢酸エチルのヘキサン溶液まで直線的に変化させた。この後、勾配をこの溶媒組成で１０分維持し、次いで１０分かけて１００％酢酸エチルまで変えた。３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－ニトロピリジンが、クロマトグラムの３０～４０分部分で溶出し、プールしたフラクションを減圧下、次いで真空で２時間蒸発させて、３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－ニトロピリジン(６８７mg、１.９７３mmol、７２.０％収率)を淡黄色油状物として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ 8.11 (dt, J=4.9, 1.6 Hz, 1H), 7.60 (ddd, J=10.0, 8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.52 (ddd, J=7.9, 4.9, 0.7 Hz, 1H), 4.30 - 4.16 (m, 2H), 3.95 - 3.83 (m, 2H), 3.80 - 3.61 (m, 10H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H) 13C NMR (101MHz, クロロホルム-d) d 147.3, 139.5, 128.4, 124.4. 71.1, 70.7, 70.6,70.0, 69.9, 69.3, 50.7. HRMS (ESI)理論値:C13H20N5O6+m/z 342.1408;実測値342.1409
実施例６：３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－ブロモピリジンの合成
Figure 0007016323000035
Figure 0007016323000036
 水素化ナトリウム(ＮａＨ、２５.７mg、０.６４３mmol)のジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、５mL)懸濁液に、０℃で２－ブロモピリジン－３－オール(１１２mg、０.６４３mmol)のＤＭＦ(１mL)溶液を滴下し、続いて２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル４－メチルベンゼンスルホネート(２００mg、０.５３６mmol)のＤＭＦ(１mL)溶液を滴下した。懸濁液を０℃で１０分維持し、次いで環境温度とし、１時間維持し、続いて６０℃で４時間加熱した。加熱完了後、粗製反応混合物の溶媒を減圧下除去した。粗製反応物を５０mLの酢酸エチルに再溶解し、２×５０mLの塩水溶液で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗製反応物を逆相ＨＰＬＣを使用して精製して、３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－ブロモピリジン、ＴＦＡ(１１２mg、０.２２９mmol、４２.７％収率)を淡黄色油状物として得た。HRMS ESI m/z (M+H), 理論値C13H20BrN4O4 375.0664実測値375.0662 ; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.97 (dd, J=4.6, 1.5 Hz, 1H), 7.54 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1H), 7.40 (dd, J=8.1, 4.6 Hz, 1H), 4.24 (dd, J=5.3, 3.9 Hz,2H), 3.85 - 3.78 (m, 2H), 3.68 - 3.62 (m, 2H), 3.62 - 3.52 (m, 8H), 3.42 - 3.34 (m, 2H)
実施例７：トリメチルアミニウム化合物の合成スキーム
Figure 0007016323000037
実施例８：３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチルピリジン－２－アミンの合成
Figure 0007016323000038
Figure 0007016323000039
 ３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジン(１６０mg、０.５０９mmol)、炭酸カリウム(Ｋ２ＣＯ３、８４mg、０.６１１mmol)およびジメチルアミン(４０％水溶液、０.０９７mL、０.７６４mmol)のジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ、２.５mL)の混合物を、密閉耐圧容器中１１０℃で１４時間加熱した。加熱完了後、粗製反応混合物の溶媒を減圧下除去した。粗製反応を５０mLの酢酸エチルに溶解し、２×５０mLの塩水溶液で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗製反応物を順相クロマトグラフィーを使用して精製して、３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチルピリジン－２－アミン(１４０mg、０.４１３mmol、８１％収率)を無色油状物として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ 7.86 (dd, J=4.9, 1.5 Hz, 1H), 7.02 (dd, J=7.8, 1.5 Hz, 1H), 6.73 (dd, J=7.8, 4.9 Hz, 1H), 4.20 - 4.07 (m, 2H), 3.98 - 3.86 (m, 2H), 3.81 - 3.61 (m, 9H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H), 3.13 - 2.94 (m, 6H), 1.69 (s, 2H). HRMS (ESI)理論値:C15H26N5O4+m/z 340.1980;実測値340.1979。
実施例９：３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルピリジン－２－アミニウムの合成
Figure 0007016323000040
Figure 0007016323000041
 メチルトリフルオロメタンスルホネート(０.０６５mL、０.５８９mmol)を、密閉容器中、窒素気流下、３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチルピリジン－２－アミン(４０mg、０.１１８mmol)のトルエン(１.５mL)溶液に添加した。反応混合物を、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去し、得られた残渣を２×１０mlのエーテルで洗浄し、２×１mlのジクロロメタンで共沸的に乾燥させ、高圧真空で一夜乾燥させて、３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルピリジン－２－アミニウム、トリフルオロメタンスルホン酸塩を、濃無色油状物として定量的収率で得た。LCMS m/z 354.33; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.24 - 8.17 (m, 1H), 7.98 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.75 (ddd, J=8.2, 4.6, 3.2 Hz, 1H), 4.44 (br. s., 2H), 3.88 (d, J=3.9 Hz, 2H), 3.69 - 3.45 (m, 21H)
実施例１０：３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルピリジン－２－アミニウム、トリフルオロメタンスルホン酸塩の合成を使用する[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジン
Figure 0007016323000042
 [１８Ｆ]－フルオライド水溶液(２.０ml,３３.３GBq／９００mCi)をP.E.T. Net(登録商標)Pharmaceuticals in West Point PAから購入し、Sep-Pak light QMA[使用前に５mlの０.５Ｍ 重炭酸カリウム、５mlの脱イオン水および５mlのＭｅＣＮで連続的に前条件化されたSep-Pak light QMAカートリッジ]に直接移した。この移動完了後、[１８Ｆ]フルオライド水溶液を、炭酸カリウム(１５mg／ml；０.１ml)、続いて炭酸カリウム(３０mg／ml、０.１ml)、４,７,１３,１６,２１,２４－ヘキサオキサ－１,１０－ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサン(１５mg、０.０４mmol)および１.２mlのＭｅＣＮの混合物の連続的添加によりQMA Sep-Pakから遊離させた。溶媒を、９０℃で穏やかな窒素気流および減圧下蒸発させた。共沸的乾燥を、各１mlのアセトニトリルで２回繰り返し、無水Ｋ.２.２.２／Ｋ[１８Ｆ]Ｆ複合体を得た。３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルピリジン－２－アミニウム、トリフルオロメタンスルホン酸塩(２mg、５.６μmolを５００μlのＤＭＳＯに溶解し、乾燥クリプタンドに添加した。この溶液を１２０℃で１０分加熱した。この後、粗製反応混合物を３mlのＤＩ水で希釈した。次いで、粗製反応混合物の全内容物を移し、充填し、次の条件下、逆相ＨＰＬＣを使用して精製した：ＨＰＬＣカラム：Luna C18 ２５０×１０溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡのＤＩ水溶液；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を４.６ml／分流速で、定組成方法３２％Ｂを使用し、同時に２８０nmでＵＶをモニターした。[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンをクロマトグラムの２４分マークで単離し、２分にわたり回収した。この生成物を１０mlのＤＩ水を含む１００mlフラスコに集め全内容物をWatersからのSep-Pak Vac tC18 6 cc 1g sep packに送達した。６.１GBq／１６４mCiの[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンをこの反応物から単離した。これを３mlのエタノールを使用してsep-pakから遊離させ、この溶液を、９８℃の熱源で、穏やかな窒素気流下に１５分間減圧蒸発させてフィルム状残渣とした。最終生成物を１００％１×ＰＢＳ緩衝液に再溶解し、この媒体中、１時間、３７℃で安定であった。
[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンを、アルキンを含む適当な生物学的物質との“クリック”アジド－アルキン反応を利用して、１８Ｆ標識生物学的物質(例えば、下記１８Ｆ標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン)の産生に使用できる。
実施例１１：“クリック化学”を使用する１８Ｆ放射標識タンパク質の産生
Ａ. [ １８ Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡを産生するための４－ＰＥＧ－トシル－アジド前駆体のフッ素付加
９００mCiの１８Ｆの１８Ｏ水(３ml)活性(IBA Molecularから購入)を、４,７,１３,１６,２１,２４－ヘキサオキサ－１,１０－ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサン(２.８mg、７.４４μmol)および炭酸カリウム(１.７mg、０.０１２mmol)含有マイクロバイアル(ＱＭＡなし)に直接添加した。さらに２.０mlのアセトニトリルをこの粗製反応混合物に移し、混合物全体を共沸的に乾燥させた。この工程は、混液を９８℃油浴を使用し、穏やかなＮ２気流および部分真空の適用により完了させた。溶液の体積は約２mlに減少した。さらに２mlのアセトニトリルを添加し、この工程を４０分にわたり３回繰り返した。溶液の体積が０.３ml未満に減少したとき、０.７ml分のアセトニトリルを添加し、溶液を体積が約０.１mlになるまでさらに共沸蒸留により減少させた。さらに０.９mlのアセトニトリルを添加し、この工程は、白色固体を形成させて完了させた。この工程は約５５分を要した。最終段階では、バイアルを油浴から取り出し、その後溶液を乾固させ、バイアル中の残渣を完全真空(Ｎ２気流を絶ち)に室温で２０分置いた。クリプタンド混合物の生成および乾燥の全時間は６５分であった。
乾燥クリプタンド混合物に、５００μlのＤＭＳＯに溶解した３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－ニトロピリジン(２mg、５.８６μmol)溶液を添加し、このこの混合物を１２０℃で１０分加熱した。次いで、粗製反応混合物を３mlのＤＩ水で希釈し、全内容物をＨＰＬＣカラムに移し次の条件を使用して精製した：ＨＰＬＣカラム：Luna C18 ２５０×１０mm；溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡのＤＩ水溶液；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液；流速４.６ml／分；圧力１８２０PSI；定組成方法３２％Ｂ；ＵＶ－２８０nm。[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジン([１８Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡ)生成物をクロマトグラムの２４分マークの位置で２分にわたり採取した。この生成物を１５mlのＤＩ水を含む１００mlフラスコに溶解し、全内容物をSep PakVac tC18 6 cc 1g sep packとした。ＰＮ ＷＡＴ０３６７９５。[１８Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡを２.５mlのエタノールを使用してSep Pakから遊離させ、この溶液を、乾燥するまで９８℃、Ｎ２および減圧で濃縮した。この化合物を０.１ml １×ＰＢＳ(リン酸緩衝化食塩水)に溶解した。この生成物をVarian HPLC HPLCカラムLuna C18 (2)４.６×１５０mm(溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡのＤＩ水溶液；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液；流速１.０ml／分；勾配方法０分９０％Ａ １０％Ｂ；１５分３０％Ａ ７０％Ｂ；１７分３０％Ａ ７０％Ｂ；１８分９０％Ａ １０％Ｂ；２０分９０％Ａ １０％Ｂ；ＵＶ－２８０nm)を使用して分析した。２２０mCiの[１８Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡを単離した。
Ｂ. Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯの製造
この実施例は、Ｅ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＰＥＧ４－ＤＢＣＯへの結合を説明する。
マレイミド化学をアドネクチンのＰＥＧ４－ＤＢＣＯへの結合に使用するため、Ｅ０１アドネクチンを、まずそのＣ末端にプロリン、続いてシステインを加えることにより修飾した。この修飾Ｅ０１アドネクチンのアミノ酸配列は、配列番号１０４に提供する。システインを使用して、アドネクチンをＰＥＧ４－ＤＢＣＯに結合する。
４倍モル過剰のマレイミド－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ(クリック化学ツール)をＤＭＳＯに溶解し、１mM ＴＣＥＰ存在下、精製修飾Ｅ０１アドネクチンに添加した。最終ＤＭＳＯ濃度は、コンジュゲーション混合物の５％を超えなかった。コンジュゲーション混合物を室温で１時間静置し、その後質量分析した。コンジュゲーションのＭＳ確認後、サンプルを、ＰＢＳ ｐＨ７.２で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 75カラム(GE Healthcare)を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
Ｃ. [１８Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡのアドネクチンへのカップリング
[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ合成の模式図を図２および９に示す。
０.２mlのＥ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯアドネクチン溶液(セクションＢに記載のとおり製造)の５.４mg／ml溶液を２００mCiの０.１mlの[１８Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡ(実施例４)と、１×ＰＢＳ緩衝液中インキュベートした。溶液を、粗製反応物を数回ピペット内を上下させることにより穏やかに混合し、４５分、４５℃または室温で共にインキュベートした。この粗製反応混合物の内容物をＳＥＣカラムを使用して精製した。Superdex 200 ０.５ml／分 １×ＰＢＳ緩衝液および[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡ生成物を、クロマトグラムの３７分の位置で、２分にわたり採取した。
[１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡを、非放射性標準の共注入を用いるＳＥＣ、ＰＬＲＰＳカラムを使用するＲＰ ＨＰＬＣおよびゲル電気泳動で分析した。
サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を次のパラメータを用いて実施した：
Superdex 200カラム；溶媒１００％１×ＰＢＳ緩衝液；０.５ml／分 ２８０ＵＶ；
逆相ＨＰＬＣ
カラム：ＰＬＲＰＳ ８ミクロン１０００Ａ ４.６×２５０mm
溶媒Ａ：０.１％ギ酸のＤＩ水溶液
溶媒Ｂ：アセトニトリル
流速：１ml／分
圧力：１３５１PSI
勾配：
０分９０％Ａ １０％Ｂ
３０分４５％Ａ ５５％Ｂ
３２分２５％Ａ ７５％Ｂ
３６分２５％Ａ ７５％Ｂ
５０分９０％Ａ １０％Ｂ
１５mCi [１８Ｆ]－Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ－ＦＰＰＥＧＡを、反応を４５℃で実施したとき、ＳＥＣおよびＲＰ ＨＰＬＣ両方の計算で＞９９％の放射化学純度(ＲＣＰ)および比放射能０.６mCi／nmolで得た。反応を室温で実施したとき、５.７２mCiが得られた。[１８Ｆ]－ＦＰＰＥＧＡの比放射能は、反応を４５℃または室温でそれぞれ実施したとき、その合成終了から３時間後、０.５１２mCi／nmolであり、ＲＣＰ８５.７％であった。比放射能は、Nanodrop(www.nanodrop.com参照)を使用して測定した。生成物は、ＳＥＣおよびＰＬＲＰＳ両方で非放射性標準と共溶出した。ゲル電気泳動は、１１kDa分子 １８Ｆ放射標識Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯを、診断造影、基礎研究および放射線治療適用を含む、種々のインビトロおよび／またはインビボ造影適用に使用できる。診断造影および放射線治療適用の可能性のある具体例は、哺乳動物またはその臓器もしくは組織サンプルにおけるＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍の位置、相対的活性決定および／または定量、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍のラジオイムノアッセイおよびＰＤ－Ｌ１分布陽性腫瘍決定のためのオートラジオグラフィーを含む。
特に、１８Ｆ放射標識Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯは、ヒトおよび実験動物の肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚および他の臓器におけるＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍の陽電子放出断層(ＰＥＴ)造影に有用である。１８Ｆ放射標識Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯを使用するＰＥＴ造影を使用して、次の情報を得ることができる：患者における候補ＰＤ－Ｌ１腫瘍処置医薬による組織占拠レベルと、臨床効果の相関；長期臨床試験開始前のＰＤ－Ｌ１腫瘍処置医薬治験のための用量選択；構造新規ＰＤ－Ｌ１腫瘍処置医薬の効果比較；ＰＤ－Ｌ１腫瘍処置医薬での臨床的標的の処置中のインビボトランスポーター親和性および密度に対するＰＤ－Ｌ１腫瘍処置医薬の影響の試験；有効および無効処置中のＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍の密度および分布変化。
Ｄ. １８Ｆ標識アドネクチン製造の別方法
[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンおよびそれでのアドネクチン標識の小改変した方法を提供する。
９００mCiのフッ素－１８の１８Ｏ水(２ml)活性をIBA Molecularから購入し、遠隔操作合成ユニットに移した。このサンプルを、４,７,１３,１６,２１,２４－ヘキサオキサ－１,１０－ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサン(３.２mg、８.５０μmol)および炭酸カリウム(１.４mg、１０.１３μmol)を含むマイクロバイアルに直接移した。さらに１.５mlのアセトニトリルをこのバイアルに移し、混合物全体を共沸的に乾燥させた。この溶液を、バイアルを９０℃油浴に入れ、穏やかなＮ２気流および部分真空の適用により蒸発させた。こ工程を、部分真空を加熱しながら１０分で達成した。マイクロバイアルの総体積を約２mlに減少させた。さらに２mlのアセトニトリルを添加し、このこの工程を４０分にわたり３回繰り返した。溶液の体積が０.３ml未満に減少したとき、０.７ml分のアセトニトリルを添加し、溶液を、体積が約０.１mlになるまでさらに共沸蒸留により濃縮し、さらに０.９ ＭｅＣＮを添加し、この工程を、白色固体が形成されるまで続けた。最終段階では、バイアルを油浴から離し、その後溶液を乾固させ、バイアル中の残渣を完全真空(Ｎ２気流を絶ち)に室温で２０分静置した。３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－ニトロピリジン(２mg、５.８６μmol)を５００μlのＤＭＳＯに溶解し、乾燥クリプタンドに添加した。この溶液を１２０℃で１０分加熱した。この後、粗製反応混合物を３mlのＤＩ水で希釈した。次いで粗製反応混合物の全内容物をＨＰＬＣカラムに移し、次の条件下で精製した：ＨＰＬＣカラム：Luna C18 ２５０×１０溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡのＤＩ水溶液；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を４.６ml／分流速で、定組成方法３２％Ｂを使用し、同時に２８０nmでＵＶをモニターした。[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンをクロマトグラムの２４分の位置で２分にわたり採取した。この生成物を１０mlのＤＩ水を含む１００mlフラスコに集め、全内容物をWatersからのSep-Pak Vac tC18 6 cc 1g sep packに送達した。２２４mCiの[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンをこの反応物から単離した。これを３mlのエタノールを使用してsep-pakから遊離させ、この溶液を、９８℃熱源で、穏やかな窒素気流下に１５分間減圧蒸発させてフィルム状残渣とした。最終生成を１００％１×ＰＢＳ緩衝液に再構成し、この媒体中、１時間、３７℃で安定であった。[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンを使用し、アルキンを含む適切な生物学的物質との“クリック”アジド－アルキン反応を利用して、いくつかのＦ－１８標識生物学的物質を産生した。
Figure 0007016323000043
実施例１２：ＮＯＤＡＧＡ－ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを産生するためのＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＮＯＤＡＧＡへの結合
この実施例は、Ｅ０１およびＡ０２抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＮＯＤＡＧＡへの結合を記載する。マレイミド化学をアドネクチンのＮＯＤＡＧＡ結合に使用するため、両アドネクチンは、そのＣ末端にプロリン、続いてシステインを使用した(上でＥ０１について記載のとおり)。修飾Ｅ０１およびＡ０２アドネクチンのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０４および８８に提供する。システインを、アドネクチンのＮＯＤＡＧＡへの結合に使用する。アドネクチンの６４Ｃｕ標識のため、５０倍モル過剰のマレイミド－ＮＯＤＡＧＡ(CheMatech)をＰＢＳ ｐＨ７.４に溶解し、１mM ＴＣＥＰ存在下精製アドネクチンに添加した。最終ＤＭＳＯ濃度は、コンジュゲーション混合物の５％を超えなかった。コンジュゲーション混合物を室温で１時間静置し、その後質量分析した。コンジュゲーションのＭＳ確認後、サンプルを、ＰＢＳ ｐＨ７.２で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 75カラム(GE Healthcare)を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
実施例１３：６４Ｃｕベースの抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンプローブの合成
６４Ｃｕ－Ａ０２－ＮＯＤＡＧＡの合成
[６４Ｃｕ]－塩化銅(６４ＣｕＣｌ２)の０.１Ｎ 塩酸溶液を０.８mLの０.１Ｎ 酢酸ナトリウム(ＮａＯＡｃ)水溶液で４分、環境温度で中和した。１mLの６４Ｃｕ／ＮａＯＡｃ溶液をＡ０２－ＮＯＤＡＧＡ(３０μLの１.６mg／mL)に添加し、粗製反応物を、混合させるために穏やかにピペッティングし、続いて環境温度で３０分静置した。粗製反応混合物の内容物を、サンプル充填前に２０mLの１×リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)緩衝液で前活性化したＰＤ－１０脱塩カラムに移した。さらに１.５mLの１×ＰＢＳ、続いてさらに０.８ml １×ＰＢＳ溶液をカラムに添加し、これらフラクションを廃棄した次いで。[６４Ｃｕ]－Ａ０２－ＮＯＤＡＧＡを、ＰＤ－１０カラムの１.２mL溶出後採取して、１０.７９mCiを所望の生成物として得た。品質管理数値は、Agilent PLRP-S HPLCカラムサイズ：２５０×４.６０mm、８μm、２８０nmおよび蒸留水中０.１％ギ酸およびアセトニトリルの移動相を使用する逆相ＨＰＬＣ系を使用して測定した。アセトニトリルのパーセンテージを、３０分時間枠で１０％～４５％に直線的に増加させた勾配方法を使用した。[６４Ｃｕ]－Ａ０２－ＮＯＤＡＧＡは、ＨＰＬＣクロマトグラムの２２分マークで対照標準と共溶出した。放射化学純度は、この方法を使用して９６％と測定された。[６４Ｃｕ]－Ａ０２－ＮＯＤＡＧＡもサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)カラム：GE Superdex 200 GLサイズ：１０×３００mm、２８０nmを使用して、２０分マークで対照物質と共溶出した。計算比放射能は、Nanodropタンパク質濃度および精製サンプルの単離放射活性に基づき、９５６.８mCi／μmolベースであった。
６４Ｃｕ－Ｅ０１－ＮＯＤＡＧＡ合成法
[６４Ｃｕ]－塩化銅([６４Ｃｕ]ＣｕＣｌ２)の０.１Ｎ 塩酸溶液(０.２５mL中２０mCi)を、１.１０mLの０.１Ｎ 酢酸アンモニウム緩衝液でｐＨ調節し、次いでＥ０１－ＮＯＤＡＧＡアドネクチンと１×ＰＢＳ水溶液(４０μLの１.２mg／mL、４.６２nmol)混合し、３０分、環境温度でインキュベートした。３０分のインキュベーション後、反応混合物(約１２５０μL)をＰＤ－１０脱塩カラム(GE Healthcare Life Science, Sephadex G25 Medium、１４.５×５０mm － ４０mLの１×ＰＢＳで平衡化)に移し、サンプルを、重力により完全にカラムに入れ、１.１mLの１×ＰＢＳを続けた。液体が完全にカラムを通った後、生成物をサンプルバイアルあたり１×ＰＢＳの１mL増分での溶出により回収した。６４Ｃｕ－Ｅ０１－ＮＯＤＡＧＡを２番目の１mlフラクションで単離し、１mlの１×ＰＢＳ中９.２６mCiと測定された。このサンプルを、ＵＶ／ｖｉｓ検出器(λ＝２８０nm)、posi-ram検出器およびSuperdex 200 10/300 GLサイズ排除カラム(GE Healthecare Life Science、ポアサイズ１３μm)を備えた分析的サイズ排除ＨＰＬＣ方法で分析した。流速は０.５mL／分であり、水性移動相は、６０分、１×ＰＢＳと０.０２％ＮａＮ３で定組成であった。放射化学純度は、この系を使用して９９％であり、生成物は非放射性対照と共溶出した。比放射能を、３点検量曲線の式に基づき計算した(ｙ＝６５６９７８ｘ)。バイアル３からの約１００μLの生成物溶液を、Superdex-200サイズ排除カラムに注入した。生成物ピークを集め、０.７４mCiであると測定され、生成物ピークのＵＶは１５６３６７単位と計数され、比放射能は.１mCi／nmolであった。
実施例１４：抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤でのＰＤ－Ｌ１陽性細胞とＰＤ－Ｌ１陰性細胞のインビトロ鑑別
この実験において、６４Ｃｕ－Ｅ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン(ＮＯＤＡＧＡをキレーターとして使用した)を、インビトロでｈＰＤ－Ｌ１陽性細胞とｈＰＤ－Ｌ１陰性細胞を区別する能力について試験した。ｈＰＤ－Ｌ１陰性ＨＴ－２９細胞と比較して、６４Ｃｕ－Ｅ０１とｈＰＤ－Ｌ１陽性Ｌ２９８７細胞の示差的会合により示されるとおり、細胞標識は特異的であった(細胞付随放射活性は、ｈＰＤ－Ｌ１陽性Ｌ２９８７細胞で４４.６倍高かった)。さらに特異性を、過剰の４５０nM 冷(非標識)Ｅ０１アドネクチンと共インキュベートしたときの細胞関連６４Ｃｕ－Ｅ０１の著しい減少により示されるとおり確認した(９９.６％減少)。細胞関連１８Ｆ－Ｅ０１の減少は、細胞を４５０nMの冷(非標識)非ＰＤ－Ｌ１結合アドネクチンと共インキュベートしたとき、最小であった(９.９％減少、非有意)(図３)。
１×１０６ ｈＰＤ－Ｌ１陽性Ｌ２９８７ヒト肺癌細胞またはｈＰＤ－Ｌ１陰性ＨＴ－２９ヒト結腸直腸腺癌細胞を、５mL 培養チューブ(ｎ＝３チューブ／条件)に入れた。６４Ｃｕ－Ｅ０１アドネクチン溶液をＰＢＳ＋０.５％ＢＳＡ中、３００nCi／２００μL濃度で調製した。この溶液の一部を冷(非標識)Ｅ０１アドネクチンまたは冷(非標識)非ＰＤ－Ｌ１結合アドネクチンで最終濃度４５０nMまで置き換えた。細胞サンプルを、５分、２００×ｇで遠心分離し、２００μLの適切な６４Ｃｕ－Ｅ０１アドネクチン溶液に再懸濁し、氷上、１時間インキュベートした。インキュベーション時間後、細胞サンプルを２００×ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを１mL ＰＢＳ＋０.５％ＢＳＡに懸濁し、洗浄操作を繰り返し、計３回洗浄した。最終洗浄後、細胞を再び２００×ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。次いで残存細胞ペレットの放射活性をガンマカウンターで測定した。
これらの結果は、６４Ｃｕ－Ｅ０１アドネクチンがインビトロでＰＤ－Ｌ１(＋)対ＰＤ－Ｌ１(－)細胞を区別する能力を示す。特異性は、４５０nM非標識抗ＰＤ－Ｌ１ Ｅ０１アドネクチンと共インキュベートしたサンプルの細胞関連放射性トレーサーの著しい減少によりさらに示された(そして、４５０nMの非ＰＤ－Ｌ１結合アドネクチンと共インキュベートしたとき、統計的に有意ではない減少しかなかった)。種々のアドネクチンバリアントならびに放射性核種としての１８Ｆを使用した同等の実験を行い、類似する結果であった。
実施例１５：抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤でのＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍とＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍の区別
ＰＥＴ造影について、迅速血液クリアランス速度は、非関連組織から“背景”プローブシグナルが枯渇するのに必要な時間を減らすことにより、抗体などのよりゆっくり除去されるタンパク質を超える利点を有する。病院において、長い血中半減期の抗体ベースのＰＥＴトレーサーは、画像を集めることができるまで、注射後数日待つ必要があり得る。迅速除去プローブは、プローブ注射と同一の日に集めることができる高コントラスト画像へのドアを開き、より重要なことに、試験動物または検査患者の全体的放射能被爆削減に役立ち得る。
この実験において、上の実施例に記載のとおり製造した６４Ｃｕ－Ａ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン(ＮＯＤＡＧＡをキレーターとして使用した)を、マウスにおいてｈＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍とｈＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍を区別する能力について試験した。
両側性異種移植腫瘍担持マウスを、１×１０６ ｈＰＤ－Ｌ１(＋)Ｌ２９８７ヒト肺癌細胞および１.５×１０６ ｈＰＤ－Ｌ１(－)ＨＴ－２９ヒト結腸癌細胞を、マウスの逆側部位皮下に注入することにより作製した。腫瘍が約３００mm３(細胞移植約２～３週後)、動物を造影のために選択した。造影について、動物を２％イソフルランで麻酔し、尾静脈カテーテルを入れた。次いでマウスを慣用の４動物収容能の動物ホルダーに入れ、そこで、試験の間、麻酔下のままにした。動物ホルダーをmicroPET(登録商標)Ｆ１２０TMスキャナー(Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN)に移した。この装置の体軸方向視野は７.６cmである。この限界で、動物を、走査領域が眼の直ぐ前からほぼ尾の付け根までとなるように配置した。
１０分伝達画像を、まず最終ＰＥＴ画像の減衰補正目的で、５７Ｃｏ点源を使用して獲得した。伝達走査後、放射性トレーサー溶液を、先に導入した尾静脈カテーテルから投与し、２時間放射画像を得た。注射放射性トレーサー溶液は、約２００μCi ６４Ｃｕ－Ａ０２(ＮＯＤＡＧＡキレーター有り)または３mg／kg最終濃度の冷、非標識Ａ０２アドネクチンを添加した２００μCi ６４Ｃｕ－Ａ０２であった(個々の動物体重に基づく)。全注射剤を、注射前２００μL 食塩水中に製剤化した。正確な注射用量を、製剤用量を正確に採り、シリンジおよび尾静脈カテーテルに残存する放射活性を減算することにより、計算した。
画像を、回収伝達画像を使用する減衰補正と共に最大事後確率(ＭＡＰ)アルゴリズムを使用して再構築しおよび放射性同位体減衰について補正した。最終画像において、注目画像領域(ＲＯＩ)を、ASIProソフトウェア(Siemens Preclinical Solutions)を使用して、腫瘍境界周囲に引いた。時間－活性曲線を各ＲＯＩについて計算し、２時間放射画像にわたる腫瘍体積内の放射性トレーサーの定量的図を得た。最終比較について、個々の時間－活性曲線を各特定の動物の注射放射性トレーサー用量に基づき、正規化した。放射性トレーサー取り込みを、各時間－活性曲線の最終１０分を使用して、腫瘍で比較した(放射性トレーサー注射後１時間５０分～２時間)。この方法を使用して、ｈＰＤ－Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植における放射性トレーサー取り込みは、６４Ｃｕ－Ａ０２放射性トレーサーしか受けていない動物で見られたｈＰＤ－Ｌ１(－)ＨＴ－２９異種移植の３.０５倍であった。ｈＰＤ－Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植に６４Ｃｕ－Ａ０２放射性トレーサーおよび３mg／kg非標識Ａ０２を共注射した動物において、アドネクチン取り込みはｈＰＤ－Ｌ１(－)ＨＴ－２９異種移植で見られる１.０４倍しかなかった(図４Ａおよび４Ｂ)。
放射性核種として１８Ｆを使用する同様の実験をマウスで行い、類似する結果が得られ、１８Ｆ－Ａ０２アドネクチン放射性トレーサーを使用して、ｈＰＤ－Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植対ｈＰＤ－Ｌ１(－)ＨＴ－２９異種移植の最大放射性トレーサー取り込み比３.５３：１が得られた。すなわち、ヌードマウスにＨＴ－２９およびＬ２９８７細胞を皮下にインプラントした。腫瘍が約２００～３００mm３に達したら、動物を造影のために選択した。マウスを、酸素中２％イソフルランで麻酔し、Focus 120 PET造影系(Siemens Preclinical Solutions)の撮影床に置いた。次いで約１５０μCi １８Ｆ－Ａ０２を尾静脈から注射し、動物を１２０分連続的に造影した。次いで１０分伝達画像を減衰補正として使用するため、５７Ｃｏ点源を使用して集めた。AsiProソフトウェア(Siemens Preclinical Solutions)を使用する減衰補正と共に３Ｄ最大事後確率アルゴリズムを使用して、画像を再構築した。結果は、放射性トレーサーしか受けていないマウスにおけるｈＰＤ－Ｌ１(－)ＨＴ２９異種移植と比較して、ｈＰＤ－Ｌ１(＝)Ｌ２９８７異種移植における明らかな示差的取り込みを示した。
いくつかの試験で、動物を造影直後頸椎脱臼により屠殺した。次いで動物の剖検を行い、個々の組織(血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉、胃、骨、Ｌ２９８７腫瘍およびＨＴ－２９腫瘍)を予め秤量したチューブに集めた。次いで、全組織を再び秤量して、各組織の重量を決定した。次いで、各組織の放射活性をPerkin-Elmer Wizard3ガンマカウンターを使用してエクスビボで直接測定した。全組織について、カウント毎分(ＣＰＭ)で測定した値を個々の動物の注射放射性について正規化し、放射性減衰について補正した。次いでこれらの結果をプロットして、放射性トレーサーの生体分布を示した。１８Ｆ－Ａ０２アドネクチン放射性トレーサーについてのこの分析の例を図５に示す。これらの結果は、ｈＰＤ－Ｌ１(－)ＨＴ－２９異種移植と比較したｈＰＤ－Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植における放射性トレーサーの明らかな示差的取り込みを示す。さらに、高ＰＤ－Ｌ１取り込みの組織は腎臓のみであり、これは、１８Ｆ－Ａ０２アドネクチンのクリアランスが、この分子の分子量に基づき、腎臓濾過に基づくととして予測される。
まとめると、これらの結果は、インビボでのｈＰＤ－Ｌ１(＋)対ｈＰＤ－Ｌ１(－)異種移植腫瘍の鑑別の直接可視化を提供する。特異性を、３mg／kg非標識抗ＰＤ－Ｌ１ Ａ０２アドネクチンの共注射によりさらに証明し、ｈＰＤ－Ｌ１(－)異種移植レベルに対して、ｈＰＤ－Ｌ１(＋)腫瘍における放射性トレーサー取り込みの減少をもたらした。これは、ＰＥＴ造影を使用するＰＤ－Ｌ１組織発現の可視化のための抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンをさらに検証する。
抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンベースの造影剤はまたカニクイザルで実施したとき、類似する結果を示す。これらの試験において、上の実施例に記載のとおり製造した１８Ｆ－Ｅ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンを、カニクイザルにおいて高コントラスト画像を作成する能力について試験した。ここに記載する抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンは、カニクイザルＰＤ－Ｌ１に高親和性を維持した(しかし、齧歯類ＰＤ－Ｌ１に低親和性を有した)。さらに、カニクイザルがマウスモデルのようなＰＤ－Ｌ１(＋)腫瘍を有しないため、造影性能を、主に内因性ＰＤ－Ｌ１発現(ＰＤ－Ｌ１(＋)組織の高感受性検出の可能性を可能とする低バックグラウンドを有する)の状況での画像で測定した背景レベルで評価した。これらの試験において、得られたＰＥＴ画像における背景レベルは極めて低く、主に腎臓、脾臓および膀胱に顕著な放射性トレーサー蓄積があった。
血管アクセスポート(ＶＡＰ)を先に導入したカニクイザル雄サルを０.０２mg／kgアトロピン、５mg／kg テラゾールおよび０.０１mg／kg ブプレノルフィンＩ.Ｍ.で麻酔した(全て一シリンジに吸引)。次いでｉ.ｖ.カテーテルを橈側皮静脈に、造影操作中水和を維持するための流体投与のために設置する。動物に気管内チューブ(通常３.０mm)を挿管し、microPET(登録商標)F220TMＰＥＴ装置(Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN)の撮影床に移した。イソフルランおよび酸素で麻酔を維持し、Ｉ.Ｖ.流体(ＬＲＳ)を造影操作中６ml／kg／時間の速度で注入した。microPET(登録商標)F220TM装置の体軸方向視野がわずか７.６cmであるため、５つの異なる床位置の画像を得て、心臓の直ぐ上からほぼ骨盤までの動物の多層画像を作成した。
各視野について、１０分伝達画像を、まず最終ＰＥＴ画像の減衰補正目的で、５７Ｃｏ点源を使用して獲得した。伝達画像が全床位置で得られたら、約１.５mCi(約０.０１５mg／kg)の１８Ｆ－Ｅ０１アドネクチン放射性トレーサーを、挿入ＶＡＰから投与した。次いで５分間放射走査を、各床位置で逐次的に開始し、心臓をほぼ中心とする位置１から開始し、動物の骨盤に向かって移動させた。画像が各位置で獲得されたら(１～５)、撮影床を床位置１に戻し、この工程を反復した。この操作を使用して、計５つの異なる画像を、各床位置で造影試験中に得た。
個々の画像を、回収伝達画像を使用する減衰補正と共にフィルタ補正逆投影法(ＦＢＰ)アルゴリズムを使用して再構築し、放射性同位体減衰について補正した。次いで、最終多層画像を、造影試験の期間をカバーする、単一パス(すなわち単一多層画像は、床位置１～５の連続的画像の各セットから作られた)から得られた全５床位置の画像の整列により得た。最終画像を目視検査して、可視放射性トレーサー取り込み(すなわち脾臓、腎臓、膀胱)および背景組織(筋肉)の領域を記した(図６)。１８Ｆ－Ｅ０１アドネクチンの背景蓄積は極めて低く、わずかなシグナルが筋肉などの背景組織で可視であった。さらに、取り込みは脾臓に確認され、これは、ｍＲＮＡ発現に基づくＰＤ－Ｌ１(＋)であると考えられる。それ故に、カニクイザルでの試験は、内因性ＰＤ－Ｌ１の存在下での高感受性ＰＤ－Ｌ１造影の可能性を示す。
全体で、齧歯類およびカニクイザルでのＰＥＴ試験は、６４Ｃｕおよび１８Ｆ標識抗ヒトＰＤ－Ｌ１アドネクチンが、低レベルＰＤ－Ｌ１発現の組織の高感受性検出の可能性がある、ＰＤ－Ｌ１陽性組織のインビボ標識の強くかつ特異的なプローブを提供する。
インビボ造影実験を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体でも行い、この造影剤が検出された領域は、ＰＤ－Ｌ１造影剤が検出された領域と同一であり、それ故に抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤がインビボでのＰＤ－Ｌ１陽性細胞を成功裏に検出することを確認する。
実施例１６：[１８Ｆ]－Ｅ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンでのヒトおよび異種移植組織のインビトロオートラジオグラフィー
ヒト肺腫瘍組織をＯＣＴに包埋し、凍結するまで２－メチルブタン中で２～５分冷やした。サンプルを、使用するまで－８０℃冷凍庫に保管した。ヒト異種移植組織もこのアッセイに包含させた。両側性異種移植を担持するマウスを、４×１０６ ｈＰＤ－Ｌ１(＋)Ｌ２９８７細胞および１.５×１０６ ｈＰＤ－Ｌ１(－)ＨＴ－２９ｔ細胞をｎｕ／ｎｕマウスの逆側側面に皮下に注射することにより作製した。適切なサイズ(約２００～３００mm３)に達した異種移植腫瘍が得られたら、マウスを２％イソフルランで麻酔し、頸椎脱臼により屠殺した。新鮮腫瘍組織を切除し、ＯＣＴに浸し、２－メチルブタン中、２～５分、凍結するまで冷やした。次いで組織をホイル／ジップロック(登録商標)バッグに包み、使用するまで－８０℃で保管した。全組織(ヒト肺腫瘍および異種移植)について、５μm厚の切片(２切片／スライドとして採取)をクライオスタットを使用して作成し、ガラス顕微鏡スライドに融解させて載せ、約３０分空気乾燥させた。
それぞれ０.０２５nM、０.２５nM、２.５nMおよび２５nMの冷(非標識)Ａ０２アドネクチンでおよび２５nM非ＰＤ－Ｌ１結合アドネクチンでの遮断試験を、次の条件を使用して実施した。個々のスライド(１スライド／濃度)をプラスチックスライドカセットに入れ、Ｄａｋｏ無血清タンパク質遮断溶液と３０分プレインキュベートした。次いでスライドをガラススライドインキュベーションチャンバーにさらなるインキュベーションのために移した。別に、０.２５nM １８Ｆ－Ａ０２アドネクチンの原液を、１０.６μlの元の放射性リガンド原液(実験時７０６４nM)を３００mlのＰＢＳ＋０.５％ＢＳＡで希釈することにより調製した。この原液から、４０mlを各インキュベーションチャンバーに添加した。これらのチャンバーの１つは放射性リガンド緩衝液溶液しか含まず、これを総結合セクションと称する。他のインキュベーションチャンバーには、４０mlのこの原液を各濃度の遮断化合物(０.０２５nM、０.２５nM、２.５nMまたは２５nMの非標識Ａ０２アドネクチンまたは２５nMの非標識非ＰＤ－Ｌ１結合アドネクチン)と共に入れた。スライドを個々の緩衝液溶液で１時間、室温でインキュベートして、最大結合に到達させた。インキュベーション後、各処置群からのスライドをインキュベーション溶液から除き、氷冷洗浄緩衝液(ＰＢＳ＋０.５％ＢＳＡ)に３分入れ、４回に分けて洗浄した。次いでスライドを冷空気流下、約３０分乾燥させた。空気乾燥スライドをスライドを、一夜、室温で造影プレート(BAS-SR 3545S)に置くことにより暴露した。造影プレートを、バイオ画像解析装置(Fujifilm Fluorescent Image Analyzer, FLA-9000)を使用して走査した。放射線像画像のピクセルサイズは１００μmであった。画像解析をMulti-Gaugeソフトウェアを使用して実施した。目的画像領域(ＲＯＩ)を、全試験群で腫瘍組織全体の周りに設けた。組織関連放射活性からのオートラジオグラフィーシグナルを、これらＲＯＩについて定量した。
総結合セクションと比較したとき、１８Ｆ－Ａ０２アドネクチン放射性リガンドの明らかな置換が、ヒト肺腫瘍切片ならびにヒト異種移植切片の両方で、非標識Ａ０２アドネクチンの４つの異なる濃度(０.０２５nM、０.２５nM、２.５nMおよび２５nM)で決定された。１８Ｆ－Ａ０２の用量依存的置換が非標識Ａ０２アドネクチン添加で全組織切片で見られ、２５nM非ＰＤ－Ｌ１結合アドネクチンは総結合と比較して、全組織で最小遮断を示した(図７)。
各組織からの連続５μm組織切片を抗ヒト－ＰＤ－Ｌ１免疫組織化学操作に付し、サンプルにおけるＰＤ－Ｌ１抗原発現レベルを確認した(図８)。
まとめると、これらの結果は、ヒト肺腫瘍サンプルならびにヒト異種移植組織両方におけるＰＤ－Ｌ１の直接可視化を提供する。個々の組織における放射性リガンド結合レベルは、ＩＨＣによる凍結切片のＰＤ－Ｌ１染色の強度に相関する。さらに、非標識抗ＰＤ－Ｌ１ Ａ０２アドネクチンでの受容体の用量依存的遮断(および非標識非ＰＤ－Ｌ１結合アドネクチンでの遮断欠失)が、ＰＥＴ造影を使用するＰＤ－Ｌ１組織発現の可視化のための１８Ｆ－Ａ０２をさらに確認する。
実施例１７：市販GE TRACERlab FX2 N合成ユニットを使用する放射性合成のための一般的操作による、[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンの自動化製造
Figure 0007016323000044
 操作：
[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンの自動化合成を、非カセットタイプGE TRACERlab FX2 N合成モジュールを使用して実施した。合成ユニットの設定を表４に示す。[１８Ｆ]－フルオライド水溶液(２.０ml、２９.６GBq／８００mCi)を、Sep-Pak light QMA[Sep-Pak light QMAカートリッジを、使用前５mlの０.５Ｍ 重炭酸カリウム、５mlの脱イオン水および５mlのアセトニトリルで連続的に前条件化した]に送達した。この移動完了後、[１８Ｆ]フルオライド水溶液を、リアクターへの溶出混合物(“Ｖ１”から)の添加によりQMA Sep-Pakから遊離させた。溶媒を穏やかな窒素気流および減圧下蒸発させた。前駆体溶液(“Ｖ３”から)を乾燥クリプタンド残渣に添加し、この反応混合物を１２０℃で１０分加熱した。次いで４mlの蒸留水(“Ｖ４”から)をリアクター中の粗製反応混合物に添加し、混合物を充填の最後を制御する液体センサーを経て、半分取ＨＰＬＣの５mlサンプル注入ループに移した。混合物を半分取ＨＰＬＣカラム(Luna C18(２)。２５０×１０mm、Phenomenex)に充填した。３５％アセトニトリルの０.１％トリフルオロ酢酸水溶液中の混合物を、４.６ml／分の速度でカラムを通した。このＨＰＬＣカラムから生成物を１５ml 蒸留水含有希釈フラスコに集め、その全内容物をｔＣ１８ １グラム、固相抽出カートリッジに移した。３５２mCi(１３GBq)の[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンを、このカートリッジ(“Ｖ１４”から)から３mlのエタノールで遊離させ、アルキンを含む適切な生物学的物質との“クリック”アジド－アルキン反応を利用して、１８Ｆ標識生物学的物質の産生に使用し得る。
Figure 0007016323000045
実施例１８：IBA Synthera合成ユニットでの放射性合成の一般的に操作による[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンの自動化製造
Figure 0007016323000046
 操作：
[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンの自動化合成を、カセットタイプIBA Synthera合成モジュールおよび適切にアセンブルしたインテクレーター・フルイディック・プロセッサーキットを使用して実施した。インテクレーター・フルイディック・プロセッサー(ＩＦＰ)キットにこの合成の適切な前駆体を充填し、表５に要約する。精製をVarian HPLCユニットで行った。ＨＰＬＣの注入ループの充填は、ＨＰＬＣユニットの窒素の定流により制御された。両自動化の設定を表５に要約する。[１８Ｆ]－フルオライド水溶液(２.０ml、２９.６GBq／８００mCi)をSep-Pak light QMA[Sep-Pak light QMAカートリッジを、使用前５mlの０.５Ｍ 重炭酸カリウム、５mlの脱イオン水および５mlのアセトニトリルで連続的に前条件化した]に送達した。この移動完了後、[１８Ｆ]フルオライド水溶液を、リアクターへの溶出混合物(“Ｖ１”から)の添加によりQMA Sep-Pakから遊離させた。溶媒を穏やかな窒素流および減圧下蒸発させた。前駆体溶液(“Ｖ２”から)を乾燥クリプタンド残渣に添加し、この反応混合物を１２０℃で１０分加熱した。次いで３mlの蒸留水(“Ｖ４”から)をリアクター中の粗製反応混合物に添加し、混合物を充填の最後を制御する液体センサーを経て、半分取ＨＰＬＣの５mlサンプル注入ループに移した。混合物を半分取ＨＰＬＣカラム(Luna C18(２)。２５０×１０mm、Phenomenex)に充填した。３５％アセトニトリルの０.１％トリフルオロ酢酸水溶液中の混合物を、４.６ml／分の速度でカラムを通した。生成物を１５ml 蒸留水含有希釈フラスコに集め、その全内容物をその全内容物をｔＣ１８ １グラム、固相抽出カートリッジに移した。３２５mCi(１２GBq)の[１８Ｆ]－３－(２－(２－(２－(２－アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)－２－フルオロピリジンをこのカートリッジから３mlのエタノールで遊離させ、アルキンを含む適切な生物学物質との“クリック”アジド－アルキン反応を利用して、１８Ｆ標識生物学的物質の産生に使用し得る。
Figure 0007016323000047
実施例１９：６８Ｇａベースの抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンプローブの合成
６８Ｇａ－Ｅ０１－ＮＯＤＡＧＡの合成
０.１Ｎ 塩酸溶液中の[６８Ｇａ]－ガリウムクロライドを３２mgの酢酸ナトリウム(ＮａＯＡｃ)で４分、環境温度で中和し、得られた溶液を全体積が適切に混合されたことを確実にするために、撹拌した。次いでこの溶液をＥ０１－ＮＯＤＡＧＡ(１５μLの１.３mg／mL)溶液に添加し、粗製反応を混合を可能とするために穏やかにピペッティングし、続いて環境温度に１５分静置した。粗製反応混合物の内容物を、サンプル充填前に２０mLの１×リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)緩衝液で前活性化したＰＤ－１０脱塩カラムに移した。さらに１.５mLの１×ＰＢＳ、続いてさらに０.８ml １×ＰＢＳ溶液をカラムに添加し、これらフラクションを廃棄した。次いで[６８Ｇａ]－Ｅ０１－ＮＯＤＡＧＡをＰＤ－１０カラムの１.４mL溶出後に回収して、５.７８mCi(２１４MBq)を所望の生成物として得た。品質管理数値は、Agilent PLRP-S HPLCカラムサイズ：２５０×４.６０mm、８μm、２８０nmおよび蒸留水中０.１％ギ酸およびアセトニトリルの移動相を使用する逆相ＨＰＬＣ系を使用して測定した。アセトニトリルのパーセンテージを、３０分時間枠で１０％～４５％に直線的に増加させた勾配方法を使用した。[６８Ｇａ]－Ｅ０１－ＮＯＤＡＧＡは、ＨＰＬＣクロマトグラムの２２分マークで対照標準と共溶出した。放射化学純度は、この方法を使用して９８％と測定された。[６８Ｇａ]－Ｅ０１－ＮＯＤＡＧＡもサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)カラム：GE Superdex 200 GLサイズ：１０×３００mm、２８０nmを使用して、２０分マークで対照物質と共溶出した、(ＳＥＣ)カラム：GE Superdex 200 GLサイズ：１０×３００mm、２８０nm。
Figure 0007016323000048
実施例２０：[１９Ｆ]－Ｅ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンの薬物動態
次の実験を、カニクイザル(ｎ＝３)における１９Ｆ標識－Ｅ０１抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンおよびＥ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯ(非標識抗ＰＤ－Ｌ１－アドネクチン－ＤＢＣＯ前駆体)の薬物動態の比較のために実施した。これは、投与の間に２週間のウォッシュアウト期間を挟むクロスオーバー設計試験であった。血清サンプルを集め、[１９Ｆ]－Ｅ０１をＥ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯと区別しない特定のアドネクチン結合試薬を使用するＬＢＡまたはＥ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯと[１９Ｆ]－Ｅ０１を区別するＬＣ／ＭＳアッセイで分析した。
ＰＫパラメータの概要を表６に示す。
Figure 0007016323000049
カニクイザルへのｉ.ｖ.投与後、[１９Ｆ]－Ｅ０１のＣＬＴは両試験で低かった。Ｔ－ＨＡＬＦも短く、約１.７時間であった。Ｅ０１－４ＰＥＧ－ＤＢＣＯのＰＫは[１９Ｆ]－Ｅ０１のものと類似した。ＰＫパラメータもＬＣ／ＭＳで類似した。
Figure 0007016323000050
Figure 0007016323000051
Figure 0007016323000052
Figure 0007016323000053
Figure 0007016323000054
Figure 0007016323000055
Figure 0007016323000056
Figure 0007016323000057
Figure 0007016323000058
Figure 0007016323000059
Figure 0007016323000060
Figure 0007016323000061
Figure 0007016323000062
Figure 0007016323000063
Figure 0007016323000064
Figure 0007016323000065
Figure 0007016323000066
Figure 0007016323000067
Figure 0007016323000068
Figure 0007016323000069
Figure 0007016323000070
Figure 0007016323000071
Figure 0007016323000072
Figure 0007016323000073
Figure 0007016323000074
Figure 0007016323000075
Figure 0007016323000076
Figure 0007016323000077
Figure 0007016323000078
Figure 0007016323000079
Figure 0007016323000080
Figure 0007016323000081
均等物
当業者は、ここに記載する特定の実施態様の多くの均等物を認識するかまたは日常的レベルを超えない実験で、確認し得る。このような均等物は、添付する特許請求の範囲に包含させることが意図される。

Claims (14)

  1. 対象におけるＰＤ－Ｌ１タンパク質を可視化するのに用いる放射標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤であって、該造影剤にはヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するフィブロネクチンIII型第１０ドメイン(１０Ｆｎ３)を含み、
    該可視化する方法が、
    （ａ）該対象に放射標識抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤を約３～１０ｍＣｉ（１００～３３３ＭＢｑ）の用量または約６ｍＣｉ（±１０％）の用量で投与し；そして
    （ｂ）段階（ａ）の後対象のＰＥＴ走査を約３０～１２０分または６０～１００分実施する
    ことを特徴とし、
    抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが
    (ａ)それぞれ配列番号６、７および８；
    (ｂ)それぞれ配列番号２１、２２および２３；
    (ｃ)それぞれ配列番号３６、３７および３８；
    (ｄ)それぞれ配列番号５１、５２および５３；
    (ｅ)それぞれ配列番号６６、６７および６８；
    (ｆ)それぞれ配列番号８１、８２および８３；または
    (ｇ)それぞれ配列番号９７、９８および９９
    のアミノ酸配列を含む、造影剤。
  2. 対象が少なくとも１つの腫瘍と腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１タンパク質のレベルを有する、請求項１の造影剤。
  3. 対象がＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの治療に応答しそうであるかどうかを決定するための請求項２に記載の造影剤であって、１つまたはそれ以上の腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１のレベルがＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの治療に要求されるＰＤ－Ｌ１のレベルに等しいかまたはそれ以上、例えば５％、２５％、５０％またはそれ以上の腫瘍細胞がＰＤ－Ｌ１を発現するならば、対象がＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの治療応答しそうである、造影剤。
  4. １つまたはそれ以上の腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１のレベルがＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストでの治療に要求されるＰＤ－Ｌ１のレベルに等しいかまたはそれ以上ならば、対象をＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストで治療する、請求項３の造影剤。
  5. 対象が治療剤で治療されている、請求項１の造影剤。
  6. 治療剤がＰＤ－１アンタゴニストである、請求項５に記載の造影剤。
  7. 抗ヒトＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤が１８Ｆで標識されている、請求項１～６の何れかに記載の造影剤。
  8. 造影剤が治療剤の最初の投与前に対象に投与される、請求項５に記載の造影剤。
  9. 造影剤が治療剤の最初の投与後に対象に投与される、請求項５に記載の造影剤。
  10. 抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンがポリエチレングリコールおよびシアル酸からなる群から選択される１つまたはそれ以上の薬物動態(ＰＫ)部分を含む、請求項１～６の何れかに記載の造影剤。
  11. 抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチン造影剤が１８Ｆ放射標識補欠分子族および二機能性接合（ＢＦＣ）部分を含み、該造影剤が次の構造
    Figure 0007016323000082
     を有し、ここで、
    （ａ）１８ＦがＮ原子に対してオルトであり、ｘが１～８、２～６、３～５の整数または４であり、
    （ｂ）［Ｏ（ＣＨ２）２］ｘ部分がピリジン環の窒素に対して１～３配置、ピリジン環の窒素に対して１～２配置、またはピリジン環の窒素に対して１～４配置で存在し、
    （ｃ）ＢＦＣ部分が（ｉ）タンパク質のアミン、カルボキシル、カルボニルまたはチオール官能基と共有結合を形成する反応性基、および（ii）ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ｙスペーサーアーム（ここで、ｙは１～８、２～６の整数、または４または５である）を含むシクロオクチンであり、
    （ｄ）該タンパク質が抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンである、
    請求項１～６の何れかに記載の造影剤。
  12. １８Ｆ放射標識補欠分子族が以下の構造
    Figure 0007016323000083
    Figure 0007016323000084
     または
    Figure 0007016323000085
     のいずれか１つを有する、請求項１１に記載の造影剤。
  13. ＢＦＣがＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ－エステル、ＤＢＣＯ－スルホ－ＮＨＳ－エステル、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－酸、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－アミン、またはＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドである、請求項１１に記載の造影剤。
  14. 造影剤が次の構造
    Figure 0007016323000086
     を有し、ここで、Ｘは抗ＰＤ－Ｌ１アドネクチンであり、配列番号１３、２８、４３、５８、７３、８８および１０４の何れかのアミノ酸配列を含む、請求項１～６の何れかに記載の造影剤。
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