KR20090122439A - 단일 아미노산을 갖는 화학적 링커 및 이의 접합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효능있는 세포독소이며 약물과 리간드 사이의 링커를 포함하는 약물-리간드 접합체를 제공하는데, 상기 링커는 단일 아미노산을 가진다. 본 발명은 또한 약물-리간드 접합체를 포함하는 조성물 및 그것들 이용한 치료 방법에 관한 것이다.
약물-리간드 접합체, 단일 아미노산, 화학적 링커
Description
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2007년 2월 21일에 출원된 미국 임시 특허출원 번호 제60/891,028 호의 우선권을 주장하며, 그의 이익은 35 U.S.C. § 119 하에서 본 명세서에 의하여 주장되고 그의 내용은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 병합된다.
기술분야
본 발명은 약물 및 리간드에 부착하고 생체내에서 분리되는 단일 아미노산을 갖는 링커를 제공한다. 상기 링커는 본 발명의 세포독소의 전구약물 및 접합체는 물론 다른 진단적 및 치료적 부분(moieties)을 형성하는 데 있어서 유용하다.
많은 치료적 제제, 특히 암 화학요법에 특별히 효과적인 것들은 종종 생체 내에 심각한 독성, 특히 뼈의 골수 및 점막 독성, 뿐만 아니라 만성 심장 및 신경학적 독성을 나타낸다. 그러한 높은 독성은 그것들의 적용을 제한할 수 있다. 종양 세포에 대한 효과를 높이고 이들의 생성물의 부작용(독성, 비-종양 세포의 파괴 등)의 횟수나 중증도를 감소시키기 위하여 더욱 안전한 특별한 치료적 제제, 특히 항종양 제제를 개발하는 것이 바람직하다. 일부 기존 치료적 제제에 있어서의 또 다른 난점은 그것들이 혈장에서는 최적으로 안정적이지 않다는 것이다. 이러한 화합물을 안정화시키기 위해 기능기(functional groups)를 첨가하면 활성을 상당히 떨어뜨리는 결과를 가져온다. 따라서 허용가능한 치료적 활성 수준을 유지하면서 화합물을 안정화시키는 방법을 확인하는 것이 바람직하다.
더 선택적인 세포독성 제제에 대한 연구가 수십년 동안 매우 활발히 이루어져 왔는데, 독성(즉 정상 조직에 대한 세포독소의 바람직하지 않은 활성)을 제한하는 용법은 암 치료에 있어서 주요 실패 요인 중의 하나이다. 예를 들면, CC-1065 및 두오카르마이신이 매우 효능있는 세포독소로 알려져 있다.
CC-1065는 1981년 Upjohn Company 에 의해 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)로부터 처음 분리되었고(Hanka 등, J. Antibiot. 31: 1211 (1978); Martin 등, J. Antibiot. 33: 902 (1980); Martin 등, J. Antibiot. 34: 1119 (1981)), 시험관 내(in vitro) 및 실험 동물 내(in experimental animals)의 둘 다에서 효능있는 항종양 및 항균 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다(Li 등, Cancer Res. 42: 999 (1982)). CC-1065는 5'-d(A/GNTTA)-3' 및 5'-d(AAAAA)-3'의 서열 우선으로 마이너 그루브(minor groove) 내에서 이중-가닥 B-DNA에 결합하며(Swenson 등, Cancer Res. 42: 2821 (1982)), 분자 내에 존재하는 CPI 왼편(left-hand) 단위에 의해 3'-아데닌의 N3 위치를 알킬화한다(Hurley 등, Science 226: 843 (1984)). 효능있고 광범위한 항종양 활성에도 불구하고, CC-1065는 실험 동물에서 죽음을 지연시키기 때문에 인간에 사용될 수 없다.
CC-1065 및 두오카르마이신의 많은 유사체 및 유도체가 당해 분야에 공지되어 있다. 많은 화합물의 구조, 합성 및 성질에 대한 연구가 검토되었다. 예를 들어, Boger 등, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996); 및 Boger 등, Chem. Rev. 97: 787 (1997)을 참조.
Kyowa Hakko Kogya Co., Ltd.에서의 한 그룹이 많은 CC-1065 유도체를 제조하였다. 예를 들어, 미국특허 번호 제 5,101,038호; 제 5,641,780호; 제 5,187,186호; 제 5,070,092호; 제 5,703,080호; 제 5,070,092호; 제 5,641,780호; 제 5,101,038호; 및 제 5,084,468호; 공개된 PCT 출원 제 WO 96/10405호 및 공개된 유럽 출원 제 0 537 575 Al호를 참조.
또한 Upjohn Company(Pharmacia Upjohn)도 CC-1065의 유도체를 제조하는 데 있어서 활발하였다. 예를 들어, 미국특허 번호 제 5,739,350호; 제 4,978,757호, 제 5,332,837호 및 제 4,912,227호를 참조.
또한 연구가 전구약물의 형태로 존재하는 새로운 치료적 제제의 개발에 초점이 맞추어졌는데, 이 전구약물은 그 구조의 소정의 화학적 또는 효소적 변형에 의해 생체내에서 약물(활성 치료적 화합물)로 전환될 수 있는 화합물이다. 독성을 감소시킬 목적을 위하여, 이 전환은 바람직하게 순환계 또는 비-표적 조직보다는 작용의 자리 또는 표적 조직으로 한정된다. 그러나, 전구약물이라도 많은 것은 혈액 및 혈청에서의 낮은 안정성이라는 특징으로 인하여 문제가 있는데, 이것은 전구약 물이 환자의 몸 안의 원하는 자리에 도달하기 전에 전구약물을 분해하거나 활성화시키는 효소의 존재에 기인한다.
Bristol-Myers Squibb는 특정 리소좀 효소-분리성 항종양 약물 접합체를 기술하였다. 예를 들어 미국특허 번호 제 6,214,345호를 참조. 이 특허는 아미노벤질 옥시카르보닐을 제공한다.
Seattle Genetics는 미국특허 출원 제 2003/0096743 호 및 미국특허 출원 제 2003/0130189호를 공개하였고, 이것들은 약물 전달 제제 내의 p-아미노벤질에테르를 기술한다. 이 출원들에 기술된 링커는 아미노벤질 에테르 조성물에 제한된다.
또한 다른 그룹들도 링커를 기술하였다. 예를 들어, de Groot 등, J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot 등, J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); de Groot 등, J. Med. Chem. 66, 8815, (2001); 제 WO 02/083180호; Carl 등, J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981); Dubowchik 등, Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998)을 참조. 이 링커들은 아미노벤질 에테르 스페이서, 연장된 전자 케스케이드(electronic cascade) 및 고리화 스페이서 시스템, w-아미노 아미노카르보닐과 같은 고리화 제거 스페이서, 및 p 아미노벤지 옥시카르보닐 링커를 포함한다.
생체내 안정성을 포함하여, 세포독성 약물의 안정성은 다룰 필요가 있는 아직은 중요한 문제이다. 덧붙여, 많은 화합물의 독성은 그것들을 덜 유용하게 하므로, 분리가능한 전구약물의 형성과 같이, 약물 독성을 줄일 조성물이 필요하다. 그러므로 당해 기술분야의 진보에도 불구하고, 포유동물, 및 특히 인간의 치료를 위한 개선된 치료적 제제, 더 특별하게는 유사한 구조의 공지된 화합물에 비해 혈액 내에서 작용의 높은 특이성, 감소된 독성, 및 개선된 안정성을 나타내는 세포독소를 개발할 필요가 계속적으로 있다. 본 발명은 그런 요구들을 다룬다.
<발명의 개요>
본 발명은 약물과 리간드가 링커를 통하여 연결된, 약물-리간드 접합체에 관한 것이다. 이 접합체들은 활성 형태로 관심의 작용 위치에 선택적으로 운반되고 이후에 분리되어 활성 약물을 방출할 수 있는 효능있는 세포독소이다.
한 구체예는 다음 식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
여기에서
L1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬 기이고;
m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
L2는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이며;
L3은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로알릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬이고;
o는 0 또는 1이며;
L4는 링커 멤버이고;
p는 0 또는 1이며;
X4는 보호된 반응성 기능기(protected reactive functional groups), 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 멤버이고; 및
D는 다음 구조를 포함한다:
여기에서 상기 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬이며;
E 및 G는 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 및 단일 결합으로부터 독립적으로 선택되는 멤버들이거나, 또는 E 및 G는 결합되어 치환 및 비치환 아릴, 치환 및 비치환 헤테로아릴 및 치환 및 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하고;
X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버인데;
R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 아실이고;
R3은 OR11인데,
여기에서 R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 디포스페이트, 트리포스페이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12, 또는 SiR12R13R14이고,
이 때 R12, R13 및 R14는 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬 및 치환 및 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버이며, 상기 R12 및 R13은 그들이 부착되는 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하고;
R4, R4 ’, R5 및 R5 ’는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, SO3, SO2R15, NR15R16, NR16C(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, R4, R4’, R5 및 R5’ 중 임의의 인접한 쌍은, 그들이 부착된 탄소 원자와 함께 결합되어 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데;
여기에서
n은 1 내지 20의 정수이고;
R15 및 R16은 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬, 치환 및 비치환 아릴, 치환 및 비치환 헤테로아릴, 치환 및 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 및 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며;
R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고, 존재하면 R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 및
R7은 R6과 함께 상기 사이클로프로필 고리 내에서 결합된 CH2-X1 또는 -CH2- 인데, 여기에서
X1은 이탈기이며,
여기에서 R4, R4 ’, R5, R5 ’, R11, R12, R13, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 D를 화합물의 잔여 부분에 연결시킨다.
이들 화합물은 약물-리간드 접합체로서 사용되거나, 약물-리간드 접합체를 형성하는데 사용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 약제학적 제형에 관한 것이다. 그러한 제형은 전형적으로 본 발명의 접합체 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 접합체 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 세포를 살해하는 방법을 제공하는데, 여기에서 본 발명의 접합체 화합물은 세포를 살해하기에 충분한 양으로 상기 세포에 투여된다. 한 바람직한 구체예에서, 세포는 종양세포이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 포유류 대상체에서 종양의 성장을 지연시키거나 정지시키는 방법을 제공하는데, 여기에서 본 발명의 접합체 화합물은 종양의 성장을 지연시키거나 정지시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에 투여된다.
다른 관점들에서, 본 발명의 장점 및 목적들은 하기 상세한 설명을 검토하면 확실해질 것이다.
<발명의 상세한 설명>
약어들
“Ala”는 알라닌을 지칭한다.
“Boc”는 t-부틸옥시카르보닐을 지칭한다.
“CPI”는 사이클로프로파피롤로인돌을 지칭한다.
“Cbz”는 카르보벤족시를 지칭한다.
“DCM”은 디클로로메탄을 지칭한다.
“DDQ”는 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논을 지칭한다.
“DIPEA”는 디이소프로필에탈아민을 지칭한다.
“DMDA”는 N,N’-디메틸에틸렌 디아민을 지칭한다.
“RBF”는 둥근 바닥 플라스크를 지칭한다.
“DMF”는 N,B-디메틸포름아미드를 지칭한다.
“HATU”는 N-[[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-일]메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드를 지칭한다.
기호 “E”는 효소적으로 분리가능한 기를 나타낸다.
“EDCI”는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드를 지칭한다.
“FMOC”는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐을 지칭한다.
“HOAt”는 7-아자-1-하이드록시벤조트리아졸을 지칭한다.
“Leu”는 류신을 지칭한다.
“PABA”는 para-아미노벤조산을 지칭한다.
“PEG”는 폴리에틸렌 글리콜을 지칭한다.
“PMB”는 para-메톡시벤질을 지칭한다.
“TBAF”는 테트라부틸암모늄 플루오라이드를 지칭한다.
“TBSO”는 t-부틸디메틸실릴 에테르를 지칭한다.
“TEA”는 트리에틸아민을 지칭한다.
“TFA”는 트리플루오로아세트산을 지칭한다.
“EDC”는 (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드)를 지칭한다.
“TBTU”는 (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트)를 지칭한다.
“HOBT”는 N-하이드록시벤조트리아졸을 지칭한다.
기호 “Q”는 치료적 제제, 진단적 제제 또는 검출가능한 표지를 지징한다.
정의들
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 일반적으로 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서 및 하기에서 기술되는 세포 배양, 분자 유전학, 유기화학 및 핵산 화학, 및 교잡에서의 실험 공정들에 사용되는 명칭은 당해 기술 분야에 잘 알려지고 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술이 핵산 및 펩티드 합성에 사용된다. 일반적으로, 효소 반응 및 정제 단계들을 제조자의 설명에 따라 실시한다. 일반적으로 기술 및 공정들을 당해 기술 분야에서의 통상적인 방법 및 다양한 일반 참조문헌(일반적으로, Sambrook 등 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제 2 판 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.을 참조하며, 이것은 참고로서 본 명세서에 병합됨)에 따라 실시하는데, 이것들은 본 문서를 통하여 제공된다. 본 명세서 및 하기에서 기술되는 분석 화학 및 유기 합성에서의 실험 공정에 사용되는 명칭들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용된다. 표준 기술 또는 이의 변형이 화학 합성 및 화학 분석에 사용된다.
용어 “치료적 제제”는 치료학적으로 효과적인 양으로 존재할 때 포유동물에 원하는 치료적 효과를 내는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 암종을 치료하기 위하여, 치료적 제제 또한 표적 세포에 들어갈 수 있는 것이 바람직하다.
용어 “세포독소”는 암 세포에 세포독성인 원하는 효과를 갖는 치료적 제제를 의미하는 것으로 의도된다. 세포독소는 제제가 세포의 성장을 저지하거나 살해하는 것을 의미한다. 예시적인 세포독소는, 예시의 방법에 의하나 제한적인 것이 아닌, 콤브레타스타틴(combretastatins), 두오카르마이신, CC-1065 항-종양 항생제, 안트라시클린(anthracyclines), 및 관련 화합물들을 포함한다. 다른 세포독소들은 마이코톡신, 리신 및 이의 유사체, 칼리케아미신(calicheamycins), 독시루비신(doxirubicin) 및 마이탄시노이드(maytansinoids)를 포함한다.
용어 “전구약물” 및 용어 “약물 접합체”는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 둘 모두는 접합된 형태로 정지해 있는 동안에는 세포에 비교적 무해하나 표적 세포 내에서 또는 부근에 위치해서는 조건, 예를 들면, 효소에 의하여 약리학적으로 활성인 형태로 선택적으로 분해되는 화합물을 지칭한다.
용어 “마커”는 종양 또는 다른 의학적 상태의 특성화, 예를 들면, 종양의 진단, 진행, 및 종양 세포에 의해 분비된 인자의 분석에 유용한 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 마커는 “진닥적 제제”의 부분집합으로 생각된다.
효소적 분리 수단과 연결되어 사용되는 용어 “선택적인”은 링커 부분의 분리 속도가 임의의 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 분리 속도보다 더 큰 것을 의미한다.
용어 “표적화 기” 및 “표적화 제제”는 (1) 표적 세포, 예를 들면, 종양 세포의 특정 유형에 부착되도록(예컨대, 치료적 제제 또는 마커로서) 그것에 향할 수 있거나 (2) 표적 조직, 예를 들면, 종양에서 우선적으로 활성화되는 부분을 의미하는 것으로 의도된다. 표적화 기 또는 표적화 제제는 작은 분자일 수 있으며, 이는 비-펩티드 및 펩티드 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 또한 표적화 기는 거대분자일 수 있으며, 이는 당류, 렉틴, 수용체, 수용체용 리간드, BSA와 같은 단백질, 항체 등을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 표적화 기는 항체 또는 항체 단편, 더욱 바람직하게는 단일클론 항체 또는 단일클론 항체 단편이다.
용어 “자기-희생 스페이서”는 두 개의 화학적 부분을 공유적으로 연결하여 정상적인 안정한 3구분 분자(tripartate molecule)를 형성할 수 있는 2-기능성 화학적 부분을 말한다. 자기-희생 스페이서는 첫 번째 부분에 대한 결합이 분리되면, 두 번째 부분으로부터 자발적으로 분리될 수 있다.
용어 “검출가능한 표지”는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 부분을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 “분리가능한 기”는 생체 내에서 불안정한 부분을 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게 “분리가능한 기”는 마커 또는 제제를 접합체의 나머지로부터 분리함으로써 마커 또는 치료적 제제를 활성화하게 한다. 실효적으로 정의하면, 링커는 바람직하게는 생물학적 환경에 의해 생체 내에서 분리된다. 분리는 제한없이 임의의 공정, 예를 들면, 효소적, 환원적, pH 등으로부터 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 분리가능한 기는 원하는 작용 자리에서 활성화가 일어나도록 선택되는데, 이 자리는 치료적 작용 또는 마커 활성의 자리와 같은 표적 세포(예컨대, 암종 세포)나 조직 내의 또는 근처의 자리가 될 수 있다. 그러한 분리는 효소적일 수 있으며, 예시적인 효소적으로 분리가능한 기는 천연 아미노산 또는 천연 아미노산으로 끝나고 그의 카르복실 말단에서 링커에 부착되는 펩티드 서열을 포함한다. 분리 비율 증진의 정도가 본 발명에 중요한 것은 아니지만, 분리가능한 링커의 바람직한 예는 분리가능한 기의 적어도 약 10%, 가장 바람직하게는 적어도 약 35%가 투여의 24 시간 이내에 혈류에서 분리되는 것들이다.
용어 “리간드”는 표적 세포 또는 조직 상에서 수용체, 기질, 항원 결정체, 또는 다른 결합 자리에 특이적으로 결합하거나, 반응적으로 회합하거나(associate), 함께 복합체를 형성하는 임의의 분자를 의미한다. 리간드의 예는 항체 및 이의 단편들(예컨대, 단일클론 항체 또는 이의 단편), 효소(예컨대, 섬유소분해 효소(fibrinolytic enzymes)), 생물학적 반응 조절제(예컨대, 인터루킨, 인터페론, 에리스로포이에틴(erythropoietin) 또는 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors)), 펩티드 호르몬 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다.
링커 또는 이의 임의의 부분의 고리화를 지칭할 때, 용어 “고리화 반응”은 링커가 고리로 되어 약물-리간드 복합체의 분리를 시작하는 고리화를 나타낸다. 이 비율은 고리화 후에 측정될 수 있고 생성물의 적어도 90%, 95%, 또는 100%가 형성되었을 때 완료된다.
용어 “폴리펩티드”, “펩티드” 및 “단백질”은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하는 것으로 본 명세서에 상호교환가능하게 사용된다. 이 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 해당 자연 발생적 아미노산의 인공적 화학 모방체인 아미노산 폴리머는 물론, 자연 발생적 아미노산 폴리머 및 비-자연 발생적 아미노산 폴리머에 적용된다. 또한 이들 용어는 용어 “항체”를 포함한다.
용어 “아미노산”은 자연 발생적 및 합성적 아미노산은 물론, 자연 발생적 아미노산에 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생적 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화되는 것들을 물론, 후에 변형된 아미노산, 예컨대, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생적 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합되는 α 탄소를 갖는 화합물, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포니움을 지칭한다. 그러한 유사체는 변형 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생적 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 특별히 사용될 수 있는 하나의 아미노산은 시트룰린인데, 이는 아르기닌의 전구체이며 간에서 요소의 형성에 관련이 있다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 다른 구조를 갖는 화학적 화합물을 지칭하나, 자연 발생적 아미노산과 유사한 방식으로 기능한다. 용어 “비천연 아미노산”은 상술된 20개의 자연 발생적 아미노산의 "D" 입체화학적 형태(stereochemical form)를 나타내는 것으로 의도된다. 나아가 용어 비천연 아미노산은 천연 아미노산의 동종체(homologues) 및 천연 아미노산의 합성적 변형 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 합성적 변형 형태는 탄소 원자가 2개까지 단축되거나 연장된 알킬렌 사슬을 갖는 아미노산, 임의적으로 치환된 아릴기를 포함하는 아미노산, 및 할로겐화된 기, 바람직하게는 할로겐화된 알킬 및 아릴 기들을 포함하는 아미노산을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 링커 또는 접합체에 부착될 때, 아미노산은 “아미노산 측쇄”의 형태이고, 여기에서 아미노산의 카르복실산 기는 케토(C(O)) 기로 대체된다. 따라서, 예를 들면, 알라닌 측쇄는 -C(O)-CH(NH2)-CH3 등이다.
아미노산 및 펩티드는 차단 기(blocking groups)에 의해 보호될 수 있다. 차단기는 원하지 않는 반응으로부터 아미노산 또는 펩티드의 N-말단을 보호하고 약물-리간드 접합체의 합성 동안에 사용될 수 있는 원자 또는 화학적 부분이다. 그것은 상기 합성을 통하여 N-말단에 부착된 채로 남아있어야 하며, 약물 접합체의 합성을 완료한 후에 선택적으로 그것을 제거할 수 있는 화학적 또는 다른 조건에 의해 제거될 수 있어야 한다. N-말단 보호에 적절한 차단 기는 펩티드 화학의 분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 차단 기는 수소, D-아미노산 및 카르보벤족시(Cbz) 클로라이드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
“핵산”은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 폴리머를 지칭한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형 골격 잔기 또는 연결체(linkage)를 포함하는 핵산을 포함하는데, 이것은 합성적, 자연 발생적, 및 비-자연 발생적이며, 참조 핵산(reference nucleic acid)과 유사한 결합 성질을 가지고, 참조 핵산과 유사한 방식으로 대사된다. 그러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 포스포라미데이트(phosphoramidates), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonates), 카이랄-메틸 포스포네이트(chiral-methyl phosphonates), 2-O-메틸 리보뉴클레오티드(2-O-methyl ribonucleotides), 펩티드-핵산(peptide-nucleic acids, PNAs)을 포함하며 이에 제한되지 않는다.
달리 지시되지 않으면, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(conservatively modified variants)(예컨대, 축퇴 코돈 치환체(degenerate codon substitutions)) 및 상보적 서열은 물론, 명백히 지시된 서열을 암시적으로 포함한다. 특히, 축퇴 코돈 치환체는 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로 얻을 수 있다(Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 등, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 상호교환가능하게 사용된다.
기호 
는, 결합으로서 사용되거나 결합에 수직으로 표시되거나, 표시된 부분이 분자, 고체 지지체 등의 잔여 부분에 부착되는 지점을 나타낸다.
용어 “알킬”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, 다른 언급이 없으면, 직쇄 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이의 조합을 의미하고, 이들은 충분히 포화되거나, 단일불포화되거나 또는 다중불포화되며, 지정된 탄소 수(즉, C1-C10은 한 개부터 열 개의 탄소를 의미함)를 갖는, 이가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예들은, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체(homologs) 및 이성질체(isomers)와 같은 기들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가지는 것이다. 불포화 알킬기의 예들은, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고도 동족체 및 이성질체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 용어 “알킬”은, 다르게 기술되지 않으면, “헤테로알킬”과 같은, 하기에 더 자세히 정의되는 알킬의 유도체들을 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소기에 한정되는, 알킬기는 “호모알킬(homoalkyl)”로 불리운다.
용어 “알킬렌”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, -CH2CH2CH2CH2-에 의하여 예시되나 이에 한정되지 않는, 알칸으로부터 유도되는 이가 라디칼을 의미하고, “헤테로알킬렌”으로서 하기에 설명된 기들을 더 포함한다. 일반적으로, 알킬(또는 알킬렌)기는 1개부터 24개의 탄소 원자를 가질 것이며, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기들이 본 발명에서 바람직하다. “저급 알킬” 또는 “저급 알킬렌”은, 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는, 더 짧은 사슬 알킬 또는 알킬렌 기이다.
용어 “헤테로알킬”은, 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여, 다른 언급이 없으면, 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하는데, 정해진 수의 탄소 원자와 O, N, Si, 및 S으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 이루어지며, 여기에서 질소, 탄소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 선택적으로 4급화될(quaternized) 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, S, 및 Si은 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬기가 분자의 잔여 부분에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 예들은, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3와 같이, 두 개까지의 헤테로원자가 연속적일 수 있다. 유사하게, 용어 “헤테로알킬렌”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의하여 예시되나 이에 한정되지 않는, 헤테로알킬로부터 유도되는 이가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌기에 있어서, 헤테로원자는 또한 사슬 말단의 어느 한쪽 또는 둘 다를 차지할 수 있다(예, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 등등). 용어 “헤테로알킬” 및 “헤테로알킬렌”은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 그의 유도체(예를 들어, Shearwater Polymers Catalog, 2001 참조)를 포함한다. 더 나아가, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 있어서, 연결기의 식이 쓰여진 방향에 의하여 연결기의 어떠한 방향도 암시되지 않는다. 예를 들어, 식 -C(O)2R’-은 -C(O)2R’- 및 -R’C(O)2- 둘 다를 나타낸다.
용어 “저급”은 용어 “알킬” 또는 “헤테로알킬”과 조합하여 1 개부터 6개의 탄소 원자를 갖는 부분을 지칭한다.
용어들 “알콕시”, “알킬아미노”, “알킬설포닐”, 및 “알킬티오”(또는 티오알콕시)는 그들의 일반적인 의미로 사용되며, 각각, 산소 원자, 아미노기, SO2기, 또는 황 원자를 통하여 분자의 잔여 부분에 부착된 알킬기를 지칭한다. 용어 “아릴설포닐”은 SO2기를 통하여 분자의 잔여 부분에 부착된 아릴기를 지칭하며, 용어 “설피드릴”은 SH기를 지칭한다.
일반적으로, “아실 치환기”는 또한 상기에서 서술된 기로부터 선택된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “아실 치환기”는 본 발명의 화합물의 다중고리 핵에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 카르보닐 탄소에 부착되어 그 원자가(valence)를 맞추는 기들을 지칭한다.
용어 “사이클로알킬” 및 “헤테로사이클로알킬”은, 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여, 다른 언급이 없으면, 각각, 치환 또는 비치환 “알킬” 및 치환 또는 비치환 “헤테로알킬”의 고리 형을 나타낸다. 추가적으로, 헤테로사이클로알킬에 있어서, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 잔여 부분에 부착된 위치를 점유할 수 있다. 사이클로알킬의 예는, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 등등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 헤테로사이클로알킬의 예는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 등등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 고리 구조의 헤테로원자 및 탄소 원자는 임의로 산화될 수 있다.
용어 “할로” 또는 “할로겐”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, 다른 언급이 없으면, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 원자를 의미한다. 추가적으로, “할로알킬”과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 용어 “할로(C1-C4)알킬”은, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필, 등등을 포함하나 이에 한정되지 않는 것으로 의미된다.
용어 “아릴”은, 다른 언급이 없으면, 함께 융합되거나 공유 결합되어 단일 고리 또는 다중 고리(바람직하게는 1개부터 3개의 고리)가 될 수 있는 치환 또는 비치환 다중포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 “헤테로아릴”은, N, O, 및 S로부터 선택된 1개부터 4개의 헤테로원자를 포함하는 아릴기(또는 고리)를 지칭하는데, 여기에서, 질소, 탄소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며, 질소 원자(들)는 선택적으로 4급화될 수 있다. 헤테로아릴기는 헤테로원자를 통해 분자의 잔여 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기들의 비-제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤지미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹사리닐, 5-퀴녹사리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기에서 기술된 아릴 및 헤테로아릴 고리계의 각각의 치환기는 하기에서 기술된 허용가능한 치환기들의 군으로부터 선택된다. “아릴” 및 “헤테로아릴”은 또한 하나 이상의 비-방향족 고리계가 융합되거나, 그렇지 않으면, 아릴 또는 헤테로아릴 시스템에 결합된 고리계를 포함한다.
요약하면, 용어 “아릴”은 다른 용어들(예, 아릴옥시, 아릴티옥시, 및 아릴알킬)과 조합하여 사용될 때, 상기에서 정의된 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘 다를 포함한다. 따라서, 용어 “아릴알킬”은, 탄소 원자(예, 메틸렌기)가 예를 들면, 산소 원자에 의해 대체된(예, 펜옥시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필, 등등) 알킬기들을 포함하는, 알킬기(예, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸, 등등)에 아릴기가 부착된 라디칼들을 포함하는 것을 의미한다.
상기 용어들(예, “알킬”, “헤테로알킬”, “아릴” 및 “헤테로아릴”) 각각은 지시된 라디칼의 치환 및 비치환 형태를 포함한다. 라디칼의 각 유형의 바람직한 치환기는 하기에 제공된다.
알킬, 및 헤테로알킬 라디칼의 치환기(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로 흔히 지칭되는 그러한 기들을 포함함)는 일반적으로 “알킬 치환기” 및 “헤테로알킬 치환기”로 각각 지칭되고, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택되는 여러 가지 기들 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 그 수는 0 부터 (2m'+l)의 범위를 가지는데, m'은 그러한 라디칼 내에서 탄소 원자의 총 수이다. R', R", R"' 및 R"" 각각은 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 예를 들면, 1-3 할로겐으로 치환된 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 때, 예를 들면, 각각의 R기들은 하나 이상의 이들 기가 존재할 때 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기들로서 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되면, 이들은 질소 원자와 결합되어 5-, 6-, 또는 7-멤버 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나 이에 한정되지 않는 것으로 의미된다. 치환기에 대해 상술한 것으로부터, 당업자는 용어 “알킬”이 할로알킬(예, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, 등등)과 같은, 수소기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기술된 치환기와 유사하게, 아릴 치환기 및 헤테로아릴 치환기는 일반적으로 “아릴 치환기” 및 “헤테로아릴 치환기”로 각각 지칭되며, 예를 들면, 0부터 방향족 고리계 상의 개방 원자가(open valence)의 총 수까지의 범위에서, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR"', - S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 다양화되고 선택되는데; 여기에서, R', R", R"' 및 R""은 바람직하게는 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환 아릴 및 헤테로아릴, (비치환 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 때, 예를 들면, 각각의 R기들은 하나 이상의 이들 기가 존재할 때 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기들로서 독립적으로 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 아릴 치환기들 중 둘은 식 -T-C(O)-(CRR')q-U-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일 결합이고, q는 0부터 3까지의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기들 중 둘은 식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일결합이고, r은 1부터 4까지의 정수이다. 그렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합들 중 하나는 이중결합으로 임의로 대체될 수 있다. 대안적으로 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기들 중 둘은 식 -(CRR')s-X-(CR"R"')d-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, s 및 d는 독립적으로 0부터 3까지의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환기 R, R', R" 및 R"'는 바람직하게는 수소 또는 치환 또는 비치환 (C1-C6) 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “디포스페이트”는 두 개의 포스페이트기를 포함하는 인산의 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 “트리포스페이트”는 세 개의 포스페이트기를 포함하는 인산의 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 갖는 특정 약물은 다음을 포함한다:
본 명세서에서 사용되는, 용어 “헤테로원자”는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 실리콘(Si)을 포함한다.
기호 “R”은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클릴 기들로부터 선택되는 치환기를 나타내는 일반적인 약자이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “약제학적으로 허용가능한 담체”는 화학적 제제를 운반하거나 수송하는 것과 관련된, 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 첨가제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은, 약제학적으로-허용가능한 물질, 조성물 또는 비이클(vehicle)을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는데, 여기에서, 용어 “약제학적으로 허용가능한 염”은 본 명세서에서 기술된 화합물 상에서 발견되는 특정 치환체에 따라, 상대적으로 비독성인 산 또는 염기로 제조된 활성 화합물의 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 비교적 산성 기능성기(functionalities)를 포함하면, 순수하게 또는 적절한 불활성 용매내에서, 그러한 화합물의 중성 형태를 원하는 염기의 충분한 양과 접촉시킴으로써 염기 부가염(base addition salts)을 얻을 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염기 부가염의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 비교적 염기성 기능성기를 포함하면, 순수하게 또는 적절한 불활성 용매내에서 그러한 화합물의 중성 형태를 원하는 산의 충분한 양과 접촉시킴으로써 산 부가염(acid addition salts)을 얻을 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 산 부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 모노하이드로겐카르본산, 인산, 모노하이드로겐포스포린산, 디하이드로겐포스포린산, 황산, 모노하이드로겐설푸린산, 요오드화수소산 또는 아인산 등과 같은 무기산으로부터 유도된 것들은 물론, 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 등과 같은 비교적 비독성인 유기산으로부터 유도된 염들을 포함한다. 또한, 알긴산염 등과 같은 아미노산의 염 및 글루쿠론산 또는 갈락투론산 등과 같은 유기산의 염을 포함한다(예를 들면, Berge 등, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19을 참조). 본 발명의 소정의 특정 화합물은 화합물이 염기 또는 산 부가염으로 전환되게 하는 염기성 및 산성 기능성기 둘 다를 포함한다.
화합물의 중성 형태는 염을 염기 또는 산과 접촉시키고 통상적인 방식으로 부모 화합물을 분리함으로써 바람직하게 재생된다. 화합물의 부모 형태는 극성 용매에서의 용해성과 같은, 소정의 물리적 성질에 있어서 여러 염 형태와 다르지만, 상기 염은 본 발명의 목적을 위한 화합물의 부모 형태와 같다.
염 형태에 덧붙여, 본 발명은 전구약물 형태인 화합물을 제공한다. 본 명세서에 기술된 화합물의 전구약물은 생리학적인 조건하에서 쉽게 화학적으로 변화하여 본 발명의 화합물을 제공하는 화합물들이다. 부가적으로, 전구약물은 생체외 환경에서 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들면, 전구약물은 경피 팻치 수조에서 적절한 효소 또는 화학적 제제와 함께 있을 때 본 발명의 화합물로 서서히 전환될 수 있다.
본 발명의 소정의 화합물은 수화된 형태를 포함하여, 용매화된 형태뿐만 아니라 비용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 비용매화된 형태에 대응하며 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 소정의 화합물은 다중 결정 또는 비정질 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태는 본 발명에 의해 고려되는 용도에 대응하고 본 발명의 범위내에 있는 것으로 의도된다.
본 발명의 소정의 화합물은 비대칭 탄소 원자(광학적 중앙) 또는 이중 결합을 가지고; 라세미체, 부분입체이성질체, 기하학적 이성질체 및 개별 이성질체는 본 발명의 범위내에 포함된다.
또한 본 발명의 화합물은 그러한 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에서 비자연적 비율의 원자 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 화합물은 예컨대 삼중수소(3H), 요오드-125(125I) 또는 탄소-14(14C)와 같은, 방사성 동위원소로 방사능 표지될 수 있다. 방사성이나 그렇지 않거나, 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변이체들은 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 의도된다.
용어 “부착 부분” 또는 “표적화 기를 부착하는 부분”은 링커로의 표적화 기의 부착을 허용하는 부분을 지칭한다. 전형적인 부착 기는 알킬, 아미노알킬, 아미노카르보닐알킬, 카르복시알킬, 하이드록시알킬, 알킬-말레이미드, 알킬-N-하이드록실숙신이미드, 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드 및 폴리(에틸렌 글리콜)-N-하이드록실숙신이미드를 포함하며, 이는 설명을 위한 것으로 제한적인 것은 아니고, 이들 모두는 더 치환될 수 있다. 또한 링커는 표적화 기에 실제로 부착된 부착 부분을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “이탈기”는 반응에서 기질로부터 분리되는 기질의 부분을 지칭한다.
본 명세서에서 지칭되는 용어 “항체”는, 온전한 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, “항원-결합부”) 또는 단일 사슬을 포함한다. “항체”는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두개의 중쇄(H) 및 적어도 두개의 경쇄(L), 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세가지 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성되며, 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론 이소타입일 수 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성되며, 이것은 카파 및 람다 이소타입일 수 있다. VH 및 VL 영역들은, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리워지는, 초가변 영역들로 더 나뉠 수 있는데, 이들은 골격 영역(framework region, FR)으로 불리우는 더 보존적인 영역과 섞여있다. 각 VH 및 VL은 세 개 CDR과 네 개 FR로 구성되고, 이들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단방향으로 다음 순서로 정렬되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 상기 항체들의 불변 영역은, 면역계(예, 작동자(effector) 세포)의 다양한 세포 및 전통적인 보체계(classical complement system)의 제 1 요소(Clq)를 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린을 결합시키는 것을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 항체의 “항체 단편” 또는 “항원-결합부”(또는 간단히 “항원부”)는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편들을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의하여 수행될 수 있음을 보여 주었다. 용어 항체의 “항체 단편” 또는 “항원-결합부” 내에 포함되는 결합 단편들의 예는, (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 힌지 영역에서 디설파이드 다리(disulfide bridge)에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 가지(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된, dAb 단편(Ward 등 (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 개 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화 되어 있지만, 그것들은 재조합 방법들을 사용하여, 합성 링커에 의해 결합되어 단일 단백질 사슬로서 만들어 질 수 있고, 여기에서 VL 및 VH 영역들은 짝을 이뤄 단일가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로서 공지됨; 예, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)를 형성하게 된다. 그러한 단일 사슬 항체들은 또한 용어 항체의 “항원-결합부”의 범위내에 내포되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편들은 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 기술을 사용하여 얻어질 수 있고, 상기 단편들을 본래의 항체들과 동일한 방식으로 스크리닝하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “단일클론 항체”는, 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물을 지칭한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다.
단일클론 또는 다중클론 항체를 제조하기 위하여, 당해 분야에 알려진 임의의 기술이 이용될 수 있다(예컨대, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor 등, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole 등, pp. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)을 참조).
다중클론 항체의 생산 방법은 당업자에 알려져 있다. 마우스(예컨대, BALB/C 마우스) 또는 토끼의 동종번식 종(inbred strain)을 프로인트 보조제와 같은 표준 보조제 및 표준 면역 프로토콜을 이용하여 단백질로 면역화시킨다. 테스트 혈액을 채취하고 베타 부단위(beta subunits)에 대한 반응의 역가를 결정함으로써 면역원 제조물에 대한 동물의 면역 반응을 모니터한다. 면역원에 대한 항체의 적절히 높은 역가를 얻으면, 혈액을 상기 동물로부터 수집하고 항혈장을 제조한다. 필요에 따라 항혈장에 대한 분별을 실시하여 단백질에 반응성인 항체를 강화시킬 수 있다.
단일클론 항체를 당업자에게 익숙한 여러 기술에 의하여 수득할 수 있다. 간략하면, 원하는 항원으로 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 일반적으로 골수종 세포와의 융합에 의하여 무한증식시킨다(immortalized)(Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)을 참조). 대안적인 무한증식 방법은 엡스테인바 바이러스(Epstein Barr Virus), 종양형성유전자, 또는 레트로바이러스를 이용한 형질전환, 또는 당해 기술 분야에 잘 알려진 다른 방법들을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 항체는 키메릭 또는 인간화 항체이다. 본 발명의 키메릭 또는 인간화 항체는 뮤린 단일클론 항체의 서열을 기본으로하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 관심의 뮤린 하이브리도마로부터 수득할 수 있으며 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 비-뮤린(예컨대, 인간) 면역글로불린 서열을 포함하도록 조작할 수 있다. 예를 들면, 키메릭 항체를 생성하기 위하여, 뮤린 가변 영역을 당해 기술 분야에서 공지된 방법을 이용하여 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다(예컨대, Cabilly 등의 미국 특허 번호 제 4,816,567호를 참조). 인간화 항체를 생성하기 위하여, 뮤린 CDR 영역들을 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 인간 골격으로 삽입시킬 수 있다(예컨대, Winter의 미국 특허 번호 제 5,225,539호, 및 Queen 등의 미국 특허 번호 제 5,530,101호; 제 5,585,089호; 제 5,693,762호 및 제 6,180,370호를 참조).
다른 바람직한 구체예에서, 항체는 인간 항체이다. 내인성 마우스 면역글로불린 유전자가 불활성화되고 외인성 인간 면역글로불린 유전자가 도입된 유전자이식(transgenic) 또는 염색체이식(transchromosomic) 마우스를 면역화시킴으로써 그러한 인간 항체를 생성할 수 있다. 그러한 마우스는 당해 기술 분야에 공지되어 있다(예컨대, Lonberg와 Kay의 미국 특허 번호 제 5,545,806호; 제 5,569,825호; 제 5,625,126호; 제 5,633,425호; 제 5,789,650호; 제 5,877,397호; 제 5,661,016호; 제 5,814,318호; 제 5,874,299호; 및 제 5,770,429호; Kucherlapati 등의 미국 특허 번호 제 5,939,598호; 제 6,075,181호; 제 6,114,598호; 제 6,150,584호 및 제 6,162,963호; 그리고, Ishida 등의 PCT 공개번호 제 WO 02/43478호를 참조). 또한 인간 면역글로불린 유전자들의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 인간 항체를 제조할 수 있다. 인간 항체를 분리하기 위한 그러한 파아지 디스플레이 방법도 당해 기술 분야에 공지되어 있다(예컨대, Ladner 등의 미국 특허 번호 제 5,223,409호; 제 5,403,484호; 및 제 5,571,698호; Dower 등의 미국 특허 번호 제 5,427,908호 및 제 5,580,717호; McCafferty 등의 미국 특허 번호 제 5,969,108호 및 제 6,172,197호; Griffiths 등의 미국 특허 번호 제 5,885,793호; 제 6,521,404호; 제 6,544,731호; 제 6,555,313호; 제 6,582,915호 및 제 6,593,081호를 참조).
본 명세서에서 사용되는, “고형 지지체”는 선택된 용매 시스템에서 실질적으로 불용성이거나 그것이 용해되는 선택된 용매 시스템으로부터 쉽게 분리될 수 있는(예컨대, 침전에 의해) 물질을 지칭한다. 본 발명을 실행하기에 유용한 고형 지지체는 선택된 종(species)이 고형 지지체에 결합될 수 있도록 활성화되거나 또는 활성화할 수 있는 기들을 포함할 수 있다. 또한 고형 지지체는 본 발명의 개개의 또는 하나 이상의 화합물이 결합된 기질 예를 들면, 칩, 웨이퍼 또는 웰일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “반응성 기능기(reactive functional group)”는 올레핀, 아세틸렌, 알코올, 페놀, 에테르, 옥사이드, 할라이드, 알데히드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 아민, 하이드라진, 하이드라존, 하이드라지드, 디아조, 디아조니움, 니트로, 니트릴, 메르캅탄, 설파이드, 디설파이드, 설폭시드, 설폰, 설폰산, 설핀산, 아세탈, 케탈, 무수물, 설페이트, 설펜산 이소니트릴, 아미딘, 이미드, 이미데이트, 니트론, 하이드록실아민, 옥심, 하이드록삼산 티오하이드록삼산, 알렌, 오르토 에스테르, 설파이트, 엔아민, 인아민, 요소, 유사요소(pseudoureas), 세미카르바지드, 카르보디이미드, 카르바메이트, 이민, 아지드, 아조 화합물, 아족시 화합물, 및 니트로소 화합물을 포함하는 기들을 지칭하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 반응성 기능기는 생접합체, 예컨대, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 말레이미드 등을 제조하기 위해 사용되는 것들을 포함한다(예를 들면, Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic press, San Diego, 1996을 참조). 이들 기능기 각각을 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 특정 목적을 위한 이들의 적용 또는 변형은 당업자의 능력으로 할 수 있다(예를 들면, Sandler 및 Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989을 참조). 반응성 기능기는 보호되거나 보호되지 않을 수 있다.
본 발명의 화합물은 단일 이성질체(예컨대, 거울상이성질체, 시스-트란스이성질체, 위치이성질체, 부분입체이성질체) 또는 이성질체의 혼합물로서 제조된다. 바람직한 구체예에서, 화합물은 실질적으로 단일 이성질체로서 제조된다. 실질적으로 이성질체적으로 순수한 화합물을 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 카이랄 중심에서의 입체 화학을 변하지 않게 하거나 그의 완전한 전환을 가져오게 하는 반응과 조합하여 거울상이성질체적으로 순수한 합성 중간체를 사용함으로써 거울상이성질체적으로 강화된 혼합물 및 순수한 거울상이성질체 화합물을 제조할 수 있다. 대안적으로, 합성 경로를 따른 최종 생성물 또는 중간체는 단일 입체이성질체로 분해될 수 있다. 특정 입체중심(stereocenter)을 전환시키거나 변하지 않게 하는 기술, 및 입체이성질체의 혼합물을 분해하는 기술은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 특정 상황을 위한 방법을 선택하고 사용하는 것은 당업자의 능력으로 할 수 있다. 일반적으로, Furniss 등 (eds.), VOGEL’S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 제 5 판, Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, pp. 809-816; 및 Heller, Acc. Chem. Res. 23: 128 (1990)을 참조.
링커
본 발명은 (L4)p-F-(L1)m로 표시되는, 아미노산 링커를 통해 약물이 리간드에 연결되는 약물-리간드 접합체를 제공한다. 약물에 부착된 링커에 부가하여, 본 발명은 또한 필수적인 임의의 분자 종에 부착하기에 적절한 분리가능한(cleavable) 링커 가지를 제공한다. 본 발명의 링커 가지의 양상은 치료 부분(moiety)에 대한 이들의 부착을 참고로 하여 본 명세서에 예시된다. 그러나, 링커는 진단용 제제, 분석용 제제, 생분자, 표적화 제제, 검출가능한 표지 등을 포함하나 이에 한정되지 않고, 다양한 종에 부착될 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.
약물-리간드 접합체에서 펩티딜 및 다른 링커들의 용도는 미국 임시 특허출원 일련번호 제 60/295,196호; 제 60/295,259호; 제 60/295,342호; 제 60/304,908호; 제 60/572,667호; 제 60/661,174호; 제 60/669,871호; 제 60/720,499호; 제 60/730,804호; 제 60/735,657호; 제 60/882,461호; 및 제 60/991,300호, 및 미국 특허출원 일련번호 제 10/160,972호; 제 10/161,234호; 제 11/134,685호; 제 11/134,826호; 및 제 11/398,854호 및 미국 특허번호 제6,989,452호 및 PCT 특허출원 번호 제 PCT/US2006/37793호, 제 PCT/US2006/60050호, 제 PCT/US2006/60711호, 및 제 PCT/SU2007/89100호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 참조 문헌으로서 본 명세서에 병합된다.
한 관점에서, 본 발명은 치료적 제제 및 마커에 표적화기(targeting groups)를 부착하는데 유용한 링커에 관한 것이다. 다른 관점에서, 본 발명은 화합물에 안정성을 부여하거나, 그들의 생체내 독성을 감소시키거나, 그렇지 않으면, 그들의 약물동력학, 생물학적 이용효능 및/또는 약물역학에 유리하게 영향을 미치는 링커를 제공한다. 그러한 구체예에서, 약물이 작용의 자리에 전달되면, 상기 링커는 분리되어 활성 약물을 방출하는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 링커는 흔적이 없어서, 일단 치료적 제제 또는 마커로부터 제거되면(예를 들어 활성화 동안에), 링커의 존재 흔적은 남지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 링커들은 치료 작용 또는 마커 활성의 자리에서와 같은 표적 세포의 자리에서 또는 근처에서 분리될 수 있는 그들의 능력에 의해 특징지워진다. 그러한 분리는 자연에서 효소적일 수 있다. 이 특징은 치료적 제제 또는 마커의 전신 활성을 감소시키고 독성 및 전신 부작용을 감소시키는 것에 도움을 준다. 다른 구체예에서, 링커는 pH에 민감하고, pH의 변화를 통해 분리된다.
링커에 단일 아미노산을 포함하는 본 화합물의 놀라운 관점은 이러한 화합물이 펩티딜 성분을 갖는 링커와 유사한, 또는 능가하는 활성을 가질 수 있다는 것이다. 단일 아미노산이, 펩티드와는 반대로, 반드시 효소를 위한 기질이 아니기 때문에 본질적으로 더 낮은 활성을 기대할 것이다.
또한 링커는 순환 중에 분해에 대항하여 치료적 제제 또는 마커를 안정화시키는 작용을 한다. 그러한 안정화는 부착된 제제 또는 마커의 순환 반감기를 연장하기 때문에 이 특징은 유의한 이점을 제공한다. 또한 링커는 부착된 제제 또는 마커의 활성을 약화시켜서 접합체를 순환 중에 상대적으로 양성을 띠게하여(relatively benign), 원하는 작용 자리에서 활성화 후에, 원하는 효과, 예를 들면, 독성을 갖게 한다. 치료적 제제 접합체에 대해서, 링커의 이 특징이 제제의 치료 지표를 개선한다.
바람직하게 안정화기는 혈액 또는 비-표적 조직에 존재할 수 있는 효소에 의한 치료적 제제 또는 마커의 제거 및 대사를 제한하기 위해서 선택되며, 더 나아가 제제 또는 마커가 세포로 이동하는 것을 제한하기 위해 선택된다. 안정화기는 제제 또는 마커의 분해를 차단하는 작용을 하고, 또한 제제 또는 마커의 다른 물리학적 특성을 제공하는 작용도 할 수 있다. 안정화기는 또한 제형화된 또는 비-제형화된 형태로 저장되는 동안 제제 또는 마커의 안정성을 개선할 수 있다.
이상적으로, 37℃에서 2시간 동안 인간 혈액내에 제제 또는 마커를 저장함으로써 테스트시 안정화기가 분해로부터 제제 또는 마커를 보호한다면, 안정화기는 치료적 제제 또는 마커를 안정화시키는데 유용하며 주어진 분석 조건하에서 인간 혈액내에 존재하는 효소에 의해 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만 및 더더욱 바람직하게는 2% 미만으로 제제 또는 마커를 분리하게 된다.
또한 본 발명은 이러한 링커들을 포함하는 접합체에 관한 것이다. 더욱 특별하게, 본 발명은 질병의 치료, 특히 암 화학요법에 사용될 수 있는 전구약물에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에 기술된 링커들의 사용은 유사한 구조의 전구약물에 비해 혈액내에서 작용의 높은 특이성, 감소된 독성 및 개선된 안정성을 나타내는 전구약물을 제공한다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 링커는 세포독성 접합체 내의 다양한 위치에 존재할 수 있다.
따라서, 그러한 기를 결여하는 구성체들의 속도에 비해 증진된 속도로, 생체내, 예컨대, 혈액류에서 분리될 그의 사슬의 부분으로서 임의의 다양한 기들을 포함할 수 있는 링커를 제공한다. 또한 치료적 제제 및 진단용 제제와 링커 가지의 접합체도 제공한다. 링커는 치료적 제제의 전구약물 유사체를 형성하고 치료적 제제 또는 진단용 제제를 표적화 제제, 검출가능한 표지, 또는 고형 지지체에 가역적으로 연결하는데 유용하다. 링커를 본 발명의 세포독소를 포함하는 복합체에 혼입할 수 있다.
하나 이상의 자기-희생 링커기 L1은 세포독소와 표적화 제제 사이에 선택적으로 도입된다. 또한 이러한 링커기는 스페이서기(spacer groups)로 기술될 수도 있으며, 적어도 2개의 반응성 기능기(functional groups)를 포함한다. 전형적으로, 스페이서기의 하나의 화학적 기능성기(functionality)는 치료적 제제, 예를 들면, 세포독소의 화학적 기능성기에 결합되고, 반면에 상기 스페이서기의 다른 화학적 기능성기는 표적화 제제 또는 분리가능한 링커의 화학적 기능성기에 결합하는데 사용된다. 스페이서기의 화학적 기능성기의 예는 하이드록시, 메르캅토, 카르보닐, 카르복시, 아미노, 케톤, 및 메르캅토 기들을 포함한다.
L1으로 표시되는, 자기-희생 링커는 일반적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬 기이다. 한 구체예에서, 알킬 또는 아릴 기는 1개 내지 20개 사이의 탄소 원자를 포함한다. 또한 그것들은 폴리에틸렌 글리콜 부분도 포함할 수 있다.
예시적 스페이서기는, 예를 들어, 6-아미노헥사놀, 6-메르캅토헥사놀, 10-하이드록시데칸산, 글리신 및 다른 아미노산, 1,6-헥산디올, β-알라닌, 2-아미노에탄올, 시스테아민(2-아미노에탄티올), 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산산, 3-말레이미도벤조산, 프탈리드, α-치환 프탈리드, 카르보닐기, 아민성 에스테르, 핵산, 펩티드 등을 포함한다.
스페이서는 부가적인 분자 부분 및 화학적 기능성기를 세포독소-표적화 제제 복합체 내로 도입하게 할 수 있다. 일반적으로, 부가적인 부분 및 기능성기는 상기 복합체의 혈장 반감기 및 다른 성질들에 영향을 줄 것이다. 따라서, 스페이서기의 신중한 선택을 통하여, 혈장 반감기 범위를 갖는 세포독소 복합체를 생산할 수 있다.
약물 부분에 직접 인접하여 위치한 스페이서(들)는 또한 (L1)m으로 나타내며, 여기에서 m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이다. 다중 L1 스페이서가 존재할 때, 동일한 또는 상이한 스페이서를 사용할 수 있다. L1 은 임의의 자기-희생기일 수 있다.
L4는 상기 부분을 포함하는 링커를 사용하여 접합체에 증가된 용해성 또는 감소된 응집성을 바람직하게 부여하거나 상기 접합체의 가수분해 속도를 변경하는 링커 부분이다. L4 링커는 자기 희생이 될 필요가 없다. 한 구체예에서, L4 부분은 직쇄, 분지쇄, 또는 고리일 수 있는, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다. 치환기는, 예를 들면, 저급(C1-C6)알킬, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 또는 디알킬아미노일 수 있다. 어떤 구체예에서, L4 는 비-고리형 부분을 포함한다. 다른 구체예에서, L4 는 임의의 양 또는 음으로 하전된 아미노산 폴리머, 예를 들면, 폴리리신 또는 폴리아르게닌을 포함한다. L4는 폴리에틸렌 글리콜 부분과 같은 폴리머를 포함할 수 있다. 부가적으로, L4 링커는 예를 들면, 폴리머 성분 및 작은 화학적 부분 둘 다를 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, L4는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분을 포함한다. L4의 PEG 부분은 1-50개 단위의 길이일 수 있다. 바람직하게는, PEG는 1-12개의 반복 단위, 더욱 바람직하게는 3-12개의 반복 단위, 더욱 바람직하게는 2-6개의 반복 단위, 또는 심지어 더 바람직하게는 3-5개의 반복 단위 및 가장 바람직하게는 4개의 반복 단위를 가질 것이다. L4는 단지 PEG 부분만으로 구성되거나, 부가적인 치환 또는 비치환 알킬 또는 헤테로알킬을 또한 포함할 수 있다. L4 부분의 일부로서 PEG를 조합하여 복합체의 수용성을 향상시키는 것이 유용하다. 부가적으로, PEG 부분은 항체에 약물이 접합하는 동안 일어날 수 있는 응집의 정도를 감소시킨다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 링커는 다음의 일반식으로 표시될 수 있다: (L4)p-F-(L1)m, 여기에서 F는 아미노산을 포함하는 링커 부분을 나타낸다. 한 구체예에서, F 부분은 임의의 부가적인 자기-희생 링커(들), L2, 및 카르보닐기를 포함한다. 다른 구체예에서, F 부분은 아미노기 및 임의의 스페이서기(들), L3을 포함한다.
따라서, 한 구체예에서, 링커를 포함하는 접합체는 식 1의 구조를 포함한다:
(1)
이 구체예에서, L1은 상술된 바와 같이, 자기-희생 링커이고, L4는 상술된 바와 같이, 바람직하게는 증가된 용해성 또는 감소된 응집성을 부여하거나 가수분해율을 변경하는 부분이다. L2 는 자기-희생 링커(들)를 나타낸다. 덧붙여, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다. AA1은 천연 아미노산 또는 비천연 α-아미노산을 나타낸다.
상기 식 1의 본 발명의 링커에서, AA1은 그의 아미노 말단에서 L4에 직접 연결되거나, 또는 L4가 부재하는 경우, X4기(즉, 표적화 제제, 검출가능한 표지, 보호된 반응성 기능기 또는 비보호된 반응성 기능기)에 직접 연결된다.
다른 구체예에서, 링커를 포함하는 접합체는 식 2의 구조를 포함한다:
(2)
이 구체예에서, L4는 상술된 바와 같이, 바람직하게는 증가된 용해성 또는 감소된 응집성을 부여하거나 가수분해율을 변경하는 부분이고; L3은 일차 또는 이차 아민 또는 카르복실 기능기를 포함하는 스페이서기이며, L3의 아민은 D의 매달린(pendant) 카르복실 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 또는 L3 의 카르복실은 D의 매달린 아민 기능기와 아미드 결합을 형성하고; o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다. AA1는 천연 아미노산 또는 비천연 α-아미노산을 나타낸다. 이 구체예에서, L1은 없다(즉, m은 일반식에서 0임).
자기희생 링커 L
2
자기-희생 링커 L2는 두 개의 간격이 있는 화학적 부분을 함께 공유적으로 연결시켜 정상적으로 안정한 3구분 분자(tripartate molecule)를 형성할 수 있는 2-기능성 화학적 부분으로, 효소적 분리 수단에 의해 상기 3구분 분자로부터 상기의 간격이 있는 화학적 부분 중의 하나를 방출하고; 상기 효소적 분리 후에, 상기의 간격이 있는 화학적 부분 중 다른 하나를 상기 분자의 잔여 부분으로부터 자발적으로 분리하여 방출한다. 본 발명에 따르면, 자기-희생 스페이서를 그의 한쪽 끝에서 아미노산 AA1에 공유적으로 연결시키고, 그의 다른 쪽 끝에서 유도체화가 약리학적 활성을 억제하는 약물 부분의 화학적 반응성 자리에 공유적으로 연결시켜, 결과적으로 아미노산 AA1과 약물 부분을 함께 구분하고 공유적으로 연결하여 3구분 분자를 형성하는데, 이것은 표적 효소가 없을 때는 안정되고 약리학적으로 비활성이지만, 스페이서 부분과 아미노산 AA1을 공유적으로 연결하는 결합부에서 표적 효소에 의해 효소적으로 분리되어 3구분 분자(tripartate molecule)로부터 아미노산 AA1을 방출하는데 영향을 준다. 그러한 효소적 분리는, 다시, 스페이서 부분의 자기-희생적 특성을 활성화하고 약물 부분에 스페이서 부분을 공유적으로 연결하는 결합부의 자발적 분리를 개시하는데, 그렇게 함으로써 약물을 약리학적으로 활성인 형태로 방출하는데 영향을 준다.
자기-희생 링커 L2는 임의의 자기-희생기일 수 있다. 바람직하게 L2는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 또는 치환 및 비치환 헤테로아릴이다.
특히 바람직한 자기-희생 스페이서 L2는 식 3에 의하여 나타낼 수 있다:
(3)
아미노벤질기의 방향족 고리는 하나 이상의 “K”기로 치환될 수 있다. “K”기는, 고리 구조의 일부인 4개의 비치환 탄소 중 하나에 부착된 수소를 대체한 방향족 고리 상의 치환기다. “K”기는 할로겐과 같은 단일 원자일 수 있고, 또는 알킬, 헤테로알킬, 아미노, 니트로, 하이드록시, 알콕시, 할로알킬, 및 시아노와 같은 다-원자기일 수 있다. 각 K는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, 및 OR21로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R21 및 R22는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬 및 비치환 헤테로사이클로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 예시적인 K 치환기는 F, Cl, Br, I, NO2, OH, OCH3, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3 및 메틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. “Ka”에서, a는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다. 한 바람직한 구체예에서, a는 0이다.
상기에서 보여진 구조의 에테르 산소 원자는 카르보닐기에 연결된다. NR24 기능성기로부터 방향족 고리로 난 선은, 아민 기능성기가 고리를 형성하면서 -CH2-O- 기에 의해 치환되지 않는 5개의 탄소 중 임의의 것에 결합됨을 나타낸다. 바람직하게, X의 NR24 기능성기는 -CH2-O- 기에 대한 파라 위치에서 방향족 고리에 공유적으로 결합되어 있다. R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 멤버이다. 특정 구체예에서, R24는 수소이다.
한 구체예에서, 본 발명은 식 (1)의 링커를 제공하는데, 여기에서, F는 다음 구조를 포함한다:
여기에서, R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 선택된다. 각 K는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, 및 OR21로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버인데, 여기에서 R21 및 R22는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬 및 비치환 헤테로사이클로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며; a는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다.
다른 구체예에서, 식 (1)의 링커는 다음 구조를 포함하는 -F-(L1)m-를 포함한다:
여기에서 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다.
어떤 구체예에서, 자기-희생 스페이서 L2는 다음을 포함한다:
여기에서 각 R17, R18, 및 R19는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택되고, w는 0 내지 4의 정수이다. 어떤 구체예에서, R17 및 R18은 독립적으로 H 또는 알킬(바람직하게, 비치환 C1-4 알킬)이다. 바람직하게, R17 및 R18은 메틸 또는 에틸과 같은, C1-4 알킬이다. 어떤 구체예에서, w는 0이다.
어떤 구체예에서, L2는 다음을 포함한다:
스페이서기 L
3
스페이서기 L3은 일차 또는 이차 아민 또는 카르복실 기능기를 포함하는 것으로 특징지워지며, L3기의 아민이 D의 매달린 카르복실 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 또는 L3의 카르복실이 D의 매달린 아민 기능기와 아미드 결합을 형성한다. L3은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, L3은 방향족기를 포함한다. 더욱 바람직하게, L3은 벤조산기, 아닐린기 또는 인돌기를 포함한다. -L3-NH- 스페이서로 작용할 수 있는 구조의 비-제한적인 예들은 다음의 구조를 포함한다:
여기에서 Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택되는 멤버이며, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이다.
L3을 포함하는 본 발명의 링커의 분리시, L3 부분은 약물, D에 부착된 상태로 남는다. 따라서, L3 부분은 D에 부착된 그의 존재가 D의 활성을 유의하게 변경하지 않도록 선택된다. 다른 구체예에서, 약물 D의 일 부분은 그 자체가 L3 스페이서로 기능한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 약물, D는, 약물의 일 부분이 L3 스페이서로서 기능하는 두오카르마이신 유도체이다. 그러한 구체예의 비-제한적인 예는 NH2-(L3)-D가 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 것들을 포함한다:
여기에서 Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이고; 각 구조상의 NH2기는 AA1와 반응하여 -AA1-NH-를 형성한다.
아미노산
AA
1
AA1기는 단일 아미노산을 나타내고 천연 아미노산 또는 비천연 α-아미노산일 수 있다. 아미노산은 L 또는 D 형(configuration) 일 수 있다. 아미노산은 종양-관련 프로테아제(tumor-associated protease)와 같은 특정 분자에 의한 선택적 분리에 대한 그들의 적합성을 기준으로 선택될 수 있다.
항체로부터 독소를 분리하는 특정 기작에 제한을 받지 않고, 본 발명의 화합물의 적어도 일부는 카텝신 B에 의하여 분리되리라 믿어진다. 또한 적절한 환경에서 본 발명의 독소를 분리하거나 방출시키는 다른 기작이 본 발명에서 고려되거나 포함된다. 일 구체예에서, 아미노산 AA1은 리소좀 프로테아제에 의하여 분리되는 링커의 능력을 기준으로 선택되는데, 그의 비-제한적인 예는 카텝신 B, C, D, H, L 및 S를 포함한다. 어떤 구체예에서, 아미노산 AA1을 포함하는 링커는 시험관내에서 카텝신 B에 의하여 분리될 수 있는데, 이를 당해 분야에서 알려진 시험관내 프로테아제 분리 분석법(protease cleavage assays)을 이용하여 테스트할 수 있다.
어떤 구체예에서, 아미노산 AA1을 포함하는 링커는 시험관내에서 카텝신 B에 의하여 본질적으로 분리되지 않으나(예, 24시간 내에서는 본질적 분리가 없음), 생체내에서는 여전히 분리가능하여 활성 약물을 만들어낸다.
다른 구체예에서, 아미노산 AA1은 종양 세포의 부근에서 세포외적으로 발견되는 프로테아제와 같은, 종양-관련 프로테아제에 의하여 분리될 수 있는 그의 능력을 기준으로 선택되는데, 이의 비-제한적인 예는 티메트 올리고펩티다아제(thimet oligopeptidase, TOP) 및 CD10을 포함한다. TOP 또는 CD10에 의해 분리되는 링커의 능력을 당해 분야에서 알려진 시험관내 프로테아제 분리 분석법을 이용하여 테스트할 수 있다.
일 구체예에서, 아미노산은 다음으로부터 구성되는 군으로부터 선택된다: Ala, Arg, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val. 다른 구체예에서, 아미노산은 Cit, Glu, Lys, 및 Ser으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
프로테아제는 암 전이에 관련되어 왔다. 프로테아제 우로키나아제의 합성의 증가는 많은 암에서 전이하는 능력의 증가와 관련되어 있다. 우로키나아제는 세포외 공간에 편재하여 위치하는, 플라스미노겐으로부터 플라스민을 활성화하고, 그의 활성화는, 전이하는 종양 세포가 침입하는 통로가 되는 세포외 기질에서 단백질의 분해를 일으킬 수 있다. 플라스민은 또한 콜라게나제를 활성화하여, 모세관 및 림프계를 둘러싸는 기저막에서 콜라겐의 분해를 증진시키고, 그 때문에 종양 세포가 표적 조직으로 침입하게 한다(Dano 등, Adv. Cancer. Res., 44:139 (1985)). 따라서, 우로키나아제에 의해 분리되는 링커를 이용하는 것은 본 발명의 범위내에 있다.
또한 본 발명은 트립타제에 의한 분리에 민감한 링커의 이용을 제공한다. 인간 마스트 세포(mast cells)는, α βI, βII, 및 βIII로 지정된, 적어도 4개의 다른 트립타제를 발현한다. 이러한 효소들은 혈액 혈장 프로테이나제 억제제에 의해서 조절되지 않으며, 단지 시험관내에서 약간의 생리학적인 기질을 분리한다. 세린 프로테아제의 트립타제 군(family)은 마스트 세포를 수반하는 다양한 알러지 및 염증성 질병에 관련되어 있는데, 이는 이러한 질병을 갖는 환자의 생물학적 유체(biological fluids)에서 발견되는 높아진 트립타제 수준으로 인한 것이다. 그러나, 질병의 병리생리학에 있어서 트립타제의 정확한 역할은 서술될 것으로 남는다. 트립타제의 생물학적 기능 및 해당 생리학적 결과의 범위는 그들의 기질 특이성에 의하여 실질적으로 한정된다.
트립타제는 종양 전이 및 침입과 관련된 프로테아제의 치모겐(zymogen) 형태인, 프로-우로키나아제 플라스미노겐 활성제(uPA)의 우수한 활성제이다. 세포의 유출 및 이동을 위한 세포외 기질의 파괴를 초래하는, 플라스미노겐 케스케이드의 활성화는 Pro-Arg-Phe-Lys(서열번호 1)의 P4-P1 서열에서 프로-우로키나아제 플라스미노겐 활성제의 트립타제 활성화의 작용일 수 있다(Stack 등, Journal of Biological Chemistry 269 (13): 9416-9419 (1994)). 관 투과성의 조절에 관련되어 있는 뉴로펩티드인, 혈관작용성 장 펩티드는, 또한 Thr-Arg-Leu-Arg(서열번호 2) 서열에서 일차적으로, 트립타제에 의하여 분리된다(Tam 등, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 3: 27-32 (1990)). G-단백질과 짝지어진 수용체 PAR-2는 Ser-Lys-Gly-Arg(서열번호 3) 서열에서 트립타제에 의하여 분리되고 활성화되어 섬유아세포 증식을 이끌 수 있으며, 반면에 트롬빈 활성화 수용체 PAR-1은 Pro-Asn-Asp-Lys(서열번호 4) 서열에서 트립타제에 의하여 비활성화된다(Molino 등, Journal of Biological Chemistry 272(7): 4043-4049 (1997)). 취합하면, 이 증거는 질병의 결과로서 조직 리모델링에서의 트립타제의 주요한 역할을 암시한다. 이는 여러 마스트 세포-매개 질병에서 관찰되는 의미있는 변화와 일치한다. 만성 천식 및 다른 장기성 호흡기 질병들의 한 증거는 그의 생리학적 표적의 트립타제 활성화의 결과일 수 있는 하부 조직의 섬유증 및 비대화이다. 유사하게, 일련의 보고서는 다양한 암에서 마스트 세포 밀도, 트립타제 활성 및 나쁜 예후와 관련된 혈관생성(angiogenesis)을 보여준다(Coussens 등, Genes and Development 13(11): 1382-97 (1999)); Takanami 등, Cancer 88(12): 2686-92 (2000); Toth-Jakatics 등, Human Pathology 31(8): 955-960 (2000); Ribatti 등, International Journal of Cancer 85(2): 171-5 (2000)).
본 발명의 약물-리간드 접합체는 선택적으로 둘 이상의 링커를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나의 링커는 약물을 리간드에 연결하는데 사용될 수 있으며 제2 링커는 진단적 제제를 복합체에 부착시킬 수 있다. 추가 링커들을 위한 다른 용도는 분석적 제제, 생분자, 표적화 제제 및 검출가능한 표지를 약물-리간드 복합체에 연결하는 것을 포함한다. 다중 링커들은 같을 수도 있고 다를 수도 있다.
또한, 예를 들어, 본 발명의 화합물의 이량체, 삼량체, 사량체 및 고도의 동족체, 또는 이의 반응성 유사체와 같은, 종을 포함하는, 다중- 또는 다-가 종인 본 발명의 화합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 다중- 및 다-가 종은 본 발명의 단일 종 또는 하나 이상의 종으로부터 응집될 수 있다. 예를 들면, 이량체적 구성체는 “동종-이량체적” 또는 “이종 이량체적”일 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물 또는 이의 반응성 유사체가 올리고머 또는 폴리머 골격(예, 폴리리신, 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 등)에 부착되는 다중- 및 다-가 구성체는 본 발명의 범위 내에 있다. 골격은 바람직하게 다중기능적이다(즉, 본 발명의 화합물을 부착하기 위한 반응 자리들의 배열을 가짐). 또한, 본 발명의 단일 종 또는 본 발명의 하나 이상의 종을 갖는 골격이 유도될 수 있다.
또한, 본 발명은, 유사하게 기능화되지 않은 유사 화합물에 비하여 향상된 수용성을 갖는 화합물을 제공하도록 기능화된 화합물을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 설명된 임의의 치환기는 향상된 수용성을 갖는 유사 라디칼로 대체될 수 있다. 예를 들면, 하이드록실기를 디올로 대체하는 것, 또는 아민을 4급 아민, 하이드록시 아민 또는 유사한 보다 수용성인 부분으로 대체하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직한 구체예에서, 부모 화합물의 수용성을 향상시킨 부분으로 본 명세서에 설명된 화합물의 이온 채널을 향하여 활성에 본질적이지 않은 자리에서의 치환에 의하여, 추가적인 수용성이 부여된다. 유기 화합물의 수용성을 향상시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 그러한 방법은, 예컨대 4급 암모늄과 같은 영구히 하전된 부분을 가지는 유기 핵, 또는 예컨대 카르복실산, 아민과 같은 생리학적으로 관련된 pH에서 하전된 기를 기능화하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 방법은 유기 핵 하이드록실- 또는 아민-함유기, 예컨대, 알코올, 폴리올, 폴리에테르, 등에 부가하는 것을 포함한다. 대표적인 예는 폴리리신, 폴리에틸렌이민, 폴리(에틸렌글리콜) 및 폴리(프로필렌글리콜)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 화합물을 위한 적절한 기능화 화학법 및 전략은 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들어, Dunn, R.L. 등, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991을 참조.
약물
본 명세서에서 “D”로 기술된 약물이 약물-리간드 접합체의 일부로서 본 발명에서 제공되는데, 상기 약물-리간드 접합체에서 약물은 링커를 통해 리간드에 연결된다. 약물은 원하는 생물학적 활성을 가지고 있어야 하며, 리간드에 결합하기 위해 반응성 기능기를 포함하여야 한다. 원하는 생물학적 활성은 인간과 같은 동물에서의 질병의 진단, 치료, 진정, 처치 또는 예방을 포함한다. 따라서, 이것이 요구된 반응성 기능기를 가지는 한, 용어 “약물”은 미국 약전(United States Pharmacopeia), 미국동종요법약전(official Homeopathic Pharmacopeia of the United States) 또는 국내처방집(official National Formulary)에서 약물로 인정하는 화학물질, 또는 이의 임의의 보충제를 지칭한다. 예시적인 약물은 Physician's Desk Reference(PDR)에서 그리고 미국 식품 의약국(Food and Drug Administration, FDA)에 의하여 지지되는 Orange Book에서 설명되어 있다. 새로운 약물은 계속적으로 발견되고 개발되고 있으며, 본 발명은 이들 새로운 약물도 본 발명의 약물-리간드 복합체에 포함될 수 있다는 것을 알려둔다.
바람직한 기능기는 일차 또는 이차 아민, 하이드록실, 설프하이드릴, 카르복실, 알데히드, 및 케톤을 포함한다. 더 바람직한 기능기는 하이드록실, 일차 또는 이차 아민, 설프하이드릴 및 카르복실산 기능기들을 포함한다. 더욱 바람직한 기능기는 하이드록실, 일차 및 이차 아민 및 카르복실산 기능기들을 포함한다. 약물은 적어도 하나, 그러나 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 반응성 기능기를 가져야 한다. 덧붙여, 자기-희생 스페이서, L1은 약물의 반응성 기능기와 링커 사이에 혼입될 수 있다.
약물-리간드 접합체는 해당 약물이 효과적이라는 통상적인 목적에 대하여 효과적이지만, 약물이 특히 유익한 원하는 세포에 약물을 운반하는 적어도 어떤 리간드 고유의 능력 때문에 더욱 우수한 효능을 가진다.
예시적인 약물은 리간드로의 결합을 위한 기능기를 포함하는 단백질, 펩티드 및 소 분자 약물을 포함한다. 더욱 특히, 이들 약물은, 예를 들면, 디하이드로폴레이트 환원효소 억제제(dihydrofolate reductase inhibitors), 티미딜레이트 합성효소 억제제(thymidylate synthase inhibitors), DNA 삽입제(DNA intercalators), DNA 절단제(DNA cleavers), 토포이소머라아제 억제제(topoisomerase inhibitors)와 같은 효소 억제제, 안트라사이클린계 약물(anthracycline family of drugs), 빈카 약물(vinca drugs), 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성적 뉴클레오시드, 프테리딘계 약물(pteridine family of drugs), 디이넨(diynenes), 포도필로톡신(podophyllotoxins), 분화 유도제(differentiation inducers) 및 택솔(taxols)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 약물은 암 치료에 유용한 세포독성 약물, 및 독소와 같은, 원하는 생물학적 활성을 갖는 기타 소 분자, 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 약물은 종양-특이적 리간드에 접합함으로써 종양 세포에서 활성화되도록 선택될 수 있다. 이들 종양 특이적 약물-리간드 접합체는 리간드의 특이성으로부터 생기는 종양 특이성을 가진다. 이것들의 예는 종양 특이적 효소에 대하여 높은 선택적 기질인 약물-리간드 접합체인데, 이 효소는 종양 근처에서 유리 약물의 세포독성 수준을 생성하기에 충분한 양으로 종양의 근처에서 존재한다. 이들 종양-특이적 약물-리간드 복합체의 한 장점은 그것들이 인간 혈장내에서 우발성 프로테아제(adventitious proteases)에 대하여 안정하다는 것이다. 약물-리간드 복합체의 다른 장점은 그것들이 해당 유리 약물보다 덜 독성적인 것이며; 덧붙여, 이 복합체의 특이성은 유리 약물에 비해 사용되는 전체 농도를 더 낮게 할 수 있는데, 그 이유는 높아진 특이성으로 종양 자리에 존재하는 복합체의 퍼센트가 높아지기 때문이다.
세포독소
본 발명에 유용한 세포독성적 약물은, 예를 들면, 두오카르마이신과 CC-1065, 및 이의 유사체를 포함하는데, 이들은 두오카르마이신과 CC-1065의 CBI(1,2,9,9a-테트라하이드로사이클로프로파[c]벤즈[e]인돌-4-온)-기반 유사체, MCBI(7-메톡시-l,2,9,9a-테트라-하이드로사이클로프로파[c]벤즈[e]인돌-4-온)-기반 유사체 및 CCBI(7-시아노-l,2,9,9a-테트라-하이드로사이클로-프로파[c]벤즈[e]-인돌-4-온)-기반 유사체, 독소루비신 및 모르폴리노-독소루비신과 시아노모르폴리노-독소루비신 같은 독소루비신 접합체, 돌라스타틴-10과 같은 돌라스타틴, 콤브레타스타틴, 칼리케아미신, 마이탄신, 마이탄신 유사체, DM-1, 오리스타틴 E, 오리스타틴 EB(AEB), 오리스타틴 EFP(AEFP), 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 5-벤조일발레르산-AE 에스테르(AEVB), 투불리신, 디소라졸, 에포틸론, 파클리탁셀, 도세탁셀, SN-38, 토포테칸, 리족신, 에키노마이신, 콜히친, 빈블라스틴, 빈데신, 에스트라무스틴, 세마도틴, 엘레우테로빈, 메토트렉세이트, 메토프테린, 디클로로메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토푸린, 시토신 아라비노시드, 멜팔란, 류로신, 류로시데인, 악티노마이신, 다우노루비신 및 다우노루비신 접합체, 미토마이신 C, 미토마이신 A, 카르미노마이신, 아미노프테린, 탈리소마이신, 포도필로톡신 및 에토포시드 또는 에토포시드 포스페이트와 같은 포도필로톡신 유도체, 빈크리스틴, 택솔, 탁소테레 레티노산, 부티르산, N8-아세틸 스페르미딘, 캄프토테신, 및 그의 유사체를 포함한다. 다른 알려진 약물은 본 명세서에 기술된 링커에 접합하기 위한 기능기를 제공하기 위해서 변형될 수 있다. 그러한 화학적 변형은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명에 사용하기에 바람직한 세포독소는 다음을 포함한다: 두오카르마이신, CC-1065, 및 이의 CCBI-기반 및 MCBI-기반 그의 유사체, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 돌라스타틴-10, 콤브레타스타틴, 칼리케아미신, 마이탄신, DM-I, 오리스타틴 E, AEB, AEFP, MMAE, 투불리신 A, 디소라졸, 에포틸론 A 및 에포틸론 B를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 세포독소는 활성있고 효능있는 두오카르마이신 유도체 및 CC- 1065이다. 부모 시약은 DNA의 가역적, 입체전자적 조절 서열 선택적 알킬화를 통해 그들의 생물학적 효과를 유도하는 뛰어나게 효능있는 항종양 항생제이다(Boger 등 J. Org. Chem. 55: 4499 (1990); Boger 등, J. Am. Chem. Soc. 112: 8961 (1990); Boger 등, J. Am. Chem. Soc. 113: 6645 (1991); Boger 등, J. Am. Chem. Soc. 115: 9872 (1993); Boger 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2: 759 (1992)). 두오카르마이신의 최초의 공지 이후, 두오카르마이신 및 그의 구조적 원형체의 DNA 알킬화 선택성을 밝히기 위해 광범위한 노력을 해왔다.
본 발명의 특히 바람직한 관점은 다음 식 4에 따른 구조를 갖는 세포독성적 화합물을 제공한다:
여기에서, 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택되는 멤버이다. 예시적인 고리계는 페닐 및 피롤을 포함한다.
기호 E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일결합으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 E 및 G는 임의로 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성한다.
기호 X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버를 나타낸다. R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이다.
기호 R3은 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로부터 선택된 멤버를 나타내는데, 여기에서 R11은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 디포스페이트, 트리포스페이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 또는 SiR12R13R14이다. 기호 R12, R13, 및 R14는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 아릴을 나타내며, 여기에서, R12 및 R13은 이들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4부터 6까지의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다.
R4, R4’, R5 및 R5’는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, SO3, SO2R15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 독립적으로 선택되는 멤버들인데, 여기에서 n은 1부터 20까지의 정수이며, 또는 R4, R4’, R5 및 R5’의 임의의 인접한 쌍은, 그들이 부착된 탄소 원자와 함께, 결합되어 4부터 6까지의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4부터 6까지의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. 하나의 예시적인 구조는 아닐린이다.
R4, R4’, R5, R5’, R11, R12, R13, R15 및 R16 중 적어도 하나는, 본 명세서에서 기술한 바와 같이, 약물을 본 발명의 링커, 예를 들어, 존재한다면 L1에 또는 F에 결합시키는데 사용된다.
한 구체예에서, R4, R4’, R5, R5’, R11, R12, R13, R15 및 R16 중 적어도 하나는 화합물을 접합하기에 적절한 반응기를 가진다. 다른 예시적인 구체예에서, R4, R4’, R5, R5’, R11, R12, R13, R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 알킬 및 치환 헤테로알킬로부터 선택되며, 알킬 또는 헤테로알킬 부분의 자유말단에서 반응성 기능기를 가진다. R4, R4’, R5, R5’, R11, R12, R13, R15 및 R16 중 하나 이상은 다른 종, 예를 들어, 표적 제제, 검출가능한 표지, 고형 지지체, 등등에 접합될 수 있다.
R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이다. R6이 존재하면, R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성한다. R7은 CH2-X1 또는 -CH2-이다. R7이 -CH2-이면, 그것은 사이클로프로판 고리의 성분이다. 기호 X1은 할로겐, 예를 들어 Cl, Br 또는 F와 같은 이탈기를 나타낸다. R6 및 R7의 조합은 화학 원자가의 규칙을 어기지 않는 방식으로 해석된다.
X1은 임의의 이탈기일 수 있다. 유용한 이탈기는 할로겐, 아지드, 설포닉 에스테르(예, 알킬설포닐, 아릴설포닐), 옥소늄 이온, 알킬 퍼클로레이트, 암모니오알칸설포네이트 에스테르, 알킬플루오로설포네이트 및 플루오르화 화합물(예, 트리플레이트, 노나플레이트, 트레실레이트) 및 기타 유사한 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이탈기로서 유용한 특정 할로겐은 F, Cl 및 Br이다. 이들 및 특정의 반응 조건에 적절한 다른 이탈기를 선택하는 것은 당해 분야의 숙련자의 능력 범위안에 있다(예를 들어, March J, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 제2판, John Wiley and Sons, 1992; Sandler SR, Karo W, ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, 제2판, Academic Press, Inc., 1983; 및 Wade LG, COMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETIC METHODS, John Wiley and Sons, 1980).
6-멤버 고리 내의 곡선은 고리가 하나 이상의 불포화도를 가질 수 있으며, 방향족일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 아래에 설명된 것들과 같은 고리 구조 및 관련 구조는 식 (5)의 범위 내에 있다:
어떤 구체예에서, R4, R4’, R5, 및 R5’ 중 적어도 하나는 상기 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결시킨다.
한 구체예에서, R11은 자기-고리화하지 않으며 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결하는 부분, X5를 포함한다. 부분, X5는, 바람직하게 효소를 사용하여 분리가능하며, 분리될 때, 활성 약물을 제공한다. 예로써, R11은 다음 구조(약물의 잔여 부분에 결합하는 우측을 가짐)를 가진다:
예시적 구체예에서, 식 (4)의 고리계 A는 치환 또는 비치환 페닐 고리이다. 고리계 A는 본 명세서에 정의 부분에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 아릴기 치환기로 치환될 수 있다. 어떤 구체예에서, 페닐 고리는 CN 또는 메톡시 부분으로 치환된다.
다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 식 6에 따른 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
이 구체예에서, 치환기 R3, R4, R4’, R5, R5’, R6, R7 및 X의 아이덴티티들(identities)은 실질적으로 식 4에서 상술한 바와 같으며, 뿐만 아니라 특정 구체예에서도 같다. 기호 Z는 O, S 및 NR23으로부터 독립적으로 선택된 멤버이다. 기호 R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버를 나타낸다. 각 R23은 독립적으로 선택된다. 기호 R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8 또는 CO2R8을 나타낸다. R8은 치환 알킬, 비치환 알킬, NR9R10, NR9NHR10 및 OR9로부터 선택된 멤버이다. R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택된다. R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬이다. R2가 치환 알킬일 때, 그것은 퍼플루오로알킬, 예를 들어, CF3이외의 것이 일반적으로 바람직하다. 한 구체예에서, R2는 치환 알킬인데, 여기에서 치환기는 할로겐이 아니다. 다른 구체예에서, R2는 비치환 알킬이다.
어떤 구체예에서, R1은 CO2CH3와 같은, 에스테르 부분이다. 어떤 구체예에서, R2은 저급 알킬기인데, 치환되거나 비치환될 수 있다. 현재 바람직한 저급 알킬기는 CH3이다. 어떤 바람직한 구체예에서, R1은 CO2CH3이고 R2는 CH3이다.
어떤 구체예에서, R4, R4’, R5, 및 R5’는 H, 할로겐, NH2, OMe, O(CH2)2N(R29)2 및 NO2로부터 독립적으로 선택된 멤버들이다. 각 R29는 독립적으로 H 또는 저급 알킬(예, 메틸)이다.
어떤 구체예에서, 이탈기 X1이 할로겐, 일킬설포닐, 아릴설포닐, 및 아지드로 구성되는 군으로부터 선택되는 멤버이도록 약물을 선택한다. 어떤 구체예에서, X1는 F, Cl, 또는 Br이다.
어떤 구체예에서, Z는 O 또는 NH이다. 어떤 구체예에서, X는 O이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 식 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
(7) (8)
식 4의 두오카르마이신 유사체의 다른 바람직한 구조는 고리계 A가 비치환 또는 치환 페닐 고리인 구조이다. 고리계 A가 피롤일 때의 식 4의 구조에 대해 상술된 약물 분자 상의 바람직한 치환기는 또한 고리계 A가 비치환 또는 치환 페닐 고리일 때의 바람직한 치환기이다.
예를 들면, 바람직한 구체예에서, 약물 (D)는 식 (9)의 구조를 포함한다:
이 구조에서, R3, R6, R7, X는 식 4에 대하여 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며;
R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8이고, 여기에서 R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R1’은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8이고, 여기에서, R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 시아노, 또는 알콕시이고; R2’는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다.
R4, R4’, R5, R5’, R11, R12, R13, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결한다.
약물 (D)의 다른 구체예는 구조 (13)을 포함하는데, 여기에서 R4 및 R4’는 결합되어 헤테로사이클로알킬을 형성한다:
이 구조에서, R3, R5, R5’, R6, R7, X는 식 4에 대해 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며;
R32는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 20의 정수이다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4내지 6의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다.
R5, R5’, R11, R12, R13, R15, R16, 또는 R32의 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결한다. 적어도 어떤 구체예에서, R32는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 결합한다.
이 화합물의 바람직한 구체예는 다음 구조를 가진다:
R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8이고, 여기에서 R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R1’은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8이고, 여기에서, R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 시아노, 또는 알콕시이고; R2’는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다.
다른 구체예는 다음 식을 가진다:
이 구조에서, A, R6, R7, X, R4, R4’, R5, 및 R5’는 식 4에 대해 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며;
R33은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 20의 정수이다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4내지 6의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. R33은 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결한다.
바람직하게, A는 치환 또는 비치환 페닐, 또는 치환 또는 비치환 피롤이다. 또한, R11에 대하여 본 명세서에 서술된 치환기의 임의의 선택은 R33에도 적용가능하다.
리간드
X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 구성된 군으로부터 선택된 리간드를 나타낸다. 바람직한 리간드는 항체 및 이의 단편과 같은, 표적화 제제이다.
어떤 구체예에서, X4기는 R29, COOR29, C(O)NR29, 및 C(O)NNR29로부터 선택되는 멤버로 기술될 수 있으며, 여기에서 R29는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택된 멤버이다. 또 다른 예시적 구체예에서, R29는 H; OH; NHNH2;
로부터 선택된 멤버이고,
여기에서 R30은 반응성 기능기 말단 치환 또는 비치환 알킬, 기능성기 말단 치환 또는 비치환 헤테로아릴을 나타낸다. 상기 구조들은, 예를 들어, 항체와 같은 표적화 제제의 아미노산의 측쇄와 반응하여 표적화 제제를 링커-약물 부분에 연결시킬 수 있는 반응성 보호기로서 작용한다.
표적화 제제
본 발명의 링커 가지 및 세포독소는 유효적재물을 몸의 세포, 기관 또는 영역에 선택적으로 전달하는 표적화 제제에 연결될 수 있다. 항체(예컨대, 키메릭, 인간화 및 인간의), 수용체의 리간드, 렉틴, 당류, 항체 등과 같은 예시적인 표적화 제제는 당해 분야에 인식되어 있으며 본 발명을 실행하는데 있어서 제한 없이 유용하다. 다른 표적화 제제는 폴리(에틸렌 글리콜), 다당류, 폴리아미노산 등과 같은 거대분자를 포함하는데 특정 분자 인식 모티프를 포함하지 않는 화합물류를 포함하며, 분자 부분을 세포독소에 부가한다. 부가적인 분자 부분은 세포독소의 약물동력학, 예를 들면, 혈장 반감기에 영향을 미친다.
예시적인 구체예에서, 본 발명은, 생분자 예컨대, 항체, 수용체, 펩티드, 렉틴, 당류, 핵산 또는 이의 조합인 표적화 제제와 함께 세포독소, 링커 또는 세포독소-링커 접합체를 제공한다.
본 발명을 실행하는데 있어어 유용한 생분자는 임의의 원료로부터 유도될 수 있다. 생분자는 천연 원료로부터 분리되거나 합성 방법에 의해 생산될 수 있다. 단백질은 천연 단백질 또는 돌연변이된 단백질일 수 있다. 돌연변이는 화학적 돌연변이유발, 부위특이적 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 또는 당업자에 알려진 돌연변이를 유발하는 다른 수단에 의하여 달성될 수 있다. 본 발명을 실행하는데 있어서 유용한 단백질은, 예를 들면, 효소, 항원, 항체 및 수용체를 포함한다. 항체는 다중클론 또는 단일클론일 수 있으나, 가장 바람직하게는 단일클론이다. 펩티드 및 핵산은 천연원료로부터 분리되거나 또는 그 원천에서 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 표적화 제제는 관심의, 표적 세포 상에서 또는 표적 자리에서 발현되는 항원에 대한 그의 특이성을 근거로 선택된, 항체 또는 항체 단편이다. 매우 다양한 종양-특이적 또는 다른 질환-특이적 항원들이 밝혀졌으며, 이들 항원에 대한 항체가 그러한 종양 또는 다른 질환의 치료에 사용되거나 사용을 위하여 제시되었다. 당해 기술 분야에 알려진 항체들은 본 발명의 접합체에, 특히 표적 항원이 관련된 질병의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체-링커-약물 접합체가 표적화될 수 있는 표적 항원(및 이와 관련된 질병)의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: Her2(유방암), CD20(림프종), EGFR(고형종양), CD22(비-호지킨 림프종을 포함하는 림프종), CD52(만성 림프성 백혈병), CD33(급성 골수종 백혈병), CD4(림프종, 류마티스 관절염을 포함하는 자가면역 질환), CD30(비-호지킨 림프종을 포함하는 림프종), Mucl8(흑색종), 인테그린스(고형 종양), PSMA(전립선 암, 양성 전립샘 증식), CEA(직장결장 암), CDl1a(건선), CD80(건선), CD23(천식), CD40L(면역 혈소판감소 자색반), CTLA4(T 세포 림프종) 및 BLys(전신 홍반성 낭창을 포함하는 자가면역 질환).
이들 구체예에서, 상기 인식 부분은 단백질 또는 항체일 수 있으며, 단백질은 표면 또는 자체 조립 단층(self assembled monolayer, SAM) 성분에 결합되거나 단백질의 표면 상의 유용한 임의의 반응성 펩티드 잔기에 의해 스페이서 가지를 통해 연결될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 반응성 기는 아민 또는 카르복실레이트이다. 특히 바람직한 구체예에서, 반응성 기는 리신 잔기의 ε-아민기이다. 더욱이, 이 분자들은 비-특이적 상호작용(예컨대, 화학흡착, 물리적흡착)에 의해서 기질의 표면 또는 SAM 상으로 흡착될 수 있다.
항체인 인식 부분은 단백질, 펩티드, 핵산, 당류 또는 약물, 제초제, 살충제, 공업용 화학물질 및 전쟁용 제제와 같은 소분자를 인식하는데 사용될 수 있다. 특정 분자의 항체를 키우는 방법은 당업자에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,147,786호; 제 5,334,528호; 제 5,686,237호; 및 제 5,573,922호를 참조. 표면에 항체를 부착하는 방법도 기술-공지되어 있다. 예를 들어, Delamarche 등, Langmuir 12:1944-1946 (1996)을 참조.
표적화 제제는 임의의 유용한 반응성 기에 의해 본 발명의 링커에 부착될 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 아민, 카르복실, 설프하이드릴 또는 하이드록실기를 통해 부착될 수 있다. 그러한 기는 펩티드 말단에 또는 펩티드 사슬의 내부 자리에 잔류할 수 있다. 핵산은 염기(예컨대, 엑소사이클릭 아민) 상의 반응성 기 또는 당 부분 상의 유용한 하이드록실기(예컨대, 3'- 또는 5'-하이드록실)를 통해 부착될 수 있다. 펩티드 및 핵산 사슬은 하나 이상의 자리에서 더 유도되어 사슬 상으로 적절한 반응성 기들을 부착시킬 수 있다. 예를 들어, Chrisey 등, Nucleic Acids Res. 24:3031-3039 (1996)을 참조.
펩티드 또는 핵산이 완전히 또는 부분적으로 합성된 분자일 때, 반응성 기 또는 차폐 반응성 기가 합성의 과정 중에 혼입될 수 있다. 펩티드 및 핵산 둘다에서 반응성 기 혼입을 위해 적절한 많은 유도성 단량체들은 당업자에 알려져 있다. 예를 들면, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY, Vol. 2: “Special Methods in Peptide Synthesis”, Gross, E. 및 Melenhofer, J., Eds., Academic Press, New York (1980)을 참조. 많은 유용한 단량체들은 상업적으로 입수가능하다(Bachem, Sigma, 등). 그리고나서, 이 차폐된 기는 벗겨지고 합성되며, 이 때 본 발명의 화합물의 성분과 반응하는데 사용가능하게 된다.
예시적인 핵산 표적화 제제는 아프타머(aptamer), 안티센스(antisense) 화합물 및 삼중 나선형을 형성하는 핵산들을 포함한다. 전형적으로, 당 잔기의 하이드록실기, 염기 잔기의 아미노기, 또는 뉴클레오티드의 포스페이트 산소는 뉴클레오티드-기반 표적화 제제를 세포독소에 결합시키기 위하여 필요한 화학적 기능성기로서 사용된다. 그러나 당업자는 다른 “비-천연” 반응성 기능성기를 통상적인 기술에 의해서 핵산에 덧붙일 수 있다는 것을 쉽게 알 것이다. 예를 들면, 당 잔기의 하이드록실기는 당해 분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 메르캅토 또는 아미노 기로 전환될 수 있다.
아프타머(또는 핵산 항체)는 특정 분자 표적에 결합하는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 단일-가닥 RNA 분자이다. 일반적으로, 아프타머는 분자 표적, 예컨대, 단백질의 작용을 억제함으로써, 혈액 내에서 순환하는 표적의 푸울(pool)에 결합함으로써 기능한다. 아프타머는 화학적 기능성기를 가지며, 따라서 본 명세서에 기술한 바와 같이, 세포독소에 공유적으로 결합할 수 있다.
매우 다양한 분자 표적이 소분자 약물, 대사물, 보조인자, 독소, 당-기반 약물, 뉴클레오티드-기반 약물, 당단백질 등을 포함하는, 아프타머와 비-공유적이나 특이적인 회합을 형성할 수 있다 하더라도, 일반적으로 분자 표적은 혈장 단백질, 키닌, 아이코사노시드, 세포 표면 분자 등을 포함하여, 단백질 또는 펩티드를 포함할 것이다. 아프타머의 예는 길리드 항트롬빈 억제제(Gilead's antithrombin inhibitor) GS 522 및 그의 유도체(Gilead Science, Foster City, Calif.)를 포함한다. 또한, Macaya 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3745-9 (1993); Bock 등 Nature (London) 355:564-566 (1992) 및 Wang 등 Biochem. 32:1899-904 (1993)을 참조.
주어진 생분자에 특이적인 아프타머는 당해 분야에서 공지된 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 예컨대, Toole 등 (1992) PCT 공개번호 제 WO 92/14843호; Tuerk 및 Gold (1991) PCT 공개 번호 제 WO 91/19813호; Weintraub 및 Hutchinson (1992) PCT 공개 번호 제 92/05285호; 그리고 Ellington 및 Szostak, Nature 346:818 (1990)를 참조. 간략하면, 이들 기술은 전형적으로 올리고뉴클레오티드의 랜덤한 혼합물과 함께 분자 표적의 복합체 형성을 포함한다. 아프타머-분자 표적 복합체는 복합체를 형성하지 않은 올리고뉴클레오티드로부터 분리된다. 아프타머는 분리된 복합체로부터 회수되어 확장된다. 이러한 사이클이 반복되어 분자 표적에 대해 높은 친화성을 갖는 아프타머 서열을 확정한다.
유전자의 부적당한 발현으로 초래된 질환에서, 그러한 유전자의 발현의 특이적 예방 또는 감소는 이상적인 치료법이다. 원칙적으로, mRNA 내의 접근가능한 서열(accessible sequence) 또는 pre-mRNA 가공(processing)에 필수적인 전사체 내의 서열, 또는 유전자 그 자체 내의 서열에 상보적인 단일-가닥 데옥시뉴클레오티드 또는 리보데옥시뉴클레오티드의 교잡에 의하여 특정 유전자 생성물의 생산을 억제하거나 감소시키거나 또는 중지시킬 수 있다. 유전적 조절을 위한 이 패러다임은 흔히 안티센스 또는 항유전자 억제로서 지칭된다. 부가적인 효능은 본 발명의 것들과 같은, 알킬화제를 핵산에 접합시킴으로써 부여된다.
안티센스 화합물은 특정 단백질을 생성하는 mRNA에 결합하여 mRNA의 생산을 방지하거나 무력화하도록 고안된 핵산이다. 안티센스 화합물은 안티센스 RNA 또는 DNA, 단일 또는 이중 가닥, 올리고뉴클레오티드, 또는 그들의 유사체를 포함하며, 이들은 개개의 mRNA 종에 특이적으로 교잡하고 mRNA 종의 전사 및/또는 RNA 가공 및/또는 암호화된 폴리펩티드의 번역을 방지하여 각각의 암호화된 폴리펩티드의 양을 감소시킨다(Ching 등 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10006-10010 (1989); Broder 등 Ann. Int. Med. 113:604-618 (1990); Loreau 등 FEBS Letters 274:53-56 (1990); Holcenberg 등 제WO91/11535호; 제WO91/09865호; 제WO91/04753호; 제WO90/13641호; 제WO 91/13080호, 제WO 91/06629호, 및 제EP 386563호). 그들의 정교한 표적 감지성 및 선택성으로 인해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 원하는 분자 표적에 대해 본 발명의 세포독소와 같은, 치료적 제제를 전달하는데 유용하다.
핵산이 삼중 나선 형성을 통해서 이중 DNA에 결합하고 전사 및/또는 DNA 합성을 억제할 수 있다는 것이 보고되었다. 삼중 나선 화합물(삼중 가닥 약물로서도 지칭됨)은 이중-가닥 DNA의 서열에 결합하며, 바이러스 유전자, 예컨대, HIV 및 단순포진 바이러스, 및 종양발생유전자와 같은 질환-야기 유전자의 전사를 선택적으로 억제하는 것으로 의도되는, 즉 이들은 세포 핵에서 단백질 생성을 정지시키는 올리고뉴클레오티드이다. 이들 약물은 세포 게놈에서 이중 가닥 DNA에 직접 결합하여 삼중 나선을 형성하고 세포가 표적 단백질을 만드는 것을 방지한다. 예컨대, PCT 공개 번호 제 WO 92/10590호, 제 WO 92/09705호, 제 WO91/06626호, 및 미국 특허 번호 제 5,176,996호를 참조. 따라서, 본 발명의 세포독소도 삼중 나선을 형성하는 핵산 서열에 접합된다.
핵산의 자리 특이성(예컨대, 안티센스 화합물 및 삼중 나선 약물)은 포스포디에스테르 연결의 변형에 의하여 또는 올리고뉴클레오티드 말단의 화학적 변형에 의하여 심각하게 영향을 받지 않는다. 결과적으로, 이들 핵산은 화학적으로 변형되며; 전체적인 결합 안정성을 증진시키고, 화학적 분해에 관한 안정성을 증가시키며, 올리고뉴클레오티드가 세포로 전달되는 속도를 증가시키고, 분자에 화학적 반응성을 부여한다. 안티센스 치료요법에 유용한 여러 핵산을 구성하는 일반적인 접근은 van der Krol 등, Biotechniques 6:958-976 (1988) 및 Stein 등 Cancer Res. 48:2659-2668 (1988)에 의하여 검토되었다. 따라서, 예시적인 구체예에서, 본 발명의 세포독소는 포스포디에스테르 연결의 변형에 의하여 핵산에 접합된다.
더욱이, 관련 표적 서열과의 특이적 교잡 또는 회합이 올리고뉴클레오티드의 기능성 성질로서 유지되는 한, 본 발명의 세포독소를 지닌 안티센스 화합물 및 삼중 나선 약물은 또한 뉴클레오티드 치환, 첨가, 삭제 또는 전위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 어떤 구체예는 자연 발생적인 포스페이트 디에스테르 상응체에 비해 뉴클레아제(nucleases)에 의한 분해에 더 저항적인 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 유사체를 사용할 것이며, 따라서 생체내에서 더 높은 지속성과 더욱 큰 효능을 가질 것으로 기대된다(예컨대, Campbell 등, J. Biochem. Biophys. Methods 20:259-267(1990)을 참조). 또한 올리고뉴클레오티드의 포스포라미데이트 유도체는 상보적인 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 수용된 공유 결합 리간드 종의 부가적인 성능을 가지는 것이 알려져 있으며, 본 발명의 방법을 따를 것이다. 예를 들면, Froehler 등, Nucleic Acids Res. 16(11):4831 (1988)을 참조.
어떤 구체예에서, 아프타머, 안티센스 화합물 및 삼중 나선 약물은 O-메틸리보뉴클레오티드를 포함할 것이다(EP 공개 번호 제 360609호). 또한 키메릭 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다(Dagle 등, Nucleic Acids Res. 18: 4751 (1990)). 어떤 응용에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 삼중 나선은 폴리아미드 핵산(Nielsen 등, Science 254: 1497 (1991) 및 PCT 공개 번호 제 WO 90/15065호) 또는 다른 양이온성 유도체(Letsinger 등, J. Am. Chem. Soc. 110: 4470-4471 (1988))를 포함할 수 있다. 다른 응용은 올리고뉴클레오티드를 이용할 수 있는데, 여기에서 하나 이상의 포스포디에스테르 연결이 PCT 공개 번호 제 WO 92/05186호 및 제 91/06556호에 기술된 바와 같이 2-4 원자 길이의 인터뉴클레오티드 결합과 같은 이소스테르기, 또는 포름아세탈기(Matteucci 등, J. Am. Chem. Soc. 113: 7767-7768 (1991)) 또는 아미드기(Nielsen 등, Science 254: 1497-1500 (1991))로 치환된다.
부가적으로, 예를 들면, 당 또는 염기는 화학적으로 변형되는, 뉴클레오티드 유사체가 본 발명에 사용될 수 있다. 퓨린 및 피리미딘의 “유사체” 형태는 당해 분야에서 일반적으로 알려진 것들이 있으며, 이들 중 많은 것들은 화학치료적 제제로서 사용된다. 모든 것을 망라한 목록은 아니지만 예는 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, β-D-만노실큐에오신, 5'메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 큐에오신(queosine), 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 부가적으로, 통상적인 것은 할로겐화된 염기를 기반으로 한다. 더욱이, 염기 상의 2'-퓨라노스 위치는 비-하전된 거대한 기 치환을 가질 수 있다. 비-하전된 거대 기의 예는 분지형(branched) 알킬, 당 및 분지형 당을 포함한다.
또한, 말단 변형은 세포독소를 핵산에 접합시키고, 세포 유형 특이성, 약물동력학, 핵 투과성, 및 올리고뉴클레오티드 약제학적 제제의 순수 세포 흡수 속도를 변형하기 위한 유용한 과정을 제공한다. 예를 들면, 5' 및 3' 말단에서 반응성 기를 포함하는 치환체의 배열은 공지되어 있으며, 이것은 세포독소의 공유적 부착을 허용한다. 예컨대, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES: ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, (1989) Cohen, Ed., CRC Press; PROSPECTS FOR ANTISENSE NUCLEIC ACID THERAPEUTICS FOR CANCER AND AIDS, (1991), Wickstrom, Ed., Wiley-Liss; GENE REGULATION: BIOLOGY OF ANTISENSE RNA AND DNA, (1992) Erickson 및 Izant, Eds., Raven Press; 그리고 ANTISENSE RNA AND DNA, (1992), Murray, Ed., Wiley-Liss을 참조. 안티센스 화합물과 관련된 일반적인 방법에 대하여, ANTISENSE RNA AND DNA, (1988), D. A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.을 참조.
검출가능한 표지
본 발명의 화합물 및 방법과 연관되어 사용된 특정 표지 또는 검출가능한 기는 일반적으로 그것이 본 발명의 화합물의 활성 또는 유용성에 유의하게 간섭하지 않는 한, 본 발명의 중요한 관점이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 그러한 검출가능한 표지는 면역분석 분야에서 잘 발달되어 왔으며, 일반적으로, 그러한 방법에 유용한 대부분의 임의의 표지는 본 발명에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광기의, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에 유용한 표지는 자성 구슬(예, DYNABEADS™), 형광 색소(예, 형광물질 이소티오시아네이트, 텍사스 레드(Texas red), 로다민(rhodamine), 등), 방사능표지(예, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소(예, 호스 라디시 퍼옥시다제(horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타제, 및 ELISA에 일반적으로 사용되는 다른 것들), 및 콜로이드성 금 또는 착색된 유리 또는 플라스틱 구슬(예, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 등)과 같은 비색 표지를 포함한다.
당해 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 표지를 본 발명의 화합물에 직접적으로 또는 간접적으로 결합시킬 수 있다. 상술한 바와 같이, 요구되는 민감도, 화합물과의 접합의 용이성, 안정성 요구, 사용가능한 설비 및 처리 규정에 따라 표지를 선택함으로써 매우 다양한 표지를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물이 검출가능한 표지에 접합될 때, 상기 표지는 바람직하게는 방사성 동위원소, 형광성 제제, 형광성 제제 전구체, 발색단(chromophores), 효소 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 멤버이다. 항체에 여러 기들을 접합시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 항체에 빈번히 접합되는 검출가능한 표지는 호스라디시 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 및 글루코스 옥시다제와 같은 효소이다.
비-방사성 표지는 흔히 간접적인 수단에 의해서 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예, 비오틴)는 접합체의 성분에 공유적으로 결합된다. 다음에 상기 리간드는 고유하게 검출가능하거나, 검출가능한 효소, 형광성 화합물, 또는 화학발광성 화합물과 같은, 신호 시스템에 공유적으로 결합되는 다른 분자(예, 스트렙타비딘)에 결합된다.
또한 본 발명의 접합체의 성분은, 예를 들면, 효소 또는 형광단과의 접합에 의하여, 신호 생성 화합물에 직접적으로 접합될 수 있다. 표지로서 관심의 효소는 우선적으로 하이드롤라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도타제, 특히 퍼옥시다제일 것이다. 형광성 화합물은 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 등등을 포함한다. 화학발광성 화합물은 루시페린, 및 2,3-디하이드로프탈라진디온, 예를 들면, 루미놀을 포함한다. 사용될 수 있는 여러 표지화 또는 신호 생성 시스템의 검토를 위하여, 미국 특허번호 제 4,391,904호를 참조.
표지를 검출하는 방법은 당업자에 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들면, 표지가 방사성 표지일 때, 검출 방법은 자가방사기록법(autoradiography)에서와 같은 신틸레이션 계수기 또는 사진 필름의 사용을 포함한다. 표지가 형광성 표지일 때, 적절한 파장의 빛을 갖는 형광색소를 여기시키고(exciting) 그 결과의 형광을 검출함으로써 표지를 검출할 수 있다. 사진 필름에 의하여, 전하결합소자(charge coupled devices, CCDs) 또는 광증폭기 등과 같은 전자 검출기를 사용함으로써, 상기 형광을 육안으로 검출할 수 있다. 유사하게, 효소에 적절한 기질을 제공하고 그 결과의 반응 생성물을 검출함으로써, 효소 표지를 검출할 수 있다. 마지막으로, 단순한 비색 표지는 표지와 관련된 색깔을 관찰함으로써 간단히 검출할 수 있다. 따라서, 여러 딥스틱(dipstick) 분석법에서, 접합된 금은 흔히 분홍색으로 나타나고, 반면에 다양한 접합된 구슬은 구슬의 색으로 나타낸다.
형광성 표지는 취급시 주의를 거의 요구하지 않는다는 장점을 가지며, 고-처리량 가시화 기술(컴퓨터를 포함하는 통합된 시스템에서 분석용 이미지의 디지털화를 포함하는 광학적 분석)에 사용할 수 있어서 현재 바람직하다. 바람직한 표지는 다음 중 하나 이상에 의하여 전형적으로 특징지어질 수 있다: 표지화하는데 있어서 높은 감응성, 높은 안정성, 낮은 백그라운드(background), 낮은 환경 감응성 및 높은 특이성. 많은 형광성 표지는 SIGMA chemical company(Saint Louis, MO), Molecular Probes(Eugene, OR), R&D systems(Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories Inc.(Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company(Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(Gaithersburg, MD), Fluka Chemica- Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), 및 Applied Biosystems(Foster City, CA), 뿐만 아니라 당업자에게 알려진 많은 다른 상업적 소스(sources)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 더욱이, 당업자들은 특정 용도에 적절한 형광단을 선택하는 방법을 알 것이며, 상업적으로 용이하게 입수할 수 없다면, 필요한 형광단을 새로 합성하거나 상업적으로 입수할 수 있는 형광성 화합물을 합성적으로 변형하여 원하는 형광성 표지에 도달할 수 있을 것이다.
작은 분자 형광단에 덧붙여, 자연적으로 발생하는 형광성 단백질 및 그러한 단백질의 조작된 유사체가 본 발명에서 유용하다. 그러한 단백질은, 예를 들면, 자포동물의 녹색 형광성 단백질(Ward 등, Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982); Levine 등, Comp. Biochem. Physiol., 72B:77-85 (1982)), 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri) 균주로부터의 황색 형광성 단백질(Baldwin 등, Biochemistry 29:5509-15 (1990)), 와편모충 심비오디니움(dinoflagellate Symbiodinium) sp 종으로부터의 페리디닌-클로로필(Peridinin-chlorophyll)(Morris 등, Plant Molecular Biology 24:673:77 (1994)), 시네코코커스(Synechococcus), 예를 들면, 피코에리트린(phycoerythrin) 및 피코시아닌(phycocyanin)과 같은 해양 시아노박테리아로부터의 피코빌리단백질(phycobiliproteins)(Wilbanks 등, J. Biol. Chem. 268:1226-35 (1993)), 등을 포함한다.
일반적으로, 세포독소와 표적화 제제(또는 다른 시약), 및 선택적으로는 스페이서기의 사이에 결합을 형성하기 전에, 적어도 하나의 화학적 기능성기가 활성화될 것이다. 당업자는 하이드록시, 아미노, 및 카르복시기를 포함한, 다양한 화학적 기능성기가 다양한 표준 방법 및 조건을 사용하여 활성화될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 세포독소 또는 표적화 제제의 하이드록실기를 포스겐 처리를 통해 활성화시켜 해당 클로로포르메이트, 또는 p-니트로페닐클로로포르메이트를 형성하고 해당 카르보네이트를 형성할 수 있다.
한 예시적인 구체예에서, 본 발명은 카르복실 기능성기를 포함하는 표적화 제제를 이용한다. 예를 들면, 카르복실기를 해당 아실 할라이드 또는 활성 에스테르로의 전환에 의하여 활성화시킬 수 있다. 이 반응을 상기 March, pp. 388-89에 기술된 바와 같이 다양한 조건하에서 실시할 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, 아실 할라이드를 카르복실-함유기와 옥살일 클로라이드의 반응을 통하여 제조한다. 활성화된 제제를 세포독소 또는 세포독소-링커 가지 조합과 반응시켜 본 발명의 접합체를 형성한다. 카르복실-함유 표적화 제제의 사용은 단순히 예시적이고, 많은 다른 기능성 기들을 갖는 제제를 본 발명의 링커에 접합할 수 있다는 것을 당업자는 알 것이다.
반응성 기능기
기술되는 바를 명확히 하기 위하여, 다음의 논의는 표적화 제제에 본 발명의 세포독소를 접합시키는 것에 초점을 맞춘다. 이 초점은 본 발명의 한 구체예를 예시하고, 다른 것들은 당업자에 의해서 쉽게 추론될 수 있다. 한 구체예의 논의에 초점을 맞춘 것으로 본 발명이 한정되지 않는다.
본 발명의 예시적 화합물은 치환 또는 비치환 알킬 또는 헤테로알킬 사슬에 일반적으로 위치하며, 다른 종에 그것들의 용이한 부착을 허용하는, 반응성 기능기를 포함한다. 상기 반응성기의 편리한 위치는 사슬의 말단 위치이다.
본 발명을 실시하는 데 유용한 반응들의 반응성기 및 반응부류는 일반적으로 생접합 화학의 분야에 잘 알려진 것들이다. 반응성 기능기를 보호하거나 보호하지 않을 수 있으며, 상기 기의 보호된 성질을 유기 합성의 분야에 알려진 방법에 의해 변하게 할 수 있다. 반응성 세포독소 유사체에 유용한 반응들의 현재 선호되는 부류는 비교적 온화한 조건하에서 진행하는 것들이다. 이것들은 친핵성 치환(nucleophilic substitutions)(예, 아실 할라이드, 활성 에스테르를 갖는 아민 및 알코올의 반응), 친전자성 치환(예, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 첨가(예, 마이클 반응(Michael reaction), 디엘스-알더 첨가(Diels-Alder addition))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 및 다른 유용한 반응들은 예를 들면, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 제3판, John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Feeney 등, MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982에서 논의된다.
예시적인 반응 유형은 N-하이록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 카르복실기 및 이의 다양한 유도체들의 반응을 포함한다. 하이드록실기는 에스테르, 에테르, 알데히드, 등등으로 전환될 수 있다. 할로알킬기는, 예를 들면, 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카르바니온 또는 알콕시드 이온과의 반응에 의하여 새로운 종류로 전환될 수 있다. 디에노필(예, 말레이미드)기는 디엘스-알더 반응에 참여한다. 알데히드 또는 케톤 기는 이민, 하이드라존, 세미카르바존 또는 옥심으로, 또는 그리그나드(Grignard) 첨가 또는 알킬리튬 첨가와 같은 메커니즘을 통하여, 전환될 수 있다. 설포닐 할라이드는 아민과 쉽게 반응하여, 예를 들면, 설폰아미드를 형성한다. 아민 또는 설프하이드릴 기는 예를 들면, 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있다. 알켄은, 사이클로첨가, 아실화, 마이클 첨가, 등등을 이용하여 새로운 종류의 배열로 전환될 수 있다. 에폭시드는 아민 및 하이드록실 화합물과 쉽게 반응한다.
당업자는 많은 이러한 연결들을 다양한 방법으로 다양한 조건을 이용하여 생성할 수 있음을 알 것이다. 에스테르의 제조에 대해서, 예를 들면, 상기 March, 1157 참조; 티오에스테르에 대해서, 상기 March, 362-363, 491, 720-722, 829, 941, 및 1172 참조; 카르보네이트에 대해서, 상기 March, 346-347 참조; 카르바메이트에 대해서, 상기 March, 1156-57 참조; 아미드에 대해서, 상기 March 1152 참조; 우레아 및 티오우레아에 대해서, 상기 March 1174 참조; 아세탈 및 케탈에 대해서, 상기 Greene 등 178-210 및 상기 March 1146 참조; 아실옥시알킬 유도체에 대해서, PRODRUGS: TOPICAL AND OCULAR DRUG DELIVERY, K. B. Sloan, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1992 참조; 에놀 에스테르에 대해서, 상기 March 1160 참조; N-설포닐이미데이트에 대해서, Bundgaard 등, J. Med. Chem., 31:2066 (1988) 참조; 안하이드라이드에 대해서, 상기 March 355-56, 636-37, 990-91, 및 1154 참조; N-아실아미드에 대해서, 상기 March 379 참조; N-마니쉬 염기에 대해서, 상기 March 800-02 및 828 참조; 하이드록시메틸 케톤 에스테르에 대해서, Petracek 등, Annals NY Acad. Sci., 507:353-54 (1987) 참조; 디설피드에 대해서, 상기 March 1160 참조; 그리고 및 포스포네이트 에스테르 및 포스폰아미데이트에 대해서 참조.
반응성 기능기들은 반응에 참여하지 않거나 반응을 간섭하지 않도록 비보호되거나 선택될 수 있다. 대안적으로, 보호기의 존재에 의하여 반응성 기능기가 반응에 참여하는 것을 막을 수 있다. 당업자는 특정 기능기가 반응 조건의 선택을 간섭하는 것을 막는 방법을 알 것이다. 유용한 보호기의 예에 대해서, Greene 등, PROTECTIVE FROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991 참조.
전형적으로, 표적화 제제는 표준 화학 기술을 사용하여 그들 각각의 화학적 기능성기들을 통해 세포독소에 공유적으로 연결된다. 임의적으로, 링커 또는 제제는 하나 이상의 스페이서기를 통하여 제제에 결합된다. 스페이서기는 조합으로 사용될 때 등가이거나 다를 수 있다.
일반적으로, 세포독소와 반응성 기능기 사이의 연결이 형성되기 전에, 그리고 임의로, 스페이서기는, 적어도 하나의 화학적 기능성기가 활성화될 것이다. 당업자는 하이드록시, 아미노 및 카르복시 기들을 포함하는, 다양한 화학적 기능성기들이 다양한 표준 방법들 및 조건들을 이용하여 활성화될 수 있다는 것을 알 것이다. 한 예시적인 구체예에서, 본 발명은 반응성 기능기로서 카르복실 기능성기를 포함한다. 카르복실기는 상기에서 기술된 바와 같이 활성화될 수 있다.
접합체의 예
본 발명의 링커는 세포독성 제제로서 두오카르마이신 또는 CBI 유사체를 포함하는 접합체에 사용될 수 있다. 본 발명의 접합체의 예는 하기에 더 자세히 기술된다. 다른 지시가 없으면, 치환기들은 세포독소 및 링커에 관한 부분에서 상술된 바와 같이 정의된다.
적절한 접합체의 한 예는 다음 식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
여기에서
L1은 자기-희생 링커이고;
m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
F는 다음 구조를 포함하는 링커인데:
여기에서
AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
L2는 자기-희생 링커이며;
o는 0 또는 1이고;
L4는 링커 멤버이며;
p는 0 또는 1이고;
X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 멤버이며; 및
D는 다음 구조를 포함한다:
여기에서 상기 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬기이며;
E 및 G는 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택되는 멤버들이거나, 또는 E 및 G는 결합되어 치환 및 비치환 아릴, 치환 및 비치환 헤테로아릴 및 치환 및 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하고;
X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버인데;
R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 아실이고;
R3은 OR11인데,
여기에서 R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 디포스페이트, 트리포스페이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12, 및 SiR12R13R14로 구성되는 군으로부터 선택된 멤버이고,
이 때 R12, R13 및 R14는 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬 및 치환 및 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버이며, 상기 R12 및 R13은 그들이 부착되는 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며;
R4, R4’, R5 및 R5’는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, SO3, SO2R15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, R4, R4’, R5 및 R5’ 중 임의의 인접한 쌍은, 그들이 부착된 탄소 원자와 함께 결합되어 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데;
여기에서
n은 1 내지 20의 정수이고;
R15 및 R16은 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 및 비치환 아릴, 치환 및 비치환 헤테로아릴, 치환 및 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 및 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며;
R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고, 존재하면 R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 및
R7은 R6과 함께 상기 사이클로프로필 고리 내에서 결합된 CH2-X1 또는 -CH2- 인데, 여기에서
X1은 이탈기이며,
여기에서 R4, R4’, R5, R5’, R11, R12, R13, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 상기 약물을, 존재하면 L1에, 또는 F에 연결시킨다.
다른 구체예는 다음 식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
여기에서
L1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬 기이고;
m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
L2는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이며;
L3은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬이고;
o는 0 또는 1이며;
L4는 링커 멤버이고;
p는 0 또는 1이며;
X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 멤버이고; 및
D는 다음 구조를 포함한다:
여기에서 상기 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬이며;
E 및 G는 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 및 단일 결합으로부터 독립적으로 선택되는 멤버들이거나, 또는 E 및 G는 결합되어 치환 및 비치환 아릴, 치환 및 비치환 헤테로아릴 및 치환 및 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하고;
X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버인데;
R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 아실이고;
R3은 OR11인데,
여기에서 R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 디포스페이트, 트리포스페이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12, 또는 SiR12R13R14이고,
이 때 R12, R13 및 R14는 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬 및 치환 및 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버이며, 상기 R12 및 R13은 그들이 부착되는 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하고;
R4, R4 ’, R5 및 R5 ’는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, SO3, SO2R15, NR15R16, NR16(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, R4, R4’, R5 및 R5’ 중 임의의 인접한 쌍은, 그들이 부착된 탄소 원자와 함께 결합되어 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데;
여기에서
n은 1 내지 20의 정수이고;
R15 및 R16은 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬, 치환 및 비치환 아릴, 치환 및 비치환 헤테로아릴, 치환 및 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 및 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며;
R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고, 존재하면 R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 및
R7은 R6과 함께 상기 사이클로프로필 고리 내에서 결합된 CH2-X1 또는 -CH2- 인데, 여기에서
X1은 이탈기이며,
여기에서 R4, R4’, R5, R5’, R11, R12, R13, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 D를 상기 화합물의 잔여 부분에 연결한다.
접합체로서 사용되기에 적합한 화합물의 특정한 예는 다음을 포함한다:
여기에서 X1은 Cl 또는 Br이다. 바람직한 구체예에서, X1은 Cl이다.
약제학적 제형 및 투여
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형(formulation)을 제공한다.
이의 부가염 또는 수화물과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 본 명세서에 기술된 화합물은 매우 다양한 투여의 경로 또는 방식을 이용하여 환자에 전달될 수 있다. 적절한 투여의 경로는, 흡입, 경피, 경구, 직장, 경점막, 장내 및 근육내, 피하 및 정맥내 주사를 포함하는 비경구 투여를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 본 발명의 접합체는 비경구, 더욱 바람직하게는 정맥내 투여될 수 있다.
본 명세서에서 이용된, 용어 “투여하는” 또는 “투여”는 그의 의도된 작용 자리에 직접적으로 및 간접적으로 화합물을 전달하는 모든 수단을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 기술된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및/또는 수화물은, 단독으로, 본 발명의 다른 화합물과 조합으로 및/또는 다른 치료적 제제와 조합된 칵테일로 투여될 수 있다. 물론, 본 발명의 화합물과 공동-투여될 수 있는 치료적 제제의 선택은, 부분적으로는, 치료될 상태에 달려있다.
예를 들면, 본 발명의 화합물은, 자기 유도자(autoinducer)에 의존하는 기관에 의해 야기된 질병 상태로 고생하는 환자에 투여될 때, 통증, 감염 및 기타 증상 및 질병과 일반적으로 관련된 부작용을 치료하기 위해서 사용되는 제제를 포함하는 칵테일(cocktails)로 투여될 수 있다. 그러한 제제는, 예컨대, 진통제, 항생제 등을 포함한다.
상기 화합물은 암 치료를 하는 환자에 투여할 때는, 본 화합물은 항암제 및/또는 보충적 강화 제제를 포함하는 칵테일로 투여될 수 있다. 또한 상기 화합물은 항-구토제, 방사선 보호제 등과 같은, 방사선 치료의 부작용을 치료하는 제제를 포함하는 칵테일로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물과 함께 공동-투여될 수 있는 보충적인 강화 제제는, 예컨대, 트리사이클릭 항-진정제 약물(예컨대, 이미프라민, 데시프라민, 아미트리프틸린, 클로미프라민, 트리미프라민, 독세핀, 노르트리프틸린, 프로트리프틸린, 아목사핀 및 마프로틸린); 비-트리사이클릭 및 항-진정제 약물(예컨대, 세르트랄린, 트라조돈 및 시탈로프람); Ca+2 길항제(예컨대, 베라파밀, 니페디핀, 니트렌디핀 및 카로베린); 암포테리신; 트리파라놀 유사체(예컨대, 타목시펜); 항부정맥 약물(예컨대, 퀴니딘); 항고혈압 약물(예컨대, 레세르핀); 티올 소모제(예컨대, 부티오닌 및 설폭시민); 및 칼슘 류코보린을 포함한다.
본 발명의 활성 화합물(들)은 그 자체로 또는 약제학적 조성물의 형태로 투여되는데, 여기에서 상기 활성 화합물(들)은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합되어 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은, 상기 활성 화합물을 약제학적으로 사용될 수 있는 조제물로 가공하는 것을 용이하게 하는, 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 통상적인 방식으로 전형적으로 제형화된다. 적절한 제형은 선택된 투여의 경로에 의존한다.
경점막 투여에 있어서, 투과될 벽에 적절한 침투제가 상기 제형에 사용된다. 그러한 침투제는 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려져 있다.
경구 투여에 있어서, 상기 활성 화합물(들)을 당해 기술 분야에 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체와 결합시킴으로써 상기 화합물을 제형화할 수 있다. 그러한 담체는 본 발명의 화합물이, 치료받을 환자에 의한 경구 섭취를 위하여, 정제, 알약, 당의정(dragees), 캡슐, 액상, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화되는 것을 가능하게 한다. 경구용 약제학적 조제물은 고형의 부형제에 적절한 보조제를 첨가한 후, 결과의 혼합물을 선택적으로 분쇄하고 그 과립의 혼합물을 가공함으로써 얻어질 수 있는데, 필요에 따라 정제 또는 당의정 코어(dragee core)를 얻을 수 있다. 적절한 부형제는, 특히, 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 솔비톨을 포함하는 당류와 같은 충진제; 예를 들면, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스 고무, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카르복시니에틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 셀룰로오스 조제물이다. 필요에 따라, 상호-연결된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 혹은 알긴산 나트륨과 같은 이의 염과 같은, 분해제가 첨가될 수 있다.
적당한 코팅을 갖는 당의정 코어가 제공된다. 이 목적을 위해서, 농축 당 용액이 사용될 수 있는데, 이것은 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적절한 유기 용매 혹은 용매 혼합물을 선택적으로 포함할 수 있다. 염료 또는 색소가 활성 화합물 투여량의 서로 다른 조합을 확인하기 위해서 또는 특징짓기 위하여 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는, 약제학적 조제물은 젤라틴으로 형성된 푸시-핏(push-fit) 캡슐은 물론, 젤라틴 및 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 형성된 연질의 밀폐된 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 그리고 선택적으로 안정화제와의 혼합물 내에서 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물이 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 덧붙여, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여용의 모든 제형은 그러한 투여에 적절한 투여량이어야 한다.
구강 투여를 위하여, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠게의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위하여, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적절한 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체를 사용하여 가압 팩 또는 네뷸라이저(nebulizer)로부터 에어로솔 스프레이 외양의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로솔의 경우에, 투여 단위는 측정된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입 또는 취입에 사용하기 위한, 예컨대, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 상기 화합물과 락토오스 또는 전분과 같은 적절한 분말베이스의 분말 혼합물을 포함하여 제형화될 수 있다.
상기 화합물은 주사, 예컨대, 볼러스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 주사는 본 발명의 조성물의 바람직한 투여 방법이다. 주사용 제형은, 첨가된 보존제와 함께, 단위 투여량 형태, 예컨대, 앰플 내에 또는 다중-투여(multi-dose) 용기 내에 나타낼 수 있다. 상기 조성물은 유성 혹은 수성 비이클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형성 제제(formulatory agents)를 포함할 수 있고, 가교-연결된(cross-lonked) 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알기닌산 혹은 알긴산 나트륨과 같은 이의 염이 첨가될 수 있다.
비경구 투여를 위한 약제학적 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 부가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친유성(lipophilic) 용매 또는 비이클은 참기름과 같은 지방성 오일 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨, 또는 덱스트란과 같은, 현탁액의 점도를 증진시키는, 기질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 현탁액은 적절한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액을 제조하게 하기 위하여 화합물의 용해성을 증가시키는 제제도 포함할 수 있다. 주사를 위하여, 본 발명의 제제는 수성 용액, 바람직하게는 한크스 용액(Hanks's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 생리학적 염수 버퍼와 같은 생리학적으로 양립가능한 버퍼로 제형화될 수 있다.
대안적으로, 상기 활성 성분은, 사용 전에, 적절한 비이클, 예컨대, 살균성 발열물질 비함유 물(sterile pyrogen-free water)과의 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
본 화합물은 또한, 예컨대, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기제를 포함하는, 좌약 또는 정체성 관장제와 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
상술된 제형에 부가하여, 상기 화합물은 또한 저장 조제물로서 제형화될 수 있다. 그러한 장기 활성 제형은 주입 또는 경피성 전달(예컨대, 피하 또는 근육내), 근육내 주사 또는 경피 팻치에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 화합물은 적절한 폴리머 또는 소수성 물질(예컨대, 허용가능한 오일 내의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체, 예를 들면, 난용성 염과 함께 제형화될 수 있다
약제학적 조성물은 또한 적절한 고형물 또는 겔 상의 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 그러한 담체 또는 부형제의 예는 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 여러 당류, 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 약제학적 조성물은 정맥내 주사와 같은 주사용으로 제형화된 조성물이고, 총 약제학적 조성물의 100중량%를 기준으로, 약물 접합체 약 0.01중량% 내지 약 100중량%를 포함한다. 상기 약물 접합체는 항체가 특정 암을 표적화하기 위해 선택되는 항체-세포독소 접합체일 수 있다.
라이브러리
또한 세포독소, 세포독소-링커 및 본 발명의 세포독소 및 링커의 제제-링커 접합체의 라이브러리가 본 발명의 범위내에 속한다. 예시적인 라이브러리는 적어도 10개의 화합물, 더 바람직하게는 적어도 100개의 화합물, 더욱 바람직하게는 적어도 1000개의 화합물 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 100,000개의 화합물을 포함한다. 라이브러리는 특정 성질, 예컨대, 세포독성, 효소 또는 다른 분리 시약에 의한 링커의 분리에 대하여 쉽게 조회하는(query) 형태이다. 예시적인 형태는 칩 형, 마이크로어레이(microarrays) 등을 포함한다.
병행 또는 조합, 합성은 본 설명을 통해 스캐폴드(scaffold)로 지칭되는, 공통적인 특징을 모두 공유하는 다양한 분자들의 라이브러리를 생성하는 것을 그 일차적인 목적으로 가진다. 스캐폴드 분자의 각 가변 부분에서 상이한 부분들을 치환함으로써, 라이브러리 내의 검색가능 영역의 양이 많아진다. 이론 및 현대 의약 화학은 주어진 생물학적 표적에 대해 주어진 화합물의 효능을 결정하는 데 있어서 주요한 요인으로 점유 영역의 개념을 주장한다. 큰 비율의 표적화된 영역을 검색하는, 분자들의 다양한 라이브러리를 생성함으로써, 고도로 효능있는 주도 화합물의 개발 수가 극적으로 증가한다.
병행 합성은 일반적으로 폴리머 수지와 같은, 고체상 지지체 상에서 수행된다. 스캐폴드 또는 다른 적절한 중간체가 화학적 링커에 의하여 수지에 분리가능하게 구속된다. 상기 입자에 구속되어 있는 동안 반응이 실시되어 스캐폴드를 변형한다. 시약 및/또는 반응 조건에서의 변수는 구조적 다양성을 만드는데, 이는 각 라이브러리의 특징이다.
“소” 분자(200-1000의 분자량을 갖는 비-올리고머)의 병행 합성은 1990년 이전에는 드물게 시도되었다. 예를 들어, Camps. 등, Annaks de Quimica, 70: 848 (1990)을 참조. 최근에, Ellmann은 프로스타글란딘 및 베타-턴 모방체를 사용한 11개의 벤조디아제핀 유사체의 고체 상-지지 병행(“조합”으로도 지칭됨) 합성을 공지하였다. 이 공지는 미국 특허 번호 제 5,288,514호에 예시되어 있다. 소 분자의 병행 합성에 대한 다른 관련 공지는 미국 특허 번호 제 5,324,483호에서 찾을 수 있다. 이 특허는 16개의 상이한 스캐폴드 각각에서 4 내지 40개 화합물의 병행 합성을 공지한다. 또한 Chen 등은 유기 합성 전략을 적용하여 폴리머 지지체 상에서 다중-단계 공정을 이용하여 합성된 비-펩티드 라이브러리를 개발하였다(Chen 등, J. Am. Chem. Soc., 116: 2661-2662 (1994)).
일단 특정 화합물의 라이브러리가 제조되면, 자기유도체의 라이브러리를 출발점으로 사용하고 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 면역접합체 또는 항체의 라이브러리의 제조물을 제조할 수 있다.
키트
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 포함하는 키트와 상기 화합물 또는 조성물의 사용에 대한 지침을 제공한다. 한 예시적인 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 링커를 다른 분자에 접합시키는 키트를 제공한다. 상기 키트는 링커 및 특정 기능기에 링커를 부착시키기 위한 지침을 포함한다. 또한, 또는 대안적으로, 상기 키트는 하나 이상의 세포독성 약물, 표적화 제제, 검출가능한 표지 및 약제학적 염 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 용기를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 유리병(vial), 테스트 튜브, 플라스크, 병(bottle) 또는 주사기를 포함할 수 있다. 키트의 다른 형태는 당업자에게 자명할 것이며 본 발명의 범위 내에 속한다.
정제
다른 예시적인 구체예에서, 본 발명은 리간드 X4에 결합하는, 본 발명의 리간드-세포독소에서 분자 표적을 분리하는 방법을 제공한다. 이 방법은 바람직하게는, 표적을 포함하는 세포 제조물을 고정화 화합물에 접촉시키고, 그렇게 함으로써 수용체와 고정화 화합물 사이에 복합체를 형성하는 것을 포함한다.
본 발명의 세포독소는 임의의 기술-인식된 수단에 의하여 친화성 지지체 상에 고정될 수 있다. 대안적으로, 세포독소는 하나 이상의 본 발명의 링커를 사용하여 고정될 수 있다.
또 다른 예시적인 구체예에서, 본 발명은 친화성 정제 매트릭스를 제공한다.
표적을 분리하는 본 발명의 방법은 전형적으로 하나 이상의 친화성 크로마토그래피 기술을 사용할 것이다. 친화성 크로마토그래피는 생물학적 분자 또는 생고분자와 같은 종류의 효율적 분리를 가능하게 하는데, 이는 높은 정도의 선택성으로 소정의 지지된 화학적 구조에 대한 그것들의 인식 자리를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 문헌으로, 친화성 크로마토그래피 지지체, 가교연결 멤버, 리간드 및 그것들의 제조 및 사용과 같은 주제를 포함하여, 친화성 크로마토그래피의 주제에 대한 기사, 논문 및 책이 많다. 그러한 문헌들의 예는 다음을 포함한다: Ostrove, Methods Enzymol. 182: 357-71 (1990); Ferment, Bioeng. 70: 199-209 (1990). Huang 등, J. Chromatogr. 492: 431-69 (1989); “Purification of enzymes by heparin-Sepharose affinity chromatography”, J. Chromatogr., 184: 335-45 (1980); Farooqi, Enzyme Eng., 4: 441-2 (1978); Nishikawa, Chem. Technol., 5(9): 564-71 (1975); Guilford 등, in, PRACT. HIGH PERFORM. LIQ. CHROMATOGR., Simpson (ed.), 193-206 (1976); Nishikawa, Proc. Int. Workshop Technol. Protein Sep. Improv. Blood Plasma Fractionation, Sandberg (ed.), 422-35; (1977) “Affinity chromatography of enzymes”, Affinity Chromatogr., Proc. Int. Symp. 25-38, (1977) (1978 출판); 및 AFFINITY CHROMATOGRAPHY: A PRACTICAL APPROACH, Dean 등 (ed.), IRL Press Limited, Oxford, England (1985). 당업자는 본 발명의 물질을 사용하는 특정 친화성 크로파토그래피 방법을 발달시키는데 있어서 많은 지침을 가지고 있다.
본 방법에서, 다양한 화학적 구조의 친화성 크로마토그래피 매체가 지지체로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로스 겔 및 가교-연결된 아가로스 겔은 지지체 물질로서 유용한데, 이는 그것들의 친수성이 그것들을 비특이적 결합이 상대적으로 없게 만들기 때문이다. 다른 유용한 지지체는, 예를 들면, 조절-기공 유리(CPG) 비즈, 셀룰로오스 입자, 폴리아크릴아미드 겔 비즈 및 덱스트란과 에피클로로히드린으로 만들어진 Sephadex™ 겔 비즈를 포함한다.
약물 접합체 사용 방법
상술된 조성물 및 구성체에 부가하여, 본 발명은 또한 본 발명의 화합물 및 접합체를 사용하여 실행될 수 있는 많은 방법을 제공한다. 본 발명의 약물-리간드 접합체를 이용하는 방법은 다음을 포함한다: 종양 세포 또는 암 세포를 살해하거나 종양 세포 또는 암 세포의 성장 또는 복제를 억제하는 것, 암을 치료하는 것, 전-암 상태를 치료하는 것, 자가면역 항체를 발현하는 세포를 살해하거나 자가면역 항체를 발현하는 세포의 성장 또는 복제를 억제하는 것, 자가면역 질환을 치료하는 것, 전염성 질환을 치료하는 것, 종양 세포 또는 암 세포의 증식을 방지하는 것, 암을 예방하는 것, 자가면역 항체를 발현하는 세포의 증식을 방지하는 것, 자가면역 질환을 예방하는 것, 및 감염성 질환을 예방하는 것. 이러한 사용 방법은 이것이 필요한 포유류와 같은 동물 또는 인간에 유효한 양의 약물-리간드 접합체를 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 효소는 별도로 투여되어 종양 또는 표적 세포와 회합하게 된다.
본 발명의 약물-리간드 접합체 복합체는, 예를 들어, 동물에서의 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환을 치료하는 데 유용하다. 약제학적으로 허용가능한 방식으로 조성물을 대상체에 공급함으로써 종양을 치료하는 조성물 및 방법은, 본 발명의 약제학적으로 유효한 양의 조성물과 함께 제공된다.
본 발명은 동물에 있어서 암을 치료하고 종양 세포 또는 암 세포의 증식을 억제하는데 특히 유용하다. 암 또는 전암 상태는 종양, 전이, 또는 비조절 세포 성장으로 특징지워지는 임의의 질환 또는 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 본 발명의 약물-리간드 복합체를 투여함으로 치료하거나 예방될 수 있다. 상기 복합체는 약물을 종양 세포 또는 암 세포에 전달한다.
약물-리간드 복합체를 사용하는 한 구체예에서, 리간드는 종양-세포 또는 암-세포-관련 항원에 특이적으로 결합 또는 회합한다. 그것이 리간드에 매우 근접하여 있기 때문에, 약물은 예를 들면, 수용체-매개 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 종양 세포 또는 암세포 내로 흡수될 수 있다. 항원은 종양세포 또는 암세포에 부착될 수 있거나 또는 종양 세포 또는 암세포와 회합된 세포외 매트릭스 단백질일 수 있다. 일단 세포 내에서, 링커는 종양-세포 또는 암-세포-관련 프로테아제에 의하여 분해되어 약물을 방출한다. 그리고 나서 방출된 약물은 유리되어 확산되고 세포독성 활성을 유도한다. 한 대안적인 구체예에서, 약물은 종양 세포 또는 암 세포 외부에서 약물-리간드 복합체로부터 분리되고, 이어서 약물은 세포를 통과한다.
리간드는 예를 들면, 종양 세포 또는 암 세포, 종양 세포 또는 암 세포의 표면에 있는 종양 세포 또는 암 세포 항원, 또는 종양 세포 또는 암세포와 회합된 세포외 매트릭스 단백질인 종양 세포 또는 암 세포 항원에 결합할 수 있다. 리간드는 특정 종양 세포 또는 암 세포 유형에 대하여 특이적으로 고안될 수 있다. 따라서, 효과적으로 치료될 수 있는 종양 또는 암의 유형은 리간드의 선택에 의해서 변경될 수 있다.
접합체에 의하여 표적화될 수 있는 전암 상태의 대표적인 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 화생(metaplasia), 과형성(hyperplasia), 형성장애(dysplasia), 결장 폴립(colorectal polyps), 광선각화증(actinic ketatosis), 광선입술염(actinic cheilitis), 인간 유두종 바이러스(human papillomaviruses), 백반증(leukoplakia), 편평태선(lychen planus) 및 보웬 병(Bowen's disease).
접합체에 의하여 표적될 수 있는 암 또는 종양의 대표적인 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 폐암, 결장암, 전립선암, 림프종, 흑색종, 유방암, 난소암, 고환암, CNS암, 신장암, 콩팥암(kidney cancer), 췌장암, 위암, 구강암, 비암, 경부암 및 백혈병. 접합체에 사용되는 특정 리간드 또는 분리가능한 기질이 약물로 치료될 종양 조직에 그 약물을 표적화시키도록 선택될 수 있다는 것은 당업자에게는 분명히 자명하다.
한 구체예에서, 본 발명은 세포를 살해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 살해하기에 충분한 양의 본 발명의 화합물을 세포에 투여하는 것을 포함한다. 한 예시적인 구체예에서, 본 화합물은 이 세포를 지닌 대상체에 투여된다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 투여는 세포(예컨대, 세포는 종양 세포일 수 있음)를 포함하는 종양의 성장을 지연시키거나 정지시킨다. 성장을 지연시키기 위한 투여에서, 세포의 성장 비율은 투여전의 성장 비율보다 적어도 10% 적어야 한다. 바람직하게는, 성장 비율이 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%로 지연되거나 완전히 정지될 것이다.
효과적인 투여량
본 발명에 사용하기에 적절한 약제학적 조성물은 활성 성분이 치료학적으로 유효한 양, 즉 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 들어 있는 조성물을 포함한다. 특정 적용에 효과적인 실제 양은 특히 치료되고 있는 상태에 따라 다르다. 효과적인 양을 결정하는 것은, 특히 본 명세서에서 공지된 상세한 설명의 견지에 비추어, 당업자의 능력 범위 내에 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 화합물에 대해서, 치료학적으로 효과적인 양은 세포 배양 분석으로부터 처음에 결정될 수 있다. 표적 혈장 농도는 세포 성장 또는 분열을 억제할 수 있는 활성 화합물(들)의 농도일 것이다. 바람직한 구체예에서, 세포 활성은 적어도 25% 억제된다. 적어도 약 50%, 75%, 또는 90% 또는 더 높게 세포 활성의 억제를 유도할 수 있는 활성 화합물(들)의 표적 혈장 농도가 현재 바람직하다. 수득한 혈장 약물 농도의 적절성을 평가하기 위하여 환자 내의 세포 활성의 억제 백분율을 모니터할 수 있으며, 원하는 억제의 백분율을 얻기 위하여 투여량을 위로 또는 아래로 조절할 수 있다.
당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 인간에 사용하기에 치료학적으로 효과적인 양은 또한 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들면, 인간에 대한 투여량이 동물에서 효과적인 것으로 밝혀진 순환 농도를 얻도록 제형화될 수 있다. 상술된 바와 같이, 인간에서의 투여량은 세포 억제를 모니터하고 투여량을 위로 또는 아래로 조정함으로 조절될 수 있다.
또한 치료학적으로 효과적인 투여량은 유사한 약물학적 활성을 나타내는 것으로 알려진 화합물에 대한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용된 투여량은 공지된 화합물과 비교하여 투여된 화합물의 상대적인 생물학적 이용가능성 및 효능을 기반으로 조절될 수 있다.
상술된 방법들 및 당해 기술 분야에 잘 알려진 다른 방법들을 기반으로 인간에서 최대 효능을 얻기 위한 투여량을 조절하는 것은 당업자의 능력 범위내에 있다.
국부적 투여의 경우에 있어서, 투여된 화합물의 전신 순환 농도는 특별히 중요하지 않다. 그러한 경우에, 의도된 결과를 달성하는데 효과적인 국부 지역에서의 농도를 얻기 위하여 상기 화합물을 투여한다.
프로피락시스(prophylaxis)에서의 사용 및/또는 비정상 세포 증식과 관련된 질병의 치료에서, 약 0.001 μM 내지 20 μM의 화합물의 농도를 순회하여 투여하는 것이 바람직한데, 약 0.01 μM 내지 5 μM이 바람직하다.
본 명세서에 설명된 화합물의 구강 투여에 관한 환자 투여량은, 전형적으로 약 1 mg/일 내지 약 10,000 mg/일, 더 전형적으로 약 10 mg/일 내지 약 1,000 mg/일, 그리고 가장 전형적으로 약 50 mg/일 내지 약 500 mg/일의 범위를 가진다. 환자 체중의 견지에서 언급했듯이, 전형적인 투여량은 약 0.01 내지 약 150 mg/kg/일, 더욱 전형적으로 약 0.1 내지 약 15 mg/kg/일, 가장 전형적으로 약 1 내지 약 10 mg/kg/일의 범위를 가지며, 예를 들면 5 mg/kg/일 또는 3 mg/kg/일이다.
적어도 어떤 구체예에서, 종양 성장을 지연시키거나 억제하는 환자 투여량은 1 μmol/kg/일 이하일 수 있다. 예를 들어, 환자 투여량은, 항체-약물 접합체와 같은, 약물 또는 약물 접합체의 0.9, 0.6, 0.5, 0.45, 0.3, 0.2, 0.15, 0.1, 0.05, 0.03, 0.01 또는 0.005 μmol/kg/일 이하(약물의 mole을 지칭함)일 수 있다. 바람직하게, 약물 또는 약물 접합체는 매일 투여량으로 적어도 5일의 기간동안 투여될 때 종양의 성장을 억제한다. 적어도 어떤 구체예에, 종양은 SCID 마우스에서의 인간-유형 종양이다. 예로써, SCID 마우스는 CB17.SCID 마우스(Taconic, Germantown, NY로부터 입수가능)일 수 있다.
다른 방식의 투여에 대해서, 투여의 양 및 간격을 개별적으로 조절하여 치료될 특정 임상적 징후에 효과적인 투여 화합물의 혈장 수준을 제공할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 화합물은 비교적으로 높은 농도로 하루에 여러번 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 화합물을 최소 유효 농도로 투여하고 적은 횟수의 투여 요법을 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 이것은 개개의 질환의 중증도에 맞는 치료 요법을 제공할 것이다.
본 명세서에 제공된 기술들을 사용하여, 실질적인 독성을 일으키지 않으나 특정 환자에 의해 나타나는 임상적 증상들을 치료하는데 매우 효과적인 치료학적 치료 요법을 계획할 수 있다. 이 계획은 화합물 효능, 상대적인 생물학적 이용가능성, 환자 체중, 해로운 부작용의 존재 및 중증도, 바람직한 투여 방식 및 선택된 제제의 독성 프로파일과 같은 인자들을 고려하여 활성 화합물을 신중하게 선택하는 것을 포함하여야 한다.
본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 하기의 실시예들에 의하여 더 설명될 것이다. 이 실시예들은 설명을 위해 제공되며 본 발명을 제한하지 않는다.
본 발명의 비-제한적이고 비-배제적인 구체예가 다음 도면을 참고로하여 기술되어 있다. 도면에서, 달리 특정되지 않으면 같은 참조 번호는 다양한 도면을 걸쳐 같은 부분을 지칭한다.
본 발명을 더 잘 이해하기 위하여, 첨부된 도면과 관련하여 읽게 될 참고는 이어지는 상세한 설명을 위하여 만들어질 것이며, 여기에서:
도 1-9는 각각 생체내 연구에서 평균 종양 부피, 중간 종양 부피 및 중간 % 체중 변화 대 투여 후 일 수의 그래프들이다.
재료 및 방법
하기 실시예에서, 달리 언급하지 않으면, 온도는 섭씨(℃)로 주어지고; 작업을 실온 또는 주위 온도(전형적으로 약 18-25℃의 범위)에서 실시하며; 용매의 증발을 60℃ 까지의 조(bath) 온도로 감압 하에서(전형적으로, 4.5-30 mmHg) 회전 증발기를 사용하여 실시하고; 반응의 과정들에 이어서 전형적으로 TLC를 행하고 반응 시간들은 단지 설명을 위해서 제공되며; 융점은 정확하지 않고; 생성물은 만족스러운 1H-NMR 및/또는 미량분석 데이터를 나타냈으며; 수율은 단지 설명을 위하여 제공되고; 다음의 통상적인 약어들도 사용하였다: mp(융점), L(리터(들)), mL(밀리리터), mmol(밀리몰), g(그램), mg(밀리그램), min(분), LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광분석) 및 h(시간).
1H-NMR 스펙트럼을 베리안 머큐리(Varian Mercury) 300 MHz 분광기로 측정하였고 지정된 구조와 일치하였다. 화학적 변화를 테트라메틸실란으로부터 ppm(parts per million) 다운필드(downfield)로 기록하였다. 전자분무 질량 스펙트럼은 퍼킨 엘머 사이엑(Perkin Elmer Sciex) API 365 질량 분광기로 기록하였다. 원소 분석을 Robertson Microlit Laboratories, Madison, NJ에 의하여 실시하였다. 플래시 크로마토그래피용 실리카 겔은 머크 등급(E. Merck grade)(230-400 메쉬)이었다. 역-상 분석(Reverse-Phase analytical) HPLC를 HP 1100 또는 Penomenex Luna 5 μm C-18(2) 150 mm x 4.6 mm 컬럼 또는 Varian Microsorb-MV 0.1 μm C- 18 150 mm x 4.6 mm컬럼을 갖는 Varian ProStar 210 장비로 실시하였다. 1 mL/분의 유속으로 0% - 50% 농도구배의 버퍼 B는 15분에 걸쳐서 또는 10% - 100% 농도구배의 버퍼 B는 10분에 걸쳐서 254nm에서 UV로 검사하였다. 버퍼 A, 20 mM 암모늄 포메이트 + 20% 아세토니트릴 또는 아세토니트릴내의 0.1% 트리플루오로아세트산; 버퍼 B, 20 mM 암모늄 포메이트 + 80% 아세토니트릴 또는 0.1% 수성 트리플루오로아세트산. 역상(Reverse phase preparative) HPLC는 Waters Delta Pak 15 μm C- 18 300 mm x 7.8 mm 컬럼을 갖는 Varian ProStar 215 장비에서 실시하였다.
실시예 1
화합물
1
의 합성
DMF(50 mL) 내의 2-브로모에틸아민 브로마이드(5 g, 24.4 mmole)의 용액에 디이소프로필에틸아민(8.5 mL, 48.8 mmole) 및 벤질 클로로포메이트(3.48 mL, 24.4 mmole)를 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 농축하였고 잔여물을 구배로서 에틸 아세테이트/헥산(3/7)을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 오일로서 화합물 1(4 g, 64%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 3.54 (bs, 2H), 3.61 (bs, 2H), 5.12 (s, 2H), 7.36 (m, 5H).
화합물
2
의 합성
DMF(50 mL) 내의 화합물 1(3.34 g, 12.99 mmole) 및 발린 터트(tert)-부틸 에스테르(3.27 g, 15.59 mmole)의 용액에 탄산 칼륨(5.39 g, 38.97 mmole) 및 요오드화 칼륨(2.59 g, 15.59 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 100℃ 에서 밤새 교반하였다. 이 반응 혼합물을 농축하였고 잔여물을 구배로서 에틸 아세테이트/헥산(2/8)을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 오일로서 화합물 2(3.12 g, 69%)를 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 0.92 (m, 6H), 1.46 (s, 9H), 1.86 (m, 1H), 2.53 (m, 1H), 2.80 (m, 2H), 3.18 (m, 1H), 3.31 (m, 1H), 5.10 (s, 2H), 5.25 (bs, 1H), 7.36 (m, 5H); LC-MS (ESI) 296 (M+H-tbutyl+), 352 (M+H+).
화합물
3
의 합성
메탄올(30 mL) 내의 화합물 2(3.4 g, 9.72 mmole) 및 활성탄(charcoal)(200 mg) 상의 팔라듐의 용액을 수소 대기압하에서 실온에 두었다. 이렇게 해서 얻은 혼 합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 팔라듐을 여과하였고 이 반응 혼합물을 건조 상태로 농축시켜 오일로서 화합물 3(2.1 g, 98%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 0.94 (m, 6H), 1.47 (s, 9H), 1.63 (bs, 2H), 1.90 (m, 1H), 2.47 (m, 1H), 2.73 (m, 2H).
화합물
4
의 합성
디클로로메탄(30 mL) 내의 화합물 3(2.1 g, 9.72 mmole)의 용액에 FmocOSu(N-(9-플루오르에닐메톡시카르보닐옥시)숙신이미드)(3.28 g, 9.72 mmole)를 0℃ 에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 건조 상태로 농축하였고 그리고 나서 잔여물을 구배로서 100% 디클로로메탄, 이어서 디클로로메탄 내의 0.5% 메탄올 및 마지막으로 디클로로메탄 내의 1% 메탄올을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 무색 오일로서 화합물 4(2.55 g, 60%)를 수득하였다. 1H-NMR (CDCl3) δ 1.03 (d, 3H), 1.14 (d, 3H), 1.52 (s, 9H), 2.28 (m, 1H), 3.14 (m, 2H), 3.46 (m , 2H), 3.89 (d, 1H), 4.24 (m, 1H), 4.44 (m, 2H), 7.29 (m, 2H), 7.40 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.80 (d, 2H); LC-MS (ESI) 383 (M+H-tbutyl+), 440 (M+H+), 462 (M+Na+), 478 (M+K+).
화합물
5
의 합성
테트라하이드로퓨란-물(3/1, 8 mL) 내의 화합물 4(177 mg, 0.4 mmole)의 용액에 HCl 가스를 사용하여 5분 동안 거품이 일게 하였다. 이 반응 혼합물을 37℃에서 밤새 교반하고 나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 고체로서 화합물 5(168 mg, 98%)를 생산하였는데 이것은 더 정제되지 않고 다음 단계에서 사용되었다. 1H-NMR (CDCl3) δ 1.04 (d, 3H), 1.14 (d, 3H), 2.32 (m, 1H), 3.18 (m, 2H), 3.46 (m , 2H), 3.95 (d, 1H), 4.22 (m, 1H), 4.42 (m, 2H), 7.29 (m, 2H), 7.39 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.79 (d, 2H); LC-MS (ESI) 383 (M+H+), 405 (M+Na+).
화합물
6
의 합성
THF(15 mL) 내의 N-메틸-1,2-페닐렌디아민(2 ml, 17.6 mmole)의 용액에 디-터트-부틸디카르보네이트(3.32 g, 15.2 mmole)를 첨가하였다. 이렇게 하여 얻은 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고 잔여물을 구배로서 헥산 내의 30% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 무색 오일로서 화합물 6(1.12 g, 32%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.46 (bs, 9H), 3.15 (s, 3H), 3.73 (bs, 2H), 6.75 (d, 2H), 7.06 (m, 2H).
화합물
7
의 합성
디클로로메탄(30 mL) 내의 화합물 6(777 mg, 3.05 mmole)의 용액에 2-니트로벤젠설포닐 클로라이드(811 mg, 3.66 mmole) 및 디이소프로필에틸아민(796 μL, 4.57 mmole)을 0℃에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고 잔여물을 구배로서 헥산 내의 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 황색 고체로서 화합물 7(1.17 g, 94%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 1.49 (bs, 9H), 2.47 및 2.61 (2bs, 3H), 7.05 (bd, 1H), 7.27 (m, 2H), 7.56-7.92 (m, 5H).
화합물
8
의 합성
DMF(5 mL) 내의 화합물 7(326 mg, 0.8 mmole)의 용액에 탄산 칼륨(164 mg, 1.19 mmole) 및 요오드화 메틸(148 μL, 2.39 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고 잔여물을 구배로서 헥산 내의 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 황색 고체로서 화합물 8(370 mg, 65%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.35 및 1.52 (2s, 9H), 3.16 및 3.21 (2s, 3H), 3.26 및 3.29 (2s, 3H), 6.93 (d, 1H), 7.20 (m, 1H), 7.6 (m, 2H), 7.68-7.80 (m, 4H); LC-MS (ESI) 444 (M+Na+), 460 (M+K+).
화합물
9
의 합성
디클로로메탄(5 mL) 내의 화합물 8의 용액에 트리플루오로아세트산(5 mL)을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분동안 교반하였고, 그리고 나서, 에틸 아세테이트(100 mL) 및 포화 소듐 암모늄 비카르보네이트(200 mL) 사이에서 나누었다. 유기층을 식염수(100 mL)로 세정하고, Na2SO4로 건조시키며, 농축시켜 백색 고체로서 유리 아민(화합물 9)(270 mg, 98%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 2.68 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 6.56 (m, 2H), 6.88 (m, 1H), 7.20 (m, 1H), 7.48 (m, 1H), 7.57 (m, 1H), 7.65 (m, 2H).
화합물
10
의 합성
디클로로메탄(10 mL) 내의 화합물 9(270 mg, 0.84 mmole)의 용액에 톨루엔(440 μL, 2.5 mmole) 내의 2N 포스겐을 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 30분 동안 교반하고 건조 상태로 농축하여 백색 고체로서 화합물 10(297, 92%)을 수득하였는데, 이것은 더 정제되지 않고 다음 단계에서 사용되었다. 1H NMR (CDCl3) δ 3.25 및 3.30 (2s, 3H), 3.34 및 3.44 (2s, 3H), 6.98 (m, 1H), 7.25-7.40 (m, 2H), 7.45 (m, 1H), 7.55-7.80 (m, 4H); LC-MS (ESI) 384 (M+H+), 407 (M+Na+), 422 (M+K+).
화합물
11
의 합성
THF(3 mL) 내의 10% DMF의 용액에서의 화합물 10(120 mg, 0.31 mmole)의 용액에 Boc-Cit-PABOH((S)-터트-부틸 1-(4-(하이드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일카르바메이트, 238 mg, 0.62 mmole), N,N-디메틸아미노피리딘(76 mg, 0.62 mmole) 및 디이소프로필에틸아민(55 μL, 0.31 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 65℃ 에서 10일동안 교반하였다. 용매를 제거하고 잔여물을 구배로서 디클로로메탄 내의 5% 메탄올을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 고체로서 화합물 11(90 mg, 40%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.43 (bs, 9H), 1.56-1.70 (m, 3H), 1.79 (m, 1H), 3.06-3.27 (m, 8H), 4.17 (2m, 1H), 5.04 및 5.17 (2bs, 2H), 6.89 및 6.95 (2d, 1H), 7.15-7.26 (m, 2H), 7.37-7.72 (m, 8H), 7.80 (m, 1H); LC-MS (ESI) 729 (M+H+), 751 (M+Na+), 767 (M+K+).
화합물
12
의 합성
DMF(2 mL) 내의 화합물 11(84 mg, 0.11 mmole)의 용액에 탄산 칼륨(48 mg, 0.33 mmole) 및 티올페놀(60 μL, 0.55 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 용매를 제거하고 잔여물을 구배로서 디클 로로메탄 내의 5% 메탄올을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 고체로서 화합물 12(55 mg, 87%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.44 (bs, 9H), 1.56-1.70 (m, 3H), 1.78 (m, 1H), 2.76 (bs, 3H), 3.05-3.20 (m, 5H), 4.17 (bs, 1H), 4.99 (bs, 2H), 6.62 (m, 2H), 6.93 (m, 1H), 7.15 (m, 2H), 7.40-7.60 (m, 3H); LC-MS (ESI), 566 (M+Na+), 581 (M+K+).
화합물
13
의 합성
디클로로메탄(3 mL) 내의 화합물 12(65 mg, 0.12 mmole)의 용액에 톨루엔(180 μL, 0.36 mmole) 내의 2N 포스겐을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 0℃에서 1시간동안 교반하였다. 그리고나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일(72 mg, 100%)을 수득하였는데, 이것은 더 정제되지 않고 다음 단계에서 사용되었다.
디클로로메탄(1 mL) 내의 5% N-메틸피롤리돈 내의 오일(72 mg, 0.12 mmole)의 용액에 화합물 18(하기 실시예 2를 참조)(25 mg, 0.06 mmole) 및 N,N-디메틸아미노피리딘(22 mg, 0.18 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC(semi-preparative HPLC)에 의하여 정제하고 오일로서 화합물 13(15 mg, 35%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.42 (bs, 9H), 1.45-1.80 (m, 4H), 2.97 (bs, 6H), 3.10-3.36 (m, 7H), 3.57 (bs, 3H), 3.98 (bs, 1H), 4.10-4.35 (m, 4H), 4.50-4.75 (m, 3H), 5.15 (bs, 2H), 7.16-7.95 (m, 16H), 8.2 (d, 1H); LC-MS (ESI), 1034 (M+H+), 1056 (M+Na+), 1073 (M+K+).
화합물
14
의 합성
디클로로메탄(0.5 mL) 내의 화합물 13(13 mg, 0.011 mmole)의 용액에 트리플루오로아세트산(0.5 mL)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그리고나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일을 수득하였는데, 이것은 더 정제되지 않고 다음 단계에서 사용되었다.
디클로로메탄(0.5 mL) 내의 TFA 염착 아민(TFA salted amine)의 용액에 화합물 5(5 mg, 0.012 mmole), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄헥사플루오로포스페이트(BOP)(6 mg, 0.013 mmole) 및 디이소프로필에틸아민(8 μL, 0.044 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC(semi-preparative HPLC)에 의하여 정제하고 오일로서 화합물 14(9 mg, 50%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.03 및 1.10 (2m, 6H), 1.60 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 2.20 (m, 1H), 2.99 (s, 6H), 3.04-3.50 (m, 11H), 3.60 (bs, 3H), 3.8 (bs, 1H), 4.00 (bs, 1H), 4.20-4.45 (m, 6H), 4.50-4.75 (m, 4H), 5.15 (bs, 2H), 7.20-7.70 (m, 22H), 7.77 (d, 2H), 7.90 (bs, 2H); LC-MS (ESI), 1300 (M+H+).
화합물
15
의 합성
DMF(0.5 mL) 내의 화합물 14(9 mg, 0.006 mmole)의 용액에 피페리딘(6 μL, 0.06 mmole) 을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1 시간동안 교반하였다. 그리고나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일을 수득하였는데, 이것은 더 정제되지 않고 다음 단계에서 사용되었다.
디클로로메탄(1 mL) 내의 10% DMF의 용액 내의 오일의 용액에 (N-{y-말레이미도부티릴옥시}숙신이미드 에스테르(GMBS)(3.5 mg, 0.012 mmole) 및 디이소프로필에틸아민(2 μL, 0.012 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 하여 얻은 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하고 오일로서 화합물 15(6.5 mg, 75%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.04-1.13 (m, 6H), 1.65 (m, 2H), 1.75 (m, 1H), 1.90 (m, 3H), 2.23 (m, 3H), 2.98 및 3.01 (2s, 6H), 3.05-3.25 (m, 6H), 3.60 (m, 2H), 3.45-3.55 (m, 6H), 3.64 (t, 2H), 3.80 (m, 2H), 4.05 (m, 1H), 4.35 (bs, 1H), 4.41 (m, 2H), 4.55 (m, 2H), 4.80 (m, 1H), 5.15 (bs, 2H), 6.78 (s, 2H), 7.22 (dd, 2H), 7.35-7.65 (m, 11H), 7.90-8.00 (m, 3H), 7.77 (d, 2H), 7.90 (bs, 2H); LC-MS (ESI), 1243 (M+H+).
실시예 2
화합물
16
의 합성
DMF(45 mL) 내의 Fmoc-Cit-PABOH(2 g, 3.98 mmole)의 용액에 피페리딘(5 mL)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1 시간동안 교반하였다. 이 혼합물을 건조 상태로 농축한 다음 잔여물을 구배로서 100% 디클로로메탄, 이어서 디클로로메탄 내의 10% 메탄올 및 마지막으로 디클로로메탄 내의 30% 메탄올을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 무색 오일로서 H-Cit-PABOH(1 g, 90%)를 수득하였다.
DMF(4 mL) 내의 H-Cit-PABOH(80 mg, 0.28 mmole)의 용액에 화합물 5(100 mg, 0.24 mmole)(제조를 위하여 실시예 1을 참조), HATU (100 mg, 0.26 mmole) 및 디이소프로필에틸아민(125 μL, 0.84 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합 물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 오일로서 화합물 16(119 mg, 66%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.03-1.11 (2d, 6H), 1.58 (m, 2H), 1.77 (m, 1H), 1.88 (m, 1H), 2.23 (m, 1H), 3.05-3.20 (m, 4H), 3.44 (m, 2H), 3.83 (d, 1H), 4.21 (m, 1H), 4.39 (m, 2H), 4.54 (bs, 2H), 4.60 (m, 1H), 7.30 (m, 4H), 7.37 (m, 2H), 7.51 (m, 2H), 7.62 (m, 2H), 7.77 (m, 2H), 8.80 (d, 1H), 10.05 (s, 1H); LC-MS (ESI), 646 (M+H+), 668 (M+Na+), 684 (M+K+).
화합물
17
의 합성
디클로로메탄(4 mL) 내의 10% NMP 내의 화합물 16(190 mg, 0.25 mmole)의 용액에 디이소프로필에틸아민(131 μL, 0.75 mmole), N,N-디메틸아미노피리딘(15 mg, 0.12 mmole) 및 4-니트로페닐 클로로포메이트(101 mg, 0.5 mmole)를 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 오일로서 화합물 17(151 mg, 65%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.04-1.11 (2d, 6H), 1.59 (m, 2H), 1.79 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 2.24 (m, 1H), 3.05-3.20 (m, 4H), 3.44 (m, 2H), 3.83 (d, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.39 (m, 2H), 4.60 (m, 1H), 5.22 (bs, 1H), 7.29 (m, 2H), 7.39 (m, 4H), 7.60 (m, 4H), 7.75 (d, 2H), 8.81 (d, 1H), 10.05 (s, 1H); LC-MS (ESI), 811 (M+H+), 833 (M+Na+), 848 (M+K+).
화합물
19
의 합성
디클로로메탄(8 mL) 내의 40% THF 내의 화합물 18(50 mg, 0.11 mmole)의 용액에 4-니트로페닐 클로로포메이트(87 mg, 0.43 mmole) 및 트리에틸아민(88 μL, 0.64 mmole)을 0℃에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 에테르에서의 침전시킨 후 여과함으로써 분리하여 황색 고체로서의 PNPC-18(60 mg, 90%)을 수득하였다.
디클로로메탄(5 mL) 내의 PNPC-18(60 mg, 0.095 mmole)의 용액에 화합물 보크피페라진(bocpiperazine)(71 mg, 0.38 mmole) 및 트리에틸아민(53 μL, 0.38 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 오일로서 화합물 18(77 mg, 90%)을 수득하였다. LC-MS (ESI), 678 (M+H+), 700 (M+Na+), 716 (M+K+)
화합물
20
의 합성
디클로로메탄(0.5 mL) 내의 화합물 19(28 mg, 0.035 mmole)의 용액에 트리플루오로아세트산(0.5 mL)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그리고 나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일을 수득하였는데 이것은 더 이상의 정제 없이 다음의 단계에 사용되었다.
DMF(1 mL) 내의 상기 오일의 용액에 화합물 17(28 mg, 0.035 mmole) 및 디이소프로필에틸아민(18 μL, 0.105 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 오일로서 화합물 20(36 mg, 70%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.03-1.10 (2d, 6H), 1.58 (m, 2H), 1.77 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 2.23 (m, 1H), 2.97 (bs, 6H), 3.05-3.20 (m, 4H), 3.30-3.85 (m, 14H), 3.97 (m, 1H), 4.19-4.41 (m, 6H), 4.60 (m, 2H), 4.69 (m, 1H), 5.11 (bs, 2H), 7.16 (dd, 1H), 7.27-7.38 (m, 7H), 7.45 (m, 1H), 7.51-7.63 (m, 7H), 7.76 (d, 2H), 7.85 (d, 2H), 8.24 (bs, 1H), 8.79 (d, 1H), 10.00 (s, 1H); LC-MS (ESI), 1248 (M+H+).
화합물
21
의 합성
DMF(1 mL) 내의 화합물 20(36 mg, 0.024 mmole)의 용액에 피페리딘(12 μL, 0.12 mmole)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1 시간동안 교반하였다. 그리고나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일을 수득하였는데, 이것은 더 이상의 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다.
디클로로메탄(1 mL) 내의 10% DMF 내의 상기 오일의 용액에 MAL-PEG4-NH 에스테르(19 mg, 0.037 mmole) 및 디이소프로필에틸아민(8.5 μL, 0.048 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증 발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 오일로서 화합물 21(25 mg, 62%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.06-1.12 (2d, 6H), 1.59 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 2.24 (m, 1H), 2.44 (t, 2H), 2.50 (t, 2H), 2.99 (bs, 6H), 3.05-3.20 (m, 4H), 3.46-3.85 (m, 34H), 3.99 (m, 1H), 4.25 (m, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.59-4.73 (m, 3H), 5.13 (bs, 2H), 6.79 (s, 2H), 7.18 (dd, 1H), 7.31 (d, 1H), 7.36 (m, 2H), 7.47 (m, 1H), 7.58 (m, 5H), 7.89 (m, 2H), 8.24 (bs, 1H), 8.79 (d, 1H); LC-MS (ESI), 1423 (M+H+).
화합물
22
의 합성
DMF(1 mL) 내의 화합물 20(26 mg, 0.017 mmole)의 용액에 피페리딘(9 μL, 0.088 mmole)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1 시간동안 교반하였다. 그리고나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일을 수득하였는데, 이것은 더 이상의 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다.
디클로로메탄(1 mL) 내의 10% DMF 내의 상기 오일의 용액에 GMBS(7.5 mg, 0.025 mmole) 및 디이소프로필에틸아민(6 μL, 0.034 mmole)을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 오일로서 화합물 22(13 mg, 52%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.07-1.13 (2d, 6H), 1.60 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.90 (m, 3H), 2.24 (m, 3H), 3.00 (bs, 6H), 3.05-3.24 (m, 4H), 3.42-3.74 (m, 16H), 3.78-3.90 (m, 4H), 4.00 (m, 1H), 4.34 (m, 1H), 4.39 (m, 2H), 4.60 (m, 1H), 4.80 (m, 2H), 5.14 (bs, 2H), 6.81 (s, 2H), 7.22 (dd, 1H), 7.37 (m, 3H), 7.50 (m, 1H), 7.60 (m, 5H), 7.92 (m, 2H), 8.24 (bs, 1H), 8.79 (d, 1H), 10.05 (s, 1H); LC-MS (ESI), 1191 (M+H+).
실시예 3
화합물
23
의 합성
디클로로메탄(100 mL) 내의 50% 메탄올 내에서 에틸-5-니트로인돌-2 카르복실레이트(2 g, 8.5 mmole) 및 활성탄(200 mg) 상의 팔라듐의 수용액을 수소 대기압 하에서 실온에 두었다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 팔라듐을 여과하였고 반응 혼합물을 건조 상태로 농축시켜 무색 오일로서 화합물 23(1.68 g, 97%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.38 (t, 3H), 4.34 (q, 2H), 6.86 (dd, 1H), 6.95 (d, 1H), 6.98 (d, 1H), 7.25 (d, 1H).
화합물
24
의 합성
디클로로메탄(5 mL) 내의 화합물 23(300 mg, 1.47 mmole)의 용액에 Boc2O(385 mg, 1.76 mmole)를 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 농축하고 잔여물을 구배로서 헥산 내의 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정 제하여 흰색 고체로서 화합물 24(272 mg, 61%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.39 (t, 3H), 1.52 (s, 9H), 4.37 (q, 2H), 7.07 (s, 1H), 7.23 (dd, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.68 (bs, 1H).
화합물
25
의 합성
에탄올(3 mL) 내의 화합물 24(100 mg, 0.33 mmole)의 용액에 물(1 mL) 내의 LiOH(12 mg, 0.49 mmole)의 용액을 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 2시간동안 50℃에서 교반하였다. 이 반응 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일을 수득하였다. 잔여물을 물에 용해시키고 10% HCl를 사용하여 pH 3으로 산성화시키고, 이어서 EtOAc를 사용하여 추출하였다. 이 유기 용액을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 후, 건조 상태로 농축하여 무색 오일로서 화합물 25(85 mg, 92%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.51 (s, 9H), 7.07 (d, 1H), 7.23 (dd, 1H), 7.33 (d, 1H), 7.68 (bs, 1H).
화합물
26
의 합성
디클로로메탄(3 mL) 내의 30% DMF의 용액 내의 Fmoc-Cit-OH(206 mg, 0.52 mmole)의 용액에 EDC(120 mg, 0.62 mmole), HOBt(84 mg, 0.62 mmole) 및 터트-부틸-4-아미노 벤조에이트(120 mg, 0.62 mmole)를 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 10분동안 교반하고 나서 염화 구리(84 mg, 0.62 mmole)를 이 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 교반하였다. 이 혼합물을 건조 상태로 농축하고 나서 잔여물을 구배로서 디클로로메탄 내의 5% 메탄올을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 무색 오일로서 화합물 26(184 mg, 62%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.53-1.58 (m, 2H), 1.57 (s, 9H), 1.71 (m, 1H), 1.82 (m, 1H), 3.08 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.38 (m, 2H), 7.28-7.39 (m, 3H), 7.49 (m, 2H), 7.56-7.86 (m, 5H), 7.89 (m, 2H); LC-MS (ESI), 573 (M+H+), 595 (M+Na+), 611 (M+K+).
화합물
27
의 합성
DMF(18 mL) 내의 화합물 26(1 g, 1.75 mmole)의 용액에 피페리딘(2 mL)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1 시간동안 교반하였다. 이 혼합물을 건조 상태로 농축한 다음 잔여물을 구배로서 100% 디클로로메탄, 이어서 디클로로메탄 내의 5% 메탄올 및 마지막으로 디클로로메탄 내의 30% 메탄올을 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 무색 오일(561 mg, 92%)을 수득하였다.
DMF(10 mL) 내의 오일(561 mg, 1.6 mmole)의 용액에 디이소프로필에틸아민(679 μL, 3.9 mmole), 화합물 5(509 mg, 1.3 mmole)(제조를 위하여 실시예 1을 참조) 및 HATU(494 mg, 1.3 mmole)를 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합 물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 건조 상태로 농축하고 나서 잔여물을 구배로서 디클로로메탄 내의 5% 메탄올을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 무색 오일로서 화합물 27(691 mg, 65%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.36 (dd, 6H), 1.58-1.62 (m, 2H), 1.6 (s, 9H), 1.71 (m, 1H), 1.82 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 2.65 (m, 2H), 3.2-3.3 (m, 4H), 3.70 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 4.28 (m, 2H), 4.38 (m, 2H), 4.60 (m, 1H), 7.28-7.39 (m, 4H), 7.60-7.70 (m, 4H), 7.8 (d, 2H), 7.89 (d, 2H); LC-MS (ESI), 716 (M+H+), 737 (M+Na+), 753 (M+K+).
화합물
28
의 합성
DMF(9 mL) 내의 화합물 27(300 mg, 0.45 mmole)의 용액에 피페리딘(1 mL)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1 시간동안 교반하였다. 그리고나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일을 수득하였는데, 이것을 에테르(20 mL)에서 파괴시켰다. 이 물질을 여과하여 흰색 고체(186 mg, 84%)를 수득하였다.
디클로로메탄(1 mL) 내의 유리 아민(32 mg, 0.065 mmole)의 용액에 MAL-PEG4-NH 에스테르(50 mg, 0.097 mmole)를 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의 하여 정제하여 오일로서 화합물 28(47 mg, 95%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.10 및 1.15 (2d, 6H), 1.58-1.62 (m, 2H), 1.6 (s, 9H), 1.75 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 2.25 (m, 1H), 2.45 (t, 2H), 2.5 (t, 2H), 3.10-3.25 (m, 4H), 3.30 (m, 2H), 3.45-3.65 (m, 16H), 3.75 (m, 4H), 3.85 (d, 1H), 4.65 (m, 1H), 6.80 (s, 2H), 7.67 (d, 2H), 7.90 (d, 2H), 8.80 (d, 1H), 10.20 (s, 1H); LC-MS (ESI), 891 (M+H+), 913 (M+Na+), 929 (M+K+).
화합물
29
의 합성
디클로로메탄(0.5 mL) 내의 화합물 28(47 mg, 0.062 mmole)의 용액에 트리플루오로아세트산(0.5 mL)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그리고나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일로서 화합물 29를 수득하였는데, 이것은 더 이상의 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다(40 mg, 92%). 1H NMR (CD3OD) δ 1.10 및 1.15 (2d, 6H), 1.60 (m, 2H), 1.80 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 2.25 (m, 1H), 2.45 (t, 2H), 2.5 (t, 2H), 3.10-3.25 (m, 4H), 3.30 (m, 2H), 3.45-3.65 (m, 16H), 3.75 (m, 4H), 3.85 (d, 1H), 4.65 (m, 1H), 6.80 (s, 2H), 7.67 (d, 2H), 7.95 (d, 2H), 8.80 (d, 1H); LC-MS (ESI), 836 (M+H+), 858 (M+Na+), 874 (M+K+).
화합물
31
의 합성
EtOAc(2 mL) 내의 화합물 30(100 mg, 0.2 mmole)의 용액에 EtOAc(3 mL) 내의 농축된 HBr 용액을 실온에서 첨가하였다. Boc 탈보호를 1시간 후에 완료하였다. 침전된 물질을 여과하였다(양적 생산). 그리고나서 TFA염착 아민을 DMF(3 mL)에서 용해시켰다. 이 용액에 화합물 25(55 mg, 0.2 mmole), 디이소프로필에틸아민(173 μL, 1 mmole) 및 HATU(79 mg, 0.2 mmole)를 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 백색 고체로서 화합물 31(86 mg, 57%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.54 (s, 9H), 2.91 (s, 3H), 3.10-3.60 (m, 8H), 3.72 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 4.30-4.60 (m, 3H), 6.94 (bs, 1H), 7.05 (m, 1H), 7.12 (d, 1H), 7.45 (m, 2H), 7.68 (d, 1H), 7.75 (bs, 1H), 7.86 (d, 1H), 8.23 (bs, 1H); LC-MS (ESI), 562 (M+H-100+), 606 (M+H-56+), 662 (M+H+), 685 (M+Na+), 701 (M+K+).
화합물
32
의 합성
디클로로메탄(0.5 mL) 내의 화합물 31(30 mg, 0.039 mmole)의 용액에 아니솔(100 μL) 및 트리플루오로아세트산(0.4 mL)을 실온에서 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 30분동안 교반하였다. 그리고나서 이 혼합물을 건조 상태로 농축하여 오일을 수득하였는데, 이것은 더 이상의 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다.
DMF(1 mL) 내의 상기 오일의 용액에 화합물 29(36 mg, 0.039 mmole), 디이소프로필에틸아민(40 μL, 0.23 mmole) 및 HATU(15 mg, 0.039 mmole)를 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 오일로서 화합물 32(36 mg, 60%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.09 및 1.15 (2d, 6H), 1.62 (m, 2H), 1.81 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 2.27 (m, 1H), 2.45 (t, 2H), 2.51 (t, 2H), 2.98 (s, .3H), 3.13-3.25 (m, 4H), 3.47-3.62 (m, 24H), 3.76 (m, 4H), 3.82 (m, 1H), 3.85 (d, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.55-4.70 (m, 4H), 6.79 (s, 2H), 7.06 (s, 1H), 7.36 (bs, 1H), 7.43-7.54 (m, 2H), 7.72-7.81 (m, 3H), 7.91 (m, 3H), 8.05 (s, 1H), 8.25 (bs, 1H), 8.82 (d, 1H), 10.25 (s, 1H); LC-MS (ESI), 691 (M+2H+)/2, 1381 (M+H+), 1419 (M+K+).
실시예 4
화합물
3
의 합성
브로모 아세틸 클로라이드 2(240uL, 2.86 mMoles)를 한방울씩 벤질 2-아미노에틸카르바메이트 1(500 mg, 2.6 mMoles) 및 10 mL의 디클로로메탄 내의 TEA(800 uL, 5.7 mMoles)의 용액에 0 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였고 온도는 실온까지 점진적으로 상승시켰다. 용매를 증발시키고 이어서 수성 처리(aqeous work up) 및 에틸 아세테이트를 이용한 추출을 실시하였다. 유기층을 10% 구연산, 물 및 포화 소듐 비카르보네이트 및 식염수로 세정하고 무수황산나트륨으로 건조시켜, 화합물 3(260 mg, 32 % 수율)을 수득하였다. MS: M+1 = 315.3. H1 NMR (CDCL3): 7.37 ppm (5H), 5.11ppm (2H), 3.83 ppm (2H), 3.40 ppm (4H).
화합물
6
의 합성
1.5 g의 Fmoc-시트룰린 5(0.0038 Moles), 0.88 g의 t-부틸-4-아미노 벤조에이트 4(0.0045 Moles), 0.6 g의 HOBt(0.0045 Moles), 0.68 g의 EDC(0.0043 Moles) 및 촉매량의 염화 구리를 9mL의 DCM/DMF (2:1)의 혼합물에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고 그 생성물을 DCM 내의 5-10%의 MeOH를 이용하여 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여, 화합물 6(1.54 g, 71 % 수율)을 수득하였 다. MS: M+1 = 573.9.
화합물
8
의 합성
화합물 6(300 mg, 0.66 mMoles) 내에서 Fmoc 보호기의 탈보호를 DMF 내의 5% 피페리딘을 이용하여 20분동안 실시하였다. 용매를 증발시키고 조고체(crude solid)를 디에틸 에테르로 세정하여 230 mg의 화합물 7(99% 수율)을 수득하였다. MS: M+1 = 352
230 mg의 화합물 7(0.65 mMoles)을 DMF 및 DCM 내의 333 mg의 Fmoc-발린(0.98 mMoles) 및 188 mg의 EDC(0.98 nmoles)와 반응시키고 DCM 내의 실리카 겔 5-10% MeOH로 정제한 후에 240mg의 화합물 8(55 % 수율)을 수득하였다. MS: M+1 = 673.
화합물
10
의 합성
500 mg의 화합물 8(0.75 mMoles)을 DMF 내의 피페리딘을 이용하여 탈보호시켜 화합물 9를 수득하였는데, 이것을 용매 제거 후에 디에틸 에테르로 세정하였다. 더 이상의 정제 없이 화합물 9를 125 mg의 KI(0.75 mMoles) 및 313 uL의 트리에틸 아민의 존재하에 235 mg의 화합물 3(0.75 mmoles)과 40 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이 조반응 혼합물(crude reaction mixture)을 농축하고 역상 HPLC에 의하여 정제하여 300 mg의 화합물 10을 55.8%의 수율로 수득하였다. MS: M[+1] = 685.
화합물
11
의 합성
화합물 10(300 mg)을 HCL-EA로 3시간 동안 탈보호화시켰다. 용매를 증발시키고 그 생성물을 고진공하에서 건조시켜 화합물 11을 수득하였다. MS: M[+1] = 628. . H1 NMR (DMSO): 10.45 ppm (1H), 8.8 ppm (1H), 8.5 (1H), 7.88 ppm (2H), 7.75 ppm (2H), 7.3 ppm (5H), 6.1 (1H), 5.5 (2H), 4.99 (2H), 4.5 ppm (1H), 3.7-3.4 (3H), 3.2-2.9 (5H), 2.16 (1H), 1.45 (2H). 1.1 (3H), 0.92 ppm (3H)
화합물
14
의 합성
EtOAc(5 ml) 내의 4 N HBr 내의 화합물 12(42 mg, 0.09 mmol)의 용액을 25℃에서 45분동안 교반하였다. 용매를 제거하고 고진공 하에서 4시간 동안 더 건조시켰다. 5-(아미노-터트-부톡시카르보닐)-인돈-2-카르복실산(39.2 mg, 0.14 mmol) 및 BOP(71mg, 0.16 mmol)을 DMF(2mL) 내의 잔여물에 첨가하고 이어서 DIPEA(83uL, 0.48 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 20분동안 교반하고 짧은 컬럼의 실리카 겔을 통과시켰다. 용매를 제거하고, 조생성물을 헥산 내의 20% EtOAc를 사용하여 용출시켜 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 하고 화합물 14를 수득하였다(49 mg, 88%). 1HNMR DMSO-d6) δ 11.63 (s, 1H), 9.18 (br s, 1H), 8.19 (d, 1H, J=8.4 Hz), 8.09 (br s, 1H), 7.90 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.79 (br s, 1H), 7.53-7.58 (m, 3H), 7.39-7.43 (m, 3H), 7.28-7.35 (m, 3H), 7.11 (s, 1H), 5.29 (s, 2H), 4.80 (t, 1H, 11.2 Hz), 4.54 (dd, 1H, 8.8 Hz), 4.31 (m, 1H), 3.92 (dd, 1H, J=10.2 Hz), 3.82 (dd, 1H, J=10.7 Hz), 1.47 (s, 9H).
화합물
15
의 합성
MeOH/CH2Cl2(1/2, 10 ml) 내의 화합물 14(49 mg, 0.08 mmol) 및 10% Pd-C (35 mg)의 혼합물을 진공에서 40초동안 탈가스화시켰다. 그 결과의 혼합물을 수소의 대기 하에 두었고 25℃에서 7시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)로 여과시켰다(MeOH-CH2Cl2 세척). 용매를 진공에서 제거하였다. DCM 내의 2% MeOH를 사용하여 용출시켜 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 하고 화합물 15(40.6 mg, 97%)를 수득하였다. 1NMR DMSO-d6) δ 11.59(s, 1H), 10.43 (s, 1H), 9.18 (br s, 1H), 8.09 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.93 (br s, 1H), 7.81 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.78 (br s, 1H), 7.49 (t, 1H, J=8.4 Hz), 7.27-7.35 (m, 3H), 7.08 (s, 1H), 4.80 (t, 1H, 11.2 Hz), 4.54 (dd, 1H, 8.8 Hz), 4.31 (m, 1H), 3.92 (dd, 1H, J=10.2 Hz), 3.82 (dd, 1H, J=10.7 Hz), 1.47 (s, 9H).
화합물
16
의 합성
CH2Cl2 (7mL) 내의 화합물 15(36 mg, 0.07 mmol), 4-메틸-1-피페라진카르보닐 클로라이드 하이드로클로라이드(20 mg, 0.10 mmol), 알릴 알코올(0.1 mL) 및 무수 피리딘(63 μml)의 용액 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하지 않고, 이 조생성물을 CH2Cl2 내의 2%-10% MeOH로 용출시켜 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 하고 화합물 16(32.4 mg, 73%)을 수득하였다. 1NMR DMSO-d6) δ 11.59(s, 1H), 9.18 (br s, 1H), 8.09 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.93 (br s, 1H), 7.81 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.78 (br s, 1H), 7.49 (t, 1H, J=8.4 Hz), 7.27-7.35 (m, 3H), 7.08 (s, 1H), 4.80 (t, 1H, 11.2 Hz), 4.54 (dd, 1H, 8.8 Hz), 4.31 (m, 1H), 3.92 (dd, 1H, J=10.2 Hz), 3.82 (dd, 1H, J=10.7 Hz), 3.77 (br s, 2H), 3.47 (br s, 2H), 3.37 (br s, 2H), 2.63 (s, 3H), 2.38 (br s, 2H), 1.47 (s, 9H).
화합물
17
의 합성
EtOAc(4 ml) 내의 4N HBr 내의 화합물 16(32 mg, 0.05 mmol)의 용액을 25℃ 에서 45분 동안 교반하였다. 용매를 제거하고 고진공에서 4시간동안 더 건조시켰다. 화합물 11(48.2 mg, 0.07 mmol) 및 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄헥사플루오로포스페이스(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphate, BOP)(34.5 mg, 0.08 mmol)를 DMF(2 mL) 내의 잔여물에 첨가하고 이어서 DIPEA(68 uL)를 첨가한 후, 그 반응 혼합물을 25℃에서 25분동안 교반하였다. 용매를 진공하에서 제거하고 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하고, 화합물 17(42.1 mg, 64%)을 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분 동안 유지시켰다. MS: C58H67BrN12O10의 계산치 (M+H) m/z 1171.43, 발견치 1172.40.
화합물
18
의 합성
MeOH(5mL) 내의 화합물 17(33.6 mg, 0.025 mmol)의 용액에 10% Pd-C(28 mg)를 첨가하고, 이 혼합물을 N2를 사용하여 탈가스화시켰다. 이 반응 혼합물에 H2를 흐르게하고 나서, H2 대기 하에서 교반하였다. 반응의 완성 시(40분)에, 이 반응 혼합물을 여과하고 농축하여 화합물 18(31.5 mg, 96%)을 수득하였다. MS: C50H61BrN12O8의 계산치 (M+H) m/z 1037.39, 발견치 1038.20.
화합물
19
의 합성
DMF(2mL) 내의 화합물 18(31.5 mg, 0.024 mmol)의 용액에 DCM(0.5mL) 내의 Mal-PEG4-NHS 에스테르(42 mg, 0.08 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 최종 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하고, 화합물 19(29.7 mg, 77%)을 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분 동안 유지시켰다. MS: C68H87BrN14O16의 계산치 (M+H) m/z 1435.56, 발견치 1437.00.
실시예 5
화합물 2의 합성: 인돌-4-카르복스알데하이드(1, 583 mg, 4 mmol) 및 건조 메탄올(20 mL) 내의 메틸 아지도아세테이트(460 mg, 40 mmol)의 용액에 메탄올 내의 소듐 메톡사이드(6.9 mL의 25% NaOMe, 32 mmol)를 N2 하에서 -25℃(드라이아이스/CCl4)에서 한방울씩 첨가하였다. 반응 화합물을 0℃로 가온하고 3.5시간동안 교반하였다. 이 반응 화합물을 물(120 mL)에 부었고 EtOAc(2 x 60 mL)을 사용하여 추출하였다. 이 조합 추출물을 포화 수성 NaCl(60 mL)로 세척하였고 건조시켰다(MgSO4). 용매를 진공에서 제거하여 화합물 2(890 mg, 91%)를 수득하였다. 1HNMR (CDCl3) δ 8.28 (br s, 1H), 8.06 (d, 1H, J=7.6 Hz), 7.45 (s, 1H), 7.42 (d, 1H, J=7.6 Hz), 7.30 (t, 1H, J=3.2 Hz), 7.26 (s, 1H), 6.73 (br s, 1H), 3.96 (s, 3H).
화합물 3의 합성: 건조 자일렌(100 mL) 내의 메틸 2-아지도-3-(1H-인돌-4-일)아크릴레이트(2, 890 mg, 3.68 mmol)의 현탁액을 N2 하에서 1시간동안 환류시켰다. 용매를 진공에서 제거하고 잔여물을 실리카 겔(30% EtOAc-헥산)의 컬럼에 통과시켜 화합물 3(663 mg, 85%)을 수득하였다. 1HNMR (CDCl3) δ 8.97 (br s, 1H), 8.36 (br s, 1H), 7.47 (d, 1H, J=2 Hz), 7.40 (d, 1H, J=9.2 Hz), 7.26 (t, 1H, J=2.8 Hz), 7.22 (d, 1H, J=9.2 Hz), 6.82 (t, 1H, J=2.4 Hz), 3.95 (s, 3H).
화합물 4의 합성: 빙초산(9 mL) 내의 메틸피롤로[3,2-e]인돌-2-카르복실레이트(화합물 3, 663 mg, 3.1 mmol)의 용액에 쇼듐 시아노보로하이드라이드(600 mg, 9.5 mmol)를 N2하 15℃에서 첨가하였고, 이 반응 혼합물을 2.5시간동안(13-18 ℃) 교반하였다. 이 반응 혼합물을 물(60 mL)에 붓고 고체 탄산나트륨을 조심스럽게 첨가하여 pH 8-9를 만들었다. 이 수성 혼합물을 EtOAc(3 x 60 mL)로 추출하고, 이 조합 추출물을 건조시켰다(MgSO4). 용매를 진공에서 제거하였다. 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 20% EtOAc-헥산)를 실시하여 화합물 4(562 mg, 84%)를 수득하였다. 1HNMR (CDCl3) δ 8.85 (br s, 1H), 7.15 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.04 (s, 1H), 6.89 (d, 1H, J=8.4 Hz), 3.94 (s, 3H), 3.68 (t, 2H, J=8.4 Hz), 3.24 (t, 2H, J=8.4 Hz).
화합물 5의 합성: 건조 THF(8 mL) 내의 메틸 1,2-디하이드로-3H-피롤로[3,2-e]인돌-7-카르복실레이트(화합물 4, 450 mg, 1.42 mmol)의 용액을 디-터트-부틸 디카르보네이트(621 g, 2.8 mmol)로 N2하에서 25℃에서 처리하였다. 이 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하였고, 그리고 나서 용매를 진공에서 제거하였다. 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 30% EtOAc-헥산)에 의하여 화합물 5(551 mg, 84%)를 수득하였다. 1HNMR (CDCl3) δ 8.78 (br s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.25 (d, 1H, J=8.5 Hz), 7.07 (s, 1H), 4.12 (br s, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.27 (t, 2H, J=8.8 Hz), 1.57 (s, 9H).
화합물 6의 합성: LiOH의 수성 용액(2.2 mL의 4.0 M 용액, 8.7 mmol)을 60 mL의 THF/MeOH/H2O(3:2:1) 내의 메틸 3-(터트-부틸옥시카르보닐)-1,2-디하이드로-3H-피롤로[3,2-e]인돌-7-카르복실레이트(화합물 5, 551 mg, 1.74 mmol)의 슬러리에 첨가하 였고, 이 반응 혼합물을 25℃에서 14시간동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 물(30mL)로 희석시키고나서 2N HCl로 pH 4로 조정하여서, 흰색 침전물을 생산하였다. 이 고체를 여과에 의하여 수거하고 물(10 mL)로 세척하였다. 고진공에서 이 고체를 건조하여 화합물 6(524 mg, 99%)을 수득하였다. 1HNMR (DMSO-d 6) δ 12.93 (br s, 1H), 11.69 (s, 1H), 7.80 ( br s, 1H), 7.20 (d, 1H, J=8.8 Hz), 6.91 (s, 1H), 3.96 (t, 2H, J=8.8 Hz), 3.18 (t, 2H, J=8.8 Hz), 1.48 (s, 9H).
화합물 9의 합성: EtOAc(5 ml)에서 4 N HBr 내의 화합물 7(48 mg, 0.1 mmol)의 용액을 질소하에서 25℃에서 45분동안 교반하였다. 용매를 제거하고 고진공에서 4시간동안 더 건조시켰다. 잔여물에 3-(터트-부틸옥시카르보닐)-1,2-디하이드로-3H-피롤[3,2-e]인돌-7-카르복실산(화합물 6, 36.24 mg, 0.12 mmol)을 첨가하였다. DMF(3 ml) 내의 EDC(22.9 mg, 0.12 mmol)의 용액을 첨가하고 그 반응 혼합물을 25℃에서 6시간동안 교반하였다. 용매를 제거하였다. 조생성물을 CH2Cl2내 3-10% MeOH로 용출시켜 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 하고 화합물 9(26 mg, 40%)를 수득하였다. 1HNMR (DMSO-d 6 ) δ 11.69 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.01 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.81 (d, 2H, J=8.8 Hz), 7.59 (t, 1H, J=7.6 Hz), 7.49 (t, 1H, J=7.6 Hz), 7.29 (d, 1H, J=9.2 Hz), 7.07 (s, 1H), 4.87 (t, 1H, 10 Hz), 4.54 (d, 1H, 8.8 Hz), 4.43 (br s, 1H), 3.89-4.03 (m, 4H), 3.76 (br s, 2H), 3.46 (br s, 2H). 3.26 (m, 2H), 2.46 (br s, 2H), 2.38 (br s, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.49 (s, 9H).
화합물 10의 합성: EtOAc(5 ml) 내에서 4 N HBr 내의 화합물 9(26 mg, 0.04 mmol)의 용액을 질소하 25℃에서 45분동안 교반하였다. 이 용매를 제거하고 진공하에서 14시간동안 더 건조시켜 화합물 10(27.7 mg, 98%)을 수득하였다. 1HNMR (DMSO-d 6 ) δ 12.09 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.03 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.92 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.63 (t, 1H, J=7.6 Hz), 7.49-7.55 (m, 2H), 7.34 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.32 (s, 1H), 4.91 (t, 1H, 10.8 Hz), 4.54 (d, 1H, 10.8 Hz), 4.47 (br s, 1H), 3.84-3.99 (m, 4H), 3.27- 3.50 (m, 10H), 2.88 (s, 3H).
화합물 12의 합성: MeOH/CH2Cl2(1/2, 10 ml) 내에서 화합물 11(20 mg, 0.05 mmol) 및 10% Pd-C(15 mg)의 용액을 진공에서 40초동안 탈가스화였다. 그 결과의 혼합물 을 수소 대기 하에 두었고, 25℃에서 7시간동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 셀라이트로 여과시켰다(CH2Cl2 세척). 용매를 진공에서 제거하였다. EtOAc/Hex(2/8)를 사용하여 용출시켜 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 하고 화합물 12(15.4 mg, 98%)를 수득하였다. 1NMR (DMSO-d 6 ) δ 10.36 (s, 1H), 8.04 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.72 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.61 (br s, 1H), 7.45 (t, 1H, J=8.4 Hz), 7.261 (t, 1H, J=8.4 Hz), 4.06 (m, 4H), 3.73 (br s, 1H), 1.52 (s, 9H).
화합물 13의 합성: EtOAc(3 ml) 내에서 4 N HCl 내의 화합물 12(14 mg, 0.04 mmol)의 용액을 질소하 25℃에서 30-45분동안 교반하였다. 용매를 제거하고 고진공에서 14시간동안 더 건조시켰다. 잔여물에 3-(터트-부틸옥시카르보닐)-1,2-디하이드로-3H-피롤로[3,2-e]인돌-7-카르복실산(화합물 6, 15.1 mg, 0.05 mmol)을 첨가하였다. DMF(2 ml) 내의 EDC(9.6 mg, 0.05 mmol)의 용액을 첨가하였고 그 반응 혼합물을 25℃에서 15시간동안 교반하였다. 용매를 제거하였다. 조생성물을 CH2Cl2 내의 3-10% MeOH로 용출시켜 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 하고 화합물 13(18.6 mg, 86%)을 수득하였다. 1HNMR (CDCl3) δ 9.45 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.29 (d, 1H, J=8.4 Hz), 8.02 (s, 2H), 7.63 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.54 (t, 1H, J=6.8 Hz), 7.43 (t, 1H, J=6.8 Hz), 7.29 (d, 1H, J=8.0 Hz), 6.89 (s, 1H), 4.75 (d, 1H, 10.8 Hz), 4.64 (t, 1H, 8.8 Hz), 4.12 (br s, 2H), 4.03 (t, 1H, J=8.8 Hz), 3.93 (dd, 1H, J=11.2 Hz), 3.42 (t, 1H, J=10.8 Hz), 3.22-3.31 (m, 2H), 1.61 (s, 9H).
화합물 14의 합성: DMF(3 ml) 내의 화합물 13(19 mg, 0.04 mmol)의 용액에 0-5℃에서 소듐 메톡사이드(MeOH내에 0.5 M, 79 uL, 0.04 mmol)를 첨가하고 5분동안 교반하였다. 이 반응 혼합물에 물(20 mL)을 첨가하고, 수성 혼합물을 EtOAc(2 x 10 mL)로 추출하였다. 이 조합 추출물을 건조시켰다(MgSO4). 용매를 진공에서 제거하고, 조생성물을 CH2Cl2 내의 10% MeOH로 용출시켜 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 하고 화합물 14(15.3 mg, 87%)를 수득하였다. 1NMR (CDCl3) δ 9.24 (br s, 1H), 8.25 (dd, 1H, J=9.2, 1.6 Hz), 8.02 (s, 1H), 7.54 (tt, 1H, J=7.6, 1.6 Hz), 7.43 (tt, 1H, J=7.6, 1.6 Hz), 7.28 (d, 1H, J=9.2 Hz), 7.20 (s, 1H), 6.94 (d, 1H, J=7.6 Hz), 6.88 (s, 1H), 4.49 (m, 2H), 4.12 (br s, 2H), 3.26 (m, 2H), 2.92 (m, 1H), 1.76 (dd, 2H, J=7.6 Hz), 1.61 (s, 9H).
화합물 15의 합성: EtOAc(3 ml) 내의 4N HBr 내의 화합물 14(6.4 mg, 0.013 mmol)의 용액을 질소하 25℃에서 30분동안 교반하였다. 이 용매를 진공에서 제거하고 고진공에서 14시간동안 더 건조시켜 화합물 15(7.1 mg, 99%)를 수득하였다. 1HNMR (DMSO-d 6 ) δ 12.16 (s, 1H), 10.45 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.94 (br s, 1H), 7.83 (d, 1H, J=8.0 Hz), 7.51 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.27 (s, 1H), 4.81 (t, 1H, 10.8 Hz), 4.48 (d, 1H, 10.8 Hz), 4.28 (br s, 1H), 3.77-3.91 (m, 4H), 3.41- 3.48 (m, 2H).
화합물 16의 합성: 화합물 10(0.033 mMoles, 2HBr 염)을 HATU(20 mg, 0.054 mMoles) 및 TEA(15-20 μL)의 존재하에서 2.5 mL DMF 내의 실시예 3의 화합물 29(45 mg, 0.054 mMoles)와 50분동안 반응시켰다. 용매를 증발시키고 조생성물을 역상 HPLC에 의하여 정제하여 10 mg의 화합물 16(21 % 수율)을 수득하였다. MS: 1405.6, 1427.8 및 1444.6.
화합물 19의 합성: 화합물 10(25mg, 0.033 mMoles, 2HBr 염)을 HATU(16.5 mg, 0.0433 mMoles) 및 TEA(10-15 μL)의 존재하에 45분동안 2.5 mL DMF 내의 실시예 5의 화합물 D(21.5 mg, 0.043 mMoles)와 반응시켰다. 용매를 증발시키고 조(crude) 생성물을 역상 HPLC에 의하여 정제하여 25mg의 화합물 17(71 % 수율)을 수득하였다. MS: 1067.0. 화합물 17(0.0187 mMoles)을 DMF(3 mL) 내의 5% 피페리딘으로 45분동안 탈보호화시켰다. 용매를 증발시키고 잔여물을 디에틸 에테르로 세척하여 화합물 18(MS: 845.2)을 수득하였다. 3 mL DMF 내의 0.00935mMoles의 화합물 18의 용액에 1 mL DCM 내의 Mal-dPEG4-NHS 에스테르(10 mg, 0.019 mMoles), 이어서 TEA(5 μL)를 첨가하였다. 30분 후에, 용매를 증발시키고 조생성물을 역상 HPLC에 의하여 정제하여 5.2 mg의 순수한 화합물 19(MS: 1243.2, 1266.8 및 1281.2)를 수득하였다.
실시예 6
화합물 3의 합성: DMF(2 mL) 내의 화합물 1(18.2 mg, 0.03 mmol)에 화합물 2(16 mg, 0.036 mmol) 및 HATU(14 mg, 0.036 mmol)를 첨가하고, 이어서 DIPEA(19 uL)를 첨가하고 나서, 이 반응 혼합물을 25℃에서 7시간동안 교반하였다. 진공 하에서 용매를 제거하고 그 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내 의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 3(15.8 mg, 53%)을 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분 동안 유지시켰다. MS: C59H58ClN7O9의 계산치 (M+H) m/z 1044.4, 발견치 1045.
화합물 4의 합성: DMF(2mL) 내의 화합물 3(15 mg, 0.014 mmol)의 용액을 DMF(2 mL) 내의 5% 피페리딘으로 처리하였다. 그 반응 혼합물을 25℃에서 5분동안 교반하였다. 최종 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 4(11.2 mg, 95%)를 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분 동안 유지시켰다. MS: C44H48ClN7O7의 계산치 (M+H) m/z 822.33, 발견치 822.6.
화합물 6의 합성: DMF(2 mL) 내의 화합물 4(11.2 mg, 0.014 mmol)의 용액에 DCM(0.5mL) 내의 화합물 5(5.5 mg, 0.018 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 1 시간동안 교반하였다. 최종 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC (SymmetrPrep C18, 7 μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 6(13 mg, 94%)을 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분동안 유지시켰다. MS: C54H59ClN8O10의 계산치 (M+H) m/z 1015.4, 발견치 1016.0.
화합물 7의 합성: TFA/DCM(1/1, 2mL) 내의 화합물 6(13 mg, 0.013 mmol)의 용액을 15분동안 교반하였다. 용매를 진공 하에서 제거하고 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 7(12 mg, 97%)을 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분동안 유지시켰다. MS: C50H51ClN8O10의 계산치 (M+H) m/z 959.34, 발견치 960.
실시예 7
화합물 3의 합성: DMF(3 ml) 내의 화합물 1(47 mg, 0.06 mmol), 화합물 2(40mg, 0.078 mmol) 및BOP(34.5 mg, 0.078 mmol)의 용액을 DIPEA(68 uL)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 용매를 제거하고 이어서 고진공에서 4시간동안 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 제거하고 조생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 3(56 mg, 85%)을 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분동안 유지시켰다. MS: C56H54BrN9O8의 계산치 (M+H) m/z 1060.33, 발견치 1060.44.
화합물 4의 합성: DMF(2mL) 내의 화합물 3(22 mg, 0.02 mmol)의 용액을 DMF(2 mL) 내의 5% 피페리딘으로 처리하였다. 그 반응 혼합물을 25℃에서 5분동안 교반하였다. 최종 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 4(16.2 mg, 93%)를 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분 동안 유지시켰다. MS: C41H44BrN9O6의 계산치 (M+H) m/z 838.26, 발견치 839.2.
화합물 6의 합성: DMF(2 mL) 내의 화합물 4(16 mg, 0.015 mmol) 및 화합물 5(6.2mg, 0.02 mmol)의 용액을 DIPEA(10 uL)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 1시간동안 교반하였다. 최종 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC (SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 6(13 mg, 75%)을 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분동안 유지시켰다. MS: C51H55BrN10O9의 계산치 (M+H) m/z 1031.33, 발견치 1031.6.
실시예 8
화합물 1의 합성: THF(21 mL) 내의 5% DMF의 용액에서의 Fmoc-Lys(Boc)-OH(500 mg, 1.07 mmol)의 용액에 EDC(245 mg, 1.28 mmol), HOBt(173 mg, 1.28 mmol) 및 터트-부틸-4-아미노 벤조에이트(247 mg, 1.28 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 이렇게해서 얻은 혼합물을 10분동안 교반하고 나서, 염화 구리(172 mg, 1.28 mmol)를 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 교반하였다. 이 혼합물을 건조 상태로 농축하고 나 서, 잔여물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 내의 5% 메탄올로 용출시켜 무색 오일로서 화합물 1(286 mg, 42%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.38 (s, 9H), 1.45-1.54 (m, 4H), 1.58 (s, 9H), 1.80 (m, 2H), 3.05 (t, 2H), 4.22 (m, 2H), 4.38 (d, 2H), 7.30 (m, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.68 (m, 4H), 7.78 (d, 2H), 7.90 (d, 2H); LC-MS (ES+), 544 (M+H-Boc)+, 667 (M+Na)+.
화합물 2의 합성: 일반적인 EDC 결합 과정에 대하여 화합물 1의 제조를 참조. Fmoc-Leu-OH(500 mg, 1.42 mmol)를 터트-부틸-4-아미노 벤조에이트(328 mg, 1.70 mmol)와 결합시켜 335 mg의 화합물 2(44%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 0.95 (t, 6H), 1.58 (s, 9H), 1.55-1.80 (m, 3H), 4.22 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 7.35 (m, 4H), 7.65 (m, 4H), 7.78 (d, 2H), 7.90 (d, 2H).
화합물 3의 합성: 일반적인 EDC 결합 과정에 대하여 화합물 1의 제조를 참조. Fmoc-Cit-OH(206 mg, 0.52 mmol)를 터트-부틸-4-아미노 벤조에이트(120 mg, 0.62 mmol)와 결합시켜 184 mg의 화합물 3(62%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.53-1.58 (m, 2H), 1.57 (s, 9H), 1.71 (m, 1H), 1.82 (m, 1H), 3.08 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.38 (m, 2H), 7.28-7.39 (m, 3H), 7.49 (m, 2H), 7.56-7.86 (m, 5H), 7.89 (m, 2H); LC-MS (ES+), 573 (M+H)+, 595 (M+Na)+, 611 (M+K)+.
화합물 4의 합성: 디클로로메탄(4 mL) 내의 화합물 1(280 mg, 0.44 mmol)의 용액에 TFA(2 mL)를 첨가하였다. 그 결과의 용액을 20분동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔여물(260 mg, 98%)을 더 이상의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.45-1.80 (m, 5H), 1.88 (m, 1H), 2.09 (t, 2H), 4.25 (m, 2H), 4.45 (m, 2H), 7.30 (m, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.68 (m, 4H), 7.80 (d, 2H), 7.98 (d, 2H).
화합물 5의 합성: DMF(5 mL) 내의 화합물 4(214 mg, 0.44 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민(153 μL, 0.88 mmol), Boc2O(144 mg, 0.66mmol)을 실온에서 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 흰색 고체로서 화합물 5(181 mg, 70%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.40 (s, 9H), 1.45-1.50 (m, 4H), 1.80 (m, 2H), 3.03 (t, 2H), 4.21 (m, 2H), 4.40 (d, 2H), 7.35 (m, 4H), 7.65 (m, 4H), 7.68 (d, 2H), 7.95 (d, 2H); LC-MS (ES+) 489 (M+H-Boc)+, 610 (M+Na) +.
화합물 6의 합성: 터트-부틸 에스테르 탈보호화 과정에 대하여 화합물 4의 제조를 참조. 화합물 2(15 mg, 0.028 mmol)를 탈보호화시켜 13 mg의 화합물 6(98%)을 수득하였다. 잔여물을 더 이상의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. LC-MS (ES+) 495 (M+H) +.
화합물 7의 합성: 터트-부틸 에스테르 탈보호화 과정에 대하여 화합물 4의 제조를 참조. 화합물 3(20 mg, 0.035 mmol)를 탈보호화시켜 17 mg의 화합물 7(98%)을 수득하였다. 잔여물을 더 이상의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 8의 합성: DMF(1 mL) 내의 화합물 A(화합물 A를 실시예 4에서의 화합물 16에서 설명된 것과 같은 유사한 방식으로 합성하였음)의 용액에 화합물 5(19 mg, 0.032 mmol), 디이소프로필에틸아민(28 μL, 0.16 mmol) 및 HATU(12 mg, 0.032 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 이렇게해서 얻은 혼합물을 2 시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 흰색 고체로서 상기 타이틀 화합물(25 mg, 66%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.40 (s, 9H), 1.45-1.50 (m, 4H), 1.80 (m, 2H), 2.93 (s, 3H), 3.03 (t, 2H), 3.10-3.60 (m, 8H), 3.85 (d, 1H), 4.05 (m, 1H), 4.21 (m, 2H), 4.40 (m, 4H), 4.52 (m, 1H), 6.95 (s, 1H), 7.27-7.50 (m, 8H), 7.63-7.77 (m, 7H), 7.84 (m, 3H), 7.99 (s, 1H), 8.25 (bs, 1H); LC-MS (ES+) 1088 (M+H) +.
화합물 9의 합성: HATU 결합 과정에 대하여 화합물 8의 제조를 참조. 화합물 6(13 mg, 0.027 mmol)을 화합물 25(20 mg, 0.027mmol)와 결합시켜 17 mg의 화합물 9(57%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 0.86 (m, 6H), 1.45-1.70 (m, 3H), 2.78 (s, 3H), , 3.05-3.50 (m, 8H), 3.70 (d, 1H), 3.80 (m, 1H), 4.07 (m, 1H), 4.20-4.40 (m, 6H), 6.76 (s, 1H), 7.13-7.30 (m, 8H), 7.51-7.72 (m, 10H), 7.86 (s, 1H), 8.15 (bs, 1H); LC-MS (ES+) 973 (M+H) +.
화합물 10의 합성: HATU 결합 과정에 대하여 화합물 8의 제조를 참조. 화합물 7(27 mg, 0.053 mmol)을 화합물 25(39 mg, 0.053 mmol)와 결합시켜 36 mg의 화합물 10(60 %)을 수득하였다.
화합물 11의 합성: DMF(1 mL) 내의 화합물 8(25 mg, 0.02 mmol)의 용액에 피페리딘(10 μL, 0.1 mmol)을 첨가하였다. 그 결과의 용액을 1 시간동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 에테르 내에서 파괴하고 여과하였다(18 mg, 98%). 화합물을 더 이상의 정제없이 사용하였다. LC-MS (ES+) 866 (M+H) +, 888 (M+Na) +.
화합물 12의 합성: 일반적인 Fmoc 탈보호화 과정에 대하여 화합물 11의 제조를 참조. 화합물 9(17 mg, 0.016 mmol)를 탈보호화시켜 14 mg의 화합물 12(98%)를 수득하였다. 잔여물을 더 이상의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 13의 합성: 일반적인 Fmoc 탈보호화 과정에 대하여 화합물 11의 제조를 참조. 화합물 10(36 mg, 0.036 mmol)을 탈보호화시켜 28 mg의 화합물 13(98%)을 수득하였다. 잔여물을 더 이상의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 14의 합성: 디클로로메탄(1 mL) 내의 20% DMF에서의 화합물 11(18 mg, 0.021 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민(11 μL, 0.63 mmol) 및 N-숙신이미딜-6-말레이미도헥사노에이트(10 mg, 0.031 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 이렇게해서 얻은 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔여물을 반-분취 HPLC에 의하여 정제하여 흰색 고체로서 화합물 14(19 mg, 79%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.32 (m, 2H ), 1.42 (s, 9H), 1.45-1.80 (m, 8H), 1.78 (m, 1H), 1.85 (m, 1H), 2.28 (t, 2H), 2.96 (s, 3H), 3.05 (t, 3H), 3.35-3.70 (bs, 8H), 3.47 (t, 2H), 3.60 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 4.44 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 6.76 (s, 2H), 6.96 (s, 1H), 7.31 (bs, 2H), 7.42 (m, 1H), 7.46 (m, 1H), 7.71 (m, 3H), 7.86 (m, 3H), 7.99 (s, 1H), 8.25 (bs, 1H); LC-MS (ES+) 1059 (M+H) +, 1082 (M+Na)+.
화합물 15의 합성: 디클로로메탄(0.8 mL) 내의 화합물 14(19 mg, 0.08 mmol)의 용액에 TFA(0.2 mL)를 첨가하였다. 그 결과의 용액을 20분 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 동결건조시켜 흰색 고체로서 화합물 15(17 mg, 90%)를 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.34 (m, 2H ), 1.45-1.80 (m, 9H), 1.95 (m, 1H), 2.29 (t, 2H), 2.96 (t, 3H), 3.00 (s, 3H), 3.35-3.70 (bs, 8H), 3.48 (t, 2H), 3.75 (m, 1H), 3.98 (dd, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.69 (m, 2H), 6.78 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 7.42 (bs, 2H), 7.48 (m, 1H), 7.57 (m, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.87-7.95 (m, 4H), 8.05 (s, 1H), 8.25 (bs, 1H); LC-MS (ES+) 959 (M+H) +, 982 (M+Na)+.
화합물 16의 합성: N-숙신이미딜-6-말레이미도헥사노에이트 결합 과정에 대하여 화합물 14의 제조를 참조. 화합물 12(11 mg, 0.015 mmol)를 N-숙신이미딜-6-말레이미도헥사노에이트(7 mg, 0.022 mmol)와 결합시켜 10 mg의 화합물 16(66%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 0.97 (d, 3H ), 1.01 (d, 3H), 1.31 (m, 2H), 1.56-1.75 (m, 7H), 2.28 (t, 2H), 2.97 (s, 3H), 3.35-3.55 (m, 8H), 3.47 (t, 2H), 3.62 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 4.06 (m, 1H), 4.51 (m, 1H), 4.55 (m, 2H), 6.76 (s, 2H), 6.99 (s, 1H), 7.33 (bs, 2H), 7.42 (m, 1H), 7.49 (m, 1H), 7.69 (d, 2H), 7.75 (m, 1H), 7.86 (m, 3H), 8.00 (s, 1H), 8.25 (bs, 1H); LC-MS (ES+) 944 (M+H) +, 966 (M+Na)+.
화합물 17의 합성: N-숙신이미딜-6-말레이미도헥사노에이트 결합 과정에 대하여 화합물 14의 제조를 참조. 화합물 13(28 mg, 0.035 mmol)을 N-숙신이미딜-6-말레이미도헥사노에이트(16 mg, 0.053 mmol)와 결합시켜 24 mg의 화합물 17(60%)을 수득하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 1.34 (m, 2H ), 1.55-1.68 (m, 6H), 1.68-190 (m, 2H), 2.29 (t, 2H), 3.00 (s, 3H), 3.12-3.30 (m, 2H), 3.35-3.70 (bs, 8H), 3.48 (t, 2H), 3.70 (m, 1H), 3.96 (dd, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.65 (m, 2H), 6.78 (s, 2H), 7.08 (s, 1H), 7.41 (bs, 2H), 7.47 (m, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.73 (d, 2H), 7.86 (d, 4H), 7.90 (d, 2H), 8.03 (s, 1H), 8.25 (bs, 1H); LC-MS (ES+) 988 (M+H) +, 1010 (M+Na)+.
실시예 9
화합물 3의 합성: DMF(2 mL) 내의 화합물 1(50 mg, 0.079 mmol)에 화합물 2(49 mg, 0.085 mmol) 및 HATU(33 mg, 0.086 mmol)를 첨가하고 이어서 DIPEA(45 uL)를 첨가하였으며, 이 반응 혼합물을 실온에서 4 시간동안 교반하였다. 용매를 진공 하에서 제거하고 생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 3(47 mg, 60%)을 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분동안 유지시킨다. MS: (M+H)+ 1003.
화합물 5의 합성: DMF(3 ml) 내의 화합물 3(15 mg, 0.014 mmol)의 용액을 DMF(2 mL) 내의 5% 피페리딘으로 처리하였고 이 반응 혼합물을 25℃에서 10분동안 교반하였다. 조생성물을 디에틸에테르를 사용하여 침전시키고 다음 단계에서 더 이상의 정제없이 사용하였다. 조생성물을 DMF(3 mL) 내에서 용해하고 이어서 DMF(2 mL) 내의 화합물 4(25 mg, 0.025 mmol) 및 DIEA(20 uL)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 이 반응 혼합물에 TFA를 첨가하고 이 반응 혼합물을 실온에서 45 분동안 교반하여 분석 HPLC에 의하여 지시된 바와 같이 화합물 5를 수득하였다. 조생성물을 다음의 구배를 사용하여 10 ml/분(물/아세토니트릴 내의 0.01% TFA)으로 용출시켜 Prep HPLC(SymmetrPrep C18, 7μm, 19 x 150 mm 컬럼)에 의하여 정제하여 화합물 5(3 mg, 94%)를 수득하였다: 10%의 아세토니트릴은 5분동안에, 10% 내지 50%의 아세토니트릴은 15 분동안, 50% 아세토니트릴은 5 분동안에, 50% 내지 100% 아세토니트릴은 5분동안 유지시킨다. MS: (MH)+ 889.
실시예 10
화합물 1의 합성: 1.5그램(3.77 mMol)의 Fmoc-시트룰린을 0.87 그램(4.5 mMol)의 EDC, 0.61 그램(4.5 mMol)의 HOBt가 첨가된 둥근 바닥 플라스크 안의 3mL의 DMF에 용해하였다. 그리고나서, 6 mL의 DCM을 첨가하고 이어서 0.88 그램(4.5mMol)의 t-부틸-4-아미노벤조에이트 및 촉매량의 염화 구리를 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 조생성물을 실리카 겔 상에서 DCM 내의 5 내지 10%의 MeOH를 사용하여 정제하여 2그램의 화합물 1을 92 %의 수율로 수득하였다. M+1 = 574
화합물 7의 합성: 210 mg(0.63 mMol)의 화합물 2를 HBr-에틸 아세테이트 용액으로 30분동안 처리하였다. 용매를 증발시키고 그 결과의 염 3을 고진공 하에서 건조시켰다. 상기에서 제조된 0.63 mmol의 화합물 3을 133 mg(0.69 mMol)의 EDC의 존재하에 10 mL의 DMF 내의 210 mg(0.69 mMol)의 화합물 4와 2시간동안 반응시켰다. 용매를 증발시키고 조생성물을 실리카 상에서 정제하여 160 mg의 화합물 5(47.6% 수율)를 수득하였다. M+1 = 518
40 mg(0.27 mMol)의 화합물 5를 1.7 mL의 알릴알콜 및 214 μL의 피리딘과 함께 17 mL의 DCM 내의 상업적으로 입수가능한 4-메틸피페라진 카르보닐클로라이드 하이드로클로라이드와 밤새 반응시켰다. 용매를 증발시키고 조생성물을 용출제로서 5%의 MeOH/DCM을 사용하여 실리카 상에서 정제하여 70 mg의 화합물 6(40 % 수율)을 수득하였다. M+1 = 645.
35 mg(0.054 mMol)의 화합물 6을 5mL의 1:2 TFA-DCM으로 5 분동안 처리하였다. 용매를 증발시키고 그 결과의 염 7을 고진공 하에서 밤새 건조시키고 다음 단계에서 사용하였다. M+1 = 544
화합물 8의 합성: 66 mg(0.11 mMol)의 화합물 1을 3 mL의 1:2 TFA:DCM과 함께 20분동안 교반하여 화합물 8로 변환시켰다. 용매를 증발시키고 산을 고진공 하에서 건조시켰다. M+1 = 517.8, M+Na = 540
화합물 10의 합성: 0.054 mMol의 화합물 7(MED-2477)을 포함한 플라스크에서 0.065 mmol의 화합물 8 및 44.7 mg(0.065 mMol)의 BOP를 용액으로서 2 mL의 무수 DMF 내 에 첨가하였다. 그리고나서 DIPEA(93 uL, 0.54 mMol)를 첨가하고 1 시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 조혼합물을 역상 prep HPLC에 의하여 정제하여 48 mg의 화합물 9(그의 TFA 염으로서, 77 % 수율)를 수득하였다. M+1 = 1043. 정제 후에, 16 mg의 화합물 9(0.015 mMol)를 1 mL의 DMF 내의 5% 피페리딘 용액으로 10 분동안 처리하였다. 용매를 증발시키고 고체 잔여물을 헥산 및 디에틸 에테르로 세척하였다. 생성물 10을 고진공 하에서 건조시켰다. M+1 = 821
화합물 11의 합성: 상기에서 제조된 0.015 mMol의 화합물 10을 1.5 mL의 무수 DMF 및 10 μL의 DIPEA 내의 11 mg의 상업적으로 입수가능한 N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트(0.035 mMol)와 1 시간동안 반응시켰다. 용매를 증발시키고 조생성물을 역상 HPLC에 의하여 정제하여 10.7 mg의 화합물 11(그의 TFA 염으로서, 63 % 수율)을 수득하였다. M+1 = 1014
실시예 11
: 항체에 대한 약물-링커 분자의 접합
아미노산 및 펩티드 링커에서: 이 실시예는 본 발명의 약물-링커 분자(스페이서, 반응성 기능기 등등과 같은, 다른 기들을 선택적으로 포함함)를 표적화 제제, X4로서 항체에 접합시키는 반응 조건 및 방법을 기술한다. 상기 조건 및 방법은 단지 예시적일 뿐이며 비-제한적인 것으로 의도된다. 항체에 약물-링커 분자를 접합시키는 다른 접근들은 당해 기술 분야에 알려져 있다.
본 명세서에서 기술된 접합법은 항체의 리신과 2-이미노티올란의 반응, 이어서 약물-링커 분자와 활성 말레이미드기의 반응을 통하여 항체에 유리 티올기를 도입하는 것을 기반으로 한다. 처음에는 접합될 항체를 50 mM NaCl, 2mM DTPA, pH 8.0을 포함한 0.IM 인산염 버퍼 pH 8.0으로 버퍼 교환하고 5-10 mg/ml로 농축시켰다. 항체에 2-이미노티올란을 첨가하여 티올화를 이루었다. 첨가될 2-이미노티올란의 양은 예비 실험에서 결정되었고 항체에 따라 변한다. 예비 실험에서, 항체에 대해 2-이미노티올란의 양을 증가시키면서 첨가하여 적정하였고, 이어서 항체를 실온에서 1시간동안 배양하였으며, 항체를 세파덱스 G-25 컬럼을 사용하여 50 mM HEPES 버퍼 pH 6.0 내로 탈염시키고 도입된 티올기의 수를 디티오디피리딘(DTDP)과의 반응에 의하여 빠르게 결정하였다. DTDP와 티올기의 반응으로 티오피리딘이 유리화되었고 이를 324nm에서 모니터하였다. 0.5-1.0 mg/ml의 단백질 농도에서의 샘플을 사용하였다. 280nm에서의 흡광도를 사용하여 샘플의 단백질 농도를 정확히 측정하고, 다음에 각 샘플의 분취액(0.9ml)을 실온에서 10분 동안 0.1 ml DTDP(5mM 에탄올내 원액)와 함께 배양하였다. 버퍼 단독에 DTDP를 합한 블랭크 샘플들도 또한 나란히 배양하였다. 10분 후에, 324nm에서의 흡광도를 측정하고 존재하는 티올의 수를 19800 M-1의 티오피리딘 소광 계수를 사용하여 정량화하였다.
전형적으로 항체당 3 개의 티올기의 티올화 수준이 바람직하다. 예를 들면, 한 특정 항체에서 2-이미노티올란의 15배 몰 초과량을 첨가하고 이어서 실온에서 1시간 동안 배양함으로써 이를 성취할 수 있다. 따라서 접합될 항체를 원하는 몰 비율에서 2-이미노티올란과 함께 배양하고 다음에 접합 버퍼(5mM 글리신, 0.5% 포비돈(10k) 및 2mM DTPA를 포함하는 50 mM HEPES 버퍼 pH 6.0)내로 탈염시켰다. 티올화된 물질을 얼음 위에서 유지하면서 도입된 티올의 수를 상기한 바와 같이 정량화하였다.
도입된 티올의 수를 확인한 후, 활성 말레이미드기를 포함하는 약물-링커 분자를 티올당 3-배 몰 초과량으로 첨가하였다. 접합 반응을 최종 농도 5% DMSO(또는 적절한 대체 용매)를 또한 포함하는 접합 버퍼에서 실시하였다. 일반적으로, 약물-링커 원액을 100 % 디메틸 설폭시드에 용해하였다. 항체에 부가하여, 최종 농도 10 %를 만들도록 충분히 첨가된 DMSO를 갖는, 원액을 티올화된 항체에 직접 첨가하거나, 또는 최종 농도 10% DMSO를 포함하는 접합 버퍼에 미리 희석시키고, 이어서 동일 부피의 티올화된 항체에 첨가하였다.
접합 반응물을 혼합과 함께 실온에서 2시간동안 배양하였다. 배양에 이어서 이 반응 혼합물을 원심분리하고 0.2 마이크로미터 필터를 통하여 정제하였다. 접합체의 정제는 여러 방법을 사용하여 크로마토그래피를 통하여 이루었다. 접합체를 5mM 글리신, 50 mM NaCl 및 0.5 % 포비돈(10k)을 포함하는 50 mM HEPES 버퍼 pH 7.2로 미리 평형을 맞춘 세파크릴 S200 컬럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 크로마토그래피를 28 cm/h의 선형 유속에서 실시하였다. 접합체를 포함하는 부분을 수집하고, 모으고, 농축하였다. 대안적으로 정제를 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 이룰 수 있다. 조건은 항체에 따라 변하고 각각의 경우에 최적화될 필요가 있다. 예를 들면, 항체-약물 접합체 반응 혼합물을 50 mM HEPES, 5mM 글리신, 0.5 % 포비돈(10k), pH 5.5에서 미리 평형을 맞춘 SP-세파로스 컬럼에 적용하였다. 항체 접합체를 평형 버퍼 내의 0-1 M NaCl의 구배를 사용하여 pH 5.5에서 용출시켰다. 접합체를 포함하는 관련 부분을 모으고 제형 버퍼(formulation buffer)(5mM 글리신, 100 mM NaCl 및 0.5% 포비돈(10k)을 포함하는 50 mM HEPES 버퍼 pH 7.2)에 대하여 투석하였다.
실시예 12
: 생체내 연구
786-O(ATCC 기탁번호 CRL-1932) 세포를 표준 실험실 공정을 이용하여 시험관 내에서 증폭시켰다. 6-8 주령의 수컷 CB17.SCID 마우스(Taconic, Hudson, NY)에 마우스당 0.2 ml의 PBS/마트리겔(Matrigel)(1:1) 내의 2백 5십만 개의 786-O 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 이식 후에 매주 2회씩 마우스의 체중을 재고 전자 캘리퍼를 이용하여 삼차원적으로 종양에 대해서 측정하였다. 종양 부피를 높이 ×폭×길이로 계산하였다. 평균 200 mm3의 종양을 갖는 마우스를 치료 그룹으로 무작위 분류하였다. 마우스에게 제0일에 PBS 비이클, 독소-접합 이소타입 대조군 항체 또는 독소-접합 항-CD70 HuMAb 2H5를 복강내로 투여하였다. 각 그룹은 8 마리의 마우스를 포함하였다.
다음 독소들이 연구되었다:
화합물 A
화합물 B
화합물 C
화합물 D
화합물 E
화합물 F
화합물 G
표 1은 독소(화합물 A-G)의 μmole에 기초한 투여 그룹의 개요이다.
| 그룹 | 투여량(독소 μmole, Ab mg/kg ) | |
| 1 | 비이클 IP SD | 매칭 0.03 vol |
| 2 | CD70.1 0.1 IP SD | 0.03 |
| 3-4 | CD70.1- 화합물 A IP SD | 0.03, 0.005 |
| 5-6 | CD70.1- 화합물 B IP SD | 0.03, 0.005 |
| 7-8 | CD70.1- 화합물 C IP SD | 0.03, 0.005 |
| 9-10 | CD70.1- 화합물 D IP SD | 0.03, 0.005 |
| 11-12 | CD70.1- 화합물 E IP SD | 0.03, 0.005 |
| 13-14 | CD70.1- 화합물 F IP SD | 0.03, 0.005 |
| 15-16 | CD70.1- 화합물 G IP SD | 0.03, 0.005 |
도 1, 2, 5 및 6은 평균 종양 부피 대 투여 후 일 수(days)를 보여주고 도 3, 4, 7 및 8은 중간 종양 부피 대 투여 후 일 수를 보여준다(0.03 μmol - 도 1, 3, 5 및 7; 0.005 μmol - 도 2, 4, 6 및 8). 도 9는 두 가지 0.03 및 0.0005 μmol 투여량에 대하여 중간 백분율 체중 변화 대 투여 후 일 수를 보여준다. 효능은, 0.03 μmol 투여량 실험에 기초하여, 다음의 내림차 순인 것으로 보인다: 화합물 E > 화합물 F > 화합물 A > 화합물 C, 화합물 D > 화합물 B > 화합물 G.
실시예 13
: 단일 아미노산 링커의 카텝신 B 매개 분리
각각의 아미노산 조성물은 다르나 유사한 구조를 가지는, 단일 아미노산 화합물들의 패널을 카텝신 B 활성에 대하여 검사하였다. 다음 화합물을 테스트하였다: 화합물 A, B, C, D, E 및 F. 카텝신 B-매개 생성물의 출현을 340 nm에서의 흡광도에 의하여 약물 생성물의 양으로 RP-HPLC에 적용하여 모니터하였다. 화합물을 다양한 시간 구간 동안에 카텝신 B로 배양하였고 그들의 대략적 반감기(t 1/2)를 하기 표 2에 기록하였다. 테스트된 화합물에서, 오직 화합물 A 및 화합물 D가 카텝신 B에 의하여 분리되었다.
| 화합물 | 카텝신 B 분리 | 대략적인 기질 반감기 |
| 화합물 A | Yes | 24 시간 |
| 화합물 B | No | |
| 화합물 C | No | |
| 화합물 D | No | |
| 화합물 E | Yes | 4 시간 |
| 화합물 F | No |
카텝신 B 효소 시험: 25 Mm 아세트산 나트륨/1 mM EDTA pH 5.0의 버퍼(10 mL) 내의 동결건조시킨 고체(56% 단백질에서 6 mg)를 용해함으로써 소 비장 카텝신 B(시그마 생산 코드 C-6286)의 원액(stock solution)을 제조하였다. 원액(50 uL)을 30 mM DTT/ 15 mM EDTA로 구성된 활성화 버퍼(100 ul)와 혼합함으로써 효소 활성화를 실시하였고 이어서 실온에서 15 분동안 배양하였다. 활성화된 카텝신 B를, 사용하기 전에, 25 mM 아세트산 나트륨/ 1 mM EDTA, pH 5.0의 용액으로 1:1로 희석하였다. 약물 방출을 시험하기 위하여, 시스테인 변경 화합물(cysteine modified compound)(DMSO 내의 2.5 mM의 용액 4 uL)을 25 mM 아세트산 나트륨/1 mM EDTA pH 5.0 버퍼(86 uL) 및 활성화된 카텝신 B(3.6 U/mL에서 10 uL)에 첨가하였다. 샘플을 적절한 시간 동안에 37℃에서 배양하고 메탄올(100 uL)로 정지시켰다.
화합물 샘플(40 uL)을 역상 컬럼(Waters Nova-pak C18, 3.9 x 150 mm 컬럼, 생산 코드 WAT086344)으로 맞추어진 Waters 2795 HPLC 시스템에 적용하였다. 샘플 크로마토그래피를 10-100% B 버퍼의 구배 용출제를 사용하여 물/0.1 % TFA(A 버퍼) 및 아세토니트릴/0.1% TFA(B 버퍼)로 구성된 이중 이동상 시스템을 사용하여 20 분동안 1.0 mL/분 으로 실시하였다. 화합물을 그의 340 nm의 흡광도(A340)에 의하여 탐지하였다.
본 명세서에서 언급되거나 지칭된 특허 출원, 특허, 공개 및 다른 공개된 문서 각각은 각 개별 특허 출원, 특허, 공개 및 다른 공개된 문서가 참조로서 병합된다고 특별하게 그리고 개별적으로 지시했던 것과 동일한 정도로 본 명세서에 그 전체가 참조로서 병합된다.
본 발명을 특정 구체예에 관하여 기술하였지만, 본 발명 및 첨부된 청구항들의 사상 및 범위를 벗어나지 않게 다양한 변형예를 만들수 있고 동등한 예를 대체할 수 있음을 당해 분야의 당업자들은 알 수 있을 것이다. 또한, 많은 변경예가 만들어져서 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞게, 특정 상황, 물질, 물질의 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 변경할 수 있다. 그러한 변경 모두는 본 명세서에 첨부된 청구항들의 범위 내에 속하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Medarex, Inc.
Chen, Liang
Gangwar, Sanjeev
Guerlavais, Vincent
Lonberg, Nils
Zhang, Qian
<120> CHEMICAL LINKERS WITH SINGLE AMINO ACIDS AND CONJUGATES THEREOF
<130> 2205829-WO0
<150> 60/891,028
<151> 2007-02-21
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
Peptide
<400> 1
Pro Arg Phe Lys
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
Peptide
<400> 2
Thr Arg Leu Arg
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
Peptide
<400> 3
Ser Lys Gly Arg
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
Peptide
<400> 4
Pro Asn Asp Lys
1
Claims (20)
- 다음 식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:또는
여기에서L1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬 기이고;m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산이고;L2는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이며;L3은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치 환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬이고;o는 0 또는 1이며;L4는 링커 멤버이고;p는 0 또는 1이며;X4는 보호된 반응성 기능기(protected reactive functional groups), 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 멤버이고; 및D는 다음 구조를 포함한다:
여기에서 상기 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬이며;E 및 G는 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택되는 멤버들이거나, 또는 E 및 G는 결합되어 치환 및 비치환 아릴, 치환 및 비치환 헤테로아릴 및 치환 및 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하고;X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버인데;R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 아실이고;R3은 OR11인데,여기에서 R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 디포스페이트, 트리포스페이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12, 또는 SiR12R13R14이고,이 때 R12, R13 및 R14는 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬 및 치환 및 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버이며, 상기 R12 및 R13은 그들이 부착되는 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며;R4, R4 ’, R5 및 R5 ’는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, SO3, SO2R15, NR15R16, NR16C(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2,로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, R4, R4 ’, R5 및 R5 ’ 중 임의의 인접한 쌍은, 그들이 부착된 탄소 원자와 함께 결합되어 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데;여기에서n은 1 내지 20의 정수이고;R15 및 R16은 H, 치환 및 비치환 알킬, 치환 및 비치환 헤테로알킬, 치환 및 비치환 아릴, 치환 및 비치환 헤테로아릴, 치환 및 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 및 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며;R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고, 존재하면 R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 및R7은 R6과 함께 상기 사이클로프로필 고리 내에서 결합된 CH2-X1 또는 -CH2- 인데, 여기에서X1은 이탈기이며,여기에서 R4, R4’, R5, R5’, R11 , R12, R13, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 D를 화합물의 잔여 부분에 연결시킨다. - 청구항 1에 있어서, 상기 D는 다음 구조를 가지는 화합물:
여기에서Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버인데,여기에서,R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 아실이고;R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8인데, 여기에서 R8은 치환 알킬, 비치환 알킬, NR9R10, NR9NHR10, 또는 OR9이고,이 때 R9 및 R10은 H, 치환 및 비치환 알킬 및 치환 및 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택된 멤버이며; 및R2는 H, 치환 알킬 또는 비치환 저급 알킬이다. - 청구항 1에 있어서, 상기 D는 다음 구조를 가지는 화합물:
여기에서,Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버인데,여기에서R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실이며;R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8인데, 상기 R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버인데,이 때R9 및 R10은 H, 치환 및 비치환 알킬 및 치환 및 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택된 멤버들이며;R1’은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8이고, 여기에서, R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이고,이 때R9 및 R10은 H, 치환 및 비치환 알킬 및 치환 및 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이며;R2는 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 비치환 헤테로알킬, 시아노 또는 알콕시이고; 및R2’는 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬 또는 비치환 헤테로알킬이다. - 청구항 1에 있어서, 상기 D는 다음 구조를 가지는 화합물:(13)
여기에서Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버인데,여기에서R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 아실이고;R32은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NR16C(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 또는 O(CH2)nN(CH3)2로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 20의 정수이며, 및R5, R5 ’, R11 , R12, R13, R15, R16, 또는 R32 중 적어도 하나는 D를 상기 화합물 의 잔여 부분에 연결한다. - 청구항 4에 있어서, 상기 D는 다음 구조를 가지는 화합물:
R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8이고, 여기에서 R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며,여기에서R9 및 R10은 H, 치환 및 비치환 알킬 및 치환 및 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택된 멤버이고;R1’은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8이며, 여기에서 R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며,여기에서R9 및 R10은 H, 치환 및 비치환 알킬 및 치환 및 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택된 멤버이고;R2는 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 비치환 헤테로알킬, 시아노 또는 알콕시이며; 및R2’는 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬 또는 비치환 헤테로알킬이다. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 하나의 항에 있어서,상기 AA1는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물: Ala, Arg, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val.
- 청구항 6에 있어서,상기 AA1는 Cit, Glu, Lys, 및 Ser으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물.
- 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 하나의 항에 있어서,R4, R4 ’, R5, R5 ’, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 D를 상기 화합물의 잔여 부 분에 연결하는 화합물.
- 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 하나의 항에 있어서,상기 m은 0이 아니며 L1은 자기-희생 링커인 화합물.
- 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 하나의 항에 있어서,상기 L2는 존재하고, 자기-희생 링커인 화합물.
- 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 하나의 항에 있어서,상기 L3은 존재하고, -L3-NH-는 다음으로부터 선택되는 화합물:
여기에서Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고,여기에서R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 아실이다. - 청구항 11에 있어서, 상기 -L3-NH- 는
인 화합물. - 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 다음으로부터 선택된 화합물:
여기에서 X1은 Cl 또는 Br이다. - 청구항 13에 있어서,상기 X1은 Cl인 화합물.
- 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 하나의 항에 있어서,상기 X4는 표적화 제제인 화합물.
- 청구항 15에 있어서,상기 X4는 항체인 화합물.
- 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 하나의 항에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형.
- 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 하나의 항에 따른 화합물을 셀을 죽일 만큼 충분한 양으로 상기 셀에 투여하는 것을 포함하는, 상기 셀을 죽이는 방법.
- 청구항 18에 있어서,상기 셀은 종양 세포인 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 하나의 항에 따른 화합물을 포유류 대상체 내의 종양의 성장을 지연시키거나 정지시킬 만큼 충분한 양으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유류 대상체 내의 상기 종양이 성장을 지연시키거나 정지시키는 방법.
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