JP4061819B2 - インターストランドクロスリンク剤の合成方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学合成により製造し得る化合物を用いて２本鎖ＤＮＡを同時にアルキル化し、切断し得る化合物、これらの化合物を用いたＤＮＡのアルキル化方法、２本鎖ＤＮＡの切断方法、及び、これらの化合物を用いた医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムプロジェクトにより我々の「生命の設計図」である全遺伝子の塩基配列が数年内に解明されようとしている。この設計図に傷があったり、後天的に傷がはいると、病気や老化を引き起こすことが知られている。ヒトゲノムプロジェクトの進展により癌を含む多くの疾病はＤＮＡレベルで理解されるようになり、診断、予防などを中心とした医学全体が、革命的に変化するものと考えられる。さらに、これらの疾病のＤＮＡレベルでの理解に基づいた治療法、すなわち病因遺伝子やその産物をターゲットとした医薬品の開発への期待も大きいが、基礎研究を臨床研究に活かしてゆくための橋渡し的な研究はまだ、途についたばかりである。
癌についても、ＤＮＡレベルでの研究が行われているが、現在用いられている抗癌剤は、スクリーニングによって選択された抗生物質が多く、もともと癌細胞を殺すために微生物が産生したものではなく、癌の分子生物学的知見に基づいたものはほとんどない。細胞内の特定遺伝子の発現を細胞外から自由自在にコントロールすることが可能になれば、究極の遺伝子レベルでの治療法となると考えられる。
【０００３】
ところで、遺伝情報を担うＤＮＡが化学的に修飾を受けると、生命維持の根幹にあたる遺伝情報が損なわれ、細胞の突然変異や死滅が引き起こされる。また、正常細胞中のＤＮＡへの共有結合による修飾は、がん化の原因となっていることが知られている一方で、逆にがん細胞中のＤＮＡに作用することで、抗がん剤としても利用することができる。
ＤＮＡの二本鎖をクロスリンクさせる次式
【０００４】
【化４】
【０００５】
で示されるようなインターストランドクロスリンク反応は、ＤＮＡの複製を完全に阻害することが様々な系で確認されており、一本鎖のアルキル化と比較して生体に対して非常に強い作用を有していることが知られている（S.R.Rajski and R.M.Williams, Chem. Rev., 98, 2723-2795(1998).）。
例えば、ファージの失活には平均１．３等量のインターストランドクロスリンク化が起これば充分であるのに対し、単純な一本鎖のアルキル化では２８０等量のアルキル化剤を必要とするとされている（P.D.Lawley, J.H.Lethbridge, P.A.Edwards, K.V.Shooter, J. Mol. Biol., 39, 181(1969).）。
【０００６】
典型的なインターストランドクロスリンク反応を起こす抗がん性抗生物質としてマイトマイシンやカルチノフィリンＡが知られている。また、これまでにビゼレシンを代表とするＤＮＡインターストランドクロスリンクする化合物が数多く合成されている。ＤＮＡインターストランドクロスリンク反応を起こすことが報告されている代表的な化合物としては、次に示すマイトマイシン、カルチノフィリンＡやナイトロジェンマスタードなどが知られている。
【０００７】
【化５】
【０００８】
これらのマイトマイシンやナイトロジェンマスタード（mechlorethamine）などは、有効な抗がん剤として現在も臨床で利用されている。
現在までに様々なインターストランドクロスリンク剤の塩基配列特異性が詳細に調べられている（a) S.-J.Lee, F.C.Seaman, D.Sun, H.Xiong, R.C.Kelly, L.H.Hurley, J. Am. Chem. Soc., 119, 3434-3442(1997); b) J.T.Millard, R.J.Spencer, P.B.Hopkins, Biochemistry, 37, 5211-5219(1998); c) T.Fujiwara, I.Saito, H.Sugiyama, Tetrahedron Lett., 40, 315-318(1999).）。しかし、それらの化合物の抗がん性とインターストランドクロスリンク剤の塩基配列選択性との相関については全く明らかにされていない。さらに、任意の塩基配列でインターストランドクロスリンクする化合物の分子設計には成功していない。また、これまでに合成されているＤＮＡインターストランドクロスリンク剤は一般的に反応の効率が著しく低い。例えば、ＤＮＡ中の５’−ＧＮＣ塩基配列に対してクロスリンク能を有することが知られているマスタードによるインターストランドクロスリンク体は使用しているＤＮＡに対してわずかに数％しか生成しているにすぎない（Y.-H.Fan and B.Gold, J. Am. Chem. Soc., 121, 11942-11946(1999).）。
従って、効率よいＤＮＡインターストランドクロスリンク剤の開発が極めて重要になってきている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率よいＤＮＡインターストランドクロスリンク剤、そのための化合物、及びそれを用いた医薬組成物を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、すでにＤＮＡ塩基配列認識能をもつピロール−イミダゾールジアミド部とデュオカルマイシンセグメントの間にビニル基を導入した次式（１）
【００１１】
【化６】
【００１２】
で表されるハイブリット分子（１）のＤＮＡアルキル化能を解析してきた。このハイブリット分子（１）はホモダイマーを形成して次式で表されるような、
【００１３】
【化７】
【００１４】
ＤＮＡ中の特定の塩基配列に対して選択的にダブルアルキル化することを明らかにしてきた。この化合物は、ビニル基をリンカーＬとするＡ−Ｌ−Ｂ−Ｒ型
（式中、ＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を示し、ＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカーを示し、Ｒはアルキル基などの末端基を示す。）
の構造を有する分子である（特願平１１−８３５９１号参照）。
そこで、本発明者らは、この型の分子を基本として検討してきたところ、この型の分子を異なる長さのスペーサーで連結した化合物が効率よいＤＮＡインターストランドクロスリンク能を有する化合物であることを見出した。
【００１５】
本発明は、一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ）
（式中、各々のＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を示し、各々のＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカーを示し、ＸはＡ−Ｌ−Ｂコンポーネントを結合させるスペーサーを示す。）
で表されるＤＮＡの２本鎖をインターストランドクロスリンクすることができる化合物に関する。
また、本発明は前記化合物を用いるＤＮＡをインターストランドクロスリンクする方法、ＤＮＡのインターストランドクロスリンク剤、及びこれを含有してなる医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明者らは、インターストランドクロスリンク能を有する化合物を開発する目的で、例えばハイブリット分子（１）を異なる長さのスペーサーで連結した化合物（７ａ−ｄ）を、次に示すスキーム、
【００１７】
【化８】
【００１８】
（式中、Ｘは、
【００１９】
【化９】
【００２０】
を示す。）
に従って合成した。化合物（７ａ−ｄ）の合成は、ジアミド誘導体（３）にそれぞれ対応するスペーサーとなる活性化したカルボニル化合物を縮合させることにより行った。
まず、Ｎ−メチル−２−ピロールアルデヒドを硝酸などでニトロ化した後、（ＥｔＯ）２Ｐ（Ｏ）ＣＨＣＯ２Ｅｔなどのウイティッヒ型の試薬を用いてエステル体（２）とする。得られたエステル体（２）をＮａＢＨ４などの金属水素化物などで還元してアミノ体とし、これに１−メチル−３−ニトロ−５−トリクロロアセチルイミダゾールを反応させてイミダゾール−ピロール化合物（３）とする。これを前記と同様な方法によりニトロ基を還元してアミノ基とし、これに目的物に応じた酸ハロゲン化物、またはカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を反応させることにより二量体化合物（４ａ−ｄ）とする。次いで、両末端のエステル基を加水分解して遊離カルボン酸体（５ａ−ｄ）とし、これをＣＤＩを用いて活性アミド体（６ａ−ｄ）とした後、これに抗生物質ＤＵ８６のセグメントＡ部分を反応させて目的の化合物（７ａ−ｄ）とした。
この合成法は、同種の対称二量体の合成に対して応用可能な汎用性の高い手法であり、本発明の化合物はこの方法に準じて製造することができる。
【００２１】
本発明を前記した化合物（７ａ−ｄ）を例にして、具体的に説明する。
これらの化合物を用いた２本鎖ＤＮＡのインターストランドクロスリンク反応を次の１８塩基及び１５塩基のＤＮＡ対を用いて実験した。
このＯＤＮ−１８の５’末端側をテキサスレッド（ＴＸＲｅｄ）で標識したヌクレオチドをＴＸＲ−１８と呼ぶことにする。
また、この実験には補助試薬として次式、
【００２２】
【化１０】
【００２３】
で表される化合物（この化合物を本明細書では、ＩｍＩｍＰｙという。）を用いた。このＩｍＩｍＰｙは、本明細書における「ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を有する物質」として使用された。
前記したＤＮＡに、本発明の化合物（７ａ−ｄ）、及び必要によりＩｍＩｍＰｙを添加して、ＤＮＡオリゴマーに対する化合物（７ａ−ｄ）のインターストランドクロスリンク反応について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析を行った。
【００２４】
結果を図１に図面に代わる写真として示す。図１の、
レーン１はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）のみの場合を示し、
レーン２はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）にＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン３はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）を添加した場合を示し、
レーン４はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン５はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ｂ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン６はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ｃ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン７はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ｄ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示す。
【００２５】
その結果、化合物（７ａ）は単独では反応はほとんど観察できなかったが（レーン３）、ＩｍＩｍＰｙが存在すると、出発原料のＤＮＡフラグメントＴＸＲ−１８は泳動度の低いバンドに変化した（レーン４）。他のスペーサーをもつ化合物（７ｂ−ｄ）では、化合物単独でもＩｍＩｍＰｙを併用してもレーン４で観察されたような泳動度の低いバンドは殆ど生成しなかった（レーン５、６、７）。これらの事実は化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙを併用した場合に極めて特異的なＤＮＡオリゴマーＴＸＲ−１８に対する反応が起こったことを示している。
【００２６】
次に、先に観察されたバンドがインターストランドクロスリンク体に由来するものであることを確認するために、上のストランド（ＴＸＲ−１８）と下のストランド（ＴＸＲ−１８Ｒ）を別々にラベルしたオリゴマーからなる２組のＤＮＡ対を用いた実験を行った。即ち、前記のＴＸＲ−１８とＯＤＮ−１５の対と、次に示すＯＤＮ−１５ＲとＴＸＲ−１８Ｒとの対を用いた。
５’−ＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡ−３’ （ＯＤＮ−１５Ｒ）
３’−ＧＴＣＡＣＣＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴ−５’ （ＯＤＮ−１８Ｒ）
使用したＴＸＲ−１８Ｒは、前記したＯＤＮ−１８Ｒの５’末端側をテキサスレッド（ＴＸＲｅｄ）で標識したヌクレオチドである。
さらにこの実験には標品として次のヌクレオチドＴＸＲ−１４及びＴＸＲ−１４Ｒを用いた。
５’−ＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＣ−３’ （ＯＤＮ−１４）
３’−ＣＣＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴ−５’ （ＯＤＮ−１４Ｒ）
これらの塩基配列はいずれもＯＤＮ−１８又はＯＤＮ１８Ｒの５’末端側の塩基配列と同じになるように設計されている。ＴＸＲ−１４は、前記したＯＤＮ−１４の５’末端側をテキサスレッド（ＴＸＲｅｄ）で標識したヌクレオチドであり、同様に、ＴＸＲ−１４ＲはＯＤＮ−１４Ｒの５’末端側をテキサスレッド（ＴＸＲｅｄ）で標識したヌクレオチドである。
【００２７】
この結果を図２に図面に代わる写真として示す。図２の
レーン１は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）のみの場合を示し、
レーン２は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン３は、前記レーン２において、さらに９０℃で２０分加熱処理した後、９０℃で２０分間ピペリジン処理した場合を示し、
レーン４は、前記レーン３において、さらに３７℃で２時間アルカリ脱リン酸化酵素処理した場合を示し、
レーン５は、標品のＴＸＲ−１４を示し、
レーン６は、ＴＸＲ−１８Ｒ（３μＭ）とＯＤＮ−１５Ｒ（６μＭ）のみの場合を示し、
レーン７は、ＴＸＲ−１８Ｒ（３μＭ）とＯＤＮ−１５Ｒ（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン８は、前記レーン７において、さらに９０℃で２０分加熱処理した後、９０℃で２０分間ピペリジン処理した場合を示し、
レーン９は、前記レーン８において、さらに３７℃で２時間アルカリ脱リン酸化酵素処理した場合を示し、
レーン１０は、標品のＴＸＲ−１４Ｒを示す。
【００２８】
この実験により、インターストランドクロスリンク体と考えられる新たな生成物を確認した（レーン２及び７）。これに対し、加熱処理、ピペリジン処理を行うと、切断されたフラグメントが得られた（レーン３及び９）。さらに、このフラグメントをＡＰ（alkaline phosphatase）処理すると泳動度が減少した（レーン４及び８）。この生成物は別に合成した標品とポリアクリルアミドゲル電気泳動で同一物であることを確認した（レーン５及び１０）。
この実験結果は、化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙによって、ＤＮＡオリゴマー上の２個所のアデニン部位で配列選択的にアルキル化されていたことを示している。つまり、反応によって泳動速度の大きな変化が観察された事実と併せて考えれば、ほぼ定量的にＤＮＡに対するインターストランドクロスリンク反応が進行することが確認された。
【００２９】
これらの結果、ピロール−イミダゾールポリアミドＣＰＩコンジュゲート体（７ａ）はピロール−イミダゾールの塩基配列認識のルール（a) P.B.Dervan, et al., Nature, 282, 111-115(1998); b) T.Fujiwara, Z.-F.Tao, Y.Ozeki, I.Saito, A.H.-J.Wang, M.Lee, H.Sugiyama, J. Am. Chem. Soc., 121, 7706-7707(1999).参照）に従ったトリアミドの存在下のみＤＮＡを効率よくインターストランドクロスリンクすることが明らかとなった。化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙによるインターストランドクロスリンク体の構造を図３に示す。
【００３０】
次に、インターストランドクロスリンク体の塩基配列特異性を検討した。
この化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙによるインターストランドクロスリンクの配列特異性を検討するために、ＩｍＩｍＰｙと他の３種のトリアミド存在下での化合物（７ａ）のクロスリンク反応に変化を調べた。この実験で使用したトリアミドの構造を次に示す。
【００３１】
【化１１】
【００３２】
即ち、ＩｍＩｍＰｙは、Ｘ＝Ｎで、Ｙ＝Ｎで、Ｚ＝ＣＨのものであり、
ＩｍＩｍＩｍは、Ｘ＝Ｎで、Ｙ＝Ｎで、Ｚ＝Ｎのものであり、
ＩｍＰｙＰｙは、Ｘ＝Ｎで、Ｙ＝ＣＨで、Ｚ＝ＣＨのものであり、
ＰｙＩｍＰｙは、Ｘ＝ＣＨで、Ｙ＝Ｎで、Ｚ＝ＣＨのものである。
この結果を、図４に図面に代わる写真として示す。図４の
レーン１は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）のみの場合を示し、
レーン２は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン３は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＩｍ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン４は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＰｙＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン５は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＰｙＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示す。
【００３３】
この結果、ＩｍＩｍＩｍを用いた系（レーン３）においても効率は若干低下するもののクロスリンク体の生成が明確に観察された。しかし、他のトリアミドを用いた系（レーン４及び５）では、クロスリンク体の生成はほとんど確認することはできなかった。これらの結果は、図３に示すモデルに基づいて任意の配列でＤＮＡのインターストランドクロスリンク反応が行える可能性を示している。
【００３４】
さらに、インターストランドクロスリンク反応の最適条件の検討を行った。
化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙによるインターストランドクロスリンク反応における最適の塩基配列の間隔を調べる実験を行うために次の塩基対を用いた実験を行った。
５’末端側のＴＸＲｅｄは、テキサスレッドでの標識を示す。
ｎ＝０の場合の、上段のものをＴＸＲ−１７と称し、下段のものをＯＤＮ−１４と称する。ｎ＝１の場合の、上段のものをＴＸＲ−１８と称し、下段のものをＯＤＮ−１５と称する。ｎ＝２の場合の、上段のものをＴＸＲ−１９と称し、下段のものをＯＤＮ−１６と称する。ｎ＝３の場合の、上段のものをＴＸＲ−２０と称し、下段のものをＯＤＮ−１７と称する。
【００３５】
この結果を、図５に図面に代わる写真として示す。図５の
レーン１は、ｎ＝０のもので、ＴＸＲ−１７（３μＭ）とＯＤＮ−１４（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン２は、ｎ＝１のもので、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン３は、ｎ＝２のもので、ＴＸＲ−１９（３μＭ）とＯＤＮ−１６（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン４は、ｎ＝３のもので、ＴＸＲ−２０（３μＭ）とＯＤＮ−１７（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示す。
【００３６】
この結果、ｎ＝０の場合（レーン１）には全くクロスリンク体を確認することはできなかったが、ｎ＝２の場合（レーン３）においては先に述べてきたｎ＝１の場合（レーン２）と同様の定量的なインターストランドクロスリンク反応が起こっていることがわかった。しかしながら、ｎ＝３の場合（レーン４）には２０％程のクロスリンク体が観察されたにとどまった。
【００３７】
さらに、試薬濃度と等量比の反応条件についても検討を行った結果、最終的にTexas Red-18（３μＭ）に対して、化合物（７ａ）、ＩｍＩｍＰｙをそれぞれ２５μＭにまで下げた条件まで定量的なクロスリンク反応を確認することができた。
これらの結果、化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙなどによる協同的インターストランドクロスリンク反応を確立することができた。
さらに最適のトリアミドとクロスリンカーを設計することで、任意の塩基配列を有するＤＮＡサイトにのみ選択的にインターストランドクロスリンクする能力をもつテーラーメイドドラッグを実現することができるようになる。
【発明の実施の態様】
【００３８】
本発明の一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ）
（式中、各々のＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を示し、各々のＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカーを示し、ＸはＡ−Ｌ−Ｂコンポーネントを結合させるスペーサーを示す。）
で表されるＤＮＡの２本鎖をインターストランドクロスリンクすることができる化合物は、２個の（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントをスペーサーＸで相互に連結させた構造を有することを特徴とするものである。
【００３９】
（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントの中のＢ部分は、ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を有するものであり、好ましくは置換基を有してもよいピロール（本明細書ではＰｙと略称する。）及び／又はイミダゾール（本明細書ではＩｍと略称する。）から誘導される化学構造などであり、これらの置換基を有してもよいピロール環や置換基を有してもよいイミダゾール環をアミド結合で結合させた化学構造が好ましい。この部分の化学構造とこれに結合するＤＮＡの塩基配列については、a) P.B.Dervan, et al., Nature, 282, 111-115(1998); b) T.Fujiwara, Z.-F.Tao, Y.Ozeki, I.Saito, A.H.-J.Wang, M.Lee, H.Sugiyama, J. Am. Chem. Soc., 121, 7706-7707(1999).などの公知技術を参照することができる。
【００４０】
（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントの中のＡ部分は、ＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を有する部分であり、ＤＮＡ中の塩基と共有結合形成できるものが好ましい。好ましいＡ部分としてはＤＮＡをアルキル化する抗癌抗生物質のアルキル化部分であって、シクロプロパン環やアジリジン環などを有する化学構造がさらに好ましい。
（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントの中のリンカーＬは、Ａ部分及びＢ部分の化学構造を結合させ得るものであればよく、これによりＤＮＡの塩基をアルキル化する部分とＤＮＡの塩基配列を認識し得る部分とを一体化することが可能となる。即ち、ＤＮＡの特定の塩基配列の部分を特異的に認識し、当該認識部位に応じた塩基を特異的にアルキル化して結合することが可能となる。
リンカーＬとしては、適当な長さを有し、即ち原子数が２〜１０個、好ましくは２〜５個程度を有し、Ａ部分とＢ部分を化学結合させ得るものであればよい。好ましいリンカーＬとしてはビニル基を含有する化学構造が挙げられる。
好ましい（Ａ−Ｌ−Ｂ）−コンポーネントとしては、次式（II）
【００４１】
【化１２】
【００４２】
又は次式（III）
【００４３】
【化１３】
【００４４】
で表される基などが挙げられる。
（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントを結合させるスペーサーＸとしては、適当な長さを有し、即ち原子数が１〜１５個、好ましくは２〜８個程度を有し、２個の（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントを化学結合させ得るものであればよい。例えば、カルボニル基又は炭素数２〜１５、好ましくは２〜８の有機ジカルボン酸から誘導されるアシル基などが挙げられる。有機ジカルボン酸としては飽和又は不飽和の脂肪族ジカルボン酸、飽和又は不飽和の環式脂肪族ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、芳香脂肪族ジカルボン酸、複素環式ジカルボン酸などが挙げられる。
スペーサーＸとしては、−ＣＯ−基、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−基、−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−基、又は、−ＣＯ−（ｐ−Ｃ６Ｈ４）−ＣＯ−基などが挙げられるが、脂肪族飽和ジカルボン酸のアシル基が好ましく、より具体的には−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−基などが好ましい。
【００４５】
本発明は、前記した本発明の化合物のいずれかを用いて、２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分をインターストランドクロスリンクする方法を提供する。この本発明の方法においては、さらにＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を有する物質、例えばＩｍＩｍＰｙ、ＩｍＩｍＩｍなどのトリアミドの存在下に行うのが好ましい。
本発明の方法によりインターストランドクロスリンクする場合には、（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントの中のＢ部分のＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造により、ＤＮＡの特定の塩基配列部分に特異的にインターストランドクロスリンクすることができる。例えば、本発明の化合物として前記した化合物（７ａ）などを用いた場合には、ＤＮＡのＴＧＧＣ若しくはＧＣＣＡ又はそれらの相補鎖部分にインターストランドクロスリンクすることができる。
【００４６】
また、本発明は、前記した本発明の化合物からなる、２本鎖ＤＮＡのインターストランドクロスリンク剤を提供する。本発明のインターストランドクロスリンク剤は効率よく、しかもＤＮＡの特定の塩基配列部分インターストランドクロスリンクすることができる。
本発明のインターストランドクロスリンク剤は、ＤＮＡの特定の塩基配列の部分にインターストランドクロスリンクすることができるので、遺伝子の異常による各種の疾患の治療又は予防に有用である。特に癌遺伝子に対してその発現の予防、治療に有用となる。したがって、本発明は前記した本発明の化合物及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、遺伝子の異常に伴う各種疾患、例えば癌の治療又は予防に有用である。
【００４７】
【実施例】
次に、実地例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１ 化合物（７ａ）の製造
（１） 化合物（２）の製造
濃硫酸（１．５ｍｌ、３５．７ｍｍｏｌ）の無水酢酸溶液（３ｍｌ）中に１−メチル−２−ピロールアルデヒド（３．０ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）の無水酢酸溶液（５ｍｌ）を−４０℃下で４０分間ゆっくりと滴下した。反応混合物を−１０℃下で２時間攪拌した後、そこにヘキサン（１００ｍｌ）を加えた。生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め、ヘキサン（１０ｍｌ ｘ ２）で洗浄することにより黄色粗結晶（１．４３ｇ、３４％）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
水素化ナトリウム（３７２ｍｇ、９．２９ｍｍｏｌ、６０％ oil suspension）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液中に２−ジエチルホスホノ酢酸エチルエステル（triethylphosphonoacetate）（１．９３ｍｌ、９．７５ｍｍｏｌ）を０℃下でゆっくりと加えた。さらに、１−メチル−４−ニトロ−２−ピロールアルデヒド（１．４３ｇ、９．２９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去し蒸留水（１０ｍｌ）を加えた。水層を酢酸エチル（１００ｍｌ ｘ ２）を用いて抽出した。有機層を集め無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、濾過、濃縮し残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２５→５０％ ＥｔＯＡｃ in hexane, gradient elution）にて精製することにより化合物（２）（１．６９ｇ、８１％）を得た。
【００４９】
１H NMR(CDCl３) δ
1.34(t, J=7.0Hz, 3H), 3.77(s, 3H), 4.26(q, J=7.0Hz, 2H),
6.31(d, J=16.0Hz, 1H), 7.11(d, J=1.5Hz, 1H),
7.48(d, J=16.0Hz, 1H), 7.56(d, J=1.5Hz, 1H).
１３C NMR(CDCl３) δ
14.3, 35.4, 60.8, 106.1, 118.4, 125.3, 129.8, 130.1,
136.7, 166.5.
MS(FAB+) 225[M＋].
【００５０】
（２） 化合物（３）の製造
化合物（２）（５００ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）の無水メタノール（２５ｍｌ）溶液中に１０％パラジウム−炭素（２２０ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（１５３ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）の蒸留水（３ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をセライトにて濾過した後、酢酸エチル（５００ｍｌ）を加えた。有機層を蒸留水（１０ｍｌ）にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、濾過、濃縮し褐色粗結晶（４６１ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液中にエチルジイソプロピルアミン（０．５２ｍｌ、２．９８ｍｍｏｌ）と別途合成した１−メチル−４−ニトロ−２−トリクロロアセチルイミダゾール（Ｏ２ＮＩｍＣＯＣＣｌ３）（５５０ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を、順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３０→５０％ ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中））にて精製することにより、化合物（３）（４００ｍｇ、５２％ for ２ steps）を得た。
【００５１】
１H NMR(CDCl３) δ
1.33(t, J=7.0Hz, 3H), 3.71(s, 3H), 4.21(s, 3H),
4.25(q, J=7.0Hz, 2H), 6.16 (d, J=16.0Hz, 1H),
6.62(d, J=l.5Hz, 1H), 7.32(d, J=l.5Hz, 1H),
7.55(d, J=16.0Hz, 1H), 7.82(s, 1H), 8.97(brs, 1H).
１３C NMR(CDCl３) δ
14.3, 34.4, 37.1, 60.3, 102.5, 114.2, 117.9, 122.1, 124.4,
127.6, 131.4, 137.2, 145.3, 154.4, 167.4.
MS(FAB+) 347[M+].
【００５２】
（３） 化合物（４ａ）の製造
化合物（３）（２５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（１：１、１０ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（１２０ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（５４．５ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．５ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にて濾過した後、溶媒を留去して褐色粗結晶（１４１ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（２ｍｌ）溶液中にエチルジイソプロピルアミン（０．２５ｍｌ、１．３３ｍｍｏｌ）とアジポイル−ジクロライド（adipoyl chloride）（３２μｌ、０．２２ｍｍｏｌ）を、順次０℃で加えた後、反応混合物を室温下で１４時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０→３％ ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）にて精製することにより化合物（４ａ）（９６．２ｍｇ、３６％ for ２ steps）を得た。
【００５３】
１H NMR(CDCl３) δ
1.32(t, J=6.5Hz, 6H), 1.81(s, 4H), 2.42(s, 4H), 3.67(s, 6H),
4.04(s, 6H), 4.24(q, J=6.5Hz, 4H), 6.10(d, J=15.5Hz, 2H),
6.51(s, 2H), 7.34(s, 2H), 7.41(s, 2H), 7.53(d, J=15.5Hz, 2H),
8.04(brs, 2H), 8.80(brs, 2H).
１３C NMR(5%CD３OD in CDCl３) δ
14.1, 24.8, 34.1, 34.5, 34.6, 60.3, 102.3, 112.9, 114.3,
118.0, 122.8, 127.1, 131.8, 133.7, 135.8, 155.8, 168.0, 171.0.
MS(ESI+) 744.6[M＋].
【００５４】
（４） 化合物（５ａ）の製造
４ａ（７６．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．６ｍｌ）懸濁液中に１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセン−７（ＤＢＵ：1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene）（０．６ｍｌ、４．０１ｍｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１５時間攪拌した。反応の終結をＨＰＬＣ（０→１００％ ５０ｍｍｏｌギ酸アンムニウム水溶液−アセトニトリル, ２０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で確認した後、反応溶液の溶媒を留去して得た褐色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を用いて結晶化させた。得られたＤＢＵ塩化合物を１％希塩酸を用いて脱塩した後、生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め減圧下乾燥することにより５ａ（４０．０ｍｇ、５７％）を得た。
【００５５】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.58(s, 4H), 2.32(s, 4H), 3.68(s, 6H), 3.94(s, 6H),
6.03(d, J=15.5Hz, 2H), 6.80(s, 2H), 7.41(s, 2H), 7.43(s, 2H),
7.46(d, J=15.5Hz, 2H), 9.89(brs, 2H), 10.24(brs, 2H).
MS(ESI+) 688.5[M+].
【００５６】
（５）化合物（６ａ）の製造
５ａ（３０．０ｍｇ、４３，６μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液中に１，１’−カルボニルジイミダゾール（1,1'-carbonyldiimidazole）（ＣＤＩ）（４２ｍｇ、２６１μｍｏｌ）を加えた反応溶液を、室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（６ａ）（３５．７ｍｇ、１００％）を得た。
【００５７】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.59(s, 4H), 2.34(s, 4H), 3.78(s, 6H), 3.96(s, 6H),
7.11(s, 2H), 7.16(d, J=14.5Hz, 2H), 7.32(s, 2H),
7.45(s, 2H), 7.49(s, 2H), 7.87(d, J=14.5Hz, 2H),
7.90(s, 2H), 8.68(s, 2H), 10.07(brs, 2H), 10.23(brs, 2H).
【００５８】
（６） 化合物（７ａ）の製造
水素化ナトリウム（２．６ｍｇ、６４．４μｍｏｌ、６０％ oil suspension）の無水ジメチルホルムアミド（０．２ｍｌ）溶液中に、別途合成したＤＵ８６のセグメントＡ（１２．５ｍｇ、４８．３μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．２ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、化合物（６ａ）（１３．６ｍｇ、１７．２μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．２ｍｌ）溶液を加えた反応溶液を０℃下で４時間攪拌した。反応溶液中に１０ｍＭリン酸ナトリウム（２ｍｌ）緩衝溶液を０℃下で加えた後、減圧下溶媒を留去し黄色残留物を得た。粗結晶を桐山ロート上で蒸留水（１０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（７ａ）（１２．２ｍｇ、６１％）を得た。
【００５９】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.29(m, 2H), 1.58(s, 4H), 2.09(m, 2H), 2.33(s, 4H),
2.47(s, 6H), 3.45(m, 2H), 3.72(s, 6H), 3.73(s, 6H),
3.95(s, 6H), 4.18(m, 2H), 4.28(m, 2H),
6.57(d, J=14.5Hz, 2H), 6.83(brs, 2H), 6.99(s, 2H),
7.41(s, 2H), 7.44(s, 2H), 7.58(d, J=14.5Hz, 2H),
9.98(s, 2H), 10.23 (s, 2H), 12.36(brs, 2H).
MS(ESI+) 1168.6[M＋].
【００６０】
実施例２ 化合物（７ｂ）の製造
（１） 化合物（４ｂ）の製造
実施例１の（２）で製造した化合物（３）（４２０ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（１：１、３０ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（２００ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（１０６ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）の蒸留水（１ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にて濾過した後、溶媒を留去して褐色粗結晶（３２７ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液中にエチルジイソプロピルアミン（０．６ｍｌ、３．６３ｍｍｏｌ）とテレフタル酸ジクロライド（terephtaloyl chloride）（１２２ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を、順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０→３％ ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）にて精製することにより化合物（４ｂ）（２２３ｍｇ、４８％ for ２ steps）を得た。
【００６１】
１H NMR(CDCl３) δ
1.33(t, J=7.5Hz, 6H), 3.71(s, 6H), 4.12(s, 6H),
4.25(q, J=7.5Hz, 4H), 6.13(d, J=16.0Hz, 2H),
6.55(s, 2H), 7.38(s, 2H), 7.56(d, J=16.0Hz, 2H),
7.61(s, 2H), 8.02(s, 4H), 8.38(brs, 2H), 8.82(brs, 2H).
【００６２】
（２） 化合物（５ｂ）の製造
化合物（４ｂ）（３０．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．２ｍｌ）懸濁液中に１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセン−７（1,8-dazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene）（ＤＢＵ）（０．２ｍｌ、１．３４ｍｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１２時間攪拌した。反応の終結をＨＰＬＣ（０→１００％ ５０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム水溶液−アセトニトリル, ２０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で確認した後、反応溶液の溶媒を留去して得た褐色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を用いて結晶化させた。得られたＤＢＵ塩化合物を１％希塩酸を用いて脱塩した後、生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め減圧下乾燥することにより化合物（５ｂ）（２１．５ｍｇ、８５％）を得た。
【００６３】
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.68(s, 6H), 4.00(s, 6H), 6.04(d, J=16.0Hz, 2H), 6.81(s, 2H),
7.43(s, 2H), 7.46(d, J=16.0Hz, 2H), 7.66(s, 2H), 8.10(s, 4H),
9.95(s, 2H), 10.95(s, 2H).
【００６４】
（３） 化合物（６ｂ）の製造
化合物（５ｂ）（５４．５ｍｇ、７９．９μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液中に、ＣＤＩ（７６ｍｇ、２３１μｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（６ｂ）（６３．０ｍｇ、９７％）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.79(s, 6H), 4.02(s, 6H), 7.10(s, 2H), 7.17(d, J=15.0Hz, 2H),
7.32(s, 2H), 7.50(s, 2H), 7.68(s, 2H), 7.87(d, J=15.0Hz, 2H),
7.90(s, 2H), 8.11(s, 4H), 8.67(s, 2H), 10.15(s, 2H),
10.96(s, 2H).
【００６５】
（４） 化合物（７ｂ）の製造
水素化ナトリウム（４．５ｍｇ、１１２．５μｍｏｌ、６０％ oil suspension）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液中に、別途合成したＤＵ８６のセグメントＡ（２１．０ｍｇ、８１．３μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、化合物（６ｂ）（２１．０ｍｇ、２４．９μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．８ｍｌ）溶液を加えた反応溶液を０℃下で１８時間攪拌した。反応溶液中に１０ｍＭリン酸ナトリウム（２ｍｌ）緩衝溶液を０℃下で加えた後、減圧下溶媒を留去し黄色残留物を得た。粗結晶を桐山ロート上で蒸留水（１０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（７ｂ）（２４．５ｍｇ、８３％）を得た。
【００６６】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.30(m, 2H), 2.09(m, 2H), 2.47(s, 6H), 3.46(m, 2H),
3.74(s, 12H), 4.02(s, 6H), 4.20(m, 2H), 4.29(m, 2H),
6.60(d, J=15.0Hz, 2H), 6.83(brs, 2H), 7.01(s, 2H),
7.43(s, 2H), 7.58(d, J=15.0Hz, 2H), 7.68(s, 2H),
8.12(s, 4H), 10.05(s, 2H), 10.96(s, 2H), 12.36(brs, 2H).
MS(ESI+) 1188.9[M＋].
【００６７】
実施例３ 化合物（７ｃ）の製造
（１） 化合物（４ｃ）の製造
実施例１の（２）で製造した化合物（３）（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（１：１、２０ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（１００ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（４４ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．５ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にて濾過した後、溶媒を留去して褐色粗結晶（９３ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（２ｍｌ）溶液中にエチルジイソプロピルアミン（０．１５ｍｌ、０．８８ｍｍｏｌ）とフマル酸ジクロライド（fumaryl chloride）（１６μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０→３％ ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）にて精製することにより化合物（４ｃ）（５０．１ｍｇ、４１％ for ２ steps）を得た。
【００６８】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.25(t, J=7.0Hz, 6H), 3.70(s, 6H), 3.98(s, 6H),
4.16(q, J=7.0Hz, 4H), 6.11(d, J=16.0Hz, 2H), 6.85(s, 2H),
7.26(s, 2H), 7.45(s, 2H), 7.52(d, J=16.0Hz, 2H),
7.61(s, 2H), 9.97(s, 2H), 10.90(s, 2H).
【００６９】
（２） 化合物（５ｃ）の製造
化合物（４ｃ）（４０．１ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．３ｍｌ）懸濁液中にＤＢＵ（０．３ｍｌ、２．００ｍｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１７時間攪拌した。反応の終結をＨＰＬＣ（０→１００％ ５０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム水溶液−アセトニトリル, ２０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で確認した後、反応溶液の溶媒を留去して得た褐色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を用いて結晶化させた。得られたＤＢＵ塩化合物を１％希塩酸を用いて脱塩した後、生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め減圧下乾燥することにより化合物（５ｃ）（２２．５ｍｇ、６１％）を得た。
【００７０】
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.69(s, 6H), 3.98(s, 6H), 6.04(d, J=16.0Hz, 2H),
6.83(s, 2H), 7.26(s, 2H), 7.43(s, 2H), 7.47(d, J=16.0 Hz, 2H),
7.60(s, 2H), 9.97(s, 2H), 10.90(s, 2H).
【００７１】
（３） 化合物（６ｃ）の製造
化合物（５ｃ）（１７．５ｍｇ、２６．５μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液中にＣＤＩ（３０ｍｇ、１８５μｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（６ｃ）（１８．５ｍｇ、９２％）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.78(s, 6H), 4.00(s, 6H), 7.11(s, 2H),
7.17(d, J=15.0Hz, 2H), 7.28(s, 2H), 7.34(s, 2H),
7.52(s, 2H), 7.63(s, 2H), 7.89(d, J=15.0Hz, 2H),
7.91(s, 2H), 8.68(s, 2H), 10.17(s, 2H), 10.89(s, 2H).
【００７２】
（４） 化合物（７ｃ）の製造
水素化ナトリウム（２．８ｍｇ、７１．２μｍｏｌ、６０％ oil suspension）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液中に、別途合成したＤＵ８６のセグメントＡ（１３．８ｍｇ、５３．４μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、化合物（６ｃ）（１３．５ｍｇ、１７．８μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．７ｍｌ）溶液を加えた反応溶液を０℃下で１２時間攪拌した。反応溶液中に１０ｍＭリン酸ナトリウム（２ｍｌ）緩衝溶液を０℃下で加えた後、減圧下溶媒を留去し黄色残留物を得た。粗結晶を桐山ロート上で蒸留水（１０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（７ｃ）（９．６ｍｇ、４７％）を得た。
【００７３】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.30(m, 2H), 2.08(m, 2H), 2.47(s, 6H), 3.47(m, 2H),
3.73(s, 6H), 3.74(s, 6H), 3.99(s, 6H), 4.20(m, 2H),
4.29(m, 2H), 6.59(d, J=15.0Hz, 2H), 6.79(brs, 2H),
7.01(s, 2H), 7.28(s, 2H), 7.43(s, 2H),
7.58(d, J=15.0Hz, 2H), 7.61(s, 2H), 10.07(s, 2H),
10.89(s, 2H), 12.36(brs, 2H).
MS(ESI+) 1138.5[M＋].
【００７４】
実施例４ 化合物（７ｄ）の製造
（１） 化合物（４ｄ）の製造
実施例１の（２）で製造した化合物（３）（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（１：１、２０ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（１００ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（４４ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．５ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にて濾過した後、溶媒を留去して褐色粗結晶（６３ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（２ｍｌ）溶液中にＣＤＩ（１６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０→３％ ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）にて精製することにより化合物（４ｄ）（５１．３ｍｇ、４５％ for ２ steps）を得た。
【００７５】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.24(t, J=7.0Hz, 6H), 3.70(s, 6H), 3.96(s, 6H),
4.15(q, J=7.0Hz, 4H), 6.08(d, J=16.0Hz, 2H), 6.87(s, 2H),
7.26(s, 2H), 7.45(s, 2H), 7.51(d, J=16.0Hz, 2H),
8.31(brs, 2H), 10.10(s, 2H).
【００７６】
（２） 化合物（５ｄ）の製造
４ｄ（４１．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．３ｍｌ）懸濁液中にＤＢＵ（０．３ｍｌ、２．００ｍｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１７時間攪拌した。反応の終結をＨＰＬＣ（０→１００％ ５０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム水溶液−アセトニトリル, ２０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で確認した後、反応溶液の溶媒を留去して得た褐色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を用いて結晶化させた。得られたＤＢＵ塩化合物を１％希塩酸を用いて脱塩した後、生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め減圧下乾燥することにより化合物（５ｄ）（２７．４ｍｇ、７３％）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.68(s, 6H), 3.96(s, 6H), 6.01(d, J=16.0Hz, 2H),
6.84(s, 2H), 7.26(s, 2H), 7.42(s, 2H), 7.47(d, J=16.0Hz, 2H),
8.84(brs, 2H), 10.08(s, 2H).
【００７７】
（３） 化合物（６ｄ）の製造
化合物（５ｄ）（２２．４ｍｇ、３７．１μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液中にＣＤＩ（３０ｍｇ、１８５μｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（６ｄ）（２５．２ｍｇ、９６％）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.79(s, 6H), 3.98(s, 6H), 7.10(s, 2H),
7.15(d, J=15.0Hz, 2H), 7.28(s, 2H), 7.34(s, 2H),
7.50(s, 2H), 7.87(d, J=15.0Hz, 2H), 7.90(s, 2H),
8.67(s, 2H), 8.89(brs, 2H), 10.25(s, 2H).
【００７８】
（４） 化合物（７ｄ）の製造
水素化ナトリウム（４．６ｍｇ、１１４．４μｍｏｌ、６０％ oil suspension）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液中に、別途合成したＤＵ８６のセグメントＡ（２２．１ｍｇ、８５．８μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、化合物（６ｄ）（２０．２ｍｇ、２８．６μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液を加えた反応溶液を０℃下で１２時間攪拌した。反応溶液中に１０ｍＭリン酸ナトリウム（２ｍｌ）緩衝溶液を０℃下で加えた後、減圧下溶媒を留去し黄色残留物を得た。粗結晶を桐山ロート上で蒸留水（１０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（７ｄ）（５．５ｍｇ、１８％）を得た。
【００７９】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.29(m, 2H), 2.09(m, 2H), 2.47(s, 6H), 3.44(m, 2H),
3.72(s, 6H), 3.73(s, 6H), 3.97(s, 6H), 4.18(m, 2H),
4.27(m, 2H), 6.56(d, J=14.5Hz, 2H), 6.84(brs, 2H),
7.01(s, 2H), 7.26(s, 2H), 7.42(s, 2H),
7.57(d, J=14.5Hz, 2H), 8.82(brs, 2H), 10.16(s, 2H),
12.35(brs, 2H).
MS(ESI+) 1084.5[M＋].
【００８０】
実施例５ ＩｍＩｍＰｙ（化合物（１１））の製造
（１） Ｏ２ＮＰｙＬＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２（化合物（８））の製造
Ｏ２ＮＰｙＣＯＣＣｌ３（５００ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）にジメチルアミノプロピルアミン（１ｍｌ、８．３３ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合物を室温下で１２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（３ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（８）（４６０ｍｇ、９７％）を得た。
１H NMR(CDCl３) δ
1.75(t, J=6.0Hz, 2H), 2.34(s, 6H), 2.54(t, J=6.0Hz, 2H),
3.49(q, J=6.0Hz, 2H), 4.00(s, 3H), 6.94(s, 1H),
7.52(s, 1H), 8.68(brs, 1H).
【００８１】
（２） Ｏ２ＮＩｍＰｙＬＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２（化合物（９））の製造
化合物（８）（４６０ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）の無水メタノール（３ｍｌ）溶液中に１０％パラジウム−炭素（１２０ｍｇ）を加えた後、反応混合物を水素圧下、室温で２時間攪拌した。反応溶液をセライト（ＭｅＯＨ）にて濾過した後、溶媒を留去して黄色粗結晶（４１３ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（８ｍｌ）溶液中に、エチルジイソプロピルアミン（０．５ｍｌ、２．８７ｍｍｏｌ）と、別途合成したＯ２ＮＩｍＣＯＣＣｌ３（４９３ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た残留物中に、蒸留水（３０ｍｌ）を加えて生じる黄色沈殿物を桐山ロートに用いて濾取した。蒸留水（３０ｍｌ）、ジエチルエーテル（５ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって化合物（９）（５８７ｍｇ、８６％ for ２ steps）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.61(t, J=7.0Hz, 2H), 2.14(s, 6H), 2.24(t, J=7.0Hz, 2H),
3.19(q, J=7.0Hz, 2H), 3.81(s, 3H), 4.04(s, 3H), 6.97(s, 1H),
7.27(s, 1H), 8.14(brs, 1H), 8.61(s, 1H), 10.80(brs, 1H).
【００８２】
（３） Ｏ２ＮＩｍＩｍＰｙＬＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２（化合物（１０））の製造
化合物（９）（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の無水メタノール（３ｍｌ）溶液中に１０％パラジウム−炭素（５０ｍｇ）を加えた後、反応混合物を水素圧下、室温で４時間攪拌した。反応溶液をセライト（ＭｅＯＨ）にて濾過した後、溶媒を留去して黄色粗結晶（６５．３ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（２ｍｌ）溶液中に、エチルジイソプロピルアミン（０．１ｍｌ、０．５７ｍｍｏｌ）と、別途合成したＯ２ＮＩｍＣＯＣＣｌ３（７２．２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た残留物中に、蒸留水（１０ｍｌ）を加えて生じる黄色沈殿物を桐山ロートを用いて濾取した。蒸留水（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（２ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって化合物（１０）（５８．２ｍｇ、４４％ for ２ steps）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.61(t, J=7.0Hz, 2H), 2.15(s, 6H), 2.25(t, J=7.0Hz, 2H),
3.19(q, J=7.0Hz, 2H), 3.80(s, 3H), 4.04(s, 3H),
4.06(s, 3H), 6.91(s, 1H), 7.23(s, 1H), 7.58(s, 1H),
8.13(brs, 1H), 8.65(s, 1H), 10.29(s, 1H).
【００８３】
（４） ＡｃＨＮＩｍＩｍＰｙＬＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２（化合物（１１））の製造
化合物（１０）（４８．２ｍｇ、９６．４μｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（２：１、６ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（４０ｍｇ）を加えた後、水素化ホウ素ナトリウム（８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．４ｍｌ）溶液を０℃下で滴下し、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をセライト（ＭｅＯＨ）にて濾過した後、溶媒を留去して黄色粗結晶（３８ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶にエチルジイソプロピルアミン（０．１ｍｌ、０．５７ｍｍｏｌ）と無水酢酸（０．１ｍｌ、１．０５ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合物を室温下で４時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た残留物中に、クロロホルム（１ｍｌ）を加えて生じる不溶物を濾過により除いた。溶媒を留去して得た粗結晶にジエチルエーテル（２ｍｌ）を加えて洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（１１）（２３．２ｍｇ、４７％ for ２ steps）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.61(m, 2H), 2.04(s, 3H), 2.14(s, 6H), 2.25(m, 2H),
3.19(m, 2H), 3.81(s, 3H), 3.98(s, 3H), 4.00(s, 3H),
6.92(s, 1H), 7.23(s, 1H), 7.51(s, 1H), 7.56(s, 1H),
8.12(brs, 1H), 9.34(s, 1H), 10.27(s, 1H), 10.30(s, 1H).
【００８４】
実施例６ ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント３μＭとその相補的ＤＮＡオリゴマー６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と先に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。Milli-Ｑ精製した蒸留水１１０μｌを加えて希釈した後、そこから１μｌを取り出した。その溶液（１μｌ）から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
【００８５】
実施例７ インターストランドクロスリンク体の構造確認試験
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント３μＭとその相補的ＤＮＡオリゴマー６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と先に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。 反応溶液より１μｌ取り出し、そこにMilli-Ｑを１１μｌ加えて希釈した。その希釈溶液から１μｌ取り出しレーン２、レーン７に用いた。希釈溶液（１１μｌ）を９０℃で２０分間振動した後、ピペリジン（１μｌ）を加えさらに９０℃で２０分間振動した。その溶液を遠心減圧後、さらに一晩凍結乾燥を行った。そこに５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１μｌとMilli-Ｑを１０μｌ加えて希釈した。その希釈溶液から１μｌ取り出しレーン３、レーン８に用いた。溶液（１０μｌ）中にＡｐ（１μｌ）を加え３７℃で２時間振動した後、１．１μｌ取り出しレーン４、レーン９に用いた。
それぞれ取り出した反応溶液から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させ、その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
【００８６】
実施例８ インターストランドクロスリンク体の塩基配列特異性試験
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント３μＭと各種ＤＮＡオリゴマー６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と先に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。Milli-Ｑ精製した蒸留水１１０μｌを加えて希釈した後、そこから１μｌを取り出した。その溶液（１μｌ）から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
【００８７】
実施例９ インターストランドクロスリンク反応の最適条件試験
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に各種の５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント３μＭとそれぞれに対応した相補的ＤＮＡオリゴマー６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と先に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。Milli-Ｑ精製した蒸留水１１０μｌを加えて希釈した後、そこから１μｌを取り出した。その溶液（１μｌ）から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
【００８８】
実施例１０ 試薬濃度と等量比の反応条件試験
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント（ＴＸＲ−１８）３μＭと相補的ＤＮＡオリゴマー（ＯＤＮ−１５）６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。
［７ａ（μＭ）、ＩｍＩｍＰｙ（μＭ）；５０、１００（レーン１）；２５、５０（レーン２）；１２、２５（レーン３）；６、１２（レーン４）；３、６（レーン５）；２５、１００（レーン６）；２５、５０（レーン７）；２５、２５（レーン８）；２５、１２（レーン９）、２５、６（レーン１０）］
Milli-Ｑ精製した蒸留水１１０μｌを加えて希釈した後、そこから１μｌを取り出した。その溶液（１μｌ）から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
結果を図６に示す。図６の各レーンにおける７ａ（μＭ）とＩｍＩｍＰｙ（μＭ）の濃度は前記したとおりである。
また、クロスリンキング収率を図７に示す。図７の左側は、ＩｍＩｍＰｙと７ａが２：１の場合の試料の等量を示し、図７の右側は７ａが２５μＭの場合のＩｍＩｍＰｙの等量を示している。
【００８９】
【発明の効果】
本発明は、ＤＮＡ上に存在する特定の塩基配列に対して選択的にインターストランドクロスリンクすることを可能とする試薬である。このことはヒトゲノム上での重要な遺伝子配列、あるいは遺伝子異常に対する有用なドラッグとして、はじめての遺伝子レベルでの創薬を実現する可能性を秘めている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の化合物のインターストランドクロスリンクをポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析した実験結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】図２は、２組のＤＮＡ対を用いて、本発明の化合物のインターストランドクロスリンク反応を解析した実験結果を示す、図面に代わる写真である。
【図３】図３は、本発明の化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙを用いて形成されたインターストランドクロスリンク体の化学構造を示すものである。
【図４】図４は、種々のトリアミドを併用して本発明の化合物のインターストランドクロスリンク反応を解析した実験結果を示す、図面に代わる写真である。
【図５】図５は、種々の長さのＤＮＡを用いて本発明の化合物のインターストランドクロスリンク反応を解析した実験結果を示す、図面に代わる写真である。
【図６】図６は、本発明の化合物（７ａ）及びＩｍＩｍＰｙの種々の濃度におけるクロスリンキング反応の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図７】図７は、本発明の化合物（７ａ）及びＩｍＩｍＰｙを用いた場合の種々の条件下におけるクロスリンキング収率をグラフ化したものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学合成により製造し得る化合物を用いて２本鎖ＤＮＡを同時にアルキル化し、切断し得る化合物、これらの化合物を用いたＤＮＡのアルキル化方法、２本鎖ＤＮＡの切断方法、及び、これらの化合物を用いた医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムプロジェクトにより我々の「生命の設計図」である全遺伝子の塩基配列が数年内に解明されようとしている。この設計図に傷があったり、後天的に傷がはいると、病気や老化を引き起こすことが知られている。ヒトゲノムプロジェクトの進展により癌を含む多くの疾病はＤＮＡレベルで理解されるようになり、診断、予防などを中心とした医学全体が、革命的に変化するものと考えられる。さらに、これらの疾病のＤＮＡレベルでの理解に基づいた治療法、すなわち病因遺伝子やその産物をターゲットとした医薬品の開発への期待も大きいが、基礎研究を臨床研究に活かしてゆくための橋渡し的な研究はまだ、途についたばかりである。
癌についても、ＤＮＡレベルでの研究が行われているが、現在用いられている抗癌剤は、スクリーニングによって選択された抗生物質が多く、もともと癌細胞を殺すために微生物が産生したものではなく、癌の分子生物学的知見に基づいたものはほとんどない。細胞内の特定遺伝子の発現を細胞外から自由自在にコントロールすることが可能になれば、究極の遺伝子レベルでの治療法となると考えられる。
【０００３】
ところで、遺伝情報を担うＤＮＡが化学的に修飾を受けると、生命維持の根幹にあたる遺伝情報が損なわれ、細胞の突然変異や死滅が引き起こされる。また、正常細胞中のＤＮＡへの共有結合による修飾は、がん化の原因となっていることが知られている一方で、逆にがん細胞中のＤＮＡに作用することで、抗がん剤としても利用することができる。
ＤＮＡの二本鎖をクロスリンクさせる次式
【０００４】
【化４】
で示されるようなインターストランドクロスリンク反応は、ＤＮＡの複製を完全に阻害することが様々な系で確認されており、一本鎖のアルキル化と比較して生体に対して非常に強い作用を有していることが知られている（S.R.Rajski and R.M.Williams, Chem. Rev., 98, 2723-2795(1998).）。
例えば、ファージの失活には平均１．３等量のインターストランドクロスリンク化が起これば充分であるのに対し、単純な一本鎖のアルキル化では２８０等量のアルキル化剤を必要とするとされている（P.D.Lawley, J.H.Lethbridge, P.A.Edwards, K.V.Shooter, J. Mol. Biol., 39, 181(1969).）。
【０００６】
典型的なインターストランドクロスリンク反応を起こす抗がん性抗生物質としてマイトマイシンやカルチノフィリンＡが知られている。また、これまでにビゼレシンを代表とするＤＮＡインターストランドクロスリンクする化合物が数多く合成されている。ＤＮＡインターストランドクロスリンク反応を起こすことが報告されている代表的な化合物としては、次に示すマイトマイシン、カルチノフィリンＡやナイトロジェンマスタードなどが知られている。
【０００７】
【化５】
これらのマイトマイシンやナイトロジェンマスタード（mechlorethamine）などは、有効な抗がん剤として現在も臨床で利用されている。
現在までに様々なインターストランドクロスリンク剤の塩基配列特異性が詳細に調べられている（a) S.-J.Lee, F.C.Seaman, D.Sun, H.Xiong, R.C.Kelly, L.H.Hurley, J. Am. Chem. Soc., 119, 3434-3442(1997); b) J.T.Millard, R.J.Spencer, P.B.Hopkins, Biochemistry, 37, 5211-5219(1998); c) T.Fujiwara, I.Saito, H.Sugiyama, Tetrahedron Lett., 40, 315-318(1999).）。しかし、それらの化合物の抗がん性とインターストランドクロスリンク剤の塩基配列選択性との相関については全く明らかにされていない。さらに、任意の塩基配列でインターストランドクロスリンクする化合物の分子設計には成功していない。また、これまでに合成されているＤＮＡインターストランドクロスリンク剤は一般的に反応の効率が著しく低い。例えば、ＤＮＡ中の５’−ＧＮＣ塩基配列に対してクロスリンク能を有することが知られているマスタードによるインターストランドクロスリンク体は使用しているＤＮＡに対してわずかに数％しか生成しているにすぎない（Y.-H.Fan and B.Gold, J. Am. Chem. Soc., 121, 11942-11946(1999).）。
従って、効率よいＤＮＡインターストランドクロスリンク剤の開発が極めて重要になってきている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率よいＤＮＡインターストランドクロスリンク剤、そのための化合物、及びそれを用いた医薬組成物を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、すでにＤＮＡ塩基配列認識能をもつピロール−イミダゾールジアミド部とデュオカルマイシンセグメントの間にビニル基を導入した次式（１）
【００１１】
【化６】
で表されるハイブリット分子（１）のＤＮＡアルキル化能を解析してきた。このハイブリット分子（１）はホモダイマーを形成して次式で表されるような、
【００１３】
【化７】
ＤＮＡ中の特定の塩基配列に対して選択的にダブルアルキル化することを明らかにしてきた。この化合物は、ビニル基をリンカーＬとするＡ−Ｌ−Ｂ−Ｒ型
（式中、ＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を示し、ＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカーを示し、Ｒはアルキル基などの末端基を示す。）
の構造を有する分子である（特願平１１−８３５９１号参照）。
そこで、本発明者らは、この型の分子を基本として検討してきたところ、この型の分子を異なる長さのスペーサーで連結した化合物が効率よいＤＮＡインターストランドクロスリンク能を有する化合物であることを見出した。
【００１５】
本発明は、一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ）
（式中、各々のＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を示し、各々のＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカーを示し、ＸはＡ−Ｌ−Ｂコンポーネントを結合させるスペーサーを示す。）
で表されるＤＮＡの２本鎖をインターストランドクロスリンクすることができる化合物に関する。
また、本発明は前記化合物を用いるＤＮＡをインターストランドクロスリンクする方法、ＤＮＡのインターストランドクロスリンク剤、及びこれを含有してなる医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明者らは、インターストランドクロスリンク能を有する化合物を開発する目的で、例えばハイブリット分子（１）を異なる長さのスペーサーで連結した化合物（７ａ−ｄ）を、次に示すスキーム、
【００１７】
【化８】
（式中、Ｘは、
【００１９】
【化９】
を示す。）
に従って合成した。化合物（７ａ−ｄ）の合成は、ジアミド誘導体（３）にそれぞれ対応するスペーサーとなる活性化したカルボニル化合物を縮合させることにより行った。
まず、Ｎ−メチル−２−ピロールアルデヒドを硝酸などでニトロ化した後、（ＥｔＯ）２Ｐ（Ｏ）ＣＨＣＯ２Ｅｔなどのウイティッヒ型の試薬を用いてエステル体（２）とする。得られたエステル体（２）をＮａＢＨ４などの金属水素化物などで還元してアミノ体とし、これに１−メチル−３−ニトロ−５−トリクロロアセチルイミダゾールを反応させてイミダゾール−ピロール化合物（３）とする。これを前記と同様な方法によりニトロ基を還元してアミノ基とし、これに目的物に応じた酸ハロゲン化物、またはカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を反応させることにより二量体化合物（４ａ−ｄ）とする。次いで、両末端のエステル基を加水分解して遊離カルボン酸体（５ａ−ｄ）とし、これをＣＤＩを用いて活性アミド体（６ａ−ｄ）とした後、これに抗生物質ＤＵ８６のセグメントＡ部分を反応させて目的の化合物（７ａ−ｄ）とした。
この合成法は、同種の対称二量体の合成に対して応用可能な汎用性の高い手法であり、本発明の化合物はこの方法に準じて製造することができる。
【００２１】
本発明を前記した化合物（７ａ−ｄ）を例にして、具体的に説明する。
これらの化合物を用いた２本鎖ＤＮＡのインターストランドクロスリンク反応を次の１８塩基及び１５塩基のＤＮＡ対を用いて実験した。
また、この実験には補助試薬として次式、
【００２２】
【化１０】
で表される化合物（この化合物を本明細書では、ＩｍＩｍＰｙという。）を用いた。このＩｍＩｍＰｙは、本明細書における「ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を有する物質」として使用された。
前記したＤＮＡに、本発明の化合物（７ａ−ｄ）、及び必要によりＩｍＩｍＰｙを添加して、ＤＮＡオリゴマーに対する化合物（７ａ−ｄ）のインターストランドクロスリンク反応について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析を行った。
【００２４】
結果を図１に図面に代わる写真として示す。図１の、
レーン１はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）のみの場合を示し、
レーン２はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）にＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン３はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）を添加した場合を示し、
レーン４はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン５はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ｂ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン６はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ｃ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン７はＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ｄ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示す。
【００２５】
その結果、化合物（７ａ）は単独では反応はほとんど観察できなかったが（レーン３）、ＩｍＩｍＰｙが存在すると、出発原料のＤＮＡフラグメントＴＸＲ−１８は泳動度の低いバンドに変化した（レーン４）。他のスペーサーをもつ化合物（７ｂ−ｄ）では、化合物単独でもＩｍＩｍＰｙを併用してもレーン４で観察されたような泳動度の低いバンドは殆ど生成しなかった（レーン５、６、７）。これらの事実は化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙを併用した場合に極めて特異的なＤＮＡオリゴマーＴＸＲ−１８に対する反応が起こったことを示している。
【００２６】
次に、先に観察されたバンドがインターストランドクロスリンク体に由来するものであることを確認するために、上のストランド（ＴＸＲ−１８）と下のストランド（ＴＸＲ−１８Ｒ）を別々にラベルしたオリゴマーからなる２組のＤＮＡ対を用いた実験を行った。即ち、前記のＴＸＲ−１８とＯＤＮ−１５の対と、次に示すＯＤＮ−１５ＲとＴＸＲ−１８Ｒとの対を用いた。
５’−ＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡ−３’ （ＯＤＮ−１５Ｒ）
３’−ＧＴＣＡＣＣＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴ−５’ （ＯＤＮ−１８Ｒ）
使用したＴＸＲ−１８Ｒは、前記したＯＤＮ−１８Ｒの５’末端側をテキサスレッド（ＴＸＲｅｄ）で標識したヌクレオチドである。
さらにこの実験には標品として次のヌクレオチドＴＸＲ−１４及びＴＸＲ−１４Ｒを用いた。
５’−ＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＣ−３’ （ＯＤＮ−１４）
３’−ＣＣＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴ−５’ （ＯＤＮ−１４Ｒ）
これらの塩基配列はいずれもＯＤＮ−１８又はＯＤＮ１８Ｒの５’末端側の塩基配列と同じになるように設計されている。ＴＸＲ−１４は、前記したＯＤＮ−１４の５’末端側をテキサスレッド（ＴＸＲｅｄ）で標識したヌクレオチドであり、同様に、ＴＸＲ−１４ＲはＯＤＮ−１４Ｒの５’末端側をテキサスレッド（ＴＸＲｅｄ）で標識したヌクレオチドである。
【００２７】
この結果を図２に図面に代わる写真として示す。図２の
レーン１は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）のみの場合を示し、
レーン２は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン３は、前記レーン２において、さらに９０℃で２０分加熱処理した後、９０℃で２０分間ピペリジン処理した場合を示し、
レーン４は、前記レーン３において、さらに３７℃で２時間アルカリ脱リン酸化酵素処理した場合を示し、
レーン５は、標品のＴＸＲ−１４を示し、
レーン６は、ＴＸＲ−１８Ｒ（３μＭ）とＯＤＮ−１５Ｒ（６μＭ）のみの場合を示し、
レーン７は、ＴＸＲ−１８Ｒ（３μＭ）とＯＤＮ−１５Ｒ（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン８は、前記レーン７において、さらに９０℃で２０分加熱処理した後、９０℃で２０分間ピペリジン処理した場合を示し、
レーン９は、前記レーン８において、さらに３７℃で２時間アルカリ脱リン酸化酵素処理した場合を示し、
レーン１０は、標品のＴＸＲ−１４Ｒを示す。
【００２８】
この実験により、インターストランドクロスリンク体と考えられる新たな生成物を確認した（レーン２及び７）。これに対し、加熱処理、ピペリジン処理を行うと、切断されたフラグメントが得られた（レーン３及び９）。さらに、このフラグメントをＡＰ（alkaline phosphatase）処理すると泳動度が減少した（レーン４及び８）。この生成物は別に合成した標品とポリアクリルアミドゲル電気泳動で同一物であることを確認した（レーン５及び１０）。
この実験結果は、化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙによって、ＤＮＡオリゴマー上の２個所のアデニン部位で配列選択的にアルキル化されていたことを示している。つまり、反応によって泳動速度の大きな変化が観察された事実と併せて考えれば、ほぼ定量的にＤＮＡに対するインターストランドクロスリンク反応が進行することが確認された。
【００２９】
これらの結果、ピロール−イミダゾールポリアミドＣＰＩコンジュゲート体（７ａ）はピロール−イミダゾールの塩基配列認識のルール（a) P.B.Dervan, et al., Nature, 282, 111-115(1998); b) T.Fujiwara, Z.-F.Tao, Y.Ozeki, I.Saito, A.H.-J.Wang, M.Lee, H.Sugiyama, J. Am. Chem. Soc., 121, 7706-7707(1999).参照）に従ったトリアミドの存在下のみＤＮＡを効率よくインターストランドクロスリンクすることが明らかとなった。化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙによるインターストランドクロスリンク体の構造を図３に示す。
【００３０】
次に、インターストランドクロスリンク体の塩基配列特異性を検討した。
この化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙによるインターストランドクロスリンクの配列特異性を検討するために、ＩｍＩｍＰｙと他の３種のトリアミド存在下での化合物（７ａ）のクロスリンク反応に変化を調べた。この実験で使用したトリアミドの構造を次に示す。
【００３１】
【化１１】
即ち、ＩｍＩｍＰｙは、Ｘ＝Ｎで、Ｙ＝Ｎで、Ｚ＝ＣＨのものであり、
ＩｍＩｍＩｍは、Ｘ＝Ｎで、Ｙ＝Ｎで、Ｚ＝Ｎのものであり、
ＩｍＰｙＰｙは、Ｘ＝Ｎで、Ｙ＝ＣＨで、Ｚ＝ＣＨのものであり、
ＰｙＩｍＰｙは、Ｘ＝ＣＨで、Ｙ＝Ｎで、Ｚ＝ＣＨのものである。
この結果を、図４に図面に代わる写真として示す。図４の
レーン１は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）のみの場合を示し、
レーン２は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン３は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＩｍ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン４は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＰｙＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン５は、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＰｙＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示す。
【００３３】
この結果、ＩｍＩｍＩｍを用いた系（レーン３）においても効率は若干低下するもののクロスリンク体の生成が明確に観察された。しかし、他のトリアミドを用いた系（レーン４及び５）では、クロスリンク体の生成はほとんど確認することはできなかった。これらの結果は、図３に示すモデルに基づいて任意の配列でＤＮＡのインターストランドクロスリンク反応が行える可能性を示している。
【００３４】
さらに、インターストランドクロスリンク反応の最適条件の検討を行った。
化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙによるインターストランドクロスリンク反応における最適の塩基配列の間隔を調べる実験を行うために次の塩基対を用いた実験を行った。
ｎ＝０の場合の、上段のものをＴＸＲ−１７と称し、下段のものをＯＤＮ−１４と称する。ｎ＝１の場合の、上段のものをＴＸＲ−１８と称し、下段のものをＯＤＮ−１５と称する。ｎ＝２の場合の、上段のものをＴＸＲ−１９と称し、下段のものをＯＤＮ−１６と称する。ｎ＝３の場合の、上段のものをＴＸＲ−２０と称し、下段のものをＯＤＮ−１７と称する。
【００３５】
この結果を、図５に図面に代わる写真として示す。図５の
レーン１は、ｎ＝０のもので、ＴＸＲ−１７（３μＭ）とＯＤＮ−１４（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン２は、ｎ＝１のもので、ＴＸＲ−１８（３μＭ）とＯＤＮ−１５（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン３は、ｎ＝２のもので、ＴＸＲ−１９（３μＭ）とＯＤＮ−１６（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示し、
レーン４は、ｎ＝３のもので、ＴＸＲ−２０（３μＭ）とＯＤＮ−１７（６μＭ）に化合物（７ａ）（５０μＭ）及びＩｍＩｍＰｙ（１００μＭ）を添加した場合を示す。
【００３６】
この結果、ｎ＝０の場合（レーン１）には全くクロスリンク体を確認することはできなかったが、ｎ＝２の場合（レーン３）においては先に述べてきたｎ＝１の場合（レーン２）と同様の定量的なインターストランドクロスリンク反応が起こっていることがわかった。しかしながら、ｎ＝３の場合（レーン４）には２０％程のクロスリンク体が観察されたにとどまった。
【００３７】
さらに、試薬濃度と等量比の反応条件についても検討を行った結果、最終的にTexas Red-18（３μＭ）に対して、化合物（７ａ）、ＩｍＩｍＰｙをそれぞれ２５μＭにまで下げた条件まで定量的なクロスリンク反応を確認することができた。
これらの結果、化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙなどによる協同的インターストランドクロスリンク反応を確立することができた。
さらに最適のトリアミドとクロスリンカーを設計することで、任意の塩基配列を有するＤＮＡサイトにのみ選択的にインターストランドクロスリンクする能力をもつテーラーメイドドラッグを実現することができるようになる。
【発明の実施の態様】
【００３８】
本発明の一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ）
（式中、各々のＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を示し、各々のＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカーを示し、ＸはＡ−Ｌ−Ｂコンポーネントを結合させるスペーサーを示す。）
で表されるＤＮＡの２本鎖をインターストランドクロスリンクすることができる化合物は、２個の（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントをスペーサーＸで相互に連結させた構造を有することを特徴とするものである。
【００３９】
（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントの中のＢ部分は、ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を有するものであり、好ましくは置換基を有してもよいピロール（本明細書ではＰｙと略称する。）及び／又はイミダゾール（本明細書ではＩｍと略称する。）から誘導される化学構造などであり、これらの置換基を有してもよいピロール環や置換基を有してもよいイミダゾール環をアミド結合で結合させた化学構造が好ましい。この部分の化学構造とこれに結合するＤＮＡの塩基配列については、a) P.B.Dervan, et al., Nature, 282, 111-115(1998); b) T.Fujiwara, Z.-F.Tao, Y.Ozeki, I.Saito, A.H.-J.Wang, M.Lee, H.Sugiyama, J. Am. Chem. Soc., 121, 7706-7707(1999).などの公知技術を参照することができる。
【００４０】
（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントの中のＡ部分は、ＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を有する部分であり、ＤＮＡ中の塩基と共有結合形成できるものが好ましい。好ましいＡ部分としてはＤＮＡをアルキル化する抗癌抗生物質のアルキル化部分であって、シクロプロパン環やアジリジン環などを有する化学構造がさらに好ましい。
（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントの中のリンカーＬは、Ａ部分及びＢ部分の化学構造を結合させ得るものであればよく、これによりＤＮＡの塩基をアルキル化する部分とＤＮＡの塩基配列を認識し得る部分とを一体化することが可能となる。即ち、ＤＮＡの特定の塩基配列の部分を特異的に認識し、当該認識部位に応じた塩基を特異的にアルキル化して結合することが可能となる。
リンカーＬとしては、適当な長さを有し、即ち原子数が２〜１０個、好ましくは２〜５個程度を有し、Ａ部分とＢ部分を化学結合させ得るものであればよい。好ましいリンカーＬとしてはビニル基を含有する化学構造が挙げられる。
好ましい（Ａ−Ｌ−Ｂ）−コンポーネントとしては、次式（II）
【００４１】
【化１２】
又は次式（III）
【００４３】
【化１３】
で表される基などが挙げられる。
（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントを結合させるスペーサーＸとしては、適当な長さを有し、即ち原子数が１〜１５個、好ましくは２〜８個程度を有し、２個の（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントを化学結合させ得るものであればよい。例えば、カルボニル基又は炭素数２〜１５、好ましくは２〜８の有機ジカルボン酸から誘導されるアシル基などが挙げられる。有機ジカルボン酸としては飽和又は不飽和の脂肪族ジカルボン酸、飽和又は不飽和の環式脂肪族ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、芳香脂肪族ジカルボン酸、複素環式ジカルボン酸などが挙げられる。
スペーサーＸとしては、−ＣＯ−基、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−基、−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−基、又は、−ＣＯ−（ｐ−Ｃ６Ｈ４）−ＣＯ−基などが挙げられるが、脂肪族飽和ジカルボン酸のアシル基が好ましく、より具体的には−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−基などが好ましい。
【００４５】
本発明は、前記した本発明の化合物のいずれかを用いて、２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分をインターストランドクロスリンクする方法を提供する。この本発明の方法においては、さらにＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を有する物質、例えばＩｍＩｍＰｙ、ＩｍＩｍＩｍなどのトリアミドの存在下に行うのが好ましい。
本発明の方法によりインターストランドクロスリンクする場合には、（Ａ−Ｌ−Ｂ）コンポーネントの中のＢ部分のＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造により、ＤＮＡの特定の塩基配列部分に特異的にインターストランドクロスリンクすることができる。例えば、本発明の化合物として前記した化合物（７ａ）などを用いた場合には、ＤＮＡのＴＧＧＣ若しくはＧＣＣＡ又はそれらの相補鎖部分にインターストランドクロスリンクすることができる。
【００４６】
また、本発明は、前記した本発明の化合物からなる、２本鎖ＤＮＡのインターストランドクロスリンク剤を提供する。本発明のインターストランドクロスリンク剤は効率よく、しかもＤＮＡの特定の塩基配列部分インターストランドクロスリンクすることができる。
本発明のインターストランドクロスリンク剤は、ＤＮＡの特定の塩基配列の部分にインターストランドクロスリンクすることができるので、遺伝子の異常による各種の疾患の治療又は予防に有用である。特に癌遺伝子に対してその発現の予防、治療に有用となる。したがって、本発明は前記した本発明の化合物及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、遺伝子の異常に伴う各種疾患、例えば癌の治療又は予防に有用である。
【００４７】
【実施例】
次に、実地例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１ 化合物（７ａ）の製造
（１） 化合物（２）の製造
濃硫酸（１．５ｍｌ、３５．７ｍｍｏｌ）の無水酢酸溶液（３ｍｌ）中に１−メチル−２−ピロールアルデヒド（３．０ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）の無水酢酸溶液（５ｍｌ）を−４０℃下で４０分間ゆっくりと滴下した。反応混合物を−１０℃下で２時間攪拌した後、そこにヘキサン（１００ｍｌ）を加えた。生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め、ヘキサン（１０ｍｌ ｘ ２）で洗浄することにより黄色粗結晶（１．４３ｇ、３４％）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
水素化ナトリウム（３７２ｍｇ、９．２９ｍｍｏｌ、６０％ oil suspension）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液中に２−ジエチルホスホノ酢酸エチルエステル（triethylphosphonoacetate）（１．９３ｍｌ、９．７５ｍｍｏｌ）を０℃下でゆっくりと加えた。さらに、１−メチル−４−ニトロ−２−ピロールアルデヒド（１．４３ｇ、９．２９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去し蒸留水（１０ｍｌ）を加えた。水層を酢酸エチル（１００ｍｌ ｘ ２）を用いて抽出した。有機層を集め無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、濾過、濃縮し残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２５→５０％ ＥｔＯＡｃ in hexane, gradient elution）にて精製することにより化合物（２）（１．６９ｇ、８１％）を得た。
【００４９】
１H NMR(CDCl３) δ
1.34(t, J=7.0Hz, 3H), 3.77(s, 3H), 4.26(q, J=7.0Hz, 2H),
6.31(d, J=16.0Hz, 1H), 7.11(d, J=1.5Hz, 1H),
7.48(d, J=16.0Hz, 1H), 7.56(d, J=1.5Hz, 1H).
１３C NMR(CDCl３) δ
14.3, 35.4, 60.8, 106.1, 118.4, 125.3, 129.8, 130.1,
136.7, 166.5.
MS(FAB+) 225[M＋].
【００５０】
（２） 化合物（３）の製造
化合物（２）（５００ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）の無水メタノール（２５ｍｌ）溶液中に１０％パラジウム−炭素（２２０ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（１５３ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）の蒸留水（３ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をセライトにて濾過した後、酢酸エチル（５００ｍｌ）を加えた。有機層を蒸留水（１０ｍｌ）にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、濾過、濃縮し褐色粗結晶（４６１ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液中にエチルジイソプロピルアミン（０．５２ｍｌ、２．９８ｍｍｏｌ）と別途合成した１−メチル−４−ニトロ−２−トリクロロアセチルイミダゾール（Ｏ２ＮＩｍＣＯＣＣｌ３）（５５０ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を、順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３０→５０％ ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中））にて精製することにより、化合物（３）（４００ｍｇ、５２％ for ２ steps）を得た。
【００５１】
１H NMR(CDCl３) δ
1.33(t, J=7.0Hz, 3H), 3.71(s, 3H), 4.21(s, 3H),
4.25(q, J=7.0Hz, 2H), 6.16 (d, J=16.0Hz, 1H),
6.62(d, J=l.5Hz, 1H), 7.32(d, J=l.5Hz, 1H),
7.55(d, J=16.0Hz, 1H), 7.82(s, 1H), 8.97(brs, 1H).
１３C NMR(CDCl３) δ
14.3, 34.4, 37.1, 60.3, 102.5, 114.2, 117.9, 122.1, 124.4,
127.6, 131.4, 137.2, 145.3, 154.4, 167.4.
MS(FAB+) 347[M+].
【００５２】
（３） 化合物（４ａ）の製造
化合物（３）（２５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（１：１、１０ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（１２０ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（５４．５ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．５ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にて濾過した後、溶媒を留去して褐色粗結晶（１４１ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（２ｍｌ）溶液中にエチルジイソプロピルアミン（０．２５ｍｌ、１．３３ｍｍｏｌ）とアジポイル−ジクロライド（adipoyl chloride）（３２μｌ、０．２２ｍｍｏｌ）を、順次０℃で加えた後、反応混合物を室温下で１４時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０→３％ ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）にて精製することにより化合物（４ａ）（９６．２ｍｇ、３６％ for ２ steps）を得た。
【００５３】
１H NMR(CDCl３) δ
1.32(t, J=6.5Hz, 6H), 1.81(s, 4H), 2.42(s, 4H), 3.67(s, 6H),
4.04(s, 6H), 4.24(q, J=6.5Hz, 4H), 6.10(d, J=15.5Hz, 2H),
6.51(s, 2H), 7.34(s, 2H), 7.41(s, 2H), 7.53(d, J=15.5Hz, 2H),
8.04(brs, 2H), 8.80(brs, 2H).
１３C NMR(5%CD３OD in CDCl３) δ
14.1, 24.8, 34.1, 34.5, 34.6, 60.3, 102.3, 112.9, 114.3,
118.0, 122.8, 127.1, 131.8, 133.7, 135.8, 155.8, 168.0, 171.0.
MS(ESI+) 744.6[M＋].
【００５４】
（４） 化合物（５ａ）の製造
４ａ（７６．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．６ｍｌ）懸濁液中に１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセン−７（ＤＢＵ：1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene）（０．６ｍｌ、４．０１ｍｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１５時間攪拌した。反応の終結をＨＰＬＣ（０→１００％ ５０ｍｍｏｌギ酸アンムニウム水溶液−アセトニトリル, ２０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で確認した後、反応溶液の溶媒を留去して得た褐色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を用いて結晶化させた。得られたＤＢＵ塩化合物を１％希塩酸を用いて脱塩した後、生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め減圧下乾燥することにより５ａ（４０．０ｍｇ、５７％）を得た。
【００５５】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.58(s, 4H), 2.32(s, 4H), 3.68(s, 6H), 3.94(s, 6H),
6.03(d, J=15.5Hz, 2H), 6.80(s, 2H), 7.41(s, 2H), 7.43(s, 2H),
7.46(d, J=15.5Hz, 2H), 9.89(brs, 2H), 10.24(brs, 2H).
MS(ESI+) 688.5[M+].
【００５６】
（５）化合物（６ａ）の製造
５ａ（３０．０ｍｇ、４３，６μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液中に１，１’−カルボニルジイミダゾール（1,1'-carbonyldiimidazole）（ＣＤＩ）（４２ｍｇ、２６１μｍｏｌ）を加えた反応溶液を、室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（６ａ）（３５．７ｍｇ、１００％）を得た。
【００５７】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.59(s, 4H), 2.34(s, 4H), 3.78(s, 6H), 3.96(s, 6H),
7.11(s, 2H), 7.16(d, J=14.5Hz, 2H), 7.32(s, 2H),
7.45(s, 2H), 7.49(s, 2H), 7.87(d, J=14.5Hz, 2H),
7.90(s, 2H), 8.68(s, 2H), 10.07(brs, 2H), 10.23(brs, 2H).
【００５８】
（６） 化合物（７ａ）の製造
水素化ナトリウム（２．６ｍｇ、６４．４μｍｏｌ、６０％ oil suspension）の無水ジメチルホルムアミド（０．２ｍｌ）溶液中に、別途合成したＤＵ８６のセグメントＡ（１２．５ｍｇ、４８．３μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．２ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、化合物（６ａ）（１３．６ｍｇ、１７．２μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．２ｍｌ）溶液を加えた反応溶液を０℃下で４時間攪拌した。反応溶液中に１０ｍＭリン酸ナトリウム（２ｍｌ）緩衝溶液を０℃下で加えた後、減圧下溶媒を留去し黄色残留物を得た。粗結晶を桐山ロート上で蒸留水（１０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（７ａ）（１２．２ｍｇ、６１％）を得た。
【００５９】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.29(m, 2H), 1.58(s, 4H), 2.09(m, 2H), 2.33(s, 4H),
2.47(s, 6H), 3.45(m, 2H), 3.72(s, 6H), 3.73(s, 6H),
3.95(s, 6H), 4.18(m, 2H), 4.28(m, 2H),
6.57(d, J=14.5Hz, 2H), 6.83(brs, 2H), 6.99(s, 2H),
7.41(s, 2H), 7.44(s, 2H), 7.58(d, J=14.5Hz, 2H),
9.98(s, 2H), 10.23 (s, 2H), 12.36(brs, 2H).
MS(ESI+) 1168.6[M＋].
【００６０】
実施例２ 化合物（７ｂ）の製造
（１） 化合物（４ｂ）の製造
実施例１の（２）で製造した化合物（３）（４２０ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（１：１、３０ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（２００ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（１０６ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）の蒸留水（１ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にて濾過した後、溶媒を留去して褐色粗結晶（３２７ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液中にエチルジイソプロピルアミン（０．６ｍｌ、３．６３ｍｍｏｌ）とテレフタル酸ジクロライド（terephtaloyl chloride）（１２２ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を、順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０→３％ ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）にて精製することにより化合物（４ｂ）（２２３ｍｇ、４８％ for ２ steps）を得た。
【００６１】
１H NMR(CDCl３) δ
1.33(t, J=7.5Hz, 6H), 3.71(s, 6H), 4.12(s, 6H),
4.25(q, J=7.5Hz, 4H), 6.13(d, J=16.0Hz, 2H),
6.55(s, 2H), 7.38(s, 2H), 7.56(d, J=16.0Hz, 2H),
7.61(s, 2H), 8.02(s, 4H), 8.38(brs, 2H), 8.82(brs, 2H).
【００６２】
（２） 化合物（５ｂ）の製造
化合物（４ｂ）（３０．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．２ｍｌ）懸濁液中に１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセン−７（1,8-dazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene）（ＤＢＵ）（０．２ｍｌ、１．３４ｍｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１２時間攪拌した。反応の終結をＨＰＬＣ（０→１００％ ５０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム水溶液−アセトニトリル, ２０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で確認した後、反応溶液の溶媒を留去して得た褐色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を用いて結晶化させた。得られたＤＢＵ塩化合物を１％希塩酸を用いて脱塩した後、生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め減圧下乾燥することにより化合物（５ｂ）（２１．５ｍｇ、８５％）を得た。
【００６３】
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.68(s, 6H), 4.00(s, 6H), 6.04(d, J=16.0Hz, 2H), 6.81(s, 2H),
7.43(s, 2H), 7.46(d, J=16.0Hz, 2H), 7.66(s, 2H), 8.10(s, 4H),
9.95(s, 2H), 10.95(s, 2H).
【００６４】
（３） 化合物（６ｂ）の製造
化合物（５ｂ）（５４．５ｍｇ、７９．９μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液中に、ＣＤＩ（７６ｍｇ、２３１μｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（６ｂ）（６３．０ｍｇ、９７％）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.79(s, 6H), 4.02(s, 6H), 7.10(s, 2H), 7.17(d, J=15.0Hz, 2H),
7.32(s, 2H), 7.50(s, 2H), 7.68(s, 2H), 7.87(d, J=15.0Hz, 2H),
7.90(s, 2H), 8.11(s, 4H), 8.67(s, 2H), 10.15(s, 2H),
10.96(s, 2H).
【００６５】
（４） 化合物（７ｂ）の製造
水素化ナトリウム（４．５ｍｇ、１１２．５μｍｏｌ、６０％ oil suspension）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液中に、別途合成したＤＵ８６のセグメントＡ（２１．０ｍｇ、８１．３μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、化合物（６ｂ）（２１．０ｍｇ、２４．９μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．８ｍｌ）溶液を加えた反応溶液を０℃下で１８時間攪拌した。反応溶液中に１０ｍＭリン酸ナトリウム（２ｍｌ）緩衝溶液を０℃下で加えた後、減圧下溶媒を留去し黄色残留物を得た。粗結晶を桐山ロート上で蒸留水（１０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（７ｂ）（２４．５ｍｇ、８３％）を得た。
【００６６】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.30(m, 2H), 2.09(m, 2H), 2.47(s, 6H), 3.46(m, 2H),
3.74(s, 12H), 4.02(s, 6H), 4.20(m, 2H), 4.29(m, 2H),
6.60(d, J=15.0Hz, 2H), 6.83(brs, 2H), 7.01(s, 2H),
7.43(s, 2H), 7.58(d, J=15.0Hz, 2H), 7.68(s, 2H),
8.12(s, 4H), 10.05(s, 2H), 10.96(s, 2H), 12.36(brs, 2H).
MS(ESI+) 1188.9[M＋].
【００６７】
実施例３ 化合物（７ｃ）の製造
（１） 化合物（４ｃ）の製造
実施例１の（２）で製造した化合物（３）（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（１：１、２０ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（１００ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（４４ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．５ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にて濾過した後、溶媒を留去して褐色粗結晶（９３ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（２ｍｌ）溶液中にエチルジイソプロピルアミン（０．１５ｍｌ、０．８８ｍｍｏｌ）とフマル酸ジクロライド（fumaryl chloride）（１６μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０→３％ ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）にて精製することにより化合物（４ｃ）（５０．１ｍｇ、４１％ for ２ steps）を得た。
【００６８】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.25(t, J=7.0Hz, 6H), 3.70(s, 6H), 3.98(s, 6H),
4.16(q, J=7.0Hz, 4H), 6.11(d, J=16.0Hz, 2H), 6.85(s, 2H),
7.26(s, 2H), 7.45(s, 2H), 7.52(d, J=16.0Hz, 2H),
7.61(s, 2H), 9.97(s, 2H), 10.90(s, 2H).
【００６９】
（２） 化合物（５ｃ）の製造
化合物（４ｃ）（４０．１ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．３ｍｌ）懸濁液中にＤＢＵ（０．３ｍｌ、２．００ｍｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１７時間攪拌した。反応の終結をＨＰＬＣ（０→１００％ ５０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム水溶液−アセトニトリル, ２０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で確認した後、反応溶液の溶媒を留去して得た褐色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を用いて結晶化させた。得られたＤＢＵ塩化合物を１％希塩酸を用いて脱塩した後、生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め減圧下乾燥することにより化合物（５ｃ）（２２．５ｍｇ、６１％）を得た。
【００７０】
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.69(s, 6H), 3.98(s, 6H), 6.04(d, J=16.0Hz, 2H),
6.83(s, 2H), 7.26(s, 2H), 7.43(s, 2H), 7.47(d, J=16.0 Hz, 2H),
7.60(s, 2H), 9.97(s, 2H), 10.90(s, 2H).
【００７１】
（３） 化合物（６ｃ）の製造
化合物（５ｃ）（１７．５ｍｇ、２６．５μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液中にＣＤＩ（３０ｍｇ、１８５μｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（６ｃ）（１８．５ｍｇ、９２％）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.78(s, 6H), 4.00(s, 6H), 7.11(s, 2H),
7.17(d, J=15.0Hz, 2H), 7.28(s, 2H), 7.34(s, 2H),
7.52(s, 2H), 7.63(s, 2H), 7.89(d, J=15.0Hz, 2H),
7.91(s, 2H), 8.68(s, 2H), 10.17(s, 2H), 10.89(s, 2H).
【００７２】
（４） 化合物（７ｃ）の製造
水素化ナトリウム（２．８ｍｇ、７１．２μｍｏｌ、６０％ oil suspension）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液中に、別途合成したＤＵ８６のセグメントＡ（１３．８ｍｇ、５３．４μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、化合物（６ｃ）（１３．５ｍｇ、１７．８μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．７ｍｌ）溶液を加えた反応溶液を０℃下で１２時間攪拌した。反応溶液中に１０ｍＭリン酸ナトリウム（２ｍｌ）緩衝溶液を０℃下で加えた後、減圧下溶媒を留去し黄色残留物を得た。粗結晶を桐山ロート上で蒸留水（１０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（７ｃ）（９．６ｍｇ、４７％）を得た。
【００７３】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.30(m, 2H), 2.08(m, 2H), 2.47(s, 6H), 3.47(m, 2H),
3.73(s, 6H), 3.74(s, 6H), 3.99(s, 6H), 4.20(m, 2H),
4.29(m, 2H), 6.59(d, J=15.0Hz, 2H), 6.79(brs, 2H),
7.01(s, 2H), 7.28(s, 2H), 7.43(s, 2H),
7.58(d, J=15.0Hz, 2H), 7.61(s, 2H), 10.07(s, 2H),
10.89(s, 2H), 12.36(brs, 2H).
MS(ESI+) 1138.5[M＋].
【００７４】
実施例４ 化合物（７ｄ）の製造
（１） 化合物（４ｄ）の製造
実施例１の（２）で製造した化合物（３）（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（１：１、２０ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（１００ｍｇ）を加えた。さらに水素化ホウ素ナトリウム（４４ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．５ｍｌ）溶液を０℃下で滴下した後、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にて濾過した後、溶媒を留去して褐色粗結晶（６３ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（２ｍｌ）溶液中にＣＤＩ（１６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０→３％ ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）にて精製することにより化合物（４ｄ）（５１．３ｍｇ、４５％ for ２ steps）を得た。
【００７５】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.24(t, J=7.0Hz, 6H), 3.70(s, 6H), 3.96(s, 6H),
4.15(q, J=7.0Hz, 4H), 6.08(d, J=16.0Hz, 2H), 6.87(s, 2H),
7.26(s, 2H), 7.45(s, 2H), 7.51(d, J=16.0Hz, 2H),
8.31(brs, 2H), 10.10(s, 2H).
【００７６】
（２） 化合物（５ｄ）の製造
４ｄ（４１．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．３ｍｌ）懸濁液中にＤＢＵ（０．３ｍｌ、２．００ｍｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１７時間攪拌した。反応の終結をＨＰＬＣ（０→１００％ ５０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム水溶液−アセトニトリル, ２０ｍｉｎ、２５４ｎｍ）で確認した後、反応溶液の溶媒を留去して得た褐色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を用いて結晶化させた。得られたＤＢＵ塩化合物を１％希塩酸を用いて脱塩した後、生じた沈殿物を桐山ロートを用いて集め減圧下乾燥することにより化合物（５ｄ）（２７．４ｍｇ、７３％）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.68(s, 6H), 3.96(s, 6H), 6.01(d, J=16.0Hz, 2H),
6.84(s, 2H), 7.26(s, 2H), 7.42(s, 2H), 7.47(d, J=16.0Hz, 2H),
8.84(brs, 2H), 10.08(s, 2H).
【００７７】
（３） 化合物（６ｄ）の製造
化合物（５ｄ）（２２．４ｍｇ、３７．１μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液中にＣＤＩ（３０ｍｇ、１８５μｍｏｌ）を加えた反応溶液を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（１０ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（６ｄ）（２５．２ｍｇ、９６％）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
3.79(s, 6H), 3.98(s, 6H), 7.10(s, 2H),
7.15(d, J=15.0Hz, 2H), 7.28(s, 2H), 7.34(s, 2H),
7.50(s, 2H), 7.87(d, J=15.0Hz, 2H), 7.90(s, 2H),
8.67(s, 2H), 8.89(brs, 2H), 10.25(s, 2H).
【００７８】
（４） 化合物（７ｄ）の製造
水素化ナトリウム（４．６ｍｇ、１１４．４μｍｏｌ、６０％ oil suspension）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液中に、別途合成したＤＵ８６のセグメントＡ（２２．１ｍｇ、８５．８μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液を０℃下で加えた後、化合物（６ｄ）（２０．２ｍｇ、２８．６μｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（０．１ｍｌ）溶液を加えた反応溶液を０℃下で１２時間攪拌した。反応溶液中に１０ｍＭリン酸ナトリウム（２ｍｌ）緩衝溶液を０℃下で加えた後、減圧下溶媒を留去し黄色残留物を得た。粗結晶を桐山ロート上で蒸留水（１０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（７ｄ）（５．５ｍｇ、１８％）を得た。
【００７９】
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.29(m, 2H), 2.09(m, 2H), 2.47(s, 6H), 3.44(m, 2H),
3.72(s, 6H), 3.73(s, 6H), 3.97(s, 6H), 4.18(m, 2H),
4.27(m, 2H), 6.56(d, J=14.5Hz, 2H), 6.84(brs, 2H),
7.01(s, 2H), 7.26(s, 2H), 7.42(s, 2H),
7.57(d, J=14.5Hz, 2H), 8.82(brs, 2H), 10.16(s, 2H),
12.35(brs, 2H).
MS(ESI+) 1084.5[M＋].
【００８０】
実施例５ ＩｍＩｍＰｙ（化合物（１１））の製造
（１） Ｏ２ＮＰｙＬＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２（化合物（８））の製造
Ｏ２ＮＰｙＣＯＣＣｌ３（５００ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）にジメチルアミノプロピルアミン（１ｍｌ、８．３３ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合物を室温下で１２時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た黄色残留物をジエチルエーテル（３ｍｌ）を用いて結晶化を行い化合物（８）（４６０ｍｇ、９７％）を得た。
１H NMR(CDCl３) δ
1.75(t, J=6.0Hz, 2H), 2.34(s, 6H), 2.54(t, J=6.0Hz, 2H),
3.49(q, J=6.0Hz, 2H), 4.00(s, 3H), 6.94(s, 1H),
7.52(s, 1H), 8.68(brs, 1H).
【００８１】
（２） Ｏ２ＮＩｍＰｙＬＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２（化合物（９））の製造
化合物（８）（４６０ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）の無水メタノール（３ｍｌ）溶液中に１０％パラジウム−炭素（１２０ｍｇ）を加えた後、反応混合物を水素圧下、室温で２時間攪拌した。反応溶液をセライト（ＭｅＯＨ）にて濾過した後、溶媒を留去して黄色粗結晶（４１３ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（８ｍｌ）溶液中に、エチルジイソプロピルアミン（０．５ｍｌ、２．８７ｍｍｏｌ）と、別途合成したＯ２ＮＩｍＣＯＣＣｌ３（４９３ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た残留物中に、蒸留水（３０ｍｌ）を加えて生じる黄色沈殿物を桐山ロートに用いて濾取した。蒸留水（３０ｍｌ）、ジエチルエーテル（５ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって化合物（９）（５８７ｍｇ、８６％ for ２ steps）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.61(t, J=7.0Hz, 2H), 2.14(s, 6H), 2.24(t, J=7.0Hz, 2H),
3.19(q, J=7.0Hz, 2H), 3.81(s, 3H), 4.04(s, 3H), 6.97(s, 1H),
7.27(s, 1H), 8.14(brs, 1H), 8.61(s, 1H), 10.80(brs, 1H).
【００８２】
（３） Ｏ２ＮＩｍＩｍＰｙＬＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２（化合物（１０））の製造
化合物（９）（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の無水メタノール（３ｍｌ）溶液中に１０％パラジウム−炭素（５０ｍｇ）を加えた後、反応混合物を水素圧下、室温で４時間攪拌した。反応溶液をセライト（ＭｅＯＨ）にて濾過した後、溶媒を留去して黄色粗結晶（６５．３ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶の無水塩化メチレン（２ｍｌ）溶液中に、エチルジイソプロピルアミン（０．１ｍｌ、０．５７ｍｍｏｌ）と、別途合成したＯ２ＮＩｍＣＯＣＣｌ３（７２．２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を順次０℃下で加えた後、反応混合物を室温下で１５時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た残留物中に、蒸留水（１０ｍｌ）を加えて生じる黄色沈殿物を桐山ロートを用いて濾取した。蒸留水（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（２ｍｌ）にて順次洗浄し、減圧下乾燥することによって化合物（１０）（５８．２ｍｇ、４４％ for ２ steps）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.61(t, J=7.0Hz, 2H), 2.15(s, 6H), 2.25(t, J=7.0Hz, 2H),
3.19(q, J=7.0Hz, 2H), 3.80(s, 3H), 4.04(s, 3H),
4.06(s, 3H), 6.91(s, 1H), 7.23(s, 1H), 7.58(s, 1H),
8.13(brs, 1H), 8.65(s, 1H), 10.29(s, 1H).
【００８３】
（４） ＡｃＨＮＩｍＩｍＰｙＬＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２（化合物（１１））の製造
化合物（１０）（４８．２ｍｇ、９６．４μｍｏｌ）の無水メタノール−酢酸エチル（２：１、６ｍｌ）混合溶液中に１０％パラジウム−炭素（４０ｍｇ）を加えた後、水素化ホウ素ナトリウム（８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の蒸留水（０．４ｍｌ）溶液を０℃下で滴下し、反応混合物を室温下で２０分攪拌した。反応溶液をセライト（ＭｅＯＨ）にて濾過した後、溶媒を留去して黄色粗結晶（３８ｍｇ）を得た。さらなる精製に付すことなく直ちにこのものを次の反応に用いた。
粗結晶にエチルジイソプロピルアミン（０．１ｍｌ、０．５７ｍｍｏｌ）と無水酢酸（０．１ｍｌ、１．０５ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合物を室温下で４時間攪拌した。反応溶液の溶媒を留去して得た残留物中に、クロロホルム（１ｍｌ）を加えて生じる不溶物を濾過により除いた。溶媒を留去して得た粗結晶にジエチルエーテル（２ｍｌ）を加えて洗浄し、減圧下乾燥することによって標記の化合物（１１）（２３．２ｍｇ、４７％ for ２ steps）を得た。
１H NMR(DMSO-d６) δ
1.61(m, 2H), 2.04(s, 3H), 2.14(s, 6H), 2.25(m, 2H),
3.19(m, 2H), 3.81(s, 3H), 3.98(s, 3H), 4.00(s, 3H),
6.92(s, 1H), 7.23(s, 1H), 7.51(s, 1H), 7.56(s, 1H),
8.12(brs, 1H), 9.34(s, 1H), 10.27(s, 1H), 10.30(s, 1H).
【００８４】
実施例６ ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント３μＭとその相補的ＤＮＡオリゴマー６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と先に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。Milli-Ｑ精製した蒸留水１１０μｌを加えて希釈した後、そこから１μｌを取り出した。その溶液（１μｌ）から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
【００８５】
実施例７ インターストランドクロスリンク体の構造確認試験
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント３μＭとその相補的ＤＮＡオリゴマー６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と先に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。 反応溶液より１μｌ取り出し、そこにMilli-Ｑを１１μｌ加えて希釈した。その希釈溶液から１μｌ取り出しレーン２、レーン７に用いた。希釈溶液（１１μｌ）を９０℃で２０分間振動した後、ピペリジン（１μｌ）を加えさらに９０℃で２０分間振動した。その溶液を遠心減圧後、さらに一晩凍結乾燥を行った。そこに５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１μｌとMilli-Ｑを１０μｌ加えて希釈した。その希釈溶液から１μｌ取り出しレーン３、レーン８に用いた。溶液（１０μｌ）中にＡｐ（１μｌ）を加え３７℃で２時間振動した後、１．１μｌ取り出しレーン４、レーン９に用いた。
それぞれ取り出した反応溶液から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させ、その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
【００８６】
実施例８ インターストランドクロスリンク体の塩基配列特異性試験
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント３μＭと各種ＤＮＡオリゴマー６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と先に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。Milli-Ｑ精製した蒸留水１１０μｌを加えて希釈した後、そこから１μｌを取り出した。その溶液（１μｌ）から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
【００８７】
実施例９ インターストランドクロスリンク反応の最適条件試験
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に各種の５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント３μＭとそれぞれに対応した相補的ＤＮＡオリゴマー６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と先に表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。Milli-Ｑ精製した蒸留水１１０μｌを加えて希釈した後、そこから１μｌを取り出した。その溶液（１μｌ）から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
【００８８】
実施例１０ 試薬濃度と等量比の反応条件試験
全量１０μｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント（ＴＸＲ−１８）３μＭと相補的ＤＮＡオリゴマー（ＯＤＮ−１５）６μＭ、ＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）と表記した濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf）に入れて３７℃下で一晩静置した。
［７ａ（μＭ）、ＩｍＩｍＰｙ（μＭ）；５０、１００（レーン１）；２５、５０（レーン２）；１２、２５（レーン３）；６、１２（レーン４）；３、６（レーン５）；２５、１００（レーン６）；２５、５０（レーン７）；２５、２５（レーン８）；２５、１２（レーン９）、２５、６（レーン１０）］
Milli-Ｑ精製した蒸留水１１０μｌを加えて希釈した後、そこから１μｌを取り出した。その溶液（１μｌ）から遠心減圧下得られたＤＮＡをローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。その２μｌについて、HITACHI 5500-S DNA sequencer systemを用いた１５％ディネーチャーポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った。
結果を図６に示す。図６の各レーンにおける７ａ（μＭ）とＩｍＩｍＰｙ（μＭ）の濃度は前記したとおりである。
また、クロスリンキング収率を図７に示す。図７の左側は、ＩｍＩｍＰｙと７ａが２：１の場合の試料の等量を示し、図７の右側は７ａが２５μＭの場合のＩｍＩｍＰｙの等量を示している。
【００８９】
【発明の効果】
本発明は、ＤＮＡ上に存在する特定の塩基配列に対して選択的にインターストランドクロスリンクすることを可能とする試薬である。このことはヒトゲノム上での重要な遺伝子配列、あるいは遺伝子異常に対する有用なドラッグとして、はじめての遺伝子レベルでの創薬を実現する可能性を秘めている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の化合物のインターストランドクロスリンクをポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析した実験結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】図２は、２組のＤＮＡ対を用いて、本発明の化合物のインターストランドクロスリンク反応を解析した実験結果を示す、図面に代わる写真である。
【図３】図３は、本発明の化合物（７ａ）とＩｍＩｍＰｙを用いて形成されたインターストランドクロスリンク体の化学構造を示すものである。
【図４】図４は、種々のトリアミドを併用して本発明の化合物のインターストランドクロスリンク反応を解析した実験結果を示す、図面に代わる写真である。
【図５】図５は、種々の長さのＤＮＡを用いて本発明の化合物のインターストランドクロスリンク反応を解析した実験結果を示す、図面に代わる写真である。
【図６】図６は、本発明の化合物（７ａ）及びＩｍＩｍＰｙの種々の濃度におけるクロスリンキング反応の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図７】図７は、本発明の化合物（７ａ）及びＩｍＩｍＰｙを用いた場合の種々の条件下におけるクロスリンキング収率をグラフ化したものである。
Claims (7)
- 一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ）
（式中、Ａ−Ｌ−Ｂ−コンポーネントが次式（II）
で表されるＤＮＡの２本鎖をインターストランドクロスリンクすることができる化合物。 - Ｘが、−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−基で表される化合物である請求項１に記載の化合物。
- 請求項１又は２に記載のインターストランドクロスリンクすることができる化合物からなる、２本鎖ＤＮＡのインターストランドクロスリンク剤。
- 請求項１又は２に記載の化合物を用いて、２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分をインターストランドクロスリンクする方法。ただし、人体に適用する場合を除く。
- ２本鎖ＤＮＡのインターストランドクロスリンクを、さらにＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を有する物質の存在下に行う請求項４に記載の方法。
- ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を有する物質が、ＩｍＩｍＰｙで表される物質である請求項４又は５に記載の方法。
- 特定の塩基配列が、ＴＧＡＣＧ若しくはＣＧＡＣＧ又はそれらの相補鎖である請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
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