JP3045706B1

JP3045706B1 - Ｄｎａの特定塩基配列をアルキル化する化合物及びその合成法

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Publication number: JP3045706B1
Application number: JP10260710A
Authority: JP
Inventors: 弘杉山; 志福陶; 烈斎藤
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 2000-05-29
Anticipated expiration: 2018-09-14
Also published as: WO2000015641A1; JP3753939B2; US6566336B1; JP2000159768A

Abstract

【要約】【課題】本発明は、塩基対の水素結合のマイナーグ
ループを認識すると共に、塩基と共有結合をし得る化合
物を提供する。本発明の化合物は、特定の塩基配列を認
識すると共に、隣接する塩基と共有結合により強固に結
合し、当該塩基配列を有する遺伝子の発現を制御するこ
とができる。【解決手段】本発明は、次式（Ｉ）【化１】（式中、Ｒは低級アミル基又はポリアミド基を示し、Ｘ
は窒素原子又はＣＨを示す。）で表される化合物に関す
る。また、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表される化合
物からなる遺伝子のアルキル化剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子をアルキル
化することができる化合物、その化合物を用いたアルキ
ル化剤、そのアルキル化剤を用いて遺伝子の発現を制御
する方法、及び、当該化合物を含有してなる医薬組成物
に関する。

【０００２】

【従来の技術】分子生物学の急速な進歩により、がんを
はじめさまざまな疾病の原因がＤＮＡの変異であること
が次つぎと明らかにされてきている。また、ヒューマン
ゲノムプロジェクトによりヒトＤＮＡの全塩基配列の決
定も数年以内に完了するものとみられ、これら疾病の分
子レベルの理解に基づいた治療法の出現がますます望ま
れてきている。しかし細胞の外から遺伝子の発現を制御
する一般的な方法論が確立していないことが、このよう
なアプローチの実現の大きな壁になっている。最近、デ
ィスタマイシンなどの抗生物質によるＤＮＡの分子認識
をヒントとして、塩基配列特異的に結合する分子が設計
され、遺伝子発現の制御が可能になってきた。

【０００３】三日月型をしたディスタマイシン、ネトロ
プシンなどの抗生物質が、ＤＮＡのアデニン・チミン
（Ａ・Ｔ）塩基対に富む配列のＡ−Ｔ間の水素結合のマ
イナーグループに結合することがＸ線結晶構造解析やＮ
ＭＲにより明らかにされ、この認識を利用したさまざま
な分子が合成されてきた。ピロール環をイミダゾールに
変えることにより、グアニン・シトシン（Ｇ・Ｃ）塩基
対を認識するように改変できることについては以前から
予想されていたが（M.L,Kopka,C.Yoon,D.Goodsell,P.Pj
ura,R.E.Dickerson,Proc.Natl,Acad.Aci,USA,82,1376,
(1985)) ; (J.W.Lown,K.Krowickl,U.G.Bhat,A.Skorobog
aty,B.Ward,J.C.Dabrowiak,Biochemistry,25,7408(198
6).)、実際にはそう単純ではなく、多くの混沌とした実
験結果が得られていた。

【０００４】Ｗｅｍｍｅｒらは、ディスタマイシンによ
るＤＮＡへの結合についてＮＭＲを用いて詳細に検討し
た。その結果、これまで１枚しか収容されないと考えら
れていたＤＮＡマイナーグループにディスタマイシンが
２枚入りうることを示した（J.G.Pelton,D.E.Wemmer,Pr
oc.Natl,Acad.Sci,USA,86,5723(1989).)。Ｄｅｒｖａｎ
らはこのような結合モードを考慮すると、いままでの混
沌とした結果が説明できることに着目し、アンチパラレ
ルに配向したメチルピロール（Ｐｙ）、メチルイミダゾ
ール（Ｉｍ）ポリアミドのペアにより２本鎖ＤＮＡの塩
基配列が認識できることを見いだした。

【０００５】すなわち、Ｐｙ−ＩｍによりＣ−Ｇ塩基対
が、Ｉｍ−ＰｙによりＧ−Ｃ塩基対が、Ｐｙ−Ｐｙによ
りＡ−ＴまたはＴ−Ａ塩基対を認識するという一般則を
導きだしたのである（S.White,E.E.Baird,P.B.Dervan,C
hemistry&Biology,4,569(1997).)。ペアに共有結合を導
入して、結合におけるエントロピー損失を防ぎ、より強
い結合と認識能を得るためいろいろなヘアピンや環状の
ポリアミドが合成された。なかでもγリンカー(−ＮＨ
ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−）をもつヘアピンがすぐれた
結合能と認識能をもつことが示され、そのＤＮＡとの複
合体の構造も決定されている（R.P.L.de Clairac,B.H.G
eierstanger,M.Marksich,P.B.Dervan,D.E.Wemmer,J.Am.
Chem.Soc.,119,7909(1997).）。

【０００６】また、ピロールイミダゾールのみでつくら
れるヘアピンポリアミドでは認識可能な配列は７塩基対
が上限であるが（J.M.Turner,E.F.Baird,P.B.Dervan,ib
id.,119,7636(1997).)、ホモダイマーを用いた系におい
てＡ・Ｔ配列を認識するβ−アラニン−ペアの導入で１
１塩基対の認識も可能になっている（S.E.Swalley,E.E.
Baird,D.B.Dervan,Chem.Enr.J,3,1600(1997)）。

【０００７】さらに、Ｄｅｒｖａｎ、Ｇｏｔｔｅｓｆｅ
ｌｄらはＺｎフィンガータンパクであるＴＦＩＩＩＡの
認識配列中の４番目のフィンガーの結合配列のマイナー
グループに拮抗して結合するポリアミドを設計し５ＳＲ
ＮＡの発現がｉｎｖｉｔｒｏの実験において選択的に
制御されることを示した（J.M.Gottesfeld,L.Neely,J.
W.Trauger,E.E.Baird,P.B.Dervan,Nature,387,202(199
7).)。また、同時にｉｎｖｉｔｒｏの実験において、ポ
リアミドが核内に透過していることも示された。

【０００８】近年、遺伝子の制御に関して、オリゴヌク
レオチドやペプチド核酸（ＰＮＡ）などが注目されてい
るが、細胞透過性が問題となっていることを考えると、
これらメチルピロール-メチルイミダゾールポリアミド
は遺伝子発現を制御する分子として、分子生物学の道具
として、さらには医薬としても期待がもてる化合物であ
ることが示されてきた。

【０００９】従来のＰｙ−Ｉｍ系のポリアミドは、塩基
対の水素結合のマイナーグループを認識するだけであ
り、遺伝子と共有結合するものではなかった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、塩基対の水
素結合のマイナーグループを認識すると共に、塩基と共
有結合をし得る化合物を提供する。本発明の化合物は、
特定の塩基配列を認識すると共に、隣接する塩基と共有
結合により強固に結合し、当該塩基配列を有する遺伝子
の発現を制御することができる。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、次式（Ｉ）

【００１２】

【化２】［式中、Ｒは低級アシル基、又はＮ−メチルピロール
環、Ｎ−メチルイミダゾール環及び／又はγ−リンカー
（−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−）を含有するポリア
ミド基を示し、Ｘは窒素原子又はＣＨを示す。］で表さ
れる化合物に関する。

【００１３】また、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表さ
れる化合物からなる遺伝子のアルキル化剤に関する。よ
り詳細には、本発明のアルキル化剤は、遺伝子中の特異
的な塩基配列、Ｗ−Ｗ−Ｖ（式中、ＶはＡ又はＧ、Ｗは
Ａ若しくはＴ又はＵを示す。）又はＧ−Ｗ−Ｖ（式中、
ＶはＡ又はＧ、ＷはＡ若しくはＴ又はＵを示す。）など
の配列を認識して当該部分を選択的にアルキル化するこ
とができるものである。さらに、本発明は、前記のアル
キル化剤を含んで成る、遺伝子の特異的な塩基配列を包
含する部分の発現を制御する遺伝子発現制御剤に関す
る。また、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表される化合
物を含有してなる、遺伝子により誘発され得る疾患を治
療又は予防するための医薬組成物にも関する。

【００１４】本発明の一般式（Ｉ）におけるＲの低級ア
シル基としては炭素数１〜１２、好ましくは２〜６の低
級アシル基であり、例えば、アセチル基、ｎ−プロピオ
ニル基、イソプロピオニル基、ｎ−ブタノイル基などが
挙げられるが、立体的に小さなものが好ましい。

【００１５】また、ＲのＮ−メチルピロール環、Ｎ−メ
チルイミダゾール環及び／又はγ−リンカー（−ＮＨＣ
Ｈ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−）を含有するポリアミド基とし
ては、Ｎ−メチル−４−アミノ−２−カルボキシピロー
ル（ＨＯ−Ｐｙ−Ｈ）、Ｎ−メチル−４−アミノ−２−
カルボキシイミダゾール（ＨＯ−Ｉｍ−Ｈ）、４−アミ
ノ酪酸（ＨＯ−γ−Ｈ）（γ−リンカー用）などのアミ
ノカルボン酸からなるポリアミド基が挙げられる。これ
らのポリアミド基のアミドの窒素−水素結合の部位が、
遺伝子の塩基を認識し、即ち、一般的にはＰｙ−Ｉｍは
Ｃ−Ｇ対を認識し、Ｉｍ−ＰｙはＧ−Ｃ対を認識し、Ｐ
ｙ−ＰｙはＡ−Ｔ対又はＴ−Ａ対を認識することから、
認識させたい塩基配列に応じて、前記ポリアミド基を設
計することができる。

【００１６】Ｒにおけるポリアミド基のアミドは、遺伝
子の塩基対の片側に対して５〜７個、好ましくは３個ま
でのものが好ましく、それ以上のアミド基を有すること
もできるが、塩基配列に対する親和性の向上を期待する
ことは難しい。好ましいポリアミド基としては、Ｎ−メ
チル−４−アセチルアミノ−イミダゾール−２−カルボ
ニル基が挙げられる。

【００１７】Ｒにおけるポリアミド基中のγ−アミノ酪
酸部分は、γ−リンカーとして作用するものであり、こ
の部分でポリアミド鎖がヘアピンカーブして、遺伝子の
塩基対の対になっている塩基配列を認識することにな
る。本発明の一般式（Ｉ）におけるＲのＮ−メチルピロ
ール環、Ｎ−メチルイミダゾール環及び／又はγ−リン
カー（−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−）を含有するポ
リアミド基としては、次式

【００１８】

【化３】

【００１９】で示されるものが特に好ましい。

【００２０】本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の
アルキル化部分は、次式で示されるデュオカルマイシン
Ａ（DuocarmycinＡ）のアルキル化機構と同様な機構で
アルキル化する。

【００２１】

【化４】

【００２２】しかしながら、デュオカルマイシンＡのア
ルキル化はアデニン（Ａ）のプリン環でのみ生起するの
に対して、本発明の化合物のアルキル化はアデニン
（Ａ）又は（Ｇ）のいずれのプリン環においても生起す
る点で相違がある。

【００２３】本発明の化合物のアミド結合に続くＰｙ−
Ｐｙ−の部分は、遺伝子の塩基配列Ｗ−Ｗ（Ｗは、Ａ若
しくはＴ又はＵを示す。）を認識配列とし、Ｉｍ−Ｐｙ
−の部分は遺伝子の塩基配列のＧ−Ｗ（Ｗは、Ａ若しく
はＴ又はＵを示す。）を認識配列としている。したがっ
て、本発明の化合物は次式（II）又は（III）Ｗ−Ｗ−Ｖ（II）Ｇ−Ｗ−Ｖ（III）（式中、ＶはＡ又はＧ、ＷはＡ若しくはＴ又はＵを示
す。）の塩基配列を認識し、塩基Ｖ（Ａ又はＧ）の部分
で遺伝子と共有結合を形成するものである。

【００２４】しかしながら、本発明のアルキル化剤はこ
れらの塩基配列に制限されるものではなく、前述したよ
うに標的とする塩基配列を必要に応じて設計することが
できる。また、前述したＲの部分に置いて、さらにポリ
アミド結合を延ばすことにより、認識できる塩基配列を
さらに延ばすことができる。

【００２５】本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物
は、例えば、図１（図１は、Ｒがアセチル基の場合を示
す。）に示す方法で製造することができる。本発明の化
合物のアルキル化部分は、デュオカルマイシンＢ２（Ｄ
ｕｏＢ２）を原料として図１に示す方法により製造で
き、これを別に製造されたピロールカルボン酸誘導体を
用いてアミド化することにより製造される。より具体的
な製造例を後述する実施例において例示する。

【００２６】本発明の化合物のひとつであるＸが窒素原
子でＲがアセチル基の化合物（以下、ＩＰＤｕとい
う。）を用いて、８塩基の種々のオリゴヌクレオチドと
の認識をした結果を図２に示す。図２に示す試験は、本
発明の化合物ＩＰＤｕとディスタマイシンを使用したも
のであり、本発明の化合物を−●−○−△で示し、ディ
スタマイシンを＋）−◇−○−○−○で示している（図
中では、○が灰色で示されている。）。そして、本発明
の化合物の△印で示されている部分で遺伝子と共有結合
をしている。

【００２７】前述したように、ＩＰＤｕはＧ−Ｗ−Ｖ
（式中、ＶはＡ又はＧ、ＷはＡ若しくはＴ又はＵを示
す。）の塩基配列を認識するので、図２中の４種のオリ
ゴヌクレオチドのうち、Ｇ−Ｔ−Ｇの塩基配列を有する
もの（図２中の左側部分の２種）及びＧ−Ａ−Ｇの塩基
配列を有するもの（図２中の右下側のもの）は、その塩
基配列を認識して効率よく共有結合するのに対して、前
記した認識配列とは異なるＡ−Ｔ−Ｇの塩基配列を有す
るもの（図２中の右上側のもの）はミスマッチとなり、
反応が遅く、４６時間経過後も８％程度に過ぎない。こ
のように、本発明の化合物が完全に配列を認識している
ことが判る。

【００２８】図２の左下側に示されるオリゴヌクレオチ
ドが最もよくマッチしており、このものをエレクトロス
プレー質量分析で分析した結果を図６に示す。この質量
分析のスペクトルチャートから、本発明の化合物がＤＮ
Ａに共有結合していることが示された。

【００２９】図３は、前記同様に本発明のＸがＣＨでＲ
がアセチル基である化合物（以下、ＰＰＤｕという。）
を用いて試験をした結果を示すものである。前述したよ
うに、ＰＰＤｕはＷ−Ｗ−Ｖ（式中、ＶはＡ又はＧ、Ｗ
はＡ若しくはＴ又はＵを示す。）の塩基配列を認識する
ので、図３中の４種のオリゴヌクレオチドのうち、Ｔ−
Ｔ−Ｇの塩基配列を有するもの（図３中の下側部分の２
種）及びＡ−Ｔ−Ｇの塩基配列を有するもの（図３中の
左上側のもの）は、その塩基配列を認識して効率よく共
有結合するのに対して、前記した認識配列とは異なるＧ
−Ｔ−Ｇの塩基配列を有するもの（図３中の右上側のも
の）はミスマッチとなり、反応が遅く、２２時間経過後
も２６％程度に過ぎない。このように、本発明の化合物
が完全に配列を認識していることが判る。

【００３０】図４は、同様の試験を長鎖のＤＮＡを用い
て作った結果を示している。この試験に使用したＤＮＡ
の全塩基配列は配列表の配列番号２に示されている。図
４の右側はＰＰＤｕを用いた結合を、左側はＩＰＤｕを
用いた場合を示している。図４の右側においては、部分
配列がＷ−Ｗ−Ｇである箇所において本発明のＰＰＤｕ
によるアルキル化が生起していることが判った。また、
図４の左側においては、部分配列がＧ−Ｗ−Ｇである箇
所において本発明のＰＰＤｕによるアルキル化が生起し
ていることが判った。なお、図４の試験においては、Ｉ
ＰＤｕ又はＰＰＤｕの濃度を、４、８、１６、及び、３
２μＭの４段階で行っている（各濃度においてディスタ
マイシン（Ｄｉｓｔ）の濃度をそれぞれ８、１６、３
２、及び、６４μＭとした。）。

【００３１】図５は、本発明の化合物としてＰｙ−Ｐｙ
−Ｐｙ−γ−Ｉｍ−Ｐｙ−Ｐｙ−Ｄｕを用いて、３９２
ｂｐ（Ｉ’ＤＮＡ（配列表の配列番号１に示す。））と
４４９ｂｐ（ＩＩＩ’ＤＮＡ（配列表の配列番号３に示
す。））を用いて前記と同様な試験をした結果を示すも
のである。ＰＰＤｕの認識配列であるＷ−Ｗ−Ａの部分
配列を有する部分においてアルキル化が生起しているス
ポットが観察できた。この試験においては、本発明の前
記の化合物を濃度、０．２５、０．５、１．０、及び、
２．０μＭの４段階で使用した。

【００３２】以上の試験からも明らかなように、本発明
の化合物は、遺伝子の特定の塩基配列の部分に特異的に
アルキル化し、当該遺伝子の発現を阻害することができ
る。即ち、本発明の化合物は、遺伝子の標的とする塩基
配列の部分を特異的にアルキル化することができ、当該
アルキル化により遺伝子の機能を阻害することにより、
その発現を制御することができる。図７に本発明の好ま
しい化合物を例示されている。

【００３３】また、本発明の化合物は、ピロールイミダ
ゾール系のポリアミドであり、細胞透過性に優れてお
り、生体へ通常の方法で投与することにより、標的の遺
伝子を特異的に制御することができるものである。した
がって、本発明は、本発明の化合物を用いた遺伝子の特
異的なアルキル化剤、それを用いた遺伝子の制御方法、
及び、がんなどの遺伝子に誘発される各種疾患を治療又
は予防する医薬組成物を提供するものである。

【００３４】

【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００３５】実施例１（ＸがＮでＲがアセチル基の化合
物の製造）（１）アルキル化部（Ｄｕ）の製造窒素雰囲気下、デュオカルマイシンＢ_２１２２ｍｇ
（０．２０９ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍｌとアセト
ニトリル１０ｍｌの混合物に溶解し、０℃に冷却し、こ
れに２８％ソディウムメトキサイドのメタノール溶液１
２０μｌを滴下した。反応混合物を０℃で１１時間撹拌
した後、３５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．
３）を加えた。メタノールを留去し、食塩を加え、残渣
を酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾
燥し濃縮した。濃縮物をカラムクロマトグラフィー（ク
ロロホルム：アセトン＝１：０〜３：１）で精製した。
４４ｍｇの黄色の生成物を得た（収率７７％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ；6.06( s,br,1H), 5.
71( s,1H), 5.01( s,br,1H), 3.79( m,1H),3.71( s,3
H), 3.66( d,J=11.0Hz,1H), 3.01( m,1H),2.04( dd,J=
3.7Hz,1H), 1.61( s,3H),1.00( dd,J=3.7 and 4.9Hz,1
H).^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ；193.64, 176.55,
174.95, 168.32, 166.84, 108.82, 98.65, 71.14,53.2
1, 51.90, 30.49, 24.39, 22.60, 20.98 ＦＡＢＭＳｍ／ｅ２７５［Ｍ＋１］

【００３６】（２）Ｉｍ−Ｐｙの製造（ａ）窒素雰囲気下、４ｍｌの無水酢酸に、４−アミノ
−Ｎ−メチル−イミダゾール−２−イル−カルボン酸エ
チルエステル塩酸塩３．０２５ｇ（１４．７ｍｍｏｌ）
とピリジン１０ｍｌ及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＥＡ）１５ｍｌの混合物を加えた。反応混
合物を１時間室温で撹拌し、約１５ｍｌに濃縮した。１
００ｍｌの水を加えた後、混合物を酢酸エチルで抽出し
た。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、−３０
℃に冷却して、目的のＮ−アセチル体２．６４ｇを得た
（収率８５％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；10.55( s,1H),
7.47( s,1H), 4.25( q,J=7.0Hz,2H), 3.89( s,3H),1.97
( s,3H), 1.28( t,J=7.0Hz,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；167.00, 158.
43, 137.58, 130.77, 114.62, 60.47, 35.32, 22.60,1
4.02 ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_９Ｈ_１３Ｎ_３Ｏ_３計算値：２１１．０９５７実測値：２１１．０９６０

【００３７】（ｂ）前記の（ａ）で得られたアセチル体
０．９５０ｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を１６ｍｌのメタノ
ール中にとり、２Ｎ−ＮａＯＨ１６ｍｌを加えた。反応
混合物を室温で３時間撹拌した。メタノールを留去し、
残った水溶液を４℃に冷却し、１Ｎ−ＨＣｌをもちいて
ｐＨ２に調整した。沈殿物を集め水で洗浄し、乾燥して
遊離カルボン酸０．７６３ｇを白色固体として得た（収
率９３％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；10.45( s,1H),
7.43( s,1H), 3.87( s,3H), 1.97( s,3H) ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_７Ｈ_９Ｎ_３Ｏ_３計算値：１８３．０６４４実測値：１８３．０６６６

【００３８】（ｃ）前記の（ｂ）で得られた遊離カルボ
ン酸体０．５５１ｇ（３．０１ｍｍｏｌ）の３０ｍｌＤ
ＭＦ溶液に、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ
ｔ）０．４８８ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）とジシクロヘキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）０．７４４ｇ（３．６１
ｍｍｏｌ）の混合物を加えた。混合物を室温で４０時間
撹拌した後、メチル４−アミノ−１−メチルピロール
−２−カルボン酸エステル塩酸塩０．５７４ｇ（３．０
１ｍｍｏｌ）とＤＭＦ１０ｍｌ及び１５ｍｌのＤＩＥＡ
の混合物を加えた。混合物を室温で４日間撹拌した。濾
過して、ＤＭＦを留去し、２００ｍｌの酢酸エチルを加
えた。濾過して沈殿物を除き、酢酸エチル溶液を１Ｎ塩
酸で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、−３０
℃に冷却して、目的のアミド−メチルエステル体０．５
２２ｇを得た（収率５４％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；10.19( s,1H),
10.05( s,1H), 7.50( d,J=1.8Hz,1H), 7.40( s,1H),6.6
8( d,J=1.8Hz,1H), 3.93( s,3H), 3.83( s,3H), 3.73(
s,3H),2.01( s,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−d_６） δ；167.24, 160.7
3, 155.86, 136.15, 133.78, 121.99, 120.95, 118.78,
114.01, 108.69, 50.93, 36.23, 34.88, 22.69, ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_１４Ｈ_１７Ｎ_５Ｏ_４計算値：３１９．１２８０実測値：３１９．１２７７

【００３９】（ｄ）前記の（ｃ）で得られたアミド−メ
チルエステル体０．５００ｇをメタノール１２．５ｍｌ
に溶解し、１２．５ｍｌの２Ｎ−ＮａＯＨを加えた。そ
の溶液を室温で終夜撹拌した。メタノールを留去し、水
２０ｍｌを加え濾過し、得られた水溶液を１Ｎ塩酸でｐ
Ｈ２に調整した。沈殿物を集め乾燥して、目的の遊離カ
ルボン酸体０．４３９ｇを得た（収率９２％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；12.18( s,1H),
10.20( s,1H), 9.98( s,1H), 7.45( s,1H),7.40( s,1
H), 6.92( s,1H), 3.92( s,3H), 3.82( s,3H),3.34( s,
3H), 2.01( S,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−d_６） δ；167.23, 161.8
6, 155.79, 136.15, 133.83, 121.69, 120.42, 119.82,
113.94, 108.74, 36.18, 34.88, 22.69, ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_１３Ｈ_１５Ｎ_５Ｏ_４計算値：３０５．１１２４実測値：３０５．１１２３

【００４０】（ｅ）前記の（ｄ）で得られた遊離カルボ
ン酸体０．１３５ｇ（０．４４ｍｍｏｌ）と１．１’−
カルボニルジイミダゾール８４ｍｇを５ｍｌのＤＭＦに
溶解した。室温で５時間撹拌した後、反応混合物を１０
０ｍｌの冷水に注いだ。沈殿物を集め、塩化メチレンで
洗浄し、真空で乾燥し、目的の活性アミド体０．１０８
ｇを得た（収率６９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；10.18( s,2H),
8.24( s,1H), 7.79( s,1H), 7.68( s,1H),7.43( s,1H),
7.13( s,1H), 7.10( d,J=1.9Hz,1H), 3.94( s,3H),3.9
0( s,3H), 2.02( S,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−d_６） δ；167.28, 156.7
6, 156.02, 137.76, 136.18, 133.50, 129.75, 124.42,
122.94, 119.90, 118.52, 114.34, 112.13, 36.32, 34.
96, 22.70 ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_１６Ｈ_１７Ｎ_７Ｏ_３計算値：３５５．１３９３実測値：３５５．１４０２

【００４１】（３）アミド化前記の（１）で得られた化合物１９．４ｍｇ（０．０７
１ｍｍｏｌ）の０．５５ｍｌＤＭＦ溶液に、窒素雰囲気
下、−４０℃で６０％水素化ナトリウム７．２ｍｇ
（０．１８０ｍｍｏｌ）の０．５ｍｌＤＭＦ溶液を滴下
した。混合物を−４０℃〜−２０℃で２．５時間撹拌し
た後、−５０℃に冷却し、前記（２）（ｅ）で得られた
活性アミド体４１．８ｍｇ（０．１１８ｍｍｏｌ）の
１．０ｍｌＤＭＦ溶液を滴下した。反応混合物を−５０
℃〜−３０℃で３時間撹拌した。冷たい０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）の２０ｍｌを添加した後、酢酸エ
チルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃
縮し、残渣をＴＬＣで酢酸エチルを用いて溶出して、目
的のＩＰＤｕ１５．１ｍｇを得た（収率３４％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ；8.68( s,1H), 7.68
( s,br,1H), 7.33( s,1H), 7.31( s,1H),6.51( d,,J=1.
81Hz,1H), 6.43( s,1H), 6.10( s,br,1H),4.20( dd,,J=
5.5 and 4.9Hz,1H), 4.02( d,J=11.6Hz,1H),3.98( s,3
H), 3.78( s,3H), 3.67( s,3H), 2.86( m,1H),2.21( d
d,J=3.7Hz,1H), 2.10( s,3H), 1,59( s,3H),1.24( t,J=
4.3Hz,1H) ＨＲＦＡＢＭＳｍ／ｅ５６２．２０５４［Ｍ＋
Ｈ］（Ｃ_２７Ｈ_２８Ｎ_７Ｏ_７とした計算値：５６２．
２０５０）

【００４２】実施例２（ＸがＣＨで、Ｒがアセチル基の
化合物の製造）（１）Ｐｙ−Ｐｙの製造（ａ）実施例１の（２）の（ａ）と同様にしてピロール
誘導体を得た（収率９１％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ；7.79( s,1H), 7.26
( d,J=1.8Hz,1H), 6.60( d,J=1.8Hz,1H),3.78( s,3H),
3.72( s,3H), 2.05( s,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；166.52, 160.
70, 122.81, 120.28, 118.56, 107.58, 50.87, 36.06,2
2.95 ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_９Ｈ_１２Ｎ_２Ｏ_３計算値：１９６．０８４８実測値：１９６．０８３７

【００４３】（ｂ）実施例１の（２）の（ｂ）と同様に
してピロール誘導体を得た（収率８４％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；9.80( s,1H),
7.24( d,J=1.8Hz,1H), 6.62( d,J=1.8Hz,1H),3.77( s,3
H), 1.93( s,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；166.49, 161.
83, 122.53, 119.83, 119.57, 107.61, 36.06, 22.95 ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_８Ｈ_１０Ｎ_２Ｏ_３計算値：１８２．０６９１実測値：１８２．０６８２

【００４４】（ｃ）実施例１の（２）の（ｃ）と同様に
してピロール誘導体を得た（収率５１％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；9.87( s,1H),
9.80( s,1H), 7.43( d,J=2.0Hz,1H),7.12( d,J=2.0Hz,1
H), 6.88( d,J=2.0Hz,1H), 6.82( d,J=2.0Hz,1H),3.82
( s,3H), 3.80( s,3H), 3.72( s,3H), 1.95( s,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；166.42, 160.
74, 158.36, 122.84, 122.45, 122.13, 120.70, 118.48
118.12, 108.36, 103.84, 50.87, 36.08, 36.00, 22.98 ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_１５Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_４計算値：３１８．１３２８実測値：３１８．１３１０

【００４５】（ｄ）実施例１の（２）の（ｄ）と同様に
してピロール誘導体を得た（収率８７％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；9.83( s,1H),
9.79( s,1H), 7.39( d,J=2.0Hz,1H),7.12( d,J=2.0Hz,1
H), 6.82( dd,J=2.0 and 1.5Hz,2H),3.80( s,6H), 1.96
( s,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；166.42, 161.
88, 158.33, 122.53(d), 122.12, 120.24, 119.47,118.
05, 108.36, 103.82, 36.04, 35.98, 23.00 ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_１４Ｈ_１６Ｎ_５Ｏ_４計算値：３０４．１１７１実測値：３０４．１１６７

【００４６】（ｅ）実施例１の（２）の（ｅ）と同様に
してピロール誘導体を得た（収率７４％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；9.98( s,1H),
9.80( s,1H), 8.25( s,1H), 7.75( d,J=1.5Hz,1H),7.68
( t,J=2.0 and 1.0Hz,1H), 7.13( t,J=2.0 and 1.0Hz,2
H),6.93( d,J=1.5Hz,1H), 6.88( d,J=1.5Hz,1H), 3.90
( s,3H),3.82( s,3H), 1.96( s,3H)^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ；166.47, 158.
46, 156.75, 137.70, 129.67, 124.32, 123.88, 122.2
5,122.13, 119.68, 118.56, 118.40, 111.69, 104.04,
36.23, 36.10,23.02 ＨＲＥＩＭＳｍ／ｅＣ_１７Ｈ_１８Ｎ_６Ｏ_３計算値：３５４．１４４０実測値：３５４．１４４２

【００４７】（２）アミド化実施例１の（３）と同様にしてピロール誘導体ＰＰＤｕ
を得た（収率２６％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ；8.28( s,br,1H), 7.
78( s,br,1H), 7.32( s,1H), 6.94( s,1H),6.64( s,1
H), 6.55( s,1H), 6.43( s,1H), 6.39( s,1H),4.20( d
d,J=5.5 and 4.9Hz,1H), 4.00( d,J=12.0Hz,1H),3.81(
s,3H), 3.76( s,3H), 3.70( s,3H), 2.90-2.86( m,1H),
2.21( dd,J=3.7Hz,1H), 2.03( s,3H), 1,23( s,3H),0.8
6( t,J=4.3Hz,1H) ＨＲＦＡＢＭＳｍ／ｅ５６１．２０８９［Ｍ＋
Ｈ］（Ｃ_２８Ｈ_２９Ｎ_６Ｏ_７とした計算値：５６１．
２０９８）

【００４８】実施例３（アルキル化の試験）ＤＮＡ８量体をＤＮＡ自動合成機で合成した。ＤＮＡオ
リゴヌクレオチドのアルキル化は次のようにして行っ
た。本発明の化合物（０．１ｍＭ）、ディスタマイシン
Ａ（０．１ｍｍｏｌ）及びＤＮＡ８量体（１ｍＭ）を５
０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加え、
０℃で種々の時間インキュベートした。反応をＨＰＬＣ
（ケムコボンド５−ＯＤＳ−Ｈカラム）でモニター
した。溶出液は０．０５Ｍギ酸アンモニウムと０〜５０
％アセトニトリルのリニアな傾斜（０〜４０分）で、流
量は１．０ｍｌ／分であった。２５４ｎｍで検出した。
本発明のＩＰＤｕを用いた場合の結果を図２に示す。本
発明のＰＰＤｕを用いた場合の結果を図３に示す。

【００４９】実施例４（ＩＰＤｕ及びＰＰＤｕによる長
鎖ＤＮＡのアルキル化の試験）５’−テキサスレッド−エンド−モディファイド４
５０ｂｐＤＮＡをＰＣＲ法により調製した。５’−テキ
サスレッド−エンド−モディファイドｐＵＣ１８の３
７８〜３９５及びｐＵＣ１８の逆の１８６１〜１８８１
を用いた。実施例３と同様にしてアルキル化の試験をし
た。結果を図４及び５に示す。

【００５０】

【発明の効果】本発明は、特定の塩基配列に特異的にア
ルキル化することができる化合物を提供する。本発明の
化合物は、遺伝子中の標的とした塩基配列に選択的かつ
特異的にアルキル化することができ、これにより当該塩
基配列を有する遺伝子の発現を制御し、遺伝子が誘発す
る各種疾患の治療・予防などに有用である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science And Technology Corporation <120> A compound to alkylate for the specific sequence in DNA and its method of preparation <130> PA906342 <160> 3 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> pUC 18 <400> 1 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 60 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 120 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 180 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 240 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 300 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 360 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 420 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 450 <210> 2 <211> 450 <212> DNA <213> pUC 18 <400> 2 tgtaaaacga cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg 60 ggtaccgagc tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 120 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 180 atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 240 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 300 tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 360 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 420 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 450 <210> 3 <211> 426 <212> DNA <213> pUC 18 <400> 3 ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 60 gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 120
ａｇｔｇｃａｃｃａｔａｔｇｃｇｇｔｇｔｇａａａｔａｃｃｇｃａｃａｇ
ａｔｇｃｇｔａａｇｇａｇａａａａｔａｃｃｇｃａｔｃａｇ 180 gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 240 gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 300 agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca 360 ggtcgactct agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctgt 420 ttcctg 426

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の化合物の製造方法を例示した
ものである。

【図２】図２は、ＩＰＤｕ−Ｄｉｓｔによるアルキル化
の反応性、ミスマッチのものは反応性低い。

【図３】図３は、ＰＰＤｕによるアルキル化の反応性、
ミスマッチのものは反応性低い。

【図４】図４は、ＩＰＤｕ及びＰＰＤｕによるＤＮＡフ
ラグメント（II’）を用いた配列の認識を示す。

【図５】図５は、ＩＰＤｕ及びＰＰＤｕによるＤＮＡフ
ラグメント（Ｉ^’）及び（II^’）を用いた配列の認識を
示す。

【図６】図６は、ＩＰＤｕ−Ｄｉｓｔ−８量体複合体の
エレクトロスプレーマスによるスペクトルチャートを示
す。

【図７】図７は、本発明の化合物の好ましいものの例示
である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 487/04 A61K 31/407,31/4178 A61P 35/00 C12N 15/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次式（Ｉ）【化１】［式中、Ｒは低級アシル基、又はＮ−メチルピロール
環、Ｎ−メチルイミダゾール環及び／又はγ−リンカー
（−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−）を含有するポリア
ミド基を示し、Ｘは窒素原子又はＣＨを示す。］で表さ
れる化合物。
【請求項２】Ｒがアセチル基である請求項１に記載の
化合物。
【請求項３】ＲがＮ−メチルピロール環及び／又はＮ
−メチルイミダゾール環を含有するポリアミド基である
請求項１に記載の化合物。
【請求項４】Ｒが、γ−リンカー（−ＮＨＣＨ_２ＣＨ
_２ＣＨ_２ＣＯ−）を含有するポリアミド基である請求項
１に記載の化合物。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載の化合物
からなる遺伝子のアルキル化剤。
【請求項６】アルキル化のために認識される塩基配列
が、Ｗ−Ｗ−Ｖ（式中、ＶはＡ又はＧ、ＷはＡ若しくは
Ｔ又はＵを示す。）又はＧ−Ｗ−Ｖ（式中、ＶはＡ又は
Ｇ、ＷはＡ若しくはＴ又はＵを示す。）である請求項５
に記載のアルキル化剤。
【請求項７】さらに、ディスタマイシンと組み合わせ
て使用されることを特徴とする請求項５又は６に記載の
アルキル化剤。
【請求項８】請求項５〜７のいずれかに記載のアルキ
ル化剤を含んで成る、遺伝子の特異的な塩基配列を包含
する部分の発現を制御する遺伝子発現制御剤。
【請求項９】遺伝子の特異的な塩基配列を包含する部
分が、生物の疾患を誘発する遺伝子である請求項８に記
載の発現制御剤。
【請求項１０】生物の疾患を誘発する遺伝子が、癌遺
伝子である請求項９に記載の発現制御剤。
【請求項１１】請求項１〜４のいずれかに記載の化合
物を含有してなる、遺伝子により誘発され得る疾患を治
療又は予防するための医薬組成物。