WO2000015641A1

WO2000015641A1 - Composes alkylant une sequence de base specifique d'adn, et procede de synthese desdits composes

Info

Publication number: WO2000015641A1
Application number: PCT/JP1999/001228
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Sugiyama; Zhi Fu Tao; Isao Saito
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2000-03-23
Also published as: US6566336B1; JP3045706B1; JP3753939B2; JP2000159768A

Description

明細書

D N Aの特定塩基配列をアルキル化する化合物及びその合成法技術分野

本発明は、遺伝子をアルキル化することができる化合物、その化合物を用いたアルキル化剤、そのアルキル化剤を用いて遺伝子の発現を制御する方法、及び、当該化合物を含有してなる医薬組成物に関する。背景技術

分子生物学の急速な進歩により、癌をはじめさまざまな疾病の原因が D NAの変異であることが次つぎと明らかにされてきている。また、ヒューマンゲノムプロジェクトによりヒト D N Aの全塩基配列の決定も数年以内に完了するものとみられ、これら疾病の分子レベルの理解に基づいた治療法の出現がますます望まれてきている。しかし細胞の外から遺伝子の発現を制御する一般的な方法論が確立していないことが、このようなアプローチの実現の大きな壁になっている。最近、ディスタマイシンなどの钪生物質による D N Aの分子認識をヒントとして、塩基配列特異的に結合する分子が設計され、遺伝子発現の制御が可能になってきた。三日月型をしたデイスタマイシン、ネトロブシンなどの抗生物質が、 D NAのアデニン ' チミン（Α · Τ) 塩基対に富む配列の Α— Τ間の水素結合のマイナ一グループに結合することが X線結晶構造解析や NMRにより明らかにされ、この認識を利用したさまざまな分子が合成されてきた。ピロ一ル環をィミダゾールに変えることにより、グァニン ' シトシン（G ' C) 塩基対を認識するように改変できることについては以前から予想されていたが（M. L, Kopka, C. Yoon, D. Goods el 1, P. Pjura, R. E. Dickerson, Pro Natl, Acad. Aci, USA, 82, 1376, (1985)) ； (J. W. Lo \vn, K. Krowickl, U. G. Bhat, A. Skorobogaty, B. Ward, J. C. Dabrowi ak, Biochemistry, 2 5, 7408 (1986). )、実際にはそう単純ではなく、多くの混沌とした実験結果が得られていた。

W e mm e r らは、デイスタマイシンによる D NAへの結合について NMRを用いて詳細に検討した。その結果、これまで 1枚しか収容されないと考えられていた DNAマイナ一グループにデイスタマイシンが 2枚入りうることを示した ( J. G. Pel ton, D. E. Wemmer, Pro Natl, Acad. Sc i, USA, 86, 5723 (1989). )„ D e r v a nらはこのような結合モ一ドを考慮すると、いままでの混沌とした結果が説明できることに着目し、アンチパラレルに配向したメチルピロ一ル（P y) 、メチルイミダゾ一ル（ I m) ポリアミドのペアにより 2本鎖 D N Aの塩基配列が認識できることを見いだした。

すなわち、 P y— I mにより C— G塩基対が、 I m— P yにより G— C塩基対が、 P y— P yにより A— Tまたは T一 A塩基対を認識するという一般則を導きだしたのである（S. Whi te, E. E. Baird, P. B. Dervan, Chemi s t ry&Bi o 1 ogy, 4, 569 (199 7). )。ペアに共有結合を導入して、結合におけるエントロピ一損失を防ぎ、より強い結合と認識能を得るためいろいろなヘアピンや環状のポリアミドが合成された。なかでもアリンカー（― NHCH₂CH₂CH₂C O— ) をもつヘアピンがすぐれた結合能と認識能をもつことが示され、その D N Aとの複合体の構造も決定されて！^る (R. P. L. de Clairac, B. H. Geiers tanger, M. Marks ich, P. B. Dervan, D. E. We 匿 r, J. Am. Chem. Soc. , 119, 7909 (1997). ) 。

また、ピロ一ルイミダゾ一ルのみでつくられるヘアピンポリァミドでは認識可能な配列は 7塩基対が上限であるが（J. M. Turner, E. F. Baird, P. B. Dervan, ibid. , 119, 7636 (1997). ), ホモダイマーを用いた系において A · T配列を認識する β 一ァラニン一ペアの導入で 1 1塩基対の認識も可能になっている（S. E. SwaUey, Ε. E. Baird, D. B. Dervan, Chem. Enr. J, 3, 1600 (1997)) 。

さらに、 D e r v a n、 0〇 1; 6 3 6 1 0らは211フィンガ一夕ンパクである T F I I I Aの認識配列中の 4番目のフィンガ一の結合配列のマイナーダループに拮抗して結合するポリアミドを設計し 5 S RNAの発現が i n v i t r oの実験において選択的に制御されることを示した U. M. Gottesfeld, L. Neely, J. W. Tr auger, E. E. Baird, P. B. Dervan, Nature, 387, 202 (1997). )„ また、同時に i n v i t r oの実験において、ポリアミドが核内に透過していることも示された。近年、遺伝子の制御に関して、オリゴヌクレオチドやペプチド核酸（P NA) などが注目されているが、細胞透過性が問題となっていることを考えると、これらメチルピロール-メチルイミダゾールポリアミドは遺伝子発現を制御する分子として、分子生物学の道具として、さらには医薬としても期待がもてる化合物であることが示されてきた。

従来の P y - I m系のポリアミドは、塩基対の水素結合のマイナーグループを認識するだけであり、遺伝子と共有結合するものではなかった。

本発明は、塩基対の水素結合のマイナーグループを認識すると共に、塩基と共有結合をし得る化合物を提供する。本発明の化合物は、特定の塩基配列を認識すると共に、隣接する塩基と共有結合により強固に結合し、当該塩基配列を有する遺伝子の発現を制御することができる。発明の開示

本発明は、次式（ I )

R一

(式中、 Rは低級ァシル基又はポリアミド基を示し、 Xは窒素原子又は C Hを示す。）

で表される化合物に関する。

また、本発明は、 '前記一般式（ I ) で表される化合物からなる遺伝子のアルキル化剤に関する。より詳細には、本発明のアルキル化剤は、遺伝子中の特異的な塩基配列、 W— W— V (式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。）又は G— W— V (式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。）などの配列を認識して当該部分を選択的にアルキル化することができるものである。

さらに、本発明は、前記のアルキル化剤を用いて、遺伝子の特異的な塩基配列を包含する部分の発現を制御する方法に関する。

また、本発明は、前記一般式（ I ) で表される化合物を含有してなる、遺伝子により誘発され得る疾患を治療又は予防するための医薬組成物にも関する。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の化合物の製造方法を例示したものである。

第 2図は、 I P D u— D i s t によるアルキル化の反応性、ミスマッチのものは反応性が低い。

第 3図は、 P P D uによるアルキル化の反応性、ミスマッチのものは反応性が低い。

第 4図は、 I P D u及び P PD uによる DNAフラグメント（ I I ' ) を用いた配列の認識を示す。

第 5図は、 I P D u及び P P D uによる DNAフラグメント（ 1 ' ) 及び（ I I ' ) を用いた配列の認識を示す。

第 6図は、 I P D u— D i s t — 8量体複合体のエレクトロスプレー質量分析によるスペクトルチャートを示す。

第 7図は、本発明の化合物の好ましいものの例示である。発明を実施するための最良の形態

本発明の一般式（ I ) における Rの低級ァシル基としては、カルボニル基の炭素原子を含めて炭素数 1〜 1 2、好ましくは 2〜 6の低級ァシル基であり、例えば、ァセチル基、プロピオニル基、イソプロピオニル基、ブ夕ノィル基などが挙げられるが、立体的に小さなもののほうが好ましい。

また、 Rのポリアミド基としては、 N—メチル一 4—アミノー 2—カルボキシピロ一ル（HO— P y— H) 、 N—メチルー 4—ァミノ一 2—カルボキシイミダゾール（HO— I m— H) 、 N—メチル _ 4一アミノー 3—ヒドロキシー 2—力ルポキシピロール（HO— H p— H) 、 4—ァミノ酪酸（ΗΟ— τ— H) (ァーリンカ一用）などのアミノカルボン酸からなるポリアミドが挙げられる。これらのポリアミドのアミド基の窒素一水素結合の部位が、遺伝子の塩基を認識し、即ち、一般的には P y— I mは C一 G対を認識し、 I m— P yは G— C対を認識し. P y - P yは A— T対又は T— A対を認識することから、認識させたい塩基配列に応じて、前記ポリアミドを設計することができる。

Rにおけるポリアミドのアミド基は、遺伝子の塩基対の片側に対して 5 〜 7個、好ましくは 3個までのものが好ましく、それ以上のアミド基を有することもできるが、塩基配列に対する親和性の向上を期待することは難しい。好ましいポリアミド基としては、 N —メチルー 4ーァセチルァミノ —イミダゾ一ルー 2 —カルボニル基が挙げられる。

Rにおけるポリアミド基中のァーァミノ酪酸部分は、ァ一リンカ一として作用するものであり、この部分でポリアミド鎖がヘアピンカーブして、遺伝子の塩基対の対になっている塩基配列を認識す'ることになる。

本発明のる Rのポリアミド基としては、次式

で示されるものが好ましい。

本発明の一般式（ I ) で表される化合物のアルキル化部分は、次式で示されるデュオカルマイシン A ( Duocarmyc inA ) のアルキル化機構と同様な機構でアルキルイ匕する。

CGTATpO-j ₀

Duo

OpCG しかしながら、デュオカルマイシン Aのアルキル化はアデニン（ A ) のプリン環でのみ生起するのに対して、本発明の化合物のアルキル化はアデニン（A ) 又は（ G ) のいずれのプリン環においても生起する点で相違がある。

5 差替え用紙（規則 26) 本発明の化合物のアミド結合に続く P y— P y—の部分は、遺伝子の塩基配列 W- W (Wは、 A若しくは T又は Uを示す。）を認識配列とし、 I m— P y—の部分は遺伝子の塩基配列の G— W (Wは、 A若しくは T又は Uを示す。）を認識配列としている。したがって、本発明の化合物は次式（II) 又は（III)

W- W- V (II)

G - W- V (III)

(式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。）

の塩基配列を認識し、塩基 V (A又は G) の部分で遺伝子と共有結合を形成するものである。

しかしながら、本発明のアルキル化剤はこれらの塩基配列に制限されるものではなく、前述したように標的とする塩基配列を必要に応じて設計することができる。

また、前述した Rの部分において、さらにポリアミド結合を延ばすことにより，認識できる塩基配列をさらに延ばすことができる。

本発明の一般式（ I ) で表される化合物は、例えば、第 1図（第 1図は、がァセチル基の場合を示す。）に示す方法で製造することができる。本発明の化合物のアルキル化部分は、デュオカルマイシン B 2 (D u o B 2 ) を原料として第 1図に示す方法により製造でき、これを別に製造されたピロ一ルカルボン酸誘導体を用いてァシド化することにより製造される。より具体的な製造例を後述する実施例において例示する。

本発明の化合物のひとつである Xが窒素原子で Rがァセチル基の化合物（以下、 I P D uという。 ) を用いて、 8塩基の種々のオリゴヌクレオチドとの認識をした結果を第 2図に示す。第 2図に示す試験は、本発明の化合物 I P D uとデイスタマイシンを使用したものであり、本発明の化合物をー秦ー〇—△で示し、ディスタマイシンを + ) —◊—〇一〇—〇で示している（図中では、〇が灰色で示されている。）。そして、本発明の化合物の△印で示されている部分で遺伝子と共有結合をしている。

前述したように、 I P D uは G— W— V (式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。）の塩基配列を認識するので、第 2図中の 4種のオリゴヌクレオチドのうち、 G— T— Gの塩基配列を有するもの（第 2図中の左側部分の 2 種）及び G— A— Gの塩基配列を有するもの（第 2図中の右下側のもの）は、その塩基配列を認識して効率よく共有結合するのに対して、前記した認識配列とは異なる A— T — Gの塩基配列を有するもの（第 2図中の右上側のもの）はミスマツチとなり、反応が遅く、 4 6時間経過後も 8 %程度に過ぎない。このように、本発明の化合物が完全に配列を認識していることが判る。

第 2図の左下側に示されるオリゴヌクレオチドが最もよくマッチしており、このものをエレクトロスプレー質量分析で分析した結果を第 6図に示す。この質量分析のスぺクトルチャートから、本発明の化合物が D N Aに共有結合していることが示された。

第 3図は、前記同様に本発明の Xが C Hで Rがァセチル基である化合物（以下. P P D uという。）を用いて試験をした結果を示すものである。

前述したように、 P P D uは W— W— V (式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。 ) の塩基配列を認識するので、第 3図中の 4種のオリゴヌクレオチドのうち、 T 一 T — Gの塩基配列を有するもの（第 3図中の下側部分の 2 種）及び A— T— Gの塩基配列を有するもの（第 3図中の左上側のもの）は、その塩基配列を認識して効率よく共有結合するのに対して、前記した認識配列とは異なる G— T 一 Gの塩基配列を有するもの（第 3図中の右上側のもの）はミスマツチとなり、反応が遅く、 2 2時間経過後も 2 6 %程度に過ぎない。このように, 本発明の化合物が完全に配列を認識していることが判る。

第 4図は、同様の試験を長鎖の D N Aを用いて作った結果を示している。この試験に使用した D N Aの全塩基配列は配列表の配列番号 2に示されている。

第 4図の右側は P P D uを用いた結合を、左側は I P D uを用いた場合を示している。第 4図の右側においては、部分配列が W— W— Gである箇所において本発明の P P D uによるアルキル化が生起していることが半つた。また、第 4図の左側においては、部分配列が G—W— Gである箇所において本発明の P P D uによるアルキル化が生起していることが判った。

なお、第 4図の試験においては、 I P D u又は P P D uの濃度を、 4 、 8 、 1 6、及び、 3 2 の 4段階で行っている（各濃度においてデイスタマイシン (D i s t ) の濃度をそれぞれ 8、 1 6、 3 2、及び、 6 4 jtiMとした。）。第 5図は、本発明の化合物として P y— P y— P y—ァー I m- P y - P y - D uを用いて、 3 9 2 b p ( I ' DNA (配列表の配列番号 1に示す。））と 4 4 9 b p ( I I I ' DNA (配列表の配列番号 3に示す。））を用いて前記と同様な試験をした結果を示すものである。

P P D uの認識配列である W— W— Aの部分配列を有する部分においてアルキル化が生起しているスポットが観察できた。この試験においては、本発明の前記の化合物を濃度、 0. 2 5、 0. 5、 1. 0、及び、 2. の 4段階で使用した。以上の試験からも明らかなように、本発明の化合物は、遺伝子の特定の塩基配列の部分を特異的にアルキル化し、当該遺伝子の発現を阻害することができる。即ち、本発明の化合物は、遺伝子の標的とする塩基配列の部分を特異的にアルキル化することができ、当該アルキル化により遺伝子の機能を阻害することにより、その発現を制御することができる。

第 7図に本発明の好ましい化合物が例示されている。

また、本発明の化合物は、ピロールイミダゾ一ル系のポリアミドであり、細胞透過性に優れており、生体へ通常の方法で投与することにより、標的の遺伝子を特異的に制御することができるものである。

したがって、本発明は、本発明の化合物を用いた遺伝子の特異的なアルキル化剤、それを用いた遺伝子の制御方法、及び、癌などの遺伝子に誘発される各種疾患を治療又は予防する医薬組成物を提供するものである。実施例

次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例 1 ： Xが Nで Rがァセチル基の化合物の製造

( 1 ) アルキル化部（D u) の製造窒素雰囲気下、デュオカルマイシン B ₂の 1 2 2 m g ( 0 . 2 0 9 mm o 1 ) をメタノ一ル 1 0 m l とァセトニトリル 1 0 m l の混合物に溶解し、 0 °Cに冷却し、これに 2 8 %ソディウムメトキサイドのメタノール溶液 1 2 0 1 を滴下した。反応混合物を 0 °Cで 1 1時間撹拌した後、 3 5 m l の 0. 1 Mリン酸緩衝液（ p H 5 . 3 ) を加えた。メタノールを留去し、食塩を加え、残渣を酢酸ェチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し濃縮した。濃縮物をカラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム：アセトン = 1 ： 0〜 3 ： 1 ) で精製した。 4 4 m gの黄色の生成物を得た（収率 7 7 %) 。

'H - NM R ( C D C 1 ₃) δ ；

6.06( s, br, 1H), 5.71 ( s, 1H), 5.01 ( s, br, 1H), 3.79 ( in, 1H), 3. 71 ( s, 3H), 3. 66( d, J-ll.0Hz, 1H), 3.01 ( m, 1H),

2.04( dd, J = 3. 7Hz, 1H), 1.61 ( s, 3H) ,

1.00( dd, J = 3. 7 and 4.9Hz, 1H).

1³ C - N M R ( C D C 1 ₃) δ ；

193. 64, 176. 55, 174.95, 168.32, 166.84, 108.82, 98. 65, 71. 14, 53. 21, 51.90, 30.49, 24.39, 22. 60, 20.98

F A B M S / e 2 7 5 [M + 1 ]

( 2 ) I m - P yの製造

( a ) 窒素雰囲気下、 4 m l の無水酢酸に、 4一アミノー N—メチル—イミダゾ —ルー 2 —ィル—カルボン酸ェチルエステル塩酸塩 3. 0 2 5 g ( 1 4. 7 mm o 1 ) とピリジン 1 0 m 1 及び N， N—ジイソプロピルェチルァミン（ D I E A) 1 5 m l の混合物を加えた。反応混合物を 1時間室温で撹拌し、約 1 5 m 1 に濃縮した。 1 0 0 m 1 の水を加えた後、混合物を酢酸ェチルで抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、 — 3 0°Cに冷却して、目的の N—ァセチル体 2 . 6 4 gを得た（収率 8 5 %) 。

Ή-NMR (DMS O- d e) δ ；

10. 55 ( s, 1H), 7.47( s, 1H), 4.25( q, 1 = 1. OHz, 2H) , 3.89( s, 3H),

1.97( s, 3H), 1. 28( t, J = 7. OHz, 3H) ¹³C -NMR (DMS O- d e) δ ；

167.00, 158.43, 137.58, 130. 77, 114. 62, 60.47, 35. 32, 22. 60, 14.02

H R E I M S m/ e C ₉H i₃N ₃0₃ 計算値： 2 1 1 . 0 9 5 7

実測値： 2 1 1. 0 9 6 0

( b ) 前記の（ a ) で得られたァセチル体 0 . 9 5 0 g ( 4. 5 0 mm o 1 ) を 1 6 m l のメタノール中にとり、 2 N— N a OH l 6 m l を加えた。反応混合物を室温で 3時間撹拌した。メタノールを留去し、残った水溶液を 4°Cに冷却し、 1 N— HC 1 をもちいて p H 2に調整した。沈殿物を集め水で洗浄し、乾燥して遊離カルボン酸 0. 7 6 3 gを白色固体として得た（収率 9 3 % ) 。

Ή-NMR (DM S O- d e) δ ；

10.45( s, 1H), 7.43( s, 1H), 3.87( s, 3H) , 1. 97( s, 3H)

H R E I M S m/ e C ₇H ₉N ₃0₃ 計算値： 1 8 3. 0 6 4 4

実測値： 1 8 3. 0 6 6 6

( c ) 前記の（ b ) で得られた遊離カルボン酸体 0. 5 5 1 g ( 3. 0 1 mm o 1 ) の 3 0 m 1 D M F溶液に、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ H 0 B t ) 0 . 4 8 8 g ( 3 . 6 1 mm o 1 ) とジシクロへキシルカルポジィミド（D C C ) 0 7 4 4 g ( 3 . 6 1 mm o l ) の混合物を加えた。混合物を室温で 4 0時間撹拌した後、メチル 4—アミノー 1—メチルピロ一ル— 2—カルボン酸エステル塩酸塩 0 . 5 7 4 g ( 3 . 0 1 mm o 1 ) と D M F l O m l 及び 1 5 m l の D I E Aの混合物を加えた。混合物を室温で 4 日間撹拌した。濾過して、 D M Fを留去し、 2 0 0 m 1 の酢酸ェチルを加えた。濾過して沈殿物を除き、酢酸ェチル溶液を 1 N塩酸で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、 — 3 0 °Cに冷却して、目的のアミドーメチルエステル体 0 . 5 2 2 gを得た（収率 5 4 %) 。

Ή - NM R (DM S O- d e) δ ；

10. 19 ( s, 1H), 10.05( s, 1H), 7.50( d, ] = 1.8Hz, 1H), 7.40 ( s, 1H), 6. 68( d, J = l. 8Hz, 1H), 3.93( s, 3H) , 3.83 ( s, 3H) , 3.73( s, 3H) , 2.01 ( s, 3H)

1³C— NMR (D M S O - d ₆) δ ；

167.24, 160.73, 155.86, 136.15, 133.78, 121.99, 120.95, 118.78,

114.01, 108.69， 50.93, 36.23, 34.88, 22.69,

HR E I M S mZ e C ₁₄H 17N 5 O 4 計算値： 3 1 9. 1 2 8 0

実測値： 3 1 9. 1 2 7 7

( d ) 前記の（ c ) で得られたアミドーメチルエステル体 0. 5 0 0 gをメタノール 1 2. 5 m l に溶解し、 1 2. 5 m 1 の 2 N— N a O Hを加えた。その溶液を室温で終夜撹拌した。メタノールを留去し、水 2 O m l を加え濾過し、得られた水溶液を 1 N塩酸で p H 2に調整した。沈殿物を集め乾燥して、目的の遊離力ルボン酸体 0. 4 3 9 gを得た（収率 9 2 %) 。

JH-NMR (DM S O- de) δ ；

12. 18( s, 1H), 10.20( s, 1H), 9.98( s, 1H), 7.45 ( s, 1H),

7.40 ( s, 1H), 6.92( s, 1H), 3.92( s, 3H) , 3.82( s, 3H),

3.34( s, 3H), 2.01 ( S, 3H)

1³ C - NM R (DM S O— d ₆) δ ；

167.23, 161.86, 155.79, 136.15, 133.83, 121.69, 120.42, 119.82, 113.94, 108.74, 36.18, 34.88, 22.69,

HR E I M S / e C ₁₃H ₁₅N₅〇₄ 計算値： 3 0 5. 1 1 2 4

実測値： 3 0 5. 1 1 2 3

( e ) 前記の（ d) で得られた遊離カルボン酸体 0. 1 3 5 g ( 0. 4 4 mm o 1 ) と 1. 1 ，一カルボニルジイミダゾール 8 4 m gを 5 m 1 の D M Fに溶解した。室温で 5時間撹拌した後、反応混合物を 1 0 0 m 1 の冷水に注いだ。沈殿物を集め、塩化メチレンで洗浄し、真空で乾燥し、目的の活性アミド体 0. 1 0 8 を得た（収率 6 9 %) 。

Ή -NMR (DM S O - d ₆) δ ；

10. 18( s, 2Η), 8.24( s, 1H), 7.79( s, 1H), 7.68( s, 1H), 7.43( s, 1H), 7. 13( s, 1H), 7. 10( d, J-l. 9Hz, 1H), 3.94( s, 3H),

3.90( s, 3H), 2.02( S， 3H)

1³C -NMR (DMS O- d e) d ；

167. 28, 156. 76, 156.02, 137. 76, 136. 18, 133.50, 129.75, 124.42, 122.94, 119.90, 118. 52, 114.34, 112. 13, 36.32, 34.96, 22. 70 HR E I M S m/ e C ιβΗ _{l 7}N rO 計算値： 3 5 5. 1 3 9 3

実測値： 3 5 5. 1 4 0 2

( 3 ) アミド化

前記の（ 1 ) で得られた化合物 1 9 . 4 m g ( 0 . 0 7 1 mm o 1 ) の 0 . 5 5 m l D M F溶液に、窒素雰囲気下、一 4 0 °Cで 6 0 %水素化ナトリウム 7 . 2 m g ( 0 . 1 8 0 mm o 1 ) の 0 . 5 m l D M F溶液を滴下した。混合物を一 4 0 °C〜― 2 0 °Cで 2. 5時間撹拌した後、 — 5 0 °Cに冷却し、前記（ 2 ) ( e ) で得られた活性アミド体 4 1 . 8 m g ( 0. 1 1 8 mm o l ) の 1 . O m l D M F溶液を滴下した。反応混合物を一 5 0 °C〜― 3 0 °Cで 3時間撹拌した。冷たい 0. 1 Mリン酸緩衝液（ p H 7 . 0 ) の 2 0 m 1 を添加した後、酢酸ェチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、残渣を T L Cで酢酸ェチルを用いて溶出して、目的の I P D u l 5. l m gを得た（収率 3 4 %) 。

^LH - NM R ( C D C 1 ₃) δ ；

8. 68( s, 1H), 7. 68( s, br, 1H), 7. 33( s, 1H), 7. 31 ( s, 1H), 6. 51 ( d, , J = l. 81Hz, 1H), 6.43( s, 1H), 6. 10( s, br, 1H),

4. 20 ( dd, , J = 5. 5 and 4.9Hz, 1H), 4.02 ( d, J = ll.6Hz, 1H),

3. 98 ( s, 3H), 3. 78( s, 3H), 3. 67( s, 3H), 2.86 ( m, 1H),

2. 21 ( dd, J = 3. 7Hz, 1H), 2. 10( s, 3H) , 1, 59 ( s, 3H),

1. 24( t, J-4.3Hz, 1H)

H R F A B M S m/ e 5 6 2. 2 0 5 4 [M + H]

(C₂₇H₂₈N₇0₇ とした計算値： 5 6 2. 2 0 5 0 ) 実施例 2 ： Xが CHで、 Rがァセチル基の化合物の製造 ( 1 ) P y— P yの製造

( a ) 実施例 1の（ 2 ) の（ a ) と同様にしてピロ一ル誘導体を得た（収率 9 1 %) 。

^JH - NM R (C D C 1 ₃) δ ；

7.79 ( s, 1H), 7. 26( d, J = l.8Hz, 1H), 6. 60 ( d, 1.8Hz, 1H) ,

3.78( s, 3H)， 3.72( s, 3H), 2.05( s, 3H)

1³C - NM R (D M S O - d ₆) <5 ；

166. 52, 160.70, 122.81, 120.28, 118.56, 107. 58, 50.87, 36.06,

22. 95

H R E I M S / e C ₉H 1 2 N ₂0 計算値： 1 9 6. 0 8 4 8

実測値： 1 9 6. 0 8 3 7

( b ) 実施例 1の（ 2 ) の（b) と同様にしてピロ一ル誘導体を得た（収率 8 4 %) 。

l H - N M R ( D M S O - d e ) δ ；

9.80( s, 1H), 7. 24( d, J = l.8Hz, 1H), 6. 62( d, J = l.8Hz, 1H),

3.77( s, 3H), 1. 93( s, 3H)

1³ C - NM R (D M S O - d ₆) (5 ；

166.49, 161.83, 122. 53, 119.83, 119. 57, 107. 61, 36.06, 22.95 H R E I M S / e C₈HioN ₂0 計算値： 1 8 2. 0 6 9 1

実測値： 1 8 2. 0 6 8 2

( c ) 実施例 1の（ 2) の（ c ) と同様にしてピロ一ル誘導体を得た（収率 5 %) 。

Ή - N M R ( D M S O - d a ) (5 ;

9.87( s, 1H), 9. 80( s, 1H), 7.43( d, J = 2. OHz, 1H),

7. 12 ( d, J = 2.0Hz, 1H), 6.88( d, 1 = 2. OHz, 1H), 6. 82( d, ] = 2. OHz, 1H),

3.82 ( s, 3H), 3. 80 ( s, 3H) , 3.72 ( s, 3H) , 1. 95 ( s, 3H)

¹³C - N M R ( D M S O - d e ) <5 ； 166.42, 160.74, 158. 36, 122.84, 122.45, 122. 13, 120.70, 118. 48 118. 12, 108.36, 103.84， 50. 87, 36.08, 36. 00, 22.98

H R E I M S m/ e C ₁₅H ₁₈N ₄0₄ 計算値： 3 1 8 . 1 3 2 8

実測値： 3 1 8. 1 3 1 0

( d ) 実施例 1の（ 2) の（d) と同様にしてピロ一ル誘導体を得た（収率 8 7 %) 。

>H - NM R (DM S O - d β) δ ；

9.83( s, IH), 9.79( s, IH), 7.39( d, J = 2. OHz, IH),

7. 12( d, J = 2. OHz, IH), 6.82( dd， J = 2.0 and 1. 5Hz, 2H),

3.80( s, 6H), 1. 96( s, 3H)

1³ C 一 NMR (DMS O - d ₆) δ ；

166.42, 161.88, 158.33, 122. 53 (d), 122. 12, 120. 24, 119.47,

118.05, 108.36, 103.82, 36.04, 35.98, 23.00

H R E I M S m/ e C ₁₄H ₁₆N ₅0₄ 計算値： 3 0 4. 1 1 7 1

実測値： 3 04. 1 1 6 7

( e ) 実施例 1 の（ 2 ) の（ e ) と同様にしてピロール誘導体を得た（収率 7 4 %) 。

Ή-NMR (DM S O- d e) δ ；

9.98( s, 1H), 9. 80( s, 1H), 8. 25( s, 1H), 7.75( d, J = l. 5Hz, IH), 7. 68( t, J-2.0 and 1. OHz, IH), 7. 13( t, J = 2. 0 and 1. OHz, 2H), 6.93( d, J = l.5Hz, IH), 6.88( d, J = l. 5Hz, IH), 3. 90( s, 3H), 3.82 ( s, 3H), 1. 96( s, 3H)

¹³ C -NMR (DM S O- d e) 6 ；

166.47, 158.46, 156. 75, 137. 70, 129. 67, 124. 32, 123.88, 122. 25, 122. 13, 119.68, 118. 56, 118.40, 111. 69, 104. 04, 36. 23, 36. 10, 23. 02

H R E I M S m/ e C .₇H ₁₈N ₆0₃ 計算値： 3 5 4. 1 4 4 0 実測値： 3 5 4. 1 44 2

( 2 ) アミド化

実施例 1の（ 3) と同様にしてピロ一ル誘導体 P P D uを得た（収率 2 6 %)

Ή-NMR (C D C 1 ₃) δ ；

8.28( s, br, 1H), 7.78( s, br, 1H), 7.32( s, 1H), 6.94( s, 1H),

6.64 ( s, 1H), 6.55 ( s, 1H), 6.43( s, 1H), 6.39 ( s, 1H),

4.20 ( dd, J = 5.5 and 4.9Hz, 1H), 4.00( d, J = 12.0Hz, 1H),

3.81 ( s, 3H), 3.76( s, 3H) , 3.70( s, 3H) , 2.90-2.86 ( m, 1H),

2.21 ( dd, J = 3.7Hz, 1H), 2.03( s, 3H), 1, 23( s, 3H) ,

0.86 ( t, J=4.3Hz, 1H)

HR F ABM S m/ e 5 6 1. 2 0 8 9 [M+H]

( C ₂₈H ₂₉N _eO 7 とした計算値： 5 6 1. 2 0 9 8 ) 実施例 3 ：アルキル化の試験

DN A 8量体を D N A自動合成機で合成した。 DNAオリゴヌクレオチドのァルキル化は次のようにして行った。本発明の化合物（ 0. I mM) 、デイスタマイシン A ( 0. l mmo l ) 及び DNA 8量体（ I mM) を 5 0 mMの炭酸ナトリウム緩衝液（p H 7. 0 ) に加え、 0 °Cで種々の時間インキュベートした。反応を H P L C (ケムコボンド 5—〇D S— H カラム）でモニターした。溶出液は 0. 0 5 Mギ酸アンモニゥムと 0 ~ 5 0 %ァセトニトリルのリニアな傾斜 ( 0〜 4 0分）で、流量は 1. Om l Z分であった。 2 5 4 nmで検出した。本発明の I P D uを用いた場合の結果を第 2図に示す。

本発明の P P D uを用いた場合の結果を第 3図に示す。実施例 4 ： I P D u及び P P D uによる長鎖 D N Aのアルキル化の試験

5 ' —テキサスレッド一エンド一モディファイド 4 5 0 b p DNAを P C R法により調製した。 5 ' —テキサスレッド一エンド一モディファイド p UC 1 8の 3 7 8 ~ 3 9 5及び p UC l 8の逆の 1 8 6 1〜 1 8 8 1を用いた。実施例 3と同様にしてアルキル化の試験をした。

結果を第 4図及び第 5図に示す。産業上の利用可能性

本発明は、特定の塩基配列を特異的にアルキル化することができる化合物を提供する。本発明の化合物は、遺伝子中の標的とした塩基配列に選択的かつ特異的にアルキル化することができ、これにより当該塩基配列を有する遺伝子の発現を制御し、遺伝子が誘発する各種疾患の治療 · 予防などに有用である。

Claims

主求の囲次式（ I )

で表される化合物。

2 . Rがァセチル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物。

3 . Rが N—メチルピロ一ル環及び/又は N—メチルイミダゾール環を含有するポリアミド基である請の範囲第 1項に記載の化合物。

4 . Rが、基一 C O— ( C H ₂ ) ₃— N H—で示されるァ—リンカ一を含有している請求の範囲第 3項に記載の化合物。

5 . 請求の範囲第 1 〜 4項のいずれかに記載の化合物からなる遺伝子のアルキル化剤。

6 . アルキル化のために認識される塩基配列が、 W— W— V (式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。）又は G— W— V (式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。）である請求の範囲第 5項に記載のアルキル化剤。

7 . さらに、ディス夕マイシンと組み合わせて使用されることを特徴とする請求の範囲第 5項又は第 6項に記載のアルキル化剤。

8 . 請求の範囲第 1 〜 4項のいずれかに記載の化合物からなる遺伝子のアルキル化剤を製造する方法。

9 . アルキル化のために認識される塩基配列が、 W— W— V (式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。）又は G— W—V (式中、 Vは A又は G、 Wは A若しくは T又は Uを示す。）である請求の範囲第 8項に記載のアルキル化剤を製造する方法。

1 0. さらに、ディスタマイシンと組み合わせて使用されることを特徴とする請求の範囲第 8項又は第 9項に記載のアルキル化剤を製造する方法。

1 1. 請求の範囲第 5〜 7項のいずれかに記載のアルキル化剤を用いて、遺伝子の特異的な塩基配列を包含する部分の発現を制御する方法。

1 2. 遺伝子の特異的な塩基配列を包含する部分が、生物の疾患を誘発する遺伝子である請求項 1 1に記載の方法。

1 3. 生物の疾患を誘発する遺伝子が、癌遺伝子である請求の範囲第 1 2項に記載の方法。

1 4. 請求の範囲第 1〜4項のいずれかに記載の化合物を含有してなる、遺伝子により誘発され得る疾患を治療又は予防するための医薬組成物。