WO2007029364A1 - ピロールアミド４量体を含む２’−デオキシグアノシンハイブリッド化合物及びその製造方法、そのための製造中間体 - Google Patents

ピロールアミド４量体を含む２’−デオキシグアノシンハイブリッド化合物及びその製造方法、そのための製造中間体 Download PDF

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hybrid
mmol
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Etsuko Kawashima
Yusuke Ohba
Kazuo Kamaike
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Tokyo University Of Pharmacy And Life Science
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/173—Purine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/18—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 one oxygen and one nitrogen atom, e.g. guanine

Definitions

  • the present invention relates to a novel hybrid compound in which a pyrrole amide tetramer is introduced via a linker at the ⁇ position of 2′-deoxyguanosine, which is useful as a drug for gene therapy, a method for producing the compound, and a production intermediate therefor Concerning the body.
  • antisense DNA therapy An artificial gene sequence that binds to a gene sequence is bound to the abnormal gene, thereby inhibiting transcription of the abnormal gene and deactivating the function of the abnormal gene.
  • restriction enzymes are not able to cut out target sites freely, and there are restrictions on the cutting position. Therefore, it is difficult to apply to actual treatment at the current level.
  • the method (2) is called an antisense method or an anti-gene method, and is expected as a gene therapy method for various cancer diseases and viral diseases.
  • a base sequence long enough to identify the target gene in each cell can be identified accurately.
  • Double-stranded DNA inhibits replication and transcription initiation: anti-gene method
  • mRNA inhibition of translation: antisense method, RNAi method
  • the antisense and antigene methods described above inhibit replication, transcription, and translation by binding DNA with some modification to the target mRNA, single-stranded or double-stranded DNA, or degradation by RNase H. It is a method that exerts a growth-inhibiting effect on cells, bacteria, and viruses that have target mRNA.
  • Phosphorothioate-type oligonucleotides in which one oxygen atom of the phosphate group is replaced with the homologous atom sulfur have been particularly extensively studied. This is
  • the first antisense drug approved by the FDA (US Food and Drug Administration) for application to retinitis caused by cytomegalovirus is also a phosphorothioate type oligonucleotide (21-nier) 2 1 Body) (Vitravene (registered trademark)), and recently an effect on muscular dystrophy has also been reported.
  • the therapeutic phosphorothioate oligonucleotides have lower thermodynamic stability of double strands than natural DNA, have insufficient base sequence recognition ability, and have in vivo proteins and There is a problem in that the interaction of is strong and may exhibit physiological activity not based on the activity as an antisense.
  • BNA Binary ring Nucleic Acid
  • ⁇ 3'- ⁇ / ⁇ ( ⁇ ) type puckering of the sugar furanose ring and enhanced affinity with mRNA, and enhancing the stacking effect at the base site
  • DNA therapy is also attracting interest in gene therapy using decoy-type DNA that targets the sequence recognition sites of proteins called transcriptional regulators and inhibits their action.
  • RNA interference RNA interference
  • dsRNA long double-stranded RNA
  • siRNAs small interfering RNAs
  • RISC RNA—induced silencing complex
  • conversion of the incorporated double-stranded siRNAs into single-stranded siRNA by RNA helicase conversion of the incorporated double-stranded siRNAs into single-stranded siRNA by RNA helicase, and single-stranded siRNA
  • RISC RNA—induced silencing complex
  • This is based on a series of flow of sequence-selective RISC binding to the target mRNA as a target molecule and suppression of gene expression associated with cleavage of RIRNA-bound raRNA by RNase H.
  • dsRNA having an arbitrary sequence can be introduced directly into the cell, or it can be expressed in ⁇ O using a single vector.
  • some problems remain with RNA stability.
  • nucleic acids or their derivatives can be applied to pharmaceuticals by taking advantage of their affinity for nucleotide sequence-selective genes.
  • Distamycin A represented by the following formula, which is an antibiotic isolated from bacteria, improves the thermal stability of double-stranded DNA with a sequence of three or more adenine (A) or thymine (T).
  • Distamycin A has a bowed molecular structure that matches the curvature of the mi-nor groove of B-type DNA, and its slightly inward-facing NH group is the 7V3 position of adenine, or thymine
  • the intermolecular bond is stabilized through a hydrogen bond with the carbonyl oxygen at the C2 position.
  • guanine (G) -cytidine (C) base pair is present in the sequence, there is a steric hindrance between the amino group at the C2 position of the guanine protruding to the minor groove and the hydrogen at the 1-methylpyrrole (Py) position. Since the affinity to the minor groove is reduced, the nucleotide sequence selectivity appears.
  • MGBs Minor Groove Binders
  • Typical examples are those using bleomycin, nitrogen mustard, cyclopropinoleindole, DNA interferon, and duocarmycin as functional molecules.
  • Sugiyama et al. Succeeded in selectively acting duocarmycin and its derivatives and a hybrid compound of MGB polyamide on an arbitrary target base sequence (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • Non-Patent Document 4 Non-Patent Document 5
  • Such a hybrid compound of nucleoside and MGB polyamido is incorporated into DNA by the biosynthetic pathway in the same way as the modified nucleoside used in ordinary nucleic acids and anticancer agents. If there is a site that specifically recognizes, it shows the stabilization of double-stranded DNA by forming a very tight and stable binding to the minor groove, and inhibits replication and transcription of the DNA. Conceivable.
  • the MGB polynucleoside hybrid compound alone acts on double-stranded DNA, the nucleoside in the hybrid forms a Hoogsteen-type hydrogen bond, and the affinity and base of the MGB polyamide It is thought to have an anti-gene effect that exhibits selectivity.
  • the hybrid compound of MGB polyamid combines high base sequence recognition ability, high stability to in vivo enzymes possessed by MGB polyamid, and excellent membrane permeability, and is a candidate for genetic information control molecule. I can expect.
  • Non-Patent Document 1 White, S .; Baird, E. E .; Dervan, P. B. Chem. Biol.,
  • Non-Patent Document 2 Trauger, J. W .; Baird, E. E .; Dervan, P. B. J.
  • Non-Patent Document 3 Tao, ⁇ ⁇ ; Fuj iwara, T.; Sugiyama, H. J. Am.
  • Non-Patent Document 4 Y .; Ohba, Y .; Terui, K .; Kama ike, T .; Oshima, E .;
  • Non-Patent Document 4 Y.; 0hba, Y .; Terui, K .; Kamaike, T.; 0shima,
  • Non-Patent Document 5 "Abstracts of the 14th Antisense Symposium” Antisense DNA / RNA Study Group, 1 February 2, 1994, p55 Disclosure of Invention
  • MGB polyamides can be added with unique base sequence recognition ability while maintaining their pharmacological activity by hybridizing with various functional molecules.
  • MGB polyamide has high base sequence recognition ability, high stability against in vivo enzymes, and excellent membrane permeability, hybrid compounds with MGB polyamide combine all these features. I can expect that.
  • hybrid compounds have the effect of selectively stabilizing the dsDNA containing the target nucleotide sequence (antigene approach), or the hybrid compound itself is incorporated into the DNA via the biosynthetic pathway, and the MGB in this DNA It can be expected to inhibit the replication and transcription of the target gene because it has a selective stabilizing action by preferentially coordinating only the minor groove with the site specifically recognized by the polyamide.
  • an object of the present invention is to provide an MGB polyamide hybrid compound that can synthesize oligomers effectively while maintaining the performance of the MGB polyamide hybrid compound, but has excellent stability.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing these MGB polyamide hybrid compounds and intermediates useful therefor. Means for solving the problem
  • the inventors of the present invention have high base sequence recognition ability, high stability against in vivo enzymes, excellent membrane permeability, and an MGB polyamido hybrid capable of more effective oligomer synthesis.
  • a thiol compound it was found that a 1-methyl pyrrole or 2-carboyl group was introduced instead of the terminal formyl group to form a pyrrole amide tetramer, resulting in excellent base sequence recognition.
  • the present invention has been completed by discovering that it is possible to synthesize oligomers effectively while maintaining performance, excellent bioenzyme resistance, and excellent membrane permeability.
  • the present invention is as follows.
  • R 1 and R 2 are the same or different hydroxyl protecting groups, respectively.
  • R 1 2 and 13 ⁇ 4 3 are the same or different hydroxyl protecting groups, respectively.
  • a method for producing an oxyguanosine hybrid compound is
  • pyrrole amide tetramer 1'-deoxyguanosine hybrid compound of the present invention has a 1-methyl pyrrole 2-carboyl group at its terminal, Compared to mycin A, it has extremely high base sequence recognition ability, excellent in vivo enzyme resistance, excellent membrane permeability, and enables effective oligomer synthesis.
  • the MGB polynucleoside hybrid compound of the present invention has high base sequence selectivity and is expected to be useful as a novel genetic information regulatory molecule.
  • the pyrrole polyamide trimer of the MGB polyamido part could be easily synthesized by a purification method using partitioning with acid monobase using the report of Boger et al.
  • the present inventors subsequently considered the stability when the hybrid compound is incorporated into DNA, and changed the binding mode at the ⁇ 2 position from an amide bond to a bond by alkylation, thereby removing it during DNA synthesis.
  • Fmoc phenyl carbonate was synthesized as a mono-Fmocylating reagent, and this was allowed to act on diaminoanolecan for 1 equivalent.
  • This synthesis method can be widely used as a method for introducing acid-stable protecting groups in the synthesis research of polyamine compounds, and its usefulness is considered high.
  • MGB polyamide is condensed with mono-Fmoc-daminopropan, and after removal of the Fmoc group, it is reacted with a 2-fluoroleucine derivative to bind the desired hybrid compound by ⁇ alkylation (terminal).
  • 1-methylpyrrole 2-carbonyl Z-pyrrole amide tetramer was achieved.
  • the “hydroxyl-protecting group” in R 1 and R 2 is the same or different, and is, for example, acyl, strong rumoyl or aralkyl.
  • the acyl group is preferably formyl, C 3, or the like.
  • Cycloalkylcarbonyl e.g., cyclopentane Kano levo Nino les, hexane carbonyl to consequent opening
  • C 8 - 13 ⁇ reel alkenylcarbonyl e.g., styryl ylcarbonyl
  • C 8 one 13 ⁇ reel alkynylene Luca Lupo Interview le eg, Hue C 6 — 14 arylsulfonyl (eg, ferulsonole phonyl); mono- or di-C — 6 alkyl-powered rubermoyl (eg, methylcarbamoyl, ieri-ptylcarbamoyl); C 3 —.
  • alkoxy one local Bamoiru eg, main butoxy carbamoyl
  • C j - 6 alkoxycarbonyl two Luke Rubamoinore eg, main Tokishikarubo carbamoylmethyl, et Tokishikarubo carbamoylmethyl
  • the “hydroxyl protecting group” is preferably the same, particularly preferably a acetyl group.
  • the “hydroxyl protecting group” may be TIPDS in which R 1 and R 2 are taken together.
  • Compound 33 is obtained by converting Compound 3 to carboxylic acid 32 with an aqueous sodium hydroxide solution and condensing it with a compound from which the Boc group has been removed from pyrrolamide trimer 8.
  • the ester 33 is then converted to compound 34 by hydrolysis and then condensed with mono-Fmoc diaminopropane 26 to give compound 35.
  • the pyrrole amide trimer 8 protected with the Boc group is converted into an amino group by catalytic reduction of the nitro group of compound 5, and is converted into 4- (tert- (butoxycarbonyl) amino-1-methylpyrrole-2- By condensing with rubonic acid 6, methyl 4 ⁇ [4-(tert-butyloxycarbonyl) amino 1-methylpyrrole 2-yl] carbonyl ⁇ amino 1-methylpyrrole 2-carboxylic acid ester 7 Subsequently, the Boc group of pyrrolamide dimer 7 was removed under acidic conditions, and condensation with re-pyrocarboxylic acid compound 6 was performed to obtain pyrrolamide trimer 8.
  • 'Measuring solvent heavy chloroform, heavy dimethyl sulfoxide, heavy methanol.
  • UV absorption 5% sulfuric acid / methanol solution is sprayed and heated at 100 to 150 ° C. After immersion in a mixture of anisaldehyde, ethanol, sulfuric acid, water and acetic acid, at 100 to 150 ° C. Heating.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, dissolved in methanol (100 mL), 2 M aqueous sodium hydroxide solution (100 mL) was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 2 hr. After removing methanol by concentration under reduced pressure, the remaining aqueous layer was washed with ether (50 mL ⁇ 2). The aqueous layer was adjusted to pH 3 with 10% hydrochloric acid and then extracted with ethyl acetate (200 niL X 3). The organic layers were combined, washed with a saturated aqueous sodium chloride solution (200 mL), and dried over anhydrous magnesium sulfate. After removing anhydrous magnesium sulfate by filtration, the organic layer was concentrated under reduced pressure, and the residue was recrystallized with ethyl acetate-hexane to obtain 6.97 g (89%) of Compound 6.
  • Methyl _4 1 [(4 1 ⁇ [4 1 (er -Ptyloxycarbonyl) amino methyl bilol 1 2 _yl] _Carbonyl 1 ⁇ Minomethylpyrrole 1 2-Inole) Canole Boninole] Amino 1-Metinorepyro 1 _ 2—Strengthen norebonic acid ester
  • 2′-Deoxyguanosine (8.02 g, 30 mmol) was azeotropically dehydrated three times with pyridine and dissolved in DMF (24 mL) under an argon atmosphere. Subsequently, 4-dimethylaminopyridine (0.37 g, 3.0 mmol), pyridine (24 mL) and acetic anhydride (22.1 mL, 240 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Thereafter, water (10 mL) was added to the reaction solution to stop the reaction, ethanol (200 mL) was added and stirred for 30 minutes, and then allowed to stand at room temperature.
  • Step 1 Synthesis of 1-methyl bilol 1-strength rubonic acid (3 2) _
  • Compound 3 (5.00 g, 22.0 mmol) synthesized in the previous step 1 was dissolved in methanol (50 mL), and 2.0 M aqueous sodium hydroxide solution (50 mL) was added. The reaction solution was heated to 60 ° C and stirred for 1 hour. The methanol was removed under reduced pressure, and the remaining solution was diluted with water (50 mL) and washed with ether (50 mL). The aqueous layer was adjusted to about pH 3 with 10% hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate (100 mLX3).
  • reaction solution is then diluted with ethyl acetate (200 raL), 10% hydrochloric acid (50 mLX3), saturated aqueous sodium bicarbonate (50 mLX3), and saturated aqueous sodium chloride. (50 mL) and dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • the pyrrolamide 2, -deoxyguanosine hybrid compound 38 of the present invention is stable against ssDNA having a site that pyrrole polyamide specifically recognizes when incorporated into ssDNA by biosynthesis. A double bond is formed. In addition, it has extremely high base sequence selection ability.
  • the MGB polynucleoside hybrid compound of the present invention is a novel genetic information control molecule having a high base sequence selection ability, and can be expected to be effectively applied to an antisense drug.

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Description

明細書 ピロールァミ ド 4量体を含む 2 ' —デォキシグアノシンハイプリ ッ ド 化合物及びその製造方法、 そのための製造中間体 技術分野
本発明は、 遺伝子治療のための医薬として有用な、 2 ' —デォキシグ ァノシンの Νλ 位にリンカーを介しピロールアミ ド 4量体を導入した新 規なハイプリ ッド化合物及びその製造方法、 そのための製造中間体に関 する。 背景技術
最近の分子生物学、 遺伝子技術の最近の発展は目覚しいものがある。 特に、 ゲノム科学発達に伴い、 ヒ トゲノムが解析され、 さらにポストゲ ノムとして悪性新生物や病因ウィルスの遺伝子の解析が進んでいる。 こ れまで原因がわからなかった多くの疾患の原因遺伝子が次々に同定さ れ、 それらの発症機構が分子レベルで解明されるようになった。 このよ うな遺伝子治療の考えは、遺伝子病の存在が知られるようになった 1950 年代からあつたが、 その後の組み換え DNA技術や遺伝子導入技術の発達 により、 徐々に実現可能な治療手段として現実的なものになりつつある。
遺伝子治療の方法としては、 下記 3つの方法が知られている。
( 1 ) 遺伝子そのものを直接操作する方法；
これは、 異常遺伝子はそのままにして、 正常な遺伝子を新たに細胞 に加える方法であり、 早い時期から具体化され、 現在も実用化が急速に 進められている。 過去に行われた 「A D A (アデノシンデァミナーゼ） 欠損症」 の遺伝子治療がこの方法に該当する。 その他、 家族性高コレス テ口ール血症、嚢胞性線維症、 Fanconi貧血等の遺伝子治療に対しても、 それぞれの正常遺伝子を細胞に付加する手段の検討がなされている。
遺伝子治療のなかでは、 比較的単純な方法であるといえるが、 異常 遺伝子が有害タンパク質を作らないこと、 あるいは遺伝子が必要な働き をしないために起こる病気等、 適用のための条件には制限がある。
( 2 ) 異常遺伝子の働きを止める方法；
所謂 「アンチセンス D N A」 療法と呼ばれる、 特定のターゲッ ト遺 伝子配列に対して結合する人工的な遺伝子配列を該異常遺伝子に結合 させて、 該異常遺伝子の転写を阻止して該異常遺伝子の機能を失活させ るものである。
( 3 ) 遺伝子の異常な部分を切り取る方法；
「制限酵素」 を用いて異常遺伝子を切り取る方法である。 ただし、 現在の技術では、 制限酵素はターゲット部位を自在に切り取れるわけで はなく、 切取り位置には制限がある。 したがって、 現在のレベルでは実 際の治療への応用は困難である。
上記 （2 ) の方法は、 アンチセンス法、 アンチジーン法と呼ばれ るものであり、 各種癌疾患やウィルス性疾患の遺伝子治療方法として期 待されている。
このことから、 疾患原因である特定のターゲット遺伝子配列を特異 的に認識し、かつ、その発現を阻害できる化合物の開発が望まれている。
このような化合物に求められる特性は、 下記のとおりである。
1 . 各々の細胞内の標的遺伝子を特定するために十分な長さの塩基配列 を厳密に識別できること。
2 . 標的塩基配列に対してのみ高い親和性を有すること。
3 . 化学的合成が容易であること。
4 . 生体内の各種酵素存在下において安定であること。
5 . 細胞毒性が低いこと。
6 . 細胞膜、 核膜を容易に透過できること。
7 . 一度の作用で失活せず、 繰り返し多数の細胞に作用（ターンオーバ 一）すること。 .
また、 標的となる塩基配列を持つ遺伝子としては、
A . 二重鎖 DNA (複製および転写の開始を阻害： アンチジーン法）、
B . —本鎖 DNA (転写の阻害 ： アンチセンス法）、
C . mRNA (翻訳の阻害： アンチセンス法、 RNAi法）
などを挙げることができる。
上記アンチセンス法やアンチジーン法は、標的 mRNA、 一本鎖や二重 鎖 DNAに対して何らかの修飾を施した DNAを結合させることで、 複製、 転写、 翻訳を阻害、 あるいは RNase Hによる分解を促すことにより、 標 的 mRNA を持つ細胞や細菌、 さらにはウィルスに対しても増殖抑制効果 を発揮する方法である。 アンチセンス法に用いられる化合物としては、 リン酸基の酸素原子 1つを同族原子である硫黄に置き換えたホスホロチ ォエー ト型のオリゴヌクレオチドが特に広く研究されている。 これは
( 1 ) RNase H による分解活性、 （2 ) ヌク レアーゼ耐性、 （3 ) 細胞膜 透過性、 （4 ) 水溶性において優れており、 その他の糖部や塩基部の修 飾と組み合わせて用いることも可能であり、 利便性が高い。
FDA (米国食品医薬品局）により初のアンチセンスドラッグとして， サイ トメガロウイルスによる網膜炎に対する適用で認可されたものも ホスホ ロ チォエー ト型オリ ゴヌ ク レオチ ド （ （21- nier) 2 1 量体） (Vitravene (登録商標） ）であり、 最近では筋ジス トロフィーに対する 効果も報告されている。 しかしながら、 治療薬のホスホロチォエート型 オリゴヌク レオチドには、 天然型の DNAと比較して二重鎖の熱力学的安 定性が低い、 塩基配列の認識能力が十分ではない、 生体内のたんぱく質 との相互作用が強く、 アンチセンスとしての活性に基づかない生理活性 を示すことがある等の問題点がある。 他にも糖部フラノース環のパッカ リングを 3 ' - ί/ο型 （^型） に固定し mRNA との親和性を高めた BNA (Bridged ring Nucleic Acid)や、 塩基部位にスタツキング効果を増強 させるような置換基を導入したもの、 主鎖を糖ではなくァミ ド結合の高 分子に置き換えた PNAなどが治療薬の候補として挙げられているが, 現 段階ではまだ研究段階である。
DNA を用いる治療法は、 遺伝子以外に転写調節因子と呼ばれるタン パク質の配列認識部位を標的とし、その作用を阻害するデコイ （おとり） 型 DNAを用いる遺伝子治療にも関心が集まっている。
ところで、近年非常に注目を集めている遺伝子を用いた技術が、 RNA 干渉 （RNA interference； RNAi)法である。 これは生体内において長鎖 の二重鎖 RNA (dsRNA) 力 S、 Di cerと呼ばれる酵素により 21〜23塩基対か らなる短い二重鎖 RNA (smal l interfering RNAs； siRNAs)に切断される こと力 ら 合まり、 RISC (RNA— induced s i lencing complex)と呼は'れる複 合体の形成、 取り込まれた二重鎖 siRNAs の RNAヘリカーゼによる一本 鎖 s iRNAへの変換、 一本鎖 siRNAをガイ ド分子とする標的 mRNAへの配 列選択的な RISCの結合、 RISCが結合した raRNAの RNase Hによる切断に 伴う遺伝子発現の抑制という一連の流れを利用したものである。 実際の 応用には、 細胞内に任意の配列を持つ dsRNAを直接導入するか、 ベクタ 一を用いて ^ Oで発現させればよく、 簡便に利用できるものと思わ れるが、 RNAの安定性に多少の問題は残る。
このように、 核酸あるいはその誘導体は元来から有する塩基配列選 択性的遺伝子への親和性を生かし、 医薬品へと応用していくことが可能 である.
方， 上記のような核酸誘導体ではないものの、 塩基配列選択的に 遺伝子に作用する化合物もいくつか知られている。 細菌から単離された 抗生物質である下記式で示されるディスタマイシン Aは、 配列にアデ二 ン（A)もしくはチミン（T)が 3個以上連続した二重鎖 DNAの熱的安定性を 向上させる。
Figure imgf000006_0001
ディスタマイシン A は、 その弓なりの分子構造が B型 DNA の副溝 (mi nor groove)の湾曲にマッチし、 内側を向いたわずかに酸性度を有す る NH基がアデニンの 7V3位、 あるいはチミンの C2位のカルボニル酸素 との水素結合を介することで分子間の結合を安定化させている。 配列に グァニン（G)—シチジン（C)塩基対が存在すると、 副溝側に突き出したグ ァニンの C2位のァミノ基と 1-メチルピロール（Py)の 位の水素の間に 立体的な障害があり、 副溝に対する親和性が低下することから塩基配列 選択性が現れている。
その後の研究からディスタマイシン Aは 1つのマツチサイ トに対し て逆平行に 2分子配位していることが明らかにされ、 さらに逆平行に配 向したディスタマイシン A誘導体の 1 -メチルピロールを 1 -メチルイミ ダゾール（Im)や 3 -ヒ ドロキシ- 1-メチルビロール（Hp)に置き換えること で、 4つの塩基対の組み合わせ （A- T， Τ-Α, G-C, C_G)全てを認識するこ とが可能になった （例えば、 非特許文献 1 )。 また、 Dervanらは、 逆平 行に配向する Py- Imポリアミ ド化合物をリンカ一で結合し二重鎖 DNAへ の配列選択性と親和性を向上することに成功している （例えば、 非特許 文献 2 )。
更に、 最近は、 任意の塩基配列を認識するポリアミ ド化合物は固相 法による自動合成法が確立されたことにより合成が容易に行えるよう になり、 標的とする塩基配列に適合する化合物を容易に合成できる利便 性の高さ、 さらに核酸誘導体で問題となるヌクレアーゼに対する安定性、 細胞膜や核膜に対する透過性も優れていることから、 新たな塩基配列認 識分子として関心が高まっている。
このポリアミ ド化合物を用いた研究としては、 配列選択的副溝結合 型（Minor Groove Binders ； MGBs)ポリアミ ドに DNAへ影響を与える機能 性分子を結合させ、 その機能を塩基配列選択的に発現させようとする試 みが数多くなされている。 代表的な例はブレオマイシン、 ナイ トロジェ ンマスタ一ド、 シクロプロピノレインドール、 DNA インター力レーター、 デュオカルマイシンを機能性分子として用いたものである。 その中でも、 Sugiyamaらはデュオカルマイシンおよびその誘導体と MGBポリアミ ドの ハイプリッド化合物を、 任意の標的塩基配列に選択的に作用させること に成功している （非特許文献 3 )。 このように MGB ポリアミ ドは機能性 分子の持つ薬理活性を保持したまま、 ユニークな塩基配列認識能を付加 できることが明らかにされている。
本発明者らも、 上記背景のもとにゲノム化学に基づく遺伝情報制御 分子の創製を目的として、 下記に示すような、 2 ' —デォキシグアノシ ンの m 位にァミ ド結合を有するリンカーを介しピロ一ルポリアミ ド 3 量体を導入したハイプリッド化合物や、 ^アルキル化によるリンカーを 介しピロールアミ ド 3量体を導入したハイブリッド化合物を合成し、 報 告した。 （非特許文献 4、 非特許文献 5 )
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
このようなヌクレオシドと MGBポリアミ ドとのハイブリ ッ ド化合物 は、 通常の核酸ゃ抗癌剤などに用いられる修飾ヌクレオシドと同様に生 合成経路で DNA内に取り込まれた場合、 その近辺の配列に MGBポリアミ ドが特異的に認識するサイ トが存在すると非常にタイ トで安定した副 溝への結合を形成することで二重鎖 DNAの安定化を示し、 その DNAの複 製や転写を阻害するものと考えられる。
一方、 近辺に MGBポリアミ ドにとって特に認識しないサイ トが存在 した際には二重鎖の安定化作用を示さないことから複製や転写を阻害 しないことが期待できる。 また、 MGBポリアミ ドーヌクレオシド ハイブ リッ ド化合物が単体で二重鎖 DNAに作用する場合には、 ハイプリ ッド中 のヌクレオシドが Hoogsteen型の水素結合を形成し、 さらに MGBポリア ミ ドによる親和性、 塩基選択性を発揮するようなアンチジーン的な作用 を持つことが考えられる。
このように MGBポリアミ ドのハイブリッド化合物は、 高い塩基配列 認識能と MGBポリアミ ドの有する生体内酵素に対する高い安定性、 優れ た膜透過性といった特徴を併せ持ち、 遺伝情報制御分子としての候補と して期待できる。
[非特許文献 1 ] Whi te, S.； Baird, E. E.； Dervan, P. B. Chem. Biol.，
1997， 4, 569
[非特許文献 2 ] Trauger, J. W.； Baird, E. E. ; Dervan, P. B. J.
Am. Chem. So ， 1996, 118, 6160
[非特許文献 3 ] Tao, Ζ·； Fuj iwara, T. ; Sugiyama, H. J. Am.
Chem . Soc.， 1999, 121, 4961
[非特許文献 4 ] Y.； Ohba, Y.； Terui , K.； Kama ike, T.； Oshima, E.；
Kawashima, NucleicAcids Symposium Series No. 48, 2004, p. 55-56.
非特許文献 4 ] Y. ; 0hba, Y.； Terui , K.； Kamaike, T. ; 0shima,
E.； Kawashima, NucleicAc i ds Symposium Seri es No. 48, 2004, p. 55 - 56
[非特許文献 5 ] 「第 1 4回 アンチセンスシンポジウム講演要旨集」 アンチセンス D N A / R N A研究会、 平成 1 6年 1 2月 2日、 p55 発明の開示
発明が解決しようとする課題
MGB ポリアミ ドは様々な機能性分子とハイブリッ ドさせることでそ れらの持つ薬理活性を保持したままユニークな塩基配列認識能を付加 することが可能である。 さらに、 MGB ポリアミ ドはその高い塩基配列認 識能に加え生体内酵素に対する高い安定性、 優れた膜透過性を有するた め、 MGB ポリアミ ドとのハイブリ ッド化合物はこれら全ての特徴を併せ 持つことが期待できる。
このよ うなハイブリッド化合物は、 標的塩基配列を含む dsDNAを選 択的に安定化させる作用 （アンチジーン型アプローチ）、 あるいはハイ プリッド化合物自体が生合成経路を経て DNAに組み込まれ、 この DNA中 の MGBポリアミ ドが特異的に認識するサイ トを持つ副溝に対してのみ優 位に配位することによる選択的安定化作用を有することから標的遺伝 子の複製や転写を阻害できるものと期待できる。
ところで、 本発明者らが前記ハイプリッ ド化合物 （2 0 ) をオリゴ マー合成する際に必要となるアンモニア処理に対する安定性の評価を 行ったところ、 TL (：、 ^ -丽 Rによる検討において、 アミ ド結合によるリ ンカーを介するハイブリッ ド化合物 （1 ) のアンモニア処理で検出され た 2 ' —デォキシグアノシンは検出されなかった。 このことから、 ーァ ルキル化によるリンカーの結合へと結合様式を変換したことによりに よりハイプリッド化合物の Νλ 位でのアンモニア処理に対する安定化を 高めることが可能であることが明らかになった。 しかしながら、 TLC上 で （2 0 ) よりも Rf 値の低いスポッ トがわずかながら生じた。 これは ]H-NMR から ^末端のホルミル基が脱落したと思われる化合物と推測さ れた。 即ち、 先の化合物 （2 0 ) は、 アンモニア処理において、 2， 一 デォキシグアノシンは検出されないものの、 末端のホルミル基の脱落 が観察され、 必ずしもその安定性が満足し得るものではないことが分か つ 7こ。
したがって、 本発明の目的は、 MGB ポリアミ ドハイブリッド化合物 の性能を維持しつつ、 効果的にオリゴマーを合成することができ、 しか も安定性の優れた MGBポリアミ ドハイブリッド化合物を提供することで ある。 また、 本発明の別の目的は、 これら MGBポリアミ ドハイブリッ ド 化合物の製造方法及びそのために有用な中間体を提供することである。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 高い塩基配列認識能及び生体内酵素に対する高い安 定性を有し、 かつ、 優れた膜透過性を有し、 しかも、 より効果的なオリ ゴマー合成が可能な MGBポリアミ ドハイブリ ッド化合物を見出すべく鋭 意研究をしたところ、 ^末端のホルミル基に換えて 1ーメチルビロール 一 2 —カルボ二ル基を導入してピロールアミ ド 4量体とすることによ り、 優れた塩基配列認識能、 優れた生体內酵素抵抗性、 優れた膜透過性 を維持しつつ、 しかも効果的なオリゴマー合成が可能となることを見出 して本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 以下のとおりである。
1 . ピロールアミ ド 4量体を含むことを特徴とする下記一般式 （ 3 8 ) 式で示される 2， ーデォキシグアノシンハイプリッド化合物。
Figure imgf000010_0001
2 . ピロールアミ ド 4量体を含むことを特徴とする下記一般式 （3 7 ) 式で示される水酸基が保護された 2 ' —デォキシグアノシンハイプリ ッド化合物。
Figure imgf000011_0001
(ここで、 R1及び R2は、 それぞれ同一又は異なった水酸基保護基を 意味する。）
. ピロールアミ ド 4量体を含むことを特徴とする下記一般式 （3 6) 式で示される保護された 2， ーデォキシグアノシンハイプリッド化合 物 o
Figure imgf000011_0002
(ここで、 R 1 2及び1¾3は、 それぞれ同一又は異なった水酸基保 護基を意味する。）
. 下記一般式 （3 5) で示されるジァミン化合物と下記式 （2 3) で 示される化合物を反応させることを特徴とする上記一般式 （3 6) 式 で示される保護された 2 ' ーデォキシグアノシンハイプリッド化合物 の製造方法。
Figure imgf000012_0001
(ここで、 Fmocは 9一フルォレニルメ トキシカルボ二ル基を意味する。
R R2及び R3は、 前記と同じである。）
. ピロールアミ ド 4量体を含むことを特徴とする下記一般式 （ 3 5) で示されるジァミン化合物。
Figure imgf000012_0002
(ここで、 Fmocは前記と同じである。）
. 下記式 （ 34) で示されるピロールアミ ド 4量体を含むカルボン酸 化合物と下記式 （ 2 6) で示されるカルバメート化合物を反応させる ことを特徴とする上記一般式 （3 5) で示されるジァミン化合物の製 造方法。
Figure imgf000013_0001
7 . 上記一般式 ( 3 5 ) で示されるジアミン化合物 ( 3
めの下記式 （2 6 ) で示される力ルバメート化合物。
Figure imgf000013_0002
発明の効果
本発明のピロールアミ ド 4量体一 2 ' —デォキシグアノシンハイプ リツド化合物は、 末端に 1一メチルピロ一ルー 2—カルボ二ル基を有 することを 1つの特徴とするものであり、 デイスタマイシン Aと比較し ても極めて高い塩基配列認識能を有し、かつ、優れた生体内酵素抵抗性、 優れた膜透過性を有し、 しかも効果的なオリゴマー合成が可能である。
したがって、 本発明の MGB ポリアミ ドーヌクレオシド ハイプリッ ド化合物は、 高い塩基配列選択能を有し、 新規遺伝情報制御分子として の有用性が大いに期待される。 発明を実施するための最良の形態
本発明者らの発明に係る先のハイプリ ッ ド化合物発明においては、 MGBポリアミ ド部のピロールポリアミ ド 3量体は、 Boger らの報告を応 用して酸一塩基による分配を利用した精製法により容易に合成できた。
本発明者らは、 続いて、 ハイブリ ッド化合物を DNAに組み込む際の 安定性を考慮し、 Λ2 位での結合様式をアミ ド結合から アルキル化に よる結合に変えることで DNA合成時の脱保護条件下で安定なハイプリッ ド化合物を設計し合成を行った。 リンカ一として用いるジアミノプロパ ンの片側のアミノ基を選択的に保護するために、 mono - Fmoc 化試薬とし て Fmoc フエニルカルボネートを合成し、 これをジアミノアノレカンに 1 当量だけ作用させた。 その結果、 一方のアミノ基を塩酸塩にすることで 収率よく mono- Fmoc化することに成功した。 本合成法はポリアミン化合 物などの合成研究にも酸に安定な保護基の導入法として広く活用でき、 その有用性は高いものと考えられる。続いて mono-Fmoc -ジァミノプロパ ンに対して MGBポリアミ ドを縮合し、 Fmoc基の除去後、 2-フルォロイノ シン誘導体と反応させることで目的とする ^アルキル化により結合す るハイプリ ッ ド化合物（ 末端 1-メチルビロール 2-カルボニル体 Zピロ ールアミ ド 4量体）の合成を達成した。 アルキル化により結合するハ イブリツ ド化合物（ピロールァミ ド四量体）のアンモニア処理を検討し た結果、 安定であることが判明したことから、 オリゴマー合成が可能で あることが明らかとなった。
R 1及ぴ R 2における 「水酸基保護基」 は、 それぞれ同一又は異なつ て、 ァシル、 力ルバモイルまたはァラルキル等である。 該ァシル基 は、 好ましくはホルミル、 C ,。アルキルカルボニル、 アルコキシカル ボニル、 c 6— 14ァリールカルボニル、 c 7— 13ァラルキル一カルボエル、 芳 香族複素環カルボニル、 5ないし 7員非芳香族複素環カルボニル、 C 3 — i。シクロアルキルカルボニル （例、 シクロペンタンカノレボニノレ、 シク 口へキサンカルボニル） ； C 8— 13ァリールアルケニルカルボニル （例、 ス チリルカルボニル） ； C 8一 13ァリールアルキニルカルポュル （例、 フエ二 ルェチ二ルカルボ二ノレ） ； c 6— 14ァリールスルホニル （例、 フエ-ルスノレ ホニル） ； モノ一またはジー C — 6アルキル力ルバモイル（例、 メチルカ ルバモイル、 ieri—プチルカルバモイル） ； C 3— 。シクロアルキル力ノレ ノ《モイル （例、 シクロプロピルカルパモイル、 シクロペンチルカルパモ ィル、シク口へキシルカルバモイル）； C 6— 1 4ァリ一ルカルバモイル（例、 フエ二ルカルバモイル） ； C 7— 1 4ァラルキル力ルバモイル （例、 ベンジ ノレカルパモイノレ、 フエネチルカルバモイル、 ジフエニノレエチルカルバモ ィル) ； c 4— 13シクロアルキルアルキル力ルバモイル (例、 シクロへキシ ルメチルカルバモイル） ；芳香族複素環力ルバモイル （例、 イ ソキサゾ リルカルバモイル、 ベンゾチアゾリルカルバモイル) ；非芳香族複素環 力ルバモイル (例、 ピロ リ ジニルカルバモイル） ； C 7 _ 1 4ァラノレキルォ キシカルバモイル (例、 ベンジルォキシカルバモイル） ； 等である。 ま た、 「炭素数 1〜 1 5のァシル基 」 としては、 アルコキシ一カル バモイル（例、 メ トキシカルバモイル）、 C j — 6アルコキシカルボ二ルカ ルバモイノレ（例、 メ トキシカルボ二ルカルバモイル、 エ トキシカルボ二 ルカルバモイル）なども挙げられる。 該 「水酸基保護基」 は、 好ましく は同一であり、 特に好ましくはァセチル基である。 また該 「水酸基保護 基」 は R 1及ぴ R 2が一緒になつて T I P D Sであってもよい。 本発明化合物の製造方法は、 以下のとおりである。 詳細は実施例を 参照されたい。
先のハイブリッ ド化合物 （ 1 ) や （2 0 ) では、 アンモニア処理に 対してピロール間のアミ ド結合それ自体は安定であった。 これはアミ ド の π結合がピロール環との共鳴により安定化しているものと考えられ る。 そこでハイプリッ ド化合物のその後のオリゴマー合成におけるアン モニァ処理に対する安定性改善のために、 ホルミル基にかわる 末端基 として 1—メチルピロール一 2—カルボニル基をァミ ド結合により結 合させることでアンモニア処理に対する安定化を図ろうと試みた。
まず、 化合物 3 を水酸化ナトリゥム水溶液によりカルボン酸 32 へ と変換し、 これとピロールアミ ド 3量体 8から Boc基を除去した化合物 と縮合させることにより化合物 33を得る。 次にエステル 33を加水分解 することにより化合物 34へと変換した後、 mono-Fmocジァミノプロパン 26と縮合させることによって化合物 35を得る。
Figure imgf000016_0001
なお、 Boc基で保護したピロールアミ ド 3量体 8は、 化合物 5の二 トロ基を接触還元によりアミノ基とし、 4— (tert— (ブトキシカルボ二 ル） ァミノ一 1—メチルピロール一 2—力ルボン酸 6との縮合させるこ とによりメチル 4 { [ 4— (tert- ブチロキシカルボニル） アミノー 1—メチルピロ ルー 2—ィル] カルボ二ル} ァミノ一 1—メチルピロ ルー 2—カルボン酸エステル 7とした。 続いて、 ピロールァミ ド 2量 体 7の Boc基を酸性条件下で除去し、再ぴカルボン酸化合物 6 との縮合 を行うことにより ピロールァミ ド 3量体 8とした。
Figure imgf000016_0002
上記合成法は、 縮合試薬に 1-ェチル _3-(3-ジメチルァミノプロピル） カルポジイミ ド塩酸塩 （EDCI) を用いたことにより、反応生成物の精製 を酸一塩基による分液操作のみで行うことができるため、 カラムクロマ トグラフィ一による精製なしに目的とするピロ ルポリアミ ド 3量体 8 を高収率で合成できる。
続いて、 化合物 35 の Fmoc基をトリエチルァミ ンにて除去し 2 ' — デォキシィノシン誘導体 23 のフッ素との置換反応を行うことにより化 合物 36を得る。 最後に、 化合物 36 の 位 2- (4-ニトロフエニル）ェチ ル基および 3， 位ならびに 5 ' 位ァセチル基を除去することでピロール アミ ド 4量体を含む 2 ' 一デォキシグァノシンハイプリッド化合物 38を 得ることができる。
Figure imgf000017_0001
以下、 実施例をもって具体的に説明する なお、 本実験で用いた分析機器等は以下の通りである.
( 1 ) ^核磁気共鳴スぺク トル （ - NMR) ；
• Bruker DPX 400 NMR spectrometer
•測定溶媒；重クロ口ホルム、 重ジメチルスルホキサイ ド、 重メタノ 一ノレ o
(2) 13C核磁気共鳴スぺク トル（13C- NMR) ；
• Bruker DPX 400 NMR spectrometer
'測定溶媒；重クロ口ホルム、 重ジメチルスルホキサイ ド、 重メタノ ール。
(3) 31P核磁気共鳴スぺク トル（31P- NMR) ；
• Bruker DPX 400 NMR spectrometer
•測定溶媒； 重ク口口ホルム、 重ジメチルスルホキサイ ド。
(4) 質量スぺク トノレ（MS) ；
• VG Auto SpecE (Micro Mass)
· TSQ - 700(Thermoquest)
( 5 ) 元素分析；
• Elemental Vavio EL
( 6 ) 薄層クロマトグラフィー（TLC) ;
• Merck Kieselgel 60 F254 (上昇法によって展開）
'検出法 ： UV 吸収 （5% 硫酸一メタノール溶液を噴霧し、 100〜150°C で加熱。 ァニスアルデヒ ド、 エタノール、 硫酸、 水および酢酸の混 合液に浸した後、 100〜150°Cで加熱。）
( 7 ) カラムクロマトグラフィー ；
•和光純薬工業 Wakogel C-300
· 関東化学シリ力ゲル 60N
(8) 融点測定；
•柳本製作所のミクロ融点測定装置 （未補正値を記載） 実施例 1 '
[前工程 1 ]· 2 _ トリクロロアセチルー 1ーメチルビロール （ 3) の
合成 ；
Figure imgf000019_0001
塩化トリクロロアセチル（130mL、 1. 16mo l)をアルゴン雰囲気下エー テル（250mL)に溶解し、 0 °Cに冷却した。 発熱に注意しながら、 予めェ 一テル（250mL)に溶解した 1ーメチルビロール（100 mL、 1. 12 mol)を滴 下ロートを用いて滴下した。 滴下終了後、 徐々に室温まで昇温させなが ら 1時間攪拌した。 2 M炭酸力リゥム水溶液（300mL)を加え反応を停止し、 有機層を分液操作により分離した。 水層からエーテル（300mL X 2)を用い て抽出を行い、 全ての有機層をまとめた後、 飽和塩化ナトリウム水溶液 (300mL)により洗浄した。 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ別 除去し、 ろ液を減圧下濃縮することで、 3を 244 g (96%)得た。
Ή-NMR (DMS0- 6) ： δ (s, 1H, Py-H) , 7. 43 (d, 1H, J =l. 18Hz, Py-H) , 6. 30 (dd, 1H, Jv , 2, =2. 57Hz, J2. , 2. . =1. 63 Hz, Py-H) , 3. 91 (s, 3H, Py-CH3)
13C— NMR (DMS0— d6) ： δ 171. 84, 135. 30， 123. 68, 120. 68, 109. 10， 96. 04, 37. 93
FAB-MS： m/z 225 (M+H)
分子量 (理論値) CANAC ： C, 37. 13 ; H, 2. 67； N, 6. 18.
分子量 （実測値） ： C, 37. 14： H, 2. 82： N, 6. 15.
[前工程 2 ] . 2 ——ト リ ク ロロアセチル一 1 —メチル一 4 —ニ トロピロ ル （4 ) の合成；
Figure imgf000019_0002
上記化合物 3 (2.14 g, 9.46 mmol)を無水酢酸（12 mL)に溶解、 - 40 °C に冷却した。温度を- 40 °Cに保ったまま、この溶液に発煙硝酸 (0.83 mL) を滴下した。反応'溶液を徐々に室温まで昇温し、さらに 1時間撹拌した。 反応溶液を再び- 20 °Cに冷却し、 イ ソプロパノール（12 mL)を加え 15 分間撹拌した。 その後- 20 °Cを保ったまま 15分間静置し、 生じた溶液 中の結晶を吸引ろ過により採取した。 結晶をィソプロパノールで洗浄後、 減圧下乾燥し、 白色の結晶を得た。 さらに、 ろ液を減圧下濃縮後、 再び イソプロパノールを加え一 20 °Cで 10分間攪拌し、 生じた結晶を吸引 ろ過により採取した。結晶をィソプロパノールで洗浄後、減圧下乾燥し、 先に得られた結晶と合わせて、 化合物 4を 2.01 g (78%)得た。
iH-NMR (DMSO-i/e)： δ 8.55 (d， 1H, J= 1.44 Hz, Py-H), 7.80 (d， 1H, J= 1.91 Hz, Py-H), 4.00 (s， 3H, PyCHs)
13C-NMR (OMSO-de)： δ 172.79, 134.25, 132.57, 120.60, 116.30, 94.54 m.p.: 134- 136 °C
[前工程 3 ] . メチル 1 —メチルー 4一二トロピロ一ルー 2 —カルボ
ン酸エステルの （ 5 ) 合成 ；
Figure imgf000020_0001
4
記化合物 4 (15.0 g, 55.3 mmol)をアルゴン雰囲気下メタノール
(20 mL)に溶解し、 予めメタノール (5.0 mL)に溶解した水素化ナトリ ウ ム（60%) (0.2 g、 5.5 mmol)を滴下した。 反応溶液を室温にて 1時間撹 拌した後、 濃硫酸 (0.3 mL、 5.5 mmol)を加えて反応を停止した。 反応 溶液を飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液（10 mL)により中和後、 残渣を酢 酸ェチル (200 mL)で希釈し、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液（100 mL X 2)、 及ぴ飽和塩化ナトリ ウム水溶液（100 mL)にて洗浄した。 有機層を無 水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ別除去し、 減圧下濃縮した。 残渣を酢酸 ェチルで再結晶し、 結晶を吸引ろ過により採取することで、 化合物 5を 6.02 g (61%)得た。 さらに、 ろ液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー (へキサン ： 酢酸ェチル = 5： 1)により精製し、 化合物 5を合計で 9.78 g (96%)得た。
iH-NMR (DMSO-ί/β)： δ 8.27 (d， 1H, J= 1.97 Hz, Py-H), 7.30 (d, 1H, J= 2.07 Hz, Py-H), 3.92 (s， 3H， PyCHs), 3.80 (s, 3H, -OCH3)
!3C-NMR (DMSO-i/e)： δ 159.83， 134.16 129.42, 122.59, 111.52, 51.77, 37.44 [前工程 4 ] . 4一 （tert—ブトキシカルボニル） ァミノ一 1 —メチルビ
ロール— 2 —力ルボン酸 _( 6 )—の合成 ；
Figure imgf000020_0002
6 前記化合物 5 (6.00 g、 32.6 mmol)を酢酸ェチル（200 mL)に溶解し、 10%パラジウム炭素（2.00 g)を加えた。 懸濁液を水素雰囲気下、 室温で 12時間激しく攪拌し、その後セライ トを用いてパラジウム炭素をろ別除 去した。 ろ液を減圧下濃縮後、直ちにアルゴン雰囲気下エーテル（30 mL) に溶解し、 予めエーテル（20 mL)に溶解したジ - r -ブチルジカルボネー ト（7.46 g、 34.2 mmol)を滴下し、 室温で 2時間攪拌した。 反応溶液を 減圧下濃縮後、 メタノール (100 mL)に溶解し、 2 M水酸化ナトリ ウム水 溶液（100 mL)を加え 60 °Cで 2時間攪拌した。 減圧下濃縮によりメタノ ールを除去した後、 残った水層をエーテル（50 mL X 2)で洗浄した。 水層 を 10%塩酸を用いて pH 3へと調整した後、 酢酸ェチル（200 niL X 3)に より抽出操作を行った。 有機層をひとつにまとめ、 飽和塩化ナトリ ウム 水溶液 (200 mL)により洗浄し、 無水硫酸マグネシゥムにより乾燥した。 無水硫酸マグネシウムをろ別除去した後、 有機層を減圧下濃縮し、 残渣 から酢酸ェチルーへキサンで再結晶を行うことで、 化合物 6 を 6.97 g (89%)得た。
iH-NMR (DMSO- 6)： δ 12.08 (s, 1H, -COOH), 9.03 (s, 1H， Boc-NH), 7.04 (s， 1H， Py-H), 6.58 (d, 1H， J= 1.04 Hz, PyH), 3.77 (s， 3H, Py-CH3), 1.44 (s， 9H, CH3- of Boc group)
13C-NME (DMSO-ί β)： δ 161.86， 152.70, 122.80, 119.64, 118.72, 107.45, 78.39, 36.01, 28.14
[前工程 5 ] · メチル 4— { [ 4— (tert—プチロキシカルボニル） ァ ミノ一 1 _メチルピロ一ルー 2—ィル] カルボ-ル} ァミノ _ 1 一メチルピロ一ノレ一 2—力ルボン酸エステル （ 7 ) の合
Figure imgf000021_0001
5 7
前記化合物 5 (3.00 g、 16.3 mmol)を酢酸ェチル（100 mL)に溶解し、
10%パラジウム炭素（1.00 g)を加えた。 懸濁液を水素雰囲気下、 室温で
12時間激しく攪拌し、その後セライ トを用いてパラジウム炭素をろ別除 去した。ろ液を減圧下濃縮後、直ちにカルボン酸 6 (3.92 g、 16.3 mmol), EDCI (6.25 32.6 mmol), DMAP (3.98 g, 32.6 mmol)を加え、 ァ ルゴン雰囲気下 DMF (lOO mL)に溶解し室温で 3時間攪拌した。 反応溶 液を約三分の一まで減圧下濃縮し、酢酸ェチル (200 mL)、メタノール (20 mL)の混合溶媒で希釈した。 有機層を 10%塩酸 (100 mLX3)、 飽和炭酸 水素ナトリ ゥム水溶液（100 mLx3)、 飽和塩化ナトリ ゥム水溶液（100 mL)により洗浄し、 無水硫酸マグネシウムにより乾燥した。 無水硫酸マ グネシゥムをろ別除去し、 有機層を減圧下濃縮することで、 化合物 7を 6.07 g (99%)得た。
iH-NMR (DMSO-i/e)： δ 9.85 (s, IH, -CONH"), 9.09 (s, IH, Boc-NH), 7.45 (d， 1H， J= 1.86 Hz, Py-H), 6.90 (d, IH, J= 1.90 Hz, PyH), 6.89 (s, IH, Py-H), 6.84 (s, IH, PyH), 3.83 (s, 3H, PyCHs), 3.81 (s, 3H, PyCHs), 3.73 (s， 3H, -OCH3), 1.45 (s， 9H, CHs- of Boc group)
13C-NMR (DMSO-i/e)： δ 160.80, 158.42, 152.85, 122.98, 122.60, 122.42, 120.72 118.49, 117.15, 108.37,103.82, 78.30, 50.90, 36.13, 36.13, 36.01, 28.19
[前工程 6 ] メチル _4一 [( 4一 {[ 4一 （ er -プチルォキシカルボ ニル） ァミ ノ メチルビロール一 2 _ィル] _カルボ二 ノレ }了ミノ ーメチルピロール一 2—ィノレ） カノレボニノレ] ア ミ ノ ー 1ーメチノレピロ一ノレ _ 2—力ノレボン酸エステノレ
( 8 ) の合成 ；
Figure imgf000022_0001
化合物 7 (3.00 g、 7.97 mmol)をアルゴン雰囲気下酢酸ェチル（20 mL) に溶解し、 0 °Cに冷却した。 メタノール（4.1 mL、 100 mmol)を加え、 続いて塩化ァセチル（5.7 mL、 80 mmol)を発熱に注意しながら滴下した。 0 °Cで 30 分間攪拌後、 減圧下濃縮することで溶媒および反応試薬を除 去した。残渣にカルボン酸 6 (2.11 g、 8.77 mmol), EDCI (3.06 gN 15.94 mmol) 、 DMAP (2.92 g、 23.91 mmol)を加え、 アルゴン雰囲気下 DMF (50 mL)に溶解し、 室温で 3 時間攪拌した。 反応溶液を約三分の一まで減圧 下濃縮し、 酢酸ェチル（200 mL) , メタノール（20 mL)の混合溶媒で希釈 した。 有機層を 1 0 %塩酸（100 mLX3) 、 飽和炭酸水素ナトリ ウム水溶 液（100 mLX3) 、 飽和塩化ナトリ ウム水溶液（100 mL)により洗浄し、 無 水硫酸マグネシゥムにより乾燥した。 無水硫酸マグネシゥムをろ別除去 し、 有機層を減圧下濃縮することで、 化合物 8を 3.90 g (98%)得た。 Ή-NMR (DMS0 - 6) ： δ (s, IH, -C0NH-), 9.87 (s, IH, -C0NH-) , 9.08 (s, IH, Boc-NH) , 7.47 (d, IH, J =1.85 Hz, Py-H), 7.22 (d, IH, J=l.61 Hz, Py-H) , 7.08 (d, IH, J =1.59Hz, Py-H), 6.92
(d, IH, J=l.93Hz, Py-H) , 6.90 (s, IH, Py-H) , 6.85 (s, 1H， Py-H), 3.85 (s, 3HPy-CH3), 3. 84 (s, 3H, Py-C^) , 3.82 (s, 3H, Py-CH3) , 3.74 (s, 3H, -0CH3) , 1.46 (s, 9H, C^— of Boc group)
13C - NMR(DMS0 - 6)： δ
160.81， 158.52, 158.44, 152.88, 123.01, 122.83, 122.52, 122.34, 20.74,
118.52, 117.08, 108.38, 104.83, 103.85, 78.29, 50.91, 36.15, 36.04, 28.20
[前工程 7] 3，， 5， 一ジー C>—ァセチルー 2—フルオロー Ο6— [ 2
一 （4一二トロフエ二ノレ） ェチノレ] - 2 ' ージォキシグァ ノシン （2 3) の合成 ；
[前工程 7— 1 ] 3，， 5， ージー（ ーァセチル一 2， ージォキシグアノ シン （2 1 ) の合成
Figure imgf000023_0001
2' —デォキシグアノシン（8.02 g， 30 mmol)をピリジンで 3回共沸 脱水し、 アルゴン雰囲気下で DMF(24 mL)に溶解した。 続いて 4-ジメチ ルァミノ ピリ ジン（0.37 g， 3.0 mmol) , ピリ ジン（24 mL) 、 無水酢酸 (22.1 mL ， 240 mmol)を加えて、 室温で 3時間攪拌した。 その後、 反応 溶液に水（10 mL)を加えて反応を止め、 エタノール（200 mL)を加えて 30 分間攪拌した後、 室温で放置した。 生じた結晶を吸引ろ過し、 結晶をェ タノール（10 mLX3)で洗浄し、 さらに 2 -プロパノール（100 mL)で洗浄し た後減圧下乾燥し、 化合物 21を 8.92 g (85%)得た。
-画 R(DMS0 - 6) ： δ 1.87 and2.03(2s, 6H, CH3C0X2), 2.45(ddd, IH, J,. ,2- . = 6.0 z,J2. >2. - = 2.3 Hz,J2.. ,3. =4.0Hz,H-2 ")， 2.91 (m, 1H， H— 2' ),
4.17-4.29 (m, 3H, H-4' , 5' ,5" ),5.29 (m，lH，H_3' ),
6.13 (dd, 1H， J,. ,2. =8.6Hz, J. ,2. . =6.0 Hz, Η- ),6.52(brs, 2H, N2-^) 7.90 (s, IH, H-8) , 10.74 (br s, IH, N'-H) .
[前工程 7— 2]
Figure imgf000024_0001
ト口フエニル） ェチル] 一 2， 一ジォキシグァノシン （ 2 2 ) の合成」
Figure imgf000024_0002
化合物 21(1.75 g， 5.0 mmol)を 1， 4-ジォキサンにより 3回共沸脱水 し、 ト リ フエニルホスフィン（2.62 g， 10.0 mmol)、 2— (4-ニ トロフエ- ル）エタノール（1.67 g， 10.0 mmol)を加え、 アルゴン雰囲気下で 1， 4 -ジ ォキサン（50mL) に溶解し、 室温で 15分間攪拌した. その後、 反応溶液 にァゾジカルボン酸ジフエニルエステル 40%トルエン溶液（4.5 mL， 10.0 賺 ol)を滴下し、 室温で 30分間攪拌した。 反応溶液を減圧濃縮した後、 酢酸ェチル（50 mL)を加え、 飽和炭酸水素ナトリウム（50 mL)で 2回、 さ らに水（50 mL), 飽和食塩水（50 mL)で 1回ずつ洗浄し、 有機層を無水硫 酸マグネシウムで乾燥後ろ別除去し、 ろ液を減圧下濃縮した。 残渣をシ リカゲル力ラムクロマトグラフィー （クロ口ホルム ：酢酸ェチル =1： 3) で精製し、 化合物 22を 2.30 g (92%)得た。
'H-NMR (CDC13) ： δ 2.08 and 2.13 (2s, 6H, CH3C0X2), 2.52(ddd, IH, Jv 2, , = 6.1 Hz, J ,2' ■ = 14.1 Hz, J ' ,3. = 2.5 Hz, H— 2' ' ), 2.98(ddd, IH, J ,2. = 7.8 Hz, J2, ,2. . = 14.1 Hz, J ,3· =4.9 Hz, H— 2' ), 3.27 (t, 2H, J= 6.8 Hz, CH2CH2Ph 02) , 4.31~4.47 (m， 3H, H— 4' ，5' ,5' ' ),4.73 (t, 2H， J= 6.8 Hz,
Figure imgf000024_0003
7.8 Hz, J- ,2. . = 6.1 Hz, H - ), 7.48 (d， 2H, J = 8.6 Hz, Ph -旦 of 2- (4-nitrophenyl) ethyl group) , 7.74 (s, IH, H - 8)， 8.16 (d, 2H, J= 8.6 Hz, Ph-H of 2- (4-nitrophenyl) ethyl group) .
[前工程 7— 3 ] 3 ', 5 ' ージ一り一ァセチルー 2—フルオロー（ 5—
一 [ 2— —（ 4一二トロフエニル） ェチル] 一 2 ' —ジォキシグァ ノシン （ 2 3 ) の合成
Figure imgf000025_0001
化合物 22(0.50 g, 1.00 mmol)をピリジンにより 3回共沸脱水し、 - 30°Cにおいて 45% フッ化水素 Zピリジン溶液（4.8 mL)を加え、 アルゴン 雰囲気下で亜硝酸 -ブチル（0.36 mL， 3.00 mmol)を加え、 室温に戻した 後 30分攪拌した。 その後、 飽和炭酸水素ナトリ ウム水溶液（15 mL)で中 和し、 クロ口ホルム（30 mL)で 3回抽出した後、 水（50 mL)で 2回洗浄し た。 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ別除去し、 ろ液を減圧下 濃縮した . 残渣をシリカゲル力ラムクロマ トグラフィー （クロ口ホル ム ： 酢酸ェチル =1 ： 3) で精製し、 化合物 23を 0.44 g (87%)得た。 Ή-NMR (CDC13) ： δ 2.08 and 2.11 (2s, 6H, CH3C0X2), 2.60 (ddd, 1H, J. 2', = 5.9 Hz, J2. ,2" = 14.1 Hz, J2",3' = 2.5 Hz, H - 2" ), 2.87 (ddd, 1H, Jv ,2. = 7.9 Hz, J2，，2.' = 14.2 Hz, J2, ,3. = 6.4 Hz, H— 2' ), 3.30 (t, 2H, J= 6.7 Hz, (¾CH2PhN02) , 4.30-4.39 (m， 3H, H- 4' , 5' ，5" ), 4.82 (t, 2H, J= 6.7 Hz, CH2CH2PhN02) 5.39 (m, 1H, H— 3' ), 6.35 (dd， 1H， J ,2, = 7.9 Hz, Jv ,2.' = 5.9 Hz, H-l' ), 7.48 (d, 2H, J= 8.7 Hz, Ph-H of 2- (4-nitrophenyl) ethyl group), 8.06 (s, 1H, H-8), 8.15 (d, 2H, J = 8.7 Hz, Ph-H of 2- (4-nitrophenyl) ethyl group) .
[前工程 8 ] 9—フルォレニルメチル _ 3—ァミノプロピル一 1—カル
Figure imgf000025_0002
25 o
ィ匕合物 25(3.80 g， 12.0 mmol)をメタノール（50 mL)に懸濁させた。 直ちに 1， 3-ジァミノプロパン（1.00 mL, 12.0 mmol)を加え、 室温で 4時 間攪拌した。 やや透明になった反応溶液に、 ピリ ジン塩酸塩（3.00 g， 26. Ommol)を加え、 10分間攪拌した後、 減圧下濃縮した。 残渣をシリカ ゲルカラムク口マ トグラフィ一の展開溶媒（ク口口ホルム ： メタノール =4： 1)に懸濁し、 シリ力ゲルを短く積んだカラムクロマ トグラフィー (クロ口ホルム：メタノール =4: 1)にて精製し、化合物 26を 3.25 g (82%) 得た。 ジァミンの片方を保護基で保護することは通常困難なことである 力 上記化合物によりこの目的を達成し得た。
JH-NMR (DMS0 - 6) ： δ 7.79 (d, 2H, J= 7.52 Hz, .Fmoc-H), 7.63 (d, 2H, J= 7.39 Hz, Fmoc-H), 7.39 (t, 2H, J= 7.38 Hz Ph— H) , 7.31 (t, 2H, ゾ= 7.45 Hz Ph— H) , 4.40 (d, 2H， J = 6.61 Hz, Fmoc-H), 4.20 (t, 1H, J= 6.44 Hz, Fmoc-H) , 3.20 (d, 2H, J = 6.44 Hz, CP^NH) , 2.91 (t, 2H， J = 7.34 Hz, NHCH2), 1.82. (tt, 2H, J = 7.11 Hz, J = 6.83 Hz, — CH^i^— )
13C-NMR (DMS0- 6) ： δ 159.49, 145.41, 142.80， 128.94, 128.27， 126.21， 121.10, 67.83, 48.64, 38.42, 29.32
H ESIMS m/z ： 297. 1615 (Calcd for C18H2102N2： 297.1603)
Anal. Calcd for C18H20N202C1 + H20 ： C, 61.62； H, 6.61; N， 7.98
Found. C, 61.29; H, 6.83; N, 7.27
m. p.： 129-130 °C
[工程 1 ] 1ーメチルビロール一 2—力ルボン酸 （3 2) の合成 _
Figure imgf000026_0001
前記前工程 1で合成した化合物 3(5.00 g， 22.0 mmol)をメタノール (50 mL)に溶解し、 2.0 M 水酸化ナトリ ゥム水溶液（50 mL)を加えた。 反 応溶液を 60 °Cに加温し、 1時間攪拌した。減圧下メタノ一ルを除去し、 残った溶液を水（50 mL)で希釈し、 エーテル（50 mL)で洗浄した。 水層を 10%塩酸により pH 3程度に調整し、 酢酸ェチル（100 mLX3)により抽出 した。 有機層をひとつにまとめ、 飽和塩化ナトリ ウム水溶液（150 mL)で 洗浄後、 無水硫酸マグネシウムにより乾燥し、 無水硫酸マグネシウムを ろ別除去した。 ろ液を減圧濃縮し、 残渣を減圧下乾燥することで、 化合 物 32を 2.45 g (89%)得た。
Ή-NMR (DMS( 6) ： δ 12.23 (br. 1H, -C00H), 6.99 (d, 1H, J : 1.94 Hz, Py - H) , 6.80 (d, 1H, J= 1.80 Hz, Py-H) , 6.04 (d, 1H, J= 2.58 Hz, Py-H) , 3.84 (s, 3H,
Py-CH3) ,
13C- NMR (DMSO-4) : δ 162.14, 129.82, 122.67, 117.37， 107.42， 36.34 FAB-MS m/z 125.1
Anal. Calcd for C6H7N,02: C， 57.59; H, 5.64； N, 11.19
Found. C.57.59； H, 5.64； N, 11.06
m. p.： 127-130 °C
[工程 2] メチル 1—メチルー 4 _ {[4一 （{ 4— [( 1 —メチルビ ロール一 2—ィル） カルボニル] アミ ノー 1ーメチルピロール 一 2—ィル } カルボニル） アミノー 1—メチルピロ一ルー 2— ィル] カノレポ二ノレ } アミノ ビローノレ一 2—力ノレボン酸エステル (3 3) の合成；
Figure imgf000027_0001
前工程 6で合成した化合物 8(100 mg, 0.20 mmol)をアルゴン雰囲気 下メタノール（5.0 mL)に溶解し、 0°Cに冷却した。 続いて塩化ァセチル (1.7 mL, 23.9 mmol)を発熱に注意しながら滴下し、 0°Cで 30分攪拌後、 減圧下濃縮することで溶媒および反応試薬を除去した。 残渣に前記化合 物 32 (27.7 mg, 0.22 mmol)、 EDCI (84.5 mg, 0.44 mmol)、 D AP (53.4 mg, 0.44 mmol)を加え、 アルゴン雰囲気下 DMF (2.0 mL)に溶解し 80 °C で 1時間攪拌した。 反応溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラム クロマ トグラフィー（ク ロ口ホルム ： メタノール =19： 1)によって精製 し、 化合物 33を 71.4 mg (73%)得た。
Ή-NMR (DMS( 6) ： 69.96 (s, 1H, Py-NH) , 9.95 (s, 1H, Py-NH) , 9.85 (s, 1H, Py-NH) , 7.48 (d, 1H, J = 1.89 Hz, Py-H) , 7.25 (d, 1H, J = 1.74 Hz, Py-H), 7.24 (d, 1H, J= 1.73 Hz, Py-H), 7.07 (d, 1H, J= 1.77 Hz, Py-H), 7.05 (d, 1H, J : 1.76 Hz, Py-H), 6.95 (d, 1H, J = 1.89 Hz, Py— H) , 6.93 (d, 1H, J = 1.66 Hz, Py-H) , 6.91 (d, 1H, J = 1.66 Hz, Py-H), 6.06 (d, 1H， J = 2.58 Hz, Py-H), 3.88 (s, 3H, Py-CH3) , 3.86 (s， 3H, Py-CH3), 3.85 (s， 3H, Py_CH3) , 3.84 (s， 3H, Py-CH3) , 3.74 (s， 3H, 0— CH3)
13C - NMR (DMS0-i/6) ： δ 160.82, 158.61, 158.50, 128.16, 125.45， 122.99, 122.73,
122.49, 122.32, 122.11, 120.76, 118.57, 118.48, 112.67, 108.34, 106.66,
104.77, 104.69, 50.97, 36.27, 36.20, 36.14
HRESIMS m/z :506.2156 (Calcd for C25H28N705 :506.2152)
Anal Calcd for C26H27N705: C, 59.40； H, 5.38； N, 19.40
Found. C， 59.22； H, 5.45； N, 19.38
m. .： 229-231 °C
[工程 3 ] 1 —メチルー 4— {[4一 （{ 4一 メチルピロ一ルー
2—ィル） カルボニル] アミ ノー 1一メチルピロ一ルー 2—ィ ル} カルボ-ル) アミノ一 1 —メチルピロール一 2—ィル] 力
Figure imgf000028_0001
化合物 33(127 mg, 0.25 mmol)をメタノール（2.0 mL)に溶解し、 2.0 M 水酸化ナトリゥム水溶液（2 mL)を加えた。反応溶液を 60 °Cに加温し、 2 時間攪拌した。 減圧下メタノールを除去し、 残った溶液を水（5 mL)で 希釈し、 エーテル（3 mL)で洗浄した。 水層を 10%塩酸により pH 3程度 に調整し、 酢酸ェチル（10 mLX3)により抽出した。 有機層をひとつにま とめ、 飽和塩化ナトリゥム水溶液（15 mL)で洗浄後、 無水硫酸マグネシ ゥムにより乾燥し、 無水硫酸マグネシウムをろ別除去した。 ろ液を減圧 濃縮し、 残渣を減圧下乾燥することで、 化合物 34 を 123 mg (quant. ) 得た。 Ή-NMR (DMS0- ) ： δ 12.13 (br， 1H, C00H) , 9.93 (s, 1H， Py-NH) , 9.89 (s, 1H, Py-NH) , 9.82 (s, 1H, Py-NH) , 7.43 (d, 1H， ] : 1.91 Hz, Py-H) , 7.24 (d， 2H, J = 2.10 Hz, Py-H), 7.07 (d, 1H， J : 1.83 Hz, Py-H), 7.04 (d, 1H, J = 1.84 Hz, Py-H), 6.95 (d, 1H, J= 1.81 Hz, Py-H), 6.92 (d, 1H, J = 1.73 Hz, Py-H), 6.85 (d, 1H， J= 1.94 Hz, Py-H), 6.06 (d, 1H， J = 2.55 Hz, Py-H), 6.06 (d, 1H, J= 2.58 Hz, Py-H), 3.88 (s, 3H, Py-CH3) , 3.86 (s， 3H, Py— CH3), 3.85 (s, 3H， Py-CH3), 3.83 (s, 3H, Py-CH3) ,
13C-NMR (DMSO - 6) ： δ 161.94, 158.59, 158.47, 158.43, 128.09, 125.45, 122.75, 122.68, 122.58, 122.26, 122.08, 120.24, 117.50, 118.45, 112.63, 108.38, 106.62, 104.69， 36.20, 36.08
腿 SIMS m/z ：492.1989 (Calcd for C24H26N705 ： 492.1995)
Anal Calcd for C24H25N705 + MeOH ： C, 57.35； H, 5.58； N, 18.73
Found. C, 56.95； H, 5.64； N, 18.56
m. p.： 180-182 °C
[工程 4] 9一フルォロ レンニルメチル 3 [(4— {[4— ({ 4— [( 1
—メチルピロール一 2 _ィル) _カルボニル] ァミノ一 1—メチ ルピロール _ 2—ィル } 力ルポニル） 一メチノレピ口
'ルー 2—ィル] カルボ二ル} アミ ノー 1—メチノレビロール 2
—ィル） カルボ-ル] ァミ ノ ピロピル' ート （ 3
5 ) の合成；
Figure imgf000029_0001
化合物 34(1.00 g, 2.04 ramol)と前記前工程 8で合成した化合物 26 (0.74 g, 2.24 mmol)を、 ジシクロへキシルカルボジイ ミ ド（0.63 g， 3.06 mmol)および 1-ヒ ドロキシベンズト リ ァゾール（0.41 g, 3.06 mmol)と共 にアルゴン雰囲気下 DMF (10 mL)に溶解し、 ジイソプロピルェチルアミ ン（0.39 mL， 2.24 mmol)を加えた後、 室温で 12時間攪拌した。 その後、 反応溶液を酢酸ェチル（200 raL)で希釈し、 10%塩酸（50 mLX3)、 飽和炭 酸水素ナトリゥム水溶液（50 mLX3)、 および飽和塩化ナトリゥム水溶液 (50 mL)で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムによって乾燥させた。 無水硫 酸マグネシウムをろ別除去し、 ろ液を減圧下濃縮後、 残渣をシリカゲル カラムクロマ トグラフィ一（クロ口ホルム ： メタノール = 19 : 1)によつ て精製することで化合物 35を 1.35 g (86%)得た。
Ή-NMR (DMS0 - ） ： δ 9.93 (s， 1H, Py-NH) , 9.89 (s, 1H， Py-NH) , 9.82 (s, 1H, Py-NH) , 8.31 (t, 1H, J= 5.55 Hz, Boc-NH), 7.90 (d, 2H, J= 7.48 Hz, Fmoc - H), 7.70 (d, 2H, J = 7.31 Hz, Fmoc— H)， 7.41 (t, 2H， J = 7.37 Hz, Fmoc-H) , 7.33 (t, 2H, J= 7.42 Hz, Fmoc-H), 7.28 (t, 1H, J= 5.67 Hz, Py-CONH) , 7.25 (d, 2H, J= 1.65 Hz, Py-H), 7.19 (d, 1H, J= 1.17 Hz, Py - H), 7.06 (d, 2H, Py— H)， 6.95 (d, 1H, J = 1.79 Hz, Py-H), 6.93 (d， 1H, J= 1.64 Hz, Py-H), 6.88 (d, 1H, J= 1.32 Hz, Py-H), 6.06 (d, 1H, J= 2.57 Hz, Py-H) 4.32 (d, 2H, J= 6.84 Hz, Fmoc- CH2), 4.22 (t, 1H, J= 6.64 Hz, Fmoc-CH), 3.89 (s， 3H, Py-CH3) , 3.86 (s, 3H, Py-CH3) , 3.85 (s, 3H, Py-CH3) , 3.80 (s, 3H, Py - CH3) , 3.17 (dt, 2H， J= 8.15 Hz, J= 5.27 Hz, -NHCH2-) , 3.02 (dt, 2H, J= 6.44 Hz, J= 6.28 Hz), 1.62 (tt, 2H, J : 6.68 Hz, -CH2CH2CH2-)
13C-NMR (DMS0 - 6) ： δ 161.27, 158.50, 158.46, 156.12, 143.93, 140.74, 128.11, 127.58, 128.04, 125.47, 125.11， 122.91, 122.79, 122.19, 122.16, 122.09, 120.10, 118.43， 117.80， 112.64， 106.64, 104, 71, 104.13, 65.21, 48.59, 46.78, 38.05, 36.21, 36.07.35.99, 29.66
HRESIMS m/z :770.3400 (Calcd for C42H44N906 :770.3415)
Anal Calcd for C42H43N906 + MeOH ： C, 62.99； H, 6.02； N, 15.37
Found. C, 62.92； H， 5.79; N， 15.19
[工程 5]
3，， 5 ' —ジ— O—ァセチルー V2— { 3 - [(4— {[4 - ({ 4 - [( 1 ーメチルピロ一ル一 2—ィル) 一力ルポニル] アミノー
1ーメチルビロール一 2—ィル } カルボニル） ァミノ一 1—メチ ノレピ P—ル一 2一ィノレ] カルボ二ノレ } ァミノ一 1一メチノレピロ一 ルー 2—ィル） 一カルボニル] ァミノプロピル } - Q6- [ 2— (4一二トロフエ-ル） ェチル _ 2， _ーデォキシグアノシン （3_
6) の合成
Figure imgf000031_0001
化合物 35(1.00 g， 1.30 mmol)と前記前工程 7— 3で合成した化合 物 23 (0.69 g， 1.36 mmol)をアルゴン雰囲気下 DMF (5.0 mL)に溶解し た.続いて、 トリェチルァミン（1. OmL)を加え 60 でで 12時間攪拌した。 反応溶液を減圧下濃縮後、 残渣をシリカゲルカラムク口マトグラフィー (クロ口ホルム ： メタノール =29： 1)によって精製することで化合物 36 を 1.07 g (79%)得た。
Ή-NMR (DMS0— 6) ： δ 9.93(s, 1H, Py-NH) , 9.88 (s， 1H, Py-NH) , 9.82 (s, 1H, Py-NH) , 8.18 (d, 2H, J = 8.50 Hz, NPE-H) , 8.03 (s, 1H, H— 8) , 8.02 (t, 1H, J = 5.42 Hz, -CH2NH-) , 7.60 (d, 2H, J = 8.05 Hz, NPE-H) , 7.24 (d, 2H, J = 1.69 Hz, Py-H) , 7.17 (d, 1H, J = 1.59 Hz, Py— H) , 7.06 (s, 1H, Py-H) , 7.05 (s, 1H, Py-H) , 7.03 (t, 1H, J= 5.9 Hz, N2-H) , 6.95-6.92 (m, 3H, Py-H) , 6.25 (t, 1H, J= 6.78, Η— ), 6.07 (dd， 1H, J= 2.65 Hz, J= 3.86 Hz, Py-H) , 5.43 (m， 1H, H - 3' ), 4.69 (t, 2H, J= 6.59 Hz, NPE-H) , 4.31 (t， 1H, J= 7.59 Hz, H-4' ), 4.22 (m, 2H, H - 5' ), 3.89 (s, 3H, Py-CH3) , 3.86 (s, 3H, Py-CH3) , 3.85 (s, 3H, Py-CH3) , 3.80 (s, 3H, Py - CH3)， 3.37 (m, 2H, (¾ΝΗ -）， 3.27 (m, 4H, -C0CH2) NPE-CH2) , 3.18 (m, 1H, H_2' ), 2.46 (m, 1H, H- 2' ' ), 2.08 (s, 3H, OAc), 1.99 (s, 3H, OAc), 1.77 (tt, 2H, J = 6.75 Hz, -CH2CH2CH2)
13C- NMR (DMS0- 6) ： δ 170.01, 161.33, 160.01, 158.72, 158.60, 158.50, 157.86, 146.72， 146.24, 130.22, 128.10, 125.47, 123.39, 122.96, 122.79, 122.20, 122.09, 118.43, 117.75, 112.64, 106.63, 104.71, 104.16, 81.37, 74.24, 65.42, 63.65， 36.21, 36.07, 35.91, 34.33, 20.78, 20.48
HRESIMS m/z :1031.4148 (Calcd for C49H55NH0I2 ： 1031.4124)
[工程 6]
3，， 5， 一ジー < —ァセチルー V2— { 3 - [(4一 {[4 - ({ 4 一 [( 1—一メチルピロ一ルー 2—ィノレ） —一カルボニル] アミノー ] 一メチノレピ F一ノレ— 2—イノレ} カルボ二ノレ） アミ ノー 1ーメチ ルビロール一 2—ィノレ] カルボ二ル } アミ ノー 1—メチルピロ一 ルー 2 _ィル） カルボニル] ァミ ノプロピル } - 2 ' —デォキシ
Figure imgf000032_0001
化合物 36(22,8 rag, 22 · mol)を、 アルゴン雰囲気下 0.5 M DBU/ ピリジン溶液（1.0 mL)に溶解した。 室温で 12 時間攪拌した後、 塩化ァ ンモニゥム（50.0 mg， 0.94 mmol)で反応を止めた。 反応溶液を減圧下濃 縮し、 残渣をシリ力ゲル力ラムクロマ トグラフィー（ク ロ口ホルム ： メ タノール =4： 1)によって精製し、 化合物 37を 15.6 mg (80%)得た。 Ή-NMR (DMS0 - ） ： δ 10.67 (br， 1H，H— 1), 9.93 (s, 1H, Py-NH) , 9.88 (s, 1H, Py-NH) , 9.82 (s, 1H, Py-NH) , 8.05 (t， 1H, J= 5.61 Hz, Py-CONH) , 7.87 (s, 1H, H-8), 7.24 (d, 1H, J= 1.52 Hz, Py-H) , 7.18 (d, 1H， J= 1.62 Hz, Py-H) , 7.05 (d, 1H, J = 1.58, Py-H) , 6.95—6.90 (m, 3H, Py-H) , 6.53 (br， 1H, N2 - H) , 6.17 (d, 1H, J= 7.00 Hz, H - ), 6.06 (dd, 1H, J= 2.61 Hz, J= 3.88 Hz , H ), 5.41 (m, 1H, H-3' )， 4.30 (m, 1H, H— 4' ), 4, 18 (m, 2H, H_5， ), 3.89 (s, 3H, Py-CH3) , 3.86 (s， 3H， Py-CH3) , 3.85 (s, 3H, Py-CH3) , 3.81 (s, 3H, Py-CH3) 3.36 (m, 2H， — CJ^NH-), 3.25 (m， 4H, — C0CH2， ), 3.06 (m, 1H, H-2' ), 2.47 (m, 1H, H-2' ' ), 2.08 (s, 3H, OAc), 1.75 (s, 3H, OAc)
13C-NMR (DMS0-i6)： δ 170.12, 170.01, 161.43, 158.61, 158.50, 158.46, 156.73, 152.58, 150.45, 136.25， 128.10， 125.46， 122.89, 122.78, 122.18, 146.72, 146.24, 130.22， 128.10, 125.47, 123.39, 122.96, 122.79, 122.20, 122.09, 118.42, 117.28, 112.63， 106.64, 104.72, 104.22, 83.28, 81.33, 79.16， 74.12, 63.67, 38.18, 36.21, 36.07， 35.90, 35.05, 29.18, 20.76, 20.47
HRESIMS m/z :882.3661 (Calcd for C"H48N13010 :881.89) [工程 7]
{「4 _— ({ 4— [( 1一メチルピロ一ルー 2 一ィル） —カルボ.ニル] アミ ノー 1—メチルピロール一 2—ィル } 力ノレボニ レ） アミノー 1ーメチルピロール一 2—ィル] カルボ二 ル} アミ ノー 1—メチルピロ一ノレ一 2—ィノレ) カルボ二 ：ル] アミ ノプロピル 一 2 ' デォキシグアノシン ( 3 8 ) の合成；
Figure imgf000033_0001
化合物 37(60.0 mg， 76 · niol)をアルゴン雰囲気下ピリジン（0.2 mL) に溶解した。 続いて 0.0M ナトリウムメ トキシド /メタノール溶液（0.8 mL)を加え、 室温で 2時間攪拌した。 Dowex_50(H+ form)を用いて反応溶 液を pH 6 とし、 樹脂をろ別除去した。 ろ液を減圧下濃縮後、 残渣にメ タノールを加え再結晶を行った。 生じた結晶を吸引ろ過により採取し、 化合物 38を 51.6 mg (97%)得た。
W - NMR (DMS0— 6) ： δ 10.56 (br, 1H, H—l), 9.93 (s, 1H, Py-NH) , 9.89 (s， 1H, Py-NH) , 9.84 (s， 1H, Py-NH) , 8.08 (s, 1H， H_8)， 7.90 (t, 1H, J = 5.49 Hz, -CH2NH-) , 7.24 (d, 1H, J = 1.66 Hz, Py-H) , 7.20 (m, 2H, Py-H) , 7.05 (d, 1H, J= 1.65 Hz, Py-H), 6.95-6.89 (m, 3H, Py-H) , 6.52 (br, 1H, N2 - H) , 6.15 (t, 1H， J= 6.67, Η-Γ ), 6.06 (d, 1H, J : 1.65 Hz, Py-H) 5.27 (br, 1H, 5' -OH), 4.86(t, 1H, J= 5.4 Hz, H-3' ), 4.36 (br, 1H, 3' -OH), 3.88 (s, 3H, Py-CH3) , 3.86 (s, 3H, Py-CH3' ), 3.85 (s, 3H, Py-CH3' ), 3.82 (s, 3H, Py-CH3' ), 3.81 (m, 1H， H— 4' ), 3.55 (m, 1H, H - 5' ), 3.51 (m， HI, H - 5' ' ), 3.32 (dt， 2H, J= 5.47, J= 6.49, -CH2NH-) , 3.25 (m, 2H, -CH2NH) , 2.60 (m, 1H, H~2' ), 2.21 (m, 1H, H-2' ' ), 1.75 (m, 2H, -CHgCHsCHj-)
13C-删 R (DMSO - 6) ： δ 161. 4, 158.60, 158.46, 156.75, 152.54, 150.50, 135.75, 128.11, 125.45, 122.75, 122.08, 118.42, 117.84, 116.87, 112.63, 106.64, 104.71, 104.24, 87.57, 82.76， 70.86, 61.83, 38. 18, 36.21， 36.07， 35.92, 29. 18 HRESIMS m/z :798.3445 (Calcd for C37H„N1308 ： 798.3436)
Anal. Calcd for C37H43N1308 + 3H20 + MeOH: C, 51.64； H, 6.04； N, 20.60 Found. C, 51.85； H, 5.88;N, 20.48 本発明者らは、 上記のとおり、 新規遺伝情報制御分子としての有用 性が期待される MGB ポリアミ ドーヌクレオシド ハイプリ ッ ド化合物を 合成した。 産業上の利用可能性
本発明のピロールァミ ドー 2， —デォキシグアノシンハイブリ ッ ド 化合物 38 は、 生合成により ssDNA に組み込まれた際にピロ一ルポリア ミ ドが特異的に認識するサイ トを有する ssDNAに対して安定な二重結合 を形成する。 また、 極めて高い塩基配列選択能を有する。 このように、 本発明の MGB ポリアミ ドーヌクレオシド ハイブリ ッ ド化合物は高い塩 基配列選択能を有する新規遺伝情報制御分子であり、 アンチセンス ドラ ッグへの効果的な応用が期待できる。

Claims

請求の範囲
1. ピロールアミ ド 4量体を含むことを特徴とする下記一般式 （ 3 8) 式で示される 2 ' ーデォキシグアノシンハイブリッ ド化合物。
Figure imgf000035_0001
2. ピロールアミ ド 4量体を含むことを特徴とする下記一般式 （3 7) 式で示される水酸基が保護された 2 ' —デォキシグアノシンハイプリ ッド化合物。
Figure imgf000035_0002
(ここで、 R 1及び R2は、 それぞれ同一又は異なった水酸基保護基を 意味する。） '
3. ピロールアミ ド 4量体を含むことを特徴とする下記一般式 （3 6 ) 式で示される保護された 2 ' —デォキシグアノシンハイプリッド化合 物。
Figure imgf000036_0001
(ここで、 R 1 2及び1^3は、 それぞれ同一又は異なった水酸基保 護基を意味する。）
· 下記一般式 ( 3 5) で示されるジァミン化合物と下記式 (2 3) で 示される化合物を反応させることを特徴とする上記一般式 （3 6) 式 で示される保護された 2 ' ーデォキシグアノシンハイプリッド化合物. の製造方法。
Figure imgf000036_0002
(ここで、 Fmocは 9一フルォレニルメ トキシカルボ二ル基を意味する。
R R2及び R3は、 前記と同じである。 Hal はハロゲン原子を意 味する。）
5. ピロールアミ ド 4量体を含むことを特徴とする下記一般式 （3 5) で示されるジアミン化合物。
5)
Figure imgf000037_0001
(ここで、 Fmocは前記と同じである。）
6. 下記式 （3 4) で示されるピロールアミ ド 4量体を含むカルボン酸 化合物と下記式 ( 2 6 ) で示されるカルバメート化合物を反応させる ことを特徴とする上記一般式 （ 3 5 ) で示されるジァミン化合物の製 造方法。
Figure imgf000037_0002
7. 上記一般式 （ 3 5 ) で示されるジァミン化合物 （3 5 ) の製造のた めの下記式 （ 2 6 ) で示される力ルバメート化合物。
Figure imgf000037_0003
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