JP2020132604A - 核酸合成用固相担体及びそれを用いた核酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、高収率、高効率及び高選択的な核酸合成に使用できる固相担体、並びにそれを用いた核酸の製造方法を提供する。【解決手段】ポリマーキャリアと、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーと、以下の式Ｉで表される活性化剤と、を含む、核酸合成用固相担体であって、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカー及び活性化剤が、ポリマーキャリアに連結されている、固相担体。【選択図】図１

Description

本発明は、核酸合成用固相担体及びそれを用いた核酸の製造方法に関する。

ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を合成（製造）する方法として、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が汎用されている。

このような固相合成法は、概ね以下の工程によって行われる：
（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液等の酸により、固相担体に連結しているヌクレオシドの５’水酸基の保護基を脱保護する、脱保護工程；
（２）活性化剤（テトラゾール等）の存在下、ヌクレオシドホスホロアミダイトユニットを脱保護したヌクレオシドの５’水酸基へカップリングを行う、カップリング工程；
（３）無水酢酸等により、未反応の５’水酸基をキャップする、キャップ化工程；及び
（４）含水ヨウ素等により、ホスファイトを酸化する、酸化工程。

このように、（１）脱保護工程、（２）カップリング工程、（３）キャップ化工程、及び（４）酸化工程をこの順で繰り返し、３’末端から５’末端方向にオリゴヌクレオチドの伸長反応を進めることによって、目的の配列を持った核酸が合成される。そして最後に、アンモニア水やメチルアミン溶液等により開裂性リンカーを加水分解させ、合成した核酸を固相合成用担体から切り離す（例えば、非特許文献１）。

上記のようなホスホロアミダイト法を用いた固相合成法に関して、これまでに様々な開発がなされていた。

例えば、特許文献１では、活性化剤としてのピリジニウム塩が連結された固相担体が開示されている。この固相担体を用いることで、外部からの過剰の活性化剤の供給を行うことなく、固相担体上でヌクレオシドホスホロアミダイトユニットを活性化し、カップリング効率を向上することができる。

また、上述したホスホロアミダイト法を用いた固相合成法では、通常、塩基部を保護したヌクレオシドホスホロアミダイトユニットが使用される。これに対して、特許文献２、並びに非特許文献２及び３では、塩基部無保護のヌクレオシドホスホロアミダイトユニットを用いた核酸の合成方法（以下、「塩基部無保護法」とも呼ぶ）が開示されている。

この塩基部無保護法は、主に、活性化剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）又はその誘導体と、塩基部無保護のヌクレオシドホスホロアミダイトユニットとを用いることによって、２０量体程度の核酸を高純度で合成することができる。

米国特許第７５７９４５９Ｂ２号明細書 国際公開第２００５／０８２９２３号

Ａｎｄｒｅｉ Ｐ． Ｇｕｚａｅｖ "Ｓｏｌｉｄ‐Ｐｈａｓｅ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ" Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１３） Ｉｓｓｕｅ１ Ｐａｇｅｓ３．１．１〜３．１．６０． Ａ． Ｏｈｋｕｂｏ， Ｋ． Ｓｅｉｏ， Ｍ． Ｓｅｋｉｎｅ， "Ｏ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ Ｎ−ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｍｅｔｈｏｄ．" Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２６， １０８８４−１０８９６ （２００４）． Ａ． Ｏｈｋｕｂｏ， Ｋ， Ｓｅｉｏ， Ｍ． Ｓｅｋｉｎｅ， "Ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｐｔｉｄｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏｗａｒｄ ｐｅｒｆｅｃｔ Ｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｂａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．" Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ４５， ３６３−３６６ （２００４）．

核酸医薬の発展に伴い、核酸の大量合成又は長鎖の核酸の合成の需要が一層高まると予想される。このため、より高収率及び高効率の核酸を合成する技術の開発が必要である。

しかしながら、例えば上述した特許文献１では、固相担体に連結された活性化剤として、吸湿性が高いピリジニウム塩が使用されているため、高収率及び高効率での核酸の大量合成に適用することが困難である。

また、特許文献１に開示されている固相担体に連結された活性化剤としてピリジニウム塩を使用した場合は、当該ピリジニウム塩は、ホスホロアミダイトユニットと反応して活性中間体を形成する。当該活性中間体の反応性が高いため、例えば特許文献２の塩基部無保護法を用いる場合に５’水酸基のみならず塩基部位とも反応してします。したがって、高収率で、かつ高選択的な核酸合成に適用することも困難である。

したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、高収率、高効率及び高選択的な核酸合成に使用できる固相担体、並びにそれを用いた核酸の製造方法を提供することを目的とする。

特に、塩基部無保護法にも適用可能な固相担体、及びそれを用いた核酸の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、以下の手段により、上記課題を解決できることを見出した。
〈態様１〉
ポリマーキャリアと、
ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーと、
以下の式Ｉ：
［式中、
Ｘ^１〜Ｘ^４は、それぞれ独立してＮ又はＣＲであり、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルキル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルコキシ基、ニトロ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいヒドラジノ基である。]
で表される活性化剤と、
を含む、核酸合成用固相担体であって、
前記ヌクレオシド又はユニバーサルリンカー及び前記活性化剤が、前記ポリマーキャリアに連結されている、固相担体。
〈態様２〉
前記活性化剤が、スペーサーを介して前記ポリマーキャリアに連結されている、態様１に記載の固相担体。
〈態様３〉
前記スペーサーが、以下の式ＩＩ：
[式中、Ｌは、不活性な二価の基である。]
で表わされる構造を有する、態様２に記載の固相担体。
〈態様４〉
前記活性化剤が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、１−ヒドロキシ−６−トリフルオロメチルベンゾトリアゾール、及び１−ヒドロキシ−６−ニトロベンゾトリアゾールからなる群より選択される少なくとも一つである、態様１〜３のいずれか一つに記載の固相担体。
〈態様５〉
前記ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーに対する前記活性化剤のモル比率が、０．１〜１０．０である、態様１〜４のいずれか一つに記載の固相担体。
〈態様６〉
前記ヌクレオシドの５’水酸基が、保護されている、態様１〜５のいずれか一つに記載の固相担体。
〈態様７〉
前記ヌクレオシドの塩基部位が、保護されていない、態様１〜６のいずれか一つに記載の固相担体。
〈態様８〉
塩基部無保護法で使用される、態様１〜７のいずれか一つに記載の固相担体。
〈態様９〉
２０量体〜５００量体の核酸合成のために使用される、態様１〜８のいずれか一つに記載の固相担体。
〈態様１０〉
前記ポリマーキャリアは、ガラス系多孔質担体である、態様１〜９のいずれか一つに記載の固相担体。
〈態様１１〉
態様１〜１０のいずれか一つに記載の固相担体を用いて核酸合成反応を行うことを含む、核酸の製造方法。
〈態様１２〉
ホスホロアミダイト法によって行われる、態様１１に記載の方法。
〈態様１３〉
前記式Ｉで表される活性化剤を更に添加する、態様１２に記載の方法。
〈態様１４〉
酸触媒を更に添加する、態様１２又は１３に記載の方法。
〈態様１５〉
前記酸触媒が、ベンズイミダゾールトリフラート（ＢＩＴ）、４−エチルチオテトラゾール、イミダゾリウムトリフラート、及び４，５−ジシアノイミダゾールからなる群より選択される少なくとも一つである、態様１４に記載の方法。
〈態様１６〉
塩基部を保護していないヌクレオシドホスホロアミダイトユニットを使用する、態様１１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
〈態様１７〉
２０量体〜５００量体の核酸を製造する、態様１１〜１６のいずれか一つに記載の方法。

本発明によれば、高収率、高効率及び高選択的な核酸合成に使用できる固相担体、並びにそれを用いた核酸の製造方法を提供することができる。特に、本発明の固相担体を用いて、塩基部無保護法によって高収率、高効率及び高選択的に核酸を製造することができる。

図１は、本発明の固相担体の構成の一形態を示すイメージ図である。 図２は、実施例１及び２、並びに比較例１及び２の逆相ＨＰＬＣチャートを示す図である。 図３は、実施例３及び４、並びに比較例３及び４の陰イオン交換ＨＰＬＣチャートを示す図である。

本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の化合物（オリゴヌクレオチド）を意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡ等が含まれる。核酸は、１本鎖、２本鎖のいずれであってもよいが、核酸合成機による効率的な合成が可能であることから、好ましくは１本鎖である。また、「核酸」には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドも含まれる。

《固相担体》
ポリマーキャリアと、
ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーと、
以下の式Ｉ：
［式中、
Ｘ^１〜Ｘ^４は、それぞれ独立してＮ又はＣＲであり、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルキル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルコキシ基、ニトロ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいヒドラジノ基である。]
で表される活性化剤と、
を含む、核酸合成用固相担体であって、
この際、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカー及び活性化剤が、ポリマーキャリアに連結されている、固相担体である。

図１は、本発明の固相担体の構成の一形態を示すイメージ図である。図１に示されているように、本発明の固相担体は、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーＢと、上記の式Ｉで表される活性化剤ＡとがポリマーキャリアＣに連結されている核酸合成用固相担体である。

本発明の固相担体は、上述した特有の構成を有することで、下記スキーム１に示されているように、ポリマーキャリア上でヌクレオシドホスホロアミダイトユニットを活性化することができる。また、活性化されたヌクレオシドホスホロアミダイトユニットと、ポリマーキャリアに連結されているヌクレオシドとのカップリングの反応性が大きく、ヌクレオシドの塩基部位が保護されていなくても、５’水酸基への選択性が大きい。すなわち、本発明の固相担体は、塩基部無保護法で使用されることができる。

なお、スキーム１において、ヌクレオシドと上記の式Ｉで表される活性化剤としての１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）とが用いられているが、本発明は、これらに限定されない。

また、本発明の固相担体は、カップリングの反応性が大きいため、２量体から従来の固相合成法における合成限界である２０量体程度までの核酸は勿論のこと、３０量体以上、４０量体以上、５０量体以上、６０量体以上、７０量体以上、８０量体以上、９０量体以上、１００量体以上、１５０量体以上、２００量体以上、２５０量体以上、又は３００量体以上の核酸合成のために使用されうる。また、合成する核酸の上限としては、特に限定されず、例えば５００量体以下、４５０量体以下、又は４００量体以下の核酸合成のためにも使用されうる。

以下では、本発明の固相担体の各構成部分について、詳細に説明する。

〈活性化剤〉
本発明において、活性化剤は、以下の式Ｉで表わされる。
［式中、
Ｘ^１〜Ｘ^４は、それぞれ独立してＮ又はＣＲであり、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルキル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルコキシ基、ニトロ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいヒドラジノ基である。]

式Ｉにおいて、Ｘ^１〜Ｘ^４は、それぞれ独立して、Ｎ又はＣＲである。

上記「Ｒ」は、Ｈ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルキル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルコキシ基、ニトロ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいヒドラジノ基である。

ここで、ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等が挙げられる。これらのうち、塩素原子又はフッ素原子が好ましい。例えば、Ｒがメチル基である場合、ＣＲは、トリクロロメチル基又はトリフルオロメチル基であることが好ましく、トリフルオロメチル基であることがより好ましい。

本明細書において、アルキル基としては、直鎖状、分岐状、環状のいずれでもよい。

炭素数１〜１０アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等が挙げられる。これらのうち、炭素数１〜３のアルキル基が好ましく、特に、メチル基又はエチル基が好ましい。また、これらの炭素数１〜１０アルキル基において、その水素原子の一部又は全部がハロゲン原子で置換されていてもよい。

本明細書において、アルコキシ基としては、直鎖状、分岐状、環状のいずれでもよい。

炭素数１〜１０アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペントキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｎ−ヘプチルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ノニルオキシ基、ｎ−デシルオキシ基等が挙げられる。これらのうち、炭素数１〜３のアルコキシ基が好ましく、特に、メトキシ基又はエトキシ基が好ましい。また、これらの炭素数１〜１０アルコキシ基において、その水素原子の一部又は全部がハロゲン原子で置換されていてもよい。

本発明において、上記式Ｉで表わされる活性化剤の具体例としては、特に限定されず、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、１−ヒドロキシ−６−トリフルオロメチルベンゾトリアゾール、及び１−ヒドロキシ−６−ニトロベンゾトリアゾール等からなる群より選択される少なくとも一つが挙げられる。これらのうち、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び１−ヒドロキシ−６−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ベンゾトリアゾールが好ましい。

本発明において、上記式Ｉで表される活性化剤は、共有結合又はスペーサーを介して、ポリマーキャリアに連結されており、好ましくは、スペーサーを介してポリマーキャリアに連結されている。

本発明にかかる活性化剤の、ポリマーキャリア又はスペーサーに連結する部位は、特に限定されず、例えば上記式ＩのＸ^１〜Ｘ^４のいずれかの部位であってよい。

〈スペーサー〉
本発明において、「スペーサー」とは、共有結合を介して、２つの物質を連結する分子である。この場合、スペーサーは、開裂性であることが好ましく、特にアンモニア水やメチルアミン溶液等のアルカリ溶液によって加水分解できるものであることがより好ましい。

本発明にかかるスペーサーは、下記式ＩＩ：
[式中、Ｌは、不活性な二価の基である。]
で表わされる構造を有してよい。

本明細書において、「不活性な二価の基」の「不活性な」とは、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、スルファニル基、スルホ基等の固相合成反応を阻害する官能基を有さないことを示す。

式ＩＩにおいて、Ｌは、好ましくは、主鎖が、炭素原子、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選ばれる原子（例えば１〜２００個、好ましくは、１〜１５０個、より好ましくは、１〜１００個、更に好ましくは１〜５０個、更により好ましくは、１〜１０個、特に好ましくは１〜５個）からなる不活性な二価の基である。

また、Ｌは、より好ましくは、式：−［（ＣＲ^１ _２）_ａ−Ａ−］_ｂ−（ＣＲ^１ _２）_ｃ−（式中、Ａは、結合手、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ_２−、−ＣＯ−、−Ｐｈ−、−ＯＰｈＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−等を表し；Ｒ^１は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチオ基等を表し；ａ及びｃは、それぞれ独立して、１〜１０（好ましくは１〜６）の整数を表し、ｂは、０〜１０（好ましくは０〜３）の整数を表す。）で表される二価の基である。なお、Ｐｈは、１，４−フェニレン、１，３−フェニレン又は１，２−フェニレン等であってよい。

より具体的には、Ｌは、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−、−ＣＨ_２ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＳＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２−、−Ｐｈ−、−ＣＨ_２ＰｈＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＰｈＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＰｈＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＰｈＣＨ_２ＣＨ_２ＰｈＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＯＰｈＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰｈＯＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰｈＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰｈＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰｈＯＣＨ_２ＣＨ_２−等であることが好ましい。

これらのうち、Ｌは、より好ましくは、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、又は−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、特に好ましくは、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−又は−ＣＨ_２ＣＨ_２−である。

なお、本発明において、スペーサーの長さは、特に限定されず、目的とする核酸配列の鎖長に合わせて適宜設定できる。

本発明のポリマーキャリアには、上述した式Ｉで表される活性化剤の他に、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーも連結されている。

〈ヌクレオシド〉
ヌクレオシドは、共有結合又はスペーサーを介して、ポリマーキャリアに連結されている。ここで、スペーサーは、上述した活性化剤とポリマーキャリアとの間に存在しうるスペーサーと同じものであってよい。

本発明において、ポリマーキャリアに連結されているヌクレオシドは、特に限定されず、アデノシン、デオキシアデノシン、グアノシン、デオキシグアノシン、ウリジン、チジミン、シチジン、デオキシシチジン又はこれらを任意の置換基で修飾したものから、目的とする核酸配列に合わせて適宜選択することができる。

ヌクレオシドの、ポリマーキャリア又はスペーサーに連結する部位は、例えば３’末端であることが好ましい。

ポリマーキャリアに連結されているヌクレオシドの５’水酸基は、保護されていてよい。このヌクレオシドの５’水酸基の保護基としては、特に限定されず、例えば酸で脱保護できるトリチル系保護基又はシリル系保護基であってよい。

トリチル系保護基としては、例えば、トリチル基（Ｔｒ基）、モノメトキシトリチル基（例えば、４−メトキシトリチル基（ＭＭＴｒ基））、ジメトキシトリチル基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基））、９−フェニルキサンテン−９−イル基（ピクシル基）等が挙げられ、好ましくは、ＤＭＴｒ基である。

シリル系保護基としては、例えば、任意の置換基（例えば、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、フェニル基等から選ばれる置換基）でトリ置換されたシリル基が挙げられ、具体的には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメチルメトキシシリル基、メチルジメトキシシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられ、好ましくは、トリメチルシリル基である。

これらの保護基は、トリクロロ酢酸又はジクロロ酢酸などのブロンステッド酸のジクロロメタン又はトルエン溶液を用いて脱離することができる。酸による脱保護が容易であることから、ヌクレオシドの５’水酸基の保護基としてＤＭＴｒ基が最も好ましく用いられる。

本発明において、ポリマーキャリアに連結されているヌクレオシドの塩基部位は、保護基で保護されていてもよく、保護されていなくてもよい。本発明の効果をより顕著に発揮できる観点から、ポリマーキャリアに連結されているヌクレオシドの塩基部位は、保護されていないことが好ましい。

〈ユニバーサルリンカー〉
ユニバーサルリンカーは、共有結合又はスペーサーを介して、ポリマーキャリアに連結されている。ここで、スペーサーは、上述した活性化剤とポリマーキャリアとの間に存在しうるスペーサーと同じものであってよい。

本発明において、ユニバーサルリンカーとは、ポリマーキャリアに連結されており、これを起点として、ポリマーキャリアに目的の核酸配列を合成するためのリンカーである。このユニバーサルリンカーを用いることで、目的とする核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又であっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成と同じ工程で反応させて合成を開始し、目的の核酸を合成した後、通常と同様の方法で固相合成用担体から切り出すだけで、上述した固相合成法の（１）脱保護工程のようにヌクレオシドを予めポリマーキャリアに連結される必要がない。

本発明に用いられるユニバーサルリンカーとしては、特に限定されず、特開２０１１−０８８８４３号公報に開示若しくは引用されているユニバーサルリンカー、又は特開２０１６−２０４３１６号公報に開示されているユニバーサルリンカー等であってよい。又は市販品としての、ユニバーサルリンカーがポリマーキャリアに連結されたユニバーサルサポートであってもよい。より具体的には、例えばＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社のオリゴヌクレオチド合成用のユニリンカー（商標名）ユニバーサルサポート、Ｂｉｏｓｅｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のユニバーサル ＳｙｎＢａｓｅ（商標名）及びユニバーサル Ｑ ＳｙｎＢａｓｅ（商標名）、並びにＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のユニバーサルサポートＩ，ＩＩ，およびＩＩＩ等が用いられる。

〈ポリマーキャリア〉
本発明において、ポリマーキャリアは、核酸合成及び精製のために行われる特定の反応使用される溶媒又は試薬に不溶性であるものが好ましい。

ポリマーキャリアとしては、例えば、ガラス系多孔質担体、又はポリスチレン系多孔質担体、アクリルアミド系多孔質担体等の多孔質ポリマー担体等が挙げられ、好ましくは、ガラス系多孔質担体である。

ガラス系多孔質担体とは、ガラスを構成成分として含む多孔質担体をいい、例えば、コントロールド・ポア・ガラス（ＣＰＧ）等が挙げられるが、これには限定されない。

より具体的には、ＣＰＧとしては、長鎖のアミノアルキルスペーサーを有するＣＰＧポリマーキャリア（ＬＣＡＡ−ＣＰＧポリマーキャリア）が好適に用いられ、更には、長鎖ヌクレオチドの合成の場合においては、ＣＰＧの孔が２０〜５００ｎｍ、より好ましくは５０〜２００ｎｍ、更に好ましくは１００ｎｍのものが最も好ましく用いられる。

ポリスチレン系多孔質担体とは、主にスチレン又はその誘導体の構造単位から構成される樹脂からなる多孔質担体であり、中でも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基を有するポリスチレン系多孔質担体が好ましい。

アクリルアミド系多孔質担体とは、主にアクリルアミド又はその誘導体の構造単位から構成される樹脂からなる多孔質担体であり、中でも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基を有するアクリルアミド系多孔質担体が好ましく、ヒドロキシ基を有するアクリルアミド系多孔質担体が好ましい。

本発明において、ポリマーキャリアの形状は、特に限定されず、平板状、粒子状、繊維状等いずれの形状であってよく、好ましくは粒子状である。

ポリマーキャリアとして、市販から入手してよい。例えば、市販のポリマーキャリアとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＨｉｇｈｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｒｅｓｉｎ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＰｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｃｏｌｕｍｎ、及びＢｉｏｓｅｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｑ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ等であってよいが、これらに限定されない。

〈モル比率〉
本発明の固相担体において、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーに対する活性化剤のモル比率（活性化剤：ヌクレオシド又はユニバーサルリンカー）は、特に限定されず、例えば０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、５．０以上、６．０以上、７．０以上、８．０以上、９．０以上、又は１０．０以上であってよく、また２０．０以下、１５．０以下、１０．０以下、９．０以下、８．０以下、７．０以下、６．０以下、５．０以下、４．０以下、３．０以下、２．０以下、又は１．０以下であってよい。

このモル比率は、例えばポリマーキャリアにヌクレオシド又はユニバーサルリンカーを導入して、導入されたヌクレオシド又はユニバーサルリンカーの導入率（ｍｏｌ／ｇ）を決めた後、活性化剤を導入して、導入された活性化剤の導入率（ｍｏｌ／ｇ）を決めて、二つの導入率の比から求めることができる。より具体的には、例えば先に導入されたヌクレオシド又はユニバーサルリンカーの導入率ｂ（ｍｏｌ／ｇ）を分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて測定したＤＭＴｒ基の導入量から算出する。次に、活性化剤が１００％で導入されるように過剰量の活性化剤を添加して、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーが導入されたポリマーキャリアと反応させて、１００％導入される際の導入率を活性化剤の導入率ａ（ｍｏｌ／ｇ）とする。最後に、ａ／ｂから、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーに対する活性化剤のモル比率を得ることができる。

ここで、ポリマーキャリアに対するヌクレオシド又はユニバーサルリンカーの導入率は、特に限定されず、例えば、０．５μｍｏｌ／ｇ以上、０．８μｍｏｌ／ｇ以上、１．０μｍｏｌ／ｇ以上、２．０μｍｏｌ／ｇ以上、３．０μｍｏｌ／ｇ以上、４．０μｍｏｌ／ｇ以上、５．０μｍｏｌ／ｇ以上、６．０μｍｏｌ／ｇ以上、７．０μｍｏｌ／ｇ以上、８．０μｍｏｌ／ｇ以上、９．０μｍｏｌ／ｇ以上、１０．０μｍｏｌ／ｇ以上、１１．０μｍｏｌ／ｇ以上、１２．０μｍｏｌ／ｇ以上、１３．０μｍｏｌ／ｇ以上、１４．０μｍｏｌ／ｇ以上、又は１５．０μｍｏｌ／ｇ以上であってよく、また、１８．０μｍｏｌ／ｇ以下、１７．０μｍｏｌ／ｇ以下、１６．０μｍｏｌ／ｇ以下、１５．０μｍｏｌ／ｇ以下、１４．０μｍｏｌ／ｇ以下、１３．０μｍｏｌ／ｇ以下、１２．０μｍｏｌ／ｇ以下、１１．０μｍｏｌ／ｇ以下、又は１０．０μｍｏｌ／ｇ以下であってよい。

ポリマーキャリアに対する活性化剤の導入率は、特に限定されず、例えば、０．０５μｍｏｌ／ｇ以上、０．０８μｍｏｌ／ｇ以上、０．１μｍｏｌ／ｇ以上、０．２μｍｏｌ／ｇ以上、０．３μｍｏｌ／ｇ以上、０．４μｍｏｌ／ｇ以上、０．５μｍｏｌ／ｇ以上、０．６μｍｏｌ／ｇ以上、０．７μｍｏｌ／ｇ以上、０．８μｍｏｌ／ｇ以上、０．９μｍｏｌ／ｇ以上、１．０μｍｏｌ／ｇ以上、２．０μｍｏｌ／ｇ以上、３．０μｍｏｌ／ｇ以上、４．０μｍｏｌ／ｇ以上、又は５．０μｍｏｌ／ｇ以上であってよく、また１００μｍｏｌ／ｇ以下、９０μｍｏｌ／ｇ以下、８０μｍｏｌ／ｇ以下、７０μｍｏｌ／ｇ以下、６０μｍｏｌ／ｇ以下、５０μｍｏｌ／ｇ以下、４０μｍｏｌ／ｇ以下、３０μｍｏｌ／ｇ以下、２０μｍｏｌ／ｇ以下、又は１０μｍｏｌ／ｇ以下であってよい。

《固相担体の合成》
本発明の固相担体の合成は、特に限定されず、例えば（１）ポリマーキャリアに、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーを、縮合反応等によって導入した後に、上述した式Ｉで表される活性化剤を縮合反応等によって導入すること、又は（２）ポリマーキャリアに、上述した式Ｉで表される活性化剤を縮合反応等によって導入した後に、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーを縮合反応等によって導入することによって、行うことができる。

なお、いずれの方法においても、ポリマーキャリアに、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーと、上述した式Ｉで表される活性化剤との両方を導入するために、先に導入される成分は、ポリマーキャリアに対して、１．０当量未満であることが好ましい。

例えば上記方法（１）によって本発明の固相担体を合成する場合では、ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーの使用量は、ポリマーキャリアに対して、１．０当量未満であることが好ましく、例えば、１．０当量未満、０．９当量以下、０．８当量以下、０．７当量以下、０．６当量以下、０．５当量以下、０．４当量以下、０．３当量以下、０．２当量以下、又は０．１当量以下であってよい。

《核酸の製造方法》
本発明はまた、上述した本発明の固相担体を用いて核酸合成反応を行うことを含む、核酸の製造方法を提供する。

本発明の固相担体を用いた核酸合成は、例えば核酸自動合成装置を用い、公知の種々の合成法を用いることができる。

本明細書において、「核酸合成反応」とは、特に核酸を構成するヌクレオチドの伸長反応を意味する。すなわち、固相担体上に結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに、ヌクレオチドを順次結合させることにより、伸長されたオリゴヌクレオチドを得る。

このような核酸合成反応としては、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、ホスホロアミダイト法などが挙げられるが、中でも、核酸の合成能力が高く、高純度の核酸が得られることから、ホスホロアミダイト法が好ましい。

また、本発明の方法は、上述した本発明の固相担体を用いることで、塩基無保護法による核酸を合成することができる。この場合、塩基部を保護していないヌクレオシドホスホロアミダイトユニットを使用することができる。

本発明の方法の好ましい実施態様の一つとしては、例えば、本発明の固相担体を核酸自動合成装置の反応カラムに投入し、塩基部を保護していないヌクレオシドホスホロアミダイトユニットを種類別に核酸自動合成装置にセットし、下記表１で示すプロトコールに従い、核酸を製造する方法が挙げられる。

なお、上記表１のプロトコールにおいて、各ステップに用いる溶媒及び試薬の種類、並びに各ステップを行う時間に関して、当業者によって適宜変更することは可能である。また、各洗浄ステップの後に適宜乾燥工程を追加されてもよい。

また、本発明の方法は、例えばカップリングの工程において、活性化剤を更に添加してよい。

ここで、添加する活性化剤としては、特に限定されず、例えば式Ｉで表される活性化剤であってよい。
［式中、
Ｘ^１〜Ｘ^４は、それぞれ独立してＮ又はＣＲであり、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルキル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルコキシ基、ニトロ基、炭素数１〜１０アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜１０アルキル基で置換されていてもよいヒドラジノ基である。]

なお、式Ｉで表わされる活性化剤の詳細については、上述した本発明の「固相担体」の項目を参照できるため、ここでは説明を省略する。

また、上述した式Ｉで表わされる活性化剤以外に、カップリング工程に添加できる活性化剤として、例えば、２，４−ジニトロフェノール、３，４−ジシアノフェノール及び２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノール等のフェノール類縁体であってもよいが、これらに限定されない。

また、本発明の方法は、例えばカップリング工程において、酸触媒を更に添加してもよい。

酸触媒としては、特に限定されず、例えばイミダゾール、テトラゾール、及びそれらの誘導体が好ましい。これらの好適な具体例として、ベンズイミダゾールトリフラート（ＢＩＴ）、４−エチルチオテトラゾール、イミダゾリウムトリフラート、及び４，５−ジシアノイミダゾール等が挙げられるが、これらに限定されない。

このように、本発明の方法の更なる好ましい実施態様の一つとしては、下記表２で示すプロトコールに従い、核酸を製造する方法が挙げられる。

なお、上記表２のプロトコールにおいて、各ステップに用いる溶媒及び試薬の種類、並びに各ステップを行う時間に関して、当業者によって適宜変更することは可能である。また、各洗浄ステップの後に適宜乾燥工程を追加されてもよい。

また、上記表２のプロトコールにおいて、ステップ５の後に、再びステップ４及び５を追加して行ってから、ステップ６を行ってもよい。

本発明の方法において、核酸自動合成装置による核酸合成反応終了後、固相担体上に合成された目的の核酸を固相担体と共に核酸自動合成装置から取り出して、アンモニア水やメチルアミン溶液等を加えて、製造した核酸を固相合成用担体から切り離すことによって、目的の核酸を製造することができる。

本発明の方法によれば、２量体から従来の固相合成法における合成限界である２０量体程度までの核酸は勿論のこと、３０量体以上、４０量体以上、５０量体以上、６０量体以上、７０量体以上、８０量体以上、９０量体以上、１００量体以上、１５０量体以上、２００量体以上、２５０量体以上、又は３００量体以上の核酸を製造することができる。また、上限としては、特に限定されず、例えば５００量体以下、４５０量体以下、又は４００量体以下の核酸を製造することができる。

以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

本実施例で使用した合成試薬および有機溶媒等は、特に言及がない限り、東京化成工業、和光純薬工業、関東化学、シグマアルドリッチで購入したものを使用した。

〈原料合成例１〉
下記スキーム２に基づき、実施例１の活性化剤原料を合成した。

具体的には、まず、化合物２−３（２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ，３０ｇ，７５ｍｍｏｌ，ｗｅｔｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａ． ５０％ Ｗａｔｅｒ）をピリジン−水（３７５μｌ，２：３、ｖ／ｖ）に溶解した。ヒドラジン一水和物（３．６ｍｌ，７５ｍｍｏｌ）、酢酸（１７．１ｍｌ，３００ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（２１．５４ｇ，２６２．５ｍｍｏｌ）を加え、２４時間加熱還流した。反応溶液を冷却した後、ジエチルエーテルと水を加えて３回抽出操作を行った。水層を回収し溶媒を減圧留去した。得られた粗精製物に１Ｍ ＨＣｌ（１００ｍｌ）を加えて室温で３０分攪拌した。固体を吸引濾過で回収し化合物２−４（１０．５ｇ，７８％）を得た。

次に、窒素雰囲気下で化合物２−４（１８０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）をドライメタノール（ｄｒｙ ＣＨ_３ＯＨ）（１００ｍｌ）に溶解し、ドライメタノールに浸したＰｄ−Ｃ（２０ｍｇ）を加えて激しく攪拌した。その後反応系中に水素を添加し、４．５時間激しく攪拌した。反応が完全に終了していなかったため、再びドライメタノールに浸したＰｄ−Ｃ（２０ｍｇ）を加えて２時間激しく攪拌した。反応終了後、セライトを用いてＰｄを濾過し、ろ液を減圧留去し化合物２−５（１５０ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を得た。

その後、化合物２−５（１２７ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）をドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ｄｒｙ ＤＭＦ）（８．５ｍｌ）に溶解させ、無水コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（４２３ｍｇ，４．２ｍｍｏｌ）を加え室温で時間攪拌した。反応終了後、溶媒を高温条件下で減圧留去した。得られた粗精製物に対し１Ｍ ＨＣｌを加えて室温で３０分攪拌した。固体を吸引濾過で回収し化合物２−６（１５７ｍｇ，７４％）を得た。

得られた実施例１の活性化剤原料である化合物２−６のＮＭＲ及びＭＳ（質量分析）の測定結果は、以下のとおりである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ ２．５４−２．６２（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．２４（ｓ，１Ｈ），１０．３６（ｓ，１Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ ２９．１６，３１．６４，９７．１３，１１８．５６，１２０．０８，１２８．７１，１３９．０１，１３９．８５，１７１．３１，１７４．２４
ＨＲ−ＥＳＩＭＳ
ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１０Ｈ_９Ｎ_４Ｏ_４［Ｍ−Ｈ］⁻２４９．０６２４，
ｆｏｕｎｄ ２４９．０６２２。

〈原料合成例２〉
下記スキーム３に基づき、実施例２の活性化剤原料を合成した。

具体的には、まず、化合物２−７（４−Ｃｈｌｏｒｏ−３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ，１．０ｇ，３．７ｍｍｏｌ）をドライメタノール（４ｍｌ）に溶解させ、メタノール中ナトリウムメトキシド（ＮａＯＣＨ_３ ｉｎ ＣＨ_３ＯＨ）（１．５ｍｌ，２５ｗｔ．％，５．６ｍｍｏｌ）を徐々に滴下し室温で１時間攪拌した。反応終了後、ジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）で希釈し、１Ｍ ＨＣｌで２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）で乾燥後溶媒を減圧留去し化合物２−８を得た。

次に、得られた化合物２−８全量をドライエタノール（ｄｒｙ ＣＨ_３ＣＨ_２ＯＨ）（５ｍｌ）に溶解し、ドライエタノー（１.２５ｍｌ）に溶解させたヒドラジン一水和物（１８０μｌ，３．７ｍｍｏｌ）を徐々に滴下し０°Ｃで３０分攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し粗精製物を得た。その後シリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ−２００，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル）で精製し化合物２−９（８５２ｍｇ，８７％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）を得た。

そして、化合物２−９（８５２ｍｇ，３．２ｍｍｏｌ）をエタノール−水（１６ｍｌ，２：１，ｖ／ｖ）に溶解した。ヒドラジン一水和物（１５５μｌ，３．２ｍｍｏｌ）、酢酸（７３０μｌ，１２．８ ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（９１９ｍｇ，１１．２ｍｍｏｌ）を加え、１２時間加熱還流した。反応溶液を冷却した後、ジエチルエーテルと水を加えて３回抽出操作を行った。水層を回収し溶媒を減圧留去した。得られた粗精製物に１Ｍ ＨＣｌを加えて室温で３０分攪拌した。固体を吸引濾過で回収し化合物２−１０（５７５ｍｇ，７２％）を得た。

その後、窒素雰囲気下で化合物２−１０（２２４ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）をドライメタノール（９０ｍｌ）に溶解し、ドライメタノールに浸したＰｄ−Ｃ（２０ｍｇ）を加えて激しく攪拌した。その後反応系中に水素を添加し、４時間激しく攪拌した。反応が完全に終了していなかったため、再びドライメタノールに浸したＰｄ−Ｃ（２０ｍｇ）を加えて激しく攪拌した。２時間後反応が終了していたため、セライトを用いてＰｄを濾過し、ろ液を減圧留去し化合物２−１１（１９５ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を得た。

最後に、無水コハク酸（６４０ｍｇ，６．４ｍｍｏｌ）をドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３．２ｍｍｏｌ）に溶解し、化合物２−１１（１４０ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）を加え２０時間加熱還流した。反応終了後、溶媒を高温条件下で減圧留去した。得られた粗精製物に１Ｍ ＨＣｌ（１０ｍｌ）を加え室温で３０分攪拌した。固体を吸引濾過で回収し化合物２−１２（１２５ｍｇ，６１％）を得た。

得られた実施例２の活性化剤原料である化合物２−１２のＮＭＲ及びＭＳ（質量分析）の測定結果は、以下のとおりである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ ２．５５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），７．７９（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｓ，１Ｈ），１０．９９（ｓ，１Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ ２９．０６，３１．４９，１０２．４３，１０２．４８，１０７．３８，１０８．３９，１２８．５０，１３１．７３，１３６．５７，１７２．７７，１７４．２４。
ＨＲ−ＥＳＩＭＳ
ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１Ｈ_８Ｆ_３Ｎ_４Ｏ_４［Ｍ−Ｈ］⁻ ３１７．０４９８，
ｆｏｕｎｄ ３１７．０５０３。

〈原料合成例３〉
下記スキーム４に基づき、比較例１の活性化剤原料を合成した。

具体的には、化合物２−１３（６−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ，６７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．５ｍｌ）に溶解し、無水コハク酸（１００ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で時間攪拌した。反応終了後、溶媒を高温条件下で減圧留去した。得られた粗精製物をエタノールを用いて再結晶化し、化合物２−１４（９３ｍｇ，８０％）を得た。

得られた比較例１の活性化剤原料である化合物２−１４のＮＭＲ及びＭＳ（質量分析）の測定結果は、以下のとおりである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ ２．５４−２．５７（ｍ，４Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），７．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．１４（ｓ，１Ｈ），９．９６（ｓ，１Ｈ）。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ ２９．３２，２９．４４，３１．５６，１０５．０４，１１５．０８，１１６．４６，１３４．６６，１４２．３２，１７０．２１，１７４．０５，１７４．３３。
ＨＲ−ＥＳＩＭＳ
ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１Ｈ_１０Ｎ_３Ｏ_３［Ｍ−Ｈ］⁻ ２３２．０７２２，
ｆｏｕｎｄ ２３２．０７２８。

〈原料合成例４〉
下記スキーム５に基づき、ポリマーキャリアに連結するヌクレオシドの原料を合成した。

具体的には、化合物１−２（１ｇ，１．８ｍｍｏｌ）をドライピリジンで３回、ドライトルエン（ｄｒｙ Ｔｏｌｕｅｎｅ）で３回、ドライジクロロメタン（ｄｒｙ ＣＨ_２Ｃｌ_２）で３回共沸し、ドライジクロロメタン（１８ｍｌ）に溶解した。その後無水コハク酸（２８０ｍｇ，２．８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（６７２ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）を加え室温で１６時間攪拌した。反応終了後、０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）で２回洗浄し、目的物をトリエチルアンモニウム塩に交換した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧留去し粗精製物を得た。その後シリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ−２００，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５％Ｅｔ_３Ｎ）で精製し化合物２−１５（１．２ｇ，９０％）を得た。

得られたポリマーキャリアに連結するヌクレオシドの原料である化合物２−１５のＮＭＲ測定結果は、以下のとおりである。
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）
δ １．１９−１．２６（ｍ，９Ｈ），１．３３（ｓ，３Ｈ），２．３７−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．５３−２．６１（ｍ，４Ｈ），２．９６−３．００（ｍ，６Ｈ），３．４４−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），４．１５−４．１７（ｓ，１Ｈ），５．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，９．０Ｈｚ），６．８２（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２１−７．３８（ｍ，９Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ）。

〈原料合成例５〉
下記スキーム６に基づき、実施例１及び２、並びに比較例１の固相担体を合成した。

具体的には、まずポリマーキャリア２−１６（Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ＣＰＧ，５００ｍｇ）をドライジクロロメタン（２ｍｌ）に浸し、化合物２−１５（４ｍｇ，５μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（５ｍｇ，２５μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（１ｍｇ，７μｍｏｌ）を加え室温で２４時間振とう攪拌した。反応終了後ドライジクロロメタンで洗浄・乾燥し、担持量１０μｍｏｌ／ｇの固相担体前駆体２−１７を得た。

そして、固相担体前駆体２−１７（１００ｍｇ，１０μｍｏｌ／ｇ ｄＴ担持）をドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５００μｌ）に浸し、化合物２−６（１２．５ｍｇ，５０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５２ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（９ｍｇ，７０μｍｏｌ）を加え室温で２４時間振とう攪拌した。反応終了後ドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ドライジクロロメタンで洗浄・乾燥し、実施例１及び３の固相担体２−１８を得た。

また、固相担体前駆体２−１７（１００ｍｇ，１０μｍｏｌ／ｇｄＴ担持）をドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５００μｌ）に浸し、化合物２−１２（１６ｍｇ，５０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５２ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（９ｍｇ，７０μｍｏｌ）を加え室温で２４時間振とう攪拌した。反応終了後ドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ドライジクロロメタンで洗浄・乾燥し、実施例２及び４の固相担体２−１９を得た。

また、固相担体前駆体２−１７（１００ｍｇ，１０μｍｏｌ／ｇｄＴ担持）をドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５００μｌ）に浸し、化合物２−１３（１２ｍｇ，５０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５２ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（９ｍｇ，７０μｍｏｌ）を加え室温で２４時間振とう攪拌した。反応終了後ドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ドライジクロロメタンで洗浄・乾燥し、比較例１の固相担体２−２０を得た。

〈原料合成例６〉
下記スキーム７に基づき、比較例２の固相担体を合成した。

具体的には、上記で得られた固相担体前駆体２−１７（１００ｍｇ，１０μｍｏｌ／ｇ ｄＴ担持）をピリジン−無水酢酸（５００μｌ，９：１，ｖ／ｖ）に浸し、触媒量のＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジンを加え室温で５時間振とう攪拌した。反応終了後ドライジクロロメタンで洗浄・乾燥し、比較例２の固相担体２−２１を得た。

《実施例１》
上記で得らえた固相担体２−１８を核酸自動合成装置（ジーンデザイン社製）にセットして、下記表３で示すプロトコールに従い、実施例１の核酸（Ｔ−Ｔ二量体）を製造した。

具体的には、固相担体２−１８をジクロロメタンで洗浄した後３％ＴＦＡを用いてＤＭＴｒ基を除去した。その後ジクロロメタン、ドライアセトニトリル（ｄｒｙ ＣＨ_３ＣＮ）で洗浄し、固相担体を１５分間乾燥させた。続いて０．１Ｍとなるようにアセトニトリルに溶解させたｄＴ−ホスホロアミダイトユニット（５’−Ｏ−（４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ−３’−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（４００μｌ）を加えて５分間振とう攪拌しカップリング反応を行った。反応終了後アセトニトリルで洗浄し、０．１Ｍ ヨウ素／ピリジン−水（９：１，ｖ／ｖ）を用いてリン酸部の酸化を行った。その後アセトニトリルで洗浄し、３％ＴＦＡを用いてＤＭＴｒ基を除去した。最後にアンモニア水溶液を加えて室温で２時間攪拌することで固相担体からの切り出し・シアノエチル基の脱保護を行った。固相担体を濾過して除去した後、溶液を減圧留去し目的物であるＴ−Ｔ二量体を得た。

《実施例２》
固相担体２−１９を核酸自動合成装置にセットしたこと以外は、実施例１と同様にして、実施例２の核酸（Ｔ−Ｔ二量体）を製造した。

《比較例１》
固相担体２−２０を核酸自動合成装置にセットしたこと以外は、実施例１と同様にして、比較例１の核酸（Ｔ−Ｔ二量体）を製造した。

《比較例２》
固相担体２−２１を核酸自動合成装置にセットしたこと以外は、実施例１と同様にして、比較例２の核酸（Ｔ−Ｔ二量体）を製造した。

なお、上述した実施例１及び２、並びに比較例１及び２の核酸自動合成装置における合成反応は、以下のスキーム８によるものであった。

《評価》
実施例１及び２、並びに比較例１及び２で合成したＴ−Ｔ二量体に対して、下記条件で、逆相ＨＰＬＣ分析を行った。
Ａバッファ：０．１Ｍトリエチルアミン−アセテートバッファ
Ｂバッファ：アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエント：２０ｍｉｎ、Ｂバッファ１０％。

各実施例及び比較例逆相ＨＰＬＣの結果は、図２に示されている。より具体的には、図２（ａ）は、実施例１の結果であり、図２（ｂ）は、実施例２の結果であり、図２（ｃ）は、比較例１の結果であり、図２（ｄ）は、比較例２の結果である。

各実施例及び比較例において、すべての結果に共通するメインピークが３つ（Ｘ、Ｙ、Ｚ）が検出された。これらのピークをＬＣ−ＭＳによって同定した。ピークＺは、目的物であるＴ−Ｔ二量体の分子量（５４５．１４）であることがわかった。また、ピークＹにおいて、２４１．０８及び３２１．０４の２つの分子量が検出され、２４１．０８は、未反応物であるチミジンの分子量であることがわかった。一方、３２１．０４は、チミジンの水酸基が１つだけリン酸化された分子量と一致した。なお、ピークＸは、ピークＹよりも小さい分子量であって、キャップ化反応時に未反応だったアミノ基による副生成物であったと推測できる。

図２（ａ）及び図２（ｂ）から明らかであるように、本発明の固相担体を用いて高収率、高効率及び高選択的に、Ｔ−Ｔ二量体核酸を製造することができた。特に、実施例１の固相担体は、実施例２の固相担体よりも高収率、高効率及び高選択的に、Ｔ−Ｔ二量体核酸を製造することができた。

これに対して、比較例１及び２では、Ｔ−Ｔ二量体核酸は、ほとんど製造できなかった（図２（ｃ）及び図２（ｂ））。この原因としては、比較例１の固相担体２−２０に連結されているベンズイミダゾール誘導体は、活性化剤としての機能を有さないと考えられる。また、比較例２の固相担体では、そもそも活性化剤を連結させていなかったためである。

《実施例３》
上記で得られた固相担体２−１８及びｄＴ−ホスホロアミダイトユニット（５’−Ｏ−（４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ−３’−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を、大日本精機ｎＳ−８ＩＩにセットして、下記表４で示すプロトコールに従い、実施例３の核酸（チミジン４０量体）を製造した。

合成後、アンモニア水溶液を加えて室温で２時間攪拌することで固相担体からの切り出し・シアノエチル基の脱保護を行った。固相担体を濾過して除去した後、溶液を減圧留去し目的物であるチミジン４０量体の核酸を得た。

なお、６−ニトロ−ＨＯＢｔは上述した化合物２−４である。

また、ＢＩＴの分子式は、以下のとおりである。

《実施例４》
固相担体２−１９を大日本精機ｎＳ−８ＩＩにセットしたこと以外は、実施例３と同様にして、実施例４の核酸（チミジン４０量体）を製造した。

《比較例３》
固相担体２−２０を大日本精機ｎＳ−８ＩＩにセットしたこと以外は、実施例３と同様にして、比較例３の核酸（チミジン４０量体）を製造した。

《比較例４》
固相担体２−２１を大日本精機ｎＳ−８ＩＩにセットしたこと以外は、実施例３と同様にして、比較例４の核酸（チミジン４０量体）を製造した。

なお、上述した実施例３及び４、並びに比較例３及び４の核酸自動合成装置（大日本精機ｎＳ−８ＩＩ）における合成反応は、以下のスキーム９によるものであった。
《評価》
実施例３及び４、並びに比較例３及び４で合成したチミジン４０量体に対して、下記条件で、陰イオン交換ＨＰＬＣ分析を行った。
Ａバッファ：０．２５ｍＭリン酸塩バッファ
Ｂバッファ：０．２５ｍＭリン酸塩中の１Ｍ塩化ナトリウムバッファ
流速：３ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエント：８０ｍｉｎ、Ｂバッファ８０％。

各実施例及び比較例逆相ＨＰＬＣの結果は、図３に示されている。より具体的には、図３（ａ）は、実施例３の結果であり、図３（ｂ）は、実施例４の結果であり、図３（ｃ）は、比較例３の結果であり、図３（ｄ）は、比較例４の結果である。

本実験では、保持時間５０分〜６５分の間に観測されたすべてのピーク面積に対するチミジン４０量体のピークの割合を合成収率として定めた。

その結果、実施例３及び４は、それぞれ５８％及び６１％の収率で目的物の核酸を製造することができた。

これに対して、比較例３及び４は、いずれも４８％の収率で目的物の核酸を製造することができた。

従って、外部から活性化剤が添加された場合においても、本発明の固相担体を用いた実施例３及び４は、比較例３及び４よりも収率を１０〜１３％改善することができた。

本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参考により全体として本明細書中に援用される。なお、例示の目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims (17)

1. ポリマーキャリアと、
   ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーと、
   以下の式Ｉ：
   ［式中、
   Ｘ^１〜Ｘ^４は、それぞれ独立してＮ又はＣＲであり、
   Ｒは、Ｈ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルキル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０アルコキシ基、ニトロ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜１０のアルキル基で置換されていてもよいヒドラジノ基である。]
   で表される活性化剤と、
   を含む、核酸合成用固相担体であって、
   前記ヌクレオシド又はユニバーサルリンカー及び前記活性化剤が、前記ポリマーキャリアに連結されている、固相担体。
2. 前記活性化剤が、スペーサーを介して前記ポリマーキャリアに連結されている、請求項１に記載の固相担体。
3. 前記スペーサーが、以下の式ＩＩ：
   [式中、Ｌは、不活性な二価の基である。]
   で表わされる構造を有する、請求項２に記載の固相担体。
4. 前記活性化剤が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、１−ヒドロキシ−６−トリフルオロメチルベンゾトリアゾール、及び１−ヒドロキシ−６−ニトロベンゾトリアゾールからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の固相担体。
5. 前記ヌクレオシド又はユニバーサルリンカーに対する前記活性化剤のモル比率が、０．１〜１０．０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の固相担体。
6. 前記ヌクレオシドの５’水酸基が、保護されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の固相担体。
7. 前記ヌクレオシドの塩基部位が、保護されていない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の固相担体。
8. 塩基部無保護法で使用される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の固相担体。
9. ２０量体〜５００量体の核酸合成のために使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の固相担体。
10. 前記ポリマーキャリアは、ガラス系多孔質担体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の固相担体。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の固相担体を用いて核酸合成反応を行うことを含む、核酸の製造方法。
12. ホスホロアミダイト法によって行われる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記式Ｉで表される活性化剤を更に添加する、請求項１２に記載の方法。
14. 酸触媒を更に添加する、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記酸触媒が、ベンズイミダゾールトリフラート（ＢＩＴ）、４−エチルチオテトラゾール、イミダゾリウムトリフラート、及び４，５−ジシアノイミダゾールからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１４に記載の方法。
16. 塩基部を保護していないヌクレオシドホスホロアミダイトユニットを使用する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ２０量体〜５００量体の核酸を製造する、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。