JP5194256B2 - 2’水酸基修飾リボヌクレオシド誘導体 - Google Patents
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Description
本発明は、アルコキシカルボニルエチル基などで2'水酸基を修飾した新規リボヌクレオシド誘導体、及びそのリボヌクレオシド誘導体を含む核酸誘導体に関する。アルコキシカルボニルエチル基は、化学反応によりヒドロキシエチル基、カルバモイルエチル基などへの変換が可能である。これらの修飾基を持つリボヌクレオシドを含むRNAは優れたハイブリダイゼーション能や核酸分解酵素に対する抵抗性などの性質を有すると期待され、核酸検出プローブ、アンチセンス法やRNAiなどのための人工RNAとしての有用性が期待される。
2'水酸基が修飾されたRNAの合成には2'水酸基が修飾されたリボヌクレオシドモノマー中間体が必要である。このモノマー中間体を合成する主な従来法として2つある。ひとつは、塩基部位と5'水酸基が保護されたリボヌクレオシドに対してNaHで2'あるいは3'の水酸基をアルコキシドとしたのち、ハロゲン化アルキルと反応させる方法である(非特許文献1)。この手法では、2'修飾体ばかりでなく位置異性体の3'修飾体もかなり生成するために、分離が困難なことが多い。もう一つの方法は、塩基部位と3',5'水酸基を保護したリボヌクレオシド誘導体に対してNaHで反応させて2'位の水酸基をアルコキシドにしてアルキル化したり、BEMPなどの有機強塩基存在下ハロゲン化アルキルを反応させる方法である(非特許文献2)。この方法では、3'、5'水酸基を同時に保護できる保護基が必要であり、通常1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル(TIPS)基やジ(tert-ブチル)シラニル(DBS)基が用いられる。しかし、これらの保護基はNaHやBEMPなどの試薬に対して安定性に欠けるために、副生成物が生じてしまう大きな問題点があった。上述した2つの合成法では、いずれも塩基性条件が厳しい条件を用いているために、修飾基導入試薬として用いられるハロゲン化アルキル誘導体には通常はメチルエステルやエチルエステルなどの官能基は組み込むことができない。安定性を維持するためtert-ブチルエステルなどの立体障害の高いものしかエステル骨格としては導入不可能である。
Richard H. Griffey, Brett P. Monia, Lendall L. Cummins, Susan Freier, Michael J. Greig, Charles J. Guinosso, Elena Lesnik, Sherilynn M. Manalili, Venkatraman Mohan, Steven Owens, Bruce R. Ross, Henri Sasmor, Ed Wancewicz, Kurt Weiler, Patrick D. Wheeler, and P. Dan Cook J. Med. Chem. 1996, 39, 5100-5109
Grotli, M;Douglas, M; Beijer, B.;Garcia, R. G.; Eritja, R.;Sproat, B. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 2779-2788.
上述したように、従来法では、リボヌクレオシドの2'水酸基に導入できるエステル骨格はtert-ブチルエステルなど特定のものに限られていた。本発明は、このような技術的な背景の下になされたものであり、リボヌクレオシドの2'水酸基に、より単純なエステル骨格を導入する手段を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、α、β不飽和エステルであるアクリル酸エステルを用いたMichael反応によって、きわめて緩和な反応条件でアルコキシカルボニルエチル基をリボヌクレオシド誘導体の2'水酸基に導入できることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の(1)〜(12)を提供するものである。
即ち、本発明は、以下の(1)〜(12)を提供するものである。
(1)一般式(I):
〔式中、R1は水素原子、又は水酸基の保護基を表し、R2は水素原子、水酸基の保護基、又は一般式(III):
(式中、R6、R7は同一または異なるアルキル基、もしくはR6とR7が互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成した基を表し、R8はリン酸基の保護基を表す。)
で示される基を表し、R3は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体。
で示される基を表し、R3は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体。
(2)一般式(I)においてR3が、メチル基又は2,2,2−トリフルオロエチル基を表す、(1)に記載のリボヌクレオシド誘導体。
(3)一般式(II):
〔式中、R1は水素原子、又は水酸基の保護基を表し、R2は水素原子、水酸基の保護基、又は一般式(III):
(式中、R6、R7は同一または異なるアルキル基、もしくはR6とR7が互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成した基を表し、R8はリン酸基の保護基を表す。)
で示される基を表し、R4及びR5は同一又は異なって水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体。
で示される基を表し、R4及びR5は同一又は異なって水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体。
(4)一般式(II)においてR4及びR5が、メチル基を表す、(3)に記載のリボヌクレオシド誘導体。
(5)一般式(II)においてR4及びR5の少なくとも一方が、水素原子を表す、(3)に記載のリボヌクレオシド誘導体。
(5)一般式(II)においてR4及びR5の少なくとも一方が、水素原子を表す、(3)に記載のリボヌクレオシド誘導体。
(6)一般式(IV):
〔式中、R1は水素原子、又は水酸基の保護基を表し、R2は水素原子、水酸基の保護基、又は一般式(III):
(式中、R6、R7は同一または異なるアルキル基、もしくはR6とR7が互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成した基を表し、R8はリン酸基の保護基を表す。)
で示される基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体を、一般式(V):
〔式中、R3は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表す。〕
で表されるアクリル酸エステルと反応させ、一般式(I):
〔式中、R1、R2、R3、及びBは前記と同意義を示す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体を得ることを特徴とする、リボヌクレオシド誘導体の製造方法。
で示される基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体を、一般式(V):
で表されるアクリル酸エステルと反応させ、一般式(I):
で表されるリボヌクレオシド誘導体を得ることを特徴とする、リボヌクレオシド誘導体の製造方法。
(7)一般式(I)においてR3が、メチル基又は2,2,2−トリフルオロエチル基を表す、(6)に記載のリボヌクレオシド誘導体の製造方法。
(8)一般式(VI):
〔式中、B1、B2及びB3は同一又は異なって保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表し、B2はnの繰り返しにおいて異なっていてもよく、X1、X2及びX3は同一又は異なって水素原子、水酸基、メトキシ基、シアノエトキシ基、一般式(VII):
〔式中、R3は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基又は置換基を有していてもよいアリール基を表す。〕
で示される基、又は一般式(VIII):
〔式中、R4及びR5は同一又は異なって水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表す。〕
で示される基を表し、X2はnの繰り返しにおいて異なっていてもよく、nは1以上の整数を表す。但し、X1、X2、及びX3の少なくとも一つは一般式(VII)又は(VIII)で示される基を表す。〕
で表される核酸誘導体。
で示される基、又は一般式(VIII):
で示される基を表し、X2はnの繰り返しにおいて異なっていてもよく、nは1以上の整数を表す。但し、X1、X2、及びX3の少なくとも一つは一般式(VII)又は(VIII)で示される基を表す。〕
で表される核酸誘導体。
(9)一般式(VII)においてR3が、メチル基又は2,2,2−トリフルオロエチル基を表す、(8)に記載の核酸誘導体。
(10)一般式(VIII)においてR4及びR5が、メチル基を表す、(8)に記載の核酸誘導体。
(11)一般式(VIII)においてR4及びR5の少なくとも一方が、水素原子を表す、(8)に記載の核酸誘導体。
(10)一般式(VIII)においてR4及びR5が、メチル基を表す、(8)に記載の核酸誘導体。
(11)一般式(VIII)においてR4及びR5の少なくとも一方が、水素原子を表す、(8)に記載の核酸誘導体。
(12)一般式(I):
〔式中、R1は水素原子、又は水酸基の保護基を表し、R2は水素原子、水酸基の保護基、又は一般式(III):
(式中、R6、R7は同一または異なるアルキル基、もしくはR6とR7が互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成した基を表し、R8はリン酸基の保護基を表す。)
で示される基を表し、R3は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体、若しくは一般式(II):
〔式中、R1、R2、及びBは前記と同意義を示し、R4及びR5は同一又は異なって置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体、又はこれらのリボヌクレオシド誘導体を構成成分として含む核酸誘導体をフッ化物イオンを含む試薬で処理し、対応する一般式(IV):
〔式中、式中、R1、R2、及びBは前記と同意義を示す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体、又はそれらを構成成分として含む核酸誘導体を得る方法。
で示される基を表し、R3は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体、若しくは一般式(II):
で表されるリボヌクレオシド誘導体、又はこれらのリボヌクレオシド誘導体を構成成分として含む核酸誘導体をフッ化物イオンを含む試薬で処理し、対応する一般式(IV):
で表されるリボヌクレオシド誘導体、又はそれらを構成成分として含む核酸誘導体を得る方法。
本発明によって、エステル官能基を2'水酸基に組み込むことが可能になり、修飾基として今後様々な置換基がこの官能基の反応性を利用して可能になり、アンチセンス法やRNAi法に新しい素材を提供できるようになる。また、修飾基にアミド基も導入できこの官能基の安定性を利用して蛍光色素やスピンラベルした官能基も導入できるためプローブ分子としても期待される。エステルに対してメチルアミンなどを反応させるとN-メチルカルバモイルエチル基が2'水酸基に導入できる。これを新しいRNA合成の2'水酸基の保護基として用いることも可能になった。今後、この保護基を活用するRNA合成法の発展も期待できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のリボヌクレオシド誘導体は、一般式(I)又は(II)で表される。
一般式(I)又は(II)におけるR1は、水素原子、又は水酸基の保護基を表す。水酸基の保護基としては、ヌクレオシド5'水酸基に一般的に使用されている保護基でよく、5'水酸基のみを保護する基でも、3'水酸基と5'水酸基を同時に保護する基であってもよい。5'水酸基のみを保護する基としては、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基、tert-ブチルジフェニルシリル基などのトリアルキルシリル基、ベンゾイル基、置換ベンゾイル基(例えば、2-メチルベンゾイル基、2-tert-ブチルベンゾイル基)、ナフトイル基などを例示できる。3'水酸基と5'水酸基を同時に保護する基としては、TIPS基、DBS基などを例示できる。また、R2が一般式(III)で示される基である場合には、水酸基の保護基は、4,4'-ジメトキシトリチル(DMTr)基、4-メトキシトリチル(MMTr)基、ピキシル基などであることが好ましい。
本発明のリボヌクレオシド誘導体は、一般式(I)又は(II)で表される。
一般式(I)又は(II)におけるR1は、水素原子、又は水酸基の保護基を表す。水酸基の保護基としては、ヌクレオシド5'水酸基に一般的に使用されている保護基でよく、5'水酸基のみを保護する基でも、3'水酸基と5'水酸基を同時に保護する基であってもよい。5'水酸基のみを保護する基としては、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基、tert-ブチルジフェニルシリル基などのトリアルキルシリル基、ベンゾイル基、置換ベンゾイル基(例えば、2-メチルベンゾイル基、2-tert-ブチルベンゾイル基)、ナフトイル基などを例示できる。3'水酸基と5'水酸基を同時に保護する基としては、TIPS基、DBS基などを例示できる。また、R2が一般式(III)で示される基である場合には、水酸基の保護基は、4,4'-ジメトキシトリチル(DMTr)基、4-メトキシトリチル(MMTr)基、ピキシル基などであることが好ましい。
一般式(I)又は(II)におけるR2は、水素原子、水酸基の保護基、又は一般式(III)で示される基を表す。水酸基の保護基としては、ヌクレオシド3'水酸基に一般的に使用されている保護基でよく、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基、tert-ブチルジフェニルシリル基などのトリアルキルシリル基、ベンゾイル基、置換ベンゾイル基(例えば、2-メチルベンゾイル基、2-tert-ブチルベンゾイル基)、ナフトイル基、TIPS基、DBS基などを例示できる。
一般式(I)におけるR3は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、好適には、置換基を有していてもよいアルキル基を表し、更に好適には、メチル基又は2,2,2-トリフルオロエチル基を表す。ここで、「アルキル基」とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基などである。「アラルキル基」とは、例えば、ベンジル基などである。「アルケニル基」とは、例えば、アリル基、ホモアリル基などである。「アルキニル基」とは、例えば、プロパルギル基などである。「アリール基」とは、例えば、フェニル基、ナフチル基などである。「置換基を有するアルキル基」とは、例えば、2,2,2-トリフルオロエチル基、シアノメチル基、2,2,2-トリクロロエチル基などである。「置換基を有するアラルキル基」とは、例えば、4−クロロベンジル基、4−ニトロベンジル基などである。「置換基を有するアルケニル基」とは、例えば、ジクロロアリル基などである。「置換基を有するアリール基」とは、例えば、4‐ニトロフェニル基などである。
一般式(II)におけるR4及びR5は、同一又は異なって水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、好適には、水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、更に好適には、水素原子、又はメチル基を表す。なお、「アルキル基」等の意味は、上記と同様である。
後述するように、R4及びR5の基の種類によって、一般式(II)の2'修飾基(カルバモイルエチル部分)の脱離の仕方が変わってくる。即ち、R4及びR5のいずれも水素原子でない場合は、カルバモイルエチル部分はテトラブチルアンモニウムフルオリド(Bu4NF)によって脱離し、R4及びR5の少なくとも一方が水素原子である場合は、カルバモイルエチル部分はBu4NFに対して安定である。従って、カルバモイルエチル部分を2'水酸基の保護基として使用する場合は、R4及びR5は水素原子以外のものとし、標識物質等を結合させるための修飾基として使用する場合は、R4及びR5は少なくとも一方は水素原子とすることが好ましい。
一般式(I)又は(II)におけるBは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。核酸塩基としては、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンを挙げることができる。保護基又は修飾基としては、アデニン塩基にあっては、N6位のアミノ基が一つまたは2つのアシル基で保護されるか、アミジン型保護基でもよい。グアニン塩基にあっては、N2位のアミノ基が一つまたは2つのアシル基で保護されるか、アミジン型保護基でもよい。また、グアニン塩基のO6位はシアノエチル基などのアルキル基や、ジフェニルカルバモイル基などのアシル基などで保護されてもよい。ウラシル塩基及びチミン塩基にあっては、N3位がアルキル基、アシル基で保護されてもよい。また、ピリミジン塩基では、5位にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基などあるいはそれらに蛍光性官能基、ビオチニル基、アミノ基、スピンラベルなどの置換基が含まれていてもよい。
一般式(III)におけるR6及びR7は同一または異なってアルキル基、もしくはR6とR7が互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成した基を表す。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基などを例示することができ、これらの中ではイソプロピル基が好ましい。
一般式(III)におけるR8はリン酸基の保護基を表す。リン酸基の保護基としては、2-シアノエチル基、4-ニトロフェニルエチル基、N-(トリフルオロアセチル)-4-アミノブチル基、又は、N-メチル-N-(トリフルオロアセチル)-4-アミノブチル基などを例示することができ、これらの中では2-シアノエチル基が好ましい。
一般式(III)におけるR8はリン酸基の保護基を表す。リン酸基の保護基としては、2-シアノエチル基、4-ニトロフェニルエチル基、N-(トリフルオロアセチル)-4-アミノブチル基、又は、N-メチル-N-(トリフルオロアセチル)-4-アミノブチル基などを例示することができ、これらの中では2-シアノエチル基が好ましい。
一般式(I)で表される化合物の具体例としては、2'-O-(2-メトキシカルボニルエチル)アデノシン、2'-O-(2-メトキシカルボニルエチル)シチジン、2'-O-(2-メトキシカルボニルエチル)グアノシン、2'-O-(2-メトキシカルボニルエチル)ウリジンなどを挙げることができる。
一般式(II)で表される化合物の具体例としては、2'-O-(N-メチルアミノカルボニルエチル)アデノシン、2'-O-(N-メチルアミノカルボニルエチル)シチジン、2'-O-(N-メチルアミノカルボニルエチル)グアノシン、2'-O-(N-メチルアミノカルボニルエチル)ウリジン、2'-O-(N,N-ジメチルアミノカルボニルエチル)アデノシン、2'-O-(N,N-ジメチルアミノカルボニルエチル)シチジン、2'-O-(N,N-ジメチルアミノカルボニルエチル)グアノシン、2'-O-(N,N-ジメチルアミノカルボニルエチル)ウリジンなどを挙げることができる。
一般式(II)で表される化合物の具体例としては、2'-O-(N-メチルアミノカルボニルエチル)アデノシン、2'-O-(N-メチルアミノカルボニルエチル)シチジン、2'-O-(N-メチルアミノカルボニルエチル)グアノシン、2'-O-(N-メチルアミノカルボニルエチル)ウリジン、2'-O-(N,N-ジメチルアミノカルボニルエチル)アデノシン、2'-O-(N,N-ジメチルアミノカルボニルエチル)シチジン、2'-O-(N,N-ジメチルアミノカルボニルエチル)グアノシン、2'-O-(N,N-ジメチルアミノカルボニルエチル)ウリジンなどを挙げることができる。
一般式(I)で表されるリボヌクレオシド誘導体は、一般式(IV)で表されるリボヌクレオシド誘導体を、一般式(V)で表されるアクリル酸エステルと反応させることにより製造できる。
一般式(V)におけるR3は上記と同様である。
上記反応は、適当な触媒存在下で行う。触媒としては、Cs2CO3、K2CO3、Na2CO3、DBUなどを例示できる。
また、上記反応は、反応を阻害しない溶媒中で行う。このような溶媒としては、tert-ブタノールなどを例示できる。
反応温度は特に限定されないが、0 ℃〜100 ℃の範囲内であることが好ましい。
反応時間は特に限定されないが、1〜50時間とすることが好ましい。
一般式(V)におけるR3は上記と同様である。
上記反応は、適当な触媒存在下で行う。触媒としては、Cs2CO3、K2CO3、Na2CO3、DBUなどを例示できる。
また、上記反応は、反応を阻害しない溶媒中で行う。このような溶媒としては、tert-ブタノールなどを例示できる。
反応温度は特に限定されないが、0 ℃〜100 ℃の範囲内であることが好ましい。
反応時間は特に限定されないが、1〜50時間とすることが好ましい。
反応に用いるリボヌクレオシド誘導体とアクリル酸エステルとの量比は特に限定されないが、前者と後者のモル比が1:1〜1:100の範囲内になるように反応させるのが好ましい。
一般式(II)で表されるリボヌクレオシド誘導体は、一般式(I)で表されるリボヌクレオシド誘導体を、アミンと反応させることにより製造できる。
使用するアミンとしては、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミンなどを例示できる。
上記反応は、反応を阻害しない溶媒中で行う。このような溶媒としては、エタノール、メタノール、テトラヒドロフランなどを例示できる。
一般式(II)で表されるリボヌクレオシド誘導体は、一般式(I)で表されるリボヌクレオシド誘導体を、アミンと反応させることにより製造できる。
使用するアミンとしては、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミンなどを例示できる。
上記反応は、反応を阻害しない溶媒中で行う。このような溶媒としては、エタノール、メタノール、テトラヒドロフランなどを例示できる。
反応温度は特に限定されないが、0 ℃〜100 ℃の範囲内であることが好ましい
反応時間は特に限定されないが、1〜48時間とすることが好ましい
反応に用いるリボヌクレオシド誘導体とアミンとの量比は特に限定されないが、前者と後者のモル比が1:1〜1:1000の範囲内になるように反応させるのが好ましい。
本発明の核酸誘導体は、一般式(VI)で表される。
一般式(VI)におけるB1、B2及びB3は同一又は異なって保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表し、B2はnの繰り返しにおいて異なっていてもよい。保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基は、前述したBの基と同様の基を表す。
反応時間は特に限定されないが、1〜48時間とすることが好ましい
反応に用いるリボヌクレオシド誘導体とアミンとの量比は特に限定されないが、前者と後者のモル比が1:1〜1:1000の範囲内になるように反応させるのが好ましい。
本発明の核酸誘導体は、一般式(VI)で表される。
一般式(VI)におけるB1、B2及びB3は同一又は異なって保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表し、B2はnの繰り返しにおいて異なっていてもよい。保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基は、前述したBの基と同様の基を表す。
一般式(VI)におけるX1、X2及びX3は同一又は異なって水素原子、水酸基、メトキシ基、一般式(VII)で示される基、又は一般式(VIII)で示される基を表し、X2はnの繰り返しにおいて異なっていてもよい。
一般式(VI)におけるnは1以上の整数を表すが、好適には1〜200の整数を表し、更に好適には8〜100の整数を表す。
一般式(VI)におけるX1、X2、及びX3は、上述した基を表せばよいが、これらの少なくとも一つは一般式(VII)又は一般式(VIII)で示される基を表を表す。また、X2はn個の基を表すが、n個中の5〜100%が一般式(VII)又は一般式(VIII)で示される基であることが好ましい。なお、一般式(VII)及び一般式(VIII)におけるR3〜R5は前記と同様の基を表す。
一般式(VI)におけるnは1以上の整数を表すが、好適には1〜200の整数を表し、更に好適には8〜100の整数を表す。
一般式(VI)におけるX1、X2、及びX3は、上述した基を表せばよいが、これらの少なくとも一つは一般式(VII)又は一般式(VIII)で示される基を表を表す。また、X2はn個の基を表すが、n個中の5〜100%が一般式(VII)又は一般式(VIII)で示される基であることが好ましい。なお、一般式(VII)及び一般式(VIII)におけるR3〜R5は前記と同様の基を表す。
本発明の核酸誘導体は、上述した本発明のリボヌクレオシド誘導体から公知の核酸合成法(例えば、ホスホロアミダイト法など)によって合成することができる。
本発明には、一般式(I)で表されるリボヌクレオシド誘導体、若しくは一般式(II)で表されるリボヌクレオシド誘導体(但し、R4及びR5は水素原子以外の基を表わす。)、又はこれらのリボヌクレオシド誘導体を構成成分として含む核酸誘導体をフッ化物イオンを含む試薬で処理し、対応する一般式(IV)で表されるリボヌクレオシド誘導体、又はそれらを構成成分として含む核酸誘導体を得る方法も含まれる。ここで、「フッ化物イオンを含む試薬」としては、例えば、テトラブチルアンモニウムフルオリドを挙げることができる。
本発明には、一般式(I)で表されるリボヌクレオシド誘導体、若しくは一般式(II)で表されるリボヌクレオシド誘導体(但し、R4及びR5は水素原子以外の基を表わす。)、又はこれらのリボヌクレオシド誘導体を構成成分として含む核酸誘導体をフッ化物イオンを含む試薬で処理し、対応する一般式(IV)で表されるリボヌクレオシド誘導体、又はそれらを構成成分として含む核酸誘導体を得る方法も含まれる。ここで、「フッ化物イオンを含む試薬」としては、例えば、テトラブチルアンモニウムフルオリドを挙げることができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例1〕 N3−ベンゾイル−2’−O−(2−メトキシカルボニルエチル)3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)ウリジン
文献公知のN3−ベンゾイル−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)ウリジン(1.80 g,3.03 mmol)をtert-ブチルアルコール(15 ml)に溶解させた。その溶液にアクリル酸メチル(5.4 ml,60.2 mmol),炭酸セシウム (489 mg, 1.39 mmol)を加えた。室温で4時間激しく撹拌させた後、反応液をセライトろ過した。溶媒と過剰な試薬を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い、ヘキサン‐酢酸エチル(9:1,v/v)にて溶出させ上記化合物(1.47 g,71%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 0.97‐1.11 (28 H, m), 2.58‐2.60 (2 H, m), 3.62 (3 H, s), 3.88 (1 H, d, J = 4.15), 4.00 (1 H, dd, J = 2.44, 13.67), 4.02‐4.27 (6 H, m), 5.75 (1H, s), 5.77 (1H, d, J = 8.06), 7.48‐7.94 (5 H, m), 8.00 (1H, d, J = 8.06); 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 12.6, 13.0, 13.2, 13.6, 17.0, 17.1, 17.3, 17.4, 17.6, 35.2, 51.7, 59.5, 66.7, 68.2, 81.9, 82.6, 89.2, 101.6, 129.3, 130.7, 131.4, 135.4, 139.3, 149.1, 162.3, 168.9, 171.7. HRMS calcd for C32H48N2O10Si2 (M+H+): 677.2926, Found 677.2931.
〔実施例2〕
2’−O−(2−メトキシカルボニルエチル)3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)ウリジン
3−ベンゾイル−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)ウリジン(1494 mg,2.53 mmol)をtert-ブチルアルコール(15 ml)に溶解させた。その溶液にアクリル酸メチル(5.4 ml,60.2 mmol),炭酸セシウム (489 mg, 1.38 mmol)を加えた。室温で14時間を激しく撹拌させた後、反応液をセライトろ過した。溶媒と過剰な試薬を減圧下留去した。得られた残渣を脱水テトラヒドロフラン (15 ml)に溶解させた。その溶液にノルマル‐プロピルアミン(1.5 ml, 18.0 mmol)を加え1時間撹拌した。溶媒と過剰な試薬を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い、ヘキサン‐酢酸エチル(3:1,v/v)にて溶出させ上記化合物(1030 mg, 71%)を白色泡状物質として得た。
2’−O−(2−メトキシカルボニルエチル)3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)ウリジン
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 0.92‐1.09 (28 H, m), 2.63‐2.67 (2 H, m), 3.68 (3 H, s), 3.83 (1 H, d, J = 4.15), 3.93 (1 H, dd, J = 2.20, 13.43), 4.08‐4.11 (3H, m) 4.13 (1 H, dd, J = 4.15, 9.78), 4.23‐4.21 (1 H, m), 5.66 (1H, d, J = 8.06), 5.73 (1H, s), 7.88 (1H, d, J = 8.06); 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 12.6, 13.0, 13.2, 13.5, 17.0, 17.1, 17.2, 17.3, 17.4, 17.5, 17.6, 35.2, 51.8, 59.5, 66.8, 68.3, 81.7, 82.7, 89.0, 101.6, 139.7, 150.1, 163.9, 171.9.
〔実施例3〕2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)ウリジン
3−ベンゾイル−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)ウリジン(1.80 g,3.03 mmol)をtert-ブチルアルコール(15 ml)に溶解させた。その溶液にアクリル酸メチル(5.4 ml,60.2 mmol),炭酸セシウム (489 mg, 1.39 mmol)を加えた。室温で4時間激しく撹拌させた後、反応液をセライトろ過した。溶媒と過剰な試薬を減圧下留去した。得られた残渣を40%メチルアミン‐メタノール溶液 (30ml)に溶解させ、室温で2時間撹拌した。その後、溶媒並びに過剰な試薬を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い、ヘキサン‐酢酸エチル(4:1‐2:1,v/v)にて溶出させ上記化合物(1.14 g,66%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ 0.94‐1.15 (28 H, m), 2.47‐2.63 (2 H, m), 2.79‐2.81 (3 H, m), 3.85‐4.29 (7 H, m), 5.71‐5.73 (2 H, m), 6.90 (1 H, br), 7.91 (1 H, d, J = 8.06), 9.90 (1H, br); 13C NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 12.5, 13.0, 13.1, 13.6, 16.9, 17.0, 17.1, 17.2, 17.3, 17.4, 17.5, 17.6, 23.0, 26.3, 36.6, 59.4, 67.7, 68.1, 82.0, 82.4, 88.9, 102.0, 139.3, 150.4, 163.8, 172.3. HRMS calcd for C25H45N3O8Si2 (M+H+): 572.2823, Found 572.2826.
〔実施例4〕2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)アデノシン
文献公知の6−N−ジメチルアミノメチレン−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)アデノシン(1.62g, 2.87 mmol)をtert-ブチルアルコール(15 ml)に溶解した。ここにアクリル酸メチル(5.2 mL,58mmol)と炭酸セシウム(94 mg, 0.29 mmol)を加え、室温で激しく20時間攪拌した。反応系をセライトを用いてろ過し、ろ液を減圧下濃縮した。
残渣に40%メチルアミン/エタノール(30 mL)を加え、室温で6時間攪拌し、反応系を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに充填し、クロロホルム:メタノ‐ル(99.5:0.5,v/v)で溶出し、上記化合物を白色固体(1.1g,67%)として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 0.94−1.24 (28 H, m), 2.43−2.47 (1 H, m), 2.65−2.70 (1H, m), 2.82−2.81 (3 H, m), 3.99−4.04 (2 H, m), 4.12−4.22 (4 H, m), 4.61 (1H, dd, J = 4.64, 9.28), 5.87 (2 H, br), 6.01 (1H, s), 7.28−7.29 (1H, br), 8.15 (1 H, s), 8.31 (1H, s); 13C NMR (CDCl3) δ 12.6, 13.0, 13.1, 13.6, 16.9, 17.0, 17.1, 17.2, 17.3, 17.4, 17.5, 17.6, 26.4, 36.7, 59.7, 68.1, 69.0, 81.7, 82.0, 88.8, 120.6, 138.5, 148.9, 153.1, 155.7, 172.1. HRMS calcd for C26H46N6O6Si2 (M+H+): 595.3026, Found 595.3093.
〔実施例5〕2’−O−[2−(メトキシカルボニル)エチル]ウリジン
実施例1で得られた化合物(332 mg,0.50 mmol)を乾燥テトラヒドロフラン(5 mL)に溶解した。ここにn−プロピルアミン(183 μL, 2.2 mmol)を加え、室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣を乾燥テトラヒドロフラン(2 mL)に溶解した。反応系にトリエチルアミン・3フッ化水素(248 μL, 1.54 mmol)とトリエチルアミン(108 μL, 0.77 mmol)を加え室温で一時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに充填し、クロロホルム:メタノール(99:1,v/v)で溶出し、上記化合物(183mg,96%)を得た。
1H NMR (D2O, 500 MHz) δ2.70−2.73 (2H, m), 3.72 (3H, s), 3.80 (1H, dd, J = 4.40, 12.94), 3.90−4.00 (4H, m), 4.12−4.14 (1H, m), 4.17 (1H, m), 4.32 (1H, t, J = 5.37), 5.93 (1H, d, J = 8.06), 5.97 (1H, d, J = 4.40), 7.90 (1H, d, J = 8.06) ; 13C NMR (D2O) δ35.0, 52.8, 61.1, 66.8, 68.9, 82.0, 85.1, 88.1, 102.9, 142.3, 152.0, 166.7, 175.2; HRMS calcd for C13H19N3O7 (M+H+) 331.1141, Found 331.1143.
〔実施例6〕2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]ウリジン
実施例3で得られた化合物(563 mg,0.98 mmol)を乾燥テトラヒドロフラン(2 mL)に溶解し、ここにトリエチルアミン・3フッ化水素( 570 μl, 3.50 mmol), トリエチルアミン(253 μl, 1.80 mmol)を加え、室温で30分間攪拌した。反応系を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄した。水層をDowX (H+ form)に通し溶液を濃縮し、上記化合物(250 mg, 73%)を得た。
1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 2.53−2.57 (2H, m), 2.68−2.72 (3H, m), 3.79 (1H, dd, J = 4.40, 12.94), 3.88−3.98 (3H, m), 4.12−4.17 (2H, m), 4.33 (1H, t, J = 5.40), 5.92 (1H, d, J = 8.30), 5.95 (1H, d, J = 4.64). ; 13C NMR (D2O) δ26.4, 36.5, 61.1, 67.2, 68.9, 81.8, 85.1, 88.2, 102.9, 142.3, 152.0, 166.7, 175.0. ; HRMS calcd for C13H19N3O7 (M+H+) 330.1301, found 330.1307.
〔実施例7〕
2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]アデノシン
実施例4で得られた化合物を191 mg, 0.32 mmol)を乾燥テトラヒドロフラン(3 mL)に 溶解した。ここに、トリエチルアミン・3フッ化水素(182 μl, 1.12 mmol)とトリエチルアミン (81 μl, 0.58 mmol)を加え室温で一時間攪拌した。反応系を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄した結晶をろ取し、上記化合物(44 mg, 39%)を得た。
2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]アデノシン
1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 2.40−2.43 (2H, m), 2.47 (3H, s), 3.71−3.76 (1H, m), 3.86 (1H, dd, J = 3.42, 12.67), 3.92−4.00 (2H, m), 4.34−4.36 (1H, m), 4.58 (1H, dd, J = 2.44, 5.12), 4.61 (1H, dd, J = 5.12, 6.83), 6.09 (1H, d, J = 6.83), 8.29 (1H, s), 8.34 (1H, s).; 13C NMR (D2O) HRMS calcd for C14H20N6O5 (M+Na+) 375.1393, found 375.1347.
〔実施例8〕5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]ウリジン
実施例6で得られた化合物(558 mg, 1.67 mmol)を乾燥ピリジン(8 ml)に溶解し、ここに4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(622 mg, 1.84 mmolを加え、室温で攪拌した。反応系を減圧下濃縮し、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに充填し、0.5%のトリエチルアミンを含むクロロホルム:メタノール(98:2,v/v)で溶出し、上記化合物(749mg,70%)を得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ 2.43−2.61 (2H, m), 2.81 (3H, m), 3.48−3.54 (2H, m), 3.79 (3H, s), 3.90−3.97 (2H, m), 5.23 (1H, d, J = 8.06), 5.86 (1H, br), 5.93 (1H, d, J = 2.93), 6.83−6.86 (4H, m), 7.22−7.39 (9H, m), 7.95 (1H, d, J = 8.06); 13C NMR (CDCl3) δ 26.5, 35.9, 55.4, 62.1, 66.6, 69.2, 82.9, 83.7, 87.2, 87.9, 102.4, 113.4, 127.3, 128.1, 128.3, 130.2, 130.3, 135.3, 135.5, 140.3, 144.5, 150.8, 158.8, 163.6, 172.2; HRMS calcd for C34H37N3O9 (M+Na+) 654.2427, Found 654.2446.
〔実施例9〕2−(N−メチルカルバモイル)エチル基のテトラブチルアンモニウムフルオリドに対する安定性
実施例8で合成した化合物(4 mg,0.01mmol)に1M テトラブチルアンモニウムフルオリド/THF(1 mL)を加え、室温で6日間反応を行った。シリカゲル薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム−メタノール,3:1,v/v)で分析したところ、化合物の分解は起こらず安定に存在することが明らかになった。
実施例8で合成した化合物(4 mg,0.01mmol)に1M テトラブチルアンモニウムフルオリド/THF(1 mL)を加え、室温で6日間反応を行った。シリカゲル薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム−メタノール,3:1,v/v)で分析したところ、化合物の分解は起こらず安定に存在することが明らかになった。
〔実施例10〕5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]ウリジン 3’−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト)
実施例8で得られた化合物(490 mg, 0.77 mmol)を乾燥アセトニトリル(2 mL)に溶解し、乾燥アセトニトリル(2mL)に溶解した2−シアノエトキシ N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト (358 mg, 1.19 mmol)を加えた。ここにジイソプロピルアンモニウム 1Hテトラゾリド (101 mg, 0.59 mmol)を加え、室温で8時間攪拌した。反応を水を加えて停止させて、酢酸エチルで希釈した。有機層を 飽和食塩水で3回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で3回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した後、ろ液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに充填し、0.5%のトリエチルアミンを含むクロロホルム:メタノ‐ル(99:1,v/v)で溶出し、上記化合物(384mg,66%)を得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.03−1.29 (12H, m), 2.42−2.64 (4H, m), 2.77−2.80 (3H, m), 3.43−3.75 (6H, m), 3.79−3.80 (6H, m), 3.86−4.25 (4H, m), 4.48−4.61 (1H, m), 5.21−5.28 (1H, m), 5.90 (1H, m), 6.49 (1H, br), 6.82−6.85 (4H, m), 7.27−7.47 (9H, m), 8.01−8.09 (1H, m); 13C NMR (CDCl3) δ 20.3, 20.4, 20.5, 21.5, 24.5, 24.6, 24.7, 24.6, 24.7, 24.8, 26.3, 36.9, 43.2, 43.3, 45.9, 55.3, 57.8, 58.0, 58.1, 60.5, 60.8, 67.7, 67.8, 69.4, 70.2, 81.8, 81.9, 82.0, 82.1, 82.2, 82.3, 87.0, 87.1, 88.8, 89.1, 102.3, 113.3, 117.6, 117.9, 127.2, 127.3, 128.0, 128.3, 130.3, 135.0, 135.1, 135.2, 140.0, 144.2, 144.3, 150.9, 151.0, 158.7, 158.8, 163.8, 163.9, 171.8, 171.9.; 31PNMR (CDCl3) δ 151.3, 150.5; HRMS calcd for C43H54N5O10P (M+H+) 832.3687, Found 832.3650.
〔実施例11〕オリゴヌクレオチド合成
合成したオリゴヌクレオチドは(U*)12の配列を有する12量体である。ここでU*は2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]ウリジン残基を表わしている。オリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ392オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて1μmolスケールで行った。固相担体にはユニバーサルサポートII(グレンリサーチ社製)を用いた。実施例10にて合成したホスホロアミダイトを乾燥アセトニトリルに0.1Mになるように溶解し、上記オリゴヌクレオチドシンセサイザーに適用した。ホスホロアミダイトの活性化剤に0.25 M 5−ベンジルチオ−1H−テトラゾールを用い縮合時間を10分に延長した以外は、上記シンセサイザーの標準的RNA合成プロトコール(トリチルオン)に従った。オリゴヌクレオチドの鎖伸長終了後、固相担体を2M アンモニア/メタノールに浸し室温で6時間放置した。上澄みを減圧下濃縮し、残渣をC18逆相カートリッジカラムに通し、副生物を除去した。カラムに2%トリフルオロ酢酸水溶液を添加し、ジメトキシトリチル基を除去した後、アセトニトリルを含む蒸留水で目的物を溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、残渣をイオン交換HPLCで精製して目的物を単離収率11%で得た。イオン交換HPLCはGenPak Faxカラムを用い溶離液に25 mM リン酸ナトリウム (pH 6.0)に1M NaClの勾配を1分につき1%の割合で負荷し、カラム温度50℃、流速1mL/分で行った。
〔実施例12〕2−メトキシカルボニル基のテトラブチルアンモニウムフルオリドによる除去
実施例5で合成した化合物(4 mg,0.01mmol)に1M テトラブチルアンモニウムフルオリド/THF(1 mL)を加え、室温で10分間反応を行った。シリカゲル薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム−メタノール,3:1,v/v)で分析したところ、完全にウリジン(Rf値 0.32)に変換されていることを確認した。
実施例5で合成した化合物(4 mg,0.01mmol)に1M テトラブチルアンモニウムフルオリド/THF(1 mL)を加え、室温で10分間反応を行った。シリカゲル薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム−メタノール,3:1,v/v)で分析したところ、完全にウリジン(Rf値 0.32)に変換されていることを確認した。
〔実施例13〕N3−ベンゾイル−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)−2’−O−[2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)カルボニルエチル]ウリジン
文献公知のN3−ベンゾイル−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)ウリジン(591 mg,1 mmol)をtert-ブチルアルコール(5 ml)に溶解させた。その溶液に炭酸セシウム (162 mg, 0.5 mmol)ついでアクリル酸トリフルオロエチル(2.5 ml,20 mmol),を加えた。室温で3時間激しく撹拌させた後、反応液をセライトろ過した。溶媒と過剰な試薬を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い、ヘキサン‐酢酸エチル(5:1,v/v)にて溶出させ上記化合物(387 mg,53%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 0.96‐1.11 (28 H, m), 2.67‐2.69 (2 H, m), 3.62 (3 H, s), 3.90 (1 H, d, J =4.15Hz ), 3.96(1 H, dd, J = 13.4, 2.0 Hz), 4.06(2 H, m), 4.10 (1 H, dd,J = 9.5 Hz, 1.5 Hz), 4.18 (1 H, m), 4.25 (1H,d,J =13.4 Hz),4.40(1H, m), 5.72(1H,s),5.77(1H,d,J = 8.3Hz),7.49(2H,m),7.64(1H,m),7.92(2H,m),7.99(1H,d,J=8.3 Hz)
〔実施例14〕N3−ベンゾイル−2’−O−[2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)カルボニルエチル]ウリジン
実施例13にて合成した、N3−ベンゾイル−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)−2’−O−[2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)カルボニルエチル]ウリジン(1.5 g,2 mmol)をテトラヒドロフラン(8 ml)に溶解させた。その溶液にトリエチルアミン (780 μL, 3.5 mmol)ついでトリエチルアミン・3フッ化水素(1.1 ml,7 mmol)を加えた。室温で30分撹拌させた後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い、クロロホルム‐メタノール(100:1,v/v)にて溶出させ上記化合物(803 mg,80%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 3.79−2.65 (3 H, m),3.70 (1 H, s), 4.13−3.80 (6 H, m),4.34 (1 H, t, J = 0.01),4.52−4.49 (2 H, m),5.82−5.77 (2 H, m), 7.52−7.48 (1 H, m),7.68−7.64 (1 H, m),7.94−7.92 (1H, m),7.97 (1 H, d, J =0.03).
〔実施例15〕N3−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)カルボニルエチル]ウリジン
実施例14にて合成した、N3−ベンゾイル−2’−O−[2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)カルボニルエチル]ウリジン(750 mg,1.5 mmol)を乾燥ピリジン(15 ml)に溶解させた。その溶液に4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(763 mg,2.3 mmol)を加えた。室温で1.5時間撹拌させた後、反応を水を加えて停止させた。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いヘキサン−クロロホルム(1:1,v/v)にて溶出させ上記化合物(750 mg,62%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ2.52−2.79(2H,m),3.57(2H,m),3.81(6H,s),3.90−3.96(1H,m),3.99−4.08(2H,m),4.13−4.17(1H,m),4.44−4.59(2H,m),5.37(1H,d,J=8.3 Hz),5.92(1H,m),6.86(4H,d,J=8.79Hz),7.30−7.34(7H,m),7.40(2H,m),7.50(2H,m),7.65(1H,m),7.95(2H、m),8.16(1H,d,J =8.3 Hz)
〔実施例16〕5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[2−(N,N−ジメチルカルバモイル)エチル]ウリジン
実施例15にて合成した、N3−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)カルボニルエチル]ウリジン(120 mg,0.15 mmol)に2 M ジメチルアミン/テトラヒドロフラン(4 mL)を加え、室温で15時間撹拌させた後、40℃で2時間反応を行った。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いクロロホルムにて溶出させ上記化合物(80 mg,83%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 2.43(1H,d,J =17.1 Hz),2.78(1H,ddd,J = 3.2 Hz,10.8 Hz,17.1 Hz),2.97(3H,s),3.01(3H,s),3.45(1H,dd,J=2.2 Hz,10.7Hz),3.52(1H,dd,J = 2.7 Hz,10.7 Hz),3.79 (3H,s),3.89(1H,m),3.99(1H,t,J=4.2 Hz),4.10(2H,m),4.58(1H,dd,J =5.9 Hz,10.7 Hz),5.28(1H,d,J=8.1 Hz),5.35(1H,d,J=6.6 Hz),5.96(1H,d,J=3.7 Hz),6.83(4H,d,J= 8.5 Hz),7.23−7.29(7H,m),7.39(2H,m),7.92(1H,d,J=8.30 Hz),8.72(1H,br).
〔実施例17〕2−(N,N−ジメチルカルバモイルエチル)基のテトラブチルアンモニウムフルオリドによる除去
実施例16で合成した化合物(6 mg,0.01mmol)に1M テトラブチルアンモニウムフルオリド/THF(1 mL)を加え、室温で2時間反応を行った。シリカゲル薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム−メタノール,10:1,v/v)で分析したところ、完全に5’−O−ジメトキシトリチルウリジン(Rf値 0.50)に変換されていることを確認した。
実施例16で合成した化合物(6 mg,0.01mmol)に1M テトラブチルアンモニウムフルオリド/THF(1 mL)を加え、室温で2時間反応を行った。シリカゲル薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム−メタノール,10:1,v/v)で分析したところ、完全に5’−O−ジメトキシトリチルウリジン(Rf値 0.50)に変換されていることを確認した。
〔実施例18〕6‐N−アセチル‐2‘−O−(2−メチルアミノカルボニルエチル)−5’−O−ジメトキシトリチルアデノシン
実施例4にて合成した、2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]−3’,5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)アデノシン(7.20 g,12.12 mmol)を無水ピリジン(120 ml)に溶解させた。その溶液に塩化アセチル(1 ml,14.0 mmol)を加えた。室温で5時間撹拌させた後、反応液にメタノールを加えて反応を停止した。溶媒と過剰な試薬を減圧下留去した。得られた残渣をクロロホルムで希釈し飽和食塩水、及び飽和炭酸水素ナトリウムにて洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後ろ過した。溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を無水THFに溶解させ、トリエチルアミン3フッ化水素(6.9ml、42.37mmol),トリエチルアミン(3 ml,21.93 mmol)を加え室温で1時間撹拌した。その後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させ、クロロホルム‐メタノール(100:0‐98:2‐96:4,v/v)にて粗精製を行った。得られた残渣を無水ピリジンにて4回共沸脱水を行い、無水ピリジン100mlに溶解させた。反応液にジメトキシトリチルクロリド(4.1g,12.13 mmol)を加えて室温にて1時間撹拌した。その後、メタノールを加えて反応を停止し溶媒を減圧留去した。
得られた残渣をクロロホルムに溶解させ飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥させた。溶媒を減圧下留去し得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させた。クロロホルム‐メタノール(99:1-98:2-97:3,v/v,0.5%トリエチルアミン)にて溶出させ上記化合物(4.67 g,55%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 2.29‐2.47 (2 H, m), 2.51 (3 H, s), 2.73-2.74 (3 H, m), 3.33-3.40 (2 H, m), 3.66-3.71 (7 H, m), 3.94-3.99 (1 H, m), 4.21-4.24 (1 H, m), 4.54-4.63 (3 H, m), 5.87‐5.90 (1 H, m), 6.05 (1 H, d, J = 5.62), 6.71-6.73 (4H,m), 7.12-7.36 (9H,m), 8.10 (1H,s), 8.51 (1H,s), 8.73 (1H, br)
〔実施例19〕6‐N−アセチル‐2’−O−(2−メチルアミノカルボニルエチル)−5’−O−ジメトキシトリチルアデノシン 3’−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト)
6‐N−アセチル‐2’−O−(2−メチルアミノカルボニルエチル)−5’−O−ジメトキシトリチルアデノシン(1.48 g,2.12 mmol)を無水トルエンにて3回共沸脱水を行い、アルゴン置換した。無水ジクロロメタンに溶解させジイソプロピルエチルアミン(555 μl,3.18 mmol)、2−シアノエチル‐N,N−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン(551 mg, 2.33 mmol)を無水ジクロロメタン(1ml)溶液として反応系に加えた。室温で2時間撹拌した後、クロロホルムで希釈し飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させ、クロロホルム‐メタノール(100:1‐99:1,v/v,0.5%トリエチルアミン)にて溶出させ上記化合物(1107 mg, 58%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.04‐1.18 (12 H, m), 2.31‐2.70 (10 H, m), 3.34‐3.37 (1 H, m), 3.51‐4.05 (17 H, m), 4.33‐4.41 (1 H, m), 4.57‐4.68 (1 H, m), 6.15‐6.16 (1 H, m), 6.42−6.43 (1 H, m), 6.77−6.81 (4 H, m), 7.18‐7.42 (9 H, m), 8.26‐8.30 (1H,m), 8.60‐8.62 (1H,m), 8.97 (1H,br), 8.51 (1H,s), 8.73 (1H, br)
〔実施例20〕合成したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション能評価
実施例11にて合成したオリゴヌクレオチドとその相補鎖RNAであるアデニル酸12量体(AAAAAAAAAAAA)とのTmを測定した。各オリゴヌクレオチドの濃度が2μMになるように、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0) -0.1 M NaCl中に溶解した。この溶液を70度に温め15分間保った後、1分1度の割合で5度まで冷却し、再度同じ速度で70度まで加熱した。この間の260nmでのUV吸収を測定してUV-融解曲線を得た。得られたUV融解曲線を微分し、極大値をあたえる温度をTm値とした。
Tm値は26 ℃であった。
一方、比較のために測定したウリジル酸12量体とアデニル酸12量体とのTmは14℃であり、実施例11で合成したオリゴヌクレオチドは天然型オリゴヌクレオチドよりも高いハイブリダイゼーション能を有していることが明らかとなった。
実施例11にて合成したオリゴヌクレオチドとその相補鎖RNAであるアデニル酸12量体(AAAAAAAAAAAA)とのTmを測定した。各オリゴヌクレオチドの濃度が2μMになるように、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0) -0.1 M NaCl中に溶解した。この溶液を70度に温め15分間保った後、1分1度の割合で5度まで冷却し、再度同じ速度で70度まで加熱した。この間の260nmでのUV吸収を測定してUV-融解曲線を得た。得られたUV融解曲線を微分し、極大値をあたえる温度をTm値とした。
Tm値は26 ℃であった。
一方、比較のために測定したウリジル酸12量体とアデニル酸12量体とのTmは14℃であり、実施例11で合成したオリゴヌクレオチドは天然型オリゴヌクレオチドよりも高いハイブリダイゼーション能を有していることが明らかとなった。
〔実施例21〕2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]−3’−5’−O−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)シチジン
4−ジメチルホルムアミジニル−3’,5’−O−(1,1,3,3,−テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル)シチジン(6.64 mg,12.3 mmol)をtert-ブチルアルコール(120 ml)に溶解させた。その溶液にアクリル酸メチル(23 ml, 246 mmol)、炭酸セシウム(1.95 mg, 1.20 mmol)を加えた。室温で4時間激しく攪拌させた後、反応液をセライトろ過した後、溶媒と過剰な試薬を減圧下留去した。得られた残渣を40%メチルアミン・メタノール溶液(120 ml)に溶解させ、室温で10時間攪拌した。その後、溶媒と過剰な試薬を減圧留去した。反応生成物をNH−シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、クロロホルム−メタノール溶液(99:1−95:5,v/v)にて溶出させ、上記化合物(2.50 g, 4.30 mmol)を白色泡状物質として得た。
1H NMR(CDCl3, 500 MHz)σ0.86−1.06(28 H, m),2.33−2.38(2 H, m),2.58−2.64(2 H, m),2.74−2.75(3 H, d),3.84−4.22(7 H, m),5.64(1 H, s),5.78−5.79(1 H, d),7.29−7.31(1 H, dd),7.84−7.86(1 H, d)
〔実施例22〕2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]−シチジン
実施例21にて得られた化合物(1.55 g, 2.72 mmol)を乾燥テトラヒドロフラン(15 ml)に溶解させた。その溶液にトリエチルアミン・3フッ化水素(1.55 ml, 1.65 mmol)を加え、室温で1時間激しく攪拌させた。溶媒と過剰な試薬を減圧下留去し、反応生成物をNH−シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、クロロホルム−メタノール溶液(80:20−70:30,v/v)にて溶出させ上記化合物(600 mg, 1.82 mmol)を得た。
1H NMR(DMSO, 500 MHz)σ2.35−2.45(2 H, m),2.59−2.60(3 H, d),3.57−3.61(1 H, m),3.67−3.69(1 H, s),3.73−3.81(2 H, m),3.83−3.85(2 H, m),5.15−5.16(2 H, d),5.73−5.76(1 H, d),5.83−5.84(1 H, d)7.21−7.23(2 H, d),7.90−7.93(2 H, m)
〔実施例23〕2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]−4−N−アセチルシチジン
実施例22にて得られた化合物(614 mg, 1.87 mmol)をエタノール(10 ml)に溶解させた。その溶液に無水酢酸(300 μl, 3.67 mmol)を加え、還流条件下80℃で2時間激しく攪拌させた。溶媒と過剰な試薬を減圧下留去し、エタノールと酢酸エチルを用いて再沈殿を行い、上記化合物(625 mg, 1.69 mmol)を得た。
1H NMR(DMSO, 500 MHz)σ2.09(3 H, s),2.33−2.39(2 H, m),2.55−2.56(3 H, d),3.63−4.08(m),5.21−5.26(2 H, m),5.79−5.80(1 H, d),7.17−7.19(1 H, d),7.85−7.80(1 H, t),8.41−8.43(1 H, d),10.86(1 H, s)
〔実施例24〕5'−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]−4−N−アセチルシチジン
実施例23にて得られた化合物(550 mg, 1.48 mmol)を乾燥ピリジン(15 ml)に溶解させた。その溶液に4,4'−ジメトキシトリチルクロリド(552 mg, 1.63 mmol)を加え、室温で2時間激しく攪拌させた。少量の水で反応を停止させた後、反応系を減圧下濃縮し、クロロホルムで希釈後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、クロロホルム:メタノール:トリエチルアミン(98:1.5:0.5)にて溶出し、上記化合物(445 mg, 1.00 mmol)を得た。
1H NMR(CDCl3, 500 MHz)σ2.08(1 H, s),2.18(3 H, s),2.39−2.43(1 H, m),2.53−2.61(1 H, m),2.75−2.76(3 H, d),3.54−3.55(2 H, d),3.79−3.80(6 H, m),3.92−3.93(1 H, d),4.00−4.15(3 H, m),4.45−4.49(2 H, m)
5.89(1 H, s),6.52(1 H, s),6.83−6.85(3 H, d),7.10−7.11(1 H, s),7.23−7.41(8 H, m)8.47−8.49(1 H, d),9.49(1 H, s)
5.89(1 H, s),6.52(1 H, s),6.83−6.85(3 H, d),7.10−7.11(1 H, s),7.23−7.41(8 H, m)8.47−8.49(1 H, d),9.49(1 H, s)
〔実施例25〕5'−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]−4−N−アセチルシチジン 3’−(2−シアノエチル N,N’−ジイソプロピルホスホロアミダイト)
実施例24にて得られた化合物(480 mg, 0.71 mmol)を乾燥アセトニトリル(2 ml)に溶解させた。その溶液に乾燥アセトニトリル(2 ml)に溶解させた2−シアノエトキシ N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(343 μl, 1.07 mmol)を加え、さらにジイソプロピルアンモニウム 1Hテトラゾリド(92 mg, 0.54 mmol)を加えた。室温で15時間激しく攪拌させた。少量の水で反応を停止させた後、反応系を減圧下濃縮し、クロロホルムで希釈後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、クロロホルム:メタノール:トリエチルアミン(98:1.5:0.5)にて溶出し、上記化合物(300 mg, 0.34 mmol)を得た。
1H NMR(CDCl3, 500 MHz)σ0.99−1.23(14 H, m),2.22-2.36(3 H, m),2.37−2.41(2 H, m),2.58−2.78(5 H, m),3.45−3.79(13 H, m),3.97−4.26(4 H, m),4.40−4.54(1 H, m),5.89−5.90(1 H, d),6.82−7.43(20 H, m),8.52−8.60(1 H, m),10.13−12.16(1 H, d)
〔実施例26〕オリゴリボヌクレオチド合成
合成したオリゴヌクレオチドは、(A*)12の配列を有する12量体である。ここで、A*は2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル]アデノシン残基を表している。実施例19にて合成したホスホロアミダイトを用いて、実施例11と同様の方法で合成し、目的化合物を得た。
〔実施例27〕酵素耐性
実施例11で得られたオリゴヌクレオチド(50 μmol)を、50 mM トリス塩酸バッファー(990 μl, pH 8.5, 72 mM 塩化ナトリウム, 14mM 塩化マグネシウム)に溶解させた。次に、50 mM トリス塩酸バッファー(10 μl, pH 8.5, 72 mM 塩化ナトリウム, 14mM 塩化マグネシウム)に溶解させたスネークベノムホスホジエステラーゼ(シグマアルドリッチ社製)(2.5 μg, 5×10−4 unit)を加え、37℃で反応させた。0℃で酵素反応を停止させた後、反応液を純水で薄めた。陰イオン交換クロマトグラフィーにて、完全長のオリゴヌクレオチドが残る割合を分析した。5分後では94%、10分後では95%、20分後では87%、40分後では78%、80分後では60%、160分後では41%のオリゴが完全長で残存していた。
実施例11で得られたオリゴヌクレオチド(50 μmol)を、50 mM トリス塩酸バッファー(990 μl, pH 8.5, 72 mM 塩化ナトリウム, 14mM 塩化マグネシウム)に溶解させた。次に、50 mM トリス塩酸バッファー(10 μl, pH 8.5, 72 mM 塩化ナトリウム, 14mM 塩化マグネシウム)に溶解させたスネークベノムホスホジエステラーゼ(シグマアルドリッチ社製)(2.5 μg, 5×10−4 unit)を加え、37℃で反応させた。0℃で酵素反応を停止させた後、反応液を純水で薄めた。陰イオン交換クロマトグラフィーにて、完全長のオリゴヌクレオチドが残る割合を分析した。5分後では94%、10分後では95%、20分後では87%、40分後では78%、80分後では60%、160分後では41%のオリゴが完全長で残存していた。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願(特願2006-063358号)の明細書に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (12)
- 一般式(I):
で示される基を表し、R3は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体。 - 一般式(I)においてR3が、メチル基又は2,2,2−トリフルオロエチル基を表す、請求項1に記載のリボヌクレオシド誘導体。
- 一般式(II):
で示される基を表し、R4及びR5は同一又は異なって水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体。 - 一般式(II)においてR4及びR5が、メチル基を表す、請求項3に記載のリボヌクレオシド誘導体。
- 一般式(II)においてR4及びR5の少なくとも一方が、水素原子を表す、請求項3に記載のリボヌクレオシド誘導体。
- 一般式(IV):
で示される基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体を、一般式(V):
で表されるアクリル酸エステルと反応させ、一般式(I):
で表されるリボヌクレオシド誘導体を得ることを特徴とする、リボヌクレオシド誘導体の製造方法。 - 一般式(I)においてR3が、メチル基又は2,2,2−トリフルオロエチル基を表す、請求項6に記載のリボヌクレオシド誘導体の製造方法。
- 一般式(VI):
で示される基、又は一般式(VIII):
で示される基を表し、X2はnの繰り返しにおいて異なっていてもよく、nは1以上の整数を表す。但し、X1、X2、及びX3の少なくとも一つは一般式(VII)又は(VIII)で示される基を表す。〕
で表される核酸誘導体。 - 一般式(VII)においてR3が、メチル基又は2,2,2−トリフルオロエチル基を表す、請求項8に記載の核酸誘導体。
- 一般式(VIII)においてR4及びR5が、メチル基を表す、請求項8に記載の核酸誘導体。
- 一般式(VIII)においてR4及びR5の少なくとも一方が、水素原子を表す、請求項8に記載の核酸誘導体。
- 一般式(I):
で示される基を表し、R3は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し、Bは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。〕
で表されるリボヌクレオシド誘導体、若しくは一般式(II):
で表されるリボヌクレオシド誘導体、又はこれらのリボヌクレオシド誘導体を構成成分として含み、一般式(VI):
で示される基、又は一般式(VIII):
で示される基を表し、X 2 はnの繰り返しにおいて異なっていてもよく、nは1以上の整数を表す。但し、X 1 、X 2 、及びX 3 の少なくとも一つは一般式(VII)又は(VIII)で示される基を表す。〕
で表される核酸誘導体をフッ化物イオンを含む試薬で処理し、対応する一般式(IV):
で表されるリボヌクレオシド誘導体、又はそれらを構成成分として含む核酸誘導体を得る方法。
以上
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