KR20160145828A - 열 불안정성 모이어티를 포함하는 화합물 조성물 및 방법 - Google Patents

열 불안정성 모이어티를 포함하는 화합물 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물 및 조성물의 제조 방법 및 상기 화합물 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 구조식 XO-CH2-SM-B-A의 화합물에 관한 것이다. 치환기 X는 H, 산 불안정성 보호 그룹, 고체 지지체, -P(O-R1)NR2R3, -P(O)(OH)H, -P(O)(OR1)H, -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이다. 치환기 R1은 CNE(즉, 사이아노에틸), 알킬, 또는 헤테로알킬이고, R2 및 R3는 독립적으로 알킬이다. 치환기 SM은 천연 퓨라노실이 아닌 당 모이어티(sugar moiety) 또는 이의 유사체이고, B는 염기 모이어티 또는 이의 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR4의, 염기 모이어티 상의 또는 내의 질소에 부착되는 모이어티이며, 여기서 R4는 삼차 알킬이다

Description

열 불안정성 모이어티를 포함하는 화합물 조성물 및 방법 {COMPOUNDS COMPOSITIONS AND METHODS INCLUDING THERMALLY LABILE MOIETIES}
본 발명은 일반적으로 하나 이상의 열 불안정성 모이어티를 포함하는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물 및 조성물의 제조 방법 및 상기 화합물 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
온화한 조건 하에서 제거될 수 있는 분자 모이어티는 광범위한 화합물의 합성 및 작용과 관련하여 중요하다. 이에 따라 과학자들은 그러한 화합물의 발견 및 사용에 관한 실질적인 연구를 수행하였으며, 이는 복잡한 합성 방법에서 사용되는 보호 그룹에 관한 연구를 포함한다.
예를 들어, 1997년 3월 25일, 발명의 명칭이, "뉴클레오사이드-아미노 보호 그룹으로서 5-펜텐오일 모이어티, 4-펜텐오일-보호된 뉴클레오타이드 신톤, 및 관련된 올리고뉴클레오타이드 합성"인 미국 특허 제5,614,622호가 발행되었다. 상기 특허의 논의되는 발명은 다음에 관한 것이다: "본 발명은 종래의 방법보다 더욱 온화한 조건 하에서 올리고뉴클레오타이드의 탈보호를 가능하게 하는 올리고뉴클레오타이드의 새로운 합성 방법을 제공한다. 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 합성 조건 하에서 안정하지만, 종래의 보호 그룹 보다 더욱 온화한 조건 하에서 제거될 수 있는 뉴클레오사이드 염기 보호 그룹, 뿐만 아니라, 그러한 염기 보호 그룹을 가지는 뉴클레오사이드 신톤을 또한 제공한다." 요약.
또 다른 예로, 2004년 7월 13일, 발명의 명칭이, "열불안정성 인 보호 그룹(thermolabile phosphorus protecting groups), 관련 중간체 및 사용 방법"인 미국 특허 제6,762,298호가 발행되었다. 상기 특허의 논의되는 발명은 다음에 관한 것이다: "본 바렴ㅇ은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드 간의(internucleosideic) 인 결합(phosphorus linkage)을 열적으로 탈보호하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하기 위해 실질적으로 중성인 pH의 액체 매질에서 보호된 올리고뉴클레오타이드를 가열하는 것을 포함한다. 본 발명은 상기 기재된 열적 탈보호 방법을 사용하는 올리고뉴클레오타이드 합성 방법, 및 본 발명에 따라 사용되는 열불안정성 보호 그룹을 포함하는 신규의 올리고뉴클레오타이드 및 중간체를 또한 제공한다." 요약.
또 다른 예로, 2008년 4월 8일, 발명의 명칭이, "열불안정성 하이드록실 보호 그룹 및 사용 방법"인 미국 특허 제7,355,037호가 발행되었다. 상기 특허의 논의되는 발명은 다음에 관한 것이다: "화학식 R--O--Pg의 하이드록실-보호된 알코올이 제공되며, 여기서 Pg는 화학식의 보호 그룹이다:
Figure pct00001
여기서 Y, Z, W, R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, a, b, c, d, e 및 f는 본 발명에 정의되고, R은 뉴클레오사이드 그룹, 2 내지 약 300 개의 뉴클레오사이드를 가지는 올리고뉴클레오타이드 그룹, 또는 2 내지 약 300 개의 뉴클레오사이드를 가지는 올리고머이다. 또한, 하이드록실-보호된 알코올을, 이로부터 열적으로 하이드록실-보호 그룹을 분해하기에 효과적인 온도에서 가열하는 것을 포함하는 탈보호 방법이 제공된다." 요약.
또 다른 예로, 2012년 3월 13일, 발명의 명칭이, "핵산의 열적 개시 증폭을 위한 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드 5'-트리포스페이트"인 미국 특허 제8,133,669호가 발행되었다. 상기 특허의 논의되는 발명은 다음에 관한 것이다: "핵산 복제를 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법은 핵산 복제 반응에서 3'-치환된 뉴클레오사이드 5 '-트리포스페이트 또는 3 '-치환된 말단 프라이머의 사용을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 핵산 복제에 유용성을 제공하는 3 '-치환된 NTP 및/또는 3 '-치환된 말단 프라이머의 사용에 의해 달성된다. 바람직한 구체예에서, NTP 및/또는 프라이머는 3 '-위치에 특정의 가열 불안정성 화학적 그룹, 예로서 에터, 에스터 또는 카보네이트 에스터로 치환된다." 요약.
이러한 연구가 온화한 조건 하에서 제거될 수 있는 분자 모이어티 상에서 수행되었지만, 기술 분야 내에는 새로운 분자 모이어티, 뿐만 아니라 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 구조식 XO-CH2-SM-B-A의 화합물에 관한 것이다. 치환기 X는 H, 산 불안정성 보호 그룹, 고체 지지체, -P(O-R1)NR2R3, -P(O)(OH)H, -P(O)(OR1)H, -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이다. 치환기 R1은 CNE, 알킬, 또는 헤테로알킬이고, R2 및 R3는 독립적으로 알킬이다. 치환기 SM은 천연 퓨라노실이 아닌 당 모이어티(sugar moiety) 또는 이의 유사체이고, B는 염기 모이어티 또는 이의 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR4의, 염기 모이어티 상의 또는 내의 질소에 부착되는 모이어티이며, 여기서 R4는 삼차 알킬이다.
도 1은 중합체 (예컨대, DNA 올리고머)를 합성하기 위해 사용되는 기기의 개략도이다.
발명은 일반적으로 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹(thermally labile protecting group)을 포함하는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물 및 조성물의 제조 방법 및 상기 화합물 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
"링커"("linker")는 일반적으로 양쪽 말단이 친전자성 또는 친핵성 기능성 그룹 중 하나로 종결되는, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 이러한 기능성 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: -C(O)-, -C(O)N(H)-, -C(O)N(R21)-, -C(O)O-, -N(R22)-, -O-, -S-, 여기서 R21 및 R22는, 독립적으로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴. 링커의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:; -C(O)CH2OC6H5OCH2C(O)-, -C(O)-(CH2)n-C(O) 여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고; -C(O)-(CH2)n-N(H)- 여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고; -C(O)-(CH2)n-O- 여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고; -N(H)-(CH2)n-N(H)- 여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
"표지"("label")는 (예컨대, 광학적, 전자적, 자기적, 및 화학적으로) 검출될 수 있는 모이어티이다. 표지 카테고리의 비제한적 예로는 다음을 포함한다: 형광 염료; 형광 ??칭 분자; 금속 배위를 위한 킬레이트제; 막 가용화제 (예컨대, 콜레스테롤); 삽입용 제제 (예컨대, 아크리딘); DNA 마이너 그루브 결합제; 및, 아자이드 및 알카인 (예컨대, 클릭 화학).
형광 염료 유형의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: 아크리딘 염료; 사이아닌 염료 (예컨대, SYBR green); 플루오론 염료 (예컨대, 플루오레세인); 옥사진 염료 (예컨대, Nile blue, Nile red); 페난트리딘 염료; 및 로다민 염료 (예컨대, Texas Red). 형광 염료의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: FAM; TET; Alexa Fluor 488; CAL Fluor Gold 540; HEX; CAL Fluor Orange 560; Quasar 470; 5-TAMRA; CA L Fluor Red 590; Cy3; T(Rox); CAL Fluor Red 610; CAL Fluor Red 635; T(JOE); Cy5; Quasar 670; Quasar 705.
형광 ??칭 분자의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: BHQ-1; BHQ-2; DABCYL; Pulsar 650.
"고체 지지체"는 고상 중합체 합성에 사용되는 물질이다. 일반적으로 단량체는, 직접적으로 또는 링커를 통해, 고체 지지체에 공유적으로 결합하며, 중합체 사슬은 다른 단량체의 후속적인 첨가를 통해 고체 지지체 상에서 성장한다. 올리고뉴클레오타이드 합성은 비-팽윤성 또는 저-팽윤성 고체 지지체 상에서 가장 잘 진행한다. 올리고뉴클레오타이드 합성에 가장 많이 사용되는 고체 지지체는 제어된 공극 유리 (controlled pore glass, CPG) 및 폴리스타이렌 (예컨대, 거대 기공 폴리스타이렌).
"인 함유 모이어티"("phosphorus containing moiety")는 적어도 하나의 인 원자를 포함하는 화학적 그룹이다. 인 함유 모이어티의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: -P(OR23)NR24R25; -P(=O)(OR23)NR24R25; -P(OH)2; -P(OR23)OH; -P(O)(OR23)OH; -P(O)(OH)2; -P(O)(OH)OP(O)(OH)2; -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2; -P(S)(OH)2; 및 상기 화합물의 염. R23은 알킬 (예컨대, -CH3), 치환된 알킬 (예컨대, -CH2CH2-EWG, 여기서 "EWG"는 -CN 또는 -Ph-NO2와 같이 전자 끄는 그룹임), 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 또는 치환된 헤테로아릴이다. R24 및 R25는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 또는 치환된 헤테로아릴이거나; 또는 결합하여 사이클릭, 접합된, 접합된 사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
인 시약에 관한 논의는 다음을 참조한다: Beaucage, S.L.; Caruthers M.H. (1981). "Deoxynucleoside phosphoramidites― A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis". Tetrahedron Letters 22: 1859-1862; Lin, K.-Y., Matteucci, M. D. (1998). "A cytosine analog capable of clamp-like binding to a guanine in helical nucleic acids". J. Amer. Chem. Soc. 120 (33): 8531-8532; Nielsen, J.; Marugg, J. E.; Taagaard, M.; Van Boom, J. H.; Dahl, O. (1986). "Polymer-supported synthesis of deoxyoligonucleotides using in situ prepared deoxynucleoside 2-cyanoethyl phosphoramidites". Rec. Trav. Chim. Pays-Bas 105 (1): 33-34; Nielsen, J.; Taagaard, M.; Marugg, J. E.; Van Boom, J. H.; Dahl, O. (1986). "Application of 2-cyanoethyl Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraisopropylphosphorodiamidite for in situ preparation of deoxyribonucleoside phosphoramidites and their use in polymer-supported synthesis of oligodeoxyribonucleotides". Nucl. Acids Res. 14 (18): 7391-7403; Nielsen, J.; Marugg, J. E.; Van Boom, J. H.; Honnens, J.; Taagaard, M.; Dahl, O. (1986). "Thermal instability of some alkyl phosphorodiamidites". J Chem Res. Synopses (1): 26-27; Nielsen, J.; Dahl, O. (1987). "Improved synthesis of 2-cyanoethyl Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraisopropylphosphorodiamidite (iPr2N)2POCH2CH2CN)". Nucl. Acids Res. 15 (8): 3626; Beaucage, S. L. (2001). "2-Cyanoethyl Tetraisopropylphosphorodiamidite". e-EROS Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis; Sinha, N. D.; Biernat, J.; Koester, H. (1983). "β-Cyanoethyl N,N-dialkylamino/N-mo holinomonochloro phosphoamidites, new phosphitylating agents facilitating ease of deprotection and work-up of synthesized oligonucleotides". Tetrahedron Lett. 24 (52): 5843-5846; Marugg, J. E.; Burik, A.; Tromp, M.; Van der Marel, G. A.; Van Boom, J. H. (1986). "A new and versatile approach to the preparation of valuable deoxynucleoside 3 '-phosphite intermediates". Tetrahedron Lett. 24 (20): 2271-22274; Guzaev, A. P.; Manoharan, M. (2001). "2-Benzamidoethyl group - a novel type of phosphate protecting group for oligonucleotide synthesis". J. Amer. Chem. Soc. 123 (5): 783-793; Sproat, B.; Colonna, F.; Mullah, B.; Tsou, D.; Andrus, A.; Hampel, A.; Vinayak, R. (Feb 1995). "An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides". Nucleosides & Nucleotides 14 (1&2): 255-273; Stutz, A.; Hobartner, C; Pitsch, S. (Sep 2000). "Novel fluoride-labile nucleobase-protecting groups for the synthesis of 3'(2')-O-amino-acylated RNA sequences". Helv. Chim. Acta 83 (9): 2477-2503; Welz, R.; Muller, S. (Jan 2002). "5-(Benzylmercapto)-lH-tetrazole as activator for 2'-O-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis". Tetrahedron Letters 43 (5): 795-797; Vargeese, C; Carter, J.; Yegge, J.; Krivjansky, S.; Settle, A.; Kropp, E.; Peterson, K.; Pieken, W. (1998). Nucl. Acids Res. 26 (4): 1046-1050; Gacs-Baitz, E.; Sipos, F.; Egyed, O.; Sagi, G. (2009). "Synthesis and structural study of variously oxidized diastereomeric 5'-dimethoxytrityl-thymidine-3,-O-[0-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl]-phosphoramidite derivatives. Comparison of the effects of the P=O, P=S, and P=Se functions on the NMR spectral and chromatographic properties.". Chirality 21 (7): 663-673; M. J.; Ogilvie, K. K. (1980). "Phosphoramidate analogs of diribonucleoside monophosphates.". Tetrahedron Lett. 21 (43): 4153―4154; Wilk, A.; Uznanski, B.; Stec, W. J. (1991). "Assignment of absolute configuration at phosphorus in dithymidylyl(3',5')phosphormorpholidates and -phosphormorpholidothioates.". Nucleosides & Nucleotides 10 (1-3): 319-322. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
"보호 그룹"은 합성 조작 동안 반응성 기능성 그룹을 마스킹하기 위해 일반적으로 사용되는 화학적 모이어티이다. 보호 그룹의 비제한적인 카테고리는 다음을 포함한다: 산 불안정성 보호 그룹; 염기 불안정성 보호 그룹; 환원적 불안정성 보호 그룹; 광 불안정성 보호 그룹; 및, 열 불안정성 보호 그룹.
산 불안정성 보호 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: 트리틸; 모노메톡시트리틸; 4,4'-다이메톡시트리틸 (DMT); β-메톡시에톡시메틸 에터 (MEM); 메톡시메틸 에터 (MOM); 메틸싸이오메틸 에터; 테트라하이드로피란일 (THP); 4-메톡시테트라하이드로피란-4-일; 테트라하이드로퓨란일 (THF); tert -뷰틸옥시카본일 (Boc); 실릴 에터 (예컨대, 트리메틸실릴 (TMS), tert -뷰틸다이메틸실릴 (TBDMS), 트리아이소프로필실릴옥시메틸 (TOM). 실릴 에터는 또한 플루오라이드 이온 불안정성이다.
염기 불안정성 보호 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: 벤조일 및 다른 아릴카복실레이트 유도체; 아세틸렌 및 다른 알킬카복실레이트 유도체; 알킬- 또는 아릴옥시아세테이트; 트리할로아세테이트; 다이할로아세테이트; 아실옥시메틸 에터; 플루오렌일메틸옥시카본일 (FMOC); 사이아노에틸; -CH2CH2-EWG와 같이 치환된 알킬 그룹, 여기서 "EWG"는 -PhNO2 또는 -C(O)-과 같은 전자 끄는 그룹임; 사이아노에틸옥시카본일.
환원적 불안정성 보호 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: 벤질 및 치환된 유사체; 벤질옥시카본일 (Z); 알릴옥시카본일. 광 불안정성 보호 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: o-나이트로벤질 에터 및 치환된 유도체; o-나이트로벤질카바메이트. 열 불안정성 보호 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: tert-뷰틸옥시에틸 에터 (하이드록실 그룹); 4-옥소알킬 에스터; 3-아실아미노프로필에스터; 4-카복시프로필에스터의 아마이드 및 에스터; 5-알킬싸이오알킬 에스터.
"알킬"은 일반 화학식 CnH2n +1을 가지는 화학적 모이어티이다. 알킬 그룹은 일반적으로 다음의 카테고리이다: 저급 알킬; 고급 알킬; 사이클릭 알킬; 및, 분지형 알킬이다. 저급 알킬 그룹은 6 개 이하의 탄소 원소를 가진다. 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: 메틸; 에틸; 프로필; 뷰틸; 및 펜틸. 고급 알킬은 7 개 이상의 탄소 원소를 가진다. 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: 헵틸; 옥틸; 노닐. 사이클릭 알킬은 고리 구조를 형성하는 알킬이며 화학식 CnH2n -1.이다. 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: 사이클로프로필; 사이클로뷰틸; 사이클로펜틸; 및 사이클로헥실. 분지형 알킬은 하나 이상의 수소 원소가 알킬 그룹으로 치환된 알킬 사슬 (즉, 선형)이다. 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: iso-프로필; sec-뷰틸; 및 tert -뷰틸.
"헤테로알킬"은 하나 이상의 탄소 원소가 헤테로원자 (예컨대, O, S, NH)로 대체된 알킬이다. 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: -CH2OCH3; -CH2CH2OCH3; -NC4H8O (모폴리노).
"치환된 알킬"은 하나 이상의 수소 원소가 기능성 그룹으로 대체된 알킬이다. 기능성 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함하며, 여기서 R26, R27, 및 R28는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다: -OH; -SH; -NH2; -OCH3; -OCH2CH3; -SCH3; -NHR26; -NR27R28; -NO2; -CN; -CO2H; -C(O)OR29; -OC(O)OR29; -C(O)NH2; -C(O)NHR26; -C(O)NR26R27; -OC(O)NHR26; -OC(O)NR26R27; -NHC(O)NHR26; -NHC(O)NR26R27, 여기서 R26, R27, R28 및 R29는, 독립적으로, 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴; -F; -CI; -Br; -I; -Ar, 여기서 "Ar"은 아릴 그룹이고; -Ar-X, 여기서 "Ar-X"는 치환된 아릴 그룹이고; -HAr, 여기서 "-HAr"는 헤테로아릴 그룹이고; -HAr-X 여기서 "-HAr-X"는 치환된 헤테로아릴 그룹이다.
"치환된 헤테로알킬"은 하나 이상의 수소 원소가 기능성 그룹으로 대체되는 헤테로 알킬이며, 여기서 R30, R31, R32 및 R33는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴: -OH; -SH; -NH2; -OCH3; -OCH2CH3; -SCH3; -NHR30; -NR31R32; -NO2; -CN; -CO2H; -C(O)OR33; -OC(O)OR33; -C(O)NH2; -C(O)NHR30; -C(O)NR31R32; -OC(O)NHR31 ; -OC(O)NR31R32; -NHC(O)NHR31 ; -NHC(O)NR31R32; -F; -CI; -Br; -I이다.
"아릴" 그룹은 다음의 구조이다:
Figure pct00002
"치환된 아릴" 그룹은 다음의 구조이다:
Figure pct00003
여기서 R34, R35, R36, R37 및 R38는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, -OH; -SH; -NH2; -OCH3; -OCH2CH3; -SCH3; -NHR39; -NR40R41; -NO2; -CN; -CO2H; -C(O)OR42; -OC(O)OR42; -C(O)NH2; -C(O)NHR39; -C(O)NR40R41; -OC(O)NHR39; -OC(O)NR40R41; -NHC(O)NHR39; -NHC(O)NR40R41; -F; -CI; -Br; -I으로부터 선택되고; 여기서 R39, R40, R41 및 R42는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴로부터 선택되며; 단 R34, R35, R36, R37, 및 R38 중 적어도 하나는 H가 아니다.
"헤테로아릴" 그룹은 방향족 헤테로사이클이다. 헤테로아릴 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:
Figure pct00004
Figure pct00005
여기서 R39는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택된다.
"치환된 헤테로아릴" 그룹은 H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, -OH; -SH; -NH2; -OCH3; -OCH2CH3; -SCH3; -NHR43; -NR44R45; -NO2; -CN; -CO2H; -C(O)OR46; -OC(O)OR46; -C(O)NH2; -C(O)NHR43; -C(O)NR44R45; -OC(O)NHR43; -OC(O)NR44R45; -NHC(O)NHR43; -NHC(O)NR44R45; -F; -CI; -Br; -I로부터 선택되는 하나 이상의 치환기를 가지는 헤테로아릴 그룹이며; 여기서 R43, R44, R45 및 R46는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴로부터 선택된다.
본 발명의 화합물은 구조식 XO-CH2-SM-B-A의 구조이다. 치환기 "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함한다. "SM"은 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이다. "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이다. "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티, 구조식 -C(O)OR1이며, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹이다.
뉴클레오사이드 합성에 관한 논의는 다음을 참조한다: Vorbriiggen, H.; Ruh-Polenz, C. Org. React. 2000, 55, 1; Diekmann, E.; Friedrich, K.; Fritz, H.-G. J. Prakt. Chem. 1993, 335, 415; Fischer, E.; Helferich, B. Chem. Ber. 1914, 47, 210; Miyaki, M.; Shimizu, B. Chem. Pharm. Bull. 1970, 18, 1446; Kazimierczuk, Z.; Cottam, H. B.; Revankar, G. R.; Robins, R. K. J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 6379; Wittenburg, E. Z. Chem. 1964, 4, 303; Choi, W-B.; Wilson, L. J.; Yeola, S.; Liotta, D. C; Schinazi, R. F. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 9377; Vorbriiggen, H.; Niedballa, U.; Krolikiewicz, K.; Bennua, B.; Hofle, G. In Chemistry and Biology of Nucleosides and Nucleotides; Harmon, R. E., Robins, R. K., Townsend, L. B., Eds.; Academic: New York, 1978; p. 251; Prystas, M; Sorm, F. Collect. Czech. Chem. Commun. 1964, 29, 121; Niedballa, U.; Vorbriiggen, H. J Org. Chem. 1974, 39, 3668; Itoh, T.; Melik-Ohanjanian, R. G.; Ishikawa, I.; Kawahara, N.; Mizuno, Y.; Honma, Y.; Hozumi, M.; Ogura, H. Chem. Pharm. Bull. 1989, 37, 3184; Vorbriiggen, H.; Bennua, B. Tetrahedron Lett. 1978, 1339; Vorbriiggen, H.; Bennua, B. Chem. Ber. 1981, 114, 1279; Sugiura, Y.; Furuya, S.; Furukawa, Y. Chem. Pharm. Bull. 1988, 36, 3253; Kawasaki, A. M.; Wotring, L. L.; Townsend, L. B. J. Med. Chem. 1990, 33, 3170; Nair, V.; Purdy, D. F. Heterocycles 1993, 36, 421; Hanrahan, J. R.; Hutchinson, D. W. J. Biotechnol. 1992, 23, 193; Martin, O. R. Tetrahedron Lett. 1985, 26, 2055; Langer, S. H.; Connell, S.; Wender, I. J. Org. Chem. 1958, 23, 50; Patil, V. D.; Wise, D. S.; Townsend, L. B. J Chem. Soc, Perkin Trans. 11980, 1853; Vorbriiggen, H.; Krolikiewicz, K.; Bennua, B. Chem. Ber. 1981, 114, 1234. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
당 모이어티는 일반적으로 펜토퓨라노실 모이어티이다. 이러한 모이어티의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:(여기서 화합물의 XOCH2-, B 및 A가 나타난다):
Figure pct00006
여기서 상기 구조 1 및 구조 2의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; Z는 H, OH 또는 OR3이고, 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
당 모이어티의 유사체는 일반적으로 천연 퓨라노실 모이어티의 유사체이다. 이러한 모이어티의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:
Figure pct00007
여기서 상기 구조 3 및 구조 4의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; Z는 H, OH 또는 OR3이고, 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00008
여기서 상기 구조 5 및 구조 6의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; Z는 H, OH 또는 OR3이고, 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00009
여기서 상기 구조 7 및 구조 8의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; Z는 H, OH 또는 OR3이고, 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00010
여기서 상기 구조 9 및 구조 10의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함함; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; Z는 H, OH 또는 OR3 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00011
여기서 상기 구조 11 및 구조 12의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; Z는 H, OH 또는 OR3이고, 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00012
여기서 상기 구조 13 및 구조 14의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; Z는 H, OH 또는 OR3이고, 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00013
여기서 상기 구조 15 및 구조 16의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; Z는 H, OH 또는 OR3이고, 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00014
여기서 상기 구조 17 및 구조 19의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00015
여기서 상기 구조 19 및 구조 20의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00016
여기서 상기 구조 21 및 구조 21의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00017
여기서 상기 구조 23 및 구조 24의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00018
여기서 상기 구조 25 및 구조 26의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00019
여기서 상기 구조 27 및 구조 28의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Z는 H, OH 또는 OR3이고, 여기서 R3는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00020
여기서 상기 구조 29 및 구조 30의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00021
여기서 상기 구조 31 및 구조 32의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00022
여기서 상기 구조 31 및 구조 32의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00023
여기서 상기 구조 33 및 구조 34의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; "R6"는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; "m" 및 "o"는 독립적으로 0, 1 또는 2이다.
Figure pct00024
여기서 상기 구조 35 및 구조 36의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; "R6"는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00025
여기서 상기 구조 37 및 구조 38의 치환기는 다음과 같다: "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "X1"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이고, 여기서 R2는 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; "R6"는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
Figure pct00026
여기서 상기 구조 39의 치환기는 다음과 같다: "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴 또는 보호 그룹이고; R8은 OH, 할라이드, OR9, NR10R11이고, 여기서 R9은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 또는 치환된 아릴이고, 여기서 R10 및 R11는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 또는 치환된 아릴이다.
핵염기 모이어티의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:
Figure pct00027
여기서 상기 구조 40 및 구조 41 내 치환기 "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이다.
Figure pct00028
여기서 상기 구조 42 및 구조 43 내 치환기 "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이다.
Figure pct00029
여기서 상기 구조 44 및 구조 45 내 치환기 "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이다.
Figure pct00030
여기서 상기 구조 46 및 구조 47 내 치환기 "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이다.
핵염기 유사체 모이어티의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:
Figure pct00031
여기서 "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; 여기서 "M은 N 또는 CR13이고, 여기서 R13은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR14R15이고, 여기서 R14 및 R15는, 독립적으로 H 또는 알킬이고; R12은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR14R15이고, 여기서 R14 및 R15는, 독립적으로 H 또는 알킬이다.
Figure pct00032
여기서 상기 구조 50 및 구조 51의 치환기는 다음과 같다: "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; 여기서 "M"은 N 또는 CR13이고, 여기서 R13은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR14R15이고, 여기서 R14 및 R15는, 독립적으로 H 또는 알킬이고; R12는 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NRI4R15이고; 여기서 R14 및 R15는, 독립적으로 H 또는 알킬이다.
Figure pct00033
여기서 상기 구조 52 및 구조 53의 치환기는 다음과 같다: "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; R12은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR14R15이고, 여기서 R14 및 R15는, 독립적으로 H 또는 알킬이다.
Figure pct00034
여기서 상기 구조 54 및 구조 55의 치환기는 다음과 같다: "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; R12은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR14R15이고, 여기서 R14 및 R15는, 독립적으로 H 또는 알킬이다.
Figure pct00035
여기서 상기 구조 56 및 구조 57의 치환기는 다음과 같다: "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "M", "D" 및 "E"는 독립적으로 N 또는 CR13이고, 여기서 R13은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR14R15이고, 여기서 R14 및 R15는, 독립적으로 H 또는 알킬이다.
Figure pct00036
여기서 상기 구조 58 및 구조 59의 치환기는 다음과 같다: "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고; "M", "D" 및 "E"는 독립적으로 N 또는 CR13이고, 여기서 R13은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR14R15이고, 여기서 R14 및 R15는, 독립적으로 H 또는 알킬이다.
뉴클레오사이드 유사체에 관한 논의는 다음을 참조한다: Merino, P. (Ed.) (2013) Chemical Synthesis of Nucleotide Analogues, Pedro Marino, Wiley Publishers; 미국 특허 제7,427,672호; Prakash, T. et al. J. Med. Chem. 2010, 53, 1636-1650. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
모이어티 "A"는 -C(O)OR1의 구조이며 R1은 삼차 알킬이다. 삼차 알킬은 탄소 원자가 3 개의 그룹 (즉, -CR16R17R18)에 공유적으로 결합한 알킬이며, 여기서 R16, R17 및 R18는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬 및 치환된 헤테로알킬으로부터 선택된다. 일반적으로, 치환기 R16, R17 및 R18은 중심 탄소 원자에 직접적으로 연결된 CH2 또는 CH3 으로 종결된다(예컨대, -C(CH3)2(CH2CH3). 삼차 알킬 그룹의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: -C(CH3)3; -C(CH3)2(CH2CH3); -C(CH3)(CH2CH3)(CH2CH2CH3); -C(RI9)(R20)-링커-표지; 및 -C(RI9)(R20)-링커-[고체 지지체], 여기서 R19 및 R20는 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 및 CH(CH3)2으로부터 선택된다.
-C(R19)(R20)-링커-표지의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:
Figure pct00037
여기서 상기 구조 60의 치환기는 다음과 같다: R19 및 R20는 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 및 CH(CH3)2으로부터 선택된다.
Figure pct00038
여기서 상기 구조 61의 치환기는 다음과 같다: R19 및 R20는 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 및 CH(CH3)2으로부터 선택된다.
Figure pct00039
여기서 상기 구조 62의 치환기는 다음과 같다: R19 및 R20는 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 및 CH(CH3)2으로부터 선택된다.
Figure pct00040
여기서 상기 구조 63의 치환기는 다음과 같다: R19 및 R20는 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 및 CH(CH3)2으로부터 선택된다.
-C(R19)(R20)-링커-[고체 지지체]의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:
Figure pct00041
여기서 상기 구조 64 및 구조 65의 치환기는 다음과 같다: R19 및 R20는 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 및 CH(CH3)2으로부터 선택되고; CPG는 제어된 공극 유리이고; PS는 폴리스타이렌이다.
하나의 경우에, SM이 다음의 구조이고,
Figure pct00042
상기 구조 66의 치환기는 다음과 같으며: Y는 -OP(O-CNE)ONR51R52 또는 -OP(O)(OH)H 또는 이의 염이고, 여기서 R51 및 R52는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴로부터 선택되거나, 또는 R51 및 R52는 함께 헤테로사이클 (예컨대, 피롤리딘)을 형성할 때, X는 산 불안정성 보호 그룹 또는 고체 지지체이고, Z는 H 또는 OR53이고, R53는 하이드록실 보호 그룹이다.
또 다른 경우에, SM이 다음의 구조이고,
Figure pct00043
상기 구조 67의 치환기는 다음과 같으며: X는 -P(O-CNE)(NR51R52) 또는 -P(O)(OR53)H 또는 이의 염이고, 여기서 R51 및 R52는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴로부터 선택되거나, 또는 R51 및 R52는 함께 헤테로사이클 (예컨대, 피롤리딘)을 형성하고, R53은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 알킬일 때, Y는 산 불안정성 하이드록실 보호 그룹 또는 고체 지지체이고, Z는 H이다.
또 다른 경우에, SM이 다음의 구조이고,
Figure pct00044
상기 구조 68의 치환기는 다음과 같으며: X는 -P(O)(OR )H 또는 -P(O)(OH)O[P(O)(O")(O")]nH 또는 이의 염이고, 여기서 R53은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고, 여기서 n = 0, 1 또는 2일 때, Y는 OH 또는 OR54이고, 여기서 R54는 열불안정성 하이드록실 보호 그룹이고, Z는 H, -OH, 또는 OR54이다.
본 발명의 화합물의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다:
Figure pct00045
여기서 상기 구조 69 및 구조 70의 치환기는 다음과 같다: "X"는 -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이고, "Z" 는 -H 또는 -OH이다.
Figure pct00046
여기서 상기 구조 71 및 72의 치환기는 다음과 같다: "X"는 -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이고, "Z" 는 -H 또는 -OH이다.
Figure pct00047
여기서 상기 구조 73 및 구조 74의 치환기는 다음과 같다: "X"는 -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이고, "Z" 는 -H 또는 -OH이다.
Figure pct00048
여기서 상기 구조 75 및 구조 76의 치환기는 다음과 같다: "X"는 -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이고, "Z" 는 -H 또는 -OH이다.
본 발명은, 추가적으로, 구조 -O-CH2-SM(-O-)B-A의, 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 및 이의 염에 관한 것이며, 여기서 "SM"은 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹이다.
올리고뉴클레오사이드 합성에 관한 논의는 다음을 참조한다: Ellington, A. and Pollard, J. D. 2001. Introduction to the Synthesis and Purification of Oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 00:A.3C.1-A.3C.22; Beaucage, S. L. and Reese, C. B. 2009. Recent Advances in the Chemical Synthesis ofRNA. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 38:2.16.1-2.16.31; Tsukamoto, M. and Hayakawa, Y.2005. "Strategies useful for the Chemical Synthesis of Oligonucleotides and Related Compounds." Frontiers in Organic Chemistry, Bentham
Science Publishers, Vol. 1. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
하나의 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 다음의 구조이고:
Figure pct00049
여기서 상기 구조 77의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드이고; "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹이다.
또 다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 다음의 구조 (또는 이의 염) 중 하나이고:
Figure pct00050
여기서 상기 구조 78 및 구조 79의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2은는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드이고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹이다.
또 다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 다음의 구조 (또는 이의 염) 중 하나이고:
Figure pct00051
여기서 상기 구조 80 및 구조 81의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이고;
Figure pct00052
여기서 상기 구조 82 및 구조 83의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이고;
Figure pct00053
여기서 상기 구조 84 및 구조 85의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이고;
Figure pct00054
여기서 상기 구조 86의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이고;
Figure pct00055
여기서 상기 구조 87 및 구조 88의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이다.
Figure pct00056
여기서 상기 구조 89 및 구조 90의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이다.
Figure pct00057
여기서 상기 구조 91 및 구조 92의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이다.
Figure pct00058
여기서 상기 구조 93의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이다.
또 다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 또는 6 개 이상의 상기 나타난 구조의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다.
본 발명은 추가적으로 특정의 치료적인 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체에 관한 것이다. 치료적인 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체는 질병 (예컨대, HCV)을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것이, 여기서 화합물은 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 및 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이다.
치료적인 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체에 관한 논의는 다음을 참조한다: Lars Petter Jordheim e fal. Nature Reviews Drug Discovery, 447-464 (2013); Squires, K. Antivir. Ther. 2001; 6 Suppl 3:1-14; 미국 특허 제8,664,386호; 미국 특허 제8,658,617호; 미국 특허 제8,642,756호; 미국 특허 제8,633,309호; 미국 특허 제8,629,263호; 미국 특허 제8,618,076호; 미국 특허 제8,580,765호; 미국 특허 제8,569,478호; 미국 특허 제8,563,530호; 미국 특허 제8,551,973호. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
하나의 양태에서, 치료적인 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체는 다음의 구조 중 하나이고:
Figure pct00059
여기서 상기 구조 94 및 구조 95의 치환기는 다음과 같다: A1 A2 및 A3는 독립적으로 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고;
Figure pct00060
여기서 상기 구조 96 및 구조 97의 치환기는 다음과 같다: A1 A2 및 A3는 독립적으로 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고;
Figure pct00061
여기서 상기 구조 98 및 구조 99의 치환기는 다음과 같다: A1 A2 및 A3는 독립적으로 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고;
Figure pct00062
여기서 상기 구조 100 및 구조 101의 치환기는 다음과 같다: A1 및 A3는 독립적으로 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고;
Figure pct00063
여기서 상기 구조 102 및 구조 103의 치환기는 다음과 같다: A1 A2 및 A3는 독립적으로 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고;
Figure pct00064
여기서 상기 구조 104 및 구조 105의 치환기는 다음과 같다: A1 A2 및 A3는 독립적으로 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고;
Figure pct00065
여기서 상기 구조 106 및 구조 107의 치환기는 다음과 같다: A3는 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고;
Figure pct00066
여기서 상기 구조 108 및 구조 109의 치환기는 다음과 같다: A1 A2 및 A3는 독립적으로 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이다.
또 다른 양태에서, 치료적인 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체는 다음의 구조 중 하나이고:
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
본 발명은 추가적으로 치료적인 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)에 관한 것이다. 치료적인 올리고뉴클레오타이드는 질병 (예컨대, CMV)을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것이며, 여기서 화합물은 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 (예컨대, 포미비어센(Fomivirsen), 미포머센(Mipomersen))를 포함한다. 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이다.
치료적인 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 다음의 구조 (또는 이의 염)이고:
Figure pct00070
여기서 상기 구조 116의 치환기는 다음과 같다: PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이다. "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹이다.
치료적인 올리고뉴클레오타이드에 대한 논의는 다음을 참조한다: Yogesh S. Sanghvi Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 4.1.1-4.1.22, September 2011 ; Goodchild, J. Methods Mol. Biol. 2011;764:1-15; 미국 특허 제8,697,675호. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드-표지 접합체(label conjugate) (또는 이의 염)에 관한 것이다. 올리고뉴클레오타이드-표지 접합체는 다음의 구조를 가지는 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하고:
Figure pct00071
여기서 상기 구조 117의 치환기는 다음과 같다: L1 및 L2는 독립적으로 H, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 및 표지이고, 여기서 표지를 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 상의 그의 위치에 연결하는 연결 그룹이 존재할 수 있고; L3은 H, -C(O)OR60이고 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3), 또는 표지이며, 여기서 표지를 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 상의 그의 위치에 연결하는 연결 그룹이 존재할 수 있다. 표지가 L1, L2 또는 L3가 아닌 경우, 표지는 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 뉴클레오타이드에 부착된다. "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이다.
올리고뉴클레오타이드-표지 접합체에 관한 논의는 다음을 참조한다: 미국 특허 제5,583,236호; 미국 특허 제
8,530,634호; Durrant, Ian et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 31 (1994), 163-175. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)의 합성 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 다음의 구조 중 하나인 화합물을:
Figure pct00072
여기서 상기 구조 118 및 구조 119의 치환기는 다음과 같다: "P1"는 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고,
직접적으로 또는 링커를 통해, 고체 지지체에 커플링시켜, 다음의 구조 중 하나의 고체 지지체 화합물을 제공하는 단계:
Figure pct00073
여기서 상기 구조 120 및 구조 121의 치환기는 다음과 같다: L1은 링커이고, 또는 화학 물질(chemical entity)이 아니며, S1은 고체 지지체이고; "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
2) 고체 지지체 화합물을 탈보호하여 다음의 구조 중 하나의 탈보호된 화합물을 제공하는 단계:
Figure pct00074
여기서 상기 구조 122 및 구조 123의 치환기는 다음과 같다: L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
3) 탈보호된 화합물을, 다음의 구조 중 하나인 인 원자를 포함하는 모이어티를 포함하는 화합물과 반응시켜:
Figure pct00075
여기서 상기 구조 124 및 구조 125의 치환기는 다음과 같다: "PM"은 인 함유 모이어티이고, "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고; "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고; "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임,
다음의 구조 중 하나의 다이뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
Figure pct00076
여기서 상기 구조 126 및 구조 127의 치환기는 다음과 같다: "PM*"은 반응 이후 인 함유 모이어티이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이고, "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고,"B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
4) 선택적으로, 인 함유 모이어티를 화학적으로 변형시켜, 다음의 구조 중 하나의 변형된 이합체를 제공하는 단계:
Figure pct00077
여기서 상기 구조 128 및 구조 129의 치환기는 다음과 같다: "PM**"은 화학적으로 변형된 모이어티이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이고, "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고,"B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
5) 선택적으로, 이합체 또는 변형된 이합체를 탈보호하여, 다음의 구조 중 하나의 탈보호된 이합체 또는 변형된 이합체를 제공하는 단계:
Figure pct00078
Figure pct00079
여기서 상기 구조 130, 구조 131, 구조 132 및 구조 133의 치환기는 다음과 같다: "PM*"는 이합체를 제공하기 위한 반응 이후 인 함유 모이어티이고, "PM**"는 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
6) 선택적으로, 단계 "3" 및 "4"를 반복하여, 다음의 구조 중 하나의 올리고머 또는 변형된 올리고머를 제공하는 단계:
Figure pct00080
Figure pct00081
여기서 상기 구조 134, 구조 135, 구조 136 및 구조 137의 치환기는 다음과 같다: "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT), "PM*"은 올리고머를 제공하기 위한 반응 이후 인 함유 모이어티이고, "PM**"은 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티이고, "L1"은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, "S1"은 고체 지지체이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "n"은 1 내지 200 범위의 정수 (예컨대, 1 내지 25, 1 내지 50, 1 내지 75, 1 내지 100, 등)임;
7) 이합체, 변형된 이합체, 올리고뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하고, 고체 지지체로부터 이를 제거하고, PM* 또는 PM** 모이어티를 화학적으로 변형시켜, 다음의 구조의 화합물을 제공하는 단계:
Figure pct00082
여기서 상기 구조 138의 치환기는 다음과 같다: "Q"는 O 또는 S이고, "n"은 1 내지 200 범위의 정수 (예컨대, 1 내지 25, 1 내지 50, 1 내지 75, 1 내지 100, 등)이고, 적어도 하나의 "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "1"에서 고체 지지체에 커플링된 화합물은 다음의 구조이고:
Figure pct00083
여기서 상기 구조 139 및 구조 140의 치환기는 다음과 같다: "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이다.
또 다른 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "1"에서 고체 지지체에 커플링된 화합물은 다음의 구조:
Figure pct00084
여기서 상기 구조 139 및 구조 140의 치환기는 다음과 같다: "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임; 또는,
Figure pct00085
여기서 상기 구조 141 및 구조 142의 치환기는 다음과 같다: "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "2"에서 탈보호된 구조는 다음의 구조이고:
Figure pct00086
여기서 상기 구조 143 및 구조 144의 치환기는 다음과 같다: "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "2"에서 탈보호된 구조는 다음의 구조이고:
Figure pct00087
여기서 상기 구조 145 및 구조 146의 치환기는 다음과 같다: "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임; 또는
Figure pct00088
여기서 상기 구조 147 및 구조 148의 치환기는 다음과 같다: "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "3"에서 인 원자를 포함하는 모이어티를 포함하는 화합물은 다음의 구조 중 하나이고:
Figure pct00089
여기서 상기 구조 149 및 구조 150의 치환기는 다음과 같다: "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, 여기서 "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "PM"은 다음의 모이어티 중 하나로부터 선택된 인 함유 모이어티이다:
Figure pct00090
여기서 상기 구조 151, 구조 152, 구조 153 , 구조 154 및 구조 155의 치환기는 다음과 같다: "P2" 및 "P3"는, 독립적으로, 보호 그룹 (예컨대, Bn, -CH2CH2SC(O)Ph)이고, 여기서 "EWG"는 전자 끄는 그룹 (예컨대, -CM, -NO2)이고, R61 및 R62은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 또는 인 원자에 결합된 질소 원자와 함께 헤테로 사이클 (예컨대, 피롤리딘, 피페리딘)을 형성한다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "5"에서 탈보호된, 변형된 이합체는 다음의 구조이고:
Figure pct00091
여기서 "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "PM**"은, 예를 들어, 다음의 모이어티: -P(O)(O); -P(S)(O-); -P(O)(-CH2CH2-EWG)-; -P(S)(-CH2CH2-EWG)- 중 하나로부터 선택되는 인 함유 모이어티이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "7"에서 올리고머는 다음의 구조이고:
Figure pct00092
여기서 상기 구조 158의 치환기는 다음과 같다: "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "Q"는 O 또는 S이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)의 합성 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 다음의 구조 중 하나인 화합물을:
Figure pct00093
여기서 상기 구조 159 및 구조 160의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고,
직접적으로 또는 링커를 통해, 고체 지지체에 커플링시켜, 다음의 구조 중 하나의 고체 지지체 화합물을 제공하는 단계:
Figure pct00094
여기서 상기 구조 161 및 구조 162의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임;
2) 화합물에 결합된 고체 지지체를 탈보호하여 다음의 구조 중 하나의 탈보호된 화합물을 제공하는 단계:
Figure pct00095
여기서 상기 구조 163 및 구조 164의 치환기는 다음과 같다: "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임;
3) 탈보호된 화합물을, 다음의 구조 중 하나인 인 원자를 포함하는 모이어티를 포함하는 화합물과 반응시켜:
Figure pct00096
여기서 상기 구조 165 및 구조 166의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이고,
다음의 구조 중 하나의 다이뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
Figure pct00097
여기서 상기 구조 167 및 구조 168의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이고, "PM*"은 반응 이후 인 함유 모이어티임;
4) 선택적으로, 인 함유 모이어티를 화학적으로 변형시켜, 다음의 구조 중 하나의 변형된 이합체를 제공하는 단계:
Figure pct00098
여기서 상기 구조 169 및 구조 170의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이고, "PM**"은 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티임;
5) 선택적으로, 이합체 또는 변형된 이합체를 탈보호하여, 다음의 구조 중 하나의 탈보호된 이합체 또는 변형된 이합체를 제공하는 단계:
Figure pct00099
Figure pct00100
여기서 상기 구조 171, 구조 172, 구조 173 및 구조 134의 치환기는 다음과 같다: "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이고, "PM*"은 커플링 반응 이후 인 함유 모이어티이고, "PM**"은 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티임;
6) 선택적으로, 단계 "3" 및 "4"를 반복하여, 다음의 구조 중 하나의 올리고머 또는 변형된 올리고머를 제공하는 단계:
Figure pct00101
Figure pct00102
여기서 상기 구조 175, 구조 176, 구조 177 및 구조 178의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는, 독립적으로, 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이고, "PM*"은 커플링 반응 이후 인 함유 모이어티이고, "PM**"은 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티이고, "n"은 1 내지 200 범위의 정수 (예컨대, 1 내지 25, 1 내지 50, 1 내지 75, 등)임;
7) 이합체, 변형된 이합체, 올리고뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하고, 고체 지지체로부터 이를 제거하고, PM* 또는 PM** 모이어티를 화학적으로 변형시켜, 다음의 구조의 화합물을 제공하는 단계:
Figure pct00103
여기서 "n"은 1 내지 200 범위의 정수 (예컨대, 1 내지 25, 1 내지 50, 1 내지 75, 등)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, 적어도 하나의 "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이고, "Q"는 O 또는 S이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "1"에서 고체 지지체에 커플링된 화합물은 다음의 구조이고:
Figure pct00104
여기서 상기 구조 180 및 구조 181의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는, 독립적으로, 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이다.
또 다른 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "1"에서 고체 지지체에 커플링된 화합물은 다음의 구조이고:
Figure pct00105
여기서 상기 구조 182 및 구조 183의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는, 독립적으로, 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임; 또는,
Figure pct00106
여기서 상기 구조 184 및 구조 185의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는, 독립적으로, 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임; 또는,
Figure pct00107
여기서 상기 구조 186 및 구조 187의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는, 독립적으로, 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임; 또는,
Figure pct00108
여기서 상기 구조 188의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는, 독립적으로, 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "2"에서 탈보호된 구조는 다음의 구조이고:
Figure pct00109
여기서 상기 구조 189 및 구조 190의 치환기는 다음과 같다: "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "2"에서 탈보호된 구조는 다음의 구조이고:
Figure pct00110
여기서 상기 구조 191 및 구조 192의 치환기는 다음과 같다: "P2"는 보호 그룹이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임; 또는
Figure pct00111
여기서 상기 구조 193 및 구조 193의 치환기는 다음과 같다: "P2"는 보호 그룹이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임; 또는
Figure pct00112
여기서 상기 구조 195 및 구조 196의 치환기는 다음과 같다: "P2"는 보호 그룹이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임; 또는
Figure pct00113
여기서 상기 구조 197의 치환기는 다음과 같다: "P2"는 보호 그룹이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임; 또는
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "3"에서 인 원자를 포함하는 모이어티를 포함하는 화합물은 다음의 구조 중 하나이고:
Figure pct00114
여기서 상기 구조 198 및 구조 199의 치환기는 다음과 같다: "P1" 및 "P2"는, 독립적으로, 보호 그룹이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "PM"은 다음의 모이어티 중 하나로부터 선택된 인 함유 모이어티이다:
Figure pct00115
여기서 상기 구조 200, 구조 201, 구조 202 , 구조 203 및 구조 204의 치환기는 다음과 같다: "P3" 및 "P4"는, 독립적으로, 보호 그룹 (예컨대, Bn, -CH2CH2SC(O)Ph)이고, 여기서 "EWG"는 전자 끄는 그룹 (예컨대, CN, -PhNO2)이고, R70 및 R71은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 또는 인 원자에 결합된 질소 원자와 함께 헤테로 사이클 (예컨대, 피롤리딘, 피페리딘)을 형성한다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "5"에서 탈보호된, 변형된 이합체는 다음의 구조이고:
Figure pct00116
여기서 상기 구조 205 및 구조 206의 치환기는 다음과 같다: "P2"는 보호 그룹이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "PM**"은, 예를 들어, 다음의 모이어티: -P(O)(O); -P(S)(O-); -P(O)(-CH2CH2-EWG)-; -P(S)(-CH2CH2-EWG)- 중 하나로부터 선택되는 인 함유 모이어티이고, 여기서 "EWG"는 전자 끄는 그룹 (예컨대, -CN, -NO2)이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "7"에서 올리고머는 다음의 구조이고:
Figure pct00117
여기서 상기 구조 207의 치환기는 다음과 같다: "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "Q"는 O 또는 S이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 사용하는 DNA 증폭 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 핵염기의 고리 구조 상의 또는 내의 질소 원자 상에 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹을 가지는 하나 이상의 디옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이다.
PCR에 관한 논의는 다음을 참조한다: 미국 특허 제8,133,669호; 미국 특허 제4,683,195호; 미국 특허 제4,683,202호; 미국 특허 제4,800,159호; 미국 특허 제4,965,188호; 미국 특허 제5,008,182호; 미국 특허 제5,176,995호; 미국 특허 제6,040,166호; 미국 특허 제6,197,563호. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 사용하는 DNA 증폭 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 표적 DNA (즉, 증폭되는 DNA), DNA 중합효소, 프라이머 및 디옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 dNTP는 다음의 구조 중 하나이다:
Figure pct00118
여기서 상기 구조 208 및 구조 209의 치환기는 다음과 같다: "TP"는 트리포스페이트이고, "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
Figure pct00119
여기서 상기 구조 210 및 구조 211의 치환기는 다음과 같다: "TP"는 트리포스페이트이고, "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
Figure pct00120
여기서 상기 구조 212 및 구조 213의 치환기는 다음과 같다: "TP"는 트리포스페이트이고, "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
Figure pct00121
여기서 상기 구조 214의 치환기는 다음과 같다: "TP"는 트리포스페이트이고, "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
2) 반응 혼합물을 일정 시간 (예컨대, 1 분) 동안 가열하여 (예컨대, 94 ℃ 내지 98 ℃) 표적 DNA를 변성시켜, 단일-가닥 DNA 주형을 제공하는 단계;
3) 반응 혼합물의 반응 온도를 일정 시간 (예컨대, 20 내지 40 초) 동안 낮추어 (예컨대, 50 ℃ 내지 65 ℃), 프라이머를 단일-가닥 DNA 주형에 어닐링시켜 프라이머-주형 복합체를 제공하고, 프라이머-주형 복합체에 DNA 중합효소를 결합하게 하는 단계;
4) 반응 혼합물을 가열하여(예컨대, 75 ℃ 내지 80 ℃), 5'에서 3' 방향으로 dNTP를 DNA 주형에 첨가함으로써 DNA 중합효소가 표적 DNA와 상보적인 DNA 가닥을 합성하도록 하는 단계;
5) 임의의 잔여의 단일-가닥 DNA의 확장을 보장하기 위해, 선택적으로 반응 혼합물의 온도를 70 ℃ 내지 74 ℃로 유지하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 사용하는 DNA 증폭 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 프라이머의 핵염기의 고리 구조 상의 또는 내의 질소 원자 상에 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹을 가지는 하나 이상의 프라이머 (즉, 특정 DNA 서열에 표적화된 올리고뉴클레오타이드)를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 사용하는 DNA 증폭 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 표적 DNA (즉, 증폭되는 DNA), DNA 중합효소, 프라이머 및 디옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 프라이머는 다음의 구조이다:
Figure pct00122
여기서 상기 구조 215의 치환기는 다음과 같다: "n"은 1 내지 50의 정수이고, "B"는 핵염기이고, "A"는 H 또는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이고, 단 적어도 하나의 "A"는 열 불안정성 보호 그룹임;
2) 반응 혼합물 (예컨대, 94 ℃ 내지 98 ℃)을 일정 시간 (예컨대, 1 분) 동안 가열하여 표적 DNA를 변성시켜, 단일-가닥 DNA 주형을 제공하는 단계;
3) 반응 혼합물의 반응 온도를 일정 시간 (예컨대, 20 내지 40 초) 동안 낮추어 (예컨대, 50 ℃ 내지 65 ℃), 프라이머를 단일-가닥 DNA 주형에 어닐링시켜 프라이머-주형 복합체를 제공하고, 프라이머-주형 복합체에 DNA 중합효소를 결합하게 하는 단계;
4) 반응 혼합물을 가열하여(예컨대, 75 ℃ 내지 80 ℃), 5'에서 3' 방향으로 dNTP를 DNA 주형에 첨가함으로써 DNA 중합효소가 표적 DNA와 상보적인 DNA 가닥을 합성하도록 하는 단계;
5) 임의의 잔여의 단일-가닥 DNA의 확장을 보장하기 위해, 선택적으로 반응 혼합물의 온도를 70 ℃ 내지 74 ℃로 유지하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체, 트리포스페이트 제조 방법에 관한 것이며, 여기서 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 트리포스페이트는 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹을 포함한다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 모노포스포러스 시약, 및 선택적으로 축합제 (예컨대, 카본일다이이미다졸)를 뉴클레오사이드 또는 다음의 구조의 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 반응 혼합물에 첨가하여:
Figure pct00123
여기서 상기 구조 216의 치환기는 다음과 같다: Y는 OP1이고, 여기서 P1는 보호 그룹 또는 -H이고, Z은 H이거나, 또는 OP2이고, 여기서 P2는 보호 그룹 또는 -H이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이고,
다음의 구조의 모노-포스포러스화된 중간체를 제공하는 단계:
Figure pct00124
여기서 상기 구조 217의 치환기는 다음과 같다: Y는 OP1이고, 여기서 P1는 보호 그룹이고, Z은 H이거나, 또는 OP2이고, 여기서 P2는 보호 그룹이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이고, "PM"은 단일 인 원자를 포함하는 모이어티임;
2) 폴리포스포러스 시약을 포스포러스화된 중간체에 첨가하여 다음의 구조의 폴리-포스포러스화된 중간체를 제공하는 단계:
Figure pct00125
여기서 상기 구조 218의 치환기는 다음과 같다: Y는 OP1이고, 여기서 P1는 보호 그룹이고, Z은 H이거나, 또는 OP2이고, 여기서 P2는 보호 그룹이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이고, "PP"는 여러 인 원자를 포함하는 모이어티임;
3) 폴리-포스포러스화된 중간체를 가수분해하고 P1을 제거하여 다음의 구조의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 뉴클레오사이드 유사체 트리포스페이트를 제공하는 단계:
Figure pct00126
여기서 상기 구조 219의 치환기는 다음과 같다: Y는 OP1, 여기서 P1는 보호 그룹 또는 H, Z은 H이거나, 또는 OP2, 여기서 P2는 보호 그룹 또는 H이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)이다.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "1"에서 모노포스포러스 시약은 다음의 구조이다: POCl3; 및,
Figure pct00127
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "1"의 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체는 다음의 구조 중 하나이고:
Figure pct00128
여기서 상기 구조 221 및 구조 222의 치환기는 다음과 같다: P1은 보호 그룹이고, A1은 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)임;
Figure pct00129
여기서 상기 구조 223 및 구조 224의 치환기는 다음과 같다: P1은 보호 그룹이고, A1은 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)임;
Figure pct00130
여기서 상기 구조 225 및 구조 226의 치환기는 다음과 같다: P1은 보호 그룹이고, A1은 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)임;
Figure pct00131
여기서 상기 구조 227의 치환기는 다음과 같다: P1은 보호 그룹이고, A1은 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)임.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "2"에서 고체 폴리포스포러스 시약은 다음의 구조이다: (n-Bu3NH)2H2P2O7; 및, P2O7 4 -.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "2"에서 폴리-포스포러스화된 중간체는 다음의 구조이고:
Figure pct00132
여기서 상기 구조 228의 치환기는 다음과 같다: P1은 보호 그룹이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A1은 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)임.
하나의 경우에, 상기 언급된 방법의 단계 "2"에서 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 다음의 구조이고:
Figure pct00133
Figure pct00134
여기서 상기 구조 229, 구조 230, 구조 231 및 구조 232의 치환기는 다음과 같다: A1은 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(CH3)3)임;
트리포스페이트 합성에 관한 논의는 다음을 참조한다: Gregor S. Cremosnik, Alexandre Hofer and Henning J. Jessen Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 286; Malwina Strenkowska, Przemyslaw Wanat, Marcin Ziemniak, Jacek Jemielity and Joanna Kowalska Org. Lett., 2012, 14, 4782; Tobias Santner, Vanessa Siegmund, Andreas Marx and Ronald Micura Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2012, 20, 2416; Julianne Caton- Williams, Bilal Fiaz, Rudiona Hoxhaj, Matthew Smith and Zhen Huang Sci. China Chem., 2012, 55, 80; Gregor S. Cremosnik, Alexandre Hofer and Henning J. Jessen Angew. Chem., 2014, 126, 290; Qi Sun, Shanshan Gong, Jian Sun, Si Liu, Qiang Xiao and Shouzhi Pu J. Org. Chem., 2013, 78, 8417; Julianne Caton- Williams, Matthew Smith, Nicolas Carrasco and Zhen Huang Org. Lett., 2011, 13, 4156; Julianne caton- Williams, Lina Lin, Matthew Smith and Zhen Huang Chem Commun., 2011, 47, 8142-8144. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 질병의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 치료를 필요로 하는 환자에게 치료적인 양의 화합물을 투여하는 단계, 여기서 화합물은 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하는 화합물을 포함하며, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR8이며, 여기서 R8은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)임;
2) 환자의 하나 이상의 영역에 에너지를 가하여, 하나 이상의 영역에서의 온도 상승 및 후속적인 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체의 열적 탈보호를 야기하는 단계;
이에 따라 질병을 치료하는 단계.
열불안정성 보호 그룹에 관한 논의는 다음을 참조한다: Chmielewski, M. et al. New J. Chem., 2012, 36, 603-12. 미국 특허 제8,133,669호; 미국 특허 제7,355,037호; 미국 특허 제6,762,298호. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
하나의 경우에, 치료적인 화합물은 다음의 구조 중 하나이고:
Figure pct00135
여기서 상기 구조 233 및 구조 234의 치환기는 다음과 같다: "A1", "A2" 및 "A3"는 독립적으로 -H 또는 열불안정성 보호 그룹이고, 단 A1, A2 또는 A3 중 적어도 하나는 구조식 -C(O)OR60의 열불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
Figure pct00136
여기서 상기 구조 235 및 구조 236의 치환기는 다음과 같다: "A1", "A2" 및 "A3"는 독립적으로 -H 또는 열불안정성 보호 그룹이고, 단 A1, A2 또는 A3 중 적어도 하나는 구조식 -C(O)OR60의 열불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
Figure pct00137
여기서 상기 구조 237 및 구조 238의 치환기는 다음과 같다: "A1", "A2" 및 "A3"는 독립적으로 -H 또는 열불안정성 보호 그룹이고, 단 A1, A2 또는 A3 중 적어도 하나는 구조식 -C(O)OR60의 열불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
Figure pct00138
여기서 상기 구조 239 및 구조 240의 치환기는 다음과 같다: "A1", "A2" 및 "A3"는 독립적으로 -H 또는 열불안정성 보호 그룹이고, 단 A1, A2 또는 A3 중 적어도 하나는 구조식 -C(O)OR60의 열불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
Figure pct00139
여기서 상기 구조 241 및 구조 242의 치환기는 다음과 같다: "A1", "A2" 및 "A3"는 독립적으로 -H 또는 열불안정성 보호 그룹이고, 단 A1, A2 또는 A3 중 적어도 하나는 구조식 -C(O)OR60의 열불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
Figure pct00140
여기서 상기 구조 243 및 구조 242의 치환기는 다음과 같다: "A1", "A2" 및 "A3"는 독립적으로 -H 또는 열불안정성 보호 그룹이고, 단 A1, A2 또는 A3 중 적어도 하나는 구조식 -C(O)OR4의 열불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R4는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
Figure pct00141
여기서 상기 구조 245 및 구조 246의 치환기는 다음과 같다: "A3"는 -C(O)OR60 구조의 열불안정성 보호 그룹이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
Figure pct00142
여기서 상기 구조 247 및 구조 248의 치환기는 다음과 같다: "A1", "A2" 및 "A3"는 독립적으로 -H 또는 열불안정성 보호 그룹이고, 단 A1, A2 또는 A3 중 적어도 하나는 구조식 -C(O)OR60의 열불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60는 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
하나의 경우에, 열 에너지는 환자의 하나 이상의 영역에 다음의 방법 중 하나 이상의 방법을 사용하여 가해진다: 미국 특허 제6,725,095호, 미국 특허 제6,807,446호 및 미국 특허 제6,768,925호에 논의된 마이크로웨이브 위상 배열 또는 단일 어플리케이터 하이퍼써미아, 상기 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 질병의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 치료를 필요로 하는 환자에게 치료적인 양의 화합물을 투여하는 단계, 여기서 화합물은 올리고뉴클레오타이드(또는 이의 염) 및 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하는 화합물을 포함하며, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR60 이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)임;
2) 환자의 하나 이상의 영역에 에너지를 가하여, 하나 이상의 영역에서의 온도 상승 및 후속적인 올리고뉴클레오타이드의 열적 탈보호를 야기하는 단계;
이에 따라 질병을 치료하는 단계.
하나의 경우에, 치료적인 화합물은 -C(O)OR8 구조의 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹에 결합된 포미비어센 또는 미포머센 중 하나이며, 여기서 R8은 삼차 알킬 그룹(예컨대, -C(CH3)3)이다.
하나의 경우에, 열 에너지는 환자의 하나 이상의 영역에 다음의 방법 중 하나 이상의 방법을 사용하여 가해진다: 미국 특허 제6,725,095호, 미국 특허 제6,807,446호 및 미국 특허 제6,768,925호에 논의된 마이크로웨이브 위상 배열 또는 단일 어플리케이터 하이퍼써미아, 상기 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
본 발명은 추가적으로 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체의 탈보호 방법에 관한 것이다. 보호된 화합물은 다음의 구조이다: XO-SM-B-A. 치환기 "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이다. "SM"은 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이다. "B"는 염기 모이어티의 유사체의 염기 모이어티이다. "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹이다.
탈보호 방법은 용매 (예컨대, 물)의 존재하에서 화합물을 가열하는 단계를 포함한다. 특정 경우에, 용매의 pH는 6.0 내지 9.0 - 예컨대, 6.5 내지 7.5, 6.75 내지 7.25, 6.90 내지 7.10, 또는 대략 7.0이다. 다른 경우에, 용매의 pH는 7.0 초과 - 예컨대, 7.0 내지 10.0, 7.0 내지 9.0 또는 7.0 내지 8.0이다. 가열되는 화합물의 온도는 90 ℃ 내지 100 ℃의 범위이다. 이는 종종 91 ℃ 내지 99 ℃, 92 ℃ 내지 97 ℃, 93 ℃ 내지 95 ℃의 범위이다. 특정 경우에, 상기 온도는 94 ℃이다. 이러한 온도는 1 시간 미만의 기간 동안 유지된다. 종종 이는 45 분 또는 30 분 미만 동안 유지된다. 특정 경우에 이는 20 분 미만 동안 유지된다.
탈보호 방법은 -C(O)OR1 보호 그룹의 90 % 초과를 제거를 초래한다. 종종 이는 보호 그룹의 92.5 % 또는 95 % 초과의 제거를 초래한다. 특정 경우에, 이는 보호 그룹의 97.5 % 또는 99 % 초과의 제거를 초래한다.
탈보호 방법은 추가적으로 화합물의 5 % 미만의 분해를 초래한다. 종종 이는 화합물의 4 % 또는 3 % 미만의 분해를 야기한다.
특정 경우에 이는 화합물의 2 % 또는 1 % 미만을 야기한다.
또 다른 방법에서, 화합물 XO-SM-B-A는 마이크로웨이브 기법의 사용에 의해 용매의 존재하에서 탈보호된다. 예를 들어, Culf et al., Oligonucleotides 18:81-92 (2008), 및 Kumar et al, Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 24, pp. 5127-5129를 참고하며, 상기 두 문헌 모두는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 용매의 pH는 일반적으로 6.0 초과 또는 7.0 이상 - 예컨대, 7.0 내지 7.5, 7.5 내지 8.0, 8.0 내지 8.5, 8.5 내지 9.0이다. 마이크로웨이브 온도 내의 용매의 온도는 종종 55 ℃ 미만 - 예컨대, 50 ℃ 미만, 45 ℃ 미만, 40 ℃ 미만, 35 ℃, 또는 30 ℃ 미만이다. 특정 경우에, 암모니아 또는 아민 중 하나가 탈보호의 반응 혼합물에 포함된다.
아민의 비제한적인 예로는, 모노알킬 아민, 예로서 메틸 아민, 에틸 아민, 프로필 아민, 에탄올아민, 및 다이알킬 아민, 예로서 다이메틸 아민, 다이에틸 아민, 및 다른 아민, 예로서 DBU를 포함한다. 특정 경우에, 탈보호 단계는 90 % 초과 완료까지 30 분 미만이 소요된다. 종종, 탈보호 단계는 90% 초과 완료까지 25 분, 20 분, 15 분, 10 분 또는 5 분 미만이 소요된다.
또 다른 방법에서, 화합물 XO-SM-B-A는 용매의 부재하에서 탈보호된다. 이러한 화합물은 90 ℃ 내지 100 ℃의 범위의 온도까지 가열된다. 이는 종종 91 ℃ 내지 97 ℃, 92 ℃ 내지 96 ℃, 93 ℃ 내지 95 ℃의 범위이다. 특정 경우에, 상기 온도는 94 ℃이다.
이러한 온도는 1 시간 미만의 기간 동안 유지된다. 종종 이는 45 분 또는 30 분 미만 동안 유지된다. 특정 경우에 이는 20 분 미만 동안 유지된다.
무용매 탈보호 방법은 -C(O)OR1 보호 그룹의 90 % 초과를 제거를 초래한다. 종종 이는 보호 그룹의 92.5 % 또는 95 % 초과의 제거를 초래한다. 특정 경우에, 이는 보호 그룹의 97.5 % 또는 99 % 초과의 제거를 초래한다.
무용매 탈보호 방법은 추가적으로 화합물의 5 % 미만의 분해를 초래한다. 종종 이는 화합물의 4 % 또는 3 % 미만의 분해를 야기한다. 특정 경우에 이는 화합물의 2 % 또는 1 % 미만을 야기한다.
본 발명은 추가적으로 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 탈보호 방법에 관한 것이다. 보호된 화합물은 다음의 구조이고:
Figure pct00146
여기서 상기 구조 255의 치환기는 다음과 같다: "PL1" 및 "PL2"는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체이고, "Nu1" 및 "Nu2"는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A"는 핵염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹이다.
올리고뉴클레오타이드, 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체, 탈보호 방법은 용매 (예컨대, 물)의 존재하에서 화학물을 가열하는 단계를 포함한다. 특정 경우에, 용매의 pH는 6.0 내지 9.0 - 예컨대, 6.5 내지 7.5, 6.75 내지 7.25, 6.90 내지 7.10, 또는 대략 7.0이다. 다른 경우에, 용매의 pH는 7.0 초과 - 예컨대, 7.0 내지 10.0, 7.0 내지 9.0 또는 7.0 내지 8.0이다. 가열되는 화합물의 온도는 90 ℃ 내지 100 ℃의 범위이다. 이는 종종 91 ℃ 내지 99 ℃, 92 ℃ 내지 97 ℃, 93 ℃ 내지 95 ℃의 범위이다. 특정 경우에, 상기 온도는 94 ℃이다. 특정 경우에, 상기 온도는 94 ℃이다. 이러한 온도는 1 시간 미만의 기간 동안 유지된다. 종종 이는 45 분 또는 30 분 미만 동안 유지된다. 특정 경우에 이는 20 분 미만 동안 유지된다.
탈보호 방법은 올리고뉴클레오타이드/유사체 -C(O)OR1 보호 그룹의 90 % 초과를 제거를 초래한다.
종종 이는 보호 그룹의 92.5 % 또는 95 % 초과의 제거를 초래한다. 특정 경우에, 이는 보호 그룹의 97.5 % 또는 99 % 초과의 제거를 초래한다.
탈보호 방법은 추가적으로 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 5 % 미만의 분해를 초래한다. 종종 이러한 화합물의 4 % 또는 3 % 미만의 분해를 야기한다. 특정 경우에 이러한 화합물의 2 % 또는 1 % 미만을 야기한다.
또 다른 방법에서, 구조식 -C(O)OR60의 보호 그룹을 포함하며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, C(CH3)3)인 올리고뉴클레오타이드는, 마이크로웨이브 기법의 사용에 의해 용매의 존재하에서 탈보호된다. 예를 들어, Culf et al., Oligonucleotides 18:81-92 (2008), 및 Kumar et al, Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 24, pp. 5127-5129를 참고하며, 상기 두 문헌 모두는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
용매의 pH는 일반적으로 6.0 초과 또는 7.0 이상 - 예컨대, 7.0 내지 7.5, 7.5 내지 8.0, 8.0 내지 8.5, 8.5 내지 9.0이다. 마이크로웨이브 온도 내의 용매의 온도는 종종 55 ℃ 미만 - 예컨대, 50 ℃ 미만, 45 ℃ 미만, 40 ℃ 미만, 35 ℃, 또는 30 ℃ 미만이다. 특정 경우에, 암모니아 또는 아민 중 하나가 탈보호의 반응 혼합물에 포함된다.
아민의 비제한적인 예로는, 모노알킬 아민, 예로서 메틸 아민, 에틸 아민, 프로필 아민, 에탄올아민, 및 다이알킬 아민, 예로서 다이메틸 아민, 다이에틸 아민, 및 다른 아민, 예로서 DBU를 포함한다. 특정 경우에, 탈보호 단계는 90 % 초과 완료까지 30 분 미만이 소요된다. 종종, 탈보호 단계는 90% 초과 완료까지 25 분, 20 분, 15 분, 10 분 또는 5 분 미만이 소요된다.
또 다른 방법에서, 다음의 화합물이 용매의 부재하에서 탈보호되고
Figure pct00147
여기서 상기 구조 256의 치환기는 다음과 같다: "PL1" 및 "PL2"는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체이고, "Nu1" 및 "Nu2"는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 염)이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A"는 핵염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹이다.
이러한 화합물은 90 ℃ 내지 100 ℃의 범위의 온도까지 가열된다. 이는 종종 91 ℃ 내지 97 ℃, 92 ℃ 내지 96 ℃, 93 ℃ 내지 95 ℃의 범위이다. 특정 경우에, 상기 온도는 94 ℃이다. 이러한 온도는 1 시간 미만의 기간 동안 유지된다. 종종 이는 45 분 또는 30 분 미만 동안 유지된다. 특정 경우에 이는 20 분 미만 동안 유지된다.
올리고뉴클레오타이드 또는 유사체의 무용매 탈보호 방법은 -C(O)OR1 보호 그룹의 90 % 초과를 제거를 초래한다. 종종 이는 보호 그룹의 92.5 % 또는 95 % 초과의 제거를 초래한다. 특정 경우에, 이는 보호 그룹의 97.5 % 또는 99 % 초과의 제거를 초래한다.
무용매 탈보호 방법은 추가적으로 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 5 % 미만의 분해를 초래한다. 종종 이러한 화합물의 4 % 또는 3 % 미만의 분해를 야기한다. 특정 경우에 이러한 화합물의 2 % 또는 1 % 미만을 야기한다.
본 발명은 추가적으로 중합체 (예컨대, DNA 올리고뉴클레오타이드) 합성을 위한 기기에 관한 것이다. DNA 합성기에 관한 논의는 다음을 참조한다: 미국 특허 제5,368,823호; 미국 특허 제5,472,672호; 미국 특허 제5,529,756호; 미국 특허 제5,837,858호. 전술한 참조 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
본 발명의 기기는 일반적으로 대상 중합체의 합성에 사용되는 화학적 화합물을 포함하는 하나 이상의 저장조를 포함하며, 이러한 저장조는 (예컨대, 액체 매질 중의) 다양한 시약의 합성 챔버 (예컨대, 고체 지지체를 포함하는 컬럼)으로 흐름을 가능하게 하는 시스템에 작동 가능하게 연결된다. 시약 흐름 (예컨대, 기체 압력)을 합성 챔버로 도입하는 기기 내의 매커니즘이 존재하며, 여기서 중합체 합성의 다양한 화학 반응이 수행된다. 합성 챔버는 이의 온도를 제어하기 위한 내부 또는 외부 수단(예컨대, 마이크로웨이브 장치 또는 가열된 재킷)을 포함한다. 합성된 중합체는 액체 흐름을 제어하는 밸브를 통해 합성 챔버를 나간다. 컴퓨터 제어기는 일반적으로 저장조로부터 화합물의 흐름, 합성 챔버의 온도 및 기기로부터 중합체의 배출을 조절하도록 사용된다.
도 1을 참조하면, 컴퓨터 제어 유닛은 채널의 네트워크 시스템 중의 기체 압력을 제어한다. 기체 압력은 다음의, DNA 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용되는 다양한 화학적 화합물의 흐름 - "뉴클레오사이드 A, 저장조 1", "뉴클레오사이드 C, 저장조 2", "뉴클레오사이드 G, 저장조 3", "뉴클레오사이드 T, 저장조 4", "세척", "시약 1, 저장조", "시약 2, 저장조", "시약 3, 저장조", "시약 4, 저장조", "탈보호, 제제 1", 및, "탈보호, 제제 2" - 을 고체 지지체를 포함하는 합성 지지체 컬럼으로 다음을 향하게 한다. 합성 컬럼으로 화학적 도입의 정확한 순서는 DNA 올리고머에 결합된 보호된, 고체 지지체를 제조하도록 컴퓨터 제어 유닛에 의해 지시된다. 합성 컬럼에 작동 가능하게 연결된 온도 제어 유닛 컬럼의 온도를 조절하여 올리고뉴클레오타이드로부터 하나 이상의 유형의 보호 그룹의 제거를 용이하게 하거나, 이를 초래하고; 특정 경우에 온도 제어 유닛은 추가적으로 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 제거를 용이하게 하거나, 이를 초래하여, 관심의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
특정 경우에, 합성 컬럼 및 관련 온도 제어기는 중성 조건 (즉, 대략 7.0에서 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용되는 액체 매질의 pH) 하에서 올리고뉴클레오타이드로부터 하나 이상의 BOC 그룹의 제거하도록 설계된다. 합성 컬럼의 고체 지지체에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 5 분 내지 20 분 범위의 기간 동안 91 ℃ 내지 99 ℃ (또는 대략 94 ℃)의 온도로 가열함으로써 수행된다.
특정 경우에, 합성 컬럼 및 관련 온도 제어기는 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드를 제거하도록 설계된다. 이것은, 삼차 알킬 그룹이 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체에 연결하도록 사용되는 경우, 또는 삼차 알킬 그룹이 올리고뉴클레오타이드와 고체 지지체 사이의 링커의 일부인 경우 일어날 수 있다. BOC 제거와 마찬가지로, 고체 지지체로부터 올리고머의 분열은 중성 조건 하에서 일어나며, 고체 지지체 화합물을 91 ℃ 내지 99 ℃에서 5 분 내지 20 분 범위의 기간 동안 가열하는 단계를 포함한다.
실험 섹션
DNA 합성은 Biosearch 8750 합성기와 Cruachem DNA 아미다이트 상에서 수행하였다.
음이온 교환 HPLC 분석은 다음과 같이 수행하였다: 농도에 의존하여, 2-20 mL의 수성 샘플을 Dionex 음이온 교환 컬럼 (4.6 x 250 mm)에 주입하였다; 샘플을 (A) 0.025 M TRIS HCl 및 0.01 M TRIS, 및 (B) 0.025 M TRIS HCl, 0.01 M TRIS 및 1.0 M NaCl의 수성 완충제로 1 :0 내지 0: 1의 선형 구배를 사용하여 20 분에 걸쳐 2 mL/min으로 용리시키고, 260 nm에서 UV 검출하였다.
염기 조성 분석을 위한 샘플은 이전에 기재된 바와 같이 처리하였고16, 다음에 따른 역상 HPLC에 의해 분석하였다: 20 uL의 수성 샘플을 HAISIL HL C18 5 m 컬럼 (4.6 x 150 mm) 상에 주입하였다; 샘플을 (A) 0.1M TEAA, 5% 아세토나이트릴, (B) 아세토나이트릴의 완충제로, 1 :0 내지 0: 1의 선형 구배를 사용하여 20 분에 걸쳐 1 mL/min으로 용리시키고, 260 nm에서 UV 검출하였다.
Figure pct00148
Figure pct00149
5'- O -(4, 4'다이메톡시트리릴 )- N 6 ,N 6 -( 다이 - tert - 뷰틸옥시카본일 ) 디옥시아데노신-3'- O-NN -다이아이소프로필사이아노에틸 포스포아미다이트 (구조 257).
5'-O-(4,4'다이메톡시트리틸)-N6-(벤조일)디옥시아데노신, (50 g, 76 mM) 및 이미다졸, (20 g, 0.294 M)에, 700 mL 건조 피리딘 및 50 g (O.333 M) tert -뷰틸다이메틸실릴 클로라이드를 첨가하였다.
이러한 용액을 18 시간 동안 교반하였다. 피리딘을 회전 증발에 의해 제거하고 잔류물을 700 mL의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 유기 상을 500 ml의 0.5 M K2HPO4, 이에 뒤이어 500 mL의 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 용액을 증발시켜, 62 g의 생성물 5'-O-(4,4'다이메톡시트리틸)-N6-(벤조일)-3'-O-tert -뷰틸다이메틸실릴-디옥시아데노신을 수득하였다. 900 mL의 메탄올 중의 이러한 생성물의 용액에 100 mL의 농축된 수성 암모니아를 첨가하였다. 짧게 저은 후, 용액을 밤새 방치하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 고체를 700 mL의 건조 피리딘 및 20 mL TEA에 재용해시키고, 50 g 다이-tert -뷰틸 파이로카보네이트를 첨가하였다. 이러한 용액을 18 시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 500 mL DCM에 용해시키고 이러한 용액을 500 mL 0.5 M KH2PO4으로 세척하였다.
유기상을 DMF 중 2% 메탄올 및 2% 피리딘으로 패킹된, 10 X 35 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 6% 메탄올에 대한 구배를 10 L의 용매 이상 컬럼에 적용하고, 순수한 5'-O-DMT-3'-O-tert -뷰틸다이메틸실릴-N6,N6-(다이-tert -뷰틸옥시카본일)-디옥시아데노신을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 농축시켰다. 수율은 42 g이었다(55 mM, DMT dA(Bz)으로부터 72 %).
THF 중의 60 mL 1 M TBAF 및 500 mL의 THF 중의 10 mL의 HOAc의 용액을 첨가함으로써 TBDMS 그룹을 제거하였다. 18 시간 이후 50 mL 포화 NaHCO3를 첨가하고 THF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 600 mL DCM에 용해시키고 400 mL 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 유기상을 DCM 중 2% 메탄올 및 2% 피리딘으로 패킹된, 10 X 35 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 6% 메탄올에 대한 구배를 14 L의 용매 이상 컬럼에 적용하고, 순수한 5'-O-DMT-N6,N6-(다이-tert -뷰틸옥시카본일)-디옥시아데노신을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 농축시켰다. 수율은 32 g이었다(42.5 mM, 5'-O-DMT-3'-O-tert-뷰틸다이메틸실릴-N6,N6-(다이-tert -뷰틸옥시카본일)-디옥시아데노신으로부터 89%). 1H NMR (400 mHz, CDCl3, PPM) 8.78 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.3 - 7.6 (m, 9H), 6.8 (d, 4H), 6.5 (t, 1H), 4.7 (s, 1H), 3.8 (s, 6H), 3.42 (d, 2H), 2.8 (m, 1H), 2.55 (m, 1H), 1.46 (s, 18H).
800 mL 건조 아세토나이트릴 중의 2-사이아노에틸-N,N,N',N'-테트라아이소프로필포스포로다이아미다이트 (15 g, 50 mM) 및 1H-테트라졸 (1 g, 14 mM)의 용액을 제조하고, 1 분의 혼합 후, 이를 32 g (49 mM)의 건조된 5'-O-DMT-N6,N6-(다이-tert-뷰틸옥시카본일)-디옥시아데노신을 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 뉴클레오사이드는 2 시간 동안 저으면서 천천히 용해되었다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 300 mL의 포화 NaHCO3 용액을 포함하는 EtOAc, 700 ml에 용해시켰다. 혼합물을 진탕시키고 분리시키고, 유기상을 EtOAc 중의 2% 피리딘으로 패킹된, 10 X 25 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 일정하게 용리시키고, 및 순수한 257을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 33.9 g으로 농축시켰다 (35.6 mM, 보호된 뉴클레오사이드로부터 84% 수율). 31P NMR (161 mHz, CDCl3, PPM): 149.617, 149.410. C50H64N7O10P에 대한 분석적 계산치: C, 62.95. H, 6.76. N, 10.28. 관찰 수치: C, 63.20. H, 6.79. N, 10.21.
5'- O -(4, 4'다이메톡시트리틸 )-N 4 -( tert - 부틸옥시카르보닐 ) 디옥시사이토신 - 3'- O -Ν,Ν-다이아이소프로필 사이아노에틸 포스포아미다이트 (구조 258).
건조 5'-O-(4,4'다이메톡시트리틸)-N4-(아세틸렌) 디옥시사이토신 (50 g, 87.4 mM)에 이미다졸 (20 g, 0.294 M), 700 mL 건조 피리딘, 및 50 g (O.333 M) tert -뷰틸다이메틸실릴 클로라이드를 첨가하였다. 용액을 18 시간 동안 교반하고, 피리딘을 회전 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 700 mL의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 유기 상을 500 ml의 0.5 M K2HPO4, 이에 뒤이어 500 mL의 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 증발시켜 56 g (81 mM)의 5'-O-(4,4'다이메톡시트리틸)-N4- ((아세틸)-3'-O-tert-뷰틸다이메틸실릴-디옥시사이토신을 수득하였다.
900 mL의 메탄올 중의 이러한 생성물의 용액을 제조하고, 이러한 용액에 100 mL의 농축된 수성 암모니아를 첨가하였다. 짧게 저은 후, 용액을 밤새 방치하였다. 건조 후, 고체를 700 mL의 건조 피리딘에 재용해시키고, 용매를 회전 증발 및 고진공에 의해 밤새 제거하였다. 고체를 700 mL의 건조 THF에 재해시키고, 20 g의 건조 K2CO3를 첨가하였다. 10 분 후, 50 g (229 mM)의 다이-tert -뷰틸 파이로카보네이트를 첨가하였다. 이러한 용액을 18 시간 동안 교반하였다. K2CO3를 여과에 의해 제거하고, 200 mL의 0.5 M KH2PO4를 첨가하였다. THF를 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 500 mL DCM에 용해시키고 500 mL 0.5 M KH2PO4로 세척하였다. 유기상을 DCM 중 1% 메탄올 및 1% 피리딘으로 패킹된, 10 X 35 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 용리된 밴드를 포함하는 첫 번째 DMT 이후 2% 메탄올에 대한 구배를 컬럼에 적용시키고, 순수한 5'-O-DMT-3'-O-tert -뷰틸다이메틸실릴-N4-(tert -뷰틸옥시카본일)-디옥시사이토신을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 농축시켰다. 수율은 28 g (37.6 mM, DMT dC(Ac)로부터의 43 % 수율). THF 중의 60 mL 1 M TBAF 및 500 mL의 THF 중의 10 mL의 HOAc의 용액을 첨가함으로써 TBDMS 그룹을 제거하였다. 18 시간 이후, 포화 NaHCO3 (50 mL)를 첨가하고 THF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 600 mL DCM에 용해시키고 400 mL 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 유기상을 DCM 중 2% 메탄올 및 2% 피리딘으로 패킹된, 10 X 35 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 6% 메탄올에 대한 구배를 10 L의 용매 이상 컬럼에 적용하고, 순수한 5'-O-DMT-N4-(tert -뷰틸옥시카본일)-디옥시사이토신을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 농축시켰다. 수율은 20 g이었다(31.7 mM, 5'-O-DMT-3'-O-tert-뷰틸다이메틸실릴-N4-tert-뷰틸옥시카본일-디옥시사이토신으로부터 84%). 1H NMR (400 mHz, CDCl3, PPM): 8.2 (d, 1H), 7.3 (m, 9H), 7.0 (d, 1H), 6.85 (d, 4H), 6.3 (t, 1H), 4.5 (dd, 1H), 4.15 (dd, 1H), 3.8 (s, 6H), 3.5 (dd, 2H), 3.4 (dd, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 1.5 (s, 18H).
500 mL 건조 아세토나이트릴 중의 2-사이아노에틸-N, N, N', N'-테트라아이소프로필포스포로다이아미다이트, 9 g (30 mM) 및 1H-테트라졸, 650 mg (9 mM)의 용액을 제조하고, 1 분의 혼합 후, 이를 20 g (31.7 mM)의 건조된 5'-O-DMT-N4 -(-tert-뷰틸옥시카본일)-디옥시사이토신에 첨가하였다. 뉴클레오사이드를 저으며 천천히 용해시키고, 2 시간 후 용매를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 500 mL EtOAc에 용해시키고 200 mL의 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 분리된 유기상을 EtOAc 중의 2% 피리딘으로 패킹된, 5 X 25 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 일정하게 용리시키고, 및 순수한 258을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 19.5 g(23.5 mM), 뉴클레오사이드로부터 74% 수율로 농축시켰다. 31P NMR (161 mHz, CDCl3, PPM): 149.997, 149.339. C44H56N5O9P에 대한 분석 계산치: C, 63.68. H, 6.80. N, 8.44. 관찰 수치: C, 63.59. H, 6.69. N, 8.52.
5 , - O -(4, 4'다이메톡시트리틸 )-N 2 -( tert - 뷰틸옥시카본일 ) 디옥시구아노신 - 3 , - O -N,N-다이아이소프로필사이아노에틸 포스포아미다이트 (구조 259).
건조 5'-O-(4,4'다이메톡시트리틸)-N2-(아이소뷰티릴)디옥시구아노신 (100 g, 156 mM)에 1200 mL 건조 피리딘 중의 이미다졸 (40 g, 0.588 M) 및 100 g (0.666 M) tert-뷰틸다이메틸실릴 클로라이드를 첨가하였다. 용액을 18 시간 동안 교반하고, 피리딘을 회전 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 700 mL의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 유기 상을 500 ml의 0.5 M K2HPO4, 이에 뒤이어 500 mL의 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 건조하여 110 g (145 mM)의 생성물 5'-O-(4,4'다이메톡시트리틸)-N2-(아이소뷰티릴)-3'-O-tert-뷰틸다이메틸실릴 -디옥시구아노신을 생성하였다. 1500 mL의 메탄올 중의 이러한 생성물의 용액을 제조하고, 이러한 용액에 150 mL의 농축된 수성 암모니아를 첨가하였다. 짧게 저은 후, 용액을 밤새 방치하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 건조된 고체를 1400 mL의 건조 THF에 재해시키고, 40 g의 건조 K2CO3를 첨가하였다. 10 분의 교반 후, 100 g의 다이-tert -뷰틸 파이로카보네이트를 첨가하였다. 이러한 용액을 3 시간 동안 교반하였다. TLC는 부분적인 전환을 나타냈다(실리카, 2 % MeOH, DCM 중의 2% 피리딘, rf 출발 물질 0.3, rf 생성물 0.7, 10 % H2SO4 및 가열로 시각화). 반응 시간이 길수록, 원하는 생성물은 더 적어지고, 부반응 물질이 많아졌다. K2CO3를 여과에 의해 제거하고, 400 mL의 0.5 M KH2PO4를 첨가하였다. THF를 회전 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 700 mL DCM과 혼합하였다. 유기상을 DMF 중 2% 메탄올 및 2% 피리딘으로 패킹된, 10 X 35 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 10% 메탄올에 대한 구배를 14 L의 용매 이상 컬럼에 적용하고, 순수한 5'-O-DMT-3'-O-tert -뷰틸다이메틸실릴-N2-(tert -뷰틸옥시카본일)-디옥시구아노신을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 농축시켰다. 수율은 25 g이었다(34 mM, DMT dG(iBu)로부터 22% 수율). THF 중의 60 mL 1 M TBAF 및 500 mL의 THF 중의 10 mL의 HOAc의 용액을 첨가함으로써 TBDMS 그룹을 제거하였다. 18 시간 이후, 포화 NaHCO3 50 mL를 첨가하고 THF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 600 mL DCM에 용해시키고 400 mL 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 유기상을 회전 증발에 의해 거품으로 농축시켜 5'-O-DMT-N2-(tert -뷰틸옥시카본일)-디옥시구아노신을 수득하였다(19.5 g, 29.1 mM, 5'-O-DMT-3'-O-tert -뷰틸다이메틸실릴-N2-(tert -뷰틸옥시카본일)-디옥시구아노신으로부터 86 %). 이러한 물질은 다음 단계를 위해 충분히 순수했다. 분석 샘플을, 상기 기재된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 2% 메탄올 및 2% 피리딘으로 패킹된, 10 X 35 cm 실리카 컬럼 상에 제조하였다 . 6% 메탄올에 대한 구배를 10 L의 용매 이상 컬럼에 적용하고, 순수한 생성물을 포함하는 분획을 모아 증발시켰다. 1H NMR (400 mHz, CDCl3, PPM) 7.7 (m, 1H), 7.2 - 7.4 (m, 10H), 6.8 (d, 4H), 6.2 (t, 1H), 5.7 (s, 2H), 4.65 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.8 (s, 6H), 3.35 (m, 2H), 2.7 (m, 1H), 2.45 (m, 1H), 1.6 (s, 18H).
400 mL 건조 아세토나이트릴 중의 2-사이아노에틸-N, N, N', N'-테트라아이소프로필-포스포로다이아미다이트 (12 g, 40 mM) 및 1H-테트라졸 (1 g, 14 mM)의 용액을 제조하고, 1 분의 혼합 후, 이를 19.5 g (29.1 mM)의 건조된 5'-O-DMT-N -(tert-뷰틸옥시카본일)-디옥시구아노신을 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 뉴클레오사이드를 저으며 천천히 용해시키고, 2 시간 후 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 100 mL의 포화 NaHCO3 용액을 포함하는 EtOAc (500 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 진탕시키고 분리시키고, 유기상을 EtOAc 중의 2% 피리딘으로 패킹된, 6 X 25 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 일정하게 용리시키고, 및 순수한 259을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 12 g(14 mM, 뉴클레오사이드로부터 45% 수율)로 농축시켰다. 31P NMR (161 mHz, CDCl3, PPM): 149.213, 149.175. C45H56N7O9P에 대한 분석 계산치: C, 62.13. H, 6.49. N, 11.27. 관찰 수치: C, 62.22. H, 6.69. N, 11.02.
5'- O -(4, 4'다이메톡시트리릴 )-N 3 -( tert - 뷰틸옥시카본일 )- 티미딘 -3'- O - N,N - 다이아이소프로필사이아노에틸 포스포아미다이트 (구조 260).
5'-O-(4,4'다이메톡시트리틸)-티미딘, 50 g (91.5 mM)을 700 mL의 건조 피리딘으로부터 회전 증발 및 밤새 고진공에 의해 건조시켰다. 이미다졸 20 g (0.294 M)을 700 mL 건조 피리딘 및 50 g (O.333 M) tert -뷰틸다이메틸실릴 클로라이드와 함게 첨가하였다. 용액을 18 시간 동안 교반하고, 그 결과 TLC는 완전한 전환을 나타냈다(실리카, 10 % MeOH, DCM 중의 2% 피리딘, rf 출발 물질 0.5, rf 생성물 0.9, 10 % H2SO4 및 가열로 시각화). 피리딘을 회전 증발에 의해 제거하고 생성물을 700 mL의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 이러한 용액을 500 ml의 0.5 M K2HPO4, 이에 뒤이어 500 mL의 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 용액을 증발시키고 밤새 고진공을 실시하였다. 수율은 60 g, 90.8%이었다. 이러한 생성물의 50 g을 THF 1 L에 용해시키고, 아르곤 하에서 25 g의 무수 K2CO3를 첨가하였다. 혼합물을 30 분간 교반하고, 50 g의 다이tert뷰틸파이로카보네이트를 첨가하였다. 이것이 완전히 용해된 후, 12 g의 DMAP를 첨가하였다. 밤새 교반한 후, TLC는 완전한 반응을 나타냈다 (1 : 1 석유 에터 : 에틸 아세테이트, 2% 피리딘 rf 출발 물질 0.4, rf 생성물 0.8). THF을 회전 증발에 의해 제거하고 잔류물을 700 mL의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 유기 상을 500 ml의 0.5 M K2HPO4, 이에 뒤이어 500 mL의 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 유기상을 49% 에틸 아세테이트, 49% 석유 에터 및 2% 피리딘으로 패킹된, 10 X 35 cm 실리카 컬럼 에 첨가하였다. 컬럼을 일정하게 용리시키고, 및 순수한 5'-O-DMT-3'-O-tert -뷰틸다이메틸실릴-N3-(tert -뷰틸옥시카본일)-티미딘을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 농축시켰다.
수율은 49.3 g, 86% 수율이었다. THF 중의 60 mL 1 M TBAF 및 500 mL의 THF 중의 10 mL의 HOAc의 용액을 첨가함으로써 TBDMS 그룹을 제거하였다. 18 시간 이후, TLC는 완전한 전환을 나타냈다(실리카, 2 % MeOH, DCM 중의 2% 피리딘, rf 출발 물질 0.60, rf 생성물 0.2, 10 % H2SO4 및 가열로 시각화). 포화 NaHCO3 50 mL를 첨가하고 THF를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 600 mL EtOAc에 용해시키고 400 mL의 물, 이에 뒤이어 400 mL의 포화 NaHCO3으로 세척하였다.
유기상을 회전 증발에 의해 타르로 농축시킨 후, 200 mL의 DCM에 재용해시키고, DCM 중의 2% 메탄올 및 2% 피리딘으로 패킹된, 10 X 35 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 6% 메탄올에 대한 구배를 10 L의 용매 이상 컬럼에 적용하고, 순수한 순수한 5'-O-DMT-N3-(tert -뷰틸옥시카본일)-티미딘을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 농축시켰다. 수율은 35 g (54.3 mM), 5'-O-DMT-3'-O-tert -뷰틸다이메틸실릴-N3-(tert-뷰틸옥시카본일)-티미딘으로부터 84%이었다. 1H NMR (400 mHz, CDCl3, PPM): 8.6 (d, 2H), 7.4 - 7.2 (m, 9H), 6.7 (dd, 4H), 6.37 (t, 1H), 4.6 (dd, 1H), 4.15 (dd, 1H), 3.8 (s, 6H), 3.5(dd, 1H), 3.4 (dd, 1H), 2.7 (d, 1H), 2.35 (m, 2H), 1.6 (s, 9H), 1.45(s, 3H). 25 g (45 mM)의 생성물을 건조 피리딘 500 mL 중의 용액에 의해 건조시키고, 용매를 회전 증발, 이에 뒤이어 밤새 고진공에 의해 제거하였다. 500 mL 건조 아세토나이트릴 중의 2-사이아노에틸-N, N, N', N'-테트라아이소프로필포스포로다이아미다이트, 15 g (50 mM) 및 1H-테트라졸, 650 mg (9 mM)의 용액을 제조하고, 1 분의 혼합 후, 이를 25 g (45 mM)의 건조된 5'-O-DMT-N3 -(-tert-뷰틸옥시카본일)-티미딘을 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 뉴클레오사이드를 저으며 천천히 용해시키고, 2 시간 후 TLC는 완전한 전환을 나타냈다(실리카, EtOAc 중의 2% 피리딘, rf 출발 물질 0.30, rf 생성물 0.75, 두 개의 부분 입체 이성질체 스팟으로서, 0.5 % AgNO3 및 가열에 의해 시각화). 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 200 mL의 포화 NaHCO3 용액을 포함하는 EtOAc, 500 ml에 용해시켰다. 혼합물을 진탕시키고 분리시키고, 유기상을 49% 에틸 아세테이트, 49% 석유 에터, 및 2% 피리딘으로 패킹된, 5 X 25 cm 실리카 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 일정하게 용리시키고, 및 순수한 260을 포함하는 분획을 모아 회전 증발에 의해 25.5 g(29.6 mM), 뉴클레오사이드로부터 76.3% 수율로 농축시켰다. 31P NMR (161 mHz, CDCl3, PPM): 149.711, 149.105. C45H57N4O10P에 대한 분석 계산치: C, 63.97. H, 6.80. N, 6.63. 관찰 수치: C, 63.74. H, 6.64. N, 6.78.
Boc 보호된 리보뉴클레오사이드 포스포아미다이트의 일반적인 합성.
RNA의 합성을 위한 이러한 시약은 상업적인 염기-보호된 5'-O-DMT-2'-O-TBDMS 리보뉴클레오사이드 3 '-포스포아미다이트를 암모니아로 처리하여, 핵염기 상의 보호 그룹을 제거하는 처리에 의해 제조하였다. 이의 다이-tert -뷰틸 파이로카보네이트를 사용한 처리는 RNA 합성을 위한 원하는 Boc-보호된 시약을 제공하였다.
예를 들어, riboC 시약의 제조이다.
Figure pct00150
5'-O-DMT-2'-O-TBDMS-N4-아세틸사이토신 3'-O-(N,N-다이아이소프로필사이아노에틸 포스포-아미다이트)를 메탄올 중의 수성 암모니아로 N-탈보호하였다. 생성물을 잘 건조하고, THF 중의 다이-tert -뷰틸 파이로카보네이트 및 포타슘 카보네이트로 처리하였다. 생성물 Boc RNA 아미다이트를 컬럼 크로마토그래피에 의해 단리하였다. 마찬가지로, 완전히 보호된 N6-다이Boc-아데노신, N2-Boc-구아노신, 및 N-1-Boc-우리딘 포스포아미다이트를 제조하였다.
CPG - Boc - 뉴클레오사이드의 일반적인 합성
건조 피리딘에서 5'-DMT-N-(Boc) 뉴클레오사이드를 무수 다이글리콜산 및 촉매의 N-메틸이미다졸로 처리하고, 결과의 3'-에스터를 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. CPG과 함께 두꺼운 슬러리를 형성하기에 충분한 아세토나이트릴에서 10 g의 1000 A 아미노프로필 CPG를 400 mg의 글리콜레이트, 400 mg의 BOP 및 400 μl의 N-메틸모폴린으로 처리하였다. 밤새 방치한 이후, 세척, 캡핑 및 건조하여 30 마이크로몰/g의 로딩으로 유도체화된 CPG를 수득하였다.
T 10 올리고뉴클레오타이드 상의 단일 Boc 잔류물의 탈보호를 위한 시간 경과
Boc - dC -T10의 제조 및 탈보호
dC 아미다이트를 T-10과 커플링시키고, DNA를 분열시키고 3 시간 동안 실온에서 메탄올 (1 mL) 중의 25 % 2-메톡시에틸아민으로 분열 및 탈보호하여, CPG을 제거하고, 증발 건조하고, DI 물 (1 mL)에 재용해시켰다.
ESMS는 여전히 부착되어 있는 t-뷰틸 그룹 (M + 100)을 가지는 DNA의 정확한 질량을 나타냈다. 가열 유도된 N-4-Boc-dC 탈보호를 지켜보도록 RP HPLC를 사용하였다; Boc 보호된 dC-T-10은 더 긴 체류 시간을 가지며, 이를 가지지 않는 올리고로부터 기준선 분리되었다. 적분은 용액 내 각각의 종의 상대적인 양을 제공하였다. 3 시간의 시간 경과는 15 분의 완전한 탈보호를 나타냈다; 12 분의 시간 경과는 (아래 참조) 약 6 분의 T½를 가지며 규칙적인 탈보호를 나타냈다.
Figure pct00151
( Boc ) 2 - dA -T 10 의 탈보호
BisBoc-dA 아미다이트를 T-10과 커플링시키고, DNA를 분열시키고 3 시간 동안 실온에서 메탄올 (1 mL) 중의 25 % 2-메톡시에틸아민으로 분열 및 탈보호하여, CPG을 제거하고, 증발 건조하고, DI 물 (1 mL)에 재용해시켰다. ESMS는 여전히 부착되어 있는 t-뷰틸 그룹 (M + 100)을 가지는 DNA의 정확한 질량을 나타냈다. 가열 유도된 Boc 탈보호를 지켜보도록 RP HPLC를 사용하였다. 15 분의 시간 경과는 약 7 분의 T½을 가지며 15분 동안 80%의 탈보호를 나타냈다. NMR 및 ESMS 데이터는 하나의 t-뷰틸 카보네이트가 CPG로부터 올리고뉴클레오타이드의 제거 동안 염기 처리에 의해 제거되고, 단일 아데닌 잔기 상에 단일 Boc를 남기는 것을 나타낸다.
Figure pct00152
올리고뉴클레오타이드 내 Boc-보호된 dA의 탈보호에 대한 시간 경과
Boc -보호된 RNA
리보뉴클레오사이드 아미다이트를 10 - 15 분의 커플링 시간으로 적어도 90%의 효율로 T10로 커플링하였다. 각각은 T-10으로 커플링하였고 RP HPLC로 조사하였다. 이들은 인 NMR에 의해 98%의 순도를 가졌다. 샘플을 94 ℃에서 1 시간 동안 가열할 ??, Boc 그룹의 완전한 제거가 모든 경우에서의 가열 시 관찰되었다. 결과를 ESMS에 의해 확인하였다. 각각의 종의 양을 용이하게 평가하기 위해 HPLC를 사용하는, 전환율을 측정하기 위한 시간 경과가 나타난다. rC- 및 rA-T10 올리고뉴클레오타이드에 대한 결과가 하기 나타난다:
Figure pct00153
Figure pct00154
Boc -보호된 PCR 프라이머의 탈보호
Boc-dG CPG (1 umol)에서 Boc dA, dC, 및 dG 아미다이트를 사용하여 RNaseP 정방향 프라이머 19-mer [AGATTTGGACCTGCGAGCG]를 합성하였다. 이러한 프라이머에 있어서 완전히 탈보호된 질량은 5868 g/mol이며, 보호에 대한 예상 질량은 7369 g/mol이다 [15 Boc 잔기 · 100 amu/Boc = 1500 첨가됨]. 곁 사슬 보호 그룹의 탈보호는 메탄올 (1 mL) 중의 25 % 2-메톡시에틸아민으로 3 시간 동안 실온에서 수행하여, CPG를 제거하고, 증발 건조하고, DI 물 (1 mL)에 재용해시켰다. Boc 그룹이 소수성 핸들로서 사용될 수 있기 때문에, 분열 전에 DMT를 제거하였다. 1 mL 카트리지에 패킹된 20 - 50 마이크론 폴리스타이렌 비드로 생성물을 탈염시키고 20% ACN/H2O에 용리시켰다.
탈염된 Boc-프라이머를 각각 100 uL의 3 개의 미세 마이크로퍼지 튜브에 나누었다. 샘플을 건조시키고 1 mL의 하우스 DI 물에 넣었다. 첫 번째 튜브에 오직 물만 첨가하였다. 두 번째 튜브에 1 mL의 PCR 완충액 pH 8.5, IX와 함께 MgCl2를 6mM의 최종 농도 (표준 PCR 농도)까지 첨가하였다. 세 번째 튜브에 TEAA를 0.025 N의 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 3 개의 샘플 각각을 10 개의 200uL 얇은 벽의 PCR 튜브에 나누어, 총 30개의 튜브로 나누었다. 모든 프라이머 제조는 실온에서 이루어졌다.
ABI 9700 서모사이클러를 94 ℃로 예열하였다. 각각의 샘플을 가열 블록에 넣고, 시점에서 제거하고, 드라이 아이스에 놓아 반응을 중단시켰다. 음성 대조군으로서, T=O 샘플은 가열하지 않고 실험 초기에 직접 얼음에 놓았다. 샘플을 실온에서 해동시키고, HPLC 및 질량 분광 분석을 위해 96-웰 플레이트로 옮겼다.
매 시점마다, 역상 및 질량 분광 데이터를 수집하여 Boc 보호 그룹의 제거를 추적하였다. Boc 보호된 프라이머는 단일 종이 아니라 보호의 다양한 단계에서 수집된 것이다. T=O 샘플에서, 100의 질량 단위가 상이한 일련의 종은, 아마도 질량 분광기의 고온의 유입 포트에 노출되어, 일부 Boc 그룹이 이미 떨어져 나간 것을 보여준다.
가열 이전 HPLC:
Figure pct00155
가열 이전 ESMS:
Figure pct00156
10분 후, 거의 모든 Boc 그룹이 떨어져 나갔다; 그러나 일부는 TEAA 샘플에 남아있었다. 15분 후 TEAA에서, 모든 그룹이 제거되었다. 중요한 것은, 프라이머가 일반적인 PCR 완충 하에서 10분 후 탈보호 된다.
가열 이후 HPLC:
Figure pct00157
가열 이후 ESMS:
Figure pct00158

Claims (40)

  1. 구조식 XO-CH2-SM-B-A의 화합물, X는 H, 산 불안정성 보호 그룹, 고체 지지체, -P(O-R1)NR2R3, -P(O)(OH)H, -Ρ(O)(OR)Η, -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이고, 여기서 R1은 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고, R2 및 R3는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이거나, 또는 R2 및 R3는 조합하여 사이클릭, 접합된, 접합된 사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, SM는 천연 퓨라노실이 아닌 당 모이어티 또는 이의 유사체이고, B는 염기 모이어티 또는 이의 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR4의, 염기 모이어티 상의 또는 내의 질소에 부착된 모이어티이며, 여기서 R4는 삼차 알킬임.
  2. 제 1항에 있어서, SM은 다음의 모이어티로부터 선택되고, 여기서 "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체이고; "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이고, 구조식 -C(O)OR1이며, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹이고; "X1"은 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, 고체 지지체는 선택적으로 산소와 고체 지지체 사이에 링커를 포함하고; Y는 OH 또는 OR2이며, 여기서 R2은 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; Z는 H, OH 또는 OR3이며, 여기서 R3은 보호 그룹, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R4 및 R5는, 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 또는 치환된 아릴이고; "m" 및 "o"는 독립적으로 0, 1 또는 2이고; "R"은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R6은 H, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; R7은 OH, 할라이드, OR8, NR9R10이며, 여기서 R8은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 또는 치환된 아릴이고, 여기서 R9 및 R10은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 또는 치환된 아릴인 화합물:
    Figure pct00159

    Figure pct00160

    Figure pct00161

    Figure pct00162

    Figure pct00163

    Figure pct00164

    Figure pct00165

    Figure pct00166

    Figure pct00167

    Figure pct00168

    Figure pct00169

    Figure pct00170

    Figure pct00171

    Figure pct00172

    Figure pct00173

    Figure pct00174

    Figure pct00175

    Figure pct00176

    Figure pct00177

    Figure pct00178
  3. 제1항에 있어서, "B"는 다음의 모이어티로부터 선택되고, "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹이고; "M"은 N 또는 CR3이고, 여기서 R3은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR4R5이고, 여기서 R4 및 R5는, 독립적으로 H 또는 알킬이고; 여기서 R12은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR4R5이고, 여기서 R4 및 R5는, 독립적으로 H 또는 알킬이고; "D" 및 "E"는 독립적으로 N 또는 CR3이고, 여기서 R3은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR4R5이고, 여기서 R4 및 R5는, 독립적으로 H 또는 알킬인 화합물:
    Figure pct00179

    Figure pct00180

    Figure pct00181

    Figure pct00182

    Figure pct00183

    Figure pct00184

    Figure pct00185

    Figure pct00186

    Figure pct00187

    Figure pct00188

  4. 제1항에 있어서, "A"는 다음의 모이어티로부터 선택되는 모이어티인 화합물: -C(CH3)3; -C(CH3)2(CH2CH3); -C(CH3)(CH2CH3)(CH2CH2CH3); -C(R14)(R15)-링커-표지; 및 -C(R14)(R15)-링커-[고체 지지체], 여기서 R14 및 R15는 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 및 CH(CH3)2로부터 선택됨.
  5. 제1항에 있어서, X는 H, -P(O-R1)NR2R3, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이고, 여기서 R1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고, R2 및 R3는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이거나, 또는 R2 및 R3는 조합하여 사이클릭, 접합된, 접합된 사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리를 형성하는 화합물.
  6. 구조식 XO-CH2-SM-B-A의 화합물, 여기서 X는 H, 산 불안정성 보호 그룹, 고체 지지체, -P(O-R')NR2R3, -P(O)(OH)H, -P(O)(OR1)H, -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이고, 여기서 R1는 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 및 R 및 R는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이거나, 또는 R2 및 R3는 조합하여 사이클릭, 접합된, 접합된 사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리를 형성함, SM은 다음의 구조의 퓨라노실 모이어티인 당 모이어티 또는 이의 유사체이고
    Figure pct00189

    B는 핵염기 모이어티 또는 이의 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR4의 염기 모이어티 상의 또는 내의 질소에 부착된 모이어티이고, 여기서 R4는 삼차 알킬이고;
    여기서 Y가 -OP(O-CNE)NR1R2 또는 -OP(O)(OH)H 또는 이의 염인 경우, X는 산 불안정성 보호 그룹 또는 고체 지지체이고, Z은 H 또는 OR5이고, 여기서 R5는 하이드록실 보호 그룹이고;
    여기서 X가 -Ρ(O-CNΕ)(NR1R2) 또는 -P(O)(OR3)H 또는 이의 염인 경우, Y는 산 불안정성 하이드록실 보호 그룹 또는 고체 지지체이고 Z는 H이고;
    여기서 X가 -P(O)(OR3)H 또는 -P(O)(OH)O[P(O)(O-)(O-)]H 또는 이의 염이며, 여기서 n = 0, 1 또는 2인 경우, Y는 OH 또는 OR6이고, 여기서 R6는 열불안정성 하이드록실 보호 그룹이거, Z는 H, -OH, 또는 OR6임.
  7. 제6항에 있어서, "B"는 다음의 모이어티로부터 선택되고, "A"는 구조식 -C(O)OR1이고, 여기서 R1은 삼차 알킬 그룹이고; "M"은 N 또는 CR3이고, 여기서 R3은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR4R5이고, 여기서 R4 및 R5는, 독립적으로 H 또는 알킬이고; 여기서 R12은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR4R5이고, 여기서 R4 및 R5는, 독립적으로 H 또는 알킬이고; "D" 및 "E"는 독립적으로 N 또는 CR3이고, 여기서 R3은 H, 할로, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 알켄일, 알킨일, OH, SH, 또는 NR4R5이고, 여기서 R4 및 R5는, 독립적으로 H 또는 알킬인 화합물:
    Figure pct00190

    Figure pct00191

    Figure pct00192

    Figure pct00193

    Figure pct00194

    Figure pct00195

    Figure pct00196

    Figure pct00197

    Figure pct00198

    Figure pct00199
  8. 제6항에 있어서, "A"는 다음의 모이어티로부터 선택되는 모이어티인 화합물: -C(CH3)3; -C(CH3)2(CH2CH3); -C(CH3)(CH2CH3)(CH2CH2CH3); -C(R14)(R15)-링커-표지; 및 -C(R14)(R15)-링커-[고체 지지체], 여기서 R14 및 R15는 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 및 CH(CH3)2 로부터 선택됨.
  9. 제6항에 있어서, 상기 화합물은 다음의 그룹으로부터 선택되는 화합물, 여기서 "X"는 -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2 또는 이의 염이고, 여기서 "Z" 는 -H 또는 -OH임:
    Figure pct00200

    Figure pct00201

    Figure pct00202

    Figure pct00203
  10. 구조식 -O-CH2-SM(-O-)B-A의, 하나 이상의 뉴클레오사이드 또는 변형된 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 여기서 SM은 당 모이어티 또는 이의 유사체이고, B는 핵염기 모이어티 또는 이의 유사체이고, A 는 구조식 -C(O)OR4의 염기 모이어티 상의 또는 내의 질소에 부착된 모이어티이고, 여기서 R4는 삼차 알킬임.
  11. 제10항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 다음의 구조이고,
    Figure pct00204

    여기서 PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드.
  12. 제10항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 다음의 구조 중 하나이고:
    Figure pct00205

    여기서 PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드.
  13. 제10항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 다음의 그룹의 올리고뉴클레오타이드로부터 선택되며, 여기서 PL1 및 PL2는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체 중 하나이며, Nu1 및 Nu2는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00206

    Figure pct00207

    Figure pct00208

    Figure pct00209

    Figure pct00210

    Figure pct00211

    Figure pct00212

    Figure pct00213
  14. 적어도 하나의 구조식 -C(O)OR4의 모이어티는 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체 또는 올리고뉴클레오타이드 상의 핵염기에 결합되고, 여기서 R4는 삼차 알킬인, 치료적 활성 뉴클레오사이드, 치료적 활성 뉴클레오사이드 유사체, 치료적 활성 뉴클레오타이드, 치료적 활성 뉴클레오타이드 유사체 또는 치료적인 올리고뉴클레오타이드.
  15. 제14항에 있어서, 다음의 그룹으로부터 선택되는 치료적 활성 뉴클레오사이드, 치료적 활성 뉴클레오사이드 유사체, 치료적 활성 뉴클레오타이드, 치료적 활성 뉴클레오타이드 유사체 또는 치료적인 올리고뉴클레오타이드, 여기서 A1, A2 및 A3는 독립적으로 H 또는 열 불안정성 보호 그룹이고, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR8이며, 여기서 R8은 삼차 알킬 그룹이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체임:
    Figure pct00214

    Figure pct00215

    Figure pct00216

    Figure pct00217

    Figure pct00218

    Figure pct00219

    Figure pct00220


  16. 제14항에 있어서, 다음의 그룹으로부터 선택되는 치료적 활성 뉴클레오사이드, 치료적 활성 뉴클레오사이드 유사체, 치료적 활성 뉴클레오타이드, 치료적 활성 뉴클레오타이드 유사체 또는 치료적인 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00222

    Figure pct00223

    Figure pct00224
  17. 제14항에 있어서, 다음의 그룹으로부터 선택되는 치료적 활성 뉴클레오사이드, 치료적 활성 뉴클레오사이드 유사체, 치료적 활성 뉴클레오타이드, 치료적 활성 뉴클레오타이드 유사체 또는 치료적인 올리고뉴클레오타이드: 구조식 -C(O)OR8의 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하는 포미비어센(Fomivirsen), 여기서 R8은 삼차 알킬 그룹이고; 구조식 -C(O)OR8의 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하는 미포머센(Mipomersen), 여기서 R8은 삼차 알킬 그룹임.
  18. 다음의 구조중 하나인 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 접합체:
    Figure pct00225

    여기서 상기 구조 117의 치환기는 다음과 같음: L1 및 L2는 독립적으로 H, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 및 표지이고, 여기서 표지를 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 상의 그의 위치에 연결하는 연결 그룹이 존재할 수 있고; L3은 H, -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬, 또는 표지이고, 여기서 표지를 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 상의 그의 위치에 연결하는 연결 그룹이 존재할 수 있고; 여기서 표지가 L1, L2 또는 L3이 아닌 경우, 이는 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 뉴클레오타이드에 부착되며; 여기서 "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고; 여기서 "B"는 핵염기 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 유사체임.
  19. 다음의 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 합성 방법:
    1) 다음의 구조 중 하나인 화합물을:
    Figure pct00226

    여기서 "P1"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬이고,
    직접적으로 또는 링커를 통해, 고체 지지체에 커플링 시켜, 다음의 구조 중 하나의 고체 지지체 화합물을 제공하는 단계:
    Figure pct00227

    여기서 L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임;
    2) 고체 지지체 화합물을 탈보호하여 다음의 구조 중 하나의 탈보호된 화합물을 제공하는 단계:
    Figure pct00228

    여기서 L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임;
    3) 탈보호된 화합물을, 다음의 구조 중 하나인 인 원자를 포함하는 모이어티를 포함하는 화합물과 반응시켜:
    Figure pct00229

    여기서 "PM"은 인 함유 모이어티이고; 여기서 "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고; "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고; "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임, 다음의 구조 중 하나의 다이뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
    Figure pct00230

    여기서 "PM*"은 반응 이후 인 함유 모이어티이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이고, "P1"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임.
    4) 인 함유 모이어티를 화학적으로 변형시켜, 다음의 구조 중 하나의 변형된 이합체를 제공하는 단계:
    Figure pct00231

    여기서 "PM**"은 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이고, "P1"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임;
    5) 이합체 또는 변형된 이합체를 탈보호하여, 다음의 구조 중 하나의 탈보호된 이합체 또는 변형된 이합체를 제공하는 단계:
    Figure pct00232

    Figure pct00233

    여기서 "PM*"는 이합체를 제공하기 위한 반응 이후 인 함유 모이어티이고, "PM**"는 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬임; 6) 단계 "3" 및 "4"를 반복하여, 다음의 구조 중 하나의 올리고머 또는 변형된 올리고머를 제공하는 단계:
    Figure pct00234

    Figure pct00235

    여기서 "P1"은 보호 그룹이고, "PM*"은 올리고머를 제공하기 위한 반응 이후 인 함유 모이어티이고, "PM**"은 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티이고, "L1"은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, "S1"은 고체 지지체이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고; "n"은 1 내지 200 범위의 정수임;
    7) 이합체, 변형된 이합체, 올리고뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하고, 고체 지지체로부터 이를 제거하고, PM* 또는 PM** 모이어티를 화학적으로 변형시켜, 다음의 구조의 화합물을 제공하는 단계:
    Figure pct00236

    여기서 "Q"는 O 또는 S이고, "n"은 1 내지 200 범위의 정수이고, 적어도 하나의 "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체임.
  20. 제19항에 있어서, 고체에 커플링된 화합물은 다음의 구조 중 하나인 방법:
    Figure pct00237

    여기서 "P1"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬임.
  21. 제19항에 있어서, 고체에 커플링된 화합물은 다음의 구조인 방법:
    Figure pct00238

    여기서 "P1"은 보호 그룹 (예컨대, DMT)이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬임;
    Figure pct00239

    여기서 "P1"는 보호 그룹이고, 및 "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬임.
  22. 제19항에 있어서, 단계 "2"의 탈보호된 구조는 다음의 구조 중 하나인 방법:
    Figure pct00240

    여기서 "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A1"은 -H 또는 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬이고, L1은 링커이고, 또는 화학 물질이 아니며, S1은 고체 지지체임.
  23. 제19항에 있어서, 단계 "7"의 올리고머는 다음의 구조인 방법:
    Figure pct00241

    여기서 "Α"는 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "Q"는 O 또는 S임.
  24. 다음의 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 합성 방법:
    1) 다음의 구조 중 하나인 화합물을:
    Figure pct00242

    여기서 "P1" 및 "P2"는 독립적으로 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임,
    직접적으로 또는 링커를 통해, 고체 지지체에 커플링 시켜, 다음의 구조 중 하나의 고체 지지체 화합물을 제공하는 단계:
    Figure pct00243

    여기서 "P1" 및 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임;
    2) 고체 지지체 화합물을 탈보호하여 다음의 구조 중 하나의 탈보호된 화합물을 제공하는 단계:
    Figure pct00244

    여기서 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임;
    3) 탈보호된 화합물을, 다음의 구조 중 하나인 인 원자를 포함하는 모이어티를 포함하는 화합물과 반응시켜:
    Figure pct00245

    여기서 "P1" 및 "P2"는 독립적으로 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)임,
    다음의 구조 중 하나의 다이뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
    Figure pct00246

    여기서"P1" 및 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임;
    4) 인 함유 모이어티를 화학적으로 변형시켜, 다음의 구조 중 하나의 변형된 이합체를 제공하는 단계:
    Figure pct00247

    여기서"P1" 및 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체임;
    5) 이합체 또는 변형된 이합체를 탈보호하여, 다음의 구조 중 하나의 탈보호된 이합체 또는 변형된 이합체를 제공하는 단계:
    Figure pct00248

    Figure pct00249

    여기서 "P2"는 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이고, "PM*"은 커플링 반응 이후 인 함유 모이어티이고, "PM**"은 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티임;
    6) 단계 "3" 및 "4"를 반복하여, 다음의 구조 중 하나의 올리고머 또는 변형된 올리고머를 제공하는 단계:
    Figure pct00250

    Figure pct00251

    여기서 "P1" 및 "P2"는, 독립적으로, 보호 그룹이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "A1"은 H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬 (예컨대, -C(O)OC(CH3)3)이고, L1은 링커이고, 또는 화학적 모이어티가 아니며, S1은 고체 지지체이고, "PM*"은 커플링 반응 이후 인 함유 모이어티이고, "PM**"은 화학적으로 변형된 인 함유 모이어티이고, "n"은 1 내지 200 범위의 정수임;
    7) 이합체, 변형된 이합체, 올리고뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하고, 고체 지지체로부터 이를 제거하고, PM* 또는 PM** 모이어티를 화학적으로 변형시켜 다음의 구조 중 하나의 화합물을 제공하는 단계:
    Figure pct00252

    여기서 "n"은 1 내지 200 범위의 정수이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, 적어도 하나의 "A1"은 C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, "Q"는 O 또는 S임.
  25. 제24항에 있어서, 상기 방법의 단계 "7"의 올리고머는 다음의 구조인 방법:
    Figure pct00253

    여기서 "A1"은 -H 또는 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "Q"는 O 또는 S임.
  26. 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 사용한 DNA 증폭 방법, 여기서 상기 방법은 핵염기의 고리 구조 상의 또는 내의 질소 원자 상에 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹을 가지는 하나 이상의 디옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 사용하는 것을 포함하며, 상기 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬임.
  27. 제26항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
    1) 표적 DNA, DNA 중합효소, 프라이머 및 디옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 dNTP는 다음의 구조 중 하나임:
    Figure pct00254

    여기서 "TP"는 트리포스페이트이고, "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임;
    Figure pct00255

    여기서 "TP"는 트리포스페이트이고, "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임;
    Figure pct00256

    여기서 "TP"는 트리포스페이트이고, "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임;
    Figure pct00257

    여기서 "TP"는 트리포스페이트이고, "A1"은 -C(O)OR60이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임;
    2) 반응 혼합물을 일정 시간 동안 가열하여 표적 DNA를 변성시켜, 단일-가닥 DNA 주형을 제공하는 단계;
    3) 반응 혼합물의 반응 온도를 일정 시간 동안 낮추어, 프라이머를 단일-가닥 DNA 주형에 어닐링시켜 프라이머-주형 복합체를 제공하고, 프라이머-주형 복합체에 DNA 중합효소를 결합하게 하는 단계;
    4) 반응 혼합물을 가열하여, 5'에서 3' 방향으로 dNTP를 DNA 주형에 첨가함으로써 DNA 중합효소가 표적 DNA와 상보적인 DNA 가닥을 합성하도록 하는 단계;
    이에 따라 DNA를 증폭함.
  28. 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 사용한 DNA 증폭 방법, 여기서 상기 방법은 프라이머의 핵염기의 고리 구조 상의 또는 내의 질소 원자 상에 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹을 가지는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 것을 포함하며, 상기 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR4이며, 여기서 R4는 삼차 알킬임.
  29. 제28항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
    1) 표적 DNA, DNA 중합효소, 프라이머 및 디옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 프라이머는 다음의 구조 중 하나임:
    Figure pct00258

    여기서 "n"은 1 내지 50의 정수이고, "B"는 핵염기이고, "A"는 H 또는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이고, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, 단 적어도 하나의 "A"는 열 불안정성 보호 그룹임;
    2) 반응 혼합물을 일정 시간 동안 가열하여 표적 DNA를 변성시켜, 단일-가닥 DNA 주형을 제공하는 단계;
    3) 반응 혼합물의 반응 온도를 일정 시간 동안 낮추어, 프라이머를 단일-가닥 DNA 주형에 어닐링시켜 프라이머-주형 복합체를 제공하고, 프라이머-주형 복합체에 DNA 중합효소를 결합하게 하는 단계;
    4) 반응 혼합물을 가열하여, 5'에서 3' 방향으로 dNTP를 DNA 주형에 첨가함으로써 DNA 중합효소가 표적 DNA와 상보적인 DNA 가닥을 합성하도록 하는 단계;
    이에 따라 DNA를 증폭함.
  30. 다음의 단계를 포함하는, 환자에서 질병의 치료 방법:
    1) 치료를 필요로 하는 환자에게 화합물을 투여하는 단계, 여기서 화합물은 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하는 화합물을 포함하며, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR8이며, 여기서 R8은 삼차 알킬 그룹임;
    2) 환자의 하나 이상의 영역에 열 에너지를 가하여, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체의 열적 탈보호를 야기하는 단계;
  31. 제30항에 있어서, 투여된 화합물은 다음의 구조 중 하나인 방법:
    Figure pct00259

    여기서 "A1", "A2" 및 "A3"는 독립적으로 -H 또는 열불안정성 보호 그룹이고, 단 A1, A2 또는 A3 중 적어도 하나는 구조식 -C(O)OR60의 열불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60는 삼차 알킬이고; "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체임;
  32. 다음의 단계를 포함하는, 환자에서 질병의 치료 방법:
    1) 치료를 필요로 하는 환자에게 화합물을 투여하는 단계, 여기서 화합물은 올리고뉴클레오타이드 및 하나 이상의 열 불안정성 보호 그룹을 포함하는 화합물을 포함하며, 적어도 하나의 열 불안정성 보호 그룹은 구조식 -C(O)OR8이며, 여기서 R8은 삼차 알킬 그룹임;
    2) 환자의 하나 이상의 영역에 열 에너지를 가하여, 올리고뉴클레오타이드의 열적 탈보호를 야기하는 단계;
    이에 따라 질병을 치료하는 단계.
  33. 제32항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 포미비어센 또는 미포머센인 방법.
  34. 다음의 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 트리포스페이트 제조 방법:
    1) 모노포스포러스 시약을 다음의 구조의 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 반응 혼합물에 첨가하여:
    Figure pct00260

    여기서 Y는 OP1이고, 여기서 P1는 보호 그룹이고, Z은 H이거나, 또는 OP2이고, 여기서 P2는 보호 그룹이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임,
    다음의 구조의 모노-포스포러스화된 중간체를 제공하는 단계:
    Figure pct00261

    여기서 Y는 OP1이고, 여기서 P1는 보호 그룹이고, Z은 H이거나, 또는 OP2이고, 여기서 P2는 보호 그룹이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, "PM"은 단일 인 원자를 포함하는 모이어티임;
    2) 폴리포스포러스 시약을 포스포러스화된 중간체에 첨가하여 다음의 구조의 폴리-포스포러스화된 중간체를 제공하는 단계:
    Figure pct00262

    여기서 Y는 OP1이고, 여기서 P1는 보호 그룹이고, Z은 H이거나, 또는 OP2이고, 여기서 P2는 보호 그룹이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬이고, "PP"는 여러 인 원자를 포함하는 모이어티임;
    3) 폴리-포스포러스화된 중간체를 가수분해하고 P1을 제거하여 다음의 구조의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 뉴클레오사이드 유사체 트리포스페이트를 제공하는 단계:
    Figure pct00263

    여기서 Y는 OP1, 여기서 P1는 보호 그룹 또는 H, Z은 H이거나, 또는 OP2, 여기서 P2는 보호 그룹 또는 H이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, A는 구조식 -C(O)OR60의 열 불안정성 보호 그룹이며, 여기서 R60은 삼차 알킬임.
  35. 다음의 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체 탈보호 방법, 여기서 보호된 화합물은 구조식 XO-SM-B-A이며, "X"는 H, 보호 그룹, 고체 지지체, 인 함유 모이어티 또는 이의 염이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티의 유사체이고, "B"는 염기 모이어티 유사체의 염기 모이어티이고, "A"는 염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹임:
    7.0 초과의 pH를 가지는 용매의 존재 하에서, 90 ℃ 내지 100 ℃ 범위의 온도까지 45 분 미만의 기간 동안 화합물을 가열하는 단계
    이에 따라 탈보호된 화합물을 제공하는 단계.
  36. 다음의 단계를 포함하는, 다음의 구조의 올리고뉴클레오타이드의 탈보호 방법,
    Figure pct00264

    여기서 "PL1" 및 "PL2"는, 독립적으로, H 또는 -P(O)(OH)O- 또는 이의 유사체이고, "Nu1" 및 "Nu2"는, 독립적으로, 치환기가 아니며, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 또는 올리고뉴클레오타이드이고, "SM"는 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체이고, "B"는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고, "A"는 핵염기 모이어티 상의 또는 내의 하나 이상의 질소 원소에 부착된 하나 이상의 모이어티이며, 구조식 -C(O)OR60이고, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹임:
    7.0 초과의 pH를 가지는 용매의 존재 하에서, 90 ℃ 내지 100 ℃ 범위의 온도까지 45 분 미만의 기간 동안 화합물을 가열하는 단계
    이에 따라 탈보호된 화합물을 제공하는 단계.
  37. 다음을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 합성 장치,
    a) 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용되기 위한 화학 시약을 포함하는 하나 이상의 저장조, 여기서 저장조는 합성 챔버로 다양한 시약의 흐름을 가능하게 하는 시스템에 작동 가능하게 연결됨;
    b) 시약 흐름을 합성 챔버로 도입하는 기기 내의 매커니즘, 여기서 올리고뉴클레오타이드 합성의 다양한 화학 반응이 수행됨.
    여기서 합성 챔버는 이의 온도를 제어하기 위한 내부 또는 외부 수단을 포함함.
  38. 제37항에 있어서, 합성 챔버는 고체 지지체를 포함하는 합성 컬럼을 포함하고, 및 합성 챔버의 온도를 제어하기 위한 수단은 합성 챔버 내 시약의 온도를 제어하는 장치.
  39. 제38항에 있어서, 합성 챔버 내 시약의 가열은 구조식 -C(O)OR60을 가지는 그룹의 제거를 통해 올리고뉴클레오타이드의 탈보호를 유발하는 장치, 여기서 R60은 삼차 알킬 그룹임.
  40. 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 가열은 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 분열을 유도하는 장치.
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