CN114269764A - 立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段及其制造方法、以及使用其的立体控制寡核苷酸的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以下述式(I)表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段及其制造方法、以及使用其的立体控制寡核苷酸的合成方法。式中，B为保护/未保护核苷碱基，R1为取代/未取代脂肪族基团，R2、R3为DMTr基或‑P(R11)(NR12)2，R11为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN等，R12为取代/未取代的脂肪族基团或芳香族基团；X为H、烷基、O‑烷基等，Y为H、NHR13、卤素等或酰基类、醚类、硅烷基类保护羟基，或者在与X之间形成X‑Y键，n为0以上且4以下的整数。

Description

立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段及其制造方法、以及 使用其的立体控制寡核苷酸的合成方法
技术领域
本发明涉及用于立体控制的磷原子修饰寡核苷酸的合成的光学活性片段及其制造方法、以及使用该光学活性片段的立体控制的磷原子修饰寡核苷酸的合成方法。
背景技术
近年来，对于以天然型或非天然型寡核苷酸为基本骨架的核酸药物的关注度不断提高。为了获得为实现目标作用而设计的核酸药物，广泛使用化学合成法。
作为核酸药物被广泛采用的硫代磷酸酯寡核苷酸在磷酸二酯键中存在硫代磷酸酯的情况下，由于磷酸二酯键的非交联氧原子中的一个被取代的硫原子的存在，形成该磷酸二酯键的磷原子上具有手性中心。
广泛采用的硫代磷酸酯寡核苷酸的合成法中，难以进行磷原子上的立体控制而仅合成具有所期望的立体结构的硫代磷酸酯寡核苷酸。因此，实际情况下有时将非对映异构体混合物直接用作药物活性成分(API)(参照非专利文献1)。
另一方面，混有非对映异构体的情况下直接给药可能会导致副作用，或者为了确保具有发挥所期望的效果的立体结构的硫代磷酸酯的量，可能会不得不使非对映异构体混合物向体内的给药量过量。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2011/108682号
非专利文献
非专利文献1:European Medicnes Agency,Assessment Report,Spinraza(注册商标),第13页(2017)
发明内容
发明所要解决的技术问题
关于硫代磷酸酯寡核苷酸，至今为止尝试了若干种立体选择性合成法。作为其中一种，有以脯氨醇为手性源利用导入核苷酸亚磷酰胺的亚磷酸键部分的单元进行合成的方法。然而，合成对硫代磷酸酯部分进行立体控制的寡核苷酸时，如专利文献1所述的方法需要使用核苷单体型的单元作为合成单元，从而逐步对单体型单元进行缩合。
具体来说，在最终获得具有目标长度的寡核苷酸的阶段，需要进行除去如上所述的各工序中生成的副产物和试剂残渣的纯化工序。作为合成寡核苷酸N聚体的情况下生成的每次伸长1个碱基的合成方法中的代表性的副产物，有偶联工序中生成的短1个碱基的(N-1)聚体、短2个碱基的(N-2)聚体等。这样的(N-1)聚体、(N-2)聚体的结构和物性与作为目标的N聚体非常类似。因此，在使用色谱法等纯化N聚体的阶段，作为目标的N聚体的迁移率与作为副产物的(N-1)聚体、(N-2)聚体等的迁移率的差小。由此，存在用于将N聚体与其他物质准确分离的纯化负荷大的问题。
另外，在硫代磷酸酯寡核苷酸的硫代磷酸酯部分，可能会混有磷原子上的立体异构体。因此，又增加了纯化负荷的问题，即，必须从具有目标立体结构的硫代磷酸酯寡核苷酸分离具有不同的立体结构的副产物。目前为止已知的合成法中，没有可实现硫代磷酸酯部分得到了所期望的立体控制的寡核苷酸合成的实用化的合成法。
本发明鉴于这样的情况而进行，其目的在于提供工序数更少且可靠地进行用于合成立体控制的寡核苷酸的片段及其制造方法、以及使用其的立体控制寡核苷酸的合成方法。
解决技术问题所采用的技术方案
为了解决上述课题，本发明的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段及其制造方法、以及使用其的立体控制寡核苷酸的合成方法采用以下的手段。
本发明的第一种形态为一种以下述式(I)表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段。
[化1]
Figure BDA0002753172930000031
所述式(I)中，B独立为被保护基保护的核苷碱基或未保护核苷碱基；R1为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基；R2为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基时，R3为-P(R11){N(R12)2}，或者R2为-P(R11){N(R12)2}时，R3为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基；R4、R5独立为H、烷基、烯基、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基、-CH2-取代或未取代芳基、-CH2-取代硅烷基；R6、R7、R8、R9独立为H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；R11独立为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、OCH2CH＝CH2、OCH3；R12为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；X独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素；Y独立为H、NHR13、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基，或者在与所述X之间形成X-Y键；R13独立为H、烷基、氨基甲酸酯、酰胺基、取代硅烷基；Z独立为O或S；n为0以上且4以下的整数。
所述第一种形态中，所述式(I)中的B为被保护基保护的核苷时，该保护基可以是酰基类保护基。
所述第一种形态中，所述式(I)中，可以是所述R1为烷氧基、甲基、三氟甲基、苯基或苯乙酰基，较好是苯基或乙酰基，所述X为H，所述Y较好是H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基，所述Z为O，所述R12为异丙基。此外，所述式(I)中，R1-C(＝Z)-可以为乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等酰基类保护基。
本发明的第二种形态为一种以下述式(I)表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段的制造方法。
[化2]
Figure BDA0002753172930000041
所述式(I)中，B独立为被保护基保护的核苷碱基或未保护核苷碱基；R1为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基；R2为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基时，R3为-P(R11){N(R12)2}，或者R2为-P(R11){N(R12)2}时，R3为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基；R4、R5独立为H、烷基、烯基、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基、-CH2-取代或未取代芳基、-CH2-取代硅烷基；R6、R7、R8、R9独立为H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；R11独立为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、OCH2CH＝CH2、OCH3；R12为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；X独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素；Y独立为H、NHR13、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基，或者在与所述X之间形成X-Y键；R13独立为H、烷基、氨基甲酸酯、酰胺基、取代硅烷基；Z独立为O或S；n为0以上且4以下的整数。
所述制造方法包括：
(a)使以下述式(II):
[化3]
Figure BDA0002753172930000051
表示的核苷与下述式(III):
[化4]
Figure BDA0002753172930000052
反应，制备具有下述式(IV):
[化5]
Figure BDA0002753172930000061
的结构的化合物的工序，其中，式(II)中，R2为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基；
(b)使所述具有式(IV)的结构的化合物与具有下述式(V):
[化6]
Figure BDA0002753172930000062
的结构的化合物反应，再进行硫化反应，从而制备具有下述式(VI):
[化7]
Figure BDA0002753172930000063
的结构的化合物的工序，其中，式(V)中，R10为酰基、烷氧基羰基、烷基、缩醛或硅烷基类保护基；
(c)所述式(I)中n＝1～4的情况下，将使进行所述具有式(VI)的结构的化合物的5'-羟基的脱保护反应而得的化合物与所述具有式(IV)的结构的化合物反应并进行硫化反应的工序实施1～4次的工序；
(d)进行所述(b)或(c)工序中得到的化合物的3'-羟基的保护基OR10的脱保护反应后，使其与具有R11P{N(R12)2}2的结构的三价磷化合物反应，制备具有所述式(I)的结构的片段的工序。
所述第二种形态中，所述式(I)中的所述B为被保护基保护的核苷时，该保护基可以是酰基类保护基。
所述第二种形态中，所述式(I)中，可以所述R1为烷氧基、甲基、三氟甲基、苯基或苯乙酰基，较好是苯基或乙酰基，所述X为H，所述Y较好是H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基，所述Z为O，所述R12为异丙基。此外，所述式(I)中，R1-C(＝Z)-可以为乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等酰基类保护基。
本发明的第三种形态为一种使用以上述式(I)表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段的寡核苷酸的合成方法。
所述制造方法包括：(a)所述以式(I)表示的光学活性片段的亚磷酰胺部分与核苷或核苷酸的羟基的缩合工序、(b)所述缩合工序中与核苷或核苷酸缩合而得的所述寡核苷酸合成用片段的末端保护基的脱保护工序。
所述第三种形态中，可在溶液中实施各工序。
所述第三种形态中，可在固相载体上实施各工序。
发明的效果
如果采用本发明的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段，则可将用作原料之一的L-或D-脯氨醇衍生物用作手性源，在1个片段中具有多个立体控制的硫代磷酸酯基。因此，与使用核苷单体型的单元逐步合成立体控制寡核苷酸的以往方法相比，可减少合成相同长度的立体控制寡核苷酸的情况下所需的工序数。
另外，使用本发明的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段合成立体控制寡核苷酸的情况下，不会产生具有N-1～N-2的长度的副产物。另外，本发明的光学活性片段的在硫代磷酸酯部分的磷原子上具有与目标物的立体结构不同的立体结构的副产物的混入比例非常低。因此，可减小作为目标的N聚体的立体控制寡核苷酸的纯化负荷，因而发挥可更简便地纯化且能够更大量地供给目标物的效果。
附图说明
图1为表示本发明的一种实施方式中的实施例2得到的光学活性四核苷酸的UPLC谱的图。
具体实施方式
以下，对用于获得本发明所述的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段的一种实施方式进行说明。
本实施方式中的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段具有以下述式(I)表示的结构。
[化8]
Figure BDA0002753172930000091
所述式(I)中，B独立为被保护基保护的核苷碱基或未保护核苷碱基；R1为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基；R2为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基时，R3为-P(R11){N(R12)2}，或者R2为-P(R11){N(R12)2}时，R3为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基；R4、R5独立为H、烷基、烯基、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基、-CH2-取代或未取代芳基、-CH2-取代硅烷基；R6、R7、R8、R9独立为H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；R11独立为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、OCH2CH＝CH2、OCH3；R12为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；X独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素；Y独立为H、NHR13、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基，或者在与所述X之间形成X-Y键；R13独立为H、烷基、氨基甲酸酯、酰胺基、取代硅烷基；Z独立为O或S；n为0以上且4以下的整数。
本实施方式中的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段经如下所述的工序合成。(1)合成以L-或D-脯氨醇衍生物为手性源的光学活性磷酸化剂，(2)用保护基对5'-羟基进行保护，并根据需要用保护基对核苷碱基部分进行保护，对3'-羟基无保护的核苷(以下称为“5'-保护·3'-无保护核苷”)的3'-羟基用(1)中得到的光学活性磷酸化剂进行磷酸化而获得光学活性3'-亚磷酰胺，(3)用保护基对3'-羟基进行保护，并根据需要用保护基对核苷碱基部分进行保护，另一方面进行5'-羟基无保护的核苷(以下称为“3'-保护·5'-无保护核苷”)的5'-羟基与(2)中得到的光学活性3'-亚磷酰胺的反应，磷酸键上的磷原子上的立体结构被控制为S-或R-体的硫代磷酸酯二聚体。
然而，以上述式(I)表示的化合物中n＝0的情况下，对(3)中得到的硫代磷酸酯二聚体的3'-羟基的保护基进行脱保护，使其与3价的磷酸化剂反应，从而合成光学活性片段，即，硫代磷酸酯键上的磷原子上的立体结构被控制为S-或R-体的硫代磷酸酯二聚体的3'-亚磷酰胺。n＝1～4的情况下，对(3)中得到的硫代磷酸酯二聚体的5'-羟基的保护基进行脱保护，将(3)重复所需次数(n次)，从而合成光学活性片段，即，磷酸键上的磷原子上的立体结构被控制为S-或R-体的硫代磷酸酯(n+1)聚体的3'-亚磷酰胺。
其中，通过以上述式(II)表示的化合物的R2采用酰基、烷氧基羰基、烷基、缩醛或硅烷基类保护基、可在酸性条件下除去以上述式(V)表示的化合物的R6的保护基或硅烷类保护基，从而能够合成光学活性5'-亚磷酰胺。
因此，如果采用本实施方式所述的光学活性片段，则1个片段中，多个硫代磷酸酯键上的磷原子上的立体结构被控制为S-或R-体，所以与使用核苷单体型的单元逐步合成立体控制寡核苷酸的以往方法相比，可减少合成相同长度的立体控制寡核苷酸的情况下所需的工序数。被认为在寡核苷酸的两末端具有多个核苷酸硫代磷酸酯的被称为Gapmer的核酸药物候选物质的合成中特别有效地发挥作用。
与之相对，通过如专利文献1所述的其他方法，尝试了使用单体型的光学活性片段的立体控制寡核苷酸合成，但1个片段中对多个硫代磷酸酯键进行立体控制的硫代磷酸酯二聚体以上的3'-亚磷酰胺的合成至今未实现。
此外，使用单体型的光学活性片段进行所有磷酸键部分被硫代磷酸酯化的寡核苷酸的合成的情况下，如果磷酸键有m个，则需要进行m次缩合工序。与之相对，本实施方式中的光学活性片段被预先进行n次缩合，因此仅通过实施m/n次的缩合工序，就可获得同样长度的硫代磷酸酯化的寡核苷酸。因此，可通过较短工序合成高度立体控制的寡核苷酸。
本实施方式中的核苷碱基包括腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基等天然型碱基，5-甲基胞嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、7-甲基鸟嘌呤基、7-脱氮腺嘌呤基等修饰碱基。这些核苷碱基中的氨基包括苄基类保护基、烯丙基类保护基、氨基甲酸酯类保护基、酰基类保护基。较好是使用乙酰基、苯甲酰基、苯氧基乙酰基、异丙基羰基等酰基类保护基。
本实施方式中的脂肪族基团包括饱和或不饱和的直链状或分支的C1-C18烃、饱和或不饱和的环状C3-C18烃。较好是饱和或不饱和的C1-C8烃或C3-C8环状烃。本实施方式中的芳香族基团包括苯基等碳环类芳香环、萘基等碳环类芳香环或与非碳类芳香环缩合的碳环类芳香环。本实施方式中的脂肪族基团、芳香族基团可被饱和或不饱和的C1-C8烃或C3-C8环状烃、卤素、氰基、硝基、芳香环等取代基取代。
本实施方式中的5'-、3'-或2'-羟基的保护基包括可在酸性条件下除去的保护基、酰基类保护基、硅烷基类保护基。可在酸性条件下除去的保护基包括取代或未取代的含三苯甲基的醚类保护基、取代或未取代的四氢吡喃(THP)基，代表性的保护基有4,4'-二甲氧基三苯甲基。硅烷基类保护基包括三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三苯基硅烷基。酰基类保护基包括乙酰基、苯甲酰基。此外，还可使用以5'-位与2'-位交联的方式结合的核苷作为原料。该情况下，5'-位与2'-位可形成(5'-位)-L-O-(2'-位)的键，作为L的例子，有C1-C6亚烷基(中途的碳原子可替换为结合了氧原子、烷基的氮原子)。
上述工序(1)中，可将市售的L-或D-脯氨醇或者可通过公知的方法合成的L-或D-脯氨醇衍生物作为起始物质，按照公知的合成例合成光学活性磷酸化剂。上述工序(2)中，使5'-保护·3'-无保护核苷的3'-羟基与上述工序(1)中得到的光学活性磷酸化剂反应，获得光学活性3'-亚磷酰胺的粗生成物。在粗生成物的情况下，确认为单一的立体异构体。
上述工序(2)中，向5'-保护·3'-无保护核苷的溶液(0.1～0.3M)中，于78℃加入光学活性磷酸化剂(5'-保护·3'-无保护核苷的1.05～2.0当量)和叔胺(5'-保护·3'-无保护核苷的1.05～2.0当量)后，于0℃搅拌1～2小时。所得的光学活性3'-亚磷酰胺在硅胶纯化后，用于下一工序(3)。
上述工序(3)中，向上述工序(2)中得到的光学活性3'-亚磷酰胺中，加入5'-无保护·3'-保护核苷(5'-保护·3'-无保护核苷的0.7～0.9当量)和活化剂(5'-保护·3'-无保护核苷的1.05～1.2当量)，于室温下使其反应，经硅胶纯化，获得伸长了1碱基的立体控制核苷酸。收率为约80～95％。合成四聚体以上的立体控制核苷酸的情况下，作为每次伸长1个的另一方法，可通过使已呈二聚体以上的片段相互缩合，使其一次伸长2个以上的碱基。
将所得的立体控制核苷酸的5'-保护基脱保护并硅胶纯化后，使其与3价磷酸化剂反应而生成3'-亚磷酰胺。作为代表性的3价磷酸化剂，有NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2、CH2＝CHCH2OP[N(i-C3H7)2]2，但并不仅限于这些。作为代表性的活化剂，有1H-四唑、S-乙硫基四唑、二氰基咪唑或者磺酸与唑或叔胺形成的盐，但并不仅限于这些。根据需要，通过进一步实施工序(3)，获得四聚体以上的光学活性3'-亚磷酰胺。
使用以上述式(I)表示的立体控制寡核苷酸合成用片段的寡核苷酸的合成可在溶液中进行(以下称为“液相合成法”)，也可在固相载体上进行(以下称为“固相合成法”)。通过液相合成法进行合成的情况下，为了提高对反应溶剂的溶解性，使用在3'-保护·5'-无保护核苷的3'末端的羟基引入硅烷基类的保护基或含脂肪族的保护基的试剂，对其反复实施(a)与光学活性片段的缩合工序、(b)氧化工序、(c)脱保护工序。通过固相合成法进行合成的情况下，反复实施(a)与光学活性片段的缩合工序、(b)封端工序、(c)氧化工序、(d)脱保护工序。两类方法均可通过其后的碱性条件下的脱保护处理，获得目标的寡核苷酸。此时，通过作为硫化剂使用苯基乙酰基二硫醚(PADS)，可同时进行吡咯烷酮部分的保护，可省略封端工序。
不论液相合成法、固相合成法中的任一种的情况下，作为寡核苷酸合成的第1阶段，进行用活化剂活化以上述式(I)表示的化合物的3'-末端亚磷酰胺，使其与3'-保护·5'-无保护核苷或核苷酸缩合的工序。作为活化剂，可使用广泛采用的3价磷的活化剂，例如有1H-四唑、S-乙硫基四唑、二氰基咪唑、或者磺酸与唑或叔胺形成的盐，但并不仅限于这些。本偶联反应所需的时间一般为1分钟～30分钟左右，由进行反应的规模决定。
接着，作为立体控制寡核苷酸合成的第2阶段，进行使上述缩合工序中得到的中间体与氧化剂反应，获得磷酸酯核苷酸。
然后，作为寡核苷酸合成的第3阶段，进行使上述氧化工序中得到的中间体与无水的酸性溶液反应，获得5'-羟基无保护核苷酸。
使用本实施方式中的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段合成的立体控制寡核苷酸中的核苷碱基的保护基、5'-、3'-或2'-羟基的保护基、磷酸键中的磷酸的保护基在与所用的保护基对应的脱保护条件下脱保护。由此，获得作为目标的立体控制寡核苷酸。
以下的实施例是本发明的一种实施方式进行说明而示例的例子。按照实施例1所示的步骤，制造了作为以上述式(I)表示的化合物的一例的光学活性3'-亚磷酰胺三聚体。此外，按照实施例2所示的步骤，经由作为以上述式(I)表示的化合物的一例的光学活性3'-亚磷酰胺，制造了磷酸部光学活性四核苷酸。另外，按照实施例3所示的步骤，进行了使用作为以上述式(I)表示的化合物之一的光学活性3'-亚磷酰胺的立体控制寡核苷酸合成。
〔实施例1〕
(步骤1:光学活性磷酸化剂的合成)
[化9]
Figure BDA0002753172930000141
使三氯化磷(3.5mL，5.5g，40mmol)溶解于甲苯(50mL)，使温度为-78℃。另外，使L-脯氨醇(3.9mL，4.0g，40mmol)、三乙胺(12mL，8.9g，88mmol)溶解于甲苯(50mL)，用1小时滴加至三氯化磷。直接搅拌12小时后，回复至0℃，再搅拌1小时。反应后，硅藻土过滤除去作为副产物生成的沉淀物，减压下蒸馏除去溶剂，获得粗生成物。将其减压下蒸馏(65℃，1.0mmHg)，获得作为目标的亚磷酰氯1(3.2g，19mmol，收率48％)。
(步骤2:光学活性亚磷酰胺2的合成)
[化10]
Figure BDA0002753172930000142
将5'-DMTr保护胸苷(11g，21mmol，上海兆维科技发展有限公司制)溶解于二氯甲烷(150mL)，向其中加入二异丙基乙基胺(3.9mL，3.0g，23mmol)，冷却至-78℃。另外，将亚磷酰氯1(3.8g，23mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)，用30分钟滴加于胸苷溶液中。用12小时升温至0℃后，于0℃搅拌1小时，从而完成反应。将所得的反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗，用硫酸钠干燥，馏去溶剂，作为粗生成物获得作为目标的光学活性亚磷酰胺2(16g)。31PNMR测定中，在154ppm观测到1条信号，由此认为是大致单一的立体异构体。
(步骤3:5'-无保护核苷的合成)
[化11]
Figure BDA0002753172930000151
将5'-DMTr保护胸苷(2.7g，5.0mmol，上海兆维科技发展有限公司制)溶解于二氯甲烷(50mL)，使温度为0℃。向其中加入四甲基乙二胺(450μL，350mg，3.0mmol)、氯代烯丙氧基羰基(590μL，650mg，5.5mmol)，开始反应。12小时后，将反应混合物用二氯甲烷(100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)进行分配，回收有机层。将该有机层用饱和食盐水(50mL)清洗，用无水硫酸钠干燥，获得粗生成物。将其用以己烷-乙酸乙酯为溶出溶剂的柱色谱纯化，获得作为目标的5'-DMTr-3'-Alloc胸苷(3.0g，4.8mmol，收率95％)。ESI-MS:651.5[(M+Na)+]
将该化合物溶解于二氯甲烷(50mL)并冷却至0℃，加入二氯乙酸(8.3mL，13g，100mmol)/二氯甲烷(50mL)溶液，开始反应。确认反应混合物呈现表示三苯甲基阳离子的游离的红色后，将反应混合物直接供于以乙酸乙酯-甲醇为溶出溶剂的柱色谱，获得目标物3(1.3g，4.0mmol，收率80％)。ESI-MS:340.9[(M+Na)+]
(步骤4:具有光学活性硫代磷酸键的二核苷酸的合成)
[化12]
Figure BDA0002753172930000161
将光学活性亚磷酰胺2(2.7g，4.0mmol)和5'-羟基无保护核苷3(1.0g，3.1mmol)溶解于乙腈(20mL)，向其中加入苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(1.2g，4.6mmol)。30分钟后，加入N-甲基咪唑(0.49mL，510mg，6.2mmol)，再加入苯甲酸酐(1.7g，7.7mmol)，然后搅拌30分钟。最后，加入苯基乙酰基二硫醚(1.9g，6.2mmol)，搅拌30分钟。将反应混合物用二氯甲烷(100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)进行分配，回收有机层。将该有机层用饱和食盐水(50mL)清洗，用硫酸钠干燥，获得粗生成物。将其用以己烷-乙酸乙酯-甲醇为溶出溶剂的柱色谱纯化，获得作为目标的具有光学活性硫代磷酸键的化合物4(3.2g，2.8mmol，收率91％)。ESI-MS:1159.1[(M+Na)+]
(步骤5:磷酸部光学活性二核苷酸5'保护基的脱保护)
[化13]
Figure BDA0002753172930000162
将光学活性二核苷酸4(3.2g，2.8mmol)溶解于二氯甲烷(28mL)，使温度为0℃。向其中慢慢加入溶解于二氯甲烷(24mL)的二氯乙酸(4.6mL，7.2g，56mmol)，确认反应混合物呈现表示三苯甲基阳离子的游离的红色后，搅拌30分钟后，将反应混合物直接供于柱色谱，获得作为目标的化合物5(1.9g，2.2mmol，收率79％)。
(步骤6:光学活性三核苷酸的合成)
[化14]
Figure BDA0002753172930000171
将光学活性亚磷酰胺2(1.9g，2.9mmol)和5'-羟基无保护二核苷酸5(1.8g，2.2mmol)溶解于乙腈(14mL)，向其中加入苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(870mg，3.2mmol)。30分钟后，加入N-甲基咪唑(0.35mL，340mg，4.3mmol)，再加入苯甲酸酐(1.2g，5.4mmol)，然后搅拌30分钟。最后，加入苯基乙酰基二硫醚(1.3g，4.3mmol)，搅拌30分钟。将反应混合物用二氯甲烷(100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)进行分配，回收有机层。将该有机层用饱和食盐水(50mL)清洗，用硫酸钠干燥，获得粗生成物。将其用以己烷-乙酸乙酯-甲醇为溶出溶剂的柱色谱纯化，获得作为目标的化合物6(2.9g，1.8mmol，收率83％)。
(步骤7:光学活性三核苷酸3'-羟基保护基的脱保护)
[化15]
Figure BDA0002753172930000181
将光学活性三核苷酸6(330mg，0.2mmol)溶解于四氢呋喃(5mL)，向其中依次加入三苯膦(20mg，0.1mmol)、丁胺(23μL，0.6mmol)、甲酸(60μL，0.6mmol)、乙酸钯(4.5mg，0.02mmol)，开始反应。6小时后，馏去溶剂，溶解于二氯甲烷后，硅藻土过滤，将所得的粗生成物供于柱色谱。获得3'-无保护三核苷酸7(280mg，0.18mmol，收率90％)。
(步骤8:光学活性三核苷酸亚磷酰胺的合成)
[化16]
Figure BDA0002753172930000182
将3'-无保护三核苷酸7(280mg，0.18mmol)溶解于二氯甲烷(9mL)，向其中加入二异丙基乙基胺(37μL，28mg，0.22mmol)，冷却至-78℃。另外，化合物1(36mg，0.22mmol)溶解于二氯甲烷(9mL)，用30分钟滴加于反应溶液中。用12小时升温至0℃后，于0℃搅拌1小时，从而完成反应。将所得的反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗，用硫酸钠干燥，馏去溶剂，获得作为目标物的三核苷酸亚磷酰胺8(230mg，0.14mmol，收率60％)。根据31PNMR测定，提示生成目标物。
〔实施例2〕
(步骤9:光学活性二核苷酸的合成(N-乙酰基封端))
[化17]
Figure BDA0002753172930000191
将光学活性亚磷酰胺2(2.7g，4.0mmol)和5'-羟基无保护核苷3(1.0g，3.1mmol)溶解于乙腈(20mL)，向其中加入苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(1.2g，4.6mmol)。30分钟后，加入N-甲基咪唑(0.49mL，510mg，6.2mmol)，再加入乙酸酐(0.73mL，790mg，7.7mmol)，然后搅拌30分钟。最后，加入苯基乙酰基二硫醚(1.9g，6.2mmol)，搅拌30分钟。将反应混合物用二氯甲烷(100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)进行分配，回收有机层。将该有机层用饱和食盐水(50mL)清洗，用硫酸钠干燥，获得粗生成物。将其用以己烷-乙酸乙酯-甲醇为溶出溶剂的柱色谱纯化，获得作为目标的化合物9(2.4g，2.2mmol，收率72％)。ESI-MS:1096.8[(M+Na)+]
(步骤10:磷酸部光学活性二核苷酸5'-保护基的脱保护)
[化18]
Figure BDA0002753172930000201
将步骤9中得到的光学活性二核苷酸9(780mg，0.73mmol)溶解于二氯甲烷(7.3mL)，使温度为0℃。向其中慢慢加入溶解于二氯甲烷(6.1mL)的二氯乙酸(1.2mL，1.9g，14mmol)，确认反应混合物呈现表示三苯甲基阳离子的游离的红色后，搅拌30分钟后，将反应混合物直接供于柱色谱，获得作为目标的化合物10(500mg，0.65mmol，收率89％)。ESI-MS:794.6[(M+Na)+]
(步骤11:光学活性二核苷酸3'-羟基保护基的脱保护)
[化19]
Figure BDA0002753172930000202
将光学活性二核苷酸9(1.5g，1.4mmol)溶解于四氢呋喃(15mL)，向其中依次加入三苯膦(370mg，1.4mmol)、丁胺(700μL，7.0mmol)、甲酸(260μL，7.0mmol)以及四(三苯膦)钯(81mg，0.07mmol)，开始反应。17小时后，馏去溶剂，溶解于二氯甲烷后，硅藻土过滤，将所得的粗生成物供于柱色谱，获得3'-无保护二核苷酸11(1.1g，1.1mmol，收率79％)。ESI-MS:1012.7[(M+Na)+]
(步骤12:光学活性二核苷酸亚磷酰胺的合成)
[化20]
Figure BDA0002753172930000211
将二核苷酸11(990mg，1.0mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)，向其中加入二异丙基乙胺(340μL，260mg，2.0mmol)，冷却至-78℃。另外，将亚磷酰氯1(250mg，1.5mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)，用30分钟滴加于反应溶液中。用12小时升温至0℃后，于0℃搅拌1小时，从而完成反应。将所得的反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗，用硫酸钠干燥，馏去溶剂，获得作为目标物的光学活性二核苷酸亚磷酰胺12(1.2g)。根据31PNMR测定，提示生成目标物。
(步骤13:基于片段的相互缩合的光学活性四核苷酸的合成)
[化21]
Figure BDA0002753172930000221
将光学活性二核苷酸亚磷酰胺12(900mg，0.8mmol)和5'-羟基无保护二核苷酸10(480mg，0.62mmol)溶解于乙腈(8mL)和二氯甲烷(4mL)，向其中加入苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(250mg，0.92mmol)。30分钟后，加入N-甲基咪唑(0.097mL，100mg，1.2mmol)，再加入乙酸酐(0.15mL，160mg，1.5mmol)，然后搅拌30分钟。最后，加入苯基乙酰基二硫醚(370mg，1.2mmol)，搅拌30分钟。将反应混合物用二氯甲烷(100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)进行分配，回收有机层。将该有机层用饱和食盐水(50mL)清洗，用硫酸钠干燥，获得粗生成物。将其用以己烷-乙酸乙酯-甲醇为溶出溶剂的柱色谱纯化，获得作为目标的化合物13(1.0g，0.51mmol，收率63％)。ESI-MS:1988.0[(M+Na)+]
(步骤14:磷酸部光学活性四核苷酸5'-保护基的脱保护)
[化22]
Figure BDA0002753172930000231
将光学活性四核苷酸13(980mg，0.50mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)，使温度为0℃。向其中慢慢加入溶解于二氯甲烷(9.2mL)的二氯乙酸(0.83mL，1.3g，10mmol)，确认反应混合物呈现表示三苯甲基阳离子的游离的红色后，搅拌30分钟后，将反应混合物直接供于柱色谱，获得作为目标的化合物14(380mg，0.23mmol，收率46％)。ESI-MS:1684.6[(M+Na)+]
(步骤15:磷酸部光学活性四核苷酸的合成)
[化23]
Figure BDA0002753172930000241
将3'-羟基被保护的光学活性四核苷酸14(31mg，0.019mmol)溶解于甲醇(0.5mL)和28％氨水(0.5mL)，使温度为65℃。加热16小时后，供于离心浓缩，馏去氨。将生成物溶解于纯水，供于制备反相柱色谱，获得作为目标的化合物15(3.8mg，0.003mmol，收率17％)。ESI-MS:1201[(M-H)-]
图1中示出所得的磷酸部光学活性核苷酸四聚体15的UPLC-MS谱。出现于5.75分的主吸收在质谱分析中表示分子离子峰1201，确认为目标物15。此外，目标物之后，出现于6.07分的吸收在质谱分析中表示分子离子峰1244，确认为脱保护不充分的四聚体。与之相对，出现于5.47分的吸收在质谱分析中为与目标物相同的分子离子峰1201，因此提示为非对映异构体，未发现除此以外的吸收。由该结果可认为，基于本方法的非对映异构体副产物仅为出现于5.47分的吸收。根据出现于5.75分的主吸收与出现于5.47分的吸收的积分值的比，可知所得的磷酸部光学活性核苷酸四聚体15的非对映异构体过剩率为98.8％。
〔实施例3〕
(寡核苷酸合成)
寡核苷酸固相合成装置中，使用本实施方式中得到的光学活性亚磷酰胺，合成立体控制的寡核苷酸。按照装置的标准实验方案进行缩合反应、封端反应、根据需要的氧化或硫化反应后，取出固相载体，从固相载体切出所得的寡核苷酸，用浓氨水进行脱保护。
根据以上的结果，本实施方式的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段将用作原料之一的L-或D-脯氨醇衍生物用作手性源，可在1个片段中具有多个立体控制的硫代磷酸酯基，不仅限于1个。因此，与使用核苷单体型的单元逐步合成立体控制寡核苷酸的以往方法相比，可减少合成相同长度的立体控制寡核苷酸的情况下所需的工序数。合成四聚体以上的立体控制核苷酸的情况下，作为每次伸长1个的另一方法，可通过使已呈二聚体以上的片段相互缩合，使其一次伸长2个以上的碱基。
此外，本实施方式的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段预先硫代磷酸酯部分得到立体控制。因此，可仅希望立体控制的部分使用本发明的光学活性片段，对于除此以外的部位使用市售的亚磷酰胺，合成具有所期望的立体结构的寡核苷酸。
此外，如果采用本实施方式的寡核苷酸合成用片段，合成同样N聚体的寡核苷酸时，与作为以往方法的每次伸长1个碱基的方法相比，可减少所需的工序数。因此，可使作为目标的长度的立体控制寡核苷酸的收率提高。
此外，本实施方式的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段不仅可用于通过液相合成法大量合成较短链的立体控制寡核苷酸的情况，而且可有效地用于通过固相合成法在长链的寡核苷酸合成中仅对一部分进行立体控制的情况，例如近年来受到瞩目的Gapmer合成。因此，不仅可大幅减低寡核苷酸合成后分离立体异构体的负荷，而且可减小特别是合成长链的N聚体寡核苷酸后的纯化负荷，能够通过更简便的纯化获得可靠地得到立体控制的寡核苷酸。

Claims (9)

1.一种以下述式(I):
[化1]
Figure FDA0002753172920000011
表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段；
式中，
B独立为被保护基保护的核苷碱基或未保护核苷碱基；
R1为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基；
R2为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基时，R3为-P(R11){N(R12)2}，或者R2为-P(R11){N(R12)2}时，R3为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基；
R4、R5独立为H、烷基、烯基、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基、-CH2-取代或未取代芳基、-CH2-取代硅烷基；
R6、R7、R8、R9独立为H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；
R11独立为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、OCH2CH＝CH2、OCH3；
R12为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；
X独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素；
Y独立为H、NHR13、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基，或者在与所述X之间形成X-Y键；
R13独立为H、烷基、氨基甲酸酯、酰胺基、取代硅烷基；
Z独立为O或S；
n为0以上且4以下的整数。
2.根据权利要求1所述的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段，其中，所述式(I)中，所述B为被保护基保护的核苷时，该保护基为酰基类保护基。
3.根据权利要求1所述的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段，其中，
所述式(I)中，
所述R1为烷氧基、甲基、三氟甲基、苯基或苯乙酰基，
所述X为H，
所述Y为H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基，
所述Z为O，
所述R3为异丙基。
4.一种以下述式(I):
[化2]
Figure FDA0002753172920000031
表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段的制造方法，其中，
式中，
B独立为被保护基保护的核苷碱基或未保护核苷碱基；
R1为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基；
R2为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基时，R3为-P(R11){N(R12)2}，或者R2为-P(R11){N(R12)2}时，R3为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基；
R4、R5独立为H、烷基、烯基、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的杂芳基、-CH2-取代或未取代芳基、-CH2-取代硅烷基；R6、R7、R8、R9独立为H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；
R11独立为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、OCH2CH＝CH2、OCH3；
R12为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；
X独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素；
Y独立为H、NHR13、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基，或者在与所述X之间形成X-Y键；
R13独立为H、烷基、氨基甲酸酯、酰胺基、取代硅烷基；
Z独立为O或S；
n为0以上且4以下的整数；
该制造方法包括：
(a)使以下述式(II):
[化3]
Figure FDA0002753172920000041
表示的核苷与下述式(III):
[化4]
Figure FDA0002753172920000042
反应，制备具有下述式(IV):
[化5]
Figure FDA0002753172920000043
的结构的化合物的工序，其中，式(II)中，R2为可在酸性条件下除去的保护基或硅烷基类保护基；
(b)使所述具有式(IV)的结构的化合物与具有下述式(V):
[化6]
Figure FDA0002753172920000051
的结构的化合物反应，再进行硫化反应，从而制备具有下述式(VI):
[化7]
Figure FDA0002753172920000052
的结构的化合物的工序，式(V)中，R10为酰基、烷氧基羰基、烷基、缩醛或硅烷基类保护基；
(c)所述式(I)中n＝1～4的情况下，将使进行所述具有式(VI)的结构的化合物的5'-羟基的脱保护反应而得的化合物与所述具有式(IV)的结构的化合物反应并进行硫化反应的工序实施1～4次的工序；
(d)进行所述(b)或(c)工序中得到的化合物的3'-羟基的保护基OR10的脱保护反应后，使其与具有R11P{N(R12)2}2的结构的三价磷化合物反应，制备具有所述式(I)的结构的片段的工序。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，所述式(I)中，所述B为被保护基保护的核苷时，该保护基为酰基类保护基。
6.根据权利要求4所述的制造方法，其中，
所述式(I)中，
所述R1为烷氧基、甲基、三氟甲基、苯基或苯乙酰基，
所述X为H，
所述Y为H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基，
所述R3为异丙基。
7.一种使用权利要求1所述的以式(I)表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段的立体控制寡核苷酸的合成方法，其中，包括：
(a)所述以式(I)表示的光学活性片段的亚磷酰胺部分与核苷或核苷酸的羟基的缩合工序、
(b)所述缩合工序中与核苷或核苷酸缩合而得的所述寡核苷酸合成用片段的末端保护基的脱保护工序。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其中，在溶液中实施所述各工序。
9.根据权利要求7所述的合成方法，其中，在固体载体上实施所述各工序。
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