KR20220002469A - 올리고뉴클레오티드 합성에 사용하는 멀티플루오로스블록머 및 이를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법 - Google Patents
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Abstract
입수가 용이한 플루오로스 태그를 사용하여 정제부하를 저감할 수 있는 멀티플루오로스블록머 및 이를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법을 제공한다. B는 천연형 또는 수식 핵산염기이며; R1은 산성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산 보호기며; Pro는 무보호, 보호 또는 F-protector이며 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; X는 O 또는 S이며; l은 0부터 58의 정수이며; R7은 (C=O)(CH2)2(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3 또는 실릴계 보호기이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수인, 하기 식으로 표현되는 멀티플루오로스블록머를 합성한다.
Description
본 발명은 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서의 멀티플루오로스블록머 및 이를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법에 관한 것이다.
최근, 천연형 또는 수식 올리고뉴클레오티드를 기본 골격으로 하는 핵산 의약에 대한 주목도가 높아지고 있다. 목적으로 한 작용을 얻을 수 있도록 설계한 핵산 의약을 얻기 위해서 화학 합성법이 널리 사용되고 있다.
화학 합성법의 하나로서, 비교적 단사슬의 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 액상 중에서 모든 반응을 진행하는 액상 합성법이 널리 알려져 있다. 최근에는 그 액상 합성법에 플루오로스 태그(친플루오로카본성 치환기)를 적용하고자 하는 시도가 이루어지고 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2).
범용되고 있는 액상 합성법에 있어서는 비교적 단사슬의 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해서라도, 예를 들면 아미다이트와 뉴클레오시드의 커플링 반응이나, 다음 반응 기점을 얻기 위한 탈보호 반응 등, 수십 공정의 반응이 필요하다. 그 많은 공정에 있어서, 컬럼크로마토 그래피 등을 이용한 정제를 필요로 한다. 정제는 대부분의 경우 번잡하기 때문에 범용되고 있는 액상 합성법에 의해 대량의 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것은 용이하지 않다.
또한, 특허문헌 1, 특허문헌 2 등에서 사용되고 있는 플루오로스 태그는 그 구조가 복잡하고 용이하게 입수할 수 없기 때문에 비용도 높아진다.
본 발명은 이러한 사정에 비추어 이루어진 것이며, 입수가 용이한 플루오로스 태그를 사용하여 정제부하를 저감할 수 있는 올리고뉴클레오티드 합성에 사용하는 멀티플루오로스블록머 및 이를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 합성에 사용하는 멀티플루오로스블록머 및 이를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법은 이하의 수단을 채용한다.
본 발명의 제1 태양은 하기 식 (I)로 표현되는 뉴클레오시드 보호체이며,
상기 식 (I) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1, R2는 독립적으로, H 또는 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다.
본 발명의 제2 태양은 하기 식 (II)로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드포스포로아미다이트이며,
상기 식 (II) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산 보호기, 바람직하게는 CH2CH2CN, CH2CH=CH2, OCH3, 또는 CH2(CH2)xYG이며, Y가 NH 또는 S이며, G가 알릴 또는 아실기며, x가 0∼3이거나, 또는 R3과 인원자에 결합하는 질소원자에 결합하는 R4의 하나가 결합하여 형성되는 고리이며,; R4는 치환 또는 미치환의 지방족기, 치환 또는 미치환의 방향족기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다.
본 발명의 제3 태양은 하기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트이다.
상기 식 (III) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산 보호기, 바람직하게는 CH2CH2CN, CH2CH=CH2, OCH3, 또는 CH2(CH2)tRG이며, R이 NH 또는 S이며, G가 알릴 또는 아실기며, t가 0∼3이거나, 또는 R3과, 아미다이트 부분을 형성하는 인원자에 결합하는 질소원자에 결합하는 R5의 하나가 결합하여 형성되는 고리이며; R5는 치환 또는 미치환의 지방족기, 치환 또는 미치환의 방향족기이며; Pro는 무보호, 뉴클레오시드 염기의 보호기 또는 F-protector이며, F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; X는 O 또는 S이며; p는 0∼27의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다. 상기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트는 Pro 또는 R1, R3 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 F-protector를 가진다.
본 발명의 제4 태양은 하기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머이다.
상기 식 (IV) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산의 보호기, 바람직하게는 CH2CH2CN, CH2CH=CH2, OCH3, 또는 CH2(CH2)tRG이며, R이 NH 또는 S이며, G가 알릴 또는 아실기며, t가 0∼3이며; Pro는 무보호, 뉴클레오시드 염기의 보호기 또는 F-protector이며, F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; X는 O 또는 S이며; l은 0부터 58의 정수이며; R7은 (C=O)(CH2)2(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3 또는 실릴계 보호기이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다. 상기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머는 Pro 또는 R1, R3 중 어느 하나에 있어서 적어도 하나의 F-protector를 가진다.
본 발명의 제5 태양은 상기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트 또는 하기 식 (II')로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드H-포스포네이트와, 하기 식 (V)로 표현되는 3'-말단에 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드를 커플링 반응시키는 공정을 포함하는 상기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머의 합성방법이다. 하기 식 (II') 및 식 (V) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다.
본 발명의 염기부분을 플루오로스 보호한 뉴클레오시드, 염기 부분을 플루오로스 보호한 5'-말단보호 뉴클레오시드포스포로아미다이트, 및 멀티플루오로스블록머를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 의하면, 플루오로스앵커의 구조나 그 도입수를 조제함으로써, 올리고뉴클레오티드 합성의 중간체의 용해성이나, 정제부하를 저감할 수 있다. 이것에 의해 보다 범용성이 높은 방법으로 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 6의 ESI-TOF 매스 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 8의 ESI-TOF 매스 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 15의 UPLC 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 15의 ESI-TOF 매스 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 22의 UPLC 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 합성방법에 의해 합성된 20량체의 스펙트럼과, 종래법으로 합성된 20량체의 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 8의 ESI-TOF 매스 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 15의 UPLC 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 15의 ESI-TOF 매스 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물 22의 UPLC 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 합성방법에 의해 합성된 20량체의 스펙트럼과, 종래법으로 합성된 20량체의 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
이하에, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 합성에 사용하는 멀티플루오로스블록머 및 이를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법의 실시형태에 대해서 설명한다.
제1 실시형태에 있어서의 뉴클레오시드 보호체는 하기 식 (I)로 표현되는 구조를 가진다.
상기 식 (I) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1, R2는 독립적으로, H 또는 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다. Z-Y 결합의 예로서, 치환 또는 무치환의 C2∼C6 알킬렌기, -S-, -CO-, -CS-, -COO-, -OCONR6-(R6은 H 또는 C1∼C6알킬기), -CONR6-, -CSNR6- 등을 들 수 있다.
상기 식 (I)에 기재된 뉴클레오시드 보호체는 (1) 3',5'-수산기를 보호한 뉴클레오시드의 염기 부분에, 시판되는 플루오로스알코올을 반응시켜서 염기를 보호하고, (2) (1)에서 얻어진 화합물의 3',5'-수산기의 보호기를 탈보호함으로써 합성할 수 있다.
상기 식 (I)에 기재된 뉴클레오시드 보호체에 있어서, 염기 부분의 보호는 시판되고 있는 플루오로스알코올을 사용하고, 미츠노부 반응이나 염화 벤젠술폰산을 사용하는 반응을 적용함으로써 할 수 있다. 본 실시형태에 있어서는 1H,1H,2H,2H-노나플루오로-1-헥산올, 1H,1H,2H,2H-트리데카플루오로-1-옥타놀, 1H,1H-펜타데카플루오로-1-옥타놀 등을 사용할 수 있다. 시판되고 있는 플루오로스알코올을 사용할 수 있으므로 종래법보다 더욱 간편하고 저비용으로 상기 식 (I)에 기재된 뉴클레오시드 보호체를 합성할 수 있다. F-protector를 도입한 뉴클레오시드 유도체의 구체예로는 이하의 화합물을 들 수 있다.
제2 실시형태는 하기 식 (II)로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드포스포로아미다이트이다.
상기 식 (II) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산 보호기, 바람직하게는 CH2CH2CN, CH2CH=CH2, OCH3또는 CH2(CH2)xYG이며, Y가 NH 또는 S이며, G가 알릴 또는 아실기며, x가 0∼3이거나, 또는 R3과 인원자에 결합하는 질소원자에 결합하는 R4의 하나가 결합하여 형성되는 고리이며; R4는 치환 또는 미치환의 지방족기, 치환 또는 미치환의 방향족기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다. Z-Y 결합의 예는 상기 식 (I)로 표현되는 화합물과 동일하다.
상기 식 (II)에 기재된 3'-포스포로아미다이트는 (1) 상기 식 (I)로 표현되는 3',5'-무보호 뉴클레오시드의 5'-수산기를, 공지의 방법으로 선택적으로 보호하고, (2) (1)에서 얻어진 5'-보호 3'-무보호 뉴클레오시드에, NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2, CH2=CHCH2OP[N (i-C3H7)2]2 등과 같은 3가의 인산화제와 반응시킴으로써 합성할 수 있다. 공정(2)는 공지의 방법으로 하는 것이 가능하다.
제3 실시형태는 하기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트이다.
상기 식 (III) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산 보호기, 바람직하게는 CH2CH2CN, CH2CH=CH2, OCH3, 또는 CH2(CH2)xYG이며, Y가 NH 또는 S이며, G가 알릴 또는 아실기며, x가 0∼3이거나, 또는 R3과, 인원자에 결합하는 질소원자에 결합하는 R5의 하나가 결합하여 형성되는 고리이며; R5는 치환 또는 미치환의 지방족기, 치환 또는 미치환의 방향족기이며; Pro는 무보호, 뉴클레오시드 염기의 보호기 또는 F-protector이며, F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; p는 0∼27의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다. Z-Y 결합의 예는 상기 식 (I)로 표현되는 화합물과 동일하다. 상기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트는 Pro 또는 R1, R3 중 어느 하나에 있어서 적어도 하나의 F-protector를 가진다. 본 명세서에 있어서 블록머란 2량체 이상의 뉴클레오티드이며, 아미다이트나 3'- 또는 5'-수산기 무보호의 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 등과 축합 반응을 함으로써 추가로 장쇄의 뉴클레오티드를 형성하기 위한 합성 블록이 되는 뉴클레오티드 단위이다. 멀티플루오로스블록머란 플루오로스 태그를 복수 포함하는 블록머이다.
상기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트는 (1) 상기 식 (II)로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드포스포로아미다이트, 또는 하기 식 (II')로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드H-포스포네이트와, 하기 식 (V)로 표현되는 3'-말단에 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드를 반응시켜서 중간체를 합성하고, (2) 얻어진 중간체의 3'-말단에 결합한 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드의 플루오로스앵커를 제거하여 3'-무보호체를 얻고, (3) 무보호된 3'-수산기에 NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2, CH2=CHCH2OP[N(i-C3H7)2]2 등과 같은 3가의 인산화제와 반응시켜서 3'-포스포로아미다이트를 생성시키거나, 또는 트리페닐포스파이트와 반응시킨 후에 트리에틸아민으로 가수분해를 하는 조건, 삼염화인을 반응시킨 후에 가수분해를 하는 등과 같은 조건하에서 3'-H-포스포네이트를 생성시키고, (4) 목적으로 하는 사슬 길이의 플루오러스블록머아미다이트가 얻어지기 까지, 상기 공정 (1)에서 (3)을 반복함으로써 합성할 수 있다. 하기 식 (II') 및 식 (V) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다.
제4 실시형태는 하기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머이다.
상기 식 (IV) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산 보호기, 바람직하게는 CH2CH2CN, CH2CH=CH2, OCH3, 또는 CH2(CH2)xYG이며, Y가 NH 또는 S이며, G가 알릴 또는 아실기며, x가 0∼3이며; Pro는 무보호, 뉴클레오시드 염기의 보호기 또는 F-protector이며, F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; X는 O 또는 S이며; l은 0∼58의 정수이며; R7은 (C=O)(CH2)2(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3 또는 실릴계 보호기이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다. Z-Y 결합의 예는 상기 식 (I)로 표현되는 화합물과 동일하다. 상기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머는 Pro 또는 R1, R3 중 어느 하나에 있어서 적어도 하나의 F-protector를 가진다.
제5 실시형태는 상기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트 또는 하기 식 (II')로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드H-포스포네이트와, 하기 식 (V)로 표현되는 3'-말단에 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드를 커플링 반응시키는 공정을 포함하는 상기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머의 합성방법이다. 하기 식 (II') 및 식 (V) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성한다.
본 실시형태에 있어서의 멀티플루오로스블록머는 (1) 상기 식 (II)로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드포스포로아미다이트, 또는 상기 식 (II')로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드H-포스포네이트와, 상기 식 (V)로 표현되는 3'-말단에 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드를 반응시켜서 중간체를 합성하고, (2) 얻어진 중간체의 3'-말단에 결합한 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드의 플루오로스앵커를 제거하여 3'-무보호체를 얻고, (3) 무보호된 3'-수산기에 NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2, CH2=CHCH2OP[N (i-C3H7)2]2 등과 같은 3가의 인산화제와 반응시켜서 3'-포스포로아미다이트를 생성시키거나, 또는 트리페닐포스파이트, 디페닐포스파이트, 삼염화인, 2-클로로-4H-1,3,2-디옥사포스포린-4-온 등과 같은 인산화제와 반응시킨 후에 가수분해를 하여 3'-H-포스포네이트를 생성시키고, (4) 목적으로 하는 사슬 길이의 플루오러스블록머아미다이트가 얻어지기까지 상기 공정 (1)에서 (3)을 반복함으로써 합성할 수 있다.
상기 실시형태에 있어서의 멀티플루오로스블록머는 이하에 기재하는 다른 방법으로도 합성할 수 있다. 상기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트와, 하기 식 (VI)으로 표현되는 5'-말단이 무보호, 3'-말단에 H-포스포네이트를 가지는 플루오로스블록머H-포스포네이트와, 상기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머의 5'-말단을 탈보호한 것을, 이른바 원-팟으로 커플링 시켜는 것에 의해, 목적하는 사슬 길이를 가지는 멀티플루오로스블록머를 얻을 수 있다. 목적물의 사슬 길이에 따라서 5'-보호플루오러스블록머아미다이트와 플루오로스블록머H-포스포네이트의 커플링으로 얻어진 화합물의 5'-말단을 탈보호하고, 다시, 플루오러스블록머아미다이트와 반응시켜서, 사슬 길이가 연장된 플루오로스블록머H-포스포네이트를 합성한 후에 5'-말단을 탈보호하고, 상기의 원-팟 커플링 반응에 제공할 수도 있다. 또 다른 방법으로서, 멀티플루오로스블록머의 3'-말단을, 플루오로스 앵커로 바꾸어 고상 담체에 결합시킨 것을 사용하여 상기 반응을 수행하는 것에 의해서도 고상 담체에 결합한 멀티플루오로스블록머를 합성할 수 있다. 한편, 3'-말단에 플루오로스 앵커를 가지는 멀티플루오로스블록머, 3'-말단이 고상 담체에 결합한 멀티플루오로스블록머 중 어느 하나에 대해서도, 각 부위의 탈보호 반응을 수행함으로써, 올리고뉴클레오티드가 얻어진다. 탈보호 조건을 선택함으로써 필요한 부분에만 보호기를 남긴 수식 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것도 가능하다. 상기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머는 Pro 또는 R1, R3 중 어느 하나에 있어서 적어도 하나의 F-protector를 가진다. 이것에 의해, 멀티플루오로스블록머가 가지는 친화성을 사용하여 범용의 보호기를 사용하는 경우에 비해 중간체나 생성물의 분리정제를 간편하게 할 수 있다.
상기 실시형태에 있어서의 뉴클레오시드 염기는 아데닐기, 구아닐기, 시토시닐기, 티미닐기, 우라실기 등의 천연형 염기, 5-메틸시토시닐기, 5-플루오로우라실기, 7-메틸구아닐기, 7-데아자아데닐기 등의 변형 염기를 포함한다. 본 명세서 중 「수식 뉴클레오시드 염기」에는 아미노기, 카르보닐기, 히드록실기, 티올기 등, 반응성 관능기를 가지는 염기가 포함된다. 상기와 같은 반응성 관능기에 대하여, 플루오로스알코올 유래의 플루오로스 보호기가 도입된다. 뉴클레오시드 염기를 보호하는 보호기로는 아실기, 벤조일기, 아릴옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.
상기 실시형태에 있어서의 지방족기는 포화 또는 불포화의, 직쇄상 또는 분기되어 있는 C1-C18 탄화수소, 포화 또는 불포화의 환상 C3-C18 탄화수소를 포함한다. 바람직하게는 포화 또는 불포화의, C1-C8 탄화수소 또는 C3-C8 환상 탄화수소이다. 본 실시형태에 있어서의 방향족기는 페닐기 등의 탄소환식 방향족 고리, 나프틸기 등의 탄소환식 방향족 고리 또는 비탄소식 방향족 고리에 축합된 탄소환식 방향족 고리를 포함한다. 본 실시형태에 있어서의 지방족기, 방향족기는 포화 또는 불포화의, C1-C8 탄화수소 또는 C3-C8 환상 탄화수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 방향족 고리 등의 치환기로 치환되어 있을 수도 있다. 인원자에 결합한 질소원자에 결합되어 있는 것은 바람직하게는 직쇄상 또는 분기되어 있는 알킬기나, 피롤리딘, 디에틸아민, 모르폴리노기 등의 2급 아미노기이며, 더욱 바람직하게는 이소프로필기이다. 또한, 인원자에 결합한 질소원자에 결합한 알킬기의 일단부가, 인접하는 질소원자에 결합하여 형성된 고리일 수 있다.
상기 실시형태에 있어서의, 인접하는 뉴클레오시드를 결합하는 인산의 보호기로는 올리고뉴클레오티드 합성으로 범용의 인산 보호기를 사용할 수 있다. 바람직하게는 -CH2CH2CN, -CH2CH=CH2, -OCH3, 2-클로로페닐기, 페닐기, 또는 R'와, 인원자에 결합하는 질소원자에 결합하는 R"의 하나가 결합해서 형성되는 고리일 수도 있다. 상기 이외의 보호기로서, 염기성 조건하에서 탈보호 가능한 -CH2CH2E(E는 전자흡인성기), 불소 함유 보호기를 들 수 있다.
본 실시형태에 있어서의 5'-수산기의 보호기는 산성 조건, 염기성 조건 또는 중성 조건하에서 제거 가능한 보호기를 포함한다. 산성 조건하에서 제거 가능한 보호기는 치환 또는 미치환의 트리틸기를 포함하는 에테르계 보호기, 픽실기, 치환 또는 미치환의 테트라히드로피라닐(THP)기를 포함하고, 대표적인 보호기로서 4,4'-디메톡시트리틸기가 있다. 중성 조건하에서 제거 가능한 보호기의 예로서 실릴계 보호기가 있으며, 구체적으로는 트리메틸실릴기, 트리에틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, t-부틸디페닐실릴기, 트리페닐실릴기를 포함한다. 염기성 조건하에서 제거 가능한 보호기의 예로서, Fmoc기, 피발로일기가 있다. 상기 이외의 보호기로서 알킬기, 아실기, 아세틸기, 벤조일기, 벤질기, 알콕시알킬기, 카르바모일기 등을 들 수 있다.
상기 실시형태에 있어서, 3'-무보호 수산기를 아미다이트화하는 공정에 있어서는 3'-무보호 뉴클레오시드의 용액(0.1∼0.4M)에, 3가의 인산화제(3'-무보호 뉴클레오시드의 1.05∼2.0당량) 및 활성화제(3'-무보호 뉴클레오시드의 0.4∼0.8당량)를 더하고, 실온에서 10∼20시간 교반한다. 얻어진 3'-포스포로아미다이트를 실리카겔로 정제한다.
상기 실시형태에 있어서는 식 (II) 또는 식 (III)으로 표현되는 3'-포스포로아미다이트에 대하여, 아미다이트 부분을 활성화하는 활성화제를 첨가한 후, 상기 식 (V)로 표현되는 3'-말단에 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드를 커플링시킴으로써, 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머가 얻어진다. 활성화제의 대표적인 것으로는 1H-테트라졸, S-에틸티오테트라졸, 디시아노이미다졸, 디클로로이미다졸, 술폰산과 아졸 또는 3급 아민의 염이 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 반응은 디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란, DMF, 톨루엔 등의 용매를 건조시킨 것 중에서 한다.
상기 실시형태에 있어서의 블록머아미다이트나 멀티플루오로스블록머를 합성할 경우에는 1염기씩 신장시켜 가는 방법의 다른 방법으로서, 이미 2량체 이상이 된 블록머아미다이트를, 3'-말단에 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드와 축합시킴으로써 2이상의 염기분을 한번에 신장시킬 수도 있다.
상기 식 (III)으로 표현되는 블록머아미다이트를 사용하여 수행하는 멀티플루오로스블록머의 합성은 용액중에서 수행할 수 있다(이하, 「액상 합성법」이라 한다). 상술한 방법으로 멀티플루오로스블록머를 합성한 후, 시판되고 있는 실리카겔, 옥타데실이나 디올 등으로 수식된 실리카겔, 플루오로스 고상 추출용 실리카겔을 사용한 컬럼 크로마토 그래피로 간편하게 정제할 수 있다. 시판되고 있는 플루오로스 고상 추출용의 실리카겔로는 Aldrich사에서 구입 가능한 Fluoroflash silica gel 40μm를 일 예로 들 수 있다. 액상 합성법에서는 고상 수지 상에서 커플링 반응을 하는 고상 합성법에 비해 대량 스케일(10배∼100배 이상)로 합성할 수 있다. 따라서, 보다 저비용으로 올리고뉴클레오티드 합성용 멀티플루오로스블록머를 합성할 수 있다. 유기용매와 물 또는 플루오로스용매와 유기용매, 플루오로스용매와 물에 의한 분액조작이나, 이들 2상계의 향류 크로마토그래피, 정석ㆍ분체화에 의한 간이정제 등도 적용 가능하다.
또한, 멀티플루오로스블록머의 뉴클레오시드 염기 부분에 보호기로 도입하는 본 발명의 F-앵커의 수를 조정하는, 바꾸어 말하면 일부의 뉴클레오시드 염기 부분에는 본 발명의 F-앵커를 도입하고, 나머지의 뉴클레오시드 염기 부분에는 범용의 보호기를 사용함으로써, 플루오로스 고상 추출용의 실리카겔과의 어피니티를 변화시킬 수 있다. 이것에 의해, 멀티플루오로스블록머를 플루오로스 고상 추출용의 실리카겔측에 남도록 하고, 반응의 부생성물이나 과잉의 시약과의 분리를 보다 간편하게 할 수 있다. 또한 멀티플루오로스블록머 합성의 중간체의 단계에서도, 용매로의 용해성을 변화시킬수 있음으로써, 실리카겔 크로마토그래피에 의한 정제가 아닌, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제나, 플루오로스용매-탄화 수소계 유기용매에서의 분배에 의한 정제가 가능해진다. 이와 같이, 본 발명의 멀티플루오로스블록머는 합성하는 양이나 그 사슬 길이에 따라서 정제방법을 적절히 선택할 수 있다.
상기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머를 사용한 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서는 예를 들면, 멀티플루오로스블록머 합성의 단계에서, 3가의 인산을 산화제가 아니라 황화제와 반응시켜서 5가의 인산의 일부를 티오포스페이트로 할 수 있다. 따라서, 블록머 합성의 도중 단계에서 티오포스페이트로 한 멀티플루오로스블록머를 합성해 둠으로써, 목적한 위치에 확실하게 티오포스페이트를 도입한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
이하의 실시예는 본 발명의 실시형태를 설명하고, 예시하는 것이다. 실시예 1에 나타내는 순서에 따라, 상기 식 (II)로 표현되는 화합물의 일 예인 염기부 플루오로스 보호포스포로아미다이트를 제조하였다. 또한, 실시예 2에 나타내는 순서에 따라, 상기 식 (IV)로 표현되는 화합물의 일 예인 멀티플루오로스블록머를 제조하였다. 또한, 실시예 3에 나타내는 순서에 따라, 상기 식 (III)으로 표현되는 화합물의 하나인 블록머포스포로아미다이트 6량체 포스포로아미다이트와, 상기 식 (IV)로 표현되는 화합물의 일 예인 멀티플루오로스블록머를 사용하여 올리고뉴클레오티드 19량체의 합성을 수행하였다.
(실시예 1) 뉴클레오시드 염기부 플루오로스 보호 포스포로아미다이트의 합성
스텝 1: 3',5'-보호 뉴클레오시드의 염기부의 플루오로스 보호
공지의 방법에 의해 합성 가능한 3',5'-비스-O-tert-부틸디메틸실릴티미딘1(2.4g, 5.0mmol)을 테트라히드로퓨란(25mL)에 녹이고, 0℃로 하였다. 여기에 트리페닐포스핀(1.4g, 5.5mmol), 40% 디에틸아조디카르복실레이트/톨루엔 용액(2.5mL, 5.5mmol), 추가로 1H,1H,2H,2H-트리데카플루오로-1-옥타놀2(2.0g, 1.2mL, 5.5mmol)을 더하고, 12시간 교반하였다. 반응용액을 그대로 농축하고, 석출한 고체를 여과별, 헥산:초산에틸=1:1 용액으로 세정한 후, 얻어진 용액을 다시 농축하여 조생성물로 하였다. 이것을 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하였다. 헥산:초산에틸=4:1로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 3',5'-비스-O-tert-부틸디메틸실릴-4-O-1H,1H,2H,2H-트리데카플루오로-1H-옥틸티미딘3을 3.3g(4.1mmol), 81% 수율로 얻었다. ESI-TOF Mass:840.3[M+Na+]+.
스텝 2: 3',5'-보호-염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드의 3',5'탈보호
화합물 3(1.6g, 2.0mmol)을 테트라히드로퓨란(32mL)에 녹이고, 0℃로 하였다. 여기에 초산(120mg, 0.11mL, 2.0mol), 추가로 1.0M 테트라부틸암모늄플루오라이드/테트라히드로퓨란 용액(8.0mL, 8.0mmol)을 더하고, 12시간 교반하였다. 반응용액을 일부 농축하여 5mL 정도의 용적으로 하고, 얻어진 반응 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하였다. 초산에틸로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 4-O-1H,1H,2H,2H-트리데카플루오로-1H-옥틸티미딘4를 1.2g (2.0mmol), 98% 수율로 얻었다. ESI-TOF Mass:612.0 [M+Na+]+.
스텝 3: 3',5'-무보호-염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드의 5'-보호
화합물 4(1.2g, 2.0mmol)를 디메틸포름아미드:피리딘=1:1 용액(10mL)에 녹이고, 여기에 4,4-디메틸아미노피리딘(24mg, 0.20mmol), 및, 디메톡시트리틸클로라이드(810mg, 2.4mmol)를 더하고, 90분 교반하였다. 반응용액에 초산에틸(100mL)을 더하고, 0.2N 염산 수용액으로 3회 유기층을 세정하였다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과후 용매를 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하고, 헥산:초산에틸=7:3으로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 5'-디메톡시트리틸-4-O-1H,1H,2H,2H-트리데카플루오로-1H-옥틸티미딘5를 1.5g (1.7mmol), 83% 수율로 얻었다. ESI-TOF Mass:914.7 [M+Na+]+.
스텝 4: 5'-보호-3'-무보호-염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드의 아미다이트화
화합물 5(1.4g, 1.6mmol)를 디클로로메탄:아세토니트릴=1:1 용액(16mL)에 녹이고, 여기에 1H-테트라졸(80mg, 1.1mmol)을 더하여, 0℃에서 15분 교반하였다. 여기에 알릴테트라이소프로필포스포로아미다이트(710mg, 0.74mL, 2.4mmol)를 더하여 반응을 시작하였다. 15시간 후, 이 반응 혼합물을 그대로 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하고, 헥산:초산에틸=9:1로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 알릴5'-디메톡시트리틸-4-O-1H,1H,2H,2H-트리데카플루오로-1H-옥틸티미딘-3'-포스포로아미다이트6을 1.6g(1.4mmol), 89% 수율로 얻었다. UPLC 측정에 의해 97% 순도인 것으로 나타났다. ESI-TOF Mass:1079.2[M+H+]+. 화합물 6의 ESI-TOF스펙트럼을 도면1에 나타냈다.
(실시예 2) 멀티플루오로스블록머의 합성
스텝 5: 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드의 2량체 합성
화합물 6(520mg, 0.48mmol)과 문헌에 기재된 방법에 의해 합성 가능한 화합물 7(280mg, 0.40mmol)을 혼합 후, 진공 건조시키고, 여기에 아르곤 기류를 충진하여 상압으로 하였다. 여기에 몰리큘라시브 3A(800mg)를 더하고, 이어서 디클로로메탄:아세토니트릴=1:1 용액(8mL)을 더하여 2시간 교반하였다. 여기에 1H-테트라졸(110mg, 1.6mmol)을 더하고 실온에서 30분 교반하였다. 반응의 진행을 확인한 후, 31wt%2-부탄온퍼옥사이드/디이소낙산-2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄 용액(0.39mL, 0.6mmol)을 더하여 반응을 계속하였다. 30분 후, 이 반응 혼합물을 셀라이트 여과하고, 용액량이 8mL가 될 때까지 농축한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하였다. 헥산:초산에틸=2:3으로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 비스플루오로스TT블록머8을 640mg(0.38mmol), 94% 수율로 얻었다. UPLC 측정에 의해 98% 순도인 것으로 나타났다. ESI-TOF Mass:1680.6[M-H+]-. 화합물 8의 ESI-TOF 스펙트럼을 도면 2에 나타냈다.
(실시예 3) 6량체 포스포로아미다이트를 사용하는 올리고뉴클레오티드 19량체의 액상 합성
스텝 6: 6량체 포스포로아미다이트와 5'-보호-3'-플루오로스앵커 결합 뉴클레오시드의 축합반응
화합물 9(400mg, 0.17mmol)와 공지의 방법에 의해 합성 가능한 화합물 7(100mg, 0.15mmol)을 혼합 후, 진공 건조시키고, 여기에 아르곤 기류를 충진하여 상압으로 하였다. 여기에 몰리큘라시브 3A(600mg)를 더하고, 이어서 디클로로메탄:아세토니트릴=1:1 용액(6mL)을 더하여 2시간 교반하였다. 여기에 5-에틸-1H-테트라졸(78mg, 0.60mmol)을 더하여 실온에서 30분 교반하였다. 반응의 진행을 확인한 후, 31wt%2-부탄온퍼옥사이드/디이소낙산-2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄용액(0.15mL, 0.30mmol)을 더하여 반응을 계속하였다. 30분 후, 이 반응 혼합물을 셀라이트 여과하고, 용액량이 5mL가 될 때까지 농축한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하였다. 디클로로메탄:메탄올=20:1로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 T7량체 10을 260mg(0.084mmol), 56% 수율로 얻었다. ESI-TOF Mass:1552.2[M+2Na+]+.
스텝 7: 5'-보호-3'-플루오로스앵커 결합 뉴클레오티드 7량체의 5'-탈보호
화합물 10(230mg, 0.076mmol)을 디클로로메탄:아세토니트릴=4:1용액(4mL)을 더하여 용해시킨 후, 아이스배스에 담가 0℃로 하였다. 여기에 디클로로 아세트산(200mg, 0.13mL, 1.5mmol)을 더하여 30분 교반하였다. 반응의 진행을 확인한 후, 이 반응 혼합물을 그대로 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하였다. 디클로로메탄:메탄올=13:1로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 탈트리틸된 T7량체 11을 180mg (0.065mmol), 86% 수율로 얻었다.
스텝 8: 5'-보호 6량체 블록머아미다이트와 5'-무보호-3'-플루오로스앵커 결합 뉴클레오티드 7량체의 축합에 의한 5'-보호 뉴클레오티드 13량체 합성
화합물 9(240mg, 0.10mmol)와 화합물 11(210mg, 0.076mmol)을 혼합 후, 진공 건조시키고, 여기에 아르곤 기류를 충진하여 상압으로 하였다. 여기에 몰리큘라시브 3A(500mg)를 더하고, 이어서 디클로로메탄:아세토니트릴=1:1 용액(5mL)을 더하여 2시간 교반하였다. 여기에 5-에틸-1H-테트라졸(40mg, 0.30mmol)을 더하여 실온에서 30분 교반하였다. 반응의 진행을 확인한 후, 31wt%2-부탄온퍼옥사이드/디이소낙산-2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄 용액(0.073mL, 0.11mmol)을 더하여 반응을 계속하였다. 30분 후, 이 반응 혼합물을 셀라이트 여과하고, 용액량이 5mL이 될 때까지 농축한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하였다. 디클로로메탄:메탄올=9:1로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 T13량체 12를 260mg(0.051mmol), 73% 수율로 얻었다.
스텝 9: 5'-보호 뉴클레오티드 13량체의 5'-탈보호
화합물 12(480mg, 0.093mmol)를 디클로로메탄:아세토니트릴=4:1용액(4.5mL)을 더하여 용해시킨 후, 아이스배스에 담가 0℃로 하였다. 여기에 디클로로 아세트산(240mg, 0.15mL, 1.9mmol)을 더하여 30분 교반하였다. 반응의 진행을 확인한 후, 이 반응 혼합물을 그대로 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하였다. 디클로로메탄:메탄올=9:1로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 탈트리틸된 T13량체 13을 240mg(0.050mmol), 52% 수율로 얻었다. 얻어진 화합물이, 목적으로 하는 13량체인 것은 얻어진 화합물의 일부를 암모니아 가수분해를 거쳐, T13량체를 나타내는 분자 이온 피크[M-H+]-3889.67(계산값 3889.64)를 관측한 것에 의해 확인하였다.
스텝10 : 5'-보호 6량체 블록머아미다이트와 5'-무보호-3'-플루오로스앵커 결합 뉴클레오티드 13량체의 축합에 의한 5'-보호-3'-플루오로스앵커 결합 뉴클레오티드 19량체 합성
화합물 9(230mg, 0.093mmol)와 화합물 13(300mg, 0.062mmol)을 혼합 후, 진공 건조시키고 여기에 아르곤 기류를 충진하여 상압으로 하였다. 여기에 몰리큘라시브 3A(500mg)를 더하고, 이어서 디클로로메탄:아세토니트릴=1:1 용액(5mL)을 더하여 2시간 교반하였다. 여기에 5-에틸-1H-테트라졸(32mg, 0.25mmol)을 더하여 실온에서 30분 교반하였다. 반응의 진행을 확인한 후, 31wt%2-부탄온퍼옥사이드/디이소낙산-2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄 용액(0.060mL, 0.093mmol)을 더하여 반응을 계속하였다. 30분 후, 이 반응 혼합물을 셀라이트 여과하고, 용액량이 5mL가 될 때까지 농축한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 처리하였다. 디클로로메탄:메탄올=6:1로 용출된 분획을 회수하고, 목적으로 하는 5'-보호-인산보호-3'-플루오로스앵커 결합 T19량체 14를 82mg(0.011mmol), 18% 수율로 얻었다.
스텝 11: 5'-보호-3'-플루오로스앵커 결합 뉴클레오티드 19량체 합성의 탈보호
화합물 14를 1% β-mercaptoethanol의 메탄올:농축 암모니아 수=1:1 용액에 용해시켜 50℃에서 12시간 교반하였다. 반응 생성물을, 시판되고 있는 정제 키트를 이용하여 디메톡시트리틸기의 제거 및 정제를 함으로써, 목적으로 하는 화합물 15가 얻어지는 것을 확인하였다. 목적으로 하는 19량체인 것은 T19량체를 나타내는 분자 이온 피크[M-H-]-5714.00(분자식 C190H247N38O131P18 -, 계산값 5713.91)를 관측한 것에 의해 확인하였다. 얻어진 T19량체 15의 UPLC 스펙트럼을 도면 3에, ESI-TOF 매스 스펙트럼을 도면 4에 각각 나타냈다.
(실시예 4) 염기부가 플루오로스 보호된 뉴클레오시드를 사용한 11량체의 합성
스텝 12: 5'-보호-염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드-3'-아미다이트와 5'-무보호-3'-보호-뉴클레오티드 3량체의 축합에 의한, 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5',3'-보호 뉴클레오티드 4량체 합성
화합물 16(1.05g, 1.00mmol)과 화합물 4(1.34g, 1.20mmol)를 디클로로메탄-아세토니트릴 1:1혼합물(16mL)에 녹이고, 추가로 1H-테트라졸 (350mg, 5.00mmol)을 더하여 교반하였다. 15분 후, 31wt% 2-butanone peroxide(966μL, 1.50mmol)를 적하하여 15분 교반하였다. TLC(초산에틸100%)로 원료가 거의 소실된 것을 확인하고, 분액 세정 후, 컬럼 크로마토 그래피로 처리하여 목적으로 하는 5',3'-보호 뉴클레오티드 4량체 17을 얻었다(1.93g, 0.93mmol, 93% 수율, 순도 97%). 구조는 31PNMR, ESI-MS에 의해, 순도는 UPLC로 확인하였다).
스텝 13: 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5',3'-보호 뉴클레오티드 4량체에 3'-탈보호
5',3'-보호 뉴클레오티드 4량체 17(1.87g, 0.900mmol)에 초산(51.4μL, 0.900mmol)을 더하여 0℃까지 냉각하였다. 1.0M TBAF in THF(1.80mL, 1.80mmol)을 적하하여 3시간 교반하였다. TLC(초산에틸=100%)로 원료가 거의 소실된 것을 확인하고, 분액 세정 후, 컬럼 크로마토 그래피로 처리하고, 목적으로 하는 3'-탈보호 4량체 18을 얻었다(1.35g, 0.689mmol, 76.7% 수율, 순도 93%). 구조는 31PNMR, ESI-MS에 의해, 순도는 UPLC로 확인하였다.
스텝 14: 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5'-보호 뉴클레오티드 4량체의 3'-아미다이트화
화합물 18(1.27g, 0.65mmol)을 디클로로메탄-아세토니트릴 1:1혼합물(16mL)에 녹이고, 추가로 1H-테트라졸(59.0mg, 0.845mmol)과 N-메틸이미다졸(21.0μL, 0.260mmol)을 더하여 0℃로 하였다. 15분 후, 알릴-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로아미다이트(469μL, 1.63mmol)을 적하하여 추가하였다. 4일후, TLC(헥산:초산에틸=2:1)로 원료가 거의 소실된 것을 확인하고, 반응 혼합액을 그대로 컬럼 크로마토 그래피로 처리하고, 목적으로 하는 4량체 아미다이트체 19을 얻었다(0.873g, 0.40mmol, 62.6% 수율, 순도 98.3%). 구조는 ESI-MS에 의해, 순도는 UPLC로 확인하였다.
스텝 15: 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5'-보호 뉴클레오티드 4량체 3'-아미다이트와 5'-무보호-3'-보호 뉴클레오티드 3량체의 축합에 의한, 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5',3'-보호 뉴클레오티드 7량체 합성
화합물 16(0.537g, 0.25mmol)와 4량체 아미다이트 19(0.288g, 0.275mmol)를 디클로로메탄-아세토니트릴1:1혼합물(5mL)에 녹이고, 추가로 5-에틸티오-1H-테트라졸(70.1mg, 1.00mmol)을 더하여 교반하였다. 90분 후, 31wt% 2-butanone peroxide(241μL, 0.375mmol)을 적하하여 60분 교반하였다. TLC(초산에틸:메탄올=9:1)로 원료가 거의 소실된 것을 확인하고, 분액 세정 후, 컬럼 크로마토 그래피로 처리하고, 목적으로 하는 7량체 20을 얻었다(0.655g, 0.211mmol, 84.3% 수율, 순도 96.7%). 구조는 ESI-MS에 의해, 순도는 UPLC로 확인하였다.
스텝 16: 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5',3'-보호 뉴클레오티드 7량체의 5'-탈보호
화합물 20(0.655g, 0.211mmol)에 디클로로메탄(4mL)을 더하고 0℃까지 냉각하였다. 디클로로 아세트산(0.349mL, 4.22mmol)을 적하하여 30분 교반하였다. TLC(초산에틸:메탄올=9:1)로 원료가 거의 소실된 것을 확인하고, 반응액을 컬럼 크로마토 그래피로 처리하고, 목적으로 하는 5'-무보호 7량체 21을 얻었다(0.468g, 0.689mmol, 79.1% 수율, 순도 92.4%). 순도는 UPLC로 확인하였다.
스텝 17: 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5'-보호 뉴클레오티드 4량체 3'-아미다이트와 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5'-무보호-3'-보호 뉴클레오티드 7량체의 축합에 의한, 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5',3'-보호 뉴클레오티드 11량체 합성
5'-무보호 7량체 21(0.311g, 0.100mmol)과 4량체 아미다이트 19(0.236g, 0.110mmol)를 디클로로메탄-아세토니트릴1:1혼합물(2mL)에 녹이고, 추가로 1H-테트라졸(42.0mg, 6.00mmol) 및 N-메틸이미다졸(16μL, 0.200mmol)을 더하여 교반하였다. 90분 후, 31wt% 2-butanone peroxide(100μL, 0.150mmol)를 적하하여 60분 교반하였다. TLC(초산에틸:메탄올=9:1)로 원료가 거의 소실된 것을 확인하고, 분액 세정 후, 컬럼 크로마토 그래피로 처리하고, 목적으로 하는 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5',3'-보호 뉴클레오티드 11량체 22을 얻었다(0.450g, 0.0920mmol, 92% 수율, 순도 96.7%). 순도는 UPLC로 확인하였다. UPLC 스펙트럼을 도면5에 나타내었다.
얻어진 염기부 플루오로스 보호 뉴클레오시드를 포함하는 5',3'-보호 뉴클레오티드 11량체 22에 대하여 범용의 방법으로 탈보호를 함으로써, 보호기를 제거한 뉴클레오티드 11량체를 얻을 수 있다.
종래법으로 합성한 dTA19 배열을 가지는 뉴클레오티드 20량체의 탈보호 후의 순도와, 본 발명의 플루오로스 태그를 사용한 합성법에 의해 합성한 dTA19 배열을 가지는 뉴클레오티드 20량체의 탈보호 후의 순도를 비교한 UPLC 스펙트럼을 도면6에 나타낸다. (a)가 종래법으로 합성한 dTA19 20량체의 스펙트럼, (b)가 본 발명의 플루오로스 태그를 5'-말단 T의 염기부분에 가지는 dTA19 20량체의 스펙트럼이다. 플루오로스 태그를 남긴 상태가 되도록 탈보호를 하고, 정제함으로써, 종래법으로 합성한 20량체보다도 높은 순도로 20량체가 얻어진 것을 알 수 있다. 플루오로스 태그가 가지는 높은 지용성에 의해, 분리정제에 있어서 유지시간이 크게 바뀜으로써, 종래법보다도 간편하게 단리정제를 수행할 수 있다는 것으로 나타났다.
본 실시형태의 멀티플루오로스블록머는 시판되고 있는 불화 탄소 유도체를 그대로 사용하여 플루오로스앵커를 도입함으로써 합성할 수 있다. 또한, 목적에 따라 플루오로스앵커 중의 불소의 수를 변경하는 것이 용이하게 가능하다. 따라서, 목적으로 하는 플루오로스 태그를 얻기 위해서 복잡한 공정을 필요로 하는 종래법에 의한 뉴클레오시드에의 플루오로스 태그 도입보다도, 저비용이면서 용이하게 목적물을 얻을 수 있다.
또한, 상술한 바와 같은 문제에 기인하여, 종래법에 의한 뉴클레오시드로의 플루오로스 태그 도입은 플루오로스 태그의 도입수에 제한이 있어, 범용성이 높지 않다. 이것에 대하여, 본 실시형태의 멀티플루오로스블록머의 합성은 플루오로스앵커의 도입수를 조제함으로써, 올리고뉴클레오티드 합성의 중간체의 용해성이나, 정제부하를 저감할 수 있다. 이것에 의해, 보다 범용성이 높은 합성법으로 할 수 있다. 또한, 플루오로스 태그는 합성하는 블록머나 올리고뉴클레오티드의 길이나 배열에 따라 뉴클레오시드 염기 부분에 도입하거나, 뉴클레오시드에 3'-말단의 보호기에 도입할 수 있다.
또한, 본 실시형태의 멀티플루오로스블록머를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법은 블록머의 단계에서 산화/유화된 5가의 인산 결합 부분을 형성해 둘 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 중의 일부의 인산 결합만을 다른 부분의 인산 결합과 다른 산화/유화 상태로 하는 경우에 있어서도, 올리고뉴클레오티드 합성의 순서를 바꾸지 않고, 보다 간편하게, 목적으로 하는 수식된 인산 결합 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
또한, 지금까지 사용되고 있는 플루오로스 태그를 도입한 블록머는 그 플루오로스 태그의 물성에 영향을 받음으로써, 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서의 사슬 길이 신장시의 정제방법이 번잡하게 되어 있었다. 이것에 대하여, 멀티플루오로스블록머의 합성방법 및 멀티플루오로스블록머를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법은 그 사슬 길이에 따라서 실리카겔 여과, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제, 플루오로스용매-탄화수소계 유기용매에서의 분배 등, 정제방법의 선택 자유도가 크다. 따라서, 종래법에 의한 플루오로스 태그를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법보다도, 보다 간편한 정제로 목적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 얻을 수 있다.
또한, 본 실시형태의 멀티플루오로스블록머를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성방법에 의하면, 같은 N량체의 올리고뉴클레오티드를 합성함에 있어서, 범용으로 사용된 액상 합성법으로 1염기씩 신장하는 방법에 비해 필요한 공정수를 줄일 수 있다. 따라서, 목적으로 하는 길이의 올리고뉴클레오티드 수율을 향상시킬 수 있다.
Claims (5)
- 하기 식 (I)로 표현되는 뉴클레오시드 보호체이며,
[화학식 1]
상기 식 (I) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1, R2는 독립적으로, H 또는 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성하는 뉴클레오시드 보호체. - 하기 식 (II)로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드포스포로아미다이트이며,
[화학식 2]
상기 식 (II) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성, 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산기의 보호기이거나, 또는 R3과 인원자에 결합하는 질소원자에 결합하는 R4의 하나가 결합하여 형성되는 고리이며; R4는 치환 또는 미치환의 지방족기, 치환 또는 미치환의 방향족기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성하는 5'-말단보호 뉴클레오시드포스포로아미다이트. - 하기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트이며,
[화학식 3]
상기 식 (III) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산기의 보호기이거나, 또는 R3과, 아미다이트 부분을 형성하는 인원자에 결합하는 질소원자에 결합하는 R5의 하나가 결합하여 형성되는 고리이며; R5는 치환 또는 미치환의 지방족기, 치환 또는 미치환의 방향족기이며; Pro는 무보호, 뉴클레오시드 염기의 보호기 또는 F-protector이며, F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; p는 0∼27의 정수이며; ;Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성하고; Pro 또는 R1, R3 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 F-protector를 가지는 플루오러스블록머아미다이트. - 하기 식 (IV)로 표현되는 멀티플루오로스블록머이며,
[화학식 4]
상기 식 (IV) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; R3은 인산기의 보호기이며; Pro는 무보호, 뉴클레오시드 염기의 보호기 또는 F-protector이며, F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; X는 O 또는 S이며; l은 0부터 58의 정수이며; R7은 (C=O)(CH2)2(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3 또는 실릴계 보호기이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성하고; Pro 또는 R1, R3 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 F-protector를 가지는 멀티플루오로스블록머. - 제3항에 기재된 상기 식 (III)으로 표현되는 플루오러스블록머아미다이트 또는 하기 식 (II')로 표현되는 5'-말단보호 뉴클레오시드H-포스포네이트와, 하기 식 (V)로 표현되는 3'-말단에 플루오로스앵커가 결합한 뉴클레오시드를 커플링 반응시키는 공정을 포함하는, 제4항에 기재된 하기 식 (VI)으로 표현되는 멀티플루오로스블록머의 합성방법이며,
[화학식 5]
[화학식 6]
상기 식 (II') 및 식 (V) 중, B는 천연형 또는 수식 뉴클레오시드 염기이며; R1은 산성, 염기성 또는 중성 조건하에서 탈보호 가능한 보호기이며; F-protector는 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 O인 경우에는 O(CH2)n(CF2)mCF3이며, 뉴클레오시드 염기 B의 피보호부가 N인 경우에는 NH(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3이며, n은 1 또는 2이며, m은 1∼20의 정수이며; Y는 H, OH, 할로겐, OCH3, 메톡시에틸, CN, CF3, 또는 아실계 보호기, 에테르계 보호기, 실릴계 보호기로 보호된 수산기이며; Z는 H, 알킬, O-알킬, N-알킬, 할로겐이거나, 또는 상기 Y와의 사이에서 Z-Y 결합을 형성하고; R7은 (C=O)(CH2)2(C=O)(CH2)n(CF2)mCF3 또는 실릴계 보호기이며, n은 1 또는 2인, 멀티플루오로스블록머의 합성방법.
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US20060178507A1 (en) * | 2004-12-30 | 2006-08-10 | Berry & Associates, Inc. | Fluorous oligonucleotide reagents and affinity purification of oligonucleotides |
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WO2017086397A1 (ja) | 2015-11-17 | 2017-05-26 | 日産化学工業株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法 |
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E902 | Notification of reason for refusal |