JPS6363694A - ヌクレオシドホスホロチオイットおよびその合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なヌクレオチド誘導体であるヌクレオシド
ホスホロチオイツト、その合成法およびヌクレオシドホ
スホロチオイツトを用いた縮合反応忙よるオリゴヌクレ
オチドの製法に関スル。本発明のヌクレオシドホスホロ
チオイツトは一般式（１） （式中、Ｂは保護基を有することもある核酸残基を、Ｒ
１は水酸基の保！！基を、Ｒ”Ｕ’Ｊン酸保護基となり
得る基を、Ｒ３は置換基を有することもあるアルキル基
を表わす） で示されるヌクレオチド誘導体であり１本発明は更にヌ
クレオシドホスホロチオイツトのリン酸修飾基であるア
ルキルチオ基と、ヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導
体の５′−位水酸基とでインターヌクレオチド結合を形
成させることからなるオリゴヌクレオチドの製法に関す
る。

（従来の技術） 現在オリゴヌクレオチドを製造する方法としては、有機
化学的方法と簿素的方法の二つの方法が開発されており
、有機化学的方法としては、ヌクレオシドの３′−位と
他のヌクレオシドの５′−位とをリン酸エステルの形で
結合させる縮合反応の種類によって、トリエステル法、
ジエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法
などが知られている。これらの縮合反応のうち、ホスフ
ァイト法は、レツチンゲル（Ｌａｔａｌｎ　−ｇｏｒ）
うによって提案されたもので〔ジャーナルφオブーザ・
アメリカン・ケミカル俳ソ丈イエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｓｏｃｉｅｔｙ　）　ｓ旦、３２７８（１９７５））、
下記の反応式ＣＩ） 反応式［１３ （反応式〔ｌ）において　Ｒ４は水酸基の保護基を、Ｂ
　、　Ｒ’およびＲ１は前記と同一の意味を表わす）で
示されるように、５′−位水酸基を保護したヌクレオシ
ドにリン酸化剤を反応させてヌクレオシドホスホロクロ
リド誘導体としたのち、このヌクレオシドホスホロクロ
リド誘導体ト３’−位水酸基を保護したヌクレオシドと
を縮合させ、次いでヨウ素−水により酸化してジヌクレ
オチドを得るものである。しかし、このリン酸化剤は湿
気に対して非常に不安定であるため、カルザース（Ｃａ
ｒｕｔｈ＠ｒｓ　）らは下記の反応式〔］〕反応式〔■
〕 （反応式〔］〕において、Ｂ、Ｒ”およびＲ′は前記と
同一の意味を表わす） に示すように１反応式（１）で用いたリン酸化剤のクロ
ル基の１つをジメチルアミノ基に代えたリン酸化剤を用
いてホスホロアミダイトを得るホスホロアミダイト法を
開発した。このホスホロアミダイトは比較的安定であり
、抽出操作により精製することが可能である。このホス
ホロアミダイトはテトラゾールで活性化したのち、縮合
反応および酸化反応を行いジヌクレオチドを得ている〔
テトラヘドロン魯レターズ（Ｔｅｔｒａｈ＊ｄｒｏｎ　
Ｌｅｔｔｅｒｓ　）　、　２２　、　ｌ　８５９　（１
９８１））。

なお、現在はジメチルアミノ基の代りにジイノプロビル
アミノ基を導入したホスホロアミダイトが一般に用いら
れている。

（発明が解決しよ５とする問題点） ホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの製造
は、インターヌクレオチド結合が迅速かつ定量的に得ら
れる利点を有する反面、ホスホロアミダイト試薬が一般
的に不安定であり、とくに縮合工程のちと更に酸化工程
を必要とするなどの欠点を有している。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、オリゴヌクレオチドを製造する際のイン
ターヌクレオチド結合を、現在より迅速かつ定量的に進
行させると共に、縮合と酸化の両反応を同時におこない
得るヌクレオチド誘導体について検討を加えた結果、新
規なヌクレオチド誘導体であるヌクレオシドホスホロチ
オイツトを見い出し本発明を完成したものである。

本発明のヌクレオシドホスホロチオイツトは一般式（１
） （式中、Ｂ　、　Ｒ’　、　Ｒ”およびＲ３は前記と同
一の意味を表わす） で示されるヌクレオチド誘導体であり、下記の反応式Ｃ
Ｉ〕 反応式（１） （反応式ＣＩ）において、Ｂ　、　Ｒ’　、　Ｒ″およ
びＲ″は前記と同一の意味を表わす） に示すように、５′−位水葭基を保護したヌクレオシド
（３ンに一般式（２） （式中、ｌおよびＲ１は前記と同一の意味を表わす） で示される亜リン酸化試薬である（プルキルチオ）クロ
ロアルコキシホスフィン（２）を反応させることにより
合成することができる。この反りは、５′コ位水酸基を
保護基Ｒ１例えばトリチル基、メトキシトリチル基、ジ
メトキシトリチル基などの脱保護反応のさい選択的に脱
離する保護基により保護した２′−デオキシアデノシン
、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン
、チミジンなどのヌクレオシド（３）１当量に対して。

１当量以上で反応を完結させるに充分な量、通常は１５
当量のアルキルチオクロロアルコキシホスフィン（２）
を、ピリジン溶媒中で１５〜２５℃、３〜ｌＯ分間反応
を行ったのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに
より処理して、ヌクレオシドの３′−位水酸基をリン酸
化したホスホロチオイツト（１）が得られる。また、こ
の反応に用いる亜リン酸化試薬であるアルキルチオクロ
ロアルコキシホスフィンは下記の反応式（ｆｆ）反応式
（ＩＶ） （反応式ＣＩＶ）において、ｌおよびａＳは前記と同一
の意味を表わす） で示されるように、アルキルホスホロジクロリダイトと
アルカンチオールとを、ピリジンの存在下にヘキサン中
で反応させたのち、ピリジウム塩を除去し、蒸留するこ
とにより得られるものである。なお、ヌクレオシドホス
ホロチオイツト（１）および（アルキルチオ）クロロア
ルコキシホスフィン（２）において　ａｔのリン酸保護
基となり得る基としては、置換基を有することもあるア
ルキル基またはアリール基であり、メチル基、エチル基
、プロピル基、ブチル基、フェニル基、キシリル基など
が例示され、Ｒは置換基を有することもあるアルキル基
であり、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基な
どが例示される。

本発明は更にヌクレオシドホスホロチオイツト（１）を
用いたオリゴヌクレオチドの製法に関するものである。

すなわち下記の反応式〔Ｖ）反応式（Ｖ） （１）　　　　　　（４）　　　　　　　（Ｓ）（反応
式〔ｖ〕ニオイテ、Ｂ　、　Ｒ”　、　Ｒ”　、　Ｒ”
オヨ’ＣＪＲは前記と同一の意味を表わす） で示されるように、ヌクレオシドホスホロチオイツト（
１）を混合溶媒例えばジクロロメタン／ルチジン／トリ
エチルアミン中でヨウ素により活性化したのち、ひきつ
づき３′−位水酸基をベンゾイル基やアセチル基の如き
保護基により保護したヌクレオシド（４）を反応させる
ことにより容易に縮合と酸化とを同時に行い、目的とす
るインターヌクレオチド結合を形成して一般式（５）（
式中、Ｂ　、　Ｒ’　、　Ｒ”およびＲ４Ｆｉ前記と同
一の意味を表わ−ｆ） で示されるジヌクレオチド（５）が得られる。この除用
いる混合溶媒は塩基残基の種類などにより変動するので
上記に限定されるものではな〜・。

本発明の縮合および酸化反応に通常は１５〜２５℃で進
行し、１〜５分間という短時間で完了するが、塩基残基
のａ類などにより多少変動するのでこれらに限定される
ものではない。反応終了後はカラムクロットゲラフィー
などの操作により単離精製することができる。更にまた
、より長鎖のオリゴヌクレオチドを製造する場合は、ジ
ヌクレオチド（５）を１％トリフルオロ酢酸／クロロホ
ルム中で処理して５′−位水酸基の保楯基例えばジメト
キシトリチル基を脱離させたのち、これにヌクレオシド
ホスホロチオイツト（１）を反応させてトリヌクレオチ
ドが得られるので、これらの操作を操り返すことにより
、目的とするオリゴヌクレオチドを得る。

本発明におけるヌクレオシドホスホロデオイツ）　（１
、ヌクレオシド（３）および（４）の塩基残基中のアミ
ノ基やイミノ基は保護基により保護することが必要であ
り、通常はアシル基が保護基として用いられる。これら
の保護基（アクル基）は酸性（８０チ酢酸およびｌチド
リフルオロ酢酸／クロロホルム）および中性条件下では
安定であるが、室温でトリエチルアミン／水／ピリジン
（２／１／２．Ｖ／Ｖ／Ｖ）で処理すると徐々に脱離し
、室温で１時間濃アンモニア水で処理すると完全に脱離
する。

（発明の効果） 本発明のヌクレオシドホスホロチオイツトは新規なヌク
レオチド誘導体であり、オリゴヌクレオチドを製造する
際ヌクレオシドホスホ−チオイツトを用いることにより
、インターヌクレオチド結合を迅速かつ定量的に進行さ
せるとともに、縮合とν化の両反応を同時に行うという
効果がある。

本発明で得られるオリゴヌクレオチドは遺伝子工学罠お
ける重要な素材として有用な化合物である。

以下、実施例および実験例により説明する。

（実施例および実験例） 実験例１ （エチルチオ）クロ、ロメトキシホスフインのメチルホ
スホロジクロリダイト１１．０当量とエタンチオール２
１．０肖量とにトリ−）７１．０当量を加え、ヘキサン
中Ｏ℃で６０分間反応した。反応終了後生成したピリジ
ニウム塩を除去し、次いで蒸留することにより沸点１２
２〜１２３℃／３４ｗｘＨ９の留分のエチルチオクロル
メトキシホスフィン３を収率４２チで得た。

実験例２〜４ 実験例１のエタンチオール２の代りに、第１表記載のフ
ルカンチオールを用いたほかは実験例１と同様に操作し
て、原料のアルカンチオールに対応する（アルキルチオ
）クロロメトキシホスフィンを得た。収率、沸点を第１
表に示す。

第　　１　　表 実検例５ ５′−〇−ジメトキシトリチルー３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミジンの合、成 （上記の反応式において、Ｔｈはチミンを、Ｔｈは３−
Ｎ−ベンゾイルチミンを、Ｔ！ｙｌｓはトリメチルシリ
ル基を、　ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を表わす） ピリジン溶媒中でジイソプロピルエチルアミン５．０当
量の存在下に、チミジン４１．９白愈とトリメチルシリ
ルクロリド２５当分とを２０℃で６０分間処理して３′
−および５′−水酸基をトリメチルシリル化（５）シた
のち、塩化ベンゾイル１．５当量を加え６０分間攪拌し
てチミンのイミノ基をベンゾイル化（６）シ、さらに脱
トリメチルシリル化して３−Ｎ−ベンゾイルチミジン７
を得た。次いで３−Ｎ−ベンゾイルチミジン７の５′−
位水酸基をジメトキシトリチルクロリド１．１当量を用
いてトリチル化し、５’−０−ジメトキシトリチル−３
−Ｎ−ベンゾイルチミジン乏を収率８９チ（対チミジン
４）で得た。

実施例１ ヌクレオシドホスホロチオイツトの合成（以下余白） ９′ （上記の反応式において、ｔａｒｔ　Ｂｕはターシャリ
−ブチル基を、Ｔｈ　およびＤＭＴｒは前記と同一の意
味を表わす） 実験例５で得たｓ’−〇−ジメトキシトリチルー３−Ｎ
−ベンゾイルチミジン８１当量と実験例４で得たターシ
ャリ−ブチルチオクロロメトキシホスフィン３’１．５
当量を、ピリジン溶媒中２０℃で１０分間反応させる。

反応終了後ジクロロメタン／水で抽出し、抽出溶媒を留
去した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｉ
ａニジクロヘキサン／ジクロフメタン／ピリジン＝４／
４／２）で単離して５′−〇−ジメトキシトリチルー３
−Ｎ−ペンゾイ−ルデミジン−３’−０−（３−ターシ
ャリ−ブチルチオ）メチルホスホロチオイツト９′を収
率７３％（対５′−〇−ジメトキシトリチル−３−Ｎ−
ベンゾイルチミジン）で得、’、Ｈ−ＮＭＲおまび”　
Ｐ　−ＮＭＲ（第一１図）により同定した。

”Ｐ　−ＮＭＲｌ　３９−１２　ｐｐ＝ｎ実施例２〜４ 実施例１のターシャリ−ブチルチオクロロメトキシホス
フィン３′の代りに、第２表記載の（アルキルチオ）ク
ロロメトキシホスフィンを用いたほかは、実施例１と同
様に操作して、原料の（アルキルチオ）クロロメトキシ
ホスフィンに対応するヌクレオシドホスホロチオイツト
を第２表記載の収率で得、Ｈ−ＮΔＳＲお：び”Ｐ−Ｎ
ＭＲにより同定した。

（以下余白） 第　　２　　表 実施例５ ジヌクレオチドの合成 （上記の反応式において、Ｂｚはベンゾイル基を、Ｔｈ
　、　Ｔｈ　　、　ｔ＠ｒｔ　ＢｘおよびＤＭＴｒは前
記と同一の意味を表わす） 実施例１で得たｓ’−ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｎ
−ベンゾイルチミジン−３’−〇−（Ｓ−ターシャリ−
ジチルチオ）メチルホスホロチオイツト９′　Ｌ５当量
、３．３’−Ｎ、０−ジベンゾイルチミジン１０ＬＯ当
量およびヨウ素ｌＯ肖量とを、ジクロロメタン／ルチジ
ン／トリエチルアミン＝　８　／　１　／　１　（Ｖ／
Ｖ／Ｖ　）中で２分間反応したのち、ジクロロメタン／
水により抽出する。抽出溶媒を留去後、残渣をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（溶媒ニジクロロメタン／
メタノール＝９９／１（Ｖ／Ｖ））で単離して、保護基
により保護されたジヌクレオチド１１を収率８Ｇ％で単
離した。次にこのジヌクレオチド１１を、チオフェノー
ル／トリエチルアミン／ジオキサｙ＝１／１／２（Ｖ／
Ｖ／Ｖ）で１時間処理し、次いで濃アンモニア水で２４
時間、更に８０チ酢酸で３０分間処理して、核酸塩基部
、５′−位水酸基、リン酸基の保護基を除去したジヌク
レオチド１２をペーノ臂−クロマトグラフイーにより単
離し、７１％の収率で得た。ジヌクレオチド１２のＨＰ
ＬＣ、（ターンを第２図に示す。また、このジヌクレオ
チド１２をスネークペノムホスホジエステラーゼにより
分解し、液体クロマトグラフィーにより、ジヌクレオチ
ド１２がｐＴ：Ｔ＝１：１であることを同定した（第３
図）。

（Ｔはチミジンを、ｐＴはチミジン−５′−モノホスフ
ェートを表わす）

【図面の簡単な説明】

第１図は次のホスホロチオイツトのＰ　−ＮＭＲスペク
トルを示す。 第２図は次のジヌクレオチド（ＴｐＴ　）のＨＰＬＣノ
ターンを示す。 第３図はジヌクレオチド（ＴｐＴ　）　　の９素分解後
のＨＰＬＣ，４ターンを示す。 特許出願人　有機合成薬品工業株式会社−７−・ｉ′に
コ 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼（１） （式中、Ｂは保護基を有することもある核酸塩基残基を
   、Ｒ＾１は水酸基の保護基を、Ｒ＾２はリン酸保護基と
   なり得る基を、Ｒ＾３は置換基を有することもあるアル
   キル基を表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツト。 ２、５′−位水酸基を保護したヌクレオシドに一般式（
   ２） ▲数式、化学式、表等があります▼（２） （式中、Ｒ＾２はリン酸保護基となり得る基を、Ｒ＾３
   は置換基を有することもあるアルキル基を表わす） で示されるアルキルチオクロロアルコキシホスフィンを
   反応させることを特徴とする一般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼（１） （式中、Ｂは保護基を有することもある核酸塩基残基を
   、Ｒ＾１は水酸基の保護基を、Ｒ＾２はリン酸保護基と
   なり得る基を、Ｒ＾３は置換基を有することもあるアル
   キル基を表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトの合成法。 ３、一般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼（１） （式中、Ｂは保護基を有することもある核酸塩基残基を
   、Ｒ＾１は水酸基の保護基を、Ｒ＾２はリン酸保護基と
   なり得る基を、Ｒ＾３は置換基を有することもあるアル
   キル基を表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトとヌクレオ
   シドまたはヌクレオチド誘導体とを反応させることを特
   徴とするオリゴヌクレオチドの製法。