JPH0613548B2 - ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオリゴヌクレオチドの固相合成法 - Google Patents
ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオリゴヌクレオチドの固相合成法Info
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- JPH0613548B2 JPH0613548B2 JP61208458A JP20845886A JPH0613548B2 JP H0613548 B2 JPH0613548 B2 JP H0613548B2 JP 61208458 A JP61208458 A JP 61208458A JP 20845886 A JP20845886 A JP 20845886A JP H0613548 B2 JPH0613548 B2 JP H0613548B2
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般式（１） （式中、Ｂは保護基としてアシル基を有することもある
核酸塩基残基を、Ｒ１はアルコキシ基を有することもあ
るトリチル基よりなる水酸基用保護基を、Ｒ２はアルキ
ル基又はアリール基よりなるリン酸基用保護基を、Ｒ３
はアルキル基を、それぞれ表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオ
リゴヌクレオチドの固相合成法に関するものである。
核酸塩基残基を、Ｒ１はアルコキシ基を有することもあ
るトリチル基よりなる水酸基用保護基を、Ｒ２はアルキ
ル基又はアリール基よりなるリン酸基用保護基を、Ｒ３
はアルキル基を、それぞれ表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオ
リゴヌクレオチドの固相合成法に関するものである。
（従来の技術） 近年遺伝子工学の進歩とともに、遺伝子の化学的基礎物
質である任意の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの
有機化学的合成法はより重要となってきている。オリゴ
ヌクレオチドの有機化学的合成法としては液相合成法と
固相合成法の二つの方法が提案されており、固相法は液
相法に比較すると合成時間が短い、縮合に要する試薬類
や原料保護ヌクレオシドの量が少なくてよい等の利点を
有し、広く用いられている。一般に固相合成法はポリス
チレン樹脂またはシリカゲルなどを担体とし、コハク酸
などのスペーサーを介して結合させたヌクレオシドの
５′−位水酸基と、５′−位水酸基を保護した保護ヌク
レオチドの３′−位水酸基とを縮合させてジヌクレオチ
ドとしたのち、ジヌクレオチドの５′−位水酸基保護基
を脱保護し、この５′−位水酸基に目的とする塩基配列
に従って順次保護ヌクレオチドを縮合させて目的とする
オリゴヌクレオチドを得るものである。この固相合成法
として現在繁用されているものにカルーザス（Caruther
s）らによるホスホロアミダイト法が知られている。
質である任意の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの
有機化学的合成法はより重要となってきている。オリゴ
ヌクレオチドの有機化学的合成法としては液相合成法と
固相合成法の二つの方法が提案されており、固相法は液
相法に比較すると合成時間が短い、縮合に要する試薬類
や原料保護ヌクレオシドの量が少なくてよい等の利点を
有し、広く用いられている。一般に固相合成法はポリス
チレン樹脂またはシリカゲルなどを担体とし、コハク酸
などのスペーサーを介して結合させたヌクレオシドの
５′−位水酸基と、５′−位水酸基を保護した保護ヌク
レオチドの３′−位水酸基とを縮合させてジヌクレオチ
ドとしたのち、ジヌクレオチドの５′−位水酸基保護基
を脱保護し、この５′−位水酸基に目的とする塩基配列
に従って順次保護ヌクレオチドを縮合させて目的とする
オリゴヌクレオチドを得るものである。この固相合成法
として現在繁用されているものにカルーザス（Caruther
s）らによるホスホロアミダイト法が知られている。
（発明が解決しようとする問題点） ホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの合成
は、縮合工程のあと更に酸化工程を必要とし、工業上煩
雑であるという欠点を有している。
は、縮合工程のあと更に酸化工程を必要とし、工業上煩
雑であるという欠点を有している。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らはこれらの問題点を改良したオリゴヌクレオ
チドの固相合成法を得るべく検討を加えた結果、下記の
反応式〔１〕 反応式〔１〕 （反応式〔１〕において、−は固相合成用担体を、 はスペーサ残基を、Ｂ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は前記と
同一の意味を表わす） に示されるように、担体とスペーサーを介して結合した
ヌクレオシドと縮合させる保護ヌクレオチドとして、一
般式(1) （式中、Ｂ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は前記と同一の意味
を表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトがすぐれた
縮合能力を有するとともに、縮合反応と酸化反応を同時
に行うことができることを見い出し本発明を完成したも
のである。すなわち、本発明はホスホロチオイツトのリ
ン酸修飾基であるアルキルチオ基と、ヌクレオシドまた
はヌクレオチド誘導体の５′−位水酸基とでインターヌ
クレオチド結合を形成させることからなるオリゴヌクレ
オチドの改良された固相合成法である。
チドの固相合成法を得るべく検討を加えた結果、下記の
反応式〔１〕 反応式〔１〕 （反応式〔１〕において、−は固相合成用担体を、 はスペーサ残基を、Ｂ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は前記と
同一の意味を表わす） に示されるように、担体とスペーサーを介して結合した
ヌクレオシドと縮合させる保護ヌクレオチドとして、一
般式(1) （式中、Ｂ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は前記と同一の意味
を表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトがすぐれた
縮合能力を有するとともに、縮合反応と酸化反応を同時
に行うことができることを見い出し本発明を完成したも
のである。すなわち、本発明はホスホロチオイツトのリ
ン酸修飾基であるアルキルチオ基と、ヌクレオシドまた
はヌクレオチド誘導体の５′−位水酸基とでインターヌ
クレオチド結合を形成させることからなるオリゴヌクレ
オチドの改良された固相合成法である。
前記の反応式（１）において、水酸基保護基Ｒ１は、脱
保護反応のさい選択的に脱離する保護基であり、代表的
な基としてはトリチル基、メトキシトリチル基、ジメト
キシトリチル基などのアルコキシ基を有することもある
トリチル基のほか、ｔｅｒｔ−ブチルメチルシリル基な
どが挙げられ、Ｒ２としては、アルキル基またはアリー
ル基よりなるリン酸基用保護基であり、たとえば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、フェニル基、
キシリル基などで代表される。Ｒ３はアルキル基であ
り、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基などが
例示される（いずれも異性構造を含む）。また、Ｂは保
護基を有することもある核酸塩基残基、すなわちチミ
ン、シトシン、グアニン、アデニンを示す。核酸塩基残
基中のアミノ基やイミノ基は保護基により保護すること
が必要であり、保護基としては通常ベンゾイル基で代表
されるアシル基が用いられる。さらに、−で示した固
相合成用担体は通常のオリゴヌクレオチドの固相合成法
において用いられるものであればよく、アクリルアミド
系担体、ポリスチレン系担体、セルロース系担体、シリ
カゲル担体等が例示される。スペーサーとしては、通常
は二塩基酸たとえばコハク酸、グルタル酸、アジピン酸
が用いられるが、特にコハク酸が好ましい。これらの各
保護基、担体、スペーサーは、通常のオリゴヌクレオチ
ドの固相合成法に用いられるものであれば使用すること
ができ、上記の例示化合物に限定されるものではない。
保護反応のさい選択的に脱離する保護基であり、代表的
な基としてはトリチル基、メトキシトリチル基、ジメト
キシトリチル基などのアルコキシ基を有することもある
トリチル基のほか、ｔｅｒｔ−ブチルメチルシリル基な
どが挙げられ、Ｒ２としては、アルキル基またはアリー
ル基よりなるリン酸基用保護基であり、たとえば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、フェニル基、
キシリル基などで代表される。Ｒ３はアルキル基であ
り、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基などが
例示される（いずれも異性構造を含む）。また、Ｂは保
護基を有することもある核酸塩基残基、すなわちチミ
ン、シトシン、グアニン、アデニンを示す。核酸塩基残
基中のアミノ基やイミノ基は保護基により保護すること
が必要であり、保護基としては通常ベンゾイル基で代表
されるアシル基が用いられる。さらに、−で示した固
相合成用担体は通常のオリゴヌクレオチドの固相合成法
において用いられるものであればよく、アクリルアミド
系担体、ポリスチレン系担体、セルロース系担体、シリ
カゲル担体等が例示される。スペーサーとしては、通常
は二塩基酸たとえばコハク酸、グルタル酸、アジピン酸
が用いられるが、特にコハク酸が好ましい。これらの各
保護基、担体、スペーサーは、通常のオリゴヌクレオチ
ドの固相合成法に用いられるものであれば使用すること
ができ、上記の例示化合物に限定されるものではない。
本発明において用いるヌクレオシドホスホロチオイツト
の製造法は、下記の反応式〔II〕 反応式〔II〕 （反応式〔II〕において、Ｒ２およびＲ３は前記と同一
の意味を表わす） で示されるように、アルキルホスホロジクロリダイト
(4)とアルアンチオール(5)とを、ピリジンの存在下にヘ
キサン中で反応させて得られる亜リン酸化試薬（６）た
とえばアルキルチオクロロアルコキシホスフィンを、下
記の反応式〔III〕 反応式〔III〕 （反応式〔III〕において、Ｂ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３
は前記と同一の意味を表わす） に示すように、５′位水酸基を保護したヌクレオシド
(7)とピリジン中で反応させ、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーにより処理してヌクレオシドホスホロチオ
イツト(1)とするものである。
の製造法は、下記の反応式〔II〕 反応式〔II〕 （反応式〔II〕において、Ｒ２およびＲ３は前記と同一
の意味を表わす） で示されるように、アルキルホスホロジクロリダイト
(4)とアルアンチオール(5)とを、ピリジンの存在下にヘ
キサン中で反応させて得られる亜リン酸化試薬（６）た
とえばアルキルチオクロロアルコキシホスフィンを、下
記の反応式〔III〕 反応式〔III〕 （反応式〔III〕において、Ｂ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３
は前記と同一の意味を表わす） に示すように、５′位水酸基を保護したヌクレオシド
(7)とピリジン中で反応させ、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーにより処理してヌクレオシドホスホロチオ
イツト(1)とするものである。
本発明のヌクレオシドホスホロチオイツト(1)を用いた
オリゴヌクレオチドの固相合成法は好ましくは以下のよ
うに実施される。すなわち、アクリルアミド系担体、ポ
リスチレン系担体、セルロース系担体、シリカゲル担体
などの固相合成用担体に、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸などのスペーサーを介して結合させたヌクレオシ
ド(2)１当量に５〜２０当量のヌクレオシドホスホロチ
オイツト(1)と５０〜１００当量のヨウ素とを混合溶媒
例えばジクロロメタン／ルチジン／トリエチルアミン中
で反応を行ったのちルチジン水溶液を加え、担体に結合
したヌクレオシド(2)の５′−位水酸基とヌクレオシド
ホスホロチオイツト(1)のリン酸修飾基であるアルキル
チオ基としてインターヌクレオチド結合を形成させて担
体に結合したジヌクレオチド(3)を得る。次いで無水酢
酸／ピリジン中触媒量のジメチルアミノピリジンの存在
下に未反応の５′−位水酸基のアセチル化を行ったの
ち、１％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタンで処理して
担体に結合したジヌクレオチドの５′−水酸基保護基を
除去し、これにヌクレオシドホスホロチオイツト(1)を
縮合させるという操作を繰り返すことにより、所望する
塩基配列を有する一般式(8) （式中、ｎは任意の整数を、Ｂ，Ｒ１，Ｒ２および
Ｒ３，−および は前記と同一の意味を表わす） で示される担体に結合したオリゴヌクレオチドを得るこ
とができる。この担体に結合したオリゴヌクレオチド
(8)はさらに常法に従ってリン酸基の保護基Ｒ２の除
去、担体との切断、塩基残基の保護基の除去、５′−位
水酸基の保護基の除去を順次行ったのちクロマトグラフ
ィー等により精製することにより一般式(9) （式中、Ｂ′は核酸塩基残基を、ｎは前記と同一の意味
を表わす） で示されるオリゴヌクレオチドが得られる。
オリゴヌクレオチドの固相合成法は好ましくは以下のよ
うに実施される。すなわち、アクリルアミド系担体、ポ
リスチレン系担体、セルロース系担体、シリカゲル担体
などの固相合成用担体に、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸などのスペーサーを介して結合させたヌクレオシ
ド(2)１当量に５〜２０当量のヌクレオシドホスホロチ
オイツト(1)と５０〜１００当量のヨウ素とを混合溶媒
例えばジクロロメタン／ルチジン／トリエチルアミン中
で反応を行ったのちルチジン水溶液を加え、担体に結合
したヌクレオシド(2)の５′−位水酸基とヌクレオシド
ホスホロチオイツト(1)のリン酸修飾基であるアルキル
チオ基としてインターヌクレオチド結合を形成させて担
体に結合したジヌクレオチド(3)を得る。次いで無水酢
酸／ピリジン中触媒量のジメチルアミノピリジンの存在
下に未反応の５′−位水酸基のアセチル化を行ったの
ち、１％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタンで処理して
担体に結合したジヌクレオチドの５′−水酸基保護基を
除去し、これにヌクレオシドホスホロチオイツト(1)を
縮合させるという操作を繰り返すことにより、所望する
塩基配列を有する一般式(8) （式中、ｎは任意の整数を、Ｂ，Ｒ１，Ｒ２および
Ｒ３，−および は前記と同一の意味を表わす） で示される担体に結合したオリゴヌクレオチドを得るこ
とができる。この担体に結合したオリゴヌクレオチド
(8)はさらに常法に従ってリン酸基の保護基Ｒ２の除
去、担体との切断、塩基残基の保護基の除去、５′−位
水酸基の保護基の除去を順次行ったのちクロマトグラフ
ィー等により精製することにより一般式(9) （式中、Ｂ′は核酸塩基残基を、ｎは前記と同一の意味
を表わす） で示されるオリゴヌクレオチドが得られる。
なお、本発明の固相合成法においては、前記の如く所望
の核酸塩基を有するヌクレオシドホスホロチオイツトを
順次縮合させる手法のほか、あらかじめ合成したジヌク
レオチドホスホロチオイツトブロックまたはトリヌクレ
オチドホスホロチオイツトブロックなどのヌクレオシド
ホスホロチオイツトブロックを用いて縮合させることも
可能である。
の核酸塩基を有するヌクレオシドホスホロチオイツトを
順次縮合させる手法のほか、あらかじめ合成したジヌク
レオチドホスホロチオイツトブロックまたはトリヌクレ
オチドホスホロチオイツトブロックなどのヌクレオシド
ホスホロチオイツトブロックを用いて縮合させることも
可能である。
（発明の効果） 本発明は固相合成法によるオリゴヌクレオチドを合成す
る際に、ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いること
により、インターヌクレオチド結合を迅速かつ定量的に
進行させるとともに、縮合と酸化の両反応を同時に行う
という効果がある。
る際に、ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いること
により、インターヌクレオチド結合を迅速かつ定量的に
進行させるとともに、縮合と酸化の両反応を同時に行う
という効果がある。
本発明で得られるオリゴヌクレオチドは遺伝子工学にお
ける重要な素材として有用な化合物である。
ける重要な素材として有用な化合物である。
以下、実施例および実験例により説明する。
（実施例および実験例） 実験例１ ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミジン−３′−Ｏ−（Ｓ−ターシャリーブチルチオ）メ
チルホスホロチオイツトの合成 （上記の反応式において、Thbzは３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミンを、DMTrはジメトキシトリチル基を、tertBuはター
シャリーブチル基を表わす） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミジン１１当量と（ターシャリーブチルチオ）クロロメ
トキシホスフィン２１．５当量とを、ピリジン溶媒中２
０℃で１０分間反応させる。反応終了後ジクロロメタン
／水で抽出する。抽出溶媒を留去後、少量のベンゼンに
溶解し、ヘキサン中に徐々に滴下する再沈殿により、
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミジン−３′−Ｏ−（Ｓ−ターシャリーブチルチオ）メ
チルホスホロチオイツト３（以下、チオイツトユニット
Ｔという）を収率８６％で得１Ｈ−ＮＭＲおよび３１Ｐ
−ＮＭＲ（第１図）により同定した。
ミジン−３′−Ｏ−（Ｓ−ターシャリーブチルチオ）メ
チルホスホロチオイツトの合成 （上記の反応式において、Thbzは３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミンを、DMTrはジメトキシトリチル基を、tertBuはター
シャリーブチル基を表わす） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミジン１１当量と（ターシャリーブチルチオ）クロロメ
トキシホスフィン２１．５当量とを、ピリジン溶媒中２
０℃で１０分間反応させる。反応終了後ジクロロメタン
／水で抽出する。抽出溶媒を留去後、少量のベンゼンに
溶解し、ヘキサン中に徐々に滴下する再沈殿により、
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミジン−３′−Ｏ−（Ｓ−ターシャリーブチルチオ）メ
チルホスホロチオイツト３（以下、チオイツトユニット
Ｔという）を収率８６％で得１Ｈ−ＮＭＲおよび３１Ｐ
−ＮＭＲ（第１図）により同定した。
３１Ｐ−ＮＭＲ 139.12ppm 実験例２〜４ 保護基を有する核酸塩基として実験例１の３−Ｎ−ベン
ゾイルチミン（略称Thbz）の代りに２−Ｎ−プロピオニ
ル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイルグアニン ４−Ｎ−アニソイルシトシン（略称Cyan）または６−Ｎ
−ベンゾイルアデニン（略称Adbz）であるヌクレオシド
を用い、実験例１と同様に反応、単離を行い、原料ヌク
レオシドに対応するホスホロチオイツトを第１表記載の
収率で得、１Ｈ−ＮＭＲおよび３１Ｐ−ＮＭＲにより同
定した。
ゾイルチミン（略称Thbz）の代りに２−Ｎ−プロピオニ
ル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイルグアニン ４−Ｎ−アニソイルシトシン（略称Cyan）または６−Ｎ
−ベンゾイルアデニン（略称Adbz）であるヌクレオシド
を用い、実験例１と同様に反応、単離を行い、原料ヌク
レオシドに対応するホスホロチオイツトを第１表記載の
収率で得、１Ｈ−ＮＭＲおよび３１Ｐ−ＮＭＲにより同
定した。
実施例１ （上記の反応式においてはポリスチレン樹脂を、Thbz
およびＤＭＴｒは前記と同一の意味を表わす） ポリスチレン樹脂８（１％ジビニルベンゼン架橋、２１
０μmol/g）と５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−
Ｏ−サクシニル−３−Ｎ−ベンゾイルチミジン７１当量
とを、トリエチルアミン２当量、４−ジメチルアミノピ
リジン０．２当量の存在下、ジシクロヘキシルカルボジ
イミド２当量を用い、ジメチルホルムアミド中で８時間
反応させる。反応終了後、過剰の試薬と溶媒を過によ
り除き、更に0.05Ｍジメチルアミノピリジンの無水酢酸
／ピリジン＝１／９（Ｖ／Ｖ）溶液を用いて１時間反応
して、未反応のアミノ基をアセチル化して、ポリスチレ
ン樹脂と３−Ｎ−ベンゾイルチミジンとの縮合物９を得
た。
およびＤＭＴｒは前記と同一の意味を表わす） ポリスチレン樹脂８（１％ジビニルベンゼン架橋、２１
０μmol/g）と５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−
Ｏ−サクシニル−３−Ｎ−ベンゾイルチミジン７１当量
とを、トリエチルアミン２当量、４−ジメチルアミノピ
リジン０．２当量の存在下、ジシクロヘキシルカルボジ
イミド２当量を用い、ジメチルホルムアミド中で８時間
反応させる。反応終了後、過剰の試薬と溶媒を過によ
り除き、更に0.05Ｍジメチルアミノピリジンの無水酢酸
／ピリジン＝１／９（Ｖ／Ｖ）溶液を用いて１時間反応
して、未反応のアミノ基をアセチル化して、ポリスチレ
ン樹脂と３−Ｎ−ベンゾイルチミジンとの縮合物９を得
た。
次にこの９の１部をとり、１％トリフルオロ酢酸で３分
間処理して５′−位水酸基の保護基であるジメトキシト
リチル基を除去したのち過して得た液を過塩素酸／
エタール＝３／２（Ｖ／Ｖ）溶液に溶かしジメトキシト
リチルカルチオンにとよる比色定量を行った結果、担持
量は４２μmol/gであった。
間処理して５′−位水酸基の保護基であるジメトキシト
リチル基を除去したのち過して得た液を過塩素酸／
エタール＝３／２（Ｖ／Ｖ）溶液に溶かしジメトキシト
リチルカルチオンにとよる比色定量を行った結果、担持
量は４２μmol/gであった。
次にこのポリスチレン樹脂と３−Ｎ−ベンゾイルチミ
ジンとの縮合物９を、ｉ１％トリフルオロ酢酸で３分間
処理して５′−位水酸基の保護基であるジメトキシトリ
チル基を除去したのち、iiクロロホルムによる洗浄、ii
iジクロロメタン／２，６−ルチジン／トリエチルアミ
ン＝８／１／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）による洗浄後、iv実験例
１で得たチオイットユニットＴ３10当量とヨウ素５０当
量とを、ジクロロメタン／２，６−ルチジン／トリエチ
ルアミン＝８／１／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）中で１０分間縮合
反応させる。縮合終了後、v少量の水を含んだ２，６−
ルチジンにより洗浄し、次いでvi０．０５Ｍジメチルア
ミノピリジンの無水酢酸／ピリジン＝９／１（Ｖ／Ｖ）
溶液で３分間反応してアセチル化し、viiピリジンによ
る洗浄、viiiクロロホルムによる洗浄、という一連の操
作を３回繰り返すことで、下式のようなポリスチレン樹
脂と縮合したテトラマー１０を得た。
ジンとの縮合物９を、ｉ１％トリフルオロ酢酸で３分間
処理して５′−位水酸基の保護基であるジメトキシトリ
チル基を除去したのち、iiクロロホルムによる洗浄、ii
iジクロロメタン／２，６−ルチジン／トリエチルアミ
ン＝８／１／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）による洗浄後、iv実験例
１で得たチオイットユニットＴ３10当量とヨウ素５０当
量とを、ジクロロメタン／２，６−ルチジン／トリエチ
ルアミン＝８／１／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）中で１０分間縮合
反応させる。縮合終了後、v少量の水を含んだ２，６−
ルチジンにより洗浄し、次いでvi０．０５Ｍジメチルア
ミノピリジンの無水酢酸／ピリジン＝９／１（Ｖ／Ｖ）
溶液で３分間反応してアセチル化し、viiピリジンによ
る洗浄、viiiクロロホルムによる洗浄、という一連の操
作を３回繰り返すことで、下式のようなポリスチレン樹
脂と縮合したテトラマー１０を得た。
（式中、Thbz，ＤＭＴｒおよびは前記と同一の意味を
表わす） 上記のの工程で得たポリスチレン樹脂と縮合したテ
トラマー１０を、ｉチオフェノール／トリエチルアミン
／ジオキサン＝１／１／２（Ｖ／Ｖ／Ｖ）中で９０分処
理してリン酸基の保護基であるメチル基を除去し、ii濃
アンモニア水で２４時間処理してポリスチレン樹脂とテ
トラマーとの切断およびチミンの保護基であるベンゾイ
ル基の除去後、iiiポリスチレン樹脂を過により除いた
のち液を逆層液体クロマトグラフィーにより精製す
る。iv次に８０％酢酸で３０分間処理して５′−位水酸
基の保護基であるジメトキシトリチル基を除去し、ｖ逆
層液体クロマトグラフィーにより精製・単離して、次式
のテトラマー１１を得た（第２図）。
表わす） 上記のの工程で得たポリスチレン樹脂と縮合したテ
トラマー１０を、ｉチオフェノール／トリエチルアミン
／ジオキサン＝１／１／２（Ｖ／Ｖ／Ｖ）中で９０分処
理してリン酸基の保護基であるメチル基を除去し、ii濃
アンモニア水で２４時間処理してポリスチレン樹脂とテ
トラマーとの切断およびチミンの保護基であるベンゾイ
ル基の除去後、iiiポリスチレン樹脂を過により除いた
のち液を逆層液体クロマトグラフィーにより精製す
る。iv次に８０％酢酸で３０分間処理して５′−位水酸
基の保護基であるジメトキシトリチル基を除去し、ｖ逆
層液体クロマトグラフィーにより精製・単離して、次式
のテトラマー１１を得た（第２図）。
（式中、Ｔｈはチミンを表わす） このテトラマー１１をスネークベノムホスホジエステ
ラーゼにより分解し、液体クロマトグラフィーによりテ
トラマー１１がpT：Ｔ＝３：１であることを同定した
（第３図）。
ラーゼにより分解し、液体クロマトグラフィーによりテ
トラマー１１がpT：Ｔ＝３：１であることを同定した
（第３図）。
（Ｔはチミジンを、pTはチミジン−５′−モノホスフェ
ートを表わす） 実施例２ 実施例１ので得たポリスチレン樹脂と３−Ｎ−ベンゾ
イルチミジンとの縮合物９に、実験例４で得たチオイッ
トユニットＡ６を、実施例１のｉ〜viiiの一連の操作
を縮合させたのち、同様の操作により、実験例３で得た
チオイットユニットＣ５、実験例２で得たチオイットユ
ニットＧ４を順次縮合させたのち、実施例１のの操作
（ただし−iiの濃アンモニア水処理は４８時間）を行
って次式のテトラマー１２を得た（第４図）。
ートを表わす） 実施例２ 実施例１ので得たポリスチレン樹脂と３−Ｎ−ベンゾ
イルチミジンとの縮合物９に、実験例４で得たチオイッ
トユニットＡ６を、実施例１のｉ〜viiiの一連の操作
を縮合させたのち、同様の操作により、実験例３で得た
チオイットユニットＣ５、実験例２で得たチオイットユ
ニットＧ４を順次縮合させたのち、実施例１のの操作
（ただし−iiの濃アンモニア水処理は４８時間）を行
って次式のテトラマー１２を得た（第４図）。
（式中、Guはグアニンを、Cyはシトシンを、Adはアデニ
ンを、Thはチミンを表わす） 次にこのテトラマー１２を実験例１のと同様に酵素分
解し、液体クロマトグラフィーにより、テトラマー１２
がＧ：pC：pA：pT＝１：１：１：１であることを同定し
た（第５図）。
ンを、Thはチミンを表わす） 次にこのテトラマー１２を実験例１のと同様に酵素分
解し、液体クロマトグラフィーにより、テトラマー１２
がＧ：pC：pA：pT＝１：１：１：１であることを同定し
た（第５図）。
（Ｇは２′−デオキシグラノシンを、pCは２′−デオキ
シシチジン−５′−モノホスフエートを、pAは２′−デ
オキシアデノシン−５′−モノホスフエートを、pTはチ
ミジン−５′−モノホスフエートを表わす）
シシチジン−５′−モノホスフエートを、pAは２′−デ
オキシアデノシン−５′−モノホスフエートを、pTはチ
ミジン−５′−モノホスフエートを表わす）
【図面の簡単な説明】 第１図は次のホスホロチオイツトの３１Ｐ−ＮＭＲスペ
クトルを示す。 第２図は次のテトラマー（TpTpTpT）のHPLCパターンを
示す。 第３図はテトラマー（TpTpTpT）の酵素分解後のHPLCパ
ターンを示す。 第４図は次のテトラマー（GpCpApT）のHPLCパターンを
示す。 第５図はテトラマー（GpCpApT）の酵素分解後のHPLCパ
ターンを示す。
クトルを示す。 第２図は次のテトラマー（TpTpTpT）のHPLCパターンを
示す。 第３図はテトラマー（TpTpTpT）の酵素分解後のHPLCパ
ターンを示す。 第４図は次のテトラマー（GpCpApT）のHPLCパターンを
示す。 第５図はテトラマー（GpCpApT）の酵素分解後のHPLCパ
ターンを示す。
Claims (1)
- 【請求項１】一般式（１） （式中、Ｂは保護基としてアシル基を有することもある
核酸塩基残基を、Ｒ１はアルコキシ基を有することもあ
るトリチル基よりなる水酸基用保護基を、Ｒ２はアルキ
ル基又はアリール基よりなるリン酸基用保護基を、Ｒ３
はアルキル基を、それぞれ表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトと固相合成
用担体にスペーサーを介して結合したヌクレオシドまた
はヌクレオチド誘導体とを反応させることを特徴とする
オリゴヌクレオチドの固相合成法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61208458A JPH0613548B2 (ja) | 1986-09-04 | 1986-09-04 | ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオリゴヌクレオチドの固相合成法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61208458A JPH0613548B2 (ja) | 1986-09-04 | 1986-09-04 | ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオリゴヌクレオチドの固相合成法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6363695A JPS6363695A (ja) | 1988-03-22 |
| JPH0613548B2 true JPH0613548B2 (ja) | 1994-02-23 |
Family
ID=16556523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61208458A Expired - Lifetime JPH0613548B2 (ja) | 1986-09-04 | 1986-09-04 | ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオリゴヌクレオチドの固相合成法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0613548B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61208457A (ja) * | 1985-03-12 | 1986-09-16 | Yamaha Motor Co Ltd | 熱交換器の着霜検出装置 |
-
1986
- 1986-09-04 JP JP61208458A patent/JPH0613548B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6363695A (ja) | 1988-03-22 |
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