JPS6363695A - ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオリゴヌクレオチドの固相合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般式（１） （式中、Ｂは保護基８有することもある核酸塩基残基を
　Ｒ１は水ｔ２基の保護基を、謬はリン醒保護基となり
得る基を、Ｒ３は置換基を有することもあるアルキル基
そ表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトを用いたオ
リゴヌクレオチドの固相合成法に関するものである。

（従来の技術） 近年遺伝子工学の進歩とともに、遺伝子の化学的基礎物
質である任意の塩基配列−２有するオリゴヌクレオチド
■有機化単的合５．法はより重要となってきている。オ
リゴヌクレオチドの有機化学的合成法としては穎相合厄
法と同相合成法の二つの方法が提案されており、固相法
は液相法に比較すると合成時間か短い、縮合に要する試
薬類や原料保膿ヌクレオシドの量が少なくてよい等の利
点を有し、広く用いられている。一般に面相合成法は２
リスチレン樹脂またはシリカゲルなどそ担体とし、コハ
ク酸などのスペーサ残基介して結合させたヌクレオシド
の５′−位水酸基と、ぎ−位水敏基を保護した保護ヌク
レオチドのｙ−位水酸基とを縮合させてジヌクレオチド
としたのち、ジヌクレオチドのぎ一位水酸基保獲基を脱
保鏝し、このぎ−位水酸基に目的とする塩基配列に従っ
て順次採掘ヌクレオチドを縮合させて目的とするオリゴ
ヌクレオチドを得るものである。こ０固相合放法として
現在繁用されているものにカルーザス（、Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓ）らによるホスホロアミダイト法か知られている
。

（発明が解決しようとする問題点） ホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの合成
は、縮合工程のあと更に酸化工程を必要とし、工業上煩
雑であるという欠点を有している。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはこれらの問題点を改良したオリゴヌクレオ
チドの面相合成法を得るべく検討を加えた結果、下記の
反応式〔１〕 反応式ＣＤ （反応式（１）において、■−は固相合成用担体を、へ
へはスペーサ残基を、Ｂ。

Ｂｌ　、　ＢｌおよびＢａは前記と同一の意味を表わす
） に示されるように、担体とスペーサーを介して結合した
ヌクレオシドと縮合させる保護ヌクレオチドとして、一
般式（１） （式中、Ｂ　、Ｒ’　、Ｒ’オヨヒＲ’ハ前記ト同一の
意味を表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトかすぐれた
縮合能力を有するとともに、縮合反応と酸化反応を同時
に行うことができることを見い出し本発明を完成したも
のである。

すなわち、本発明はホスホロチオイツトのりン識修飾基
であるアルキルチオ基と、ヌクレオシドまたはヌクレオ
チド誘導体のぎ一位水酸基とでインターヌクレオチド結
合を形成させることからなるオリゴヌクレオチドの改良
された面相合成法である。

前記の反応式（１）において、水酸基保護基Ｒ′は、脱
係ｊ反応のざい選択的に脱離する保護基であり、代表的
な基としてはトリチル基、メトキシトリチル基、ジメト
キシトリチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基な
どが挙げられ、Ｒ１のリン酸保護基となり得る基として
は、置換基を有することもあるアルキル基またはアリー
ル基であり、メチル基、エチル基、ブチル基、フェニル
基、キシリル基などで代表される。Ｒａは置換基を有す
ることもあるアルキル基であり、メチル基、エチル基、
プロピル基、ブチル基などが例示される（いずれも異性
構造を含む）。また、Ｂは保護基を有することもある核
酸塩基残基、すなわちチミン、ることか必要であり、保
護基としては通常ベンゾイル基で代表されるアシル基か
用いられる。さらに、トで示した固相合成用担体は通常
のオリゴヌクレオチドの面相合成法において用いられる
ものであればよく、アクＩＪ　７レアミド系担体、ポリ
スチレン系担体、セルロース系担体、シリカゲル担体等
が例示される。

スペーサーとしては、通常は二塩基酸たとえばコハク酸
、グルタル簸、アジピン酸が用いられるが、特にコハク
酸が好ましい。これらの各採掘基、担体、ス４−サーは
、通常のオリゴヌクレオチドの固相合成法に用いられる
ものであれば使用することかでき、上記の例示化合物に
限定されるものではない。

本発明において用いるヌクレオシドホスホロチオイツト
の製造法は、下記の反応式〔厘〕反応式〔■〕 （反応式〔１〕において、Ｒ１およびＲ”　ｆａｔ前記
と同一の意味を表わす） で示されるように、アルキルホスホロジクロリダイト（
４）とアルカンナオール（５）とヲ、セリシンの存在下
にヘキサン中で反応させて得られる亜リン酸化試薬であ
るアルキルチオクロロアルコキシホスフィン（６）　−
）　Ｎ下記の反応式反応式（Ｉｔ） （反応式（ＩＩ）において、Ｂ、Ｒ’、Ｒ”およびＲｓ
は前記と同一の意味を表わす） に示すように、５′−位水酸基を保護したヌクレオシド
（７）とピリジン中で反応させ、シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより処理してヌクレオシドホスホロチ
オイツト（１）とするものである。

本発明のヌクレオシドホスホロチオイツト（１）ソ用い
たオリゴヌクレオチドの固相合成法は好ましくは以下の
ように実Ｌｔぎれる。すなわち、アクリルアミド系担体
、ポリスチレン系担体、セルロース系担体、シリカゲｌ
し担体などの固相合成用担体に１コノ１り酸、グルタル
酸、アジピン酸などのスペーサーを介して結合させたヌ
クレオシド（２）１当量に５〜２０当量のヌクレオシド
ホスホロチオイツト（１）と５０〜１００ｆｉ量のヨウ
素とを混合溶媒例えばジクロロメタン／ルチジン／トリ
エチルアミン中で反応を行ったのちルチジン水溶液を加
え、担体く結合したヌクレオシド（２）の５′−位水酸
基とヌクレオシドホスホロチオイツト（１）のリン酸修
飾基であるアルキルチオ基としてインターヌクレオチド
結合を形成させて担体に結合したジヌクレオチド（３）
を得る。次いで無水酢酸／ピリジン中触媒量のジメチル
アミノピリジンの存在下に未反応の５′−位水酸基のア
セチル化を行ったのち、１チドリフルオロ酢酸／ジクロ
ロメタンで処理して担体に結合したジヌクレオチドの５
′−水酸、基保護基を除去し、これにヌクレオシドホス
ホロチオイツト（１）を縮合させるという操作を繰り返
すことにより、所望する塩基配列を有する一般式（式中
、ｎは任意の整数を、Ｂ、Ｒ’、Ｒ１゜Ｒ”、トおよび
ヘハは前記と同一の意味を表わすン で示される担体に結合したオリゴヌクレオチドを得るこ
とかできる。この担体に結合したオリゴヌクレオチド（
８）はさらに常法に従ってリン酸基の保護基Ｂｚの除去
、担体との切断、塩基残基の保薩基Ｏ除去、ぎ−位水酸
基の保藤基の除去を順次行ったのちクロマトグラフィー
等によりｒＩＩｇ！することにより一般式（９）（式中
、Ｗは核酸塩基残基を、ｎは前記と同一の意味を表わす
） で示されるオリゴヌクレオチドが得られる。

なお、本発明■固相合成法においては、前記の如く所望
の核酸塩基を有するヌクレオシドホスホロチオイツトを
順次縮合させる手法のほか、あらかじめ合成したジヌク
レオチドホスホロチオイツトブロックまたはトリヌクレ
オチドホスホロチオイツトブロックなどのヌクレオチド
ホスホロチオイットブロックを用いて縮合させることも
可能である。

（発明の効果） 本発明は固相合成法によるオリゴヌクレオチドを合成す
る際に、ヌクレオシドホスホロチオイツトを用いること
により、インターヌクレオチド結合を迅速かつ定量的に
進行させるとともに、縮合と酸化の両反応を同時に行う
という効果力Ｓある。

本発明で得られるオリゴヌクレオチドは遺伝子工学にお
ける１ｉ要な素材として有用な化合物である。

′以下、実施列および実験例により説明する。

（実施例および実験例） 実験例１ ぎ−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｎ−ベンゾイルチミ
ジン−３’　−０−（Ｓ−ターシャリ−ブチルチオ）メ
チルホスホロチオイツトの合成 （上記の反応式において、Ｔｈ　　は３−Ｎ−ベンゾイ
ルチミンを、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基ｆ、ｔｅ
ｒｔＢｕはターシャリ−ブチル基を表わす） ５′−〇−ジメトキシトリチルー３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミジン１１当量と（ターシャリ−ブチルチオ）クロロメ
トキシホスフィン２　。

１５当量とを、ピリジン溶媒中２０℃で１０分間反応さ
せる。反応終了後ジクロロメタン／水で抽出する。抽出
溶媒そ留去後、少量のベンゼンに溶解し、ヘキサン中に
徐々に滴下する再沈段により、５″−〇−ジメトキシト
リチルー３−Ｎ−ベンゾイルチミジン−ぎ−〇−（Ｓ−
ターシャリ−ブチルチオ）メチルホスホロチオイツト之
（以下、チオイツトユニットＴという）を収率８６％で
得’Ｈ−ＮＭＲおよび’”　Ｐ　−ＮＭＲ（第１図）に
より同定した。

”Ｐ−ＮＭＲ１３９，１２ｐｐｍ 実験例２〜４ 保護基を有−する核酸塩基として実験例１の３−Ｎ−ベ
ンゾイルチミン（略称Ｔｈ’）の代りに２−Ｎ−プロピ
オニル−６−〇−ジフェニルカルバモイルグアニン（略
称Ｇｕ”ｃ）、ｐｒ。

４−Ｎ−アニソイルシトシン（略称Ｃｙａｎ）または６
−Ｎ−ベンゾイルアデニン（略称Ａｄｂ２）であるヌク
レオシドを用い、実験例１と同様に反応、単離を行い、
原料ヌクレオシドに対応するホスホロチオイットを第１
表記載の収率テ得、’Ｈ−ＮＭＲオヨヒ”Ｐ　−ＮＭＲ
Ｋ　ヨ’）　Ｉ’ｎＪ　定した。　　　。

第１表 Ａａ　ｂＺ ！ 呆施例】 （上記の反応式において■はセリスチンン樹脂を、Ｔｈ
ｂｚおよびＤＭＴｒ件前記と同一の意味を表わす） ポリスチレン樹脂８（１％ジビニルベンゼン架橋、２１
　Ｑ　ｐｍｏｔ／９　）とｓ’−ｏ−ジメトキシトリチ
ル−３′−〇−サクシニルー３−Ｎ−ベンゾイルチミジ
ン７１当夛とを、トリエチルアミン２当量、４−ジメチ
ルアミノ２リジン０．２当ｉの存在下、ジシクロへキシ
ルカルｉジイミド２当量を用い、ジメチルホルムアミド
中で８時間反応させる。反応終了後、？剰の試薬と溶媒
をテ過Ｃユより除き、更に０．０５Ｍジメチル了ミノぜ
リジンの箸水酢酸／２リジン＝　ｌ／９　（Ｖ／Ｖ　）
溶液を用いて１時間反応して、未反応のアミノ基をアセ
チル化して、ポリスチレン樹脂と３−Ｎ−ベンゾイルチ
ミジンとの縮合物９を得た。

次じこの９の１部をとり・、１％トリフルオロ酢酸で３
分間処理して５′−位水酸基の保護基であるジメトキシ
トリチル基を除去した。のち濾過して得たｐ液を過塩素
酸／エタール＝３／２．（Ｖ／Ｖ　）溶液に溶かしジメ
トキシトリチルカチオンＣ二よる比色定量を行った結果
、担持量が４２μｍ６Ｌ／ｌであった。　　　、０次１
ｍこのポリスチレン樹脂と３−　Ｎ、　−ヘンゾイルチ
ミ、ジンとの縮合物９を、■１−１）リフルオロ酢酸で
３分間処理して、５′−位水酸基の保護基であるジメト
キシトリチル基を除去したのち、■クロロホルムによる
洗浄、■ジクロロメタン／　２．６−ルチジン／　）　
！Ｊ　工ｆＪｔｉアミ：／＝８／１／ＩＣ，Ｖ／Ｖ／Ｖ
＞Ｃよる洗浄後、■実験ｆｉ４ｊ　１で得たチオイツト
ユニットＴ３】ＯＭｆｉｔとヨウ素５０当量とを、ンク
ロロメタン／２．６−ルチジン／トリエチル・アミーン
＝８／１／＋　（Ｖ／Ｖ／Ｖ　）中で１０分間絹合反応
させる。

綜合終了後、■少量の水を含んだ２．６−ルチジンによ
り洗浄し、次いで＠　０．０５　Ｍジメチルアミノピリ
ジンの無水酢酸／ピリジン；９／１（Ｖ／Ｖ）溶液で３
分間反応してアセチル化し、０ピリジンによる洗浄、Ｏ
クロロホルムによる洗浄、という一連の操作を３回繰り
返すことで、下式のようなポリスチレン樹脂と縮合した
テトラマー】Ｏを得た。

（式中、Ｔｈ　　、　ＤＭＴｒ　　および［Ｆ］２１＝
前記と同一の意味を表わす〕 ■上記の■の工程で得たポリスチレンＲＡＭＷ　ｔ！−
縮合したテトラマー１０％　、■チオフェノール／トリ
エチルアミン／ジ′オキサン＝、１／１／２（、Ｖ／Ｖ
／Ｖ）中で９０分処理してリン酸基の保護基であるメチ
ル基を除去し、■濃アンモニア水！２４時間処理してポ
リスチレン樹脂とテトラマーとの切断およびナミンの保
ｕ基である（ンゾイル基の除去後、■ポリスチレン樹脂
８濾過により除いたのちＰ液を逆層液体クロマトグラフ
ィーにより−Ｘ青農する。［株］次。

に８０％酢酸で３０分処理して５′−位水酸基０保饅基
であるジメトキシトリチル基ヲ除去し、■逆層液体クロ
マトグラフィーによりＱ製・単離して、次式のテトラマ
ー厄を得た（第２図）。

（式中、Ｔｈはチミンを表わす〕 ■このテトラマー１１％スネークペノムホスホジエステ
ラーゼにより分鱗し、液体クロマトグラフィーによりテ
トラマー辻力ｓｐ’ｒ：’ｒ＝ａ：ｌであることを同定
した（第３図）。

（Ｔはチミジンを、ｐＴはチミジンーダーモノホスフエ
ートを表わす） 実施例２ 実施例１の■で得たポリスチレン樹脂と３−Ｎ−ベンゾ
イルチミジンとの縮合物９に、実験例４で得たチオイツ
トユニットＡ６を、実施例１の■■〜Ｏの一連の操作を
縮合させたのち、同様の操作により、実験例３で得たチ
オイツトユニットｃ乏、実験例２で得たチオイツトユニ
ットＧ　４　ｆ　ｉ１１次縮合させたのち、実施例１の
■の操作（ただし■−■の濃アンモニア水処理は４８時
間）８行って次式のテトラマー遥を得た（第４図）。

坪 （式中、Ｇｕはグアニンを、Ｃｙはシトシンを、Ａｄは
アデニンそ、Ｔｈはチミンそ表わす） 次にこのテトラマー廷を実り例】の■と同様に酵素分解
し、液体クロマトグラフィーにより、テトラマー１ｇか
Ｇ　：ｐＣ：ｐＡ：ｐＴ＝＝　１　：１：１：１である
ことを同定した（朗５図〕。

（Ｇは２−デオキシグラノシンｆ、ｐｃはτ−デオキシ
シチジンーぎ−モノホスフェー）　’＆　、ｐＡはτ−
デオキシアデノシンー５′−モノホスフェ−）８、ｐＴ
はチミジン−ぎ−モノホスフェ−トラ表わす）

【図面の簡単な説明】

第１図は次のホスホロチオイツトＯ”Ｐ　−ＮＭＲスペ
クトルを示す。 第２図は次Ｏテトラ？　−（’ｒｐ’ｒｐ’ｒｐ’ｒ　
）　ノ）ＩＰＬＣノセターンを示す。 第３図はテトラマ（ＴｐＴｐＴｐＴ　）　ｏ酵素分解後
１７）　ＨＰＬＣパターンを示す。 第４因はＶ、Ｏテトラマ（ＧｐＣｐＡｐＴ　）　０ＨＰ
ＬＣパターンを示す。 第５図はテトラマー（ＧｐＣｐＡｐＴ　）の酵素分屏後
のＨＰＬＣパターンを示す。 特許出願人　有機合成薬品工業株式会社”・−ｊ。 第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼（１） （式中、Ｂは保護基を有することもある 核酸塩基残基を、Ｒ＾１は水酸基の保護基を、Ｒ＾２は
   リン酸保護基となり得る基を、Ｒ＾３は置換基を有する
   こともあるアルキル基を表わす） で示されるヌクレオシドホスホロチオイツトと、固相合
   成用担体にスペーサーを介して結合したヌクレオシドま
   たはヌクレオチド誘導体とを反応させることを特徴とす
   るオリゴヌクレオチドの固相合成法。