JPH11501936A

JPH11501936A - 光除去可能な保護基を用いた核酸合成

Info

Publication number: JPH11501936A
Application number: JP8527819A
Authority: JP
Inventors: ピアラング，マイケル・シー; シューイー，スティーブン・ダブリュー; ブラドリー，ジーン−クロード
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1995-03-16
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 1999-02-16
Also published as: EP0815114B1; EP0815114A1; US5908926A; WO1996028457A1; DE69632456T2; EP0815114A4; CA2215657A1; ATE266671T1; DE69632456D1; DK0815114T3; AU5422896A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般的には核酸合成方法に関し、特定すれば５’から３’への核酸合成方法に関する。該方法を用いることにより、５’末端を通して支持体に結合した配列（array）を製造することができる。本発明は、そのような配列を用いた変異分析法にも関する。本発明は、さらにそのような方法に適切に使用される化合物および組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】光除去可能な保護基を用いた核酸合成本出願はエネルギー部門により付与された政府補助金番号ＤＥＦＧ０５９２ＥＲによりなされた。政府は本発明における権利を有する。技術分野本発明は、一般的には核酸合成方法に関し、特定すれば５’から３’への核酸合成方法に関する。該方法を用いることにより、５’末端を通して支持体に結合した配列（array）を製造することができる。本発明は、そのような配列を用いた変異分析法にも関する。本発明は、さらにそのような方法に適切に使用される化合物および組成物にも関する。背景１９８０年代に生じたＤＮＡ技術における進歩を通じて、現在、ヒトゲノムをマップすること、含まれる遺伝子すべてを同定すること、およびそれらの機能を研究することが可能である。遺伝子すべてが公知になれば、それらがいかに協調するのかを分析することができ、それにより、疾患の理解における大きな進歩につながる。事実、次世紀における医薬は、ＤＮＡに対して次第に焦点を合わせることになると期待されうる。ＤＮＡを合成し、配列決定し、そしてＤＮＡの意味を理解する可能性は、臨床実験室、薬剤産業および研究実験室における必須の道具となるであろう。２４染色体各々の詳細な遺伝地図の新事実は、特定の遺伝子疾患の追跡の助けとなるであろう。ゲノムの物理地図は遺伝子自身を得るための必須の中間工程である。染色体中の各々の遺伝子の位置が公知である重複したクローン化ＤＮＡのライブラリーは適切な物理地図を構築する。個々のクローンに対して遺伝子が位置決めされたら、次に配列決定される。野生型の配列が利用可能になれば、このベースラインの情報は遺伝に基づく疾患の症状前の診断に使用可能である。上記方法の成功の鍵は、迅速に、正確にそして余裕をもって提供されるＤＮＡ配列決定技術の利用可能性である。ＤＮＡ分析に現在提案される最も広く推奨される方法は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（sequencing-by-hybridiz ation：SBH）に使用可能なマイクロチップである（Banis et al.，J．Theor．Bi ol．135：303（1988）；Drmanac et al.，Genomics 4：114（1989）；Khrapko e t al.，FEBS Lett．256：118（1989））。理論上、ｎマーのオリゴヌクレオチドの完全セットを有するチップは、標的ＤＮＡ中のワトソン−クリック相補による二重鎖形成によるＤＮＡ配列決定を可能にするが、その際、唯一の制限は同じ配列の繰り返しおよびｎ以上の同一塩基の合成（run）である。理論上、ＳＢＨ法は固定化されたプローブおよび溶液中の標的（リバースブロット）またはその反対のいずれかで適用されうる。事実、この技術を証明するための最初の実験は両者を用いた。光−作動合成（米国特許第5,143,854；Fador e t al.，Science 251：767（1991））は、しかしながら、ＤＮＡ合成の化学が何千もの位置において平行に指揮されるのを可能にし、プローブの固定化を必要とする。この技術を用いて製造される配列の数は、要求される化学反応の数をはるかに越える。事実、長さ１のオリゴマーの光−作動ＤＮＡ合成のためには、製造される配列の数は４¹であるが、必要とされる工程の数はたった４×１である。最近、Pease et al（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：5022（1994））は、光作動合成を通したＤＮＡチップの合成並びに偽配列決定実験におけるそれらの使用に際しての初期の努力の結果を報告した。ＭｅＮＰＯＣ光除去可能基の侵入により修飾されたホスホロアミダイト化学を用いて、Peaseとその仲間は２５６のオクタマー配列を製造した（２つのＣＧクランプを周辺に有する４つの混合されたヌクレオチド位置）。彼らは、蛍光標識された標的ＤＮＡが配列中でその相補体に選択的に結合することを見いだした。幾つかの一塩基のミスマッチは、しかしながら、完全相補の蛍光ハイブリダイゼーションシグナルのほんの２０％しか示さない。これは、ハイブリダイゼーションが、プローブの正確な配列、ハイブリダイゼーション条件およびミスマッチの位置に依存する事実による［５’末端における切断（fraying）はミスハイブリダイゼーションに共通である（Wood et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82：1585（1985））］。ミスハイブリダイゼーションは配列中にたった一つの相補を有する標的に関して容易に処理可能であるが、完全なオクタマーまたはデカマー配列およびＫｂのＤＮＡ標的で生じる何百のハイブリダイゼーションスポットの解釈を極めて疑わしく（challenging ）させうる。処理能力の高いＤＮＡ配列決定のための第二の新規な方法は、プライマー伸長合成の逆転可能な停止に基づいて生じる。この方法によれば、プライマー、鋳型および３’末端にブロッキング基を有する慣用的デオキシヌクレオチドである４つのターミネーターを用いて、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する。ｄＮＴＰｓは含まれない。たった一つのブロックされたデオキシヌクレオチドを、鋳型／プライマー配列およびポリメラーゼの忠実性に基づいて導入する。導入されたターミネーターの同定は、異なる発色の蛍光体を付することにより決定されうる。別のポリメラーゼサイクルのための遊離３’末端を提供するために、ブロッキング基は除去される（ＤＮＡを損傷しない条件下で）。道理にかなうストラテジーはブロッキング基への塩基特異的発色団の取り込みである。この方法は幾つもの実験上の落とし穴を有するが、もっとも大きなのは、酵素の存在下におけるＤＮＡ重合の可逆性である。これは、処理により市販のポリメラーゼ調製物の多くから除去される５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のことを意味するのではなく、むしろ化学反応の自然な可逆性を意味する。通常のプライマー伸長合成条件下においてこの可逆性は見えないが、何故ならば存在するｄＮＴＰｓが消化鎖の再合成を可能にするからである。各サイクルにおいて可逆物がほんの僅かな量であっても、そのようなエラーの蓄積は、顕著な長さの鋳型の配列決定に必要な何百何千のサイクルをはるかに越えるほど顕著になる。本発明は、核酸の光化学合成および変異が疾患をもたらすような場合を含む、遺伝子の迅速な分析を可能にするオリゴマーの高質な配列の製造に対する新しいアプローチを提供する。本発明は、核酸合成に対する現在のアプローチに使用可能な、新規且つ光化学で除去可能な保護基も提供する。発明の総括１つの具体例として、本発明は核酸の５’から３’への合成を行う方法に関する。該方法は下記からなる：核酸の５'から３'への合成を行う方法であって：ｉ）光除去可能な３'ヒドロキシル保護基を含むヌクレオシドを支持体に付加する工程であって、ここで前記付加は前記ヌクレオシドの５'ヒドロキシルを介して行われ； ii）工程（ｉ）で得られた前記支持体結合ヌクレオシドに照射を行い、それによって前記保護基が除去されそれにより前記３'ヒドロキシル基が遊離される工程；および、 iii）工程（ii）で得られた支持体結合ヌクレオシドを５'ホスホラミダイトを含むヌクレオチドと、前記５'ホスホラミダイトが遊離３'ヒドロキシルと反応してジヌクレオチドが形成される条件下で接触させる工程。もう１つの具体例として、本発明は、下記からなる核酸の５’から３’への合成を行う方法に関する：ｉ）第１のヌクレオチドを前記ヌクレオチドの５'ヒドロキシルを介して支持体に付加する工程であって、ここで前記ヌクレオチドは３'ホスホトリエステルを含み、前記３'ホスホトリエステルの前記エステルのうちの１種は光除去可能な基であり； ii）工程（ｉ）で得られた前記支持体結合ヌクレオチドに照射を行い、それによって前記光除去可能な基が除去され、それにより３'ホスホジエステルが形成される工程；および、 iii）工程（ii）で得られた支持体結合ヌクレオチドを、工程（ii）で得られた支持体結合ヌクレオチドの３'ホスホジエステルと反応する５'ヒドロキシル基を含む第２のヌクレオチドと接触させ、それによってジヌクレオチドが形成される工程。さらにもう１つの具体例として、本発明はヌクレオチドの５’ヒドロキシル基上のホスホラミダイトおよびヌクレオチドの３’ヒドロキシル基上のベンゾイニルカーボネートを含むヌクレオチドに関する。さらに、もう１つの具体例として、本発明は下記式の化合物に関する：式中、Ｂは窒素原子を有する芳香族複素環式基であり；ＸはＨ，ＯＨまたは保護されたＯＨであり；Ｙはベンゾイニルカーボネートであり；Ｚはホスホラミダイトである。さらに、もう１つの具体例として、本発明は３’−Ｏ−ホスホリルアリールオキシベンゾイニルヌクレオチドまたは３’−Ｏ−ホスホリルシアノエトキジベンゾイニルヌクレオチド、または３’−Ｏ−ホスホリルアリールオキシニトロベンジルヌクレオチドに関する。さらなる具体例として、本発明は、基質ならびにそれにヌクレオチドまたはヌクレオシドの５’ヒドロキシル基によって付加した複数のヌクレオチドまたはヌクレオシドからなるアレイに関する。発明の詳細な説明本発明は、核酸、例えば固体支持体に結合させた核酸を５’から３’方向へ合成する方法に関する。好ましい態様では、本発明は核酸オリゴマーの配列（arra y）を調製する方法に関する。オリゴマーをその５’末端を介して配列基質（支持体）に結合し、これによってその３’ヒドロキシル基を、酵素反応（例えば、ライゲーションや多量化）を含む反応に提供する。好ましくは、その５’酸素上にホスホラミダイトをもち、その３’酸素上にはジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、ベンゾイニルカーボネート（例えば、ジメトキシベンゾイン（ＤＭＢ）カーボネート）、ＭｅＮＰＯＣ、ニトロベンジルカーボネート又は出願番号08/339,2 16（Ｊ．Ｏrg．Ｃhem．58:6961，1993も参照のこと）に記載するようなスチリルシリル基をもつヌクレオチドモノマーを製造することによってこの方向性は得られる。あるいは、例えばモノマーが３'−Ｏ−ホスホリルアリールオキシベンゾイニル又はアリールオキシニトロベンジルヌクレオシド又は３’−Ｏ−ホスホリルシアノエトキシベンゾイニルヌクレオシドであるような、逆（５’から３’）ホスホトリエステル合成法を用いることができる。本発明の配列は標的核酸サンプル中の突然変異の検出を含む種々の用途をもつ。固体支持体上での核酸合成には、伸長する鎖を支持体に結合するための化学；結合形成を含むヌクレオチド間の結合を行うための化学；及び複素環塩基上での官能基を保護するための化学、を必要とする。これらの化学については本明細書中ではＤＮＡ合成を参照して記載しているが、そのアプローチはＲＮＡ合成についても応用でき、リボースの２’ヒドロキシル基のための保護基を加えるとよい（Ｎarang，"Ｓynthesis and Ａpplications of ＤＮＡ and ＲＮＡ"，Ｃhapter 5，Ａcademic Ｐress，Ｎew Ｙork，1987）。オリゴ配列は直接使用するので、オリゴマーができる限り純粋であることが重要である。これには脱保護とカップリング工程のそれぞれでほぼ定量的収率を必要とすることを当業者は理解するであろう。本発明の５’から３’へのホスホラミダイト核酸合成を行うための好ましいモノマーは以下の３つのクラスに分けられる：ａ）合成を開始するためのモノマーｂ）伸長する核酸鎖をふやすためのモノマーｃ）鎖伸長を終了するためのモノマー上記の構造中における”Base（塩基）”とは、アデニン、グアニン、チミン、シチジン、イノシン、ウラシルなどの核酸におけるあらゆる窒素含有芳香族複素環物質をいう。塩基上に存在するアミノ基はＤＮＡ骨格又は支持体への結合を損傷することなく除去しうる基で保護されている。適当な保護基には、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチルを含み、あるいは好ましくはアリルオキシカルボニル（ＡＯＣ）を含む（ＡＯＣは触媒量のパラジウム錯体及び蟻酸ブチルアンモニウム又はジメドンを含む種々の親核体によって容易に除去される：Ｔsuji et al.，Ａcc．Ｃhem．Ｒes．20:140，1987）。上記の構造において塩基が結合する糖は、リボース、デオキシリボース又はその修飾体、例えば，２’Ｏ−アルキルリボース又は２’ハロリボース、例えば，２’−フルオロリボースでありうる。上記の構造（ｂ）及び（ｃ）における”Ｘ”はＲ₂Ｎであり、ここでＲは同一又は異なっていてよく、アルキル又はアリール、好ましくはＣ₁−Ｃ₄アルキル（例えばイソプロビル）又はフェニルである。上記の構造（ｂ）及び（ｃ）における”Ｚ”はＯ−アリル、Ｏ−シアノエチル又はＯ−クロロフェニルである。構造（ｃ）における”Ａllyl（アリル）”とは（式中、Ｒ₁＝Ｈ、アルキル（例えばＣ₁−Ｃ₄アルキル）又はアリール（例えばフェニル）；Ｒ₂＝Ｈ；Ｒ₃＝Ｈ、ハロゲン、アルキル（例えばＣ₁−Ｃ₄アルキル）又はアリール（例えばフェニル）；Ｒ₄＝Ｈ；Ｒ₅＝Ｈ、ハロゲン、アルキル（例えばＣ₁−Ｃ₄アルキル）又はアリール（例えばフェニル））である。好ましいＲ₁−Ｒ₅は水素である。ＡＯＣで保護された塩基から上記のモノマーを製造する方法は以下に示される：（式中，ＴＣＡはトリクロロ酢酸であり、ＴＢＤＰＳはtert-ブチルジフェニルシリルであり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルであり、ＡＯＣ−ＣｌはＣＨ₂ＣＨＣＨ₂ＯＣＯＣｌである。上記の保護された化学種（protected species）である（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を用いる合成（５’から３’方向への）は次のようにして実施することができる。３’−ＤＭＢカーボネート（上記（ａ））を適当なリンカーを介して支持体（support）に結合する。次いでこの支持体に３００ｎｍを越える波長の光線を照射し、支持体に結合しているヌクレオチドの３’ヒドロキシルを遊離させる。第二のヌクレオチドを３’ＤＭＢカーボネート−５’−ホスホルアミダイト（phosphoramidite）（上記（ｂ））として付加し、テトラゾール介在カップリング（tetrazoli-mediated coupling）を実施する。その結果生じる亜リン酸トリエステル（phosphite triester）を酸化し（例えば、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたはヨウ素／水／ピリジンを用いて）そのホスフェートにする。未反応の３’末端を、例えば、無水酢酸／ピリジンを用いてキャップ（cap）する。さらに光線を照射すると次のカップリングのための新たな３’末端が生じる。光線照射、カップリング、キャッピング（capping）および酸化のプロセスを繰り返して、最後から２番目の配列を与える。最後のヌクレオチドを、例えば、３’アリルカーボネート（allylcarbonate）として加える。塩基とインターヌクレオチドホスフェート（internucleotide phosphate）保護基は、例えば、パラジウム触媒とギ酸ブチルアンモニウム（butylammonium formate）で処理することにより、３’アリルカーボネートと同時に除去することができる（ハヤカワ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２，１６９１−１６９６（１９９０））ホスホトリエステル（phosphotriester）化学を用いて５’から３’方向への核酸合成を実施する場合、そのモノマー類は３’−ホスホトリエステル類（そのうちの１つは光により除去可能である）で保護される。光により除去可能な好ましいホスフェート保護基はアリールオキシベンゾイニル（aryloxybenzoinyl）基、好適には、ジアルコキシベンゾイニル基（例えば、３’，５’または２’，３ ’−ジメトキシベンゾイニル基）またはメチルニトロピペロニル（methyl nitro piperonyl）基である。３’ホスホトリエステルは実施例１に記載されているとおり、５’−Ｏ−ＤＭＴ塩基保護ヌクレオシド類から製造することができる。合成に際して、５’位における保護基は、ＴＢＤＰＳまたはＤＭＴｒを含む当該技術分野において公知の保護基から選択することができる。例として、２つのジヌクレオチド（５’−Ｇ−Ｔ−３’およびＴ−Ｔ）の合成を以下に記載することができる。５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｎ７−アリルオキシカルボニル−Ｏ６−アリルデオキシグアニン−３’−シアノエチル（ジメトキシベンゾイン）ホスフェート（３００ｍｇ，０．２９５ミリモル）を１００ｍｌベンゼン／１ｍｌピリジン中に溶解する。この溶液にアルゴンを散布することにより脱気してＲａｙｏｎｅｔ反応器中で３０分間３５０ｎｍランプで光線照射する。溶媒を除去し、残渣をトリエチルアミン処理シリカカラム上で９０：９：１のジクロロメタン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）：エタノール（ＥｔＯＨ）：トリエチルアミン（Ｅｔ₃Ｎ）を用いてクロマトグラフを行い、多量のトリエチルアミン塩酸塩（Ｅｔ₃Ｎ．ＨＣｌ）とともに生成物を得る。多量のトリエチルアミン塩酸塩は酢酸エチルを加えて沈殿させ除去する。単一の明瞭なリンの線が³¹ＰＮＭＲによって観察され、この物質は次の工程に回される。このｄＣ塩、デオキシチミジン−３’−シアノエチル（ジメトキシベンゾイン）ホスフェート（０．２７８ｇ，０．４４３ミリモル）、および４−エトキシピリジンＮ−オキシド（０．２０５ｇ，１．４８ミリモル）をピリジンから３度共沸させて、１２ｍｌのジクロロエタン中に取り込む。（トリイソプロピル）ベンゼンスルホニルクロリド（０．１８３ｇ，０．５９０ミリモル）を加えて、その混合物をアルゴン雰囲気下で一晩中撹拌する。ＴＬＣは３つのスポット、すなわち、Ｔモノマーの５’ スルホネート、目的の生成物および過剰のｄＴモノマーが存在することを明らかにする。溶媒を除去し残渣をシリカゲル上で９５：５のジクロロメタン：エタノールを用いてクロマトグラフを行い、白色泡状物（white foam）として生成物（５’−Ｇ−Ｔ−３’，３０５ｍｇ，７５％）を得る。この生成物はその構造的帰属（structural assignment）と一致するスペクトルデータおよびＨＲＭＳ（ＦＡＢ）を示す。また、前述の方法は５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−デオキシチミジン−３’−シアノエチル（ジメトキシベンゾイン）ホスフェートにも適用することができ、２６２ｍｇ（６８％）のＴ−Ｔを得る。トリヌクレオチド、５’−Ｇ−Ｔ−３’は５’−Ｇ−Ｔ−３’ジヌクレオチド（２４０ｍｇ，０．１７５ミリモル）を１００ｍｌベンゼン／１ｍｌピリジン中に溶解し、アルゴンを用いて脱気することにより製造することができる。前述と同様にして光照射を行い、１ｍｌのトリエチルアミンを加え、溶媒を除去する。この塩、デオキシシチジン−３’−シアノエチル（ジメトキシベンゾイン）ホスフェート（０．３５ミリモル）および４−エトキシピリジンＮ−オキシドをピリジンから３度共沸させて、次の１０ｍｌのジクロロエタン中に取り込む。（トリイソプロピル）ベンゼンスルホニルクロリド（０．１０６ｇ，０．３５０ミリモル）を加えて、その混合物を一晩中撹拌する。前記と同様のクロマトグラフ処理により２１９ｍｇ（６９％）の５’−Ｇ−Ｔ−３’を得る。上に示したように、本発明の核酸合成方法は第１のモノマー（例えば上記（ａ））を支持体（基質）に直接的に若しくは適切なリンカーを介して結合することを含む。支持体への結合は該モノマーの５’ヒドロキシルによって行われる。適切な支持体の例としては、長鎖アルキルアミノで調整した小孔ガラス（long-cha in alkylamino controlled pore glass）が挙げられる。米国特許５，１４３，８５４（基質表面処理について記載されている）に記載されている基質は本発明において使用するのに適している。官能性を付与されたガラススライド（glass slide）（例えば、アミノプロピル化ガラススライド）の使用が好ましい。リンカー分子が用いられる場合、該リンカー分子はジカルボン酸誘導体（例えば、コハク酸若しくはフタル酸のエステル類およびアミド類）またはジイソシアネート類のビス付加物（例えば、トルエンジイソシアネート）である。スクシネート（succinate）が好ましい。米国特許５，１４３，８５４に記載されているリンカー類は本発明において使用するのに適している。エチレングリコールオリゴマー類（例えば、トリエチレングリコール）、スクシネート類（例えば、ジグリシンスクシネート）およびトリス（アミノヘキソネート）（tris(aminohexona te)）が好ましい。本発明において使用するのに好適なリンカー類は保護基、すなわち、末端ヒドロキシル上にある光により除去可能な基（例えば、ＤＭＢ−カルボネート、ＭｅＮＰＤＣ等）が付与される。米国特許５，１４３，８５４に記載されている保護基は本発明において適用可能である。好ましくは、該リンカーはＤＭＢカーボネート若しくはＤＭＢホスフェート、または出願番号０８／３３９，２１６に記載されているように、光により除去可能なスチリルシリル基である（また、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：６９６１（１９９３））も参照）。スクシネートリンカー類の基質への結合はジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミドを用いて実施することができる。例えば、米国特許５，１４３，８５４に記載されている結合プロトコル（protocol）を用いることができる。前述のモノマー類から核酸配列の５’から３’への光化学的合成は直接的な“ ストライプマスキング（stripe masking）を用いて実施することができる。一般に、適当な官能基密度（functional group density）を有する支持体は、第１の塩基を付加するために保護されたヌクレオシドで処理される。次いでこの支持体をマスク（例えば、５ｍｍの縞状マスク）を通して光照射し、次の塩基を結合させる。この操作は、望ましい長さ（例えば、８ないし１２塩基）のオリゴマーを製造するまで繰り返される。例えば、上述のようにして製造されたオリゴマーの配列は標的核酸試料における突然変異（mutation）を検出する際に用いることができる（例えば、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子）。標的核酸内のある部位に相補的であるプライマー（オリゴマー）を有する各配列場所（each array location）を、分離可能に標識された４つのジデオキシヌクレオチドのうちの１つのポリメラーゼによる触媒結合を促進するために用いることができる。検出可能な標識として蛍光が使用される場合、各々の場所における蛍光の色によって突然変異部位におけるヌクレオチドを同定することができる。あるいは、蛍光タッグ（fluorescent tag）の存在は、標的に相補的な配列を有する配列オリゴマーを同定するために利用することができる。この方法を用いると、タッグを獲得しないオリゴマー類は鋳型（template）の突然変異による標的内のミスマッチ（mismatch）を反映している。各ヌル部位（ea chnull location）におけるプライマー配列の知見は突然変異部位の決定を可能にする。前記の用途に加えて、本発明の方法および得られた配列は、例えば、細菌性もしくはウイルス性病原体に特異的な配列の試料中における存在を検出するために用いることができる。本発明のある側面は以下に続く非制限的な実施例中でより詳細に記述する。実施例Ｉ、は３’−Ｏ−ホスホリルアリールオキシベンゾイニルヌクレオシド類を用いたホスホトリエステルの５’から３’方向への合成に関する。実施例ＩＩは、ジメトキシベンゾイニルカーボネート類の製造および（５’保護剤としての）使用に関し、実施例ＩＩＩは、ベンゾイニルカーボネート類を３’−ヒドロキシル保護基として用いた５’から３’方向へのホスホルアミダイトの合成に関する。（ピルング（Pirrung）およびシュエイ（Shuey），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：３８９０（１９９４）も参照されたい）。実施例Ｉジメトキシベンゾイン類の不整合成、ホスホトリエステルの発生及びジヌクレオチド合成使用した方法は、Ｈａｙａｓｉｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３６４（１９９０）のものに基づいていた。基本的に、ジメトキシベンズアルデヒドをトリメチルシリルシアニド、チタンイソプロポキシド及び酒石酸ジエチルで処理することによってトリメチルシリルシアノヒドリン類を製造した。シリルシアノヒドリン類を０℃においてジエチルエーテル中でフェニルマグネシウムブロミド２モル当量で１時間処理し、そして２Ｎ塩酸中で６時間室温で加水分解させて置換ベンゾイン（そのアルコールはＤＭＢＯＨと称される）を得た。このように製造したベンゾインを、キラルＮＭＲシフト試薬Ｅｕ（ｆｏｄ）₃の使用によって光学的純度について分析した。光学的に純粋ではないそれらの化合物のために、葡萄酸塩（ｒａｃｅｍａｔｅ）の結晶化をエナンチオマー過剰を上げるために使用した。５’−保護、塩基保護ヌクレオシド類の誘導体化を次のように行った。Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−アセチルアデノシンをアセトニトリル中でＬｅｔｓｉｎｇｅｒ試薬、クロロジメチルアミノ（ｏ−クロロフェニル）ホスフィット（１．２当量）で室温において２時間処理した。光学的に活性なベンゾイン（１．４当量）を触媒量のテトラゾールの存在下に加えて、カップリングを一晩進行させた。ホスホトリエステルへの酸化は１：１ＴＨＦ／水中のヨウ素の５％溶液で達成した。生成物を水の添加及びクロロホルム抽出によって単離した（以下を参照）。溶媒の蒸発の後、粗生成物をメタノール中に懸濁させ、数滴のトリエチルアミンを加えた。室温で１時間後、反応混合物を濃縮して、水性エタノール中から生成物を結晶化させた。ＮＭＲ分析は、リンでのジアステレオマーの混合物によって、ベンゾイン基中のメチンとヌクレオシド中の３’−メチンのシグナルのダブリングを示した。これらはいかなるクロマトグラフ的または結晶化法によっても分離できなかった。これらの化合物を３’−Ｏ−ＰＡｒベンズ（ホスホリルアリールオキシベンゾイニル）ヌクレオシドと呼ぶ。ジヌクレオチドの光化学的合成を次の試験によって示した。５’−Ｏ−アセチル−３’−Ｏ−ＰＡｒベンズ−チミジンをベンゼン中で１０ｍＷ／ｃｍ²の出力で３６５ｎｍにおいて１０分間照射して、３’−Ｏ−ホスフェートジエステルを製造した。この溶液に直接Ｎ−ベンゾイルアデノシン３’−Ｏ−ＰＡｒベンズ（１当量）、メシチレンスルホニルニトロトリアゾール（ＭＳＮＴ、１当量）及びピリジン−Ｎ−オキシド（０．００５当量）を加えた。室温で２時間攪拌した後、反応混合物を水中へ入れて急冷し、クロロホルムで抽出し、そして生成物を合わせた有機層の蒸発によって単離した。粗製材料を次にメタノール／水（１：１）中に溶解し、そして０．１Ｍのｐ−ニトロベンズアルデヒデオキシム／テトラメチルグアニジンを加えた。４０℃で２時間攪拌後、ＨＰＬＣ分析は、ｏ−クロロフェニル、アセチル、及びベンジル基が完全に除去されたことを示した。生成物をアニオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｓｉｌ）でｐＨ５．５の重炭酸トリエチルアンモニウムで溶離することによって９４％より大きい収率で単離した。核酸の固体相合成のために、ガラスのビーズまたはスライドを１０％のジメチルジクロロシラン及びヘキサエチレングリコールで誘導体化（官能化）し、続いて１１０℃で２時間アニーリングし、アルゴン下で冷却した。次に担体を室温においてＬｅｔｓｉｎｇｅｒの試薬で２時間、続いて室温で５’−ＯＨ−３’−Ｏ −ＰＡｒベンズヌクレオシドで一晩処理した。この手順によって最初のヌクレオシドがその５’−ヒドロキシル基を介して担体に結合した。この担体を次に、トリエチルアミン及びｐ−ジエチルアミノニトロベンゼンを含む溶液と接触させて、１０ｍＷ／ｃｍ²の出力で３６５ｎｍにおいて１０分間照射した（カップリングのためのホスホジエステルの製造のためにこの照射時間は重要であり、６分が最適であることがわかった）。担体がスライドであれば、照射は表面のパターンを課するためにマスクを通して行うことができる。担体を純粋なメチレンクロライドで洗浄した。次に５’−ＯＨ−３’−Ｏ−ＰＡｒベンズヌクレオシド及びメシチレンスルホニルニトロトリアゾール（ＭＳＮＴ）の溶液を担体に加えて、そして２時間室温まで放置した。担体を次の照射サイクルの準備のためにメチレンクロライドで再度洗浄した。この段階で、３’−Ｏ−ＰＡｒベンズ基を含むジヌクレオチドが存在し、そして望まれるシーケンスを強めるために前述の手順を繰り返すことができる。完全なシーケンスが組み立てられた後に、最終の照射が３’ −の光不安定性基を除去し、そしてニトロベンズアルデヒドロオキシムによる前述の処理が担体に結合したオリゴヌクレオチドを保護されなくする（deprotect ）。このヌクレオチドのシーケンスは２つの方法で確立された。一つのシーケンスのみを含む担体を水性フッ化カリウムで処理して全てのＤＮＡ鎖を分離した。このＤＮＡをエタノール沈殿させ、そしてＦＡＢマス分光光度分析にかけた。これらのＤＮＡ分子はＰＣＲプライマーとしても使用でき、そして慣用の方法で製造され精製された既知量の同じシーケンスと比較して、この望まれるシーケンスの量（従ってその得られたシーケンスの純度）の推定を行った。担体上の合成サイクルの収率を、ヒドロキシル表面を３’−ＰＡｒベンズ基を含むチミンとカップリングさせることによって確立した。それはストライプ中で保護されなくなり、そして３’−アセチルチミンとカップリングした。アセチル基をＭｅＯＨ／Ｅｔ₃Ｎで除去して、３’−ヒドロキシルフルオレセイン化した。第２ストライプ重複及び直交において、基体を光化学的に保護されなくし、そして第１及び３’−ヒドロキシルをフルオレセイン化した。両方の工程において脱保護及びカップリングが完全であることを条件として、この試験の結果は全体にわたって均一な蛍光の十字（ｃｒｏｓｓ）であるべきである。脱保護が完全でないと、中心領域は「二重にカップリングしている」ので蛍光が多いはずである。実施例II ジメトキシベンゾインカーボネート類ニトロメタン中でメチル化（Sahaら，J.Am.Chem.Soc.111:4856(1989)）により活性化したカルボニルジイミダゾールによって、ＤＭＢの単一アシル化（室温で１時間）を実施すると、還流温度であっても安定である以下の”１”の化合物が得られた（以下の式１）。アルコール溶液（０．５当量）次いでピリジンを添加すると、アシル置換が誘導され、室温で１時間以内にＤＭＢカーボネートが生成した（以下の式２）。第１級、第２級及びアリールアルコール類及びチオール類（ベンジルアルコール、ベンジルメルカプタン、ｐ−メトキシフェノール、コレステロール、シクロドデカノール及びボルネオールを含む）が高い収率で保護された。これらの化合物を、ベンゼンまたはアセトニトリル中の希釈溶液（＜３ｍＭ）として３５０ｎｍランプ（Rayonet 反応器）で照射することにより、直ちに脱保護した。典型的な反応時間は、０．２５ｍｍｏｌスケールで１時間（アセトニトリル中では２倍以上）であり、アルコール類の単離収率は、一様に高かった（＞９６％）。低濃度に於けるＤＭＢアセテート及びベンジルＤＭＢカーボネートの同様の照射は本質的に同一速度の脱保護を示し、これらのカーボネート類に関する脱保護の特定収率は、アセテートに関して報告されているもの、０．６４と同様であることを示唆している。ニトロベンジル類に対するこれらのベンゾイン基の非常に優れた点は、不活性なフェニルジメトキシベンゾフラン副生成物にある。その長波長（３００ｎｍ）吸収及び強い３９６ｎｍ蛍光は、１μＭという低い濃度でもその検出が可能であるため、光化学脱保護の収率の光学方法による直接測定が可能になる。固体基体上のＤＮＡの光化学合成用のＤＭＢカーボネート保護基の有用性を示すために、２つのトリマーを調製した。５’アルコールにおけるＤＭＢ-カーボネートによるチミジンの誘導体形成及び、得られた以下の”３”化合物を以下の ”４”合物３’-ホスホアミダイトへの転換を標準方法によって実施した［式３（Gait”Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach”IRL Press Oxfor d 1984；Narang,”Synthesis and Applications of DNA and RNA”Academic Pre ss，New York（1987）；Gassen and Lang，”Chemical and Enzymatic Synthesi s of Gene Fragments”Varlag-Chemie,Weinheim（1982）：Caruthers，Science 230:281（1985）］。５'-ＤＭＴｒ−Ｔ（２５μｍｏｌ／ｇ）で誘導体形成した市販の長鎖アルキルアミンコントロール-ポアグラス（lcaa-cpg）ビーズを酸で処理し、テトラゾール触媒作用下、無水酢酸／ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）キャッピングで以下の”４”化合物に結合させた。照射（以下の式４）及び５’−ＤＭＴｒ−Ｂｚ−チトシン３’−ＣＥ−ホスホアミダイトとのカップリングによりトリヌクレオチドが得られた。この保護基及びテザーをアンモニアで開裂させ、生成物をＨＰＬＣ精製にかけた（逆相，０．１Ｍ Et₃N.HOAc／２４−３２％ CH₃CN）。配列５’−ＤＭＴｒ−ＣＴＴを含む画分の吸収を、真正サンプル（慣用のＤＭＴｒ合成により調製）の既知濃度の吸収と比較すると、全収率の７６．５％であった。配列５’−ＡＴＴ−３’を最初に５’−ＤＭＢ−ＣＯ₂−Ｔ（ベンゾフラン離脱により１８４ｎｍｏｌ）にその３’スクシネートを介して、ジシクロヘキシルカルボジイミド処理によりlcaa-cpg基体を充填することにより調製した。照射（ｔ_1/2＝２．７分；全時間＝３０分）及び”４”の化合物とのカップリングを上述のように実施した。第２の照射（ｔ_1/2＝３．３分；全時間＝４５分）及び５’−ＤＭＴｒ−Ｂｚ−アデノシン３’−ＣＥ−ホスホアミダイトとのカップリング（ベンゾフラン離脱により１６７ｎｍｏｌ）はトリヌクレオチドを与えた。これを基体から開裂させ、ＨＰＬＣにより分析すると単一ピークを示した。この生成物も、ＯＰＣカートリッジ（Applied Biosystems，Foster C ity，ＣＡ）を用いて精製し、ヘビ毒フォスフォジエステラーゼ／アルカリフォスファターゼで消化させた（Cadetら，Can.J.Chem.63:2861（1985））。得られたサンプル中のヌクレオシドをＨＰＬＣで分析した。６４．５％／３５．５％（Ｔ／Ａ）の割合が観察され、これは予想配列と一致した。これらの２つの配列中の隣接Ｔ残基にもかかわらず、光化学脱保護は、真正サンプルと比較することによって全くＴ−Ｔダイマー生成物が存在しないことによって確認されるように、ＤＮＡにとって有害ではなかった（Greenbergら，J.Org.Chem.59:746（1994））。第２級ダイマーも上記の”１”の化合物により保護され、照射により脱保護できた。実施例III ヌクレオシドの３’アルコールの光除去可能なカーボネート誘導体による保護、ホスホアミダイトによる５’アルコールの保護及び３’−アルコールの５’−リン誘導体とのカップリングカルボニルジイミダゾールをニトロメタン中でメチルトリフレートと処理すると、Ｎ−アルキルイミダゾリウム誘導体が生成した（上記実施例II参照）。この種の３’，５’−ジメトキシベンゾインとのin-situ処理により、混合カーボネートエステル／イミダゾールが生成した。５’−保護ヌクレオシドを添加し、溶液を２時間還流すると、ＤＭＢ及びヌクレオシドの３’ヒドロキシル由来の混合カーボネートが得られた。この物質は５’末端で脱保護し得、さらに、ホスホアミダイト試薬で５’−ヒドロキシル上でさらに誘導体形成した（Caruthers,Scie nce 230:281（1985））。この５’−リン誘導体と第２のヌクレオシドの３’− アルコールとのカップリングをテトラゾール触媒で実施する。発生期のＤＮＡ鎖を＞３００ｎｍの波長の光で照射することによりもうひとつのカップリングサイクルのために調製すると、ベンゾフラン誘導体、二酸化炭素及び遊離３’−ＯＨ基が生成した。上記のものを使用して、ヌクレオシドの５’アルコール類を含む他のアルコールの保護のために使用できる（実施例II参照）。チオール保護も上述のように実施し得る。上述のすべての参照文献はすべて本明細書中に含まれる。当業者はこの開示を読むことにより、本発明の趣旨及び範囲を逸脱せずに種々の変形を考え得るであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者シューイー，スティーブン・ダブリューアメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27713，ダーラム，ティモンズ・ドライブ 5011 (72)発明者ブラドリー，ジーン−クロードアメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27705，ダーラム，サウス・ラサル・ストリート 311，アパートメント・ナンバー 41エル

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸の５'から３'への合成を行う方法であって：ｉ）光除去可能な３'ヒドロキシル保護基を含むヌクレオシドを支持体に付加する工程であって、ここで前記付加は前記ヌクレオシドの５'ヒドロキシルを介して行われ； ii）工程（ｉ）から得られた前記支持体結合ヌクレオシドに照射を行い、それによって前記保護基が除去されそして前記３'ヒドロキシル基が遊離される工程；および、 iii）工程（ii）から得られた支持体結合ヌクレオシドを５'ホスホラミダイトを含むヌクレオチドと、前記５'ホスホラミダイトが遊離３'ヒドロキシルと反応してジヌクレオチドが形成される条件下で接触させる工程；を含む方法。２．３'ヒドロキシル保護基はベンゾイニルカーボネートである、請求項１記載の方法。３．ベンゾイニルカーボネートはジアルコキシベンゾイニルカーボネートである、請求項２記載の方法。４．ジアルコキシベンゾイニルカーボネートは３',５'または２',３'ジメトキシベンゾイニルカーボネートである、請求項３記載の方法。５．ヌクレオチドは３'ヒドロキシル保護基を含む、請求項１記載の方法。６．ヌクレオチドの３'ヒドロキシル保護基は光除去可能である、請求項５記載の方法。７．ヌクレオチドの３'ヒドロキシル保護基はベンゾイニルカーボネートである、請求項６記載の方法。８．核酸の５'から３'への合成を行う方法であって；ｉ）第１のヌクレオチドの５'ヒドロキシルを介して支持体に付加する工程であって、ここでヌクレオチドは３'ホスホトリエステルを含み、３'ホスホトリエステルのエステルのうちの１種は光除去可能な基であり； ii）工程（ｉ）から得られた前記支持体結合ヌクレオチドに照射を行い、それによって前記光除去可能な基が除去されそして３'ホスホジエステルが形成される工程；および、 iii）工程（ii）から得られた支持体結合ヌクレオチドを、工程（ii）から得られた支持体結合ヌクレオチドの３'ホスホジエステルと反応する５'ヒドロキシル基を含む第２のヌクレオチドと接触させ、それによってジヌクレオチドが形成される工程；を含む方法。９．光除去可能な基はアリールオキシベンゾイニル基である、請求項８記載の方法。 10．光除去可能な基はニトロベンジル基である、請求項８記載の方法。 11．アリールオキシベンゾイニル基はアリールオキシジアルコキシベンゾイニル基である、請求項９記載の方法。 12．アリールオキシジアルコキシベンゾイニル基はアリールオキシジメトキシベンゾイニル基である、請求項11記載の方法。 13．第２のヌクレオチドは３'ホスホトリエステルを含み、前記エステルのうちの１種は光除去可能な基である、請求項８記載の方法。 14．その５'ヒドロキシル上にホスホラミダイトを含み、且つその３'ヒドロキシル上にベンゾイニルカーボネートを含む、ヌクレオチド。 15．次式：［式中、Ｂは窒素質芳香族複素環式基であり、ＸはＨ、ＯＨ、または保護されたＯＨであり、Ｙはベンゾイニルカーボネートであり、Ｚはホスホラミダイトである］からなる化合物。 16．Ｙはジアルコキシベンゾイニルカーボネートである、請求項15記載の化合物。 17．Ｙはジ（Ｃ₁-Ｃ₄）アルコキシベンゾイニルカーボネートである、請求項1 6記載の化合物。 18．Ｙは３',５'または２',３'ジメトキシベンゾイニルカーボネートである、請求項17記載の化合物。 19．Ｂはウラシル、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、またはイノシンである、請求項15記載の化合物。 20．３'-ｏ-ホスホリルアリールオキシベンゾイニルヌクレオチド。 21．ヌクレオチドは３'-ｏ-ホスホリルアリールオキシジアルコキシベンゾイニルヌクレオチドである、請求項20記載のヌクレオチド。 22．ヌクレオチドは３'-ｏ-ホスホリルアリールオキシジ（Ｃ₁-Ｃ₄）-アルコキシベンゾイニルヌクレオチドである、請求項21記載のヌクレオチド。 23．ヌクレオチドは３'-ｏ-ホスホリルアリールオキシジメトキシベンゾイニルヌクレオチドである、請求項22記載のヌクレオチド。 24．支持体、およびヌクレオシドまたはヌクレオチドの５'ヒドロキシル基を介して該支持体に付加した複数のヌクレオチドまたはヌクレオシドを有する配列（array）。 25．ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３'ヒドロキシは光除去可能な保護基を含む、請求項24記載の配列。