JPH0692435B2 - 修飾ｄｎａの化学合成のためのホスホラミダイト試薬 - Google Patents
修飾ｄｎａの化学合成のためのホスホラミダイト試薬Info
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- JPH0692435B2 JPH0692435B2 JP1504376A JP50437689A JPH0692435B2 JP H0692435 B2 JPH0692435 B2 JP H0692435B2 JP 1504376 A JP1504376 A JP 1504376A JP 50437689 A JP50437689 A JP 50437689A JP H0692435 B2 JPH0692435 B2 JP H0692435B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/12—Triazine radicals
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は修飾シトシン塩基、主に5,6−ジヒドロ−５−
アザシトシンおよび５−アザシトシンを含むDNAの合
成、そしてより特に配列の特定部位での前記塩基の組入
れを可能とする修飾DNAの化学合成に使用するための試
薬に関する。
アザシトシンおよび５−アザシトシンを含むDNAの合
成、そしてより特に配列の特定部位での前記塩基の組入
れを可能とする修飾DNAの化学合成に使用するための試
薬に関する。
発明の背景 所望のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチオフラ
グメントを合成する能力は、研究および応用分子生物学
の双方において有用な手段である。短い合成ポリヌクレ
オチド、またはオリゴヌクレオチドは、より長いDNAセ
グメントを結合するのにアダプターまたはリンカーとし
て、またハイブリッド形成プローブおよびDNA合成プラ
イマーとして有用である。より長いポリヌクレオチドは
重複付着端を有するより短いセグメントより構築するこ
とができそして構造遺伝子、調節領域例えばプロモータ
ー、ターミネーター、オペレーター、および同様のもの
として使用しうる。したがって合成DNAフラグメントを
高収率で相対的に短時間で生成するための好都合な自動
化技術を提供することは大変重要なことである。
グメントを合成する能力は、研究および応用分子生物学
の双方において有用な手段である。短い合成ポリヌクレ
オチド、またはオリゴヌクレオチドは、より長いDNAセ
グメントを結合するのにアダプターまたはリンカーとし
て、またハイブリッド形成プローブおよびDNA合成プラ
イマーとして有用である。より長いポリヌクレオチドは
重複付着端を有するより短いセグメントより構築するこ
とができそして構造遺伝子、調節領域例えばプロモータ
ー、ターミネーター、オペレーター、および同様のもの
として使用しうる。したがって合成DNAフラグメントを
高収率で相対的に短時間で生成するための好都合な自動
化技術を提供することは大変重要なことである。
ヌクレオチド配列、例えばDNAの機能、構造および化学
的仕上げの理解は発展してきたので、遺伝子工学の実用
性と実行可能性の認識もまた深まった。しかし、これら
工学的成果は細胞中の化学的および生物学的反応の完全
な理解を必要とする。これら反応の一つは特異的DNAメ
チラーゼにより酵素的に行われるところの一定のシトシ
ン残基の選択的メチル化により新たに合成されたDNAの
複製後修飾である。真核DNAにおける特異メチル化様式
の形成を支配する要素を理解することは、形質発現の機
構を理解しようとする場合大変重要である。
的仕上げの理解は発展してきたので、遺伝子工学の実用
性と実行可能性の認識もまた深まった。しかし、これら
工学的成果は細胞中の化学的および生物学的反応の完全
な理解を必要とする。これら反応の一つは特異的DNAメ
チラーゼにより酵素的に行われるところの一定のシトシ
ン残基の選択的メチル化により新たに合成されたDNAの
複製後修飾である。真核DNAにおける特異メチル化様式
の形成を支配する要素を理解することは、形質発現の機
構を理解しようとする場合大変重要である。
かかる遺伝子工学の努力を基礎とするものは、単一のモ
ノヌクレオチドよりの所望のヌクレオチド鎖の合成であ
る。これに関して、出発ヌクレオチドに対する逐次リン
キングを経由して所望のオリゴヌクレオチド配列を合成
するための電気機械的器具が開発されてきた。
ノヌクレオチドよりの所望のヌクレオチド鎖の合成であ
る。これに関して、出発ヌクレオチドに対する逐次リン
キングを経由して所望のオリゴヌクレオチド配列を合成
するための電気機械的器具が開発されてきた。
現在では、ポリヌクレオチド合成のために様々な接近法
が利用できる。これら接近法はいくつかの基準を基礎と
することで特徴付けることができる。第一に、合成は通
常固相基質上または溶液中のいずれかで行なう。固相合
成は一端で基質に付着した成長鎖へのモノヌクレオチド
の逐次付加による。固相は反応体の簡単な分離を許す
が、この方法は過剰量の反応体を必要としかつ通常少量
（1mg未満）の所望配列のみを提供する。溶液相合成
は、より少量の高価試薬を必要としそしてより大量の生
成物配列を提供できるものの、全ての付加後に中間生成
物の単離と精製を必要とする。実際には全ての自動操作
のポリヌクレオチド系は固相合成による。
が利用できる。これら接近法はいくつかの基準を基礎と
することで特徴付けることができる。第一に、合成は通
常固相基質上または溶液中のいずれかで行なう。固相合
成は一端で基質に付着した成長鎖へのモノヌクレオチド
の逐次付加による。固相は反応体の簡単な分離を許す
が、この方法は過剰量の反応体を必要としかつ通常少量
（1mg未満）の所望配列のみを提供する。溶液相合成
は、より少量の高価試薬を必要としそしてより大量の生
成物配列を提供できるものの、全ての付加後に中間生成
物の単離と精製を必要とする。実際には全ての自動操作
のポリヌクレオチド系は固相合成による。
現在のところ自動操作のポリヌクレオチド合成のために
広く使用されている二つの合成化学がある。トリエステ
ル法は、CatlinおよびCramerＪ．Org．Chem．38:245−2
50（1973）およびItakura等．Can．Ｊ．Chem．51:3649
−3651（1973）により記載される通り、一般に安価でか
つ安定であるところの適当なブロック化ホスフェート−
トリエステル中間体の付加による。ホスフィット−トリ
エステル法は、LetsingerおよびLunsford Ｊ．Am．Che
m．Soc．98:3655（1975）により記載される通り、いく
らかより複雑であるが、一般にホスフェート トリエス
テル法より高収量を供給する。ホスフィット−トリエス
テル法の有用性は、当初用いられたリン−クロロダイト
中間体よりもより安定なN,N−ジアルキルアミノ ホス
フィット（アミダイト）の使用によって大いに向上し
た。ホスフィット−トリエステル法は各ヌクレオチド付
加でより高い収量が故によく好まれる一方、ホスフェー
ト−トリエステル法もまた自動操作のポリヌクレオチド
合成に適する。
広く使用されている二つの合成化学がある。トリエステ
ル法は、CatlinおよびCramerＪ．Org．Chem．38:245−2
50（1973）およびItakura等．Can．Ｊ．Chem．51:3649
−3651（1973）により記載される通り、一般に安価でか
つ安定であるところの適当なブロック化ホスフェート−
トリエステル中間体の付加による。ホスフィット−トリ
エステル法は、LetsingerおよびLunsford Ｊ．Am．Che
m．Soc．98:3655（1975）により記載される通り、いく
らかより複雑であるが、一般にホスフェート トリエス
テル法より高収量を供給する。ホスフィット−トリエス
テル法の有用性は、当初用いられたリン−クロロダイト
中間体よりもより安定なN,N−ジアルキルアミノ ホス
フィット（アミダイト）の使用によって大いに向上し
た。ホスフィット−トリエステル法は各ヌクレオチド付
加でより高い収量が故によく好まれる一方、ホスフェー
ト−トリエステル法もまた自動操作のポリヌクレオチド
合成に適する。
ポリヌクレオチドを合成するのに使用できる反応器系の
うち、密ベッドカラム、疎ベッドカラム、またはバッチ
反応器のいずれかを使用する固相反応器系がある。密ベ
ッドカラムは固相支持材で密に充填されておりそして反
応体は単一の通路中にまたは再循環流により導入され
る。
うち、密ベッドカラム、疎ベッドカラム、またはバッチ
反応器のいずれかを使用する固相反応器系がある。密ベ
ッドカラムは固相支持材で密に充填されておりそして反
応体は単一の通路中にまたは再循環流により導入され
る。
疎ベッドカラムはこれら問題を部分的に緩和するように
導入されてきた。反応体をカラムにゆっくりと通すこと
により、より高い質量移動速度が達成されそして高価な
反応体の利用が改良される。また、固相充填はそこを通
る流れ分布を一様にするように転ずるので、チャンネル
化は減少する。
導入されてきた。反応体をカラムにゆっくりと通すこと
により、より高い質量移動速度が達成されそして高価な
反応体の利用が改良される。また、固相充填はそこを通
る流れ分布を一様にするように転ずるので、チャンネル
化は減少する。
バッチ反応器においては、支持体マトリックスは密封容
器中に入れられる。反応体は導入されそして容器内容物
は、象徴的には不活性ガスを反応器中の液体に通し泡立
てることにより、攪拌される。かかる系は反応器中の保
持時間を増すことにより反応体の大変有効な利用を提供
できる反面、相対的に大容量の反応体および溶媒が反応
器を満たすのに必要とされる。
器中に入れられる。反応体は導入されそして容器内容物
は、象徴的には不活性ガスを反応器中の液体に通し泡立
てることにより、攪拌される。かかる系は反応器中の保
持時間を増すことにより反応体の大変有効な利用を提供
できる反面、相対的に大容量の反応体および溶媒が反応
器を満たすのに必要とされる。
Urdea等は、米国特許第4,517,338号において、個々のヌ
クレオチドをヌクレオチド鎖に所定の順序で加えること
により分散された固相支持体に付着された線形ポリマー
分子の逐次修飾のための方法および系を開示する。分散
された固相支持体は試薬の導入と除去のための接近部位
を備えた反応器帯域の中に保持される。試薬は少くとも
一つの接近部位を通して試薬マニホールドにより反応器
帯域に選択的に配給される。
クレオチドをヌクレオチド鎖に所定の順序で加えること
により分散された固相支持体に付着された線形ポリマー
分子の逐次修飾のための方法および系を開示する。分散
された固相支持体は試薬の導入と除去のための接近部位
を備えた反応器帯域の中に保持される。試薬は少くとも
一つの接近部位を通して試薬マニホールドにより反応器
帯域に選択的に配給される。
選択されたヌクレオチド配列をプログラム通りに合成す
るための別の装置は、Zelinka等．米国特許第4,598,049
号に記載されている。
るための別の装置は、Zelinka等．米国特許第4,598,049
号に記載されている。
５−アザシトシン デオキシリボヌクレオシドのトリア
ジン環のよく知られたところの不安定性は、上述の自動
操作のDNA合成において構築ブロックとしての使用を不
適当なものにする。この欠点にも拘らず、５−アザシト
シン残基を含有する一重および二重ストランドのDNAフ
ラグメンドの合成における利益はこの薬の作用機構の理
解において重要なゴールを構成する。生存細胞における
５−アザシトシンのDNA組入れはDNAメチラーゼ活性の抑
制およびこれに続く遺伝子活性化に関連してきた。
ジン環のよく知られたところの不安定性は、上述の自動
操作のDNA合成において構築ブロックとしての使用を不
適当なものにする。この欠点にも拘らず、５−アザシト
シン残基を含有する一重および二重ストランドのDNAフ
ラグメンドの合成における利益はこの薬の作用機構の理
解において重要なゴールを構成する。生存細胞における
５−アザシトシンのDNA組入れはDNAメチラーゼ活性の抑
制およびこれに続く遺伝子活性化に関連してきた。
５−アザシトシン残基のDNA組入れと遺伝子活性化の間
に存在する関係は十分に確立されているので、それは、
この非天然塩基を含有するオリゴヌクレオチド フラグ
メントの合成のための方法論を発展させるのに役立つで
あろう。これら修飾オリゴヌクレオチドは、5,6−ジヒ
ドロ−５−アザシトシン残基と５−アザシトシン残基を
特異部位に含むものであるが、選択的な遺伝子活性化の
機構およびこれらトリアジン塩基の存在とDNAメチル化
の抑制との間に存在する関係を解明するための道具とし
て役立つであろう。DNA合成において２′−デオキシ−
５−アザ−シチジンのホスホラミダイトの直接組入れ
は、２′−デオキシ−５−アザ−シチジンが酸またはア
ルカリ条件に極端に鋭敏であるので、失敗に帰するであ
ろう。
に存在する関係は十分に確立されているので、それは、
この非天然塩基を含有するオリゴヌクレオチド フラグ
メントの合成のための方法論を発展させるのに役立つで
あろう。これら修飾オリゴヌクレオチドは、5,6−ジヒ
ドロ−５−アザシトシン残基と５−アザシトシン残基を
特異部位に含むものであるが、選択的な遺伝子活性化の
機構およびこれらトリアジン塩基の存在とDNAメチル化
の抑制との間に存在する関係を解明するための道具とし
て役立つであろう。DNA合成において２′−デオキシ−
５−アザ−シチジンのホスホラミダイトの直接組入れ
は、２′−デオキシ−５−アザ−シチジンが酸またはア
ルカリ条件に極端に鋭敏であるので、失敗に帰するであ
ろう。
発明の要約 本発明の目的は、上記に述べたような従来技術の欠点を
克服することにある。
克服することにある。
本発明の別の目的は、5,6−ジヒドロ−５−アザシトシ
ン塩基または５−アザシトシン塩基のいずれかを配列の
特異部位に含む修飾オリゴヌクレオチドの合成方法を提
供することにある。
ン塩基または５−アザシトシン塩基のいずれかを配列の
特異部位に含む修飾オリゴヌクレオチドの合成方法を提
供することにある。
本発明のもう一つの目的は、5,6−ジヒドロ−５−アザ
シトシンおよび５−アザシトシン塩基の組入れを達成す
るDNAの自動操作合成用の試薬を提供することにある。
シトシンおよび５−アザシトシン塩基の組入れを達成す
るDNAの自動操作合成用の試薬を提供することにある。
また本発明の目的は、オリゴヌクレオチド構造において
5,6−ジヒドロ−５−アザ−シトシンを５−アザシトシ
ンに変換する方法を提供することにある。
5,6−ジヒドロ−５−アザ−シトシンを５−アザシトシ
ンに変換する方法を提供することにある。
さらに本発明の別の目的は、選択的な遺伝子活性化の機
構を研究するのに使用するための化合物を提供すること
にある。
構を研究するのに使用するための化合物を提供すること
にある。
DNA合成において２′−デオキシ−ジヒドロ−５−アザ
−シチジンのホスホラミダイトの使用は、それがDNA合
成に用いる全ての化学的段階と全体的に適合するので、
所望のインターヌクレオチド結合の満足な形成という結
果となりそして修飾DNAフラグメントの合成を可能にす
る。合成の最後において、大変特異的でかつ容易に行わ
れる酸化が、所望の５−アザ−シトシン部分を生ぜしめ
る。５−アザシトシン ヌクレオシドにおいてトリアジ
ン環の加水分解不安定性は十分よく文献に示されている
ので、５−アザシトシンデオキシリボースの慣用のホス
ホラミダイト誘導体、化合物１の使用は、それが合成の
脱保護段階のうちにトリアジン環の塩基触媒開裂の結果
となろうから、非実用的である。本発明の方法は、オリ
ゴヌクレオチドの合成の終了の後所望の５−アザシトシ
ン塩基の再生成を可能にする５−アザシトシンデオキシ
リボースの安定なホスホラミダイト前駆体を使用するこ
とによりこの問題を克服するものである。
−シチジンのホスホラミダイトの使用は、それがDNA合
成に用いる全ての化学的段階と全体的に適合するので、
所望のインターヌクレオチド結合の満足な形成という結
果となりそして修飾DNAフラグメントの合成を可能にす
る。合成の最後において、大変特異的でかつ容易に行わ
れる酸化が、所望の５−アザ−シトシン部分を生ぜしめ
る。５−アザシトシン ヌクレオシドにおいてトリアジ
ン環の加水分解不安定性は十分よく文献に示されている
ので、５−アザシトシンデオキシリボースの慣用のホス
ホラミダイト誘導体、化合物１の使用は、それが合成の
脱保護段階のうちにトリアジン環の塩基触媒開裂の結果
となろうから、非実用的である。本発明の方法は、オリ
ゴヌクレオチドの合成の終了の後所望の５−アザシトシ
ン塩基の再生成を可能にする５−アザシトシンデオキシ
リボースの安定なホスホラミダイト前駆体を使用するこ
とによりこの問題を克服するものである。
保護された5,6−ジヒドロ−５−アザシチジン ホスホ
ラミダイト（5,6−dihydro−５−azacytidine phosphor
amidite）、化合物９は、その親ヌクレオシドと同様、
大変安定なトリアジン環を有する。
ラミダイト（5,6−dihydro−５−azacytidine phosphor
amidite）、化合物９は、その親ヌクレオシドと同様、
大変安定なトリアジン環を有する。
本発明による反応は次の反応図式において示す。
ａ）2,2当量1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロ
ピルジシロキサン．ピリジン室温 １時間97％ｂ）８当
量NaBH4.THF.室温１時間78％ｃ）ｉ。８当量塩化イソブ
チル．ピリジン／クロロホルム.O°ii.MeOH.室温16時間
84％.d）i.40当量グリオキサール．ピリジン．室温乾燥
還元３回ii.クロロホルム／水抽出ｅ）２当量塩化イソ
ブチリル．ピリジン．室温２時間61％.f）1.2当量 フ
ッ化テトラブチルアンモニウム.THF.室温1/2時間60％.
g）1,2当量塩化4,4′−ジメトキシトリチル．ピリジ
ン．室温２時間50％.h）2.2当量 クロロ−N,N−ジイソ
プロピルアミノ メトキシホスフィン4.2当量テトラゾ
ール．クロロホルム室温15分71％ 図式１は５−アザ−シトシンデオキシリボースより出発
する５−アザシチジン ホスホラミダイトの合成の概略
を示す。1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピル
ジシロキサンを用いた保護、続いて化合物２の水素化ホ
ウ素還元により、所望のジヒドロ類似体、化合物３を、
酢酸メチル中の５％メタノールを用いたシリカゲル フ
ラッシュ クロマトグラフィーによる精製の後に与え
た。化合物３の1H−NMRスペクトルは新たに生成したＣ
−６メチレンプロトンを4.40ppmを中心としたAB四重線
として示す。その後化合物３の環側鎖アミノ基をイソブ
チルアミド、化合物４、として保護しそしてヘキサン中
の50％酢酸エチルを用いたシリカゲル フラッシュ ク
ロマトグラフィーにより精製した。トリアジン環の完全
な保護はビス（イソブチリルオキシ）エチレン基の導入
により達成し、２′−デオキシグアノシンについても同
様の方法により行なった。しかして、化合物４とグリオ
キサールの反応より単離された、中間体ジオール、化合
物５を塩化ジブチリルと反応させて化合物６を与え、こ
れをヘキサン中の15％酢酸エチルを用いたシリカゲル
フラッシュ クロマトグラフィーにより精製した。フッ
化テトラブチルアンモニウムを用いた化合物６中のテト
ライソプロピルジシロキサン基の除去により、塩化メチ
レン／水中の簡単な抽出に続いて、化合物７を与えた。
５′−ヒドロキシル基の保護を、塩化4,4′−ジメトキ
シトリチルを用いた標準的手順により完了して化合物８
を結晶性固体として得た。融点89−91℃（ヘキサン）。
最後に、クロロ−N,N′−ジイソプロピルアミノメトキ
シホスフィットを用いた化合物８のホスフィチル化によ
り、ヘキサン中の25％酢酸エチルを用いたシリカゲル
フラッシュ クロマトグラフィーによる精製の後に、所
望のホスホラミダイト、化合物９を白色固体、融点67−
69℃として与えた。
ピルジシロキサン．ピリジン室温 １時間97％ｂ）８当
量NaBH4.THF.室温１時間78％ｃ）ｉ。８当量塩化イソブ
チル．ピリジン／クロロホルム.O°ii.MeOH.室温16時間
84％.d）i.40当量グリオキサール．ピリジン．室温乾燥
還元３回ii.クロロホルム／水抽出ｅ）２当量塩化イソ
ブチリル．ピリジン．室温２時間61％.f）1.2当量 フ
ッ化テトラブチルアンモニウム.THF.室温1/2時間60％.
g）1,2当量塩化4,4′−ジメトキシトリチル．ピリジ
ン．室温２時間50％.h）2.2当量 クロロ−N,N−ジイソ
プロピルアミノ メトキシホスフィン4.2当量テトラゾ
ール．クロロホルム室温15分71％ 図式１は５−アザ−シトシンデオキシリボースより出発
する５−アザシチジン ホスホラミダイトの合成の概略
を示す。1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピル
ジシロキサンを用いた保護、続いて化合物２の水素化ホ
ウ素還元により、所望のジヒドロ類似体、化合物３を、
酢酸メチル中の５％メタノールを用いたシリカゲル フ
ラッシュ クロマトグラフィーによる精製の後に与え
た。化合物３の1H−NMRスペクトルは新たに生成したＣ
−６メチレンプロトンを4.40ppmを中心としたAB四重線
として示す。その後化合物３の環側鎖アミノ基をイソブ
チルアミド、化合物４、として保護しそしてヘキサン中
の50％酢酸エチルを用いたシリカゲル フラッシュ ク
ロマトグラフィーにより精製した。トリアジン環の完全
な保護はビス（イソブチリルオキシ）エチレン基の導入
により達成し、２′−デオキシグアノシンについても同
様の方法により行なった。しかして、化合物４とグリオ
キサールの反応より単離された、中間体ジオール、化合
物５を塩化ジブチリルと反応させて化合物６を与え、こ
れをヘキサン中の15％酢酸エチルを用いたシリカゲル
フラッシュ クロマトグラフィーにより精製した。フッ
化テトラブチルアンモニウムを用いた化合物６中のテト
ライソプロピルジシロキサン基の除去により、塩化メチ
レン／水中の簡単な抽出に続いて、化合物７を与えた。
５′−ヒドロキシル基の保護を、塩化4,4′−ジメトキ
シトリチルを用いた標準的手順により完了して化合物８
を結晶性固体として得た。融点89−91℃（ヘキサン）。
最後に、クロロ−N,N′−ジイソプロピルアミノメトキ
シホスフィットを用いた化合物８のホスフィチル化によ
り、ヘキサン中の25％酢酸エチルを用いたシリカゲル
フラッシュ クロマトグラフィーによる精製の後に、所
望のホスホラミダイト、化合物９を白色固体、融点67−
69℃として与えた。
新規なホスホラミダイト、化合物９の反応性を初めに、
DNA合成に用いる標準条件の下に、図式２に示されるよ
うに、典型的な、３′−Ｏ−アセチル−チミジンとのテ
トラゾール触媒の縮合反応において試験した。15分後
に、反応は完了し、そして即その場で酸化して定量され
る収量の、完全に保護された二量体、化合物11を与え
た。トリクロロ酢酸を用いたジメトキシトリチル基の除
去、そして濃厚水酸化アンモニウムを用いた残基の更な
る処理により完全にブロック化した二量体、化合物12を
得た。
DNA合成に用いる標準条件の下に、図式２に示されるよ
うに、典型的な、３′−Ｏ−アセチル−チミジンとのテ
トラゾール触媒の縮合反応において試験した。15分後
に、反応は完了し、そして即その場で酸化して定量され
る収量の、完全に保護された二量体、化合物11を与え
た。トリクロロ酢酸を用いたジメトキシトリチル基の除
去、そして濃厚水酸化アンモニウムを用いた残基の更な
る処理により完全にブロック化した二量体、化合物12を
得た。
ａ）1.5当量ホスホラミダイト9,5当量テトラゾール、Me
CN,室温,15分,b）ヨウ素３％；水２％;2,6−ルチジン２
％.THF93％；室温10分,c）ジクロロメタン中の２％トリ
クロロ酢酸，室温,10分,d）濃縮NH4OH,50°,15時間,e）
i.250当量ビス（トリメチルシリル）−トリフルオロア
セトアミド,MeCN,還流,1時間ii.水中の50％メタノー
ル，室温,1時間． 新試薬を試験するために、位置３および６のシトシン塩
基が5,6−ジヒドロ−５−アザシトシン部分により置換
された二個のデカマーをApplied Biosystems model 380
Aの自動操作DNA合成器中で合成した。トリチル分析資料
に基づき、１段階毎の収率はそれぞれ、98.5％および9
8.4％であり、非修飾デカマーについての99.09％と対比
される。
CN,室温,15分,b）ヨウ素３％；水２％;2,6−ルチジン２
％.THF93％；室温10分,c）ジクロロメタン中の２％トリ
クロロ酢酸，室温,10分,d）濃縮NH4OH,50°,15時間,e）
i.250当量ビス（トリメチルシリル）−トリフルオロア
セトアミド,MeCN,還流,1時間ii.水中の50％メタノー
ル，室温,1時間． 新試薬を試験するために、位置３および６のシトシン塩
基が5,6−ジヒドロ−５−アザシトシン部分により置換
された二個のデカマーをApplied Biosystems model 380
Aの自動操作DNA合成器中で合成した。トリチル分析資料
に基づき、１段階毎の収率はそれぞれ、98.5％および9
8.4％であり、非修飾デカマーについての99.09％と対比
される。
ジヒドロトリアジン塩基の芳香族トリアジンへの最後の
変換は、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロ−アセ
トアミド（BSTEA）および塩化トリメチルシリルをシリ
ル化試薬として、そして過酸化トリメチルシリルを酸化
試薬として使用することにより満足になし遂げた。形質
転換のために二量体化合物12を原型として使用しそして
生じる二量体13を定量される収量で生成した。
変換は、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロ−アセ
トアミド（BSTEA）および塩化トリメチルシリルをシリ
ル化試薬として、そして過酸化トリメチルシリルを酸化
試薬として使用することにより満足になし遂げた。形質
転換のために二量体化合物12を原型として使用しそして
生じる二量体13を定量される収量で生成した。
図面の簡単な説明 第１図は陰イオンFAB質量スペクトル計により得られた
二量体12のフラグメント化パターンを相対強度対m/zで
プロットして示す。
二量体12のフラグメント化パターンを相対強度対m/zで
プロットして示す。
第２図は５′−末端標識とポリアクリルアミドゲル電気
泳動の後に得られた合成オリゴヌクレオチドのオートラ
ジオグラフィーを示す。
泳動の後に得られた合成オリゴヌクレオチドのオートラ
ジオグラフィーを示す。
レーン1:（CA）3,ヘキサマー標識体 レーン2,（AT）4,オクタマー標識体 レーン3,TACGTCGCAG,親デカマー レーン4,TAXGTCGCAG,3−修飾デカマー レーン5,TACGTXGCAG,6−修飾デカマー Ｘ＝5,6−ジヒドロ−５−アザシチジン。
発明の詳細な説明 詳細な反応図式は次の通りに示される。
本発明に従うホスホラミダイトの合成は２′−デオキシ
−５−アザシチジン、化合物１より出発した。図式３に
示されるように、Markiewick等Bull. Pol. Acad. Sci.，3
2:433,1984の手順に従って、ピリジンを溶媒として使用
して３′および５′ヒドロキシル基を1,3−ジクロロ−
1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサンで同時に保
護した。この反応は97％収率で進行し、所望の化合物３
を泡体として与えた。これおよび次の図式において、テ
トライソプロピルジシロキサン基はヌクレオシドの３′
および５′酸素原子を結ぶ半円として描いた。
−５−アザシチジン、化合物１より出発した。図式３に
示されるように、Markiewick等Bull. Pol. Acad. Sci.，3
2:433,1984の手順に従って、ピリジンを溶媒として使用
して３′および５′ヒドロキシル基を1,3−ジクロロ−
1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサンで同時に保
護した。この反応は97％収率で進行し、所望の化合物３
を泡体として与えた。これおよび次の図式において、テ
トライソプロピルジシロキサン基はヌクレオシドの３′
および５′酸素原子を結ぶ半円として描いた。
続いての段階において、図式３に示されるように、二重
結合を炭素上のパラジウムにより触媒的に水素で還元す
るか、またはより効率的にテトラヒドロフラン中の水素
化ホウ素ナトリウムで還元した。
結合を炭素上のパラジウムにより触媒的に水素で還元す
るか、またはより効率的にテトラヒドロフラン中の水素
化ホウ素ナトリウムで還元した。
１時間の反応の後、メタノールおよび水での処理、仕上
げおよび酢酸エチル中の５％メタノールを用いたシリカ
ゲル上のクロマトグラフィーに続いて、所望の生成物、
化合物４を78％収率で泡体として得た。
げおよび酢酸エチル中の５％メタノールを用いたシリカ
ゲル上のクロマトグラフィーに続いて、所望の生成物、
化合物４を78％収率で泡体として得た。
図式４に参照されるように、環側鎖のアミノ官能基をピ
リジン中の化合物３と塩化イソブチリルの処理によりこ
の時点で84％の割合で保護した。慣用の仕上げおよび酢
酸エチル中の50％ヘキサンを用いたシリカゲルクロマト
グラフィーの後、化合物４を泡体として得た。
リジン中の化合物３と塩化イソブチリルの処理によりこ
の時点で84％の割合で保護した。慣用の仕上げおよび酢
酸エチル中の50％ヘキサンを用いたシリカゲルクロマト
グラフィーの後、化合物４を泡体として得た。
図式４に示されるように、アグリコン部分の完全な保護
は、イソブチリルオキシエチレン基を導入することによ
りなし遂げた。化合物４とグリオキサールの反応によ
り、無水ピリジン中塩化イソブチリルによる環化中間体
の処理に続いて、ヘキサン中15％酢酸エチルを用いたシ
リカゲルカラム クロマトグラフィーによる精製の後化
合物６を与えた。化合物６を泡体として61％収率で単離
した。
は、イソブチリルオキシエチレン基を導入することによ
りなし遂げた。化合物４とグリオキサールの反応によ
り、無水ピリジン中塩化イソブチリルによる環化中間体
の処理に続いて、ヘキサン中15％酢酸エチルを用いたシ
リカゲルカラム クロマトグラフィーによる精製の後化
合物６を与えた。化合物６を泡体として61％収率で単離
した。
図式５に参照されるように、室温にてTHF中でフッ化テ
トラブチルアンモニウムを用いて糖テトライソプロピル
ジシロキサン保護基を除去することにより化合物７を製
造した。反応混合物を還元乾固し水と塩化メチレンに配
分した後この化合物を塩化メチレン中より簡単な抽出に
より精製して化合物７を泡体として59％収率で与えた。
トラブチルアンモニウムを用いて糖テトライソプロピル
ジシロキサン保護基を除去することにより化合物７を製
造した。反応混合物を還元乾固し水と塩化メチレンに配
分した後この化合物を塩化メチレン中より簡単な抽出に
より精製して化合物７を泡体として59％収率で与えた。
DNA合成に必要とされるところの、５′−ヒドロキシ基
の選択的保護を、乾燥ピリジン中塩化4,4′−ジメトキ
シトリチルを使用した標準的な手順によりなし遂げて、
化合物８を50％収率で結晶性固体として得た。融点89−
91℃。
の選択的保護を、乾燥ピリジン中塩化4,4′−ジメトキ
シトリチルを使用した標準的な手順によりなし遂げて、
化合物８を50％収率で結晶性固体として得た。融点89−
91℃。
図式６は、ジイソプロピルアミンの存在下塩化メチレン
中クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシ ホスフィ
ンによる化合物８のホスフィチル化により、ヘキサン中
の25％酢酸エチルを用いたシリカゲル カラムクロマト
グラフィーによる精製の後に71％収率の化合物９をガラ
ス状物質として与えたことを示す。
中クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシ ホスフィ
ンによる化合物８のホスフィチル化により、ヘキサン中
の25％酢酸エチルを用いたシリカゲル カラムクロマト
グラフィーによる精製の後に71％収率の化合物９をガラ
ス状物質として与えたことを示す。
本発明のホスホラミダイト、化合物９はDNAを合成する
ために特徴的な縮合反応に使用した。
ために特徴的な縮合反応に使用した。
図式７に示されるように、PfleidererおよびSchwarz（T
etrahedron Letters,25:5513,1984）の手順に従って、
ホスホラミダイトをアセトニトリル中縮合触媒としてテ
トラゾールの存在下で３′−Ｏ−アセチル チミジン、
化合物10と混合した。薄層クロマトグラフィーは15分後
に反応完了を示し、そして二量体生成物をただちにその
場でヨウ素、ルチジン、THFおよび水の混合物により酸
化して、定量される収量の完全保護された二量体ホスフ
ェート、化合物11を与えた。ジクロロメタン中トリクロ
ロ酢酸によるこの二量体溶液の処理によりジメトキシト
リチル基を除去し、そして、図式８に示されるように、
濃厚水酸化アンモニウムにより55℃で15時間の間残渣を
処理すると、十分に脱ブロックされた目的二量体を得
た。脱ブロック化二量体の分析試料を、J.T.Baker C−1
8シリカゲル上、40マイクロメーター、水中５％メタノ
ールの逆相クロマトグラフィーの後得、そして第１図に
示すように、FAB/MSは予測の構造と一致していた。
etrahedron Letters,25:5513,1984）の手順に従って、
ホスホラミダイトをアセトニトリル中縮合触媒としてテ
トラゾールの存在下で３′−Ｏ−アセチル チミジン、
化合物10と混合した。薄層クロマトグラフィーは15分後
に反応完了を示し、そして二量体生成物をただちにその
場でヨウ素、ルチジン、THFおよび水の混合物により酸
化して、定量される収量の完全保護された二量体ホスフ
ェート、化合物11を与えた。ジクロロメタン中トリクロ
ロ酢酸によるこの二量体溶液の処理によりジメトキシト
リチル基を除去し、そして、図式８に示されるように、
濃厚水酸化アンモニウムにより55℃で15時間の間残渣を
処理すると、十分に脱ブロックされた目的二量体を得
た。脱ブロック化二量体の分析試料を、J.T.Baker C−1
8シリカゲル上、40マイクロメーター、水中５％メタノ
ールの逆相クロマトグラフィーの後得、そして第１図に
示すように、FAB/MSは予測の構造と一致していた。
最後に、ジヒドロ−５−アザシチジン含有の二量体、化
合物12を無水アセトニトリル中で懸濁させそして、図式
９に示すように、過剰量のビス（トリメチルシリル）ト
リフルオロ アセトアミド、塩化トリメチルシリルおよ
び過酸化トリメチルシリルで還流下、一夜中処理した。
質量スペクトル計においてm/z531にてM-Hピークが優性
であることより評価されるように、５−アザシチジンへ
の酸化が定量的に起きた。仕上げは大変簡単であり揮発
性溶媒と試薬の蒸発、そして残りの酸素と窒素をシリコ
ン結合より脱ブロックするための水により残留物の処理
が含まれる。水溶液の凍結乾燥により所望の二量体、化
合物13を得た。
合物12を無水アセトニトリル中で懸濁させそして、図式
９に示すように、過剰量のビス（トリメチルシリル）ト
リフルオロ アセトアミド、塩化トリメチルシリルおよ
び過酸化トリメチルシリルで還流下、一夜中処理した。
質量スペクトル計においてm/z531にてM-Hピークが優性
であることより評価されるように、５−アザシチジンへ
の酸化が定量的に起きた。仕上げは大変簡単であり揮発
性溶媒と試薬の蒸発、そして残りの酸素と窒素をシリコ
ン結合より脱ブロックするための水により残留物の処理
が含まれる。水溶液の凍結乾燥により所望の二量体、化
合物13を得た。
新試薬の有用性を試験するために、第２図において、レ
ーン４および５で示される二つの二量体は、位置３およ
び６でシトシン塩基が5,6−ジヒドロ−５−アザシトシ
ン部分により置換されているものだが、Applied Biosys
tems model 380A自動操作DNA合成器中で合成した。トリ
チル分析資料に基づいて、１段階毎の収率は夫々、98.5
％および98.4％であり、非修飾デカマーについての99.0
9％と対比される（第２図、レーン３）。
ーン４および５で示される二つの二量体は、位置３およ
び６でシトシン塩基が5,6−ジヒドロ−５−アザシトシ
ン部分により置換されているものだが、Applied Biosys
tems model 380A自動操作DNA合成器中で合成した。トリ
チル分析資料に基づいて、１段階毎の収率は夫々、98.5
％および98.4％であり、非修飾デカマーについての99.0
9％と対比される（第２図、レーン３）。
本発明はある特定の実施態様に関して以上記載されてい
るが、多くの変法が可能であり、かつ別の材料および試
薬を本発明から離れることなく使用することができると
理解されたい。ある場合においてそのような変法および
置換はいくつかの実験を必要とされるが、それらは日常
的な試験のみが含まれるであろう。
るが、多くの変法が可能であり、かつ別の材料および試
薬を本発明から離れることなく使用することができると
理解されたい。ある場合においてそのような変法および
置換はいくつかの実験を必要とされるが、それらは日常
的な試験のみが含まれるであろう。
特定の実施態様についての上述の記載は、本発明の一般
的性質を十分に表わしているので、現今の知識を適用す
ることにより、誰もがかかる特定の実施態様を包括的概
念から離れずに種々の用途のために容易に変更および／
または適合させることができるであろう。そして従っ
て、かかる適合および変更は開示された実施態様の均等
物の定義および範囲の中に包含されることを意味する。
ここにおける表現法および用語は記載のためのものであ
り制限されるものではないと理解すべきである。
的性質を十分に表わしているので、現今の知識を適用す
ることにより、誰もがかかる特定の実施態様を包括的概
念から離れずに種々の用途のために容易に変更および／
または適合させることができるであろう。そして従っ
て、かかる適合および変更は開示された実施態様の均等
物の定義および範囲の中に包含されることを意味する。
ここにおける表現法および用語は記載のためのものであ
り制限されるものではないと理解すべきである。
Claims (9)
- 【請求項１】修飾DNAの合成に使用するのに適するホス
ホラミダイトにおいて、次式： で表わされる5,6−ジヒドロ−５−アザシチジン ホス
ホラミダイト。 - 【請求項２】５−アザ−シトシンデオキシリボースを、
シロキサンで保護すること、 保護された５−アザ−シトシン−デオキシリボースを還
元すること、還元、保護された５−アザ−シトシン−デ
オキシリボースの環側鎖アミノ基とトリアジン環を保護
すること、 シロキサン基を除去しそして保護された５−アザ−シト
シン−デオキシリボースのヒドロキシル基を保護するこ
と、 生じた化合物をホスフィチル化して５−アザ−シトシン
−ホスホラミダイトを生成すること、 よりなる5,6−ジヒドロ−５−アザシチジン ホスホラ
ミダイトの製造方法。 - 【請求項３】シロキサンが1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テ
トライソプロピルジシロキサンである請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】環側鎖アミノ基をイソブチリルアミドとし
て保護する請求項２記載の方法。 - 【請求項５】ビス（イソブチリルオキシ）エチレン基に
よりトリアジン環を保護する請求項２記載の方法。 - 【請求項６】３′−Ｏ−アセチル チミジンを5,6−ジ
ヒドロ−５−アザシトシン ホスホラミダイトと反応さ
せることよりなる二量体オリゴヌクレオチドの製造方
法。 - 【請求項７】5,6−ジヒドロ−５−アザシチジン ホス
ホラミダイトを5,6−ジヒドロ−５−アザシトシン残基
および５−アザシトシン残基として使用することよりな
るDNAフラグメントの製造方法。 - 【請求項８】5,6−ジヒドロ−５−アザシトシン残基を
酸化して５−アザシトシン残基を生成することよりなる
オリゴヌクレオチドの製造方法。 - 【請求項９】前記5,6−ジヒドロ−５−アザシトシン残
基は、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトア
ミドおよび塩化トリメチルシリルよりなる群から選択さ
れた少くとも一種のシリル化剤を使用してシリル化によ
り生成し、そしてオリゴヌクレオチド中の前記５−アザ
シトシン残基を生成するように過酸化トリメチルシリル
との反応により酸化される請求項８記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/178,153 US5324831A (en) | 1988-04-06 | 1988-04-06 | Phosphoramidite reagent for chemical synthesis of modified DNA |
| US178,153 | 1988-04-06 | ||
| PCT/US1989/001395 WO1989009779A1 (en) | 1988-04-06 | 1989-04-06 | Phosphoramidite reagent for chemical synthesis of modified dna |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03502577A JPH03502577A (ja) | 1991-06-13 |
| JPH0692435B2 true JPH0692435B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=22651417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1504376A Expired - Lifetime JPH0692435B2 (ja) | 1988-04-06 | 1989-04-06 | 修飾ｄｎａの化学合成のためのホスホラミダイト試薬 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5324831A (ja) |
| JP (1) | JPH0692435B2 (ja) |
| AU (1) | AU625295B2 (ja) |
| CA (1) | CA1330960C (ja) |
| IL (1) | IL89827A0 (ja) |
| WO (1) | WO1989009779A1 (ja) |
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| US5585481A (en) * | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
| US6031091A (en) * | 1987-09-21 | 2000-02-29 | Gen-Probe Incorporated | Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes |
| US5614617A (en) * | 1990-07-27 | 1997-03-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
| US5574146A (en) * | 1994-08-30 | 1996-11-12 | Beckman Instruments, Inc. | Oligonucleotide synthesis with substituted aryl carboxylic acids as activators |
| US6562798B1 (en) | 1998-06-05 | 2003-05-13 | Dynavax Technologies Corp. | Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof |
| US6184347B1 (en) | 1998-11-19 | 2001-02-06 | Agilent Technologies Inc. | Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents |
| EP1163251A1 (en) | 1999-03-24 | 2001-12-19 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | N-acylphosphoramidites and their use in oligonucleotide synthesis |
| US7435390B2 (en) * | 2001-01-26 | 2008-10-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid synthesizers |
| US20080261220A1 (en) * | 2000-11-30 | 2008-10-23 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic Acid Detection Assays |
| US20030072689A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-04-17 | Third Wave Technologies, Inc. | Polymer synthesizer |
| US6932943B1 (en) | 2001-01-26 | 2005-08-23 | Third Wave Technologies | Nucleic acid synthesizers |
| US7355037B2 (en) * | 2001-12-03 | 2008-04-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use |
| US20070207973A1 (en) * | 2002-09-24 | 2007-09-06 | Koronis Pharmaceuticals, Incorporated | 1,3,5-Triazines for Treatment of Viral Diseases |
| CA2499036A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-04-08 | Koronis Pharmaceuticals, Incorporated | 1,3,5-triazines for treatment of viral diseases |
| US9809824B2 (en) * | 2004-12-13 | 2017-11-07 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | CpG oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods |
| US7700567B2 (en) * | 2005-09-29 | 2010-04-20 | Supergen, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| US7829735B2 (en) * | 2007-10-26 | 2010-11-09 | Northwestern University | Universal phosphoramidite for preparation of modified biomolecules and surfaces |
| ES2702495T3 (es) | 2011-08-30 | 2019-03-01 | Astex Pharmaceuticals Inc | Formulaciones de derivados de decitabina |
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| KR20200035438A (ko) | 2017-08-03 | 2020-04-03 | 오쓰까 세이야꾸 가부시키가이샤 | 약물 화합물 및 이의 정제 방법 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3817982A (en) * | 1971-12-29 | 1974-06-18 | Syntex Inc | 2{40 ,3{40 -unsaturated nucleosides and method of making |
| US4058602A (en) * | 1976-08-09 | 1977-11-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare | Synthesis, structure, and antitumor activity of 5,6-dihydro-5-azacytidine |
| US4458066A (en) * | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4668777A (en) * | 1981-03-27 | 1987-05-26 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite nucleoside compounds |
| US4849513A (en) * | 1983-12-20 | 1989-07-18 | California Institute Of Technology | Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups |
| JPH0723394B2 (ja) * | 1986-11-27 | 1995-03-15 | 日本臓器製薬株式会社 | 新規アデノシン誘導体及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物 |
-
1988
- 1988-04-06 US US07/178,153 patent/US5324831A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-03 IL IL89827A patent/IL89827A0/xx unknown
- 1989-04-05 CA CA000595701A patent/CA1330960C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-06 JP JP1504376A patent/JPH0692435B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-06 AU AU33681/89A patent/AU625295B2/en not_active Ceased
- 1989-04-06 WO PCT/US1989/001395 patent/WO1989009779A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03502577A (ja) | 1991-06-13 |
| CA1330960C (en) | 1994-07-26 |
| AU3368189A (en) | 1989-11-03 |
| AU625295B2 (en) | 1992-07-09 |
| IL89827A0 (en) | 1989-12-15 |
| US5324831A (en) | 1994-06-28 |
| WO1989009779A1 (en) | 1989-10-19 |
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