JPH03502577A - 修飾dnaの化学合成のためのホスホラミダイト試薬 - Google Patents
修飾dnaの化学合成のためのホスホラミダイト試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
修飾DNAの化学合成のためのホスホラミダイト試薬発 明 の 分
野
本発明は修飾シトシン塩基、主に翫6−シヒドロー5=アザシトシンおよび5−
アザシトシンを含むDNAの合成、セしてよシ脣に配列の特定部位での前記塩基
の組入れを可能とする修飾DNAの化学合成に使用するための試薬に関する。
発 明 の 背 景
所望のヌクレオチド配列tWするポリヌクレオチオフラグメン)f合成する能力
は、研究および応用分子生物学の双方において有用な手段である。短い合成ポリ
ヌクレオチド、ま之はオリゴヌクレオチドは、より長いDNAセグメントを結合
するのにアダプターまたはリンカ−として、ま几ハイブリッド形成プローブおよ
びDNA合成ブライマーとして有用である。より長いポリヌクレオチドは重複付
着端!−有するより短いセグメントより構築することができセして構造遺伝子、
調節領域例えばプロモーター、ターミネータ−、オペレーター、および同様のも
のとして使用しうる。したがって合成りNAフラグメントv高収率で相対的に短
時間で生成するための好都合な自動化技術t−提供することは大変重要なことで
ある。
ヌクレオチド配列、例えばDNAの機能、構造および化学的仕上げの理解は発展
してきたので、遺伝子工学の実用性と実行可能性の認識もまた深まった。しかし
、これら工学的成果は細胞中の化学的および生物学的反応の完全な理解を必要と
する。これら反応の一つri特特約的DNAメチラーゼより酵素的に行われると
ころの一定のシトシン残基の選択的メチル化により新九に合成されたDNAの複
製後修飾である。真核DNAにおける脣異メチル化様式の形成を支配する要素全
理解することは、形質発現の機構を理解しようとする場合大変重要である。
かかる遺伝子工学の努力を基礎とするものは、単一のモノヌクレオチドよりの所
望のヌクレオチド鎖の合成である◎これに関して、出発ヌクレオチドに対する逐
次リンキングを経由して所望のオリゴヌクレオチド配列を合成する几めの眠気機
械的器具が開発されてきた。
現在で框、ポリヌクレオチド合成の九〇に様々な接近法が利用できる。これら接
近法はいくつかの基準金基礎とすることで特徴付けることができる。第一に、合
成は通常固相基質上または浴液中のいずれかで行なう。固相合成は−1で基質に
付着し几成長鎖へのモノヌクレオチドの逐次付加による。固相は反応体の簡単な
分離を許すが、この方法は過剰量の反応体全必要としかつ通常少量(119未満
)の所望配列のみを提供する。溶液相合W、ハ、より少量の高価試薬全必要とし
そしてより大量の生成物配列t−提供できるものの、全ての付加後に中間生成物
の単離と精製を必要とする。実際には全ての自動操作のポリヌクレオチド系は固
相合成による。
現在のところ自動操作のポリヌクレオチド合成のために広(便用されている二つ
の合成化学がある。トリエステル法に、Catlin &よびCramer J
、 Org、 Chem、旦=245−250(1973)およびItakur
a等、 Can、 J、 Chem。
51 : 5649−5651(1973)により記載される通り、一般に安価
でかつ安定であるところの適当なブロック化ホスフェート−トリエステル中間体
の付加による。ホスフィツト−トリエステN法は、LetaingerおよびL
un5fordLと、艷3.影じ、旦:5655(1975) により記載さ
れる通り、いくらかより複雑であるが、一般にホスフェート トリエステN法/
法より高収量を供給する。ホスフィツト−トリエステN法の有用性は、当初用い
られたリン−クロロダイト中間体よりもより安定なN、N−ジアルキルアミノ
ホスフィツト(アミダイト)の便用によって大いに向上しt0ホスフィツト−ト
リエステN法は各ヌクレオチド付加でより高い収量が故によく好まれる一方、ホ
スフェート−トリエステN法もまた自動操作のポリヌクレオチド合成に適する。
ポリヌクレオチドを合成するのに使用できる反応器系のうち、密ベッドカラム、
疎ベッドカラム、またはバッチ反応器のいずれか全使用する固相反応器系がある
。密ベッドカラムは固相支持材で密に充填されておりそして反応体は単一の通路
中にまたは再循環流により導入される。
疎ベッドカラムはこれら間層1t一部分的に緩和するように導入されてきた。反
応体tカラムにゆっくりと通すこと罠より、より高い質量移動速度が達成されそ
して高価な反応体の利用が改良される。ま九、固相充填にそこを通る流れ分布を
一様にするように転するので、チャンネル化に減少する。
バッチ反応器においては、支持体マトリックスは密封容器中に入れられる。反応
体は導入されそして容器内容物は、象徴的には不活性ガスを反応器中の液体に通
し泡立てることにより、攪拌される。かかる系は反応器中の保持時間を増すこと
により反応体の大変有効な利用を提供できる反面、相対的に大容量の反応体およ
び溶媒が反応器を満たすのに必要とされる・
Urdea等は、米国特許第4517438号において、個々のヌクレオチドを
ヌクレオチド鎖に所定の順序で加えることにより分散された固相支持体に付着さ
れた線形ポリマー分子の逐次修飾のための方法および系を開示する。
分散さ九た固相支持体は試薬の導入と除去のための接近部位を備えた反応器帯域
の中に保持される。試薬は少くとも一つの接近部位全通して試薬マニホールドに
より反応器帯域に選択的に配給さnる。
選択さnたヌクレオチド配列?プログラム通りに合成するための別の装置は、Z
elinka等、米国特許第4598049号に記載されて^る。
5−アザシトシン デオキシリボヌクレオシドのトリアジン環のよく知られ九と
ころの不安定性に、上述の自動操作のD N A−&成に2いて薄条ブロックと
しての使用を不適当なものにする。この欠点にも拘らず、5−アザシトシン残基
金含有する−12工び二1ストランドのDN人フラグメントの合成における利益
はこの薬の作用機構の理解において1喪なゴールt−S成する。生存細胞におけ
る5−アザシトシンのDNA組入れflDNAメチラーゼ活性の抑制およびこれ
に続く遺伝子活性化に関連してきた。
5−アザシトシン残基のDNA組入れと遺伝子活性化の間に存在する関係に十分
に確立されているので、それは、この非天然塩it金含有るオリゴヌクレオチド
フラグメントの合成のための方法論全発展させるのに役立つであろう。これら
修飾オリゴヌクレオチドは、翫6−シヒドロー5−アザシトシン残基と5−7ザ
シトシン残基ヲ特異部位に含むものであるが、選択的な遺伝子活性化の機構およ
びこれらトリアジン塩基の存在とDNAメチル化の抑制との[5に存在する関係
を解明するための道具として役立つであろう。DNA合成において2′−デオキ
シ−5−アザ−シチジンのホスホラミダイトの直接組入れは、2′−デオキシ−
5−アザ−シチジンが酸またはアルカリ条件に極端に鋭敏であるので、失敗に帰
するであろう。
発 明 の 要 約
本発明の目的は、上記に述べ友ような従来技術の欠点を克服することにある。
本発明の別の目的は、翫6−シヒドロー5−アザシトシン塩基または5−アザ7
トシン塩基のいずれかを配列の特異部位に含む修飾オリゴヌクレオチドの合成方
法を提供することにある。
1 本発明のもう一つの目的は、翫6−シヒドロー5−アザシトシンおよび5−
アザシトシン塩基の組入れを達成するDNAの自動操作合成用の試薬を提供する
ことKあるO
また本発明の目的は、オリゴヌクレオチド構造におい)て翫6−シヒドロー5−
7ザーシトシンt5−7ザシトシンに変換する方法を提供することにある。
さらに本発明の別の目的は、選択的な遺伝子活性化の機構全研究するのに使用す
るための化合物を提供することにある。
+ DNA合成において2′−デオキシ−ジヒドロ−5−アザ−シチジンのホ
スホラミダイトの使用は、それがDNA合成に用いる全ての化学的段階と全体的
に適合するので、所望のインターヌクレオチド結合の満足な形成という結果とな
プそして修飾DNAフラグメントの合成を可能にする。合成の最後に2いて、大
変特異的でかつ容易に行われる酸化が、所望の5−アザ−シトシン部分を生せし
める。5−アザシトシン ヌクレオシドにおいてトリアジン環の加水分解不安定
性は十分よく文献に示されているので、5−アザシドシンデオキクリボースの慣
用のホスホラミダイト誘導体、化合物10使用は、それが合成の脱保護段階のう
ちにトリアジン環の塩基触媒開裂の結果となろうから、非芙用的である。本発明
の方法は、オリゴヌクレオチドの合成の終了の漫所望の5−アザシトシン塩基の
再生成を可能にする5−7ザシトンンデオ中シリボースの安定なホスホラミダイ
ト前駆体と使用することによりこの問題を克服するものである。
保護され几5,6−シヒドロー5−アザシチジン ホスホラミダイト(S、 6
− dihydro−5−azacytidine phospho−rami
dite )、化合物9は、七の親ヌクレオシドと同様、大変安定なトリアジン
環t−有する。
本発明による反応は次の反応図式において示す。
図 式 I
K RIIR’ =8 i(CHMe、 )、 081(CHMe、 )、 R
F”RF”H6、FUN =8i(CHMe、)、 08i(CHMe、)、
R”8番;Me、CHCO
a)2.z当量−5−シクロロー−t45−テトライソプロピルジシロキテン、
ピリジン室温 1時間97 * b) 8当量u NaBH4、T)lF、
室温1時間yasc)I−8当量塩化インブチリル、ピリジン/クロロホルム、
O’ li 、 MeOH,室温16時間84%、d)i、40当量グリオキ
プール、ピリジン。
室温乾燥1元3回0.クロロホルム/水抽出e) 2当量塩化インブチリル、ピ
リジン、室温2時間619G、 f)1.2当量 フッ化テトラブチルアンモニ
ウム、 Ti(F、室温り時間60%、g)t2当量塩化44′−ジメトキシト
リチル。
ピリジン、室温2時間50チ、h)2.2当量クロロ−N、 N−ジイソプロピ
ルアミノ メトキシホスフィン4.2当量テトラゾール、クロロホルム室温15
分71憾図式1は5−アザ−シトシンデオキシリボースより出発する5−アザシ
チジンホスホラミダイトの合成の概略を示す。L5−ジクロロ−LL15−テト
ライングロビルジ70キ丈ン金用いた保護、続いて化合物2の水素化ホウ素還元
により、所望のジヒドロ類似体、化合物5を、酢醗メチル中の5僑メタノールを
用いたシリカゲルフラッジ島 クロマトグラフィーによる精製の後に与えた。
化合物3の H−NM几スペクトルは新たに生成し九〇−6メチレンプロトンf
L40 ppmを中心としたAB四重線として示す。その後化合物3の環側鎖
アミノ基をインブチルアミド、化合物4、として保護しそしてヘキサン中の50
96酢醗エチルを用いたシリカゲルフラッフ& クロマトグラフィーにより精製
した。トリアジン環の完全な保護はビス(インブチリルオキシ)エチレン轟の導
入により達成し、2′−デオキシグアノクンについても同様の方法により行なっ
た。しかして、化合物4とグリオキテールの反応より単離された、中間体ジオー
ル、化合物5を塩化ジブチリルと反応させ℃化合物6を与え、これをへキサン中
の15%酢酸エチルを用いたシリカゲルフラッシェクロマトグラフィーにより精
製し九。フッ化テトラブチルアンモニウム全用^た化合物6中のテトライソグロ
ピルジシロキサンゑの除去により、塩化メチレン/水中の簡単な抽出に続いて、
化合物7會与え友。5′−ヒドロキシル基の保護を、塩化44′−ジメトキシト
リチルを用いた標準的手順により完了して化合物8t−結晶性固体として得た。
融点89−91°C(ヘキサン)・最後に、クロロ−N、N’−ジインブロビル
アミノメトキ7ホスフィットv用い良化合物8のホスフィチル化により、ヘキサ
ン中の25憾酢酸エチルを用い九シリカゲルフラッシエクロマトグラフィーによ
る精製の後に、所望のホスホラミダイト、化合物9を白色固体、融点67−69
℃として与えた。
新規なホスホラミダイト、化合物9の反応性を初めに、DNA合成に用いる標準
条件の下、図式2に示されるように、典型的な、3’−0−アセチル−チミジン
とのテトラゾール触媒の縮合反応において試験した。15分後に、反応は完了し
、セして即その場で酸化して定量される収量の、完全に保護された二量体、化合
物11vi−与えた。
トリクロロ酢11に用いたジメトキシトリチル基の除去、そして濃厚水酸化アン
モニウムを用いた残基の更なる処理により完全にブロック化した二量体、化合物
12Q得た。
図 式 2
a)1.5当量ホスホラミダイト9,5当量テトラゾール、MeCN、室温、1
5分、b)−iつ素3s;水2*:2,6−ルチジン2憾、THF93慢:室温
10分e c)ジクロロメタン中の2鳴トリクロロ酢酸、室温、10分、
d)濃縮NH40)L 50’ 、 15時間、 e)1.250当量ビス(
トリメチルシリル)−トリフルオロアセトアミド、MeCN、還流、1時間−1
水中の50−メタノール、室温、1時間。
新試薬全試験するために、位置3および6のシトシン塩基が翫6−シヒドロー5
−アザシトクン部分により置換された二個のデカ−r −f Applied
Biosystems mode1380人の自動操作DN五人合成器中合成し
た。トリチル分析資料に基づき、1段階毎の収率はそれぞれ、9&5慢および9
a4僑であり、非修飾デカマーについての99.09嘩と対比される。
ジヒドロトリアジン塩基の芳香族トリアジンへの最後の変換は、ビス(トリメチ
ルシリ/L/)トリフルオロ−アセトアミド(BSTE人)および塩化トリメチ
ルシリル全フリル化試薬として、そして退散化トリメチルシリルt−酸化試薬と
して使用することにより満足になし遂げた。形質転換のために二量体化合物12
t−原型として使用しそして生じる二量体1st定量される収量で生成した。
図面の簡単な説明
第1図は醸イオンFAB質量スペクトル計により得られ九二量体12のフラグメ
ント化パターンを相対強度灯m/zでプロットして示す・
第2図は5′−末端標識とポリアクリルアミドゲル電気泳動の後に得られ九合成
オリゴヌクレオチドのオートラジオグラフィーを示す。
レーン1 : (CA)3.ヘキテマー標識体レーン2. (AT)4.オク
タマー標識体レーンs、 TACGTCGCAG、親デカマーv −y 4
、 TAXGTCGCAG、s−修飾デカマーv −y 5 、 TACGT
XGCAG、 6− 修飾テカマーX−\6−シヒドロー5−アザシチジン・
発明の詳細な説明
詳細な反応図式は次の通りに示される。
図 式 5
%式%
本発明に従うホスホラミダイトの合成ハ2′−デオキクよりなし遂けた。化合物
4とグリオキザールの反応により、無水ピリジン中塩化インブチリルによる環化
中間体の処理に続いて、ヘキサン中154酢酸エチル金用いたシリカゲルカラム
クロマトグラフィーによる精製の後化合物6を与えた。化合物6全泡体として6
1鳴収率で単離した@
図式5に参照されるように、室温にてTHF中でフッ化テトラブチルアンモニウ
ムを用いて糖テトラインプロピル・ノシロキサン保護基金除去することにより化
合物7を製造した。反応混合物を還元乾固し水と塩化メチレンに配分した後この
化合物を塩化メチレン中よシ簡単な抽出によりmaして化合物7を泡体として5
9憾収率で与えた。
DNA合成に必要とされるところの、5′−ヒドロキシ基の選択的保護ヲ、乾燥
ピリジン中塩化44′−ジメトキシトリチル全使用した標)的な手1祇によりな
し遂げて、化合物8を50−収$で結晶性固体として得た。融点89−91℃。
図式bn、Jインプロピルアミンの存在下塩化メチレン中クロロ(ジイソプロピ
ルアミノ)メトキシ ホスフィンによる化合@8のホスフィチル化により、ヘキ
サン中の25チ酢酸エチルを用いたシリカゲル カラムクロマトグラフィーによ
る精製の後に71チ収率の化合物9tガラス状物質として与えたことを示すO
本発明のホスホラミダイト、化合物9HDNAi合成するために特徴的な縮合灰
石に便用した。
図式7に示されるように、Pf 1eidererお工びSchwar!(Te
trahedron Leiters、 25: 5515.1984 )の手
順1c従って、ホスホラミダイトt−アセトニトリル中縮合触媒としてテトラゾ
ールの存在下でS′−〇−アセチルチミジン、化合物10と混合した。薄層クロ
1トグラフィーニラ5分後に反応完了を示し、七し℃二量体生M、物t−eたち
にその場でヨウ素、ルチジン、THFおよび水の混合物により酸化して、定量さ
れる収量の完全保護された二量体ホスフェート、化合物11i与えた。ジクロロ
メタン中トリクロロ酢酸によるこの二量体溶液の処理によりジメトキシトリチル
基を除去し、セして、図式8に示されるように、濃厚水酸化アンモニウムにより
55℃で15時間の間残渣?処理すると、十分に脱ブロックされた目的二を体を
漫た。脱ブロツク化二量体の分析状料金、J、T。
Baker C−18シリカゲル上、40マイyoメーター、水中5曝メタノー
ルの逆相クロマトグラフィーの役得、セして第1図に示すように、FAB/M8
は予測の構造と一致していた。
最後に、ジヒドロ−5−アザシチジン含有の二量体、化合物12を無水アセトニ
トリル中で懸濁させそして、図式9に示すように、過剰量のビス(トリメデルシ
リル)トリフルオロ アセトアミド、塩化トリメチルシリルおよび過酸化トリメ
チルシリルで還流下、−夜中処理したO質量スペクトル計においてm/z531
にてM−Hピークが優勢であることより評価されるように、5−7ザクチジンへ
の酸化が定量的に起きた。仕上けは大変簡単であり揮発性溶媒と試薬の蒸発、そ
して残りの酸素と窒素全シリコン結合より脱ブロックする几めの水による残留物
の処理が含まれる。水溶液の凍結乾燥により所望の二重体、化合物15を得た。
新試薬のM剛性全試験するために、第2図において、レーン4および5で示され
る二つの二量体は、位置52よび6でシトシン塩基が\6−シヒドロー5−アザ
シトシン部分により置換されている本のだが、AppliedBiosyste
ms model 580人自動操作DNA合底器中で合成し友。トリチル分析
資料に基づいて、1段階毎の収率は夫々、9a5嘔および9&4鴫であシ、非修
飾デカマーについての99.09唾と対比される(第2図、レーン3)。
本発明はある特定の実施態様に関して以上記載されているが、多くの変法が可能
であり、かつ別の材料および試薬を本発明から離れることなく使用することがで
きると理解さt″L九い。ある場合において七のような変法および置換にいくつ
かの実験全必要とさnるが、それらは日常的な試験のみが含まnるであろう。
特定の実施態様についての上述の記載は、本発明の一般的性實を十分く表わして
いるので、現今の細織全適用することにより、誰もがかかる特定の実施態様を包
括的概念から離ルずに種々の用途のために容易に変更および/ま7td適合させ
ることができるであろう。そして従りて、かかる適合および変更は開示された実
施態様の均等物の定義および範囲の甲に包含されること全意味する。
ここにおける表現法および用語に記載の几めの本のであり制限されるものではな
いと理解すべきである。
耶 鵞壓郷
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)修飾DNAの合成に使用するのに適する5,6−ジヒドロ−5−アザシチ ジンホスホラミダイト・(2)5−アザーシトシンデオキシリボースを、シロキ サンで保護すること、 保護された5−アザーシトシン−デオキシリボースを還元すること、 還元、保護された5−アザーシトシンデオキシリボースの環側鎖アミノ基とトリ アジン環を保護すること、 シロキサン基を除去しそして保護された5−アザーシトシン−デオキシリボース のヒドロキシル基を保護すること、 生じた化合物をホスフィチル化して5−アザシトシンホスホラミダイトを生成す ること、 よりなる5,6−ジヒドロ−5−アザシチジンホスホラミダイトの製造方法。 (3)シロキサンが1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピルジ シロキサンである請求項2記載の方法。 (4)環側鎖アミノ基をイソブチリルアミドとして保護する請求項2記載の方法 。 (5)ビス(イソブチリルオキシ)エチレン基を導入することによりトリアジン 環を保護する請求項2記載の方法。 (6)3′−O−アセチルチミジンを5,6−ジヒドロ−5−アザシトシンホス ホラミダイトと反応させることよりなる二量体オリゴヌクレオチドの製造のため の縮合反応。 (7)5,6−ジヒドロ−5−アザシチジンホスホラミダイトを5,6−ジヒド ロ−5−アザシトシン残基および5−アザシトシン残基として使用することより なるDNAフラグメントの合成方法。 (8)オリゴヌクレオチドにおいて5,6−ジヒドロ−5−アザシトシン残基を 5−アザシトシン残基に変換するための酸化方法。 (9)前記5,6−ジヒドロ−5−アザシトシン残基は、ビス(トリメチルシリ ル)トリフルオロアセトアミドおよび塩化トリメチルシリルよりなる群から選択 された少くとも一種のシリル化剤を使用してシリル化により生成し、そしてオリ ゴヌクレオチド中の前記5−アザシトシン残基を生成するように過酸化トリメチ ルシリルとの反応により酸化される請求項8記載の方法。
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