JPH05503715A - オリゴヌクレオチド合成の方法および手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド合成の方法および手段本発明は、一般的にはオリゴヌクレオ チドの合成に関し、さらに詳しくは、オリゴヌクレオチドの合成、脱保護および 精製をより容易かつ効果的にすることが可能な、固体支持体への最初のヌクレオ シドの結合のための新規な改良方法に関する。

オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレ オシド（Ｄ　Ｎ　Ａ　）ホスフェートのポリ縮合によって構築されるポリマーで ある。合成オリゴヌクレオチドの利用は、分子生物学の研究に革命をもたらすこ とになったのである。合成オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、固相法を 用いたヌクレオチドモノマーの反復添加によって組み立てられる（引用文献４） 。Ｉｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる固相合成法の導入（引用文献５）以来、以下の要 求が処理されてきた。すなわち、（１）固体支持体は、用いられる溶媒に不溶で あり、好ましくはその中で膨潤するものであってはならない。（２）固体支持体 上の官能基は、最初のヌクレオシドを再現性よく共有結合するものでなければな らない。（３）固体支持体は、合成および脱保護時に用いられるすべての試剤に 対して化学的に不活性でなければらない。

多数の材料がこれまで試験されてきたが、現在量も一般的に使用されているもの は、制御された多孔性ガラスピーズ（ＣＰＧ）、シリカまたはポリスチレンビー ズである（引用文献４）。

最初の５′−保護ヌクレオシドは、その３′−ヒドロキシル官能基によりアルキ ルアミンスペーサーを介して支持体に結合させられる。これは通常、保護された ヌクレオシド３′−コハク酸エステルを支持体に結合したアルキルアミンと縮合 させることによって行われる（図１参照）。

これは４つの異なる支持体、すなわち各ヌクレオシド（Ａ、Ｃ，Ｇ、Ｔ）につい ての支持体が用いられることを意味する。現在オリゴヌクレオチドの合成は、は とんどが専ら完全に自動化された装置、いわゆる「シーンマシーン」を用いて行 われている。

固体支持体上での成長鎖へのヌクレオチドモノマーの付加を、ホスホラミダイト 法（引用文献６〜８）を用いて行うのに必要な工程は、以下に記載するように通 常用いられる合成サイクルとして要約することができる（図２参照）。他の方法 は主として、リン酸残基の性質が異なるもので、たとえばホスホトリエステル法 （引用文献１１）　、　Ｈ−ホスホネート法（引用文献９〜１０）がある。

１、　母体ヒドロキシル官能基を生成させるための５′−ヒドロキシル基の脱保 護。これは通常、支持体を有機溶媒中ジまたはトリクロロ酢酸で処理することに よって行われる（　ＤＭＴｒの除去）。

２、　痕跡の酸を除去するために支持体を洗浄する。

３．５′−ヒドロキシル基をアクティベーター（たとえばテトラゾール）の存在 下、適当に保護された新たに導入するヌクレオシド（Ａ、Ｃ，ＧまたはＴ）の３ ′−ホスホラミダイト残基と反応させ、３’　−５’−ホスファイトトリエステ ルを形成させる。

４、　適当な溶媒で洗浄して過剰の試剤を除去する。

５、　未反応５′−ヒドロキシル基をアセテートとしてブロックする（キャッピ ング）。

６、　キャッピング試剤を洗浄により除去する。

７、　ついで、ホスファイトトリエステルを相当するホスフェートトリエステル に酸化する。これは通常、ヨウ素水溶液を作用させて行われる。

８、　酸化試剤を洗浄により除去する。

この過程は、所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されるまで反復される。各サ イクル間は、工程３においてカップリングのために用いられるヌクレオチドモノ マーのみが相違する。

この過程の効率はきわめて高い。多（の場合、９９％以上のカップリング効率が 達成される。ポリマーに支持された反複合成に伴う固有の問題点は、合成時に使 用される各種試剤に対する成長オリゴヌクレオチド鎖の安定性である。とくに面 倒な問題点はデオキシアデノシンの酸で触媒された脱プリン化の問題であり（引 用文献１２）、またそれほどでもないが、５′−保護基の除去時（脱トリチル化 ）におけるデオキシグアノシン単位の問題がある。

この過程では複素環塩基とデオキシリボース単位間の結合が切断される。

合成後、すべての保護基が除去され、オリゴヌクレオチドが固体支持体から切断 される（引用文献１）。これは通常、濃アンモニア水溶液中、５０〜６０℃で数 時間加熱することによって行われる。この処理時に、鎖は脱プリン化の場所で切 断され、その結果、短い配列が生成することになる。これが以後の精製時に重大 な問題を引き起こすことになる。オリゴヌクレオチドの精製は様々な方法で行わ れるが、主として電気泳動およびクロマトグラフィーが用いられる。イオン交換 （ＩＥＸ）および逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の両者が、この過程におい て、強力な武器となる。ＲＰＣには、２つの基本的な別法、すなわちトリチル− オンクロマトグラフィーおよびトリチル−オフクロマトグラフィーがある。第一 の場合は、５′−保護基（ＤｉｌＴｒ）は、組み立てが終了するまでそのまま残 される。それは脱保護時および精製に使用される条件下で安定である。オリゴヌ クレオチドに比較して著しく疎水性である芳香環システムによるものであり、し たがってそれはＲＰＣ精製時に疎水性ハンドルとして使用することができる。Ｄ ｌｌＴｒをもつ生成物はＤｌｉＴｒをもたない相当する生成物に比べて、はるか に高濃度の有機モディファイア−（Ｃ［１３ＣＮまたはエタノール）で溶出され る。残念ながら、生成混合物中には同じ（ＤＩＩＴｒをもつ短いフラグメントが 常に存在する。これらは、上述のように脱プリン化の時点での鎖の切断の結果と して、また脱保護時におけるランダムな鎖の切断の結果として形成される。

ＤｌｌＴｒをもつこれらの短いフラグメントがＲＰＣクロマトグラフィー上トジ トリチルいた精製時に問題を生じるのである。

勾配を形成させることができるクロマトグラフィー系を用いることによって、長 さが少なくとも１００塩基の配列については、純粋な生成物を得ることができる 。生成物の分画を集め酢酸で処理することによりＤｌｌＴｒ基を除去できる。

本発明は脱保護条件では安定であるが、特異的な試剤で切断できる、固体支持体 への最初のヌクレオシドの結合を形成させる新規な方法に関する。この場合、脱 保護時に形成されたＤＩＩＴｒをもつ短いフラグメントはすべて、ＤｉｌＴｒを 同様に有する完全長の生成物はまだ固定化されたままである間に、支持体を洗浄 することで容易に除去されるが、固体支持体から切断した後、生成物はきわめて 簡単にＲＰＣで精製される。

本発明は、とくにオリゴヌクレオチドの合成に有用な独特の固体支持体系を提供 するものである。詳しくは本発明の系は、最初のヌクレオシドを固体支持体に結 合させる、その独特な方法に特徴がある。支持体への連結の安定性は、その過程 に使用されるすべての試剤に対してのもので、合成の場合のみでなく脱保護に対 しても安定である。しかもそれは、きわめて特異的な試剤の使用によって切断で きる。母体３′−ヒドロキシ化合物はその過程の中で形成される。本発明の系は 、いくつかの点で独特である。それはオリゴヌクレオチドの合成にきわめて効率 的な系であるばかりか、トリチル−オン逆相クロマトグラフィーによる精製過程 を著しく単純化する。精製が単純化した理由は、トリチル−オンＲＰＣ精製の観 点で最も困難な夾雑物質（ＤＩＩＴｒをもつ短いフラグメント）が脱保護工程で 固体支持体から切断されることによるものである。完全長の生成物（同じ＜　Ｄ ＩＴｒをもつ）は支持体に繋留されているから、これらの夾雑物質は単純な洗浄 操作で除去できる。精製過程は、この場合ＤＭＴｒをもつ完全長の生成物からの ＤＩＩＴｒをもたないフラグメントの分離の場合と同程度までに単純化されるこ とになる。これは使い捨てのＲＰＣキャリッジと緩衝剤からなるきわめて簡単な 積項のクロマトグラフィー装置を用いて達成できる。これは慣用の支持体系を用 いる場合に複雑なりロマトグラフィー装置を要するのと対照的である。新しい支 持体系の使用はまた、精製工程の実施に必要な時間を著しく短縮することになる 。本発明は従来知られている支持体系に比べて、はるかに高い多用途性を示すも のである。この系は現在利用されているすべてのオリゴヌクレオチド合成方法に （ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれにも）適合が可能である。まだ支持体に繋留され ている間にオリゴヌクレオチドを完全に脱保護することも可能になる。

固定化されたオリゴヌクレオチドを有する支持体は、その形態でハイブリダイゼ ーションアフィニティーマトリックスとして使用できる。このような支持体の応 用には、たとえばｍＲＮＡの精製、固相ｃＤＮＡ合成、ＤＮＡ結合蛋白質の精製 、プラスミドのアフィニティー精製があり、また遺伝子アッセンブリー（オリゴ ヌクレオチドから）に対する支持体としての利用等が考えられる。

最初のヌクレオシドと支持体の間の連結は、すべての合成ならびに緩和な酸（Ｔ ＣＡ／　ＯＣＡでの脱トリチル化）および緩和な塩基（アンモニアによる脱保護 ）の両者を含む脱保護試剤に対して完全に安定であるが、オリゴヌクレオチドに 影響することなく選択的に切断することができる。この過程は実質的に定量的に 進行する。

本発明の固体支持体系は、固体支持体とこの支持体に共有結合したヌクレオシド からなり、この場合ヌクレオシドはテトラアルキルアンモニウムフルオリド（裸 のフルオリトイオン）の作用によって支持体から選択的に切断することができる 。

本発明の新規な支持体系においては、最初のヌクレオシドはシリルエーテル結合 を介して支持体に結合され、この系は好ましくは次式（１）によって表される。

Ｘ ■ ■ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり、Ｒ２はＨ，Ｏ ■またはＯＲｓ　（Ｒｓは保護基である）であり、Ｒ１は保護基であり、Ｒ１お よびＲ４は別個にそれぞれアルキル、アリール、シクロアルキル、アルケニル、 アラールキル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、了り−ルオキシ、シ クロアルキルオキシ、アルケニルオキシおよびアラールキルオキシであり、Ｘは 支持体への共有結合に使用される撃留基であって、アルキル、アリール、シクロ アルキル、アルケニル、アラールキル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキ シ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキル オキシおよびシクロアルキルアルキルオキシによって提供され、Ｓは固体支持体 である。Ｒ３、Ｒ４およびｘ−８全体で最大限１個が、アルキルオキシ、アリー ルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキルオキシおよ びシクロアルキルアルキルオキシである。好ましい系においては、Ｒ１がトリチ ル、モノメトキシトリチル、ジメトキントリチルまたはビキンルであり、基Ｂは 好ましくはアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンまたはイノシンで ある。また、Ｒ８、Ｒ４およびｘ−８の１個が三級アルキルまたは三級アルキル オキシ基、と（に１０個以下の炭素原子を有する基である系が好ましい。Ｒ３、 Ｒ４およびＸ−８の他の２個はアルキル、アリール、アルキルオキシまたはアリ ールオキシであることが好ましい。

本発明のオリゴヌクレオチド合成法は、（ａ）固体支持体の選択、（ｂ）式１の シリルエーテルを介しての最初のヌクレオシドの結合、（ｃ）固体支持体上の過 剰の反応性基の遮断、（ｄ）支持体上の最初のヌクレオシドへのヌクレチドの縮 合によるオリゴヌクレオチドの合成、（ｅ）　５’−保護基たとえば５′−ジメ トキシトリチル基を除く、オリゴヌクレオチド上のすべての保護基の除去、およ び酸で触媒された脱保護時に形成された非プリン部位の切断、（ｆ）たとえばテ トラアルキルアンモニウムフルオリドまたはヒドロキシドとの反応による支持体 からのオリゴヌクレオチドの選択的切断、ならびに（ｇ）　５’−保護基をアフ ィニティーハンドルとして用いる逆相クロマトグラフィーによるオリゴヌクレオ チドの精製、からなる。

すなわち本発明は、便利で用途の広い、オリゴヌクレオチドの合成および精製を 可能にする独特な固体支持体系を提供するものである。それは固体支持体と、そ れにシリコン置換基の一つを介して共有結合するシリル化ヌクレオシドからなる 。

この固体支持体系の開発はきわめて有意義である。それはオリゴヌクレオチドの 便利な合成を可能にし、完全長生成物の精製を容易にする。合成時の酸で触媒さ れた脱プリン化の結果として形成される夾雑物質は、生成物がまだ支持体に撃留 された状態で除去されるので、精製は簡単になる。この除去は合成の完了後にオ リゴヌクレオチドの様々な官能基を保護するすべての基が除去される際の脱保護 工程で起こる。生成物はこの段階で、テトラアルキルアンモニウムフルオリドま たはヒドロキシドの作用により、選択的に切断され、単純なＲＰＣカートリッジ 上クロマトグラフィーで精製することができる。

さらに、この固体支持体系はさらに、支持体上に合成された配列に相補性のＤＮ ＡまたはＲＮＡの固定化を促進するためにも使用できる。この固体支持体系には アフィニティーマトリックスの観点からの様々な応用が可能なことは、本技術分 野の熟練者には明白であろう。

本発明の方法における支持体としては、広範囲の多孔性および非多孔性の固体支 持体が使用できる。好ましい支持体群には有機および無機物質が包含され、たと えばポリスチレン、架橋ポリスチレン、シリカ、多糖、架橋多糖および各種のガ ラスが包含される。

固体支持体はもちろん、オリゴヌクレオチドの合成および脱保護に使用される条 件下に安定でなければならない。それらはヌクレオシドシリルエーテルの、シリ コン置換基の一つを介した共有結合の実現に必要な反応性基を含有するように誘 導化される。この目的で使用できる反応性基には、たとえばヒドロキシル、カル ボキシル、アミノおよびチオール基がある。支持体上のヒドロキシル基は、誘導 化ヌクレオシドのクロロンラン官能基と反応させることができる。また、支持体 はアミノ基で誘導化し、これを誘導化ヌクレオシドのシリコン置換基の一つのカ ルボキシルまたはエポキシ基と反応させることができる。シリル化ヌクレオシド をシリコン置換基の一つを介して支持体に結合させるには、他に多くの方法があ る。これらについては本技術分野の通常の熟練者であれば容易に実現が可能であ ろう。固体支持体系をオリゴヌクレオチドの合成に使用する前に支持体およびヌ クレオシド上の反応性基は遮断しなければならない。これは合成時の副反応を回 避するために重要である。ヌクレオシドの場合は、これは環外性アミンをアミン またはアミジンに、５′−ヒドロキシル基を相当するジメトキシトリエステルに 変換することによって容易に達成される。支持体上の反応性基の遮断は使用され る支持体に依存し、本技術分野の通常の熟練者には明白であろう。

本発明の固体支持体系には多くの実施態様がある。しかしながら、これらにはす べてに共通の特徴がある。それは最初の塩基と固体支持体の間に、次式（１）に よって表されるように、テトラアルキルアンモニウムフルオリド（またはそれら の既知の均等化合物）によって切断可能なシリルエーテルの結合を有することで ある。

式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり、Ｒ２はＨ，０ １１または０Ｒ５（Ｒ，は保護基である）であり、Ｒ１は保護基であり、Ｒ８お よびＲ１は別個にそれぞれアルキル、アリール、シクロアルキル、アルケニル、 アラールキル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、アリールオキシ、シ クロアルキルオキシ、アルケニルオキシおよびアラールキルオキシであり、Ｘは 支持体への共有結合に使用される撃留基であって、アルキル、アリール、シクロ アルキル、アルケニル、アラールキル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキ シ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキル オキシおよびシクロアルキルアルキルオキシによって提供され、Ｓは固体支持体 である。Ｒ３、Ｒ４およびＸ−８全体で最大限１個が、アルキルオキシ、アリー ルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキルオキシおよ びシクロアルキルアルキルオキシである。好ましい系は、１がトリチル、モノメ トキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはビキシルであり、基Ｂは好ましくは アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。Ｒ３ 、Ｒ４およびＸ−８の１個が三級アルキルまたは三級アルキルオキシ基である系 も好ましい。Ｒ３、Ｒ４およびＸ−８の他の２個はアルキル、アリール、アルキ ルオキシまたはアリールオキシであることが好ましい。本発明の好ましい系は以 下の系によって例示されるが、これらに限定されるものではない。

本発明を次に以下の実施例によって例示する。

実施例１ ５′−〇−ジメトキシトリチルー３’−０−（三級ブチル−４−グリシドキシフ ェニル−フェニル）シリル−２′−デオキシチミジンの合成およびアミノ基で誘 導化された固体支持体へのその結合 ４−ブｏ　モア　ｚ　ニル−アリルエーテル（４，２６９，２０ｍｍｏｌ）を窒 素気相下に１．２−ジメトキシエタン（４０菖ｌ）に溶解した。混合物を一７８ ℃に冷却しくドライアイス／エタノール）、ブチルリチウム（ヘキサン中１．６ Ｍ　、　２０ａ＋ｍｏｌ）を、乾燥窒素でブチルリチウムボトルを加圧すること によって撹拌しながら添加した。添加直後に白色の沈殿が生成した（４−リチオ −フェニル−アリル−エーテル）。３０分後にｔ−ブチル−フェニル−ジクロロ シラン（４，６６９゜２０■ｏｌ）を加え、混合物の温度を徐々に室温まで上昇 させた。得られた混合物を、乾燥硫酸ナトリウム上で濾過しく塩化リチウムの除 去）、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。得られた油状物を分別蒸留し て精製した。沸点１４７〜１５５℃（ｌ　ｍｍ［１ｇ）　、収量：　１．８８９ （３８％）。

５′−〇−ジメトキシトリチルー３’−０−（アリルオキシフェニル−ｔ−ブチ ル−フェニル）シリル−２′−デオキシチミジン（２） ５′−〇−ジメトキシトリチルー２−デオキシチミジン（１，０９９，２，０ｍ ｍｏｌ）およびイミダゾール（０，２７ｇ、　４．０ｎＩＩＩＩＯ１）を、乾燥 ピリジン（１０ｍＪ）と２回共蒸留した。混合物をついで乾燥ピリジン（２５ｍ Ａ’）に溶解した。モノクロロシラン（１，０９，３，０ｍ＊ｏｌ）を添加し反 応を５０℃で一夜進行させた。反応はＴＬＣ（）ルエン／酢酸エチル　１コ１） で追跡した。

反応混合物を蒸発乾固し、メチレンクロリドに溶解し、１０％炭酸水素ナトリウ ムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し蒸発させた。得られたシロップ をフラッシュクロマトグラフィーで精製した（１％ピリジン含有トルエン／酢酸 エチル　３：１）。収量：　１．５０　ｇ（８９，５％）。

５′−〇−ジメトキシトリチルー３’−０−（（ｐ−アリルオキシフェニル）− 三級プチル−フェニル）シリル−２′−デオキシチミジン（０，５０ｇ、　０． ６０＋＊ｍｏｌ）をりｏｏホルム（１０８／）に溶解した。撹拌した混合物に炭 酸水素ナトリウム（１００麿ｇ）、ついでｍ−クロロ過安息香酸（８５％、１２ ０ｚｑ、　０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。反応は室温で数日間進行させた。混合 物をクロロホルムで希釈し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム、０．５Ｍ炭酸水素ナト リウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し蒸発させた。

残留物をついでフラッシュクロマトグラフィーで精製した（１％ピリジン含有ト ルエン／酢酸エチル４：１）。

収量：立体異性体の混合物として５２ｍｇ（１０％）。

グリシジルエーテル（３）（１５り）をエタノール（６ｍ／）に溶解した。この 溶液をアミノ誘導化ポリスチレンビーズ（５００ｚｑ、　２００ｕｏｌ　ＮＨ２ ／ｇ）　ｉ：：添加シタ。：　のｓ濁液を４０℃で一夜振盪した。支持体を濾過 しエタノール（５０ｇ／）およびアセトニトリル（５０ｍＡ’）で洗浄した。

支持体をアセトニトリル（１０＋／）に懸濁しアセトニトリル（１０ｍ／）中４ −ジメチルアミノピリジン（３％嘗／Ｖ）、無水酢酸（１０％ｖ／ｖ）およびｓ ｙ■−コリジン（１５％Ｖ／Ｖ）の混合物を加えて支持体上の過剰の一級アミノ 基およびグリシジルエーテルのアミツリシスで生成した二級アミノ基を遮断した 。室温に３０分間装いた後、支持体をアセトニトリル、エタノールで洗浄しジエ チルエーテルで乾燥した。支持体からのジメトキシトリチルの放出が置換の程度 ５．７１℃ｍｏｌ／　ｇを指示した。

実施例２ ５′−〇−ジメトキシトリチルー３’−０−〔（ｐ−グリシドキシ−フェニル） 三級ブチル−メチル〕−シリルー２′−デオキシチミジンの合成およびアミノ基 で誘導化された固体支持体へのその結合 ４−ブロモフェニル−アリルエーテル（８，７Ｌ　４１ｍ＋１０１）を乾燥窒素 の気相下に乾燥１．２−ジメトキシエタン（１００ｍｌ）に溶解した。混合物を 一７８℃に冷却した（ドライアイス／エタノール）。ブチルリチウム（ヘキサン 中１．６Ｍ。

４０ｍ＊ｏｌ）を、乾燥窒素でブチルリチウムボトルを加圧することによって添 加した。添加直後に白色の沈殿が生成した（４−リチオ−フェニル−アリルエー テル）。３０分後に三級ブチル−メチルジクロロシランＣ３，４ｑ、　２０ｍ１ ｏｌ）を１．２−ジメトキシエタンに溶解して加えた。混合物の温度を徐々に室 温まで上昇させた。溶液を硫酸ナトリウム上で濾過し蒸発乾固した。残留物を分 別蒸留して精製して標記化合物（５）を得た。収量＋　４．２９、沸点９１〜９ ５℃。

５′−〇−ジメトキシトリチルー２−デオキシチミジン（１，０９，１，，８１ １０１）およびイミダゾール（２７０ｍ９．３．９１１１ａ０１．）を、乾燥ピ リジン（１０＊ｊりと２回共蒸留した。残留物をついで乾燥ピリジン（２５１１ ）に溶解し、モノクロロシラン（５）を添加した（０゜７３９．２．７ｍｍｏｌ ）。反応を５０℃で一夜進行させた。反応混合物を蒸発乾固し、メチレンクロリ ドに溶解し、炭酸水素ナトリウム（１０％）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥 し、濾過し蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィーで精製すると（１％ピリ ジン含有トルエン／酢酸エチル３：１）。（６）　０．２８９（１８％）が得ら れた。収量は精製前の蒸発時における５′〜ジメトキシトリチル基の喪失により 低かった（エバポレーター夾（ｐ−グリシドキシ−フェニル）メチル）シリル− ２′−デオキシチミジン（７） ５′−〇−ジメトキシトリチルー３’−０−ｒ（ｐ−アリルオキシフェニル）− １−ブチル−メチル〕シリルー２′−デオキシチミジン（５ｈｑ、　６４μ−ｍ ｏｌ）をクロロホルム（ｌ麿ｌ）に溶解した。炭酸水素ナトリウム＜１．１ｓｑ 、　１３０μ５ｉｏｌ）、およびｍ−クロロ過安息香酸（８５％、　１３ｍｐ、 　６４ｇｍｍｏｌ）を加えて、反応混合物を室温で数日間（週末）撹拌した。

反応混合物をクロロホルムで希釈し、水酸化ナトリウム（０，１Ｍ）で洗浄し、 炭酸水素ナトリウム（０，５Ｍ　）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し蒸発乾 固した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製すると（７）が立体異性 体の混合物として得られた。収量：４．６ｇ（９％）。

グリシジルエーテル（７）のアミノ基で誘導化された固体支持体（４）への結合 グリシジルエーテル に溶解させ、アミノ誘導化ポリスチレンビーズ（　１６２ｍｇ）に添加した。反 応は４０℃で一夜進行させた。支持体を濾過しエタノールおよびアセトニトリル で洗浄した。支持体をアセトニトリル（３ｇｊりに懸濁しアセトニトリル（３ｍ ｌ）中４ージメチルアミノピリジン（３％ｖ／ｖ）　、無水酢酸（１０％ｖ／ｖ ）およびコリジン（１５％ｖ／ｖ）の混合物を加えた。３０分間室温で振盪した 後、支持体を濾過し、アセトニトリル、エタノールで洗浄しジエチルエーテルで 乾燥した。支持体からのジメトキシトリチルの放出が置換の程度５．　Ｏｕ＋ｏ ｌ／　９を指示した。

実施例３ ５′−〇ージメトキシトリチルー３’−０−（三級ブチル−イミダゾリル−フェ ニル）−シリル−２′−デオキシチミジンの合成およびヒドロキシル基で誘導化 された固体支持体（９）へのその結合 ５′−〇ージメトキシトリチルー２ーデオキシチミジン（１００１１９．　０． １８１１１１１０１）およびイミダゾールＣ３５菖ｇ．　０．５＋ａ＋ｏｌ）を 乾燥ピリジン（　５　ｍｌ＞　と２回共蒸留した。残留物を乾燥ピリジン（２． 　０ｍＪ）に溶解した。ｔ−ブチル−フェニル−ジクロロシラン（３ｂｊ！．　 ０．１８＋ｕ＋ｏｌ）の添加後、反応は室温で２時間、ＴＬＣ（トルエン／酢酸 エチル　１：１）によって反応の完了が明らかになるまで進行させた。反応混合 物をヒドロキシル基で誘導化され、予めピリジンで洗浄されたポリスチレンビー ズ（５０（１＋ｇ）に添加した。反応混合物を一夜室温で振盪した。支持体を濾 過しピリジン、エタノールで洗浄しジエチルエーテルで乾燥した。

ついで、アセトニトリル（　４　ｆｆｉＡ’）中４ージメチルアミノピリジン（ ３％ｗ／ｖ）　、無水酢酸（１０％ｖ／ｖ）およびｓｙｍ−コリジン（５％Ｖ／ Ｖ）の混合物で処理した。室温に１５分間装いた後、支持体をアセトニトリル、 エタノールで洗浄しジエチルエーテルで乾燥した。支持体からのジメトキシトリ チルの放出が置換の程度２７１１■ｏ　ｌ　／　９を指示した。

実施例４ ５′−〇ージメトキシトリチルー３’−０−［三級ブチル−（３−クロロプロピ ル）〜フェニル］ーシリルー２′ーデオキシチミジンの合成およびアミノ基で誘 導化された固体支持体へのその結合 ３−クロロプロピル−メチル−ジクロロシラン（４，０諺！、　２５ｍｍｏｌ） を乾燥石油エーテル（２０ｔ／）に溶解し、０℃に冷却した。三級ブチルリチウ ム（ペンタン中１．７Ｍ　。

１５ｍ１．２５ａ＋ｍｏｌ）を、乾燥窒素気相下に添加した。添加後、反応混合 物の温度を室温まで上昇させた。１時間後に反応混合物を乾燥硫酸ナトリウム上 で濾過しく塩化リチウムの除去）蒸発させた。分別蒸留すると純粋な（１０）　 ３．９ｇ（７３％）が得られた。沸点６８〜７２℃（５■）。

５′−〇−ジメトキシトリチルー３’−０−［三級ブチル−（３−クロロプロピ ル）−メチル〕−シリルー２′−デオキシチミジン（１１） ５′−〇−ジメトキシトリチルー２−デオキシチミジン（５４５ｇｖ、１　ｓｍ ｏｌ）を、乾燥ピリジン（ＦＭ）と２回蒸留した。残留物を乾燥ピリジン（３ｍ ｌ）に溶解した。イミダゾール（１５０厘９．２．２■聰ｏ１）および三級ブチ ル−（３−クロロプロピル）−モノクロロンラン（２３露ｇ、　１１ｍ１ｏｌ） を添加し反応混合物を５０℃で一夜撹拌した。混合物を蒸発乾固し、フラッシュ クロマトグラフィーで精製すると（１％ピリジン含有トルエン／酢酸エチル３： １）、純粋な（１，１，）　０．５４９（７５％）が立体異性体の混合物として 得られた。

３−クロロプロピル−７リルエーテル（１１）のアミノ基誘導化固体支持体への 結合 ３−クロロプロピル−シリルエーテル（１１）　（１５り、　２０μｍｏ１）を 、触媒量のテトラｎ−ブチルアンモニウムヨーシト含有Ｎ、Ｎ−ジメチルホルム アミド（０，５ｔｌり　ｌ：　溶解シた。この溶液をアミノ基誘導化ポリスチレ ンビーズ（１００す）固体支持体に添加した。混合物を５０’Ｃで一夜振盪した 。支持体を濾過しＤＭＦ、メタノールで洗浄しジエチルエーテルで乾燥した。支 持体をついでアセトニトリル（４ｔｌ中）４−ジメチルアミノピリジン（３％Ｗ ／Ｖ）　、無水酢酸（１０％Ｖ／りおよびｓｙｍ−コリジン（１５％ｖ／ｖ）の 混合物で処理した。１５分間室温に置いた後、支持体を濾過しアセトニトリル、 エタノールで洗浄しジエチルエーテルで乾燥した。支持体からのジメトキシトリ チルの放出が置換の程度８μｓａｔ／ｇを指示した。

実施例５ 支持体（４）をＧｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ”　Ｐｌｕｇ　に使用するための 反応カラムに充填した。オリゴヌクレオチドはＰＡＣ−アミダイトを用い、標１ ！ｏ、２ｔｌｍｏＩ反応サイクルによって合成した。平均カップリング効率は各 サイクルの最初におけるジメトキシトリチルの放出によって判定して９９０〜９ ９．５％の範囲であった。５′末端におけるジメトキシトリチル基は合成の完結 後にも、そのまま残されていた。反応カラムをエツベンドルフ管に取り、３００ ０ｒｐｍで１〜２分間遠心分離して支持体を乾燥した。濃アンモニア（１，０Ｉ １１）を加え、管をもう一度遠心分離して、液体を反応カラムの内部に浸透させ た。管を７０℃に１０分間加熱した。反応カラムを第二の管に入れ遠心分離した 。アンモニア溶液を合わせて逆相カラムクロマトグラフィーによって分析した。

それは保護基に加えて、合成時に形成された非プリン部位の切断によって生じた 、ＤＭＴｒ基を有する短いオリゴマーを含有していた。カラムリアクターを水、 エタノールで洗浄しジエチルエーテルで乾燥した。

支持体からのオリゴヌクレオチドの切断は、ＤＭＦ中０．１ＭのＴＢＡＦ　（１ ，０鷹ｌ）により７０℃で３０分間、または１．０Ｍ水酸化ナトリウム（１，Ｔ ｏ／）中７０℃で１５分間処理して行った。

実施例６ 支持体（４）上で作成されたオリゴヌクレオチド（１８マー）のＤＩＦ中橿ＩＭ のＴＢＡＦで切断後の精製ＴＢＡＦ溶液（１，０ｔｌ）を予め０，５Ｍ塩化ナト リウムで平衡化した陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱゝ）に適用した。０５Ｍ塩 化ナトリウムで洗浄（テトラメチルアンモニウムイオンおよびＤＭＦの除去）し た後、オリゴヌクレオチド混合物を３．０Ｍ塩化ナトリウム（２，５ｔｌ＞で溶 出した。この混合物の一部を取り、逆相クロマトグラフィーで分析した。

精製は使い捨てＲＰＣカートリッジを用いて行い、次の工程からなる。

１、　オリゴヌクレオチドの負荷。

２、　０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７，０中アセトニトリル（１ ６，５％）で洗浄。これでＤｌｌＴｒをもたないすべての物質が除去される。

３、　水洗。

４．１％ＴＦ＾／Ｈ２０で４分間処理して５’　−ＤｌｌＴｒ基の除去。

５、　水洗。

６、　生成物を０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐロア、０中アセトニト リル（１６，５％）で溶出。

ついで精製された物質をＲＰＣで分析したところ、均一な精製物が得られた。

実施例７ 水酸化ナトリウム溶液の一部を直接、逆相クロマトグラフィーで分析した。５０ マーを使い捨てＲＰＣカートリッジ（実施例６参照）を用いて精製した。精製さ れた物質を逆相クロマトグラフィーで分析すると、はぼ均一な（〉９７％）生成 物が得られた。

引　用　文　献 １．　Ｒ，ｊ　Ｅｌｌｉｓ、　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、　３　（１９８６）１９５゜ ２、　Ｊ、１１．　Ｅｎｇｅｌｓ、　Ｅ、　Ｕｈｌｍａｎｎ、　Ａｎｇｅｖ、　 Ｃｈｅｗ、　Ｉｎｔ、　Ｅｄ。

Ｅｎｇｌ、　２８　（１９８９）　７１６゜３、　Ｇ、Ｚｏｎ、　Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　５（１９８８）　５３９゜４、１．Ｊ 、　Ｇａ１ｔ、　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　−ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＴＲＬ　ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒ ｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ。

５、　Ｒ，Ｂ、　１ｌｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｓ、　Ｃｈｅｃ　Ｓｏｃ 、　８５　（１９６３）２１４９゜ ６、　Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ、　ｉ［、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、　２２　（１９８１）　１８５９゜？、　Ｎ、Ｄ 、　５ｉｎｈａ、　Ｊ、　Ｂｉｅｒｎａｔ、　Ｈ，Ｋ＋５ｓｔｅｒ、　Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、　２４　（１９８３）　５８４３．８、　Ｊ、Ｃ，５ ｈｕｌｈｏｆ、　Ｄ、　Ｉｏｌｋｏ、　Ｒ，Ｔｅｏｕｌｅ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡ ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１５　（１９８７）　３９７゜９、　Ｂ、Ｃ，Ｆｒｏｅｈ ｌｅｒ、　Ｐ、Ｇ、　Ｎｇ、　１１．０．　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４　（１９８６）　５３９９゜ＩＱ 、　Ｐ、Ｊ、　Ｇａｒｅｇｇ、　Ｉ、　Ｌｉｎｄｈ、　Ｔ、　Ｒｅｇｂｅｒｇ、 　Ｊ、　５ｔａｖｉｎ−ｓｋｉ、　Ｒ，ＳｔｒＱｍｂｅｒｇ、Ｃ，Ｈｅｎｒｉｃ ｈｓｓｏｎ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、　２７　（１９８６）　４０５ １゜１１、　Ａ、ｉｌ、　ｌ１ｉｃｈｅｌｓｏｎ、＾、Ｒ，Ｔｏｄｄ、　Ｊ、　 ＣｈｅＩｌ、　Ｓｏｃ、（１９５５）２６３２゜ １２、　Ｈ，５ｃｈａｌｌｅｒ、　［１，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ、　Ｊ、　Ａａ ＋、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ。

８５　（１９６３）　３８２ｇ。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、２ 要　約　書 最初のヌクレオシドがシリルエーテル結合を介して支持体に結合され、と（にそ の結合は式 〔式中、 Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり、 Ｒ１は保護基であり、 Ｒ２はＨ，０１１または０Ｒ３（式中、Ｒ３は保護基である）であり、 １？３、Ｒ４およびＸはそれぞれ、アルキル、アリール、シクロアルキル、アル ケニル、アラールキル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、アリールオ キシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキルオキシであり、 Ｓは固体支持体である。

ただし、Ｒ５、Ｒ４およびＸの１個だけが、アルキルオキシ、アリールオキシ、 シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキルオキシまたはシクロア ルキルアルキルオキシである〕で表される、オリゴヌクレオチド合成用の支持体 系。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．最初のヌクレオシドをシリルエーテル結合を介して支持体に結合させること を特徴とするオリゴヌクレオチド合成用の支持体系。
2. ２．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、 Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり、 Ｒ１は保護基であり、 Ｒ２はＨ、ＯＨまたはＯＲ５（式中、Ｒ５は保護基である）であり、 Ｒ３、Ｒ４およびＸはそれぞれ、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルケ ニル、アラールキル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、アリールオキ シ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキルオキシであり、 Ｓは固体支持体である。 ただし、Ｒ３、Ｒ４およびＸの１個だけが、アルキルオキシ、アリールオキシ、 シクロアルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキルオキシまたはシクロア ルキルアルキルオキシである〕を有することを特徴とする請求項１記載の支持体 系。
3. ３．Ｒ１がトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはピキシ ルであり、基Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンまたはイノ シンであることを特徴とする請求項２記載の支持体系。
4. ４．Ｒ３はアリール基であり、Ｘはアルキルまたはアルキルオキシ鎖であり、Ｒ ４は三級アルキルまたは三級アルキルオキシであることを特徴とする請求項２ま たは３に記載の支持体系。
5. ５．固体支持体（Ｓ）上でオリゴヌクレオチドを合成する方法において、最初の ヌクレオシドをシリルエーテル結合を介して支持体（Ｓ）に結合させ、ついで以 下の工程 （ｉ）最初のヌクレオシド上へのヌクレオチドの縮合、 （ｉｉ）オリゴヌクレオチド上の５′−保護基を除くすべての保養基の除去およ び酸触媒脱保護時に形成された非プリン部位の切断、 （ｉｉｉ）支持体からのオリゴヌクレオチドの選択的切断、 （ｉｖ）５′−保護基をアフィニティーハンドルとして用いた、逆相クロマトグ ラフィーによるオリゴヌクレオチドの精製 を行うことを特徴とする方法。
6. ６．５′−保護基はジメトキシトリチルであることを特徴とする請求項５記載の 方法。
7. ７．切断反応（ｉｉｉ）はテトラアルキルアンモニウムフルオリドまたはヒドロ キシドを用いて行うことを特徴とする請求項６記載の方法。
8. ８．請求項２〜４のいずれかに記載の支持体系を利用することを特徴とする請求 項５〜７のいずれかに記載の方法。