JP2002511840A

JP2002511840A - オリゴヌクレオチド及びペプチドの液相合成方法

Info

Publication number: JP2002511840A
Application number: JP53121798A
Authority: JP
Inventors: ピーケン，ウルフガング; ゴールド，ラリー
Original assignee: プロリゴ・エルエルシー
Priority date: 1997-01-08
Filing date: 1998-01-06
Publication date: 2002-04-16
Also published as: CA2277415A1; EP0996627A4; WO1998030578A1; EP0996627A1; US5874532A; AU6022398A; AU737213B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチド及びペプチドを逐次溶液相合成するための改良方法を開示する。この方法は自動化に役立ち、オリゴヌクレオチドを高効率で大規模製造するために理想的に適する。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチド及びペプチドの液相合成方法発明の分野本発明は核酸とペプチド化学の分野に関する。詳しくは、本発明はオリゴヌクレオチド及びペプチドの新規な製造方法を述べる。前記オリゴヌクレオチド及びペプチドを製造するために本発明で用いる方法は、ＰｒｏｄｕｃｔＡｎｃｈｏｒｅｄＳｅｑｕｅｎｔｉａｌＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（生成物固定逐次合成）の頭字語であるＰＡＳＳと呼ばれる。発明の背景ごく最近まで、厳密に知られている以外の能力においてオリゴヌクレオチドを考察することは行われなかった。ある種のオリゴヌクレオチドが興味深い構造可能性を有し（例えば、ｔ−ＲＮＡ類）、また他のオリゴヌクレオチドが現存するポリペプチドによって特異的に結合されるという事実にも拘わらず、オリゴヌクレオチドの知られていない能力は殆ど注目されていなかった。この理由から、特に、オリゴヌクレオチドを薬剤化合物として用いることは殆ど考えられていなかった。薬剤化合物としてのオリゴヌクレオチドの使用に関する広範囲な研究を導いた少なくとも３つの利用分野が、現在存在する。最も進歩した分野では、タンパク質の発現を防止するか又は種々な細胞機能をブロックするために、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いて、生物中のある一定のコーディング領域に結合させている。さらに、触媒機能を有するＲＮＡ種−−リボザイム−−の発見は、所望の効果を達成する細胞内反応の実施に役立つＲＮＡ種の研究をもたらしている。最後に、ＳＥＬＥＸ方法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment（指数関数的増加によるリガンドの系統的発生）（TuerkとGold(199 0)Science 249:505）の発見は、生物学的に興味ある殆ど如何なるターゲットにも結合するオリゴヌクレオチドが同定されうることを実証している。ＳＥＬＥＸは、“核酸抗体”と呼ばれる核酸リガンド、例えば、ターゲット分子と相互作用する核酸を同定し、産生する方法である（TuerkとGold(1990)Scien ce 249:505）。候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一般的選択方式を用いた結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的にいかなる目的基準の結合親和性および選択性も達成するものである。遺伝子発現を制御するための手段としてのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの使用と、オリゴヌクレオチドを薬剤として用いる可能性とは、オリゴヌクレオチドの治療的活性と安定性とを高めるためにオリゴヌクレオチドに多くの化学的修飾を導入することへの研究を刺激している。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞浸透を高め、身体においてオリゴヌクレオチド類似体の構造若しくは活性を分解若しくは妨害するヌクレアーゼと他の酵素とからオリゴヌクレオチドを安定化し、ターゲットＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合を強化し、ターゲットＲＮＡにいったん配列特異的に結合した破壊モード（終結イベント(termi nating event)）を与え、オリゴヌクレオチドの薬物動態的性質を改良するように設計される。最近の研究は、ＲＮＡの二次及び三次構造が重要な生物学的機能を有しうることを示している（Tinoco等(1987)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.52:135;La rson等(1987)Mol.Cell.Biochem.74:5;Tuerk等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 :1364;Besnekov等(1989)J.Biol.Chem.264:9953）。“ＲＮＡ模倣によって遺伝子発現を調節するための試薬と方法”なる名称のＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／１４４３６は、１種類以上のタンパク質と相互作用することができるＲＮＡの一部を模倣するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を述べている。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性にする修飾ヌクレオシド間結合(modified internucleoside linkage)を含有し、強化された細胞浸透力を有し、ターゲット・オリゴヌクレオチド配列を結合することができる。薬剤として用いるための修飾オリゴヌクレオチドの開発にはかなりの程度の活動がなされているが、臨床的開発を可能にする規模でこれらの化合物を調製し、単離することは殆ど注目されていない。慣用的な実験室規模の１μｍｏｌｅの自動化オリゴヌクレオチド合成は、臨床的開発を可能にするほどの充分な量の問題化合物を生成しない。臨床的開発のためには、オリゴヌクレオチドは少なくともグラム規模からマルチグラム規模量で産生されなければならない。大規模のオリゴヌクレオチド合成の報告が文献に存在するが、“大規模”なる用語は、グラム規模又はキログラム規模の量ではなく、１〜１０μｍｏｌｅ規模に適用されている（Ｉｗａｉ等（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４６：６６７３〜６６８８）。オリゴヌクレオチド合成における現在の最新技術は、スキーム１に説明するホスホロアミダイト方法によるオリゴヌクレオチドの自動化固相合成である（Beau cageとLyer(1992)Tetrahedron 48:2223-2311;ZonとGeiser(1991)Anti-Cancer Dr ug Design 6:539-568;MatteucciとCaruthers(1981)J.Am.Chem.Soc.103:3185-319 1）。簡単には、合成されるべきオリゴヌクレオチドの３’−末端ヌクレオシドを固体サポートに取り付けて、サポートに取り付けた状態を留めながら同時に１つのオリゴヌクレオチドを加えることによって、オリゴヌクレオチドを合成する。スキーム１に示すように、ヌクレオシドモノマーは保護され（Ｐ₁）、ホスホロアミダイトが調製される（１）。次に、ホスホロアミダイト（５’−保護モノマー単位と呼ぶ）を成長するオリゴヌクレオチド鎖（２）に、成長するオリゴヌクレオチド鎖のリボース環の５’−ヒドロキシ基を介してホスフィットトリエステル結合によって共有結合させて、オリゴヌクレオチド生成物（３）を得る、この生成物では成長するオリゴヌクレオチド鎖の大部分は１つのヌクレオチドによって伸長しているが、鎖の有意なパーセントは伸長しない。次に、生成物（３）を酸化してホスフェートトリエステル（４）を得る。成長するヌクレオチド鎖に次の塩基を付加する前に、５’−ヒドロキシ基を脱保護しなければならない。しかし、スキーム１（化合物４）において見ることができるように、固体サポート上の反応性部位の全てが５’−保護モノマーと反応するとはかぎらない。それ故、これらの未反応部位（失敗配列(failure sequence)と呼ばれる）を５’−ヒドロキシ基の脱保護（６）の前に保護されなければならない（キャッピングと呼ばれる）（５）。次に、同じように保護され、ホスホロアミダイトに転化されている、次のモノマーを、このモノマーの３’−末端に、成長するオリゴマーの５’ −末端をカップリングさせることによって逐次加える。各カップリング反応はホスフィットトリエステル結合によって１モノマーだけオリゴヌクレオチドを伸長させる。各工程において−−及び固体サポートとの初期反応の場合には−−５’−保護モノマーとの反応することができず、１ヌクレオチドモノマー伸長されていないオリゴヌクレオチド（失敗配列）を生じる反応性部位が存在する。合成が完成したときに、所望のオリゴヌクレオチド（６（ｎ＋１配列））を脱保護して、全ての失敗配列（ｎ，ｎ−ｘ）と共に樹脂から切断する。慣用的な固相オリゴヌクレオチド合成の収率は、カップリングされるモノマーの数と共に指数関数的に低下する。このことは、粗生成物を失敗配列から離して精製する困難さを高める。さらに、高い分解能の精製(resolution purification )が達成された後にも、特に精製物が非標準(non-standard)ヌクレオチドを含有する場合には、生成物の配列と組成とを立証することは依然として非常に困難である。スキーム１固体サボート上での自動化オリゴヌクレオチド合成は、最小の時間量内に少量の、０．００１〜０．０１ｍｍｏｌの多様な配列を妥当な収率で調製するために非常に効果的である。しかし、インプットモノマーを基準にした総プロセス収率を考慮すると、これは非常に非効率的なプロセスである。典型的には、モノマー付加当たりに１６倍過剰なホスホロアミダイトが必要である。自動化固相合成アプローチが、オリゴヌクレオチド薬剤の効果的な製造を可能にするレベルにスケールを設計する(scaled)には容易に適さないことが認められている（ZooとGeise r(1991)Anti-Cancer Drug Design 6:539^-568）。固相合成の非効率は、ヘテロ相(heterophase)モノマーカップリング反応によってと、未反応失敗配列と反応生成物の両方が同じサポートビーズに共有結合することによって大きな程度に生じる。各サイクルにおいて、サポートに結合したヌクレオチドの１〜５％が活性化モノマーと反応しない。不完全オリゴヌクレオチドへのモノマーの次の付加を防止するために、上記で考察したように、失敗配列と呼ばれる、これらの未反応化合物をブロック又はキャッピングしなければならない。合成のすべての工程における失敗配列の発生は、最終粗生成物にまで運ばれなければ成らない、高度に相同な(homologous)副生成物によって汚染された粗生成物を生じる（スキーム１、構造６（ｎ，ｎ−ｘ）を参照のこと）。その結果、臨床研究のために受容される状態にまで粗合成オリゴヌクレオチドを精製することは、極めて厄介であり、非効率的である。失敗配列の％を最小にするために、大過剰のモノマー（約１６倍）を用いる。高度に負荷されたポリスチレンサポートを用いる固相オリゴヌクレオチド合成をスケールアップする方法が、Montserrat等(1994)Tetrahedron 50:2617-2622によって報告されている。しかし、この方法は、失敗配列を最小にするためにかなり過剰なモノマーがまだ必要である点で、固相合成に関連した主要な問題を克服していない。さらに、この方法は一貫して充分な収率を生じない。カップリングを達成するために必要なモノマー過剰量を減じて、容易なスケール設計可能性(scaleability)を得ようと試みて、Bonora等（1993）Nucleic Acid s Res．21：1213〜1217は、モノマーカップリング反応に溶解性である３’−サポートとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることを研究している。この方法はホスホロアミダイト・カップリング、Ｈ−ホスホネート縮合及びホスホトリエステル縮合によるオリゴヌクレオチドの調製に用いられている（Bonora(1 987)Gazzetta Chimica Italiana 117:379;Bonora等(1990)Nucleic Acids Res.18 :3155;Bonora等(1991)Necleoside & Nucleotides 10:269;Colonna等(1991)Tetra hedron Lett.32:3251-3254;BonoraとScremin(1992)Innovation Perspect.Solid Phase Synth.Collect.Pap.Int.Symp.,2nd .“オリゴヌクレオチドの大規模合成。ＨＥＬＰ方法：結果と見通し”，355-358頁,Intercept,Andover,UK;ScreminとBo nora(1993)Tetrahedron Lett.34:4663;Bonora(1995)Applied Biochemistry and Biotechnology 54:3;ZaramellaとBonolla(1995)Nucleosides & Nucleotodes 14: 809を参照のこと）。このアプローチの弱点は、各反応工程後のサポート結合オリゴヌクレオチドの許容し難く低い回収率(recovery)である。さらに、この方法は、キャッピングされて、最終生成物まで運ばれなければならない失敗配列の問題に対処していない。ポリエチレングリコール−ポリスチレンコポリマー・サポートもオリゴヌクレオチド合成のスケールアップのために用いられている（Wright等(1993)Tetrahed ron Lett.34:3373^-3376）。１ｍｍｏｌスケールでは、モノマー付加当たり９６．６％カップリング効率が１８マーＤＮＡに関して報告されている。この場合にも、この方法は、樹脂に結合した失敗配列の問題に対処していない。Ｚｏｎ等は、ダイマー又はマルチマーのオリゴヌクレオチド・フラグメントのライブラリーを溶液中で調製して、相互にカップリングさせる、オリゴヌクレオチド合成のブロックアプローチ(block approach)を提案している（ZonとGeiser( 1991)Anti-Cancer Drug Design 6:539-568）。これらのフラグメントを、５’− 脱保護と３’−リン酸化(phosphorylatlon)カップリングとを区別して(differen tial)カップリングするために活性化する。フラグメント調製のためにホスホトリエステル・カップリングが提案されている（Bonora等(1993)Nucleic Acids Re s.21:1213-1217）。ホスホトリエステル・カップリングの比較的低い収率のために、このアプローチはあまり広く受容されていない。慣用的なオリゴヌクレオチド合成では、５’−保護基はカップリング工程中の１つのモノマーの５’−ヒドロキシル基と第２モノマーのホスホロアミダイト基との反応を防止するために役立つ。４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基は、オリゴヌクレオチド合成中に加えられる５’−保護モノマー単位の５’−保護基（Schaller等（1963）J．Am．Chem．Soc．85：3821）として一般に用いられる。この基は次の５’−保護モノマー単位の付加の前にオリゴヌクレオチド生成物の５’−酸素からそれが除去されうる容易さと選択性とのために選択される（検討のためには、BeaucageとIyer(1992)Tetrahedron 48:2223-2311を参照のこと）。溶液中では、酸誘導脱トリチル化の可逆性によって５’−ＤＭＴ基の脱保護がそこなわれる。この反応を完成まで進めるために、フリーのトリチルカチオンのスキャベンジャーを溶液相脱トリチル化のために加える（Ravikumar等(1995)T etrahedron Lett.36:6587）。最終５’−末端ＤＭＴ基が、全長生成物オリゴヌクレオチドを短い失敗配列から逆相クロマトグラフィーによって分離することを可能にする疎水性ハンドル(hydrophobic handle)として役立ちうることが認められている。さらに、ＤＭＴ基の高度に疎水性の類似体が、固相合成の完成後に失敗配列からの全長脱保護オリゴヌクレオチド生成物の分離の分解能を強化するために調製されている（SeligerとSchmidt(1987)Journal of Chromatography 397: 141）。他のアプローチでは、粗脱保護オリゴヌクレオチド中の全長生成物の容易な検出を可能にするために、蛍光トリチル類似体がオリゴヌクレオチド合成中の５’−末端保護基に用いられている（Fourrey等(1987)Tetrahedron Lett.28:5 157）。固相オリゴヌクレオチド合成中の特異的モノマー付加のモニターリングを可能にするために、着色トリチル基が考案されている（FisherとCaruthers(19 83)Nucleic Acids Res.11:1589）。他の修飾トリチル基が、固相オリゴヌクレオチド合成中にトリチル基がオリゴヌクレオチドから除去されることができる選択性を変化させる又は強化するために製造されている（検討のためには、Beaucage とIyer(1992)Tetrahedron 48:2223-2311を参照のこと）。現在まで、溶液中での樹脂又は膜への生成物の固定を可能にするトリチル基は設計されていない。さらに、誘導体化樹脂、膜又は溶解性ポリマーと共有結合的に(covalently)反応することができるトリチル基はまだ報告されていない。タンパク質とペプチドは実際にあらゆる生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしており、酵素、ホルモン、抗体、成長因子、イオンキャリヤー、抗生物質、毒素及び神経ペプチドとして機能している。それ故、生物学的に活性なタンパク質とペプチドは今まで化学合成の重要なターゲットであった。可能な治療的用途の新規な化合物を設計する目的で、構造を立証して、構造と機能との関係を研究するために化学合成が用いられる。合成ペプチドは薬剤の主要なクラスを含む。タンパク質とペプチドを合成するためには現在２つの基本的方法：化学(chemi stry)が溶液中で行われる溶液相合成と、化学が固体サポート上で行われる固相合成が存在する。ペプチドの溶液相合成の主要な欠点は、保護されたペプチド中間体が有機溶媒に難溶性であることである。さらに、精製は困難であり、時間がかかる。固相合成はこれらの問題を克服して、ペプチド及びタンパク質の合成に選択すべき方法になっている（Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149;Mitche ll等(1978)J.Org.Chem.43:2845-2852;Bodansky(1984)Principles of Peptide Sy nthesis ,(Springer Verlag Berlin);StewartとYoung(1984)Solid Phase Peptide Synthesis ,第2版,Pierce Chemical Company,Illinois,88-95頁を参照のこと）。一般に、固相ペプチド合成はＣ−末端からＮ末端アミノ酸へ進行する。簡単には、合成すべきペプチドのカルボキシ末端アミノ酸を保護して、固体サポート、典型的には樹脂に共有結合させる。その後、次のアミノ酸（Ｎ−保護され、側鎖保護されている）を遊離カルボン酸として又は活性化エステル誘導体として加える。Ｎ−末端アミノ基に最も頻繁に用いられる２つの保護基はＦｍｏｃ（Ｆｍｏｃ−９−フルオレニルメチルカルボニル；CarpinoとHan(1972)J.Org.Chem.37:34 04)とBoc(Boc-tert-ブトキシカルボニル;Sheppard(1986)Science33:9;PulleyとH egedus(1993)J.Am.Cem.Soc.115:9037-9047)である。合成が完成したときに、ペプチドを脱保護して、樹脂から切断して、精製する。ペプチドの溶液相調製の効率を高めることは、活発な研究分野であり続ける。Ｎ−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸フルオリドを導入して、その後、これらのモノマーをその場で形成することは、ペプチドの効果的な溶液相調製を最小のラセミ化で可能にする（Carpino等(1990)J.Am.Chem.Soc.112:9651-9652;CarpinoとEl-Faham(1 995)J.Am.Chem.Soc.117:5401-5402）。この方法は抗生物質バンコマイシンカルボキサミド誘導体の調製に適用されている（SundramとGriffin(1995)J.Org.Ch em. 60 :1102-1103）。ペプチド合成方法は絶えず改良されているが、合成ペプチドの典型的な収率は依然としてむしろ普通である。このことは、純粋な生成物を得るために、長時間の下流処理操作を必要とする。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応は、新たなσ結合の形成に用いられるπ電子を有する環状化合物を形成するための共役ジエンと不飽和分子との間の付加環化反応である。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応は４−π電子の系（ジエン）と２−π電子の系（ジエノフィル）とを含むので、この反応は［４＋２］付加環化反応の例である。この反応は、緩和な条件下で、非常に多様な反応物質に関して非常に迅速に生じさせることができる。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応は範囲が広く、当業者に周知である。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応についての考察は“Advanced Organ ic Chemistry”(March,J.編集)761-798(1977)McGraw Hill,NYに見いだすことができ、この文献は本明細書に援用される。現在までに、多くの試みがなされているが、オリゴヌクレオチドを多量に、連続操作、低い費用で、手間のかかる精製なしに製造する方法の必要性が依然としてある。発明の簡単な概要本発明は、反応収率を高め、スケールアップの見込みを可能にするオリゴヌクレオチドの逐次溶液相合成方法を包含する。成長するオリゴヌクレオチドの３’ −末端を固体サポートに結合させる従来のスキームとは対照的に、本発明は成長するオリゴヌクレオチドの５’−末端に結合するアンカー基(anchor group)の使用を特徴とし、この使用は首尾よくカップリングした生成物を未反応出発物質から分離させる。１実施態様では、アンカー基が５’−ＯＨ保護基としても役立ち、カップリング反応は溶液中で生じる。首尾よく反応したオリゴマーは保護基を含有するが、未反応オリゴマーは含有しないので、アンカー／保護基の存在に基づいて物質を分けることができる。好ましい実施態様では、アンカー基は例えば樹脂、膜又はポリマーのような誘導体化固体サポートと共有結合的に反応する。本発明の好ましい実施態様では、モノマー単位は５’−保護ホスホロアミダイト又はＨ−ホスホネートから成り、保護基は置換トリチル基、レブリン酸基、又はシリルエーテル基である。１実施態様では、未反応オリゴヌクレオチド出発物質（失敗配列）を反応したオリゴヌクレオチド生成物からクロマトグラフィー樹脂に対する保護基のアフィニティに基づいて分離することができる。好ましい実施態様では、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を反応したオリゴヌクレオチド生成物から、例えば樹脂、膜又はポリマーのような誘導体化固体サポートとの保護基の特異的反応に基づいて分離することができる。本発明の好ましい態様では、未反応オリゴヌクレオチドを除去するための分離方法は、未反応オリゴヌクレオチドの単離と再使用とを可能にするために役立ち、次の５’−保護モノマー単位のその後の付加に備えての反応したオリゴヌクレオチドの脱保護を可能にする。本発明の方法はホスホロアミダイト・カップリング化学に限定されず、例えばＨ−ホスホネート又はホスフェートトリエステル・カップリング化学のような他のカップリング反応にも適合可能である。この方法は自動化にも適し、高効率でのオリゴヌクレオチドの大規模製造に理想的に適している。本発明は生成物を未反応５’−保護モノマー単位と出発物質とから自動的に分離するための方法と装置を包含する。１実施態様では、装置は抽出器(extractio n vessel)と、固体サポートを含有するクロマトグラフィー樹脂濾過室とから成る。モノマー付加反応の完了時に、反応混合物を抽出室にポンプで注入し、抽出して、次に５’−保護モノマー単位のみを保有する固体サポートを介して溶出する。次に、生成物のみを保有する固体サポートを介して溶出することによって生成物を出発物質から分離する。第２実施態様では、クロマトグラフィー樹脂濾過室は、５’−保護モノマー単位と生成物の両方と共有結合的に反応する固体サポートを含有する。出発物質を固体サポートから溶出し、次に、モノマーと生成物とを固体サポートから希酸によって放出する。次に、生成物を限外濾過膜に通過させることによって、生成物を５’−保護モノマー単位から分離する。材料費分析は、５’−保護ホスホロアミダイトがオリゴヌクレオチド合成における最も費用のかかる反応成分であることを明らかにする。残りの材料の費用はこれに比べて些細である。それ故、このモノマーを限定試薬(limiting reagent) にすることが望ましいと考えられる。さらに、はいってくるモノマーに加わることができなかった特定の中間体のオリゴヌクレオチド配列は、その後の合成に中間体として役立つことができる。本発明の方法を用いると、オリゴヌクレオチド生成物の配列と組成とを立証することは、自明になる。全てのモノマー付加サイクル後に、完全に保護された、中性の中間体が得られ、これは面倒なサンプル調製なしに質量分析法によって容易に分析される。オリゴヌクレオチド合成の過程にわたって、全ての逐次モノマー付加に関する分析データのライブラリーを得ることができる。したがって、生成物分析はプロセスの不可欠な部分になる。本発明はさらに、ペプチドの逐次溶液相合成方法を包含する。本発明のこの実施態様は、成長するペプチドのＮ−末端保護基に結合したアンカー基の使用を特徴とし、このアンカー基の使用は首尾よくカップリングした生成物を未反応出発物質から分離することを可能にする。首尾よく反応したペプチドはアンカー基を含有し、未反応ペプチドは含有しないので、アンカー／保護基の存在に基づいて物質を分けることができる。好ましい実施態様では、アンカー基は例えば樹脂、膜又はポリマーのような誘導体化固体サポートと共有結合的に反応する。本発明は非常に多様なペプチドと修飾ペプチドの溶液相合成方法を提供する。本発明の方法はあらゆる逐次重合反応にまで拡大することができ、したがって、非限定的にペプチド核酸（ＰＮＡｓ）と炭水化物とを包含する、任意のポリマーの逐次合成に拡大することができる。図面の簡単な説明図１は、酸化前の実施例１に述べたホスホロアミダイトカップリング反応混合物の逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを説明する。図２は、酸化後の実施例１に述べたホスホロアミダイトカップリング反応混合物の逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを説明する。酸化後トレースが図１の酸化前トレースに重ね合わされている。図３は、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）フィルタープラグに通す前と通した後の両方の、実施例１に述べた酸化ホスホロアミダイトカップリング反応の混合物の逆相ＨＰＬＣトレースを説明する。図４は、水／アセトニトリルによってＣ１８樹脂から溶出した後と、酢酸によって処理し、水／アセトニトリルによって溶出した後の実施例１に述べた酸化ホスホロアミダイトカップリング反応の逆相ＨＰＬＣトレースを説明する。図５は、本発明の方法によって用いるために設計された自動化抽出及び濾過系を概略的に説明する。図６は、３’−ＰＥＧ固定溶液相合成を用いた実施例７で調製した１５塩基オリゴヌクレオチドのアニオン交換ＨＰＬＣトレースを説明する。図７は、１．０当量、２．５当量、５当量及び１０当量のマレイミドを含有するポリスチレンマレイミド樹脂との５’−ＤＨＤＴＯ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ −ＯＳｉＰＤＢＴ−５’の反応に関するＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ捕捉データ(cap ture data)をグラフによって説明する。図８は、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ生成物捕捉によって用いるために設計された自動化抽出及び濾過系を概略的に説明する。図９は、エチルエーテル、イソプロピルエーテル又はＮ−ブチルエーテルによって沈降したＰＥＧの沈降と遠心分離をグラフによって説明する。図１０は、生成物固定逐次合成（ＰＡＳＳ）を用いたペプチドのアセンブリを説明する。発明の詳細な説明本発明は、本明細書においてＰｒｏｄｕｃｔＡｎｃｈｏｒｅｄＳｅｑｕｅｎｔｉａｌＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（生成物固定逐次合成）（ＰＡＳＳ）と呼ばれるオリゴヌクレオチドの溶液相合成方法を包含する。成長するオリゴヌクレオチドの３’−末端を固体サポートに結合させる従来のスキームとは異なり、本発明は成長するオリゴヌクレオチドの５’−末端に結合するアンカー基の使用を特徴とし、この使用は首尾よくカップリングした生成物を未反応出発物質から分離させる。好ましい実施態様では、アンカー基が５’−ＯＨ保護基としても役立つ。首尾よく反応したオリゴヌクレオチド生成物は保護基を含有するが、未反応オリゴヌクレオチド出発物質は含有しないので、アンカー／保護基の存在に基づいて生成物を出発物質から分けることができる。未反応出発物質を回収して、同じオリゴヌクレオチドのその後の合成バッチに再使用することができる。したがって、慣用的な固相合成とは対照的に、本明細書で述べるオリゴヌクレオチド合成の改良方法は成長するオリゴヌクレオチド鎖の３’−末端を固定するために固体サポートを用いない。詳しくは、本発明は、溶液中で５’−保護モノマー単位を成長するオリゴヌクレオチド鎖の５’−末端と反応させることを含む、非常に多様なオリゴヌクレオチドと修飾オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法を提供する。これらの反応を固体サポート上ではなく溶液中で行うことは、良好な反応動力学を実現する。本発明の他の態様では、５’−保護モノマー単位と成長するオリゴヌクレオチドとの間の反応後に、未反応５’−保護モノマー単位を活性化し、酸化して、反応媒質の残部から容易に分離されることができる荷電種(charged species)を形成することができる。本発明の好ましい実施態様では、モノマー単位は、酸化後にホスフェートジエステルに容易に転化されることができるホスホロアミダイトである。荷電ホスフェート種は反応媒質の残部から容易に分離されることができる。さらに、好ましい実施態様では、酸化を現場で(in situ)で行うことができる。５’−保護モノマー単位として、荷電種であるＨ−ホスホネートを用いる場合には（実施例２、スキーム５）、Ｈ−ホスホネートの酸化は最終モノマーの付加後まで延期される。荷電Ｈ−ホスホネートモノマーはカップリング後に中性Ｈ− ホスホネートジエステル生成物を生じ、荷電モノマー種はアニオン交換濾過又は抽出によって容易に除去される。さらに、回収されるＨ−ホスホネートモノマーは再使用可能である。用いられる５’−保護基は、本発明の基本的必要条件を満たす化学官能性(che mical functionalities)の任意のクラスから選択することができる。保護基は、分離を行うために反応生成物を反応混合物から区別するために用いることができる種類でなければならない。好ましくは、保護基は特定の相若しくは固体サポートに対して強いアフィニティ又は反応性を有し、高い選択性で相若しくは固体サポートから容易に切断又は除去されなければならない。オリゴヌクレオチド生成物は未反応オリゴヌクレオチド出発物質から、非限定的に遠心分離、樹脂上での分離、シリカゲルに基づく分離、金属へのアフィニティに基づく分離、磁力若しくは電磁力に基づく分離又は適当な固体サポートへの共有結合に基づく分離を含めた、当業者に公知の標準方法を用いて分離することができる。本発明の好ましい態様では、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を除去するための分離方法は、未反応オリゴヌクレオチドを再使用のために単離するのに役立ち、さらに、次の５’−保護モノマー単位を次に付加するために備えて容易に脱保護される樹脂結合オリゴヌクレオチド生成物を生じる。最も好ましくは、保護基は例えば樹脂、膜又はポリマーのような誘導体化固体サポートと共有結合的に反応して、共有結合的に固定された保護基を生じ、この保護基はオリゴヌクレオチドから高い選択性で容易に切断されることができる。本発明の最も好ましい実施態様では、モノマー単位は５’−保護ホスホロアミダイト又はＨ−ホスホネートから成り、保護基は置換トリチル基、レブリン酸基又はシリルエーテル基である。保護基上の好ましい置換はジエン官能性(diene f unctionality)であり、これはＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を介して、ジエノフィルによって誘導体化されている、例えば樹脂、膜又はポリマーのような、固体サポートと反応することができる。この実施態様では、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を反応したヌクレオチド生成物から、５’−保護基と誘導体化樹脂との選択的又は特異的な共有結合的反応に基づいて分離する。本発明はさらに、ＰＡＳＳによるペプチドの溶液相合成方法をも包含する。この方法は、成長するペプチド生成物のＮ−末端アミノ酸端部に結合したアンカー基を用いることを特徴とし、このアンカー基は首尾よくカップリングした生成物を未反応出発物質から分離することを可能にする。好ましい実施態様では、アンカー基はＮ−保護基としても役立つ。首尾よく反応したペプチド生成物はアンカー基を含有するが、未反応ペプチド出発物質は含有しないので、このアンカー基の存在に基づいて生成物を出発物質から分離することができる。未反応出発物質を回収して、同じペプチドの次の合成バッチに再使用することができる。したがって、慣用的な固相合成とは対照的に、本明細書に述べるペプチド合成の改良方法は、成長するペプチド鎖のカルボキシ末端端部を固定するために固体サポートを用いない。詳しくは、本発明は、溶液中での成長するペプチド鎖のＮ−末端端部とＮ−保護アミノ酸モノマー単位との反応を含む、非常に多様なペプチドと修飾ペプチドの溶液相合成方法を提供する。本明細書に述べるペプチド合成方法は、前例がない純度のペプチドの高度に効果的で、スケール設計可能な(scalable)製造を提起するように設計される。このことは、各アミノ酸付加工程においてペプチド生成物の選択的かつ効果的な単離を可能にするハンドルとして機能するようにＮ−末端モノマー保護基を利用することによって達成される（ＰｒｏｄｕｃｔＡｎｃｈｏｒｅｄＳｅｑｕｅｎｔｉａｌＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＰＡＳＳ）。用いられるＮ−末端保護基は、本発明の基本的な必要条件を満たす化学官能性の任意のクラスから選択することができる。保護基は、分離を行うために反応混合物の残部から反応生成物を区別するために用いることができる種類でなければならない。好ましくは、保護基は、特定の相若しくは固体サポートに対して強いアフィニティ又は反応性を有し、高い選択性で相又は固体サポートから切断又は除去されなければならない。保護基はさらに、慣用的なペプチド合成工程に適合可能でなければならない。ペプチド生成物を未反応ペプチド出発物質から、非限定的に遠心分離、樹脂上での分離、シリカゲルに基づく分離、金属へのアフィニティに基づく分離、磁力若しくは電磁力に基づく分離又は適当な固体サポートへの共有結合に基づく分離を含めた、当業者に公知の標準方法を用いて分離することができる。本発明の好ましい態様では、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を除去するための分離方法は、未反応オリゴヌクレオチドを再使用のために単離するのに役立ち、さらに、次の５’−保護モノマー単位を次に付加するために備えて容易に脱保護される樹脂結合オリゴヌクレオチド生成物を生じる。最も好ましくは、保護基は例えば樹脂、膜又はポリマーのような誘導体化固体サポートと共有結合的に反応して、共有結合的に固定された保護基を生じ、この保護基はオリゴヌクレオチドから高い選択性で容易に切断されることができる。本発明の好ましい態様では、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を除去するための分離方法は、未反応オリゴヌクレオチドを再使用のために単離するのに役立ち、さらに、次のＮ−末端保護アミノ酸モノマー単位を次に付加するために備えて容易に脱保護される樹脂結合ペプチド生成物を生じる。最も好ましくは、保護基は例えば樹脂、膜又はポリマーのような誘導体化固体サポートと共有結合的に反応して、共有結合的に固定された保護基を生じ、この保護基はペプチドから高い選択性で容易に切断されることができる。本明細書において本発明を説明するために用いられる、ある一定の用語は次のように定義される： “ヌクレオシド”は、デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシド又はこれらの任意の化学的修飾(chemical modification)のいずれかを意味する。ヌクレオシドの修飾は、非限定的に、２’−位置糖修飾、５−位置ピリミジン修飾、８−位置プリン修飾、シトシン環外アミンにおける修飾、５−ブロモウラシルの置換等を包含する。 “オリゴヌクレオチド”はＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの任意の化学的修飾のいずれかを意味する。本発明の方法によって合成されるオリゴヌクレオチドは一般に次のように示される：式中、ｎ＝１〜１，０００、Ａは以下で定義するような２’−糖置換基であり、Ｂは以下で定義するようなヌクレオ塩基(nucleobase)である。本明細書で用いる“固体サポート”は、相転移を受けることができる、樹脂、膜、相、ポリマー、ポリマー先駆体又は溶解性ポリマーを意味する。固体サポートはさらに、以下で定義するようなＤ基若しくはＹ基によって誘導体化されている、樹脂、膜、相、ポリマー、ポリマー先駆体又は溶解性ポリマーを意味する。樹脂及び固体サポートなる用語は相互交換可能に用いられ、当業者は樹脂なる用語によって何が意味されるかを理解するであろう。固体サポートの例は、非限定的に、マレイミド誘導体化ポリスチレン、以下で定義するようなＤ基若しくはＹ基によって誘導体化されたポリスチレン、ジエノフィル若しくはジエン誘導体化ポリスチレン、以下で定義するようなＤ基若しくはＹ基によって誘導体化されたＴｅｎｔａｇｅｌ^TM、ジエノフィル若しくはジエン誘導体化Ｔｅｎｔａｇｅｌ^TM 、ジエノフィル若しくはジエン誘導体化限外濾過膜、ジエノフィル若しくはジエン誘導体化ポリエチレングリコール、ジエノフィル若しくはジエン誘導体化無機酸化物（例えば、シリカゲル、アルミナ、調節多孔性ガラス(cntrolled pore glas s)及びゼオライト）、その他のジエノフィル若しくはジエン誘導体化ポリマー、疎水性樹脂、例えばＣ２〜Ｃ１８ポリスチレン、チオプロピルセファロース（Ph armacia Biotech）、水銀化樹脂、アガロースアジピン酸ヒドラジド（Pharmacia Biotech）又はアビジン樹脂を包含する。“ジエノフィル”は、適当なジエンとの［２＋４］付加環化反応を受けることができる、アルケン基、又は炭素とヘテロ原子との間の二重結合、又は２つのヘテロ原子の間の二重結合を有する分子として定義される。 “ジエン”は、ジエノフィルとの［２＋４］付加環化反応を受けることができる、２つの隣接二重結合を有し、これらの二重結合を形成する原子が炭素又はヘテロ原子である分子として定義される。ジエノフィルは、非限定的に、置換若しくは非置換アルケン、又は置換若しくは非置換アルキンを含めた、任意の基であることができる。典型的に、ジエノフィルは式：Ｃ＝Ｃ−Ｚ又はＺ’−Ｃ＝Ｃ−Ｚ［式中、ＺとＺ’は、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＣｌ、ＣＯＡｒ、ＣＮ、ＮＯ₂、Ａｒ、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ハロゲン、又はＣ＝Ｃから独立的に選択される電子求引基である］で示される置換アルケンである。 “ジエノフィル誘導体化固体サポート”は、ジエノフィルによって官能化されている(functionalized)固体サポートを意味し、“ジエン誘導体化固体サポート ”は、ジエンによって官能化されている固体サポートを意味する。好ましい固体サポートは、官能化されうるヒドロキシル基を有する、シリカ、アルミナ、ゼオライト、調節多孔性ガラスから成る群から選択される無機酸化物、又はスキーム１３と１４で説明した、例えばポリスチレンのような有機サポートである。好ましい実施態様では、ジエノフィルはマレイミドであり、ジエンは３，５−ヘキサジエンである。本発明の“５’−保護モノマー単位”は、リボース環に対する慣用的なナンバーリングを含めて次のように一般的に示される：Ｂはヌクレオ塩基であり；ＡとＡ’は２’−糖置換基であり；Ｗはホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート(phosphoramidate)、保護オリゴヌクレオチド及びメチル−ホスホネートから成る群から独立的に選択され；Ｄ−Ｅは、首尾よく反応したオリゴヌクレオチド生成物を未反応オリゴヌクレオチド出発物質から分離するためのアンカーとして役立つアルコール保護基（単数又は複数）である。上記置換基に代わる他の明白な置換も、特定の反応式に限定されず、むしろ一般化された反応式に限定される本発明の範囲内に包含される。本発明の好ましい実施態様では：Ｗはホスホロアミダイト又はＨ−ホスホネートであり；ＡとＡ’は独立的に、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂ 、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴及びイミダゾールから成る群から選択され（本明細書に援用される、“２’修飾ピリミジン分子内求核置換の新規な調製方法”なる名称の米国特許出願第０８／２６４，０２９号（１９９４年６月２２日出願）を参照のこと）；Ｒ¹はＨとアルコール保護基とから成る群から選択され；Ｒ²は＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド(halide)、置換されてもよいＣ₁−Ｃ₂₀アルキル（環状、直鎖及び分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁−Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴及びエステルから成る群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｓ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃、ＳＯ₂ Ｒ⁴、アミノ酸、ペプチド及びこれらの混合物から成る群から選択され；Ｒ⁴は、置換されてもよい炭化水素（Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルキニル）、置換されてもよい複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光ラベル及びホスフェートから成る群から選択され；最も好ましくは、ＡはＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ³、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃から成る群から選択され（“２’修飾ピリミジン分子内求核置換の新規な調製方法”なる名称の米国特許出願第０８／２６４，０２９号（１９９４年６月２２日出願）を参照のこと）；Ｄ−Ｅは“成長するオリゴヌクレオチド鎖”又は“オリゴヌクレオチド生成物” を好ましくない副生成物及び出発物質から分離することを可能にする任意の基でありうる。分離は非限定的にシリカゲルに基づくクロマトグラフィー、遠心分離、又は物質を分離するための、当業者に知られた任意の他の手段を含めた、任意の適当な方法によって行われうる。好ましい分離方法は樹脂への結合によるものである。最も好ましい分離方法はＤと、例えば誘導体化樹脂、ポリマー又は膜のような誘導体化固体サポートとの間の共有結合的反応(covalent reaction)によるものである。それ故、保護基Ｄ−Ｅは好ましくは、Ｄが特定の樹脂又は相に対して強いアフィニティを有するように設計され、Ｅは５’−酸素−Ｅ結合が高い選択性で容易に切断されるように設計される。Ｅが樹脂又は相に対して高度なアフィニティを有する場合には、Ｄを省略することができる。最も好ましくは、保護基Ｄ−Ｅは、Ｄが特定の誘導体化樹脂、ポリマー又は膜に対して選択的又は特異的に共有結合を形成することができるように設計される。Ｅは、非限定的に、以下に示すようなトリチル基又はレブリン酸基又はシリルエーテル基を包含する。Ｄは、非限定的に、Ｈ、ＯＲ⁴、共役ジエン単位を有するアルキル若しくは置換アルキル基、共役ジエン単位を有するアルコキシ若しくは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、ジエノフィル置換アルコキシ基、アルコキシ基、共役ジエン単位を有するアルキルアミノ若しくは置換アルキルアミノ基、マレイミド置換アルキルアミノ基若しくは置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有するアルキルアミノ基若しくは置換アルキルアミノ基、ジスルフィド、アルデヒド、及び金属キレーターから独立的に選択される基を包含し、その幾つかの例を以下に示す。上記置換基上のアルキル基は１〜５０炭素、好ましくは１〜３０炭素を有することができる。Ｙ＝Ｏ、ＮＨ、Ｓ、ＮＨ（ＣＯ）、（ＣＯ）ＮＨ、Ｏ（ＣＯ）、（ＣＯ）Ｏ、ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ、ＮＨ（ＣＯ）Ｏ、Ｏ（ＣＯ）ＮＨ、ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ、ＮＨ（ＣＳ）Ｏ、Ｏ（ＣＳ）ＮＨ、省略、ＳＯ₂．Ｌ＝連結基Ｘ＝電子求引基又は電子供与基本発明のために、“ヌクレオ塩基”は下記定義を有する。ヌクレオベースはプリン又はピリミジン塩基である。ヌクレオ塩基は当業者に現在公知のあらゆるプリンとピリミジン、又はこれらの如何なる化学的修飾をも包含する。プリンはプリン環の９位置の窒素を介してリボース環に結合し、ピリミジンはピリミジン環の１位置の窒素を介してリボース環に結合する。ピリミジンはピリミジン環の５ −又は６−位置において修飾されることができ、プリンはプリン環の２−、６− 又は８−位置において修飾されることができる。ある一定の修飾は、“既知の及び新規な２’修飾ピリミジン分子内求核置換の新規な調製方法”なる名称の同時係属米国特許出願第０８／２６４，０２９号（１９９４年６月２２日出願）と、 “パラジウム触媒ヌクレオシド修飾−求核試薬と一酸化炭素とを用いる方法”なる名称の第０８／４５８，４２１号（１９９４年６月２日出願）と、“パラジウム触媒炭素−炭素カップリング方法と製品”なる名称の米国特許第５，４２８，１４９号とに述べられており、これらは本明細書に援用される。より具体的には、ヌクレオ塩基は、非限定的に、ウラシル、シトシン、Ｎ４−保護シトシン、４ −チオウラシル、イソシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−置換ウラシル、アデニン、Ｎ６−保護アデニン、グアニン、Ｎ２−保護グアニン、２，６− ジアミノプリン、ハロゲン化プリン並びに例えばイミダゾールのような、プリン又はピリミジン環を模倣する意味を有する複素環を包含する。本明細書で用いる“ペプチド”なる用語は、アミド結合（ＣＯＮＨ）によって化学的に結合したアミノ酸のポリマーを意味する。“アミノ酸”はアミノ基（ＮＨ₂）とカルボン酸（ＣＯＯＨ）の両方を含有する有機分子として定義される。具体的には、“アミノ酸”は一般式：Ｒ⁵ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯＯＨ（α−アミノ酸）［式中、Ｒ⁵はＨと任意の適当に保護されたアミノ酸側鎖から成る群から選択される］で示される任意の化合物である。アミノ酸側鎖の適当な保護は当業者に公知である。本明細書で用いるかぎり、“ペプチド”なる用語はペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。本発明の方法によって合成されるペプチドは一般に次のように示される：式中、ｎ＝１〜５００、Ｒ⁵は上記で定義した通りである。本発明の“Ｎ−保護アミノ酸モノマー単位”は一般に次のように示される：式中、Ｒ⁵は上記で定義した通りである。Ａ−Ｘは、首尾よく反応した生成物を未反応ペプチド出発物質から分離するためのアンカーとして役立つ窒素保護基（単数又は複数）である。Ａ−Ｘは“成長するペプチド鎖”又は“ペプチド生成物”の、好ましくない副生成物及び出発物質からの分離を可能にし、慣用的なペプチド合成に適合しうる任意の基でありうる。好ましい実施態様では、Ａは非限定的に、例えばＦｍｏｃとＢｏｃのようなウレタン、ベンジル基、アシル基又はトリフェニルメチル基を含めた、当業者に公知の多くの報告されたＮ−保護基から選択された。Ｘは樹脂上の置換基と高い選択性で反応するように選択される。Ｘは例えばジエン、特に３，５−ヘキサジエノキシ若しくはソルビンアミド(sorbic amide)、ジエノフィル、特にマレイミド、アルキン、シリルエーテル保護ジオール及びジスルフィドのような基から選択される。対応する置換基Ｙは、例えばジエノフィル、ジエン、メルカプタン又はボレートのような、置換基Ｘの選択的な共有結合的反応パートナーであるように選択される。本明細書で用いる“出発物質”はＰＡＳＳの各サイクル中に５’−保護モノマー単位と反応して、１つ以上のヌクレオチドによって伸長されているオリゴマーを生成する化合物を意味する。出発物質は、所望のオリゴヌクレオチド生成物に依存して、ヌクレオチド間の［５’、３’］結合又はヌクレオチド間の［３’、３’］結合を生じるように設計することができる。最初の場合には、出発物質は５’−脱保護され、他の点で保護された長さｎのオリゴヌクレオチドであり、第２の場合には、出発物質は３’−脱保護され、他の点で保護された長さｎのオリゴヌクレオチドである。典型的に、出発物質は５’−脱保護され、他の点で保護された長さｎのオリゴヌクレオチドであり、この場合、ｎは１〜１０００の整数である。出発物質は、５’−保護モノマー単位と出発物質との反応及び５’−脱保護反応に適合しうる、例えば塩基の不安定な基(base labile group)のような、保護基によって２’，３’−保護される。さらに、ＰＡＳＳプロセスはオリゴヌクレオチドの制御された逐次重合から成るので、１つのＰＡＳＳサイクルの出発物質は典型的に、先行ＰＡＳＳサイクルからの脱保護生成物である。ＰＡＳＳプロセスは、３’−末端ヌクレオチドが固体サポートに固定されることを必要としないので、出発物質は非ヌクレオシド修飾を包含することができる。非ヌクレオシド修飾を３’−末端に導入することができ、このことは固相合成によっては通常可能ではないと考えられる。出発物質の３’−末端に対する非ヌクレオシド修飾は、改良された薬物動態的性質を有するオリゴヌクレオチドを調製するための３’−末端モノマーとしての、非限定的に、ポリエチレングリコールモノ−メチルエーテル（分子量５，０００〜１００，０００）（ＰＥＧ）又は他の高分子量非免疫原単位(non-immunogenic unit)の使用を包含する。 “ペプチド出発物質”は、ＰＡＳＳの各サイクル中にＮ−保護アミノ酸モノマー単位と反応して１つ以上のアミノ酸によって伸長されているペプチド生成物を生成する化合物を意味する。この場合に、出発物質はＮ−末端脱保護され、他の点では保護されている長さｎのペプチド（ｎは１〜５００の整数である）である。さらに、ＰＡＳＳプロセスはペプチドの制御された逐次重合から成るので、１つのＰＡＳＳサイクルの出発物質は典型的に先行ＰＡＳＳサイクルからの脱保護生成物である。ペプチドは保護基と、当業者に公知の方法とを用いて保護される。カルボキシ末端保護基は標準保護基、溶解性ポリマー又は診断ディテクターから選択することができる。本明細書で用いる“生成物”は、各ＰＡＳＳサイクル中に５’−保護モノマー単位と出発物質との共有結合的反応によって生成されるオリゴヌクレオチドを意味する。上述したように、出発物質が長さｎの５’−脱保護オリゴヌクレオチドであり、５’−モノマー単位が単一ヌクレオチドである場合に、反応生成物は長さｎ＋１の５’−保護オリゴヌクレオチドである。５’−保護モノマー単位が長さｍのオリゴヌクレオチドブロックである場合には、反応生成物は長さｎ＋ｍの５’−保護オリゴヌクレオチドである。次に、特定のＰＡＳＳサイクルからの生成物は５’−脱保護されて、次のサイクルの出発物質になる。本明細書で用いる“ペプチド生成物”は、各ＰＡＳＳサイクル中にＮ−保護アミノ酸モノマー単位とペプチド出発物質との共有結合的反応によって生成されるペプチドを意味する。ペプチド出発物質が長さｎのＮ−末端脱保護ペプチドであり、Ｎ−保護アミノ酸モノマー単位が単一アミノ酸である場合に、反応生成物は長さｎ＋１のＮ−末端保護ペプチドである。Ｎ−保護アミノ酸モノマー単位が長さｍのペプチドブロックである場合に、反応生成物は長さｎ＋ｍのＮ−末端保護ペプチドである。次に、特定のＰＡＳＳサイクルから生成物はＮ−脱保護され、次のサイクルの出発物質になる。 “失敗配列”は、サイクル中に５’−保護モノマー単位又はＮ−保護アミノ酸モノマー単位と反応することができない、特定のＰＡＳＳサイクルからの出発物質を意味する。 “成長するオリゴヌクレオチド鎖”は、本発明の方法を用いた所望のヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドから出発する、ヌクレオチド（Ｎ）の逐次付加によって調製された５’−脱保護オリゴヌクレオチド鎖又は５’−保護オリゴヌクレオチド鎖のいずれかを意味する。ＰＡＳＳプロセスの各サイクル後に、成長するオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのオリゴヌクレオチドだけ長さを伸長して、次の反応サイクルの出発物質になる。本明細書で用いる限り、この用語は出発物質又は生成物のいずれかを意味することができ、当業者は特定の状況においてこの用語が何を意味するかを認識するであろう。スキーム２は本発明の方法を一般的に説明する。５’−保護モノマー単位、例えばホスホロアミダイト７を溶液中の出発物質８に活性剤、例えばテトラゾール又は好ましくは４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）の存在下で加えて（“ オリゴヌクレオチド合成のための改良されたカップリング活性剤”なる名称の１９９６年１０月１５日出願の米国特許出願第一号を参照のこと）、１つのヌクレオチドがホスフィットトリエステル結合を介して加えられている生成物９を得る。この図に示すように、出発物質８は５’−脱保護され、他の点で保護された長さｎのオリゴヌクレオチド（ｎは１〜１０００の整数である）であり、生成物は長さｎ＋１の５’−保護オリゴヌクレオチドである。５’−脱保護オリゴヌクレオチド出発物質８は固体サポートに固定されず、むしろ、標準方法を用いて、５ ’−保護モノマー単位と出発物質との反応及び５’−脱保護反応に適合しうる、例えば塩基の不安定な基のような、保護基によって簡単に２’，３’−保護される。固体サポートへの３’−固定の除去は、オリゴヌクレオチドに組み入れることができる３’−修飾の範囲を拡大する。さらに、３’−末端ヌクレオチドはサポート固定のために必要なヒドロキシル置換基を有する必要性をもはや有さない。したがって、固相合成では不可能である、３’−末端への修飾導入が可能になる。これは、改良された薬物動態的性質を有するオリゴヌクレオチドを調製するための３’−末端モノマーとしての、非限定的に、ポリエチレングリコールモノ −メチルエーテル（分子量５，０００〜１００，０００）又は他の高分子量非免疫原単位の使用を包含する（本明細書に援用される、“核酸リガンド錯体”なる名称の米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願を参照のこと）。５’−保護モノマー単位７と出発物質８との間の反応の完成後に、反応混合物は３種類の種：未反応５’−保護モノマー単位７と、未反応出発物質８と、反応生成物、長さｎ＋１の５’−保護オリゴヌクレオチドである化合物９とを含有する。上記で考察したように、５’−保護モノマー単位７と反応することができない任意の出発物質８（長さｎの５’−脱保護オリゴヌタレオチド）は、この配列が伸長しなかったので、失敗配列と呼ばれる。反応生成物、化合物９は、長さｎのオリゴヌクレオチドである出発物質８の５’−ヒドロキシ基と、５’−保護モノマー単位７の３’−ホスホロアミダイト基との共有結合的反応によって１ヌクレオチドだけ伸長した５’−保護オリゴヌクレオチド鎖（長さｎ＋１）である。生成物、化合物９が主要な成分であり、反応しなかった５’−保護モノマー単位７と出発物質８とは微量でのみ存在する。プロセスのこの段階において、物質の精製と、モノマー出発物質の回収の両方のために未反応５’−保護モノマー単位を反応混合物から取り出すことが必要である。この実施態様によると、反応しなかったモノマーを反応させて、容易に取り出し可能なイオン種を形成する。同じ反応フラスコ内でホスフェートエステルへのホスフィットトリエステルの酸化を、単に酸化剤を添加することによって行うことができる。ｉｎｓｉｔｕ酸化は所望のオリゴヌクレオチド生成物９と、モノマー７のホスフェート塩１０と、未反応オリゴヌクレオチド出発物質８とを生じる。モノマーホスフェート塩１０は反応混合物中の唯一の遊離塩であるので、非限定的にアニオン交換樹脂若しくは膜に通しての濾過又は水性相による抽出を含めた、当業者に公知の方法によって容易に取り出される。本発明のこの実施態様の代替え変形では、３’−末端モノマーは分子量５，０００〜１００，０００、好ましくは２０，０００のポリエチレングリコールモノ−メチルエーテルである。この場合に、モノマー１０を取り出すために、簡単な分子量カット膜(mol ecular weight cut-off membrane)を用いることができる。未反応モノマーを反応混合物から取り出した後に、“オリゴヌクレオチド生成物”を“失敗配列”から分離するために適した任意の方法で、残留濾液を分けることができる。１実施態様では、例えば逆相樹脂のような、５’−保護基（Ｄ− Ｅ）と選択的かつ特異的に相互作用するように設計された物質に濾液を供給する。樹脂に対する５’−保護基成分Ｄのアフィニティによって、生成物は固体サポート上に捕捉され又は保有される。好ましい実施態様では、例えば、Ｄがジエン単位を含有するジエノフィル誘導体化樹脂のような、５’−保護基（Ｄ−Ｅ）と共有結合的に反応するように設計された物質に濾液を供給する。生成物は樹脂と５’−保護基成分Ｄとの共有結合的反応によって固体サポート上に捕捉又は保有される。５’−保護基Ｄを有さない未反応オリゴヌクレオチド出発物質８は洗い流される。未反応出発物質を単離し、貯蔵して、その後の合成に中間体として用いる。次に、保有されたオリゴヌクレオチド生成物９を周知の方法によって樹脂から放出する。ある一定の実施態様では、５’−酸素と保護基Ｄ−Ｅとの間の結合の切断によってオリゴヌクレオチド生成物が放出される。例えば、５’−保護基がトリチル誘導体である場合に、例えば希薄なジクロロ酢酸（ＤＣＡ）のような試薬を用いて、トリチル基を切断して、オリゴヌクレオチド・カップリング生成物を放出することができる。次に、この放出された５’−脱保護オリゴヌクレオチド・カップリング生成物１１をさらなるカップリング反応に出発物質として用いることができる。スキーム２スキーム２に示したモノマー付加サイクルの工程が正確な上記順序で生ずることは、本発明の必要条件ではない。或いは、ｉｎｓｉｔｕでのカップリングと酸化に続いて、樹脂上での生成物とモノマー１０との共有結合捕捉又はアフィニティ捕捉が生ずることができる。５’−保護基のその後の切断が生成物とモノマーの両方を放出する。この段階で、抽出又は膜に基づく濾過が好ましくないモノマー副生成物を容易に除去する。オリゴヌクレオチド生成物を固定するための５’−保護基の利用は、非常に多様な３’−末端修飾を用いる可能性をもたらす。これらは、例えば、この分離のために分子量カット−オフ膜を利用するための充分な分子量のポリマー又は生成物を選択的に沈降させるための金属キレーターのような、５’−保護モノマー単位からの反応生成物の分離を容易にするように設計された基であることができる。このような場合に、これらの基は例えばスクシネートリンカー(linker)のような、オリゴヌクレオチドの３’−末端と修飾基との間の切断可能なリンカーを含有する。或いは、非ヌクレオシド３’−末端置換基は、例えばポリエチレングリコールモノ−メチルエーテル又はジステアリルグリコールのように、オリゴヌクレオチド生成物の薬物動態的性質を強化することができる（本明細書に援用される、“核酸リガンド錯体”なる名称の米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願を参照のこと）。３’−末端モノマーはさらに、例えばｉｎｖｉｖｏ画像化(imaging)のためにＴｃ９９ｍを保有するように設計されたキレーターのように、オリゴヌクレオチドの診断用途のディテクターとして役立つこともできる（本明細書に援用される、“金属錯体とオリゴヌクレオチドとから製造されたコンジュゲート、これらのコンジュゲートを含有する作用剤、放射線診断におけるそれらの使用並びにそれらの製造方法”なる名称の特許出願第ＷＯ９６／０２２７４号、１９９６年２月１日出願を参照のこと）。慣用的な固相オリゴヌクレオチド合成では、３’−末端は成長する鎖を固体サポートに固定するために用いられるので、このような置換基の導入のために３’−末端は利用可能ではない。慣用的な固相合成プロセスとは対照的に、新たなカップリング反応が行われる度毎に、オリゴヌクレオチド生成物を未反応出発物質から分離することが好ましい。したがって、最終オリゴヌクレオチド生成物は実際に純粋な形で得られ、高度に相同な失敗配列の厄介な除去は省略される。さらに、反応は溶液相で行われるので、モノマーとオリゴヌクレオチド出発物質との反応の収率も顕著に上昇する。さらに、成功したオリゴヌクレオチド・カップリング生成物のみがプロセスの次の工程に入るので、このスキームにおいてはキャッピング工程は不必要になる。キャッピング工程の省略は、慣用的プロセスに比べて、別の効率増加をもたらす。その代わり、５’−保護モノマー単位との反応を受けることができなかったオリゴヌクレオチド出発物質（失敗配列）は単離され、再使用されることができる。ＰＡＳＳ反復中に失敗配列が再単離される度毎に、失敗配列は同じオリゴマーの、又は同じ３’−末端フラグメントを共有するオリゴマーのその後の合成における同じ工程又は反復において出発物質にブレンドされることができる（スキーム３を参照のこと）。それ故、失敗配列はその後のオリゴヌクレオチド製造のための有用な逐次構成ブロックになる。このことはプロセスの効率を高めるばかりでなく、最終粗生成物の純度をも劇的に高めることになる。さらに、このことは限定試薬としてモノマーを用いることを可能にするので、プロセス効率を劇的に高める。スキーム３生成物を出発物質から分離するためのアンカーとして５’−保護基を利用して、失敗配列がその後の合成の中間体になることを可能にする上記合成スキームは、ホスホロアミダイト・カップリング化学に限定されない。これは例えばＨ−ホスホネート又はホスフェートトリエステル・カップリング化学のような、他のカップリング反応とも適合可能である（GaffneyとJones（1988）Tetrahedron Lett．29 ：2619〜2622を参照のこと）。このスキームはオリゴヌクレオチド合成の自動化にも役立ち、高効率でのオリゴヌクレオチドの大規模製造に理想的に適する。本明細書に述べるテクノロジーの態様は、ＰＡＳＳ合成プロセスを越える用途を有する。例えば、オリゴヌクレオチド合成における所望の種又は好ましくない種の共有結合的捕捉は、慣用的固相プロセス又は溶液相プロセスでの高分解能の単一工程精製方法にも適用可能である。末端モノマーのみがその５’−末端にジエン修飾トリチル基を有する場合には、ジエノフィル誘導体化樹脂又は膜上での全長生成物の選択的固定が、全ての主要な失敗配列を粗混合物から除去する（スキーム１を参照のこと）。他の用途では、共有結合的捕捉に適した部分（上記Ｄ基の全てが該当する）を含有するキャッピング試薬、例えばジエン修飾無水酢酸（若しくは一般的にＤ修飾無水酢酸）又はジエン修飾シリルクロリド、例えば３，５−ヘキサジエノキシ酢酸無水物又はトリ−（３，５−ヘキサジエノキシ）シリルクロリドを用いる場合に、全てのキャッピングされた失敗配列(capped fail ure sequence)を全てのモノマー付加後（溶液相オリゴヌクレオチド合成プロセスにおいて）又は固体サポートからの粗オリゴヌクレオチド切断後（慣用的固相オリゴヌクレオチド合成プロセスにおいて）に、粗オリゴヌクレオチドバッチから除去することができる。さらに他の用途では、ジエン修飾トリチル基とジエノフィル修飾樹脂との反応はカチオン交換樹脂の容易な製造を可能にする。実施例１では２’−フルオロピリミジン修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドのダイマーをＰＡＳＳプロセスによってアッセンブリーさせる(assembled)（スキーム４）。最初の反応では、ホスホロアミダイト・カップリング化学を用いて、３’ ，３’−ホスホジエステル結合を形成する。オリゴヌクレオチドは３’−末端における３’，３’−ホスホジエステルの組み入れによって、しばしば、３’−〜５’−エキソヌクレオリチック分解(exonucleolytic degradation)から保護される。カップリング後に、反応混合物をｉｎｓｉｔｕ酸化すると、未反応チミジン出発物質１２と、酸化アミダイト(oxidized amidite)モノマー１５と、酸化ダイマー生成物１４とが生ずる。反応混合物をジエチルアミノエチレン（ＤＥＡＥ）Sephadex（登録商標）床に通して濾過することによって、酸化アミダイトモノマー１５を除去する。濾液のＨＰＬＣ分析によると、図３に示すように、酸化アミダイトモノマーがＤＥＡＥ Sephadex（登録商標）に保持されたことを示した。酸化ダイマー生成物１４と未反応チミジン出発物質１２とを含有する濾液を濃縮して、６０％アセトニトリル／水中に再溶解して、Ｃ１８フィルタープラグ上に負荷させる。樹脂を７０％水／アセトニトリルによって洗浄した後に、５０％水／アセトニトリルによって洗浄して、未反応チミジン出発物質１２を完全に溶出する。次に、今やトリチル化ダイマー生成物１４のみを含有する樹脂を水によって洗浄し、次に８０％酢酸／水によって処理して、脱トリチル化を行う。次に樹脂を５０％アセトニトリル／水によって洗浄すると、最終生成物１６が溶出され、トリチル種は残留する（図４）。スキーム４実施例２（スキーム５）は、５’−保護モノマー単位がホスホロアミダイトではなく、Ｈ−ホスホネートである本発明の方法を説明する。この実施例では３’ −末端（Ｔ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ−トリマー）２０に３’，３’−ヌクレオチド間結合(internucleotidic linkage)を有するＨ−ホスホネートチミジントリマーが製造される。液相カップリング反応の収率は非常に高かったので、未反応３’−末端フラグメント１９は検出されなかった。したがって、生成物からトリチル基を切断し、分離するためにのみ、逆相工程を用いる。実施例３（スキーム６）は、５’−保護基（Ｄ−Ｅ）として５’−Ｏ−（４，４’−ジオクタデシルオキシトリチル）（ＤＯＴ）を含有するホスホロアミダイトモノマーの合成を述べる。実施例４は、特定の樹脂又は相との５’−保護基（Ｄ−Ｅ）の選択的又は特異的相互作用に基づいて未反応オリゴヌクレオチド出発物質（失敗配列）からカップリング生成物を分離できることを説明する。この実施例では、Ｃ１８逆相樹脂上での４，４’−ジオクタデシルとりフェニルメタノール）（ＤＯＴ）２３の移動度を４−デシルオキシ−４’−メトキシトリタノール及びジメトキシトリタノール（ＤＭＴ）の移動度と比較する（表１参照）。例えばメタノール（Ｒ_f＝０）及びアセトニトリル（Ｒ_f＝０）のような有機溶媒中でＣ１８とのＤＯＴ基の強い相互作用は、Ｃ１８樹脂上への混合物の負荷と、有機溶媒による未反応出発物質の洗い流しとによる出発物質からの生成物の１工程分離を可能にする。次に、カップリングした生成物を、有機溶媒中のハロ酢酸によってトリチル保護基を切断することによって室(chamber)から溶出することができる。トリチル基は樹脂上に残留する。実施例５は、過剰なモノマーを除去するためのアニオン交換媒体と、５’−ＤＭＴ保護生成物を選択的に捕捉するが、失敗配列を保有しないＣ１８逆相樹脂とを用いての溶液中でのヘキサマーオリゴヌクレオチド（５’−ＨＯ−Ｔ−Ｔ−Ａ −Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）のアッセンブリー(assembly)を説明する。実施例５で知ることができるように、各モノマー付加は２工程で達成される。第１工程では、ホスホロアミダイト・カップリング化学を用いて、５’−保護モノマー単位を出発物質にカップリングさせる。カップリング後に、反応混合物をｉｎｓｉｔｕ酸化すると、未反応出発物質（失敗配列）と、酸化アミダイトモノマーと、酸化生成物とが生ずる。反応混合物を例えばＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）のようなアニオン交換媒体に通して濾過することによって、酸化アミダイトモノマーが除去される。第２工程では、酸化生成物と未反応出発物質（失敗配列）とを含有する濾液を希酸によって処理して、脱トリチル化を行う。使用可能である希酸の例は、非限定的に、希鉱酸、希トリクロロ酢酸、希ジタロロ酢酸（ＤＣＡ）、例えばＺｎＢｒ₂のようなルイス酸、ニトロメタン、ｐ−トルエンスルホン酸(tosic acid)及び過塩素酸を包含する。次に、混合物をクロマトグラフィーによって分離する。或いは、生成物と未反応出発物質との混合物を最初に逆相樹脂を用いて分離した後に、脱トリチル化を行って脱トリチル化生成物を樹脂から放出する。実施例５において得られた分析データは、ＰＡＳＳプロセスが反復毎に、費用−限定モノマー(cost-limiting monomer)の最小の消費で、実際に純粋なオリゴヌクレオチド中間体を生じることを示す。実施例６（図５）は、未反応５’−保護モノマー単位を反応混合物の残部から分離するために、本発明によって用いるように設計された自動化抽出／濾過系１００を概略的に説明する。上述したように、本発明の方法は自動化に役立つので、オリゴヌクレオチドの大規模製造に理想的に適する。自動化抽出／濾過系１００は２つのセンター：抽出器１１２と、クロマトグラフィー樹脂濾過室１１４を有する。抽出器は管１１８によって、クロマトグラフィー樹脂室と流体連通する。第１三方弁１２０はクロマトグラフィー室１１４中への抽出器１１２からの内容物の流れを制御する。第２弁１２２は室１１４中への溶媒の添加を制御する。第３弁１２４は室１１４からの流出液の回収を制御する。３つの弁の全てはコントローラー１２６に電気的に結合し、コントローラー１２６は３つの弁１２０、１２２及び１２４の全てをそれらの種々な流れの位置の間で作動させるシグナルを供給する。抽出器１１２は２つの入口１２８と１３０と、スターラー１３２と、出口１３４とを装備する。反応混合物を入口１２８から抽出器１１２中へポンプで供給され、例えばＣＨ₂Ｃｌ₂のような抽出溶媒と水性緩衝液とを入口１３０からポンプで供絵する。この混合物をスターラー１３２で撹拌することができ、この時間後に、層を分離させる。次に、第１三方弁１２０を開いて、下部有機層を出口１３４から導電率(conductivity)モニター１３６中へ流出させ、次に管１１８から室１１４中へ流入させる。導電率モニターはコントローラー１２６に電子的に結合する。導電率の上昇は、有機層が導電率モニターを通過して、水性層が侵入し始めたことを示す。導電率の上昇はコントローラー１２６によって認識され、コントローラー１２６は第１三方弁１２０にシグナルを送り、三方弁を作動させて、水性層を室１１４から方向転換させる。室１１４は３つの入口１３８、１４０及び１４２と、出口１４４とを装備する。有機層は入口１３８から室１１４に入り、入口１４０から室に入る、例えばアルゴンのような、圧縮不活性ガス源によって室１１４を通して押し進められる。次に、入口１４２から室に入る溶媒（即ち、ＣＨ₂Ｃｌ₂）によって、室を洗浄する。溶媒の添加は、第２弁１２２を選択的に作動させるコントローラーによって制御される。コントローラー１２６によって第３弁１２４を開放することによって有機流出液は出口１４４から回収される。有機流出液は、１つのヌクレオチドだけ伸長した出発物質である反応生成物と、未反応オリゴヌクレオチド出発物質（失敗配列）とを含有する。未反応５’−保護モノマーは室１１４中に保有される。有機溶媒の溶出後に、入口１４０から加えられ、未反応５’−保護モノマー単位を溶出する緩衝化溶液によって、室１１４を洗浄する。次に、反応混合物を溶出するために用いられる有機溶媒（即ち、ＣＨ₂Ｃｌ₂）によって、室１１２を再平衡させる。次に、有機流出液を逆相樹脂上に通して未反応オリゴヌクレオチド出発物質（失敗配列）から生成物を分離する（実施例６を参照のこと）。実施例７は、３’残基修飾として２０，０００分子量のポリエチレングリコールを用いる、１５塩基オリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧ −［３’，３’］−Ｔ−Ｔ−３’）（配列番号：１）の溶液相合成を説明する。この実施例は溶液相合成の効率と、慣用的な固相合成を用いて直接調製されることができない３’−修飾オリゴヌクレオチドを溶液中で調製可能であることを実証する。この実施例は、典型的なＰＡＳＳサイクルにおけるような樹脂上にオリゴヌクレオチド・カップリング生成物を捕捉させる工程なしに、溶液相合成のために必要な基本的な工程を略述する。したがって、この実施例はさらに、ＰＡＳＳにおいて考えられるような生成物捕捉が提供する効率と生成物純度に対する影響を実証する。各モノマー付加サイクルにおけるこのような生成物捕捉によって、慣用的な固相合成におけるようなジエチルエーテルからの厄介な沈降がもはや不要になる。さらに、失敗配列は各モノマー付加サイクルにおいて除去されるので、ＰＡＳＳによって得られる生成物のアニオン交換クロマトグラムは、図６のクロマトグラム中に存在する多重ピークではなく、単一生成物ピークのみを示す。実施例８（スキーム７と８）は、５’−ジ−（３，５−ヘキサジエノキシ）トリチルチミジン・ホスホロアミダイトモノマー（３２）と５’−ジ−（２，４− ヘキサジエノキシ）トリチルチミジン・ホスホロアミダイトモノマーを含めた、種々なジエン修飾トリチルアルコールの合成を説明する。実施例９（スキーム９）は、マレイミドに対する効果的な付加環化のためのジエン−−４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチルアルコール（３０）と４，４’−ジ−２，４−ヘキサジエノキシトリチルアルコール（３６）−−の使用を実証する（それぞれ、反応１と２（スキーム９））。表４は種々な条件下でのこれらの２反応の反応速度を示す。表４に示したデータから、修飾トリチル化合物（３０）が種々な反応条件下で迅速に反応することが明白である。予想されたように、ジエノフィル当量の増加と、反応混合物への水の添加の両方が反応速度を高めることも明らかである。各トリチル基には２個のジエンが存在するので、ジエン置換基の５０％を越える反応がマレイミド修飾固相サポート上に全てのトリチルアルコール又はヌクレオチドを捕捉するために充分であることに注目することは重要である。このことは、反応が行われるために必要な時間を減ずる。比較のために、５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）チミジン（５’−（ＤＨＤＴ）チミジン）（３１）と５’−Ｏ−（４，４’ −ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）チミジン３’−ホスホロアミダイト（３２）とによって、反応＃３に対して与えた同じ条件（表４）下で、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を行った。結果は表５に示す。この場合にも、１時間以内にジエン基の５０％より多くが付加環化を受けた。このことは、ＰＡＳＳにおいて考えられるような生成物捕捉が迅速で効果的なモノマー付加サイクルを可能にするための妥当な時間枠内で起こりうることを示唆する。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化の速度が適当に置換したジエン及びジエノフィルの使用によって調整されうることが広範囲に知られている。したがって、生成物捕捉反応の速度はジエンとジエノフィルとの適当なセットを用いることによって調整することができる。実施例１０は、オリゴヌクレオチド生成物を置換マレイミド−ポリスチレン樹脂上に捕捉するために４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル保護基を用いるＰＡＳＳによる３’−ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドの調製を説明する。この捕捉工程は反応混合物から反応しなかった出発オリゴヌクレオチド（失敗配列）を除去する。後者はその後の製造バッチ中にオリゴヌクレオチドアッセンブリーの同じ箇所においてブレンドするために、任意に単離して、貯蔵することができる。３’−ＰＥＧ−末端修飾は、特に、治療用オリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏでの薬物動態的挙動を強化するために有用である。実施例１１は、ジエンとして５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）−ヌクレオシド（５’−Ｏ−ＤＨＤＴ−ヌクレオシド）４６を、ジエノフィルとしてマレイミド置換固体サポート４５を用いるＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ生成物捕捉によって非ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドを調製するための一般的反応スキームを説明する（スキーム１１）。上述したように、樹脂又は膜上の全長オリゴヌクレオチドの捕捉はＰＡＳＳプロセスの自動化のために不可欠である。捕捉の一般的設計は例えば樹脂、膜又はポリマー４７のような固体サポートに不可逆的に結合したトリチル基又はトリチル類似体を包含する。ひと度結合したならば、オリゴヌクレオチド４９は不可逆的に結合したトリチル基４８からそれを分離することによって放出される。この例は５’−Ｏ−ＤＨＤＴヌクレオシドのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ捕捉である。樹脂に結合した活性Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒジエノフィルはジエントリチルと共有結合的に反応し、脱トリチル化の慣用的な方法は固体サポートと結合トリチル基からヌクレオシドを放出する。実施例１１に述べたようなＰＡＳＳによって非ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドを調製するために、この捕捉を用いることができる（スキーム１２）。スキーム１１Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を用いる捕捉と放出に適している、多くの固体サポートが考えられる。好ましい固体サポートは、容易に官能化されることができる表面ヒドロキシル基を有する無機酸化物（シリカ、アルミナ、ゼオライト、調節多孔性ガラス（ＣＰＧ）等）である。ＣＰＧを考えられる例外として、これらの無機固体サポートはしばしば、商業的に入手可能な樹脂よりも非常に大きい負荷容量(loading capacity)を有する。伝統的に、これらの無機酸化物はヒドロキシルを、より多様な又は反応性の官能基を有するシリル化剤によってシリル化することによって官能化されている（スキーム１３）。スキーム１３反応性ジエノフィルを共有結合的に結合する他の方法も、例えば、６−マレイミド−カプロン酸のような分子と表面ヒドロキシル基との間のエステル化のように、考えられる（スキーム１４）。表面とジエノフィル基との間の他の共有結合リンカー(covalent linker)も、ジエノフィルの表面負荷及び／又は反応性を高めることが判明するならば、使用可能である。スキーム１４実施例１２（スキーム１５）はＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化による生成物捕捉を用いるダイマーの調製を説明する。３’，３’−結合した５’−ＤＨＤＴＯ−Ｔ−Ｔダイマーの捕捉速度は樹脂に結合したマレイミド基の過剰さに依存する。生成物捕捉は定量的に進行する。捕捉された生成物は樹脂からジクロロメタン中３％ジクロロ酢酸によって容易にかつ定量的に放出される。中和し、濃縮した後に、純粋な生成物が得られる。実施例１３は、ジエノフィル誘導体化樹脂への５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）保護オリゴヌクレオチドの付加環化を用いて、樹脂上に１つのブロックを捕捉することによる、ブロックからのオリゴヌクレオチドのアッセンブリー方法を説明する。実施例１４（図８）は、実施例１０に説明したように、サイクル毎のモノマー付加生成物の共有結合的捕捉を用いた３’−末端ポリエチレングリコールを有するオリゴヌクレオチドの自動化調製のための自動化抽出／濾過系２００とプロセスを説明する。上述したように、ヌクレオシドホスホロアミダイトの制御された逐次重合から成るＰＡＳＳプロセスは自動化形式で行うことができる。各モノマー付加は化学的処理工程のシーケンスから成る。このシーケンスは各モノマー付加（サイクル）に関して同じままである。サイクル毎の唯一の変数は、加えられるモノマーの性質である。典型的なオリゴヌクレオチドは２〜１２の異なるモノマーから成り、これらのモノマーは典型的に、専用の(dedicated)プログラム可能なシーケンスで一度ならず加えられる。図８に見ることができるように、自動化抽出／濾過系２００は３センター：反応器２１２と、濾過室２１４−−ジエノフィル修飾固体サポート２１５を含有する−−と、限外濾過膜系２１８とを有する。実施例１４はさらに、捕捉樹脂から放出された後の生成物オリゴヌクレオチドと過剰なモノマーとの分離のために必要な条件に適合しうる種々な限外濾過膜を列挙する。膜を試薬／生成物吸着、保持及び反応性に基づいて評価する。実施例１４に挙げた膜は溶媒によって影響される流動速度(flux rate)、吸着による生成物損失に基づいて、及び最終的に拡散反射ＦＴＩＲによって適切であることが判明した。説明のために、３’−末端ＰＥＧオリゴヌクレオチドの調製を実施例１４に示すが、この自動化合成方法はオリゴヌクレオチドに結合したマクロ分子が存在しても存在しなくても行うことができる。後者の場合に、分子量カットオフ膜の代わりに図５に示すような液体／液体抽出工程を用いることができる。実施例１５はマレイミド誘導体化トリチル基の合成を説明する。上記で考察したように、ＰＡＳＳプロセスの不可欠な部分はｎ−１配列を除去する方法である。１つのアプローチはマレイミド修飾トリチル基を含有するモノマーを用いたオリゴヌクレオチド合成である。これらのトリチル基はジエン修飾樹脂との反応を受けやすく、樹脂の簡単な洗浄と、その後の脱トリチル化による全長オリゴヌクレオチドの放出によってｎ−１の分離を可能にする。実施例１６は、溶液相合成中及び慣用的な固相合成中の失敗配列を選択的に除去するためのジエン修飾キャッピング試薬の使用を説明する。典型的に、失敗配列は無水酢酸によってキャッピングされる。無水酢酸とのキャッピング反応は迅速にかつほぼ定量的に進行する。したがって、例えば３，５−ヘキサジエン酸無水物（７４）と３，５−ヘキサジエノキシ酢酸無水物（７５）のような無水酢酸のジエン修飾類似体（スキーム１８）は失敗配列の効果的なキャッピングを可能にし、実施例７で述べるような溶液相合成中の各サイクルにおいてジエノフィル誘導体化樹脂又は膜への付加環化によって、キャッピングされた失敗配列の除去をも可能にする。慣用的な固相合成中に導入される５’−アセチルキャッピング基はアンモニア切断及び脱保護工程中に除去される。試薬７４又は７５を固相合成におけるキャッピング試薬として及び失敗配列を選択的に除去するためのその後のハンドルとして利用するためには、オリゴヌクレオチドを、非塩基性条件下で選択的に切断可能である、例えば実施例１２に述べるようなリンカーを介してサポートに結合させなければならない。或いは、慣用的な固相合成の最後に用いられる、典型的な塩基性脱保護条件下で除去され難いキャッピング試薬を用いることができる。ヘキサジエノキシシリルクロリド（７６、７７及び７８）は、粗オリゴヌクレオチドがサポートからアンモニアによって切断されたならば、失敗配列の選択的な除去を可能にする。シリルエーテル基はこれらの条件下で除去されない。したがって、ヘキサジエノキシシリルキャップト失敗配列は、ジエノフィル誘導体化樹脂又は膜との反応によって所望の生成物から除去されることができる。スキーム１８図１０は、ペプチドのアッセンブリーに適用される、本発明の方法を一般的に説明する。図１０に関して、Ｎ−保護アミノ酸モノマー単位７７を活性剤の存在下の溶液中でペプチド出発物質７８に加える。Ｒ⁶は標準カルボキシ・ブロッキング基、溶解性ポリマー又は診断デテクターである。Ｎ−末端保護基Ａは樹脂８０上の基Ｙと選択的かつ共有結合的に反応するように設計された部分Ｘによって誘導体化される。標準カップリング方法による、７７と、遊離Ｎ−末端アミノ基を有するペプチド出発物質７８との反応は、今やＮ−末端保護基を有する伸長ペプチド生成物７９の形成をもたらす。さらに、反応混合物は未反応ペプチド出発物質７８並びに過剰なＮ−保護アミノ酸モノマー７７とカップリング試薬を含有する。ペプチド生成物７９は、未反応モノマー７７と共に、基Ｘと樹脂上の置換基Ｙとの反応によって樹脂上に選択的に捕捉されて、固体サポート結合生成物８１と８２を形成する。樹脂からの８１と８２の放出がＮ−脱保護ペプチド生成物８３をＮ−脱保護アミノ酸モノマーと共に生じる。最も可能にはベタイン形の遊離アミノ酸である後者は沈降、抽出又は膜濾過によって容易に除去される。或いは、樹脂上に生成物を捕捉する前に、これらの方法によってアミノ酸モノマー７７を除去することができる。そのあとで、伸長した脱保護生成物８３はさらなる付加サイクルを容易に受けて、ペプチド鎖を伸長させることができる。バッチ式製造では、未反応ペプチド出発物質７８（失敗配列）を単離して、次のサイクルにおける適当なモノマー付加反応工程に用いることができる。このことは、生産的生成物へのアミノ酸モノマー転化の最大の効率を可能にする。Ｎ−末端保護基Ｘ−Ａは、その化学的組成とＸ−Ｙ捕捉反応とが慣用的なペプチド合成反応に適合しうるように設計される。基Ａは、非限定的に、例えばｆｍｏｃとＢｏｃのようなウレタン、ベンジル基、アシル基又はトリフェニルメチル基を含めた、当業者に公知の任意のＮ−保護基から選択することができる（例えば、Bodansky（1984）principles of Peptide Synthesis（Springer Berlag、Be rlin）参照）。置換基Ｘは樹脂上の置換基Ｙと高い選択性で反応するように設計される。これは例えばジエン、特に３，５−ヘキサジエノキシ若しくはソルビンアミド、ジエノフィル、特にマレイミド、アルキン、シリルエーテル保護ジオール及びジスルフィドのような基から選択される。対応置換基Ｙは、例えばジエノフィル、ジエン、メルカプタン又はボレートのような、置換基Ｘの選択的な共有結合的反応パートナーであるように選択される。選択された付加工程又はペプチド合成の最終工程におけるＮ−末端Ｘ−Ａ保護基を有するアミノ酸モノマーの導入は、各モノマー付加工程における選択的生成物捕捉のためのアンカーとして役立つばかりでなく、Ｙ−誘導体化樹脂上の捕捉を介して、最終的脱保護の前に生成物をアフィニティ精製するために役立つ。この捕捉はセグメント縮合とその後の精製の効率を劇的に高める。樹脂上のＮ−末端セグメントの捕捉によって、そのＣ−末端保護基は除去され、洗い流されるので、労力を要し、収量を減ずる仕上げ処理が不要である。この新たな遊離Ｃ−末端カルボキシル基は標準方法によって活性化されて、遊離Ｎ−末端アミノ基を有するＣ−末端セグメントにカップリングする。首尾よいセグメント縮合後に、試薬を洗い流し、生成物ペプチドを標準方法によるＮ−Ａ結合の選択的破断によって樹脂から放出して、本質的に純粋な側鎖保護ペプチドを得る。実施例１７は、ＰＡＳＳによるペプチド合成のためのＮ−２，７−ジ（３，５ −ヘキサジエノキシアセチル）ｆｍｏｃ保護アミノ酸モノマーの調製と使用を説明する。実施例１８は、ＰＡＳＳによるペプチド合成のための２，７−ジ（マレイミド）フルオレン−９−メチルクロロホルメートの調製と使用を説明する。実施例１９は、ＰＡＳＳによるヘキサジエノキシ−Ｂｏｃ保護アミノ酸を用いるペプチドのアッセンブリーを説明する。実施例２０は、ＰＡＳＳによるペプチド酢酸の調製を説明する。下記実施例は例証のためにのみ提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。実施例１．Ｎ−４−ベンゾイル−３’−（５’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−（２−シアノホスホリル）チミジル）−２’−フルオロシチジン（１６）（スキーム４）５’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン１２（５’−ＴＢＤＭＳ−チミジン）（０．１５ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥アセトニトリル（１０ｍｌ）中に溶解した。シチジンアミダイト(cytidine amidite)１３（０．４３ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加えた後に、テトラゾール（６．５ｍｌ、アセトニトリル中０．４５Ｍ）を加えた。１５分間後に、反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析（Ｃ１８、４．６ｘ１００ｍｍ、緩衝剤Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．５、緩衝剤Ｂ：アセトニトリル、２．５分間にわたって０〜８０％Ｂ）は、ダイマー（２．４分）と、未反応チミジン１２（１．４分）と、加水分解したアミダイトモノマー（２．１分）との存在を示した（図１）。反応混合物をｉｎｓｉｔｕ酸化した（１０ｍｌ、水／ピリジン中０．２Ｍヨウ素）。酸化後のＨＰＬＣ分析はピリジン（０．９分）と、未反応チミジン１２（１．４分）と、酸化アミダイトモノマー１５（１．８分）と、酸化ダイマー１４（２．３分）とを示す（図２）。酸化後に、反応混合物をアセトニトリルと共に、アセトニトリルと予備平衡させたＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）の床に通した。濾液のＨＰＬＣ分析は図３に示すように酸化アミダイトモノマー１５の保持を示した。濾液を減圧下で濃縮して、固体を６０％アセトニトリル／水中に再溶解して、７０％水／アセトニトリルと予備平衡させたＣ１８室上に負荷した。この室を７０％水／アセトニトリルによって洗浄し、次に５０％水／アセトニトリルによって洗浄して、未反応チミジン１２を完全に溶出した。次に、室を水によって洗浄し、脱トリチル化を行うために８０％酢酸／水によって処理した。脱トリチル化後に、５０％アセトニトリル／水によって洗浄して、最終生成物１６（ｍ／ｅ９２２、生成物１６プラストリエチルアミン）を溶出した。ＨＰＬＣ分析は１．７分に脱トリチル化種１６の溶出を示す（図４）。１６のＥＳＭＳ（エレクトロスプレイ質量分析法）：計算値８２０．２７（Ｍ＋）；実測値９２２．２（Ｍ＋Ｈ＋ＴＥＡ）。³¹ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃、Ｈ₃ＰＯ₄外部基準）δ−０．７３、−１．９３。トリチル種は室上に保持された。実施例２：Ｈ−ホスホネートチミジントリマー（Ｔ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）（２０）の調製３’末端に３’，３’−インターヌクレオチド結合を有するＨ−ホスホネートチミジントリマーのアッセンブリーをスキーム５に概略を示すように合成した。スキーム５５’−ジメトキシトリチルチミジン３’−Ｈ−ホスホロアミダイト１７への１２のカップリングアルゴン下で１：１アセトニトリル：ピリジン（４２ｍｌ）中の１７（０．７５ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、１２（０．２５ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を加え、次に９５：５アセトニトリル：ピリジン（８．４ｍｌ）中のピバロイルクロリド（０．２６ｍｌ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応を１０分間撹拌した、この時点において逆相ＨＰＬＣ分析は１２からダイマー１８への完全な転化を示した。次に、混合物を真空濃縮して、ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解して、０．０５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムによって抽出した。塩化メチレン層をＢｕｅｃｈｎｅｒロート上のＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）プラグに供給した。濾液の逆相ＨＰＬＣ分析は未反応モノマー１７の完全な除去を示した。濾液の蒸発によってダイマー１８を定量的収率で単離し、その構造をＮＭＲとＥＳＭＳ分析とによって確認した。未反応モノマー１７をＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）プラグから、ＩＭ炭酸水素トリエチルアンモニウムによる洗浄によって回収した。１８のＥＳＭＳ：計算値９４６．４（Ｍ＋）；実測値９４６．３．ダイマー１８の脱トリチル化．ダイマー１８（０．８５ｇ、０．９ｍｍｏｌ）をＺｎＢｒ₂（１０ｍｌ、約０．１ＭＺｎＢｒ₂）で飽和された塩化メチレン中に溶解した。１５分間後に、逆相ＨＰＬＣ分析は完全な脱トリチル化を示した。反応を等量の１Ｍ酢酸アンモニウムによってクエンチした。有機層を濃縮し、残渣を１：１アセトニトリル：水中に溶解し、Ｂｕｅｃｈｎｅｒロート上のＣ１８プラグに通した。濾液の蒸発は０．２９ｇ（５０％収率）の純粋なダイマー１９を生じた。１９のＥＳＭＳ：計算値６４４．２（Ｍ＋）；実測値６４５．３．トリマー２０の調製．１：１ピリジン：アセトニトリル（２３ｍｌ）中のダイマー１９（０．２５ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、１７（０．４１ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を加え、次に９５：５アセトニトリル：ピリジン（４．５ｍｌ）中のピバロイルクロリド（０．１４ｍｌ、１．１６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応をアルゴン雰囲気下で10分間撹拌し、この時点においてＨＰＬＣ分析はダイマー１９からトリマー２０への完全な転化を示した。混合物を蒸発乾燥させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解し、０．０５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムによって洗浄し、有機層をＢｕｅｃｈｎｅｒロート上のＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）プラグに供給した。濾液を蒸発させて、定量的収量で２０を得た。２０のＥＳＭＳ：計算値１２３４．４（Ｍ＋）；実測値９３３．５（Ｍ＋Ｈ＋ＤＭＴの損失を伴う）。実施例３：５’−Ｏ−（４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメチル）チミジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト（２６）の調製５’−保護基（Ｄ−Ｅ）として４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（ＤＯＴ）を含有するホスホロアミダイトモノマーのアッセンブリーをスキーム６に説明する。スキーム６４，４’−ジオクタデシルオキシ−ベンゾフェノン（２２）．ナトリウム金属（０．４６ｇ、２０ｍｍｏｌ）をエタノール（５０ｍｌ）中に溶解し、４，４’ −ジヒドロキシベンゾフェノン（１．０ｇ、４．６７ｍｍｏｌ）を加え、次に１ −ブロモオクタデカン（７．８ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）と触媒量のヨウ化ナトリウム（約３０ｍｇ）とを加え、反応混合物を４８時間還流させた。得られた懸濁液を冷却し、濾過した。固体をジクロロメタンとその後のヘキサンとによって洗浄して、白色固体を乾燥させて、化合物２２（２．８５ｇ、８４％収率）を得た。４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（２３）．無水ＴＨＦ（４ｍｌ）中のベンゾフェノン２２（０．３ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、臭化フェニルマグネシウム（０．５５ｍｌ、ＴＨＦ中１．０Ｍ溶液、０．５５ｍｍｏｌ）を加え、反応を３時間還流させた。追加量の臭化フェニルマグネシウム（０．２ｍｌ）を加えて、加熱を０．５時間続けて、この時点において出発物質の全ては溶解していた。次に、反応を冷却し、０．５ＭＨＣｌを加えた。懸濁液を濾過し、固体を水（３ｘ）、ヘキサン（２ｘ）及びジクロロメタン（２ｘ）によって洗浄した。有機洗液(washes)をプールして、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させて、２３（０．２１ｇ、６３．６％収率）を白色固体として得た。５’−Ｏ−（４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメチル）チミジン（２５）．化合物２３（２．１ｇ、２．６３ｍｍｏｌ）をトルエンと共に２回共蒸発させて(coevaporated)から、トルエン（３０ｍｌ）中に溶解した。塩化アセチル（１１ｍｌ、１５４．７ｍｍｏｌ）を加えて、反応を３時間還流させてから、蒸発させた。残渣をトルエンと共に２回共蒸発させて、粗生成物(crude)２４を得た。２４にピリジン（３０ｍｌ）と、ＤＭＡＰ（２５ｍｇ）と、チミジン（０．４５ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）とを加えて、反応を室温において一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させて、残渣をジクロロメタン中に入れて、５％炭酸水素ナトリウムによって洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させて、残渣をシリカゲル（酢酸エチル／２％トリエチルアミン）上で精製して、適当な画分の蒸発後に化合物２５（ＤＯＴチミジン）（１．６ｇ、８４％収率）を淡黄色固体として得た。５’−Ｏ−（４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメチル）チミジン−３’ −Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト（２６）．ＤＯＴチミジン２５をジクロロメタン（５ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍｌ、１．７５ｍｍｏｌ）中に溶解して、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１５ｍｌ、０．６３ｍｍｏｌ）を氷浴で冷却しながら加えた。氷浴を除去して、反応を室温において４時間撹拌して、この時点において追加の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１ｍｌ）を加え、反応を室温において１６時間撹拌した。反応溶液をジクロロメタンによって希釈し、５％炭酸水素ナトリウムによって洗浄して、有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させた。残渣をシリカ上で精製して、最初にヘキサンによって溶出させ、次に２０％酢酸エチル／全てが２％トリエチルアミンを含有するヘキサンによって溶出させて、２６を分割ジアステロマー（迅速０．１ｇ、緩慢０．１８ｇ、４６．７％収率）として得た。２６ａ（迅速ジアステロマー）実施例４．逆相樹脂上のアルキル置換トリチル基の分割４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（ＤＯＴ）のアルコール、４−デシルオキシ−４’−メトキシトリタノール、及びジメトキシトリタノール（ＤＭＴ）をＣ１８逆相ＴＬＣプレート上にスポットし、このプレートを３種類の異なる溶媒中で展開させた（表１）。表１において見ることができるように、例えばメタノール（Ｒ_f＝０）及びアセトニトリル（Ｒ_f＝０）のような有機溶媒中でのＤＯＴ基とＣ１８樹脂との強い相互作用が存在する。この相互作用は、Ｃ１８逆相樹脂に対するトリチル保護基のアフィニティ又は相互作用に基づいて出発物質からのカップリング生成物の１工程分離を可能にする。実施例５．生成物捕捉のために疎水性アフィニティを利用した、ＰＡＳＳによる５’−ＨＯ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ−３’の調製５’−ＨＯ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの調製．５’−ＴＢＤＰＳ−チミジン１２（０．９９ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレンによって共蒸発させ、１０ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解した。チミジンアミダイト（２．０ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）を加え、次にアセトニトリル中０．５Ｍテトラゾール（２１ｍ１、１０．５ｍｍｏｌ）を加え、反応をアルゴン下で撹拌した。９０分間後に、ヨウ素／水／ピリジンの溶液（０．２Ｍ）を、暗褐色が持続するまで加え、次に５％ＮａＨＳＯ₃を色が黄色に戻るまで加えた。濃縮した反応を分離させ（ＣＨ₂ Ｃｌ₂／水）、有機層をＭｇＳＯ₄によって乾燥させ、蒸発乾燥させた。固体残渣をメタノール／少量塩化メチレン中に溶解して、水と、次にメタノールと平衡させたＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）の７５ｇ床上にピペットで移した。ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）を３００ｍｌのメタノールによって洗浄し、一緒にしたメタノール洗液を濃縮して、２．４２ｇの白色泡状物を得た。脱トリチル化：白色泡状物を５０ｍｌの３％ＤＣＡ中に溶解し、室温において３５分間撹拌してから、塩化メチレンと平衡させた８０ｍｌのシリカゲル上に注入した。このゲルを１５０ｍｌの３％ＤＣＡによって洗浄し、次に１００％塩化メチレンから塩化メチレン中６％メタノールまでの溶液によって洗浄した。適当な画分を一緒にして、濃縮して、１．５８ｇの脱トリチル化ダイマー（５’−ＨＯ −Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）を２工程プロセスに関して９０％収率で得た。５’−ＨＯ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの調製．５’−ＨＯ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔダイマー（１．４７ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させてから、乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂と共に共蒸発させ、８．５ｍｌの乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解した。シチジンアミダイト（１．９０ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を加え、次にアセトニトリル中テトラゾール（０．５Ｍ）（１７．６ｍｌ、８．７８ｍｍｏｌ）を加え、反応をアルゴン下で撹拌した。５０分間後に、０．５Ｍヨウ素溶液を加え、次に５％ＮａＨＳＯ₃を加えて、上述したように、色を褐色から黄色まで変化させた。濃縮した反応を分離させ（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発乾燥させた。固体残渣をメタノール／少量塩化メチレン中に溶解して、水と、次にメタノールと平衡させたＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）の７５ｇ床上にピペットで移した。ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）を塩化メチレンとメタノールとによってゆっくり洗浄し、一緒にした洗液を濃縮して、２．５３ｇの黄色泡状物を得た。脱トリチル化：泡状物を５０ｍｌの３％ＤＣＡ中で室温において撹拌した。２時間後に、反応混合物を塩化メチレンと予備平衡させたシリカゲルの８０ｍｌ床上にピペットで移した。混合物を３％ＤＣＡによって溶出させ、次に１００％ＣＨ₂ Ｃｌ₂からＣＨ₂Ｃｌ₂中６％メタノールまでの溶液によって溶出させた。適当な画分を一緒にして、濃縮して、１．４３ｇの脱トリチル化トリマー（５’−ＨＯ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）を２工程プロセスに関して６４％収率で得た。５’−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの調製．脱トリチル化トリマー５’−ＨＯ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ（１．４３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させてから、乾燥塩化メチレンと共に共蒸発させ、６ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解した。アデニンアミダイト（１．２４ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を加え、次にアセトニトリル中０．５Ｍテトラゾール（１１ｍｌ、５．５７ｍｍｏｌ）を加え、反応をアルゴン下で撹拌した。約６０分間後に、０．５Ｍヨウ素溶液を暗色が持続するまで加えた。次に、混合物を１時間撹拌し、濃縮した。ガム状物を分離させ（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、一緒にした有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、２．４６ｇの黄色固体を得た。ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）精製なしに脱トリチル化を行った。脱トリチル化：泡状物を５０ｍｌの３％ＤＣＡ中で室温において撹拌し、次に、塩化メチレンと平衡させたシリカ床（約１２０ｍｌ）上にピペットで移した。反応混合物を３％ＤＣＡによって溶出させ、次に１００％塩化メチレンから塩化メチレン中１０％メタノールまでの溶液によって溶出させた。適当な画分を一緒にし、濃縮して、１．４１ｇの脱トリチル化テトラマー（５’−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ −［３’，３’］−Ｔ）を２工程プロセスに関して７２％総収率で得た。５’−ＨＯ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの調製．脱トリチル化テトラマー５’−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ（１．４１ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を高真空下で乾燥させてから、乾燥塩化メチレンと共に共蒸発させ、４．５ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解した。チミジンアミダイト（０．７８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を加え、次にアセトニトリル中テトラゾール（０．５Ｍ）（８ｍｌ、４．０２ｍｍｏｌ）を加え、反応をアルゴン下で撹拌した。２時間後に、０．５Ｍヨウ素溶液を暗色が持続するまで加えた。次に、反応を次に濃縮し、ガム状物を分離させ（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、一緒にした有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、２．１ｇの黄色泡状物を得て、これを質量分析法と逆相ＨＰＬＣとによって分析してから、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）に通して溶出させた。酸化後の粗反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析はペンタマーと、未反応テトラマー（失敗配列）と、加水分解したアミダイトモノマーとの存在を示した。ＥＳＭＳ（Ｍ−１）８０３．７４ｘ３。黄色泡状物を少量の塩化メチレン中に溶解して、水と、次にメタノールと平衡させたＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）床上に負荷させた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）をメタノールと、塩化メチレンと、次にアセトニトリルとによって洗浄した。適当な画分を一緒にし、濃縮して、１．４８ｇの物質を得た。脱トリチル化：この物質を４０ｍｌの３％ＤＣＡ中で室温において撹拌し、塩化メチレンと平衡させたシリカ床上にピペットで移した。これを３％ＤＣＡによって溶出させ、次に１００％塩化メチレンから塩化メチレン中２０％メタノールまでの溶液によって溶出させた。適当な画分を一緒にして、濃縮して、０．９８ｇの脱トリチル化ペンタマー（５’−ＨＯ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）を２工程プロセスに関して６４％総収率で得た。³¹ＰＮＭＲとそのインテグレーション(integration)は生成物に一致する。５’−ＨＯ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの調製．脱トリチル化ペンタマー５’−ＨＯ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ（０．９６ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を高真空下で乾燥させてから、乾燥塩化メチレンと共に共蒸発させ、５ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解した。チミジンアミダイト（０．４４ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を加え、次にアセトニトリル中テトラゾール（０．５Ｍ）（４．５ｍｌ、２．２７ｍｍｏｌ）を加え、反応をアルゴン下で撹拌した。この溶液は均質でなかったので、２ｍｌのアセトニトリルを加えた。２時間後に、追加の０．１５ｇのモノマーを加え、反応を一晩撹拌した。０．５Ｍヨウ素溶液を加え、次に５％ＮａＨＳＯ₃を加えて、色を褐色から黄色まで変化させた。濃縮した反応を分離させ（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、１．６１ｇの黄色固体を得て、これをＭＳによって分析した。ＥＳＭＳ（Ｍ−１）１３８４．０１ｘ２。粗反応混合物（１．４８ｇ）をＣ１８樹脂に吸収させて、アセトニトリルと平衡させた後に７０％水／アセトニトリルと平衡させたＣ１８樹脂（約１２５ｇ）床上に負荷した。この樹脂を最初に１：１水：アセトニトリルによって洗浄して、モノマーを溶出させ、次にアセトニトリルと塩化メチレンによって洗浄して、ヘキサマーを溶出させた。適当な画分を一緒にし、濃縮して、０．８３ｇ（６６％収率）の固体を得た。脱トリチル化：この固体を２０ｍｌの３％ＤＣＡ中で室温において撹拌した。トリヘキシルシラン（２ｍｌ）を加えて、撹拌を続けた。ヘキサンを加えると、固体が形成され、この固体をヘキサン／エーテルによって洗浄して、０．５ｇのピンク色固体を得た。³¹ＰＮＭＲとそのインテグレーションは生成物に一致する。ＤｏｗｅｘＣｌ形を用いて、固体サンプルから残留ＤＣＡを除去することができる。例えば、Ｔ−Ａホスホロアミダイトダイマーは、脱トリチル化とヘキサン沈降の後に約１．２当量のＤＣＡを含有することがＮＭＲによって判明した。このダイマーのサンプル（０．３ｇ）をアセトニトリル（５ｍｌ）中に溶解して、アセトニトリルと予備平衡させたＤｏｗｅｘＣｌ形（１５ｇ）のカラムに負荷した。液体をポタポタと(dropwise)溶出させ、次にカラムを３５ｍｌのアセトニトリルによって洗浄し、液体を濃縮して、０．２６ｇの白色泡状物を得た。ＮＭＲによって検査したサンプルは酸の約９５％減少を示す。実施例６．生成物を捕捉するために疎水性アフィニティを用いるＰＡＳＳの自動化例えば、実施例２における１２と１７との反応（スキーム５）のようなカップリング反応後に、反応混合物を入口１２８から抽出器１１２中へポンプで供給する（図５）。炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝剤（ＴＢＫ）（０．０５Ｍ）とＣＨ₂Ｃｌ₂とを抽出器に入口１３０から加えて、混合物を撹拌する。層を分離させる。分離後に、弁１２０を開き、塩化メチレン層を導電率計１３６に通過させて、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）プラグ１１４上に達しさせる。導電率の上昇は、ＣＨ₂Ｃｌ₂が完全に導電率計を通過して、水性層が今や導電率計に入ったことを示す。このときに、弁１２０は自動的に切り替わって、水性層をＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）プラグから方向転換させる。有機層は、入口１４０から室に入るアルゴンによって、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）プラグに通して押し進められる。次に、弁１２２によって制御されて、入口１４２から加えられるＣＨ₂Ｃｌ₂によって、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）プラグを洗浄する。オリゴヌクレオチド生成物と未反応オリゴヌクレオチド出発物質（失敗配列）とを含有するＣＨ₂Ｃｌ₂流出液は、弁１２４によって制御されて、出口１４４から回収される。ＣＨ₂Ｃｌ₂が完全に流出した直後に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ブラグに保持されている未反応ホスホロアミダイトモノマーを１ＭＴＢＫによって溶出させる。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）プラグをＣＨ₂Ｃｌ₂と再平衡させる。ＣＨ₂Ｃｌ₂流出液を次に逆相樹脂に通して、カップリング生成物を失敗配列から分離させる。その５’−末端に結合したＤＭＴ基を有するカップリング生成物は樹脂上に保持され、失敗配列は室から溶出される。次に、樹脂を酸性ジクロロ酢酸（ＣＨ₂Ｃｌ₂中３％）によって洗浄する、この酸はＤＭＴ保護基を切断して、カップリング生成物を室から放出する。カップリング生成物はｐＨ緩衝化溶液中に溶出されて、酸への過度暴露による分解を防止する。この流出液を濃縮して、カップリング生成物を次の反応サイクルの出発物質として用いる。実施例７．溶液相合成による３’−ＰＥＧ固定１５マーＤＮＡの調製３’−末端修飾として分子量２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる液相合成によって、配列５’−ＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧ−［３’ ，３’］−Ｔ−Ｔ−３’（配列番号：１）のオリゴヌクレオチドを調製した。ポリエチレングリコールは個々の工程中の成長するオリゴヌクレオチド鎖の容易な調製を可能にする。この実施例は、典型的なＰＡＳＳサイクルにおけるような樹脂上へのオリゴヌクレオチド・カップリング生成物の捕捉を含めない、溶液相合成に必要な基本的工程を略述する。したがって、この実施例は、ＰＡＳＳにおいて考えられる生成物捕捉が与える、効率及び生成物純度に対する影響を実証する。各モノマー付加サイクルにおけるこのような生成物捕捉によって、ジエチルエーテルからの厄介な沈降はもはや不要になる。さらに、失敗配列は各モノマー付加サイクルにおいて除去されるので、ＰＡＳＳによって得られる生成物のアニオン交換クロマトグラムは、図６に見られる多重ピークではなく、単一生成物ピークのみを示すと予想される。この実施例は、失敗配列から生成物を分離するための手段としての生成物捕捉を含めずに、溶液相合成による３’−ＰＥＧ固定オリゴヌクレオチドの調製の各モノマー付加サイクルのために従われる一般的な方法を提供する。下記反応の全ては、セルフシール隔壁(self-sealing septum)を備えた一つ口フラスコにおいて行った。使い捨て式プラスチック・シリンジ(syringe)を用いた。脱トリチル化：５’−ＤＭＴ−ヌクレオシド３’−Ｏ−ＰＥＧ（５．０ｇ）（２０ｋ、負荷：４５μｍｏｌ／ｇ）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）とトリヘキシルシラン（６．４ｍｌ、８０当量）との混合物５０ｍｌ中に溶解した。９分間後に、脱トリチル化５’−ＨＯ−ヌクレオシド３’−Ｏ−ＰＥＧをエーテル（２ｘ）によって沈降させ、洗浄し、濾過し、真空下で乾燥させた。カップリング反応：５’−ＨＯ−ヌクレオシド３’−Ｏ−ＰＥＧを２０ｍｌの無水アセトニトリルと共に３回、共蒸発させ、高真空下で３０分間乾燥させた。フラスコをアルゴンによってフラッシュして、外部雰囲気に対して閉鎖する。次のものを隔壁を通して注入した：５’−ＨＯ−ヌクレオシド３’−Ｏ−ＰＥＧを溶解するための５０ｍｌの無水アセトニトリル、無水アセトニトリル中アミダイト（０．１Ｍ、２．０当量）４．５ｍｌ、及びアセトニトリル中ＤＣＩ（１．０Ｍ、６．０当量）１．４ｍｌ。この溶液をアルゴン下で２５分間撹拌した後に、エーテルによって沈降させ、２０ｍｌの無水アセトニトリルとの共蒸発によって乾燥させた。酸化：沈殿を５０ｍｌの無水アセトニトリル中に溶解し、８ｍｌ（０．１Ｍ）のアセトニトリル中ヨードベンゼンジアセテートを注入し、反応混合物を８分間撹拌した。キャッピング反応：無水酢酸（６ｍｌ）と、２，６−ルチジン（６ｍｌ）と、Ｎ −メチルイミダゾール（６ｍｌ）とを同時に上記溶液に注入して、反応混合物をさらに５分間撹拌した。キャッピングしたオリゴヌクレオチド−ＰＥＧポリマーを脱トリチル化方法において上述したようにエーテルから沈降させた。結晶化：キャッピングしたオリゴヌクレオチド−ＰＥＧポリマーを６０℃における５００ｍｌの無水エタノール（１００ｍｌ／ｇ）からの結晶化によって精製した。モノマー付加サイクルプロトコールを表２に要約する。オリゴヌクレオチドの３’−末端１０塩基フラグメント（１０マー）（ＣＧＴＡＡＴＧＧ−［３’，３ ’］−Ｔ−Ｔ）（配列番号：２）の調製のための段階的カップリング効率を表３に示す。ＰＥＧからの切断と脱保護後の粗１５マー（５’−ＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧ−［３’，３’］−Ｔ−Ｔ−３’）（配列番号：１）のアニオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。実施例８．ジエン修飾トリチルアルコールの調製実施例８（スキーム７と８）は、５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）チミジン３’−ホスホロアミダイトモノマー３２を含めた、種々なジエン修飾トリチルアルコールの合成を説明する。スキーム７４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシベンゾフェノン（２９）の調製．無水ＴＨＦ（３３５ｍｌ）中の３，５−ヘキサジエノール（２７）（１３．７ｇ、１４０ｍｍｏｌ）（Ｍａｒｔｉｎ等（１９８０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：５２７４〜５２７９）の溶液に、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン（２８）（１０．０ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（３６．７ｇ、１４０ｍｍｏｌ）とを加え、次にジエチルアゾジカルボネート（ＤＥＡＤ）（２２．０ｍｌ、１４０ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。反応混合物をアルゴン下で一晩撹拌してから、真空下で蒸発乾燥させた。ジクロロメタン−ヘキサンからの沈降を行って、残留試薬を除去した。濾液を真空下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂、３／２）によって精製して、７．１２ｇの化合物２９を得た。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂、３／２）による濾液のさらなる精製がさらに５．９６ｇの２９を生じたので、合計１３．０８ｇ（７５％）の化合物２９を白色固体として得た。４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチルアルコール（３０）の調製．化合物２９（５．９６ｇ、１５．９１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１３３ｍｌ）中にやや加熱しながら溶解した。臭化フェニルマグネシウム（ＴＨＦ中の１．０Ｍ溶液３２ｍｌ、３２ｍｍｏｌ）を溶液に加え、混合物をアルゴン下、室温において５時間撹拌し、真空下で蒸発乾燥させた。残渣をジクロロメタン中に再溶解して、塩化アンモニウムの飽和溶液によって洗浄し、次に水によって洗浄した。有機層を乾燥させて（ＭｇＳＯ₄）、真空下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂、１／９）によって精製して、４．４５ｇ（６２％）の化合物３０を黄色油状物として得た。５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）チミジン（３１）の調製．化合物３０（３．５ｇ、７．７３ｍｍｏｌ）をトルエン（２ｘ）と共に共蒸発させてから、無水トルエン（８５ｍｌ）中に溶解した。塩化アセチル（３３ｍｌ、４６４ｍｍｏｌ）を溶液に加え、反応混合物を還流加熱して、アルゴン下で撹拌した。４時間後に、反応混合物を真空下で濃縮し、粗生成物をピリジンと共に共蒸発させてから、無水ピリジン（４２ｍｌ）中に溶解した。次に、ピリジンと共に共蒸発させてから、無水ピリジン（４２ｍｌ）中に溶解したチミジン（１．５ｇ、６．１８ｍｍｏｌ）を、粗生成物を含有する溶液に加えた。触媒量のジメチルアミノピリミジン（ＤＭＡＰ）を加えて、反応混合物をアルゴン下で一晩撹拌し、溶媒を蒸発させた。残渣をジクロロメタン中に再溶解して、炭酸水素ナトリウムの５％水溶液によって洗浄し、次に水によって洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／１）によって精製して、３．５３ｇ（８４％）の化合物３１を乳白色固体として得た。５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）チミジン３ ’−ホスホロアミダイト（３２）の調製．化合物３１（３．０ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン中に溶解して、ジイソプロピルエチルアミン（２．７ｍ１；１５．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を０℃に冷却し、２−シアノエチル −Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２．０ｍｌ、８．８６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をアルゴン下で撹拌しながら、室温に温度上昇させた。４時間後に、溶液をジクロロメタンによって希釈して、炭酸水素ナトリウムの５％水溶液（２ｘ）によって洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、真空下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３／７）によって精製して、２．８ｇ（７２％）の化合物３２をふわふわした白色固体として得た。スキーム８４，４’−ジ−２，４−ヘキサジエノキシベンゾフェノン（３５）の調製．４，４’−ジフルオロベンゾフェノン（３４）（４．８ｇ、２２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１リットル）中に溶解した。ＮａＨ（９５％；５．６ｇ、２２０ｍｍｏｌ）を加えて、溶液を０℃に冷却した。２，４−ヘキサジエノール（５．８ｍｌ、５１ｍｍｏｌ）を溶液に徐々に加えて、反応混合物をアルゴン下で一晩撹拌しなが室温に温度上昇させた。反応混合物を真空下で濃縮して、ジクロロメタン中に溶解し、水によって洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、真空下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂、１／３）によって精製して、２．０７ｇ（２５％）の化合物３５を白色固体として得た。４，４’−ジ−２，４−ヘキサジエノキシトリチルアルコール（３６）の調製．化合物（３５）（２．０ｇ）をＴＨＦ（４５ｍｌ）中に溶解し、この溶液に臭化フェニルマグネシウム（ＴＨＦ中の１．０Ｍ溶液；１０．６ｍｌ、１０．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温において３時間撹拌し、真空下で蒸発乾燥させた。残渣をジクロロメタン中で再溶解し、塩化アンモニウムの飽和溶液によって洗浄し、次に水によって洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、真空下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂、１／９）によって精製して、１．８４ｇ（７７％）の化合物３６を淡黄色固体として得た。化合物３６から、５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）チミジンホスホロアミダイト（３２）の調製に関して上述した同じ方法を用いて、５’−ジ−（２，４−ヘキサジエノキシ）チミジンホスホロアミダイトモノマーを調製することができる。実施例９．Ｎ−エチルマレイミドによるジエン修飾トリチルアルコールのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化実施例９（スキーム９）は、Ｎ−エチルマレイミドとの、ジエン置換トリチルアルコール［４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチルアルコール（３０）と４，４’−ジ−２，４−ヘキサジエノキシトリチルアルコール（３６）］のＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を述べる（それぞれ、反応１と２）。表４は種々な反応条件下でのこれらの２反応の反応速度を示す。スキーム９３，５−ヘキサジエノキシトリチルアルコール（３０）のＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応−反応１．化合物３０（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（０．７５ｍｌ）と水（０．７５ｍｌ）に溶解した。Ｎ−エチルマレイミド（Ｎ−Ｅｔマレイミド）（１３８ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温において撹拌した。３時間後に、粗反応混合物の¹ＨＮＭＲ分析は、反応が完成まで進行したことを示した。反応混合物を濃縮して、ジクロロメタンと予備平衡させたシリカゲル・プラグ上に負荷した。過剰なＮ−エチルマレイミドをジクロロメタンによって洗い流し、生成物を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によって溶出させた。溶媒を減圧下で濃縮して、３８ｍｇ（５９％）の化合物３７を得た。２，４−ヘキサジエノキシトリチルアルコール（３６）のＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応−反応２．化合物３６（６０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．０ｍｌ）に溶解した。Ｎ−エチルマレイミド（１６６ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温において撹拌した。２４時間後に、粗反応混合物の¹ＨＮＭＲ分析は、反応が完成まで進行したことを示した。反応混合物を濃縮して、ジクロロメタンと予備平衡させたシリカゲル・プラグ上に負荷した。過剰なＮ−エチルマレイミドをジクロロメタンによって洗い流し、生成物を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂によって溶出させ、減圧下で濃縮して、５０ｍｇ（５４％）の化合物３８を得た。実施例１０．Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化による生成物捕捉を用いた３’− ＰＥＧ結合オリゴヌクレオチドの調製実施例１０（スキーム１０）は、オリゴヌクレオチド生成物を共有結合的捕捉するためにＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化反応を用いた、溶液相合成による３ ’−ＰＥＧ固定オリゴヌクレオチド調製の各モノマー付加サイクルのために従うべき一般的方法を提供する。スキーム１０カップリング反応：ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨ（２０ｋ、２．３ｇ、０．１１ｍｍｏｌ、負荷：４６μｍｏｌ／ｇ）を、乾燥アルゴン雰囲気下で、２０ｍｌの乾燥アセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ）中に溶解した。この溶液に、５’−Ｏ−（４，４’− ジ− ３，５−ヘキサジエノキシトリチル）チミジン３’−ホスホロアミダイト（３２）（１４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加え、次にＣＨ₃ＣＮ中のＤＣｌ（０．６５ｍｌ、１．０Ｍ、６．０当量）を加えた。反応を乾燥アルゴン雰囲気下で２５分間撹拌し、この後に、３５０ｍｌの乾燥Ｅｔ₂Ｏを加えて、２０ｋ−ＰＥＧ含有物質を沈降させた。固体を濾過して、Ｅｔ₂Ｏ（２ｘ１００ｍｌ）によって洗浄し、真空下で１時間乾燥させて、２．３ｇの白色固体（９８％質量収率）を得た。酸化：カップリング生成物３９と、未反応ホスホロアミダイト３２と、未反応ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨとを含有する白色固体を２０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に再溶解して、ＣＨ₃ＣＮ中のヨードベンゼンジアセテート（８．５ｍｌ、０．１Ｍ、０．２７ｇ）によって酸化する。８分間撹拌した後に、反応混合物は未反応ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨと、酸化されたアミダイトモノマー４０と、酸化されたオリゴマー４１とを含有する。次に、反応混合物を３５０ｍｌの乾燥Ｅｔ₂Ｏによって処理して、２０ｋ−ＰＥＧを含有する物質を沈降させ、固体を濾過して、２ｘ１００ｍｌのＥｔ₂Ｏによって洗浄する。真空下での１時間の乾燥後に、未反応ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨとオリゴマー４１とを含有する白色固体を単離する。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化：この固体を２０ｍｌの５０％Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＮ中に再溶解して、５ｍｌの５０％Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＮによって予め湿潤させた、１．２ｇ（０．４ｍｍｏｌマレイミド／ｇ樹脂のマレイミド負荷に基づいて１０当量）のマレイミド官能化(maleimide-functionalized)ポリスチレン上に負荷する。反応をアルゴン雰囲気下で４５℃に１時間にわたって加温する。上澄み液の逆相ＨＰＬＣ分析は５’−保護オリゴマー４１が完全に消耗されたことを示すと予想される。次に、マレイミド誘導体化ポリスチレン４２を濾過して、１０ｍｌの５０％Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＮによって洗浄して、３．５ｇの３’−ＰＥＧ−５’− ＤＨＤＴＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒコンジュゲートオリゴマー（４２）を固体樹脂として得る。脱トリチル化／オリゴヌクレオチド放出：３．５ｇのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒコンジュゲート樹脂４２（負荷：７５μｍｏｌ／ｇ）を２０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に懸濁させることができると予想される。この懸濁液に、ＣＨ₂Ｃｌ₂中のＤＣＡとトリヘキシルシラン（６．４ｍｌ、８０当量）との混合物を加える。９分間後に、ポリスチレン−マレイミド樹脂（４４）を濾過によって除去する。次に、ＰＥＧ −ヌクレオシド（４３）をＥｔ₂Ｏ（５００ｍｌ）によって２回沈降させ、洗浄し濾過し、真空下で乾燥させる。得られたＰＥＧ−ヌクレオシドを５’−位置において脱保護し、シーケンスの次のカップリング反応の準備をする。実施例１１．Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ生成物捕捉による非−ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドの調製．スキーム１２は、ジエンとして５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル）ヌクレオシド（５’−Ｏ−ＤＨＤＴ−ヌクレオシド）を用い、ジエノフィルとしてマレイミド置換固体サポートを用いたＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ生成物捕捉によって非−ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドを調製するための一般的反応スキームを説明する。簡単には、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ捕捉ＰＡＳＳサイクル反応は次のように行われる。３’−ブロックトオリゴマー(3'-bloc ked oligomer)を通常の方法で５’−Ｏ−（４，４’−ヘキサジエノキシトリチル）ヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトとカップリングさせる。３’−ブロッキング基は脂質若しくは多糖であるか、又はより伝統的な溶液相ブロッキング基、例えばアセチル、ピラニル、又はシリル基、例えばｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテルである。スキーム１２ＤＨＤＴ：４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエノキシトリチル樹脂：マレイミド誘導体化固体サポート（ＣＰＧ、シリカ、セルロース、ＨＬＰ等）Ｘ：任意の適当に保護された２’−置換基Ｙ：ホスフェート保護基Ｂ：適当に保護され、修飾され又は誘導体化されたヌクレオ塩基Ｒ：オリゴヌクレオチド又は３’−ブロッキング基カップリング／酸化／捕捉シーケンス．ＣＨ₃ＣＮ中で、長さｎの適当な３’− ブロックトオリゴヌクレオチド（５０）を，ＣＨ３ＣＮ中のＤＣｌの０．１Ｍ溶液による処理によって、２．０当量のアミダイトモノマー５１とカップリングさせる。カップリング反応は２５分間未満を要し、ＴＬＣによってモニターされる。カップリング反応の完成時に、溶液をＣＨ₃ＣＮ中の０．１Ｍ溶液としての８．０当量のヨードベンゼンジアセテートによって直接処理する。酸化シーケンス (oxidation sequence)は８分間以内に完了する、次に、粗反応混合物をジエノフィル含有固体サポートに直接供給する。マレイミドジエノフィル含有ポリスチレンが好ましい固体サポートである。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化反応は、１：１ＣＨ₃ＣＮ：Ｈ₂Ｏの溶媒を用いることによって促進される。固体サポート５２に今や共有結合的に結合したオリゴヌクレオチドは、簡単な濾過と樹脂ビーズの洗浄とによって、未反応の出発オリゴヌクレオチド５０（失敗配列）及び試薬から容易に分離される。また５’−ＤＨＤＴ基を有するアミダイトモノマー５１も樹脂（５３）に結合する。脱トリチル化／放出シーケンス．共有結合したオリゴヌクレオチド（５２）と未反応モノマーホスフェート（５３）とを有する、洗浄され乾燥した樹脂を３％ＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂の溶液によって洗浄して、中和緩衝剤中に溶出させて、オリゴヌクレオチド鎖の酸仲介分解(acid-mediated decomposition)を防止する。放出されたオリゴマー（５４）とモノマーホスフェート（５５）とを水性抽出によって相互から分離する。有機相中の生成物オリゴヌクレオチドを乾燥させ、限外濾過によってアセトニトリル中に交換させる。実施例１２．Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化による生成物捕捉を用いるダイマーの調製スキーム１５５’−ＤＨＤＴＯ−Ｔ−［３’，３］−Ｔ−ＯＳｉＰＤＢＴ−５’（５６）の調製．５’−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３’−ＯＨ（１２）（０．２１ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのアセトニトリル中に溶解した。５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴホスホロアミダイト（３２）（０．５ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）をこの溶液に加え、次にアセトニトリル中の１．０ＭＤＣｌ３．０ｍｌ（３．０ｍｍｏｌ）を加える。この溶液をアルゴン下で２０分間撹拌して、この時点でピリジン／水中の０．２ＭＩ₂溶液の１１ｍｌを加えた。酸化反応を５分間進行させて、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）に通して濾過して（４ｘ）、黄色の大部分を取り出した。黄色固体５６（０．２３ｇ）が単離された。生成物捕捉：ポリスチレン担持マレイミド(polystyrene supported maleimide) （ＰＳ−Ｍ）の使用量を次のように：１０ｅｑ．、５ｅｑ．、２．５ｅｑ．、１ｅｑ．変化させてＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ捕捉反応を行った。以下の全ての反応に対する方法は次の通りであった。［３’，３’］−ｄＴ−ｄＴ−ＯＴＤＨＤダイマー（１１μｍｏｌ）（５６）を４００μｌのアセトニトリル中に溶解した。この溶液を１．０ｍｌの３／１ＣＨ₃ＣＮ／水中のＰＳ−Ｍの懸濁液に加えて、６５℃に加温した。反応の過程をＴＬＣ（２／１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）と、Ｒ_f＝０．１５における反応の消失と、ＨＰＬＣ分析（Ｃ１８、４．６ｘ１００ｍｍ、緩衝剤Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．５、緩衝剤Ｂ：アセトニトリル、２．５分間にわたって０〜８０％Ｂ）とによってモニターした。反応％はダイマー化物質（２．６５分）の、未反応５’−ＴＢＤＰＳｉＯ −ｄＴ−３’−ＯＨモノマー（１２）（１．７１分）に対する初期比率に比較して決定した（図７参照）。２．５当量、１．０当量、及び対照（非ＰＳ−Ｍ）のために描いたラインは全て、反応（ダイマーの消失）が４時間後に生ずることを示すことに注目することは重要である。この反応はＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ捕捉ではなく、加水分解であると考えられるものによるダイマーの分解である。ＨＰＬＣトレースには１．４７分と２．３０分に新しい物質が出現する。この物質は５’−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３’−ホスフェート（１．４７分）と５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴ−３’−ホスフェートであると考えられる。加水分解反応の過程において５’−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３’−ＯＨも生成すると考えられるので、加水分解が明らかである場合には内部基準が不適当になり、これらのトレースからＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ捕捉の相対的速度を直接得ることはできない。後のトレースで明らかになる５’−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３’−ホスフェートの量に合わせて調整することによって、加水分解を補正することができる。このプロセスは５．０当量及び１０．０当量の場合には、重要ではない。放出／脱トリチル化：１１μｍｏｌの［３’，３’］ダイマー５７によって誘導体化されたＰＳ−Ｍ２８６ｍｇを０．２５ｍｌのジクロロメタン中に懸濁させた。この溶液に、２．６ｍｌのジクロロメタン中３％ＤＣＡを加えた。ＰＳ−Ｍは直ちに明橙色に変わった。この懸濁液を５分間撹拌してから、ジクロロメタン溶液をＰＳ−Ｍから濾別した。得られた溶液を直ちに、Ｄｏｗｅｘ−Ｃｌ^-イオン交換樹脂のパッドにジクロロメタンと共に通して濾過した。次に、濾液を濃縮して、１２ｍｇの白色ガラス状固体（若干の残留溶媒と脂肪族不純物を含有する）を得た。¹ＨＮＭＲと³¹ＰＮＭＲとは所望の生成物の化合物５８と一致する。実施例１３．Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化によるフラグメント固定を用いた２ブロックからのオリゴヌクレオチドの調製ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド合成スキームは、スキーム１６に説明するような修飾ＰＡＳＳサイクルにおいて相互に結合することができる、オリゴヌクレオチドブロックの容易で、効果的な調製を可能にする。簡単には、上記で略述したようなＰＡＳＳモノマー付加サイクルによって調製されたオリゴヌクレオチドブロック５９をマレイミド樹脂と反応させて、樹脂固定オリゴヌクレオチドブロック６１を得る。このブロックから３’−末端ＰＥＧを三塩化チタンによるリンカーＬの還元切断(reductive cleavage)によって除去して、遊離３’−末端を有する樹脂結合フラグメント６３を得る。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチル −クロロホスフィンによる６３のリン酸化は３’−末端ホスホロアミダイト６４を生じる。次に、マレイミド樹脂上の捕捉と、その後の脱トリチル化後にオリゴヌクレオチドブロック６０の脱トリチル化から得られるオリゴヌクレオチドブロック６２に、化合物６４をカップリングさせる。カップリング反応の後に、ホスフィットトリエステル結合を酸化して対応ホスフェートトリエステルを得た後に、ジクロロ酢酸によって樹脂から生成物オリゴヌクレオチドを放出して、オリゴヌクレオチド・フラグメント６０を得る。スキーム１６実施例１４．オリゴヌクレオチド調製のためのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ生成物捕捉を用いたＰＡＳＳ自動化カップリング試薬を反応器２１２に加えて、実施例１０に述べたように、反応を進行させる。カップリング反応の完成時に、オリゴヌクレオチドを共有結合的に捕捉するために反応器２１４に含まれるジエン又はジエノフィル修飾樹脂又は膜（以下では、サポートと呼ぶ）を通して反応混合物を循環させる。捕捉工程に要する時間は、溶液からのカップリング生成物の消失をＨＰＬＣ又はインラインＵＶアッセイ（図示せず）によってモニターすることによって制御することができる。サポートを次にすすぎ洗いして、ジエン又はジエノフィルを含有しない全ての失敗配列を溶出させる。オリゴヌクレオチドがサポートに結合した後に、又はジエノフィルサポートに結合する前の溶液中で酸化を達成することができる。脱トリチル化の前に酸化溶液を樹脂から完全に除去しなければならない。この除去は、インライン導電率モニターリング（図示せず）によって、好都合に制御することができる。次に、サポートをＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂によってすすぎ洗いして、成長するオリゴマーと捕捉された過剰なモノマーとを樹脂から除去して、溶液中の唯一の種がＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂混合物中の５’−脱保護オリゴヌクレオチドとモノマーであるようにする。次に、アセトニトリルへの溶媒交換の他に、この混合物を膜セパレータ（２１８）に接触させて、ＤＣＡと過剰なモノマーとを除去する。或いは、沈降又は抽出によってモノマーを分離することができる。溶液中に残留する唯一の種はアセトニトリル中のマクロ分子結合オリゴマーである。この溶液は今や次のカップリング反応を受けることができる状態である。したがって、ジエノフィルサポートを用いる全てのｎ−１種の除去はキャッピング工程の使用を省略することができ、溶液は酸化される又はジエノフィルサポートを通して循環されることができる状態である。ジエノフィルサポートはジエノフィル部分と、樹脂又は膜との間の、例えばアミド結合のような、切断可能なリンカーを含有することができる。この切断可能なリンカーはジエノフィルサポートの容易な再生を可能にする。これらのようなリンカーは当業者に周知である。膜評価ポリプロピレン限外濾過膜への暴露後のＰＥＧ化(pegylated)デオキシチミジンの回収：アセトニトリル溶媒系２５ｍｌのアセトニトリル中に１．４９ｇの４６μｍｏｌｄＴ／ｇＰＥＧ−ｄＴを溶解することによって、２．７４ｍＭ２０ｋＰＥＧ−デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）の溶液を製造した。次に、この溶液のアリコート（２ｍｌ）を５０ｍｌＦａｌｃｏｎ（登録商標）管においてポリプロピレン限外濾過膜（３Ｍ（登録商標））の作用面の５．７３ｃｍ² 面積に０．２５時間、１時間及び４時間暴露させた。出発溶液をＦａｌｃｏｎ（登録商標）管と膜からアセトニトリルの２ｘ２５ｍｌ洗浄剤によってすすぎ洗いした。この洗浄溶剤をＰＥＧ−ｄＴに関して２６０ｎｍにおける吸光度によって分光測光的に分析して、出発ＰＥＧ−ｄＴの吸光度を基準にして比較検討した。膜なしのＦａｌｃｏｎ（登録商標）管を２ｍｌの出発溶液に４時間暴露させ、２６０ｎｍにおいてＰＥＧ−ｄＴに関して分析することによって、管及びガラス器による測定損失を検査した。結果は表６に示す。ポリプロピレン限外濾過膜への暴露後のＰＥＧ化デオキシチミジンの回収：塩化メチレン溶媒系２５ｍｌの塩化メチレン中に１．４８ｇの４６μｍｏｌｄＴ／ｇＰＥＧ−ｄＴを溶解することによって、２．７２ｍＭ２０ｋＰＥＧ− デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）の溶液を製造した。次に、この溶液のアリコート（２ｍｌ）を５０ｍｌＦａｌｃｏｎ（登録商標）管においてポリプロピレン限外濾過膜（３Ｍ（登録商標））の作用面の５．７３ｃｍ²面積に０．２５時間、１時間及び４時間暴露させた。出発溶液をＦａｌｃｏｎ（登録商標）管と膜から塩化メチレンの２ｘ２５ｍｌ洗浄剤によってすすぎ洗いした。この洗浄溶剤をＰＥＧ−ｄＴに関して２６０ｎｍにおける吸光度によって分光測光的に分析して、出発ＰＥＧ−ｄＴの吸光度を基準にして比較検討した。膜なしのＦａｌｃｏｎ（登録商標）管を２ｍｌの出発溶液に４時間暴露させ、２６０ｎｍにおいてＰＥＧ−ｄＴに関して分析することによって、管及びガラス器による測定損失を検査した。結果は表７に示す。再生セルロース限外濾過膜への暴露後のＰＥＧ化デオキシチミジンの回収：アセトニトリル溶媒系２５ｍｌのアセトニトリル中に１．５５ｇの４６μｍｏｌｄＴ／ｇＰＥＧ−ｄＴを溶解することによって、２．８５ｍＭ２０ｋＰＥＧ−デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）の溶液を製造した。次に、この溶液のアリコート（２ｍｌ）を５０ｍｌＦａｌｃｏｎ（登録商標）管においてポリプロピレン限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ^a、１０ＫＰＬＧＣ）の作用面の５．７３ｃｍ²面積に０．２５時間、１時間、４時間及び２４時間暴露させた。出発溶液をＦａｌｃｏｎ（登録商標）管と膜からアセトニトリルの２５ｍｌ洗浄剤によってすすぎ洗いした。膜を２５ｍｌのアセトニトリル中に６日間浸漬してから、さらに２５ｍｌのアセトニトリルによって洗浄した。この洗浄溶剤をＰＥＧ−ｄＴに関して２６０ｎｍにおける吸光度によって分光測光的に分析して、出発ＰＥＧ− ｄＴの吸光度を基準にして比較検討した。膜なしのＦａｌｃｏｎ（登録商標）管を２ｍｌの出発溶液に４時間暴露させ、２６０ｎｍにおいてＰＥＧ−ｄＴに関して分析することによって、管及びガラス器による測定損失を検査した。結果は表８に示す。アセトニトリル／エーテル中のＰＥＧ化デオキシチミジンの遠心分離：ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル及びＮ−ブチルエーテルとの比較１０ｍｌのアセトニトリル中に０．４８５５ｇの４６ｍｏｌ／ｇＰＥＧ−ｄＴを溶解することによって、２．３４ｍＭ２０ｋＰＥＧ−デオキシチミジン（ＰＥＧ− ｄＴ）の溶液を製造した。０．５、０．２５及び０．１２５ｍｌのアリコートを、１ｍｌのジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル又はＮ−ブチルエーテルを加えることによって沈降させた。沈殿を約４，４００倍の重力において２分間遠心分離した。上澄み液のＰＥＧ−ｄＴ含量を分光測光的に測定して、出発ＰＥＧ−ｄＴを基準にして比較検討した。取り扱いによる損失を示すために、１．５ｍｌの出発溶液を上記方法によって遠心分離し、分析することによって検査した。結果は図９に要約する。流動(flux)とＦＴＩＲ評価による適合性．ポリビニリジエンジフルオリド（ＰＶＤＦ）とポリプロピレン膜を、これらの膜を下記溶媒系：アセトニトリル、塩化メチレン、アセトニトリル中のカップリング／キャッピング／酸化（ｃ／ｃ／ｏ）溶液、及び塩化メチレン中３％ＤＣＡ混合物に浸漬することによって評価した。膜の小片、直径１．５”をこれらの溶液中に沈めて、２４時間浸漬させ、初期溶液の流動評価のために膜ホルダーに挿入し、さらにアセトニトリル流動評価のためにアセトニトリルによってすすぎ洗いした。このようにして、溶液中への浸漬後に膜上に残留していたと考えられる過剰な試薬は膜サンプルからすすぎ落とされた。種々な溶媒への暴露後のアセトニトリル流動速度は表９に記載する。見ることができるように、ＰＶＤＦ膜とポリプロピレン膜との間には（ｍｌ／分／ｃｍ²）での流動速度のごく僅かな変化が存在するに過ぎない。保持試験では、再生セルロース膜がＦＴＩＲによる測定によって若干のＰＥＧを保持していることが判明した。シリコーン、セラミック、ポリオレフィン及びＨＤＰＥ膜は研究中である。実施例１５．マレイミドートリチルモノマーの合成．スキーム１７４，４’−ジ−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシプロポキシ）−ベンゾフェノン（６６）の調製．４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン（２８）（１０ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）を、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ条件下で、０℃の乾燥テトラヒドロフラン中のｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−３−プロパノール（４０ｇ未精製(crude)、約１５０ｍｍｏｌ）、ＤＥＡＤ（２２．１ｍｌ、１４０．０ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（３６．７ｇ、１４０．０ｍｍｏｌ）と反応させた。反応をアルゴン下で室温に温度上昇させた。２４時間後に、反応を濃縮し、塩をヘキサン／エーテルによって沈降させ、濾過した。残留物質をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン〜８５％ヘキサン／酢酸エチルの勾配）によって精製して、所望の生成物、化合物６６を５４％収率で得た。４，４’−ジ−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシプロポキシ）−ベンゾフェノン（６６）の調製４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン（２８）（１０ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）を、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ条件下で、０℃の乾燥テトラヒドロフラン中のｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−３−プロパノール（４０ｇ未精製(crude)、約１５０ｍｍｏｌ）、ＤＥＡＤ（２２．１ｍｌ、１４０．０ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（３６．７ｇ、１４０．０ｍｍｏｌ）と反応させた。反応をアルゴン下で室温に温度上昇させた。２４時間後に、反応を濃縮し、塩をヘキサン／エーテルによって沈降させ、濾過した。残留物質をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン〜８５％ヘキサン／酢酸エチルの勾配）によって精製して、所望の生成物、化合物６６を５４％収率で得た。４，４’−ジ−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシプロポキシ）−トリフェニルメタノール（６７）の調製．保護されたベンゾフェノン６６（５．７ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）を４０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に溶解し、臭化フェニルマグネシウム（２０．５ｍｌ、２０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応をアルゴン下、室温において２時間撹拌し、濃縮し、ジクロロメタンと飽和塩化アンモニウムとに分配し、水によって洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、６．５ｇの黄色ガム状物、化合物６７を定量的収量で得て、直接次の工程に用いた。４，４’−ジ−（３−ヒドロキシプロポキシ）−トリフェニルメタノール（６８）の調製．トリチル化合物６７（６．３７ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、室温における１６時間のアセトニトリル中トリエチルアミンヒドロフルオリド（３．６４ｇ、３０ｍｍｏｌ）による処埋によって脱保護した。反応を濃縮して、カラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配：１：１ヘキサン：酢酸エチルから酢酸エチル：５％メタノール（全て１％トリエチルアミンを含む）まで）によって精製して、２．８ｇの所望の生成物６８を黄色ガム状物として６９％収率で得た。４，４’−ジ−（３−ｐ−トルエンスルホンオキシプロポキシ）−トリフェニルメタノール（６９）の調製．アセトニトリル中の塩化トシル（１．４３ｇ、７．４９ｍｍｏｌ）と２，４，６−コリジン（１ｍｌ、７．４９ｍｍｏｌ）の溶液を１５ｍｌのアセトニトリル中の化合物（６８）（１．３９ｇ、３．４ｍｍｏｌ）に加えた。反応をアルゴン下、室温において２．５日間撹拌して、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、１％トリエチルアミンを含むヘキサン中６０％酢酸エチル）によって精製して、０．６ｇのトシル化化合物６９を２５％収率で得た。４，４’−ジ−（３−アジドプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７０）の調製．１５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の６９（０．６ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の溶液に、アジ化リチウム（０．１２ｇ、２．５１ｍｍｏｌ）を加えた。反応をアルゴン下、室温において一晩撹拌し、濃縮して、カラムクロマトグラフィー（シリカ、１％トリエチルアミンを含むヘキサン中６０％酢酸エチル）によって精製して、０．３８ｇ（１００％）の化合物７０を黄色ガム状物として得た。４，４’−ジ−（３−アミノプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７１）の調製．アジ化物（７０）（０．２５ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をメタノール中で活性炭と共に加温して、濾過し、濃縮した。残渣を再び５０ｍｌのメタノールに溶解し、５５ｍｇの炭素担体付き５％パラジウムを加えた。フラスコを排気し、水素充填バルーンを加えた。室温における１時間後に、触媒を濾過した。反応を濃縮し、次の工程に直接用いた。４，４’−ジ−（３−マレイミドプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７３）の調製．未精製残渣７１を５０ｍｌの１：１アセトニトリル：水中に溶解し、氷浴中で撹拌した。メトキシカルボニルマレイミド試薬（７２）（０．１６ｇ、０．９８ｍｍｏｌ）を加えて、２時間にわたって、ｐＨが１０．１から５まで低下するのが観察された。次に、１Ｍ硫酸によってｐＨを２に調節して、反応を濃縮した。残渣を酢酸エチルとブラインとに分配した。有機層を濃縮し、１：１アセトニトリル：水中に再溶解して、１０ｍｌの５％炭酸水素ナトリウムと共に撹拌した。１７分間後に、１Ｍ硫酸によって反応をｐＨ３に調節した。酢酸エチル（２０ｍｌ）を加えて、溶液を分離させ、水性層を酢酸エチルによって再び抽出した。一緒にした有機層を濃縮して、カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチルとヘキサンの混合物）によって精製して、０．１０４ｇの生成物７３を３６％収率で得た。実施例１６．非ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド合成中の失敗配列の、ジエン修飾キャッピング試薬によるキャッピングと、ジエノフィル樹脂又は膜上へのこのような種のその後の捕捉とによる選択的除去．３，５−ヘキサジエン酸無水物（７４）、３，５−ヘキサジエノキシ酢酸無水物（７５）及びトリヘキサジエノキシシリルクロリド（７６）の調製．化合物７４、７５及び７６を当該技術分野において公知の標準方法によって調製する。化合物７４は３，５−ヘキサジエノールから対応ヘキサジエン酸への酸化とその後の脱水とによって調製することができる。化合物７５はヨード酢酸無水物と３，５−ヘキサジエノールとの反応から得られ、化合物７６は四塩化ケイ素と３，５ −ヘキサジエノールとの反応の生成物である。これらの合成方法の他に、化合物７４、７５及び７６を多様な他の方法によって調製することができる。キャッピング試薬としての化合物７５の使用と、３’−ＰＥＧ固定溶液相合成中のその後の失敗配列の除去．キャッピング試薬を変え、失敗配列の削除工程を加えること以外は、実施例７に述べるように、溶液相合成を行う。キャッピング工程中に、等量の３，５−ヘキサジエノキシ酢酸無水物（７５）と、２，６−ルチジンと、Ｎ−メチルイミダゾールとを同時に溶液中に注入して、撹拌する。マレイミド誘導体化ポリスチレン樹脂を反応混合物に加え、撹拌を続ける。樹脂を濾別し、実施例７の脱トリチル化方法に述べるように、ポリマーをエーテルから沈降させる。キャッピング試薬としての化合物７６の使用と、慣用的な固相合成中の失敗配列の除去．ＤＮＡと、ＲＮＡと、修飾オリゴヌクレオチドとの慣用的な固相合成を、トリ（３，５−ヘキサジエノキシ）シリルクロリド７６をキャッピング試薬中の酢酸無水物の代わりに用いること以外は、固相合成器製造業者が提供する仕様書に従って実施する。サポートからオリゴヌクレオチドを切断し、脱保護したときに、未精製オリゴヌクレオチドを水／アセトニトリル中に入れ、マレイミド誘導体化ポリスチレンをこの溶液に加える。反応が完成したときに、樹脂結合失敗配列を濾別して、生成物オリゴヌクレオチドを必要に応じてさらに精製する。実施例１７．ＰＡＳＳによるペプチド合成のためのＮ−２，７−ジ（３，５−ヘキサジエノキシアセチル）ｆｍｏｃ保護アミノ酸モノマーの使用．Ｎ−２，７−ジ（３，５−ヘキサジエノキシアセチル）ｆｍｏｃ保護アミノ酸モノマー（８６）の調製．スキーム１９スキーム１６は２，７−ジ（３，５−ヘキサジエノキシアセチル）ｆｍｏｃ保護アミノ酸８６の合成を略述する。簡単には、クロロアセチルクロリドによるフルオレンのＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔアシル化が２，７−クロロアセチルフルオレン誘導体化合物８４を生じる（LeisersonとWeissberger（1955）Org．Synth I II、183）。３，５−ヘキサジエノキシドによるジクロリドの求核置換が２，７ −（３，５−ヘキサジエノキシアセチル）フルオレンを生じ、これがホルムアルデヒドへの添加とその後のホスゲンとの縮合とによって９−メチルクロロホルメート誘導体８５へ転化される（BodanskyとBodansky（1984）The Practice of Pe ptide Synthesis （Springer Verlag、Berlin））。次に、ヘキサジエノキシアセチル−ｆｍｏｃクロロホルメート８５を側鎖保護アミノ酸のＮ−末端アミノ基と、標準方法で、縮合させて、２，７−ジ（３，５−ヘキサジエノキシアセチル）ｆｍｏｃ保護アミノ酸８６を得る（BodanskyとBodansky（1984）The Practice o f Peptide Synthesis （Springer Verlag、Berlin））。ＰＡＳＳによる２，７−ジ（３，５−ヘキサジエノキシアセチル）ｆｍｏｃ保護アミノ酸を用いるペプチドアッセンブリー．スキーム２０は２，７−ジ（３，５−ヘキサジエノキシアセチル）ｆｍｏｃ保護アミノ酸を用いるＰＡＳＳによるペプチドアッセンブリーを説明する。スキーム２０ヘキサジエノキシ−ｆｍｏｃ保護アミノ酸モノマー８７を、Ｗが、それぞれ標準方法によって製造されることができる、標準保護基、ブロッキング基、溶解性ポリマー又は診断デテクターによってＣ−末端において保護されたペプチドである、伸長したペプチド鎖８８に加えて、生成物８９を未反応８８及び過剰なアミノ酸モノマー８７と共に得る（BodanskyとBodansky（1984）The Practice of Pept ide Synthesis （Springer Verlag、Berlin））。この混合物から生成物８９と過剰なモノマー８７とはマレイミド誘導体化セルロース上にＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化によって捕捉される。８８を洗い流した後に、ｆｍｏｃ保護基の除去に典型的に用いられる塩基性試薬によって樹脂から生成物が放出される。生成物９０を保護されない放出過剰モノマーから抽出によって分離して、９０をペプチド鎖を伸長するための次のモノマー付加を受けることができる状態にする。実施例１８．ＰＡＳＳによるペプチド合成のための２，７−ジ（マレイミド）フルオレン−９−メチルクロロホルメートの調製と使用スキーム２１２，７−ジ（マレイミド）フルオレン−９−メチルクロロホルメート９１（スキーム２１）を、ジアミノフルオレン９２から無水マレイン酸との縮合と、その後の、標準方法を用いた９−クロロホルメート誘導体９１への転化とによって調製する。この保護基は実施例１７と同様な、但し樹脂はマレイミド誘導体化セルロースではなくヘキサジエン置換セルロースである、ＰＡＳＳペプチド合成サイクルに用いることができる。実施例１９．ＰＡＳＳによるヘキサジエノキシ−Ｂｏｃ保護アミノ酸を用いたペプチドアッセンブリースキーム２２ヘキサジエノキシ−Ｂｏｃ保護基９４は９３から、３，５−ヘキサジエノールとの反応によって調製される（スキーム２２）。次に、保護基９４を側鎖保護アミノ酸のＮ−末端アミノ基と、標準方法で、縮合させて、ヘキサジエノキシ−Ｂｏｃ保護アミノ酸モノマー９５を得る（BodanskyとBodansky（1984）The Practi ce of Peptide Synthesis （Springer Verlag、Berlin））。化合物９５は実施例１７と同様なペプチドのＰＡＳＳ合成に用いることができる。スキーム２２に説明するように、カップリング生成物９６はマレイミド誘導体化セルロースとのヘキサジエノキシ−Ｂｏｃ保護基の付加環化によって固定され、Ｂｏｃ除去のための標準酸処理を用いて放出される。実施例２０．ＰＡＳＳによるペプチド核酸調製ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）のＰＡＳＳ合成は、ヘキサジエノキシ−ｆｍｏｃ保護モノマーがＰＮＡモノマー９８であること以外は、実施例１７に述べたサイクルと同様に進行する（スキーム２３）。スキーム２３ 1.量は５．０ｇの出発ＰＥＧ−ヌクレオシド（負荷、４５μｍｏｌ／ｇ）に対してである。２．キャッピング溶液：無水酢酸、２，６−ルチジン、Ｎ−メチルイミダゾール* 反応は重水素化溶媒中で室温において行った。完成％は粗反応混合物から直接採取したアリコートの¹ＨＮＭＲ分析によって算出した。全ての反応は、他に記載しないかぎり、０．０７Ｍの濃度において行った。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年７月８日（１９９８．７．８）【補正内容】スキーム１１Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を用いる捕捉と放出に適している、多くの固体サポートが考えられる。好ましい固体サポートは、容易に官能化されることができる表面ヒドロキシル基を有する無機酸化物（シリカ、アルミナ、ゼオライト、調節多孔性ガラス（ＣＰＧ）等）である。ＣＰＧを考えられる例外として、これらの無機固体サポートはしばしば、商業的に入手可能な樹脂よりも非常に大きい負荷容量(loading capacity)を有する。伝統的に、これらの無機酸化物はヒドロキシルを、より多様な又は反応性の官能基を有するシリル化剤によってシリル化することによって官能化されている（スキーム１３）。スキーム１３慣用的な固相合成中に導入される５’−アセチルキャッピング基はアンモニア切断及び脱保護工程中に除去される。試薬７４又は７５を固相合成におけるキャッピング試薬として及び失敗配列を選択的に除去するためのその後のハンドルとして利用するためには、オリゴヌクレオチドを、非塩基性条件下で選択的に切断可能である、例えば実施例１２に述べるようなリンカーを介してサポートに結合させなければならない。或いは、慣用的な固相合成の最後に用いられる、典型的な塩基性脱保護条件下で除去され難いキャッピング試薬を用いることができる。ヘキサジエノキシシリルクロリド（７６、７７及び７８）は、粗オリゴヌクレオチドがサポートからアンモニアによって切断されたならば、失敗配列の選択的な除去を可能にする。シリルエーテル基はこれらの条件下で除去されない。したがって、ヘキサジエノキシシリルキャップト失敗配列は、ジエノフィル誘導体化樹脂又は膜との反応によって所望の生成物から除去されることができる。スキーム１８図１０は、ペプチドのアッセンブリーに適用される、本発明の方法を一般的に説明する。図１０に関して、Ｎ−保護アミノ酸モノマー単位７７を活性剤の存在下の溶液中でペプチド出発物質７８に加える。【手続補正書】【提出日】平成１１年７月１４日（１９９９．７．１４）【補正内容】（１）明細書３４頁１１〜１２行に記載の「自動化抽出／濾過系１００」を「自動化抽出／濾過系１１０」に補正する。（２）明細書３４頁１３行に記載の「自動化抽出／濾過系１００」を「自動化抽出／濾過系１１０」に補正する。（３）明細書３８頁に記載のスキーム１１を以下のものと差し替える。（４）明細書４１頁に記載のスキーム１８を以下のものと差し替える。（５）明細書４７頁記載のスキーム６を以下のものと差し替える。（６）明細書６２頁記載のスキーム９を以下のものと差し替える。（７）明細書７６頁記載のスキーム１７を以下のものに差し替える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ペプチドの溶液相合成方法であって、下記工程：（ａ）Ｎ−末端保護アミノ酸モノマー単位とペプチド出発物質とを反応させて、ペプチド生成物を含有する反応混合物を形成する工程と；（ｂ）Ｎ−末端保護基の存在に基づいて、ペプチド生成物を未反応ペプチド出発物質と、未反応Ｎ−末端保護アミノ酸モノマー単位と、副生成物と、試薬とから分離する工程とを含む上記方法。２．Ｎ−末端保護アミノ酸モノマー単位が下記式：［式中、Ｒ⁵はＨ又は保護された既知アミノ酸側鎖から選択され；Ａ−Ｘはアミノ保護基（単数又は複数）である］を有する、請求項１記載の方法。３．（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）を選択された回数の連続サイクルで繰り返して、目的生成物を得る工程をさらに含む、請求項１記載の方法。４．Ａがウレタン、ベンジル、アシル及びトリフェニルメチルから成る群から選択される、請求項２記載の方法。５．前記ウレタンが９−フルオレニルメチルカルボニル（Ｆｍｏｃ）又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択される、請求項４記載の方法。６．Ｘがジエン、ジエノフィル、アルキン、シリルエーテル保護ジオール及びジスルフィドから成る群から選択される、請求項２記載の方法。７．前記ジエンが３，５−ヘキサジエノキシ又はソルビンアミドから選択される、請求項６記載の方法。８．前記Ｎ−末端保護アミノ酸モノマーが下記構造式：［式中、Ｒ⁵はＨ又は保護された既知アミノ酸側鎖から選択される］を有する、請求項２記載の方法。９．前記Ｎ−保護アミノ酸モノマーが下記構造式：［式中、Ｒ⁵はＨ又は保護された既知アミノ酸側鎖から選択される］を有する、請求項１記載の方法。１０．前記Ｎ−保護アミノ酸モノマーが下記構造式：［式中、Ｒ⁵はＨ又は保護された既知アミノ酸側鎖から選択される］を有する、請求項１記載の方法。１１．反応混合物を固体サポートに通して溶出させることによって、分離が行われる、請求項１記載の方法。１２．前記固体サポートがＸに対してアフィニティを有する、請求項１１記載の方法。１３．前記固体サポートがＸと共有結合的に反応する、請求項１１記載の方法。１４．前記共有結合的反応がＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応である、請求項１３記載の方法。１５．前記固体サポートが樹脂、膜及びポリマーから成る群から選択される、請求項１１記載の方法。１６．前記固体サポートが疎水性逆相樹脂と、チオプロピルセファロース樹脂と、水銀化樹脂と、アガロースアジピン酸ヒドラジド樹脂と、アビジン樹脂と、限外濾過膜と、Ｔｅｎｔａｇｅｌ^TMと，ポリエチレングリコールと、シリカゲル、アルミナ、調節多孔性ガラス及びゼオライトから成る群から選択される無機酸化物とから成る群から選択される、請求項１１記載の方法。１７．疎水性逆相樹脂がＣ２〜Ｃ１８ポリスチレン樹脂から成る群から選択される、請求項１６記載の方法。１８．前記固体サポートがジエン、ジエノフィル、メルカプタン及びボレートから成る群から選択される基によって誘導体化される、請求項１１記載の方法。１９．前記ジエンが３，５−ヘキサジエンから成る群から選択される、請求項１８記載の方法。２０．前記ジエノフィルがマレイミドである、請求項１８記載の方法。２１．請求項１記載の方法によって形成される製品。２２．ペプチド核酸の溶液相合成方法であって、下記工程：（ａ）Ｎ−末端保護ペプチド核酸モノマー単位とペプチド出発物質とを反応させて、ペプチド核酸生成物を含有する反応混合物を形成する工程と；（ｂ）Ｎ−末端保護基の存在に基づいて、ペプチド核酸生成物を未反応ペプチド出発物質と、未反応Ｎ−末端保護ペプチド核酸モノマー単位と、副生成物と、試薬とから分離する工程とを含む上記方法。２３．Ｎ−末端保護ペプチド核酸モノマー単位が下記構造式：を有する、請求項２２記載の方法。２４．（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）を選択された回数の連続サイクルで繰り返して、目的生成物を得る工程をさらに含む、請求項２２記載の方法。２５．請求項２３記載の方法によって形成される製品。