JP3161730B2 - オリゴヌクレオチド合成の方法および手段 - Google Patents
オリゴヌクレオチド合成の方法および手段Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、一般的にはオリゴヌクレオチドの合成に関
し、さらに詳しくは、オリゴヌクレオチドの合成、脱保
護および精製をより容易かつ効果的にすることが可能
な、固体支持体への最初のヌクレオシドの結合のための
新規な改良方法に関する。
し、さらに詳しくは、オリゴヌクレオチドの合成、脱保
護および精製をより容易かつ効果的にすることが可能
な、固体支持体への最初のヌクレオシドの結合のための
新規な改良方法に関する。
オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシド（RNA）ま
たはデオキシリボヌクレオシド（DNA）ホスフェートの
ポリ縮合によって構築されるポリマーである。合成オリ
ゴヌクレオチドの利用は、分子生物学の研究に革命をも
たらすことになったのである。合成オリゴヌクレオチド
の最も重要な応用には、DNA配列決定のためのプライマ
ー、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）におけるプライマ
ー、遺伝子の同定および／または単離のためのプロー
ブ、遺伝子合成のための構築ブロックとしての用途、さ
らにはアンチセンスオリゴヌクレオチドの形での抗ウイ
ルス性化合物としての可能性がある（引用文献１〜
３）。
たはデオキシリボヌクレオシド（DNA）ホスフェートの
ポリ縮合によって構築されるポリマーである。合成オリ
ゴヌクレオチドの利用は、分子生物学の研究に革命をも
たらすことになったのである。合成オリゴヌクレオチド
の最も重要な応用には、DNA配列決定のためのプライマ
ー、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）におけるプライマ
ー、遺伝子の同定および／または単離のためのプロー
ブ、遺伝子合成のための構築ブロックとしての用途、さ
らにはアンチセンスオリゴヌクレオチドの形での抗ウイ
ルス性化合物としての可能性がある（引用文献１〜
３）。
オリゴヌクレオチドは、固相法を用いたヌクレオチド
モノマーの反復添加によって組み立てられる（引用文献
４）。Merrifieldによる固相合成法の導入（引用文献
５）以来、以下の要求が処理されてきた。すなわち、
（１）固体支持体は、用いられる溶媒に不溶であり、好
ましくはその中で膨潤するものであってはならない。
（２）固体支持体上の官能基は、最初のヌクレオシドを
再現性よく共有結合するものでなければならない。
（３）固体支持体は、合成および脱保護時に用いられる
すべての試剤に対して化学的に不活性でなければならな
い。
モノマーの反復添加によって組み立てられる（引用文献
４）。Merrifieldによる固相合成法の導入（引用文献
５）以来、以下の要求が処理されてきた。すなわち、
（１）固体支持体は、用いられる溶媒に不溶であり、好
ましくはその中で膨潤するものであってはならない。
（２）固体支持体上の官能基は、最初のヌクレオシドを
再現性よく共有結合するものでなければならない。
（３）固体支持体は、合成および脱保護時に用いられる
すべての試剤に対して化学的に不活性でなければならな
い。
多数の材料がこれまで試験されてきたが、現在最も一
般的に使用されているものは、制御された多孔性ガラス
ビーズ（CPG）、シリカまたはポリスチレンビーズであ
る（引用文献４）。
般的に使用されているものは、制御された多孔性ガラス
ビーズ（CPG）、シリカまたはポリスチレンビーズであ
る（引用文献４）。
最初の５′−保護ヌクレオシドは、その３′ヒドロキ
シル官能基によりアルキルアミンスペーサーを介して支
持体に結合させられる。これは通常、保護されたヌクレ
オチド３′−コハク酸エステルを支持体に結合したアル
キルアミンと縮合させることによって行われる（図１参
照）。
シル官能基によりアルキルアミンスペーサーを介して支
持体に結合させられる。これは通常、保護されたヌクレ
オチド３′−コハク酸エステルを支持体に結合したアル
キルアミンと縮合させることによって行われる（図１参
照）。
これは４つの異なる支持体、すなわち各ヌクレオシド
（A,C,G,T）についての支持体が用いられることを意味
する。現在オリゴヌクレオチドの合成は、ほとんどが専
ら完全に自動化された装置、いわゆる「ジーンマシー
ン」を用いて行われている。
（A,C,G,T）についての支持体が用いられることを意味
する。現在オリゴヌクレオチドの合成は、ほとんどが専
ら完全に自動化された装置、いわゆる「ジーンマシー
ン」を用いて行われている。
固体支持体上での成長鎖へのヌクレオチドモノマーの
付加を、ホスホラミダイト法（引用文献６〜８）を用い
て行うのに必要な工程は、以下に記載するように通常用
いられる合成サイクルとして要約することができる（図
２参照）。他の方法は主として、リン酸残基の性質が異
なるもので、たとえばホスホトリエステル法（引用文献
11）、Ｈ−ホスホネート法（引用文献９〜10）がある。
付加を、ホスホラミダイト法（引用文献６〜８）を用い
て行うのに必要な工程は、以下に記載するように通常用
いられる合成サイクルとして要約することができる（図
２参照）。他の方法は主として、リン酸残基の性質が異
なるもので、たとえばホスホトリエステル法（引用文献
11）、Ｈ−ホスホネート法（引用文献９〜10）がある。
1. 母体ヒドロキシル化合物を生成させるための５′−
ヒドロキシル基の脱保護。これは通常、支持体を有機溶
媒中ジまたはトリクロロ酢酸で処理することによって行
われる（DMTrの除去）。
ヒドロキシル基の脱保護。これは通常、支持体を有機溶
媒中ジまたはトリクロロ酢酸で処理することによって行
われる（DMTrの除去）。
2. 痕跡の酸の除去するために支持体を洗浄する。
3. ５′−ヒドロキシル基をアクティベーター（たとえ
ばテトラゾール）の存在下、適当に保護された新たに導
入するヌクレオシド（A,C,GまたはＴ）の３′−ホスホ
ラミダイト残基と反応させ、３′−５′−ホスファイト
トリエステルを形成させる。
ばテトラゾール）の存在下、適当に保護された新たに導
入するヌクレオシド（A,C,GまたはＴ）の３′−ホスホ
ラミダイト残基と反応させ、３′−５′−ホスファイト
トリエステルを形成させる。
4. 適当な溶媒で洗浄して過剰の試剤を除去する。
5. 未反応５′−ヒドロキシル基をアセテートとしてブ
ロックする（キャッピング）。
ロックする（キャッピング）。
6. キャッピング試剤を洗浄により除去する。
7. ついで、ホスファイトトリエステルを相当するホス
フェートトリエステルに酸化する。これは通常、ヨウ素
水溶液を作用させて行われる。
フェートトリエステルに酸化する。これは通常、ヨウ素
水溶液を作用させて行われる。
8. 酸化試剤を洗浄により除去する。
この過程は、所望のオリゴヌクレオチド配列が合成さ
れるまで反復される。各サイクル間は、工程３において
カップリングのために用いられるヌクレオチドモノマー
のみが相違する。
れるまで反復される。各サイクル間は、工程３において
カップリングのために用いられるヌクレオチドモノマー
のみが相違する。
この過程の効率はきわめて高い。多くの場合、99％以
上のカップリング効率が達成される。ポリマーに支持さ
れた反復合成に伴う固有の問題点は、合成時に使用され
る各種試剤に対する成長オリゴヌクレオチド鎖の安定性
である。とくに面倒な問題点はデオキシアデノシンの酸
で触媒された脱プリン化の問題であり（引用文献12）、
またそれほどでもないが、５′−保護基の除去時（脱ト
リチル化）におけるデオキシグアノシン単位の問題があ
る。この過程では複素環塩基とデオキシリボース単位間
の結合が切断される。
上のカップリング効率が達成される。ポリマーに支持さ
れた反復合成に伴う固有の問題点は、合成時に使用され
る各種試剤に対する成長オリゴヌクレオチド鎖の安定性
である。とくに面倒な問題点はデオキシアデノシンの酸
で触媒された脱プリン化の問題であり（引用文献12）、
またそれほどでもないが、５′−保護基の除去時（脱ト
リチル化）におけるデオキシグアノシン単位の問題があ
る。この過程では複素環塩基とデオキシリボース単位間
の結合が切断される。
合成後、すべての保護基が除去され、オリゴヌクレオ
チドが固体支持体から切断される（引用文献１）。これ
は通常、濃アンモニア水溶液中、50〜60℃で数時間加熱
することによって行われる。この処理時に、鎖は脱プリ
ン化の場所で切断され、その結果、短い配列が生成する
ことになる。これが以後の精製時に重大な問題を引き起
こすことになる。オリゴヌクレオチドの精製は様々な方
法で行われるが、主として電気泳動およびクロマトグラ
フィーが用いられる。イオン交換（IEX）および逆相ク
ロマトグラフィー（RPC）の両者が、この過程において
強力な武器となる。RPCには、２つの基本的な別法、す
なわちトリチル−オンクロマトグラフィーおよびトリチ
ル−オフクロマトグラフィーがある。第一の場合は、
５′−保護基（DMTr）は、組み立てが終了するまでその
まま残される。それは脱保護時および精製に使用される
条件下で安定である。オリゴヌクレオチドに比較して著
しく疎水性である芳香環システムによるものであり、し
たがってそれはRPC精製時に疎水性ハンドルとして使用
することができる。DMTrをもつ生成物はDMTrをもたない
相当する生成物に比べて、はるかに高濃度の有機モディ
ファイアー（CH3CNまたはエタノール）で溶出される。
残念ながら、生成混合物中には同じくDMTrをもつ短いフ
ラグメントが常に存在する。これらは、上述のように脱
プリン化の時点での鎖の切断の結果として、また脱保護
時におけるランダムな鎖の切断の結果として形成され
る。DMTrをもつこれらの短いフラグメントがRPCクロマ
トグラフィー上トリチルを用いた精製時に問題を生じる
のである。
チドが固体支持体から切断される（引用文献１）。これ
は通常、濃アンモニア水溶液中、50〜60℃で数時間加熱
することによって行われる。この処理時に、鎖は脱プリ
ン化の場所で切断され、その結果、短い配列が生成する
ことになる。これが以後の精製時に重大な問題を引き起
こすことになる。オリゴヌクレオチドの精製は様々な方
法で行われるが、主として電気泳動およびクロマトグラ
フィーが用いられる。イオン交換（IEX）および逆相ク
ロマトグラフィー（RPC）の両者が、この過程において
強力な武器となる。RPCには、２つの基本的な別法、す
なわちトリチル−オンクロマトグラフィーおよびトリチ
ル−オフクロマトグラフィーがある。第一の場合は、
５′−保護基（DMTr）は、組み立てが終了するまでその
まま残される。それは脱保護時および精製に使用される
条件下で安定である。オリゴヌクレオチドに比較して著
しく疎水性である芳香環システムによるものであり、し
たがってそれはRPC精製時に疎水性ハンドルとして使用
することができる。DMTrをもつ生成物はDMTrをもたない
相当する生成物に比べて、はるかに高濃度の有機モディ
ファイアー（CH3CNまたはエタノール）で溶出される。
残念ながら、生成混合物中には同じくDMTrをもつ短いフ
ラグメントが常に存在する。これらは、上述のように脱
プリン化の時点での鎖の切断の結果として、また脱保護
時におけるランダムな鎖の切断の結果として形成され
る。DMTrをもつこれらの短いフラグメントがRPCクロマ
トグラフィー上トリチルを用いた精製時に問題を生じる
のである。
勾配を形成させることができるクロマトグラフィー系
を用いることによって、長さが少なくとも100塩基の配
列については、純粋な生成物を得ることができる。生成
物の分画を集め酢酸で処理することによりDMTr基を除去
できる。
を用いることによって、長さが少なくとも100塩基の配
列については、純粋な生成物を得ることができる。生成
物の分画を集め酢酸で処理することによりDMTr基を除去
できる。
本発明は脱保護条件では安定であるが、特異的な試剤
で切断できる、固体支持体への最初のヌクレオシドの結
合を形成させる新規な方法に関する。この場合、脱保護
時に形成されたDMTrをもつ短いフラグメントはすべて、
DMTrを同様に有する完全長の生成物はまだ固定化された
ままである間に、支持体を洗浄することで容易に除去さ
れるが、固体支持体から切断した後、生成物はきわめて
簡単にRPCで精製される。
で切断できる、固体支持体への最初のヌクレオシドの結
合を形成させる新規な方法に関する。この場合、脱保護
時に形成されたDMTrをもつ短いフラグメントはすべて、
DMTrを同様に有する完全長の生成物はまだ固定化された
ままである間に、支持体を洗浄することで容易に除去さ
れるが、固体支持体から切断した後、生成物はきわめて
簡単にRPCで精製される。
本発明は、とくにオリゴヌクレオチドの合成に有用な
独特の固体支持体系を提供するものである。詳しくは本
発明の系は、最初のヌクレオシドを固体支持体に結合さ
せる、その独特な方法に特徴がある。支持体への連結の
安定性は、その過程に使用されるすべての試剤に対して
のもので、合成の場合のみでなく脱保護に対しても安定
である。しかもそれは、きわめて特異的な試剤の使用に
よって切断できる。母体３′−ヒドロキシ化合物はその
過程の中で形成される。本発明の系は、いくつかの点で
独特である。それはオリゴヌクレオチドの合成にきわめ
て効率的な系であるばかりか、トリチル−オン逆相クロ
マトグラフィーによる精製過程を著しく単純化する。精
製が単純化した理由は、トリチル−オンRPC精製の観点
で最も困難な夾雑物質（DMTrをもつ短いフラグメント）
が脱保護工程で固体支持体から切断されることによるも
のである。完全長の生成物（同じくDMTrをもつ）は支持
体に繋留されているから、これらの夾雑物質は単純な洗
浄操作で除去できる。精製過程は、この場合DMTrをもつ
完全長の生成物からのDMTrをもたないフラグメントの分
離の場合と同程度までに単純化されることになる。これ
は使い捨てのRPCキャリッジと緩衝剤からなるきわめて
簡単な種類のクロマトグラフィー装置を用いて達成でき
る。これは慣用の支持体系を用いる場合に複雑なクロマ
トグラフィー装置を要するのと対照的である。新しい支
持体系の使用はまた、精製工程の実施に必要な時間を著
しく短縮することになる。本発明は従来知られている支
持体系に比べて、はるかに高い多用途性を示すものであ
る。この系は現在利用されているすべてのオリゴヌクレ
オチド合成方法に（DNAおよびRNAのいずれにも）適合が
可能である。まだ支持体に繋留されている間にオリゴヌ
クレオチドを完全に脱保護することも可能になる。
独特の固体支持体系を提供するものである。詳しくは本
発明の系は、最初のヌクレオシドを固体支持体に結合さ
せる、その独特な方法に特徴がある。支持体への連結の
安定性は、その過程に使用されるすべての試剤に対して
のもので、合成の場合のみでなく脱保護に対しても安定
である。しかもそれは、きわめて特異的な試剤の使用に
よって切断できる。母体３′−ヒドロキシ化合物はその
過程の中で形成される。本発明の系は、いくつかの点で
独特である。それはオリゴヌクレオチドの合成にきわめ
て効率的な系であるばかりか、トリチル−オン逆相クロ
マトグラフィーによる精製過程を著しく単純化する。精
製が単純化した理由は、トリチル−オンRPC精製の観点
で最も困難な夾雑物質（DMTrをもつ短いフラグメント）
が脱保護工程で固体支持体から切断されることによるも
のである。完全長の生成物（同じくDMTrをもつ）は支持
体に繋留されているから、これらの夾雑物質は単純な洗
浄操作で除去できる。精製過程は、この場合DMTrをもつ
完全長の生成物からのDMTrをもたないフラグメントの分
離の場合と同程度までに単純化されることになる。これ
は使い捨てのRPCキャリッジと緩衝剤からなるきわめて
簡単な種類のクロマトグラフィー装置を用いて達成でき
る。これは慣用の支持体系を用いる場合に複雑なクロマ
トグラフィー装置を要するのと対照的である。新しい支
持体系の使用はまた、精製工程の実施に必要な時間を著
しく短縮することになる。本発明は従来知られている支
持体系に比べて、はるかに高い多用途性を示すものであ
る。この系は現在利用されているすべてのオリゴヌクレ
オチド合成方法に（DNAおよびRNAのいずれにも）適合が
可能である。まだ支持体に繋留されている間にオリゴヌ
クレオチドを完全に脱保護することも可能になる。
固定化されたオリゴヌクレオチドを有する支持体は、
その形態でハイブリダイゼーションアフィニティーマト
リックスとして使用できる。このような支持体の応用に
は、たとえばmRNAの精製、固相cDNA合成、DNA結合蛋白
質の精製、プラスミドのアフィニティー精製があり、ま
た遺伝子アッセンブリー（オリゴヌクレオチドから）に
対する支持体としての利用等が考えられる。
その形態でハイブリダイゼーションアフィニティーマト
リックスとして使用できる。このような支持体の応用に
は、たとえばmRNAの精製、固相cDNA合成、DNA結合蛋白
質の精製、プラスミドのアフィニティー精製があり、ま
た遺伝子アッセンブリー（オリゴヌクレオチドから）に
対する支持体としての利用等が考えられる。
最初のヌクレオシドと支持体の間の連結は、すべての
合成ならびに緩和な酸（TCA/DCAでの脱トリチル化）お
よび緩和な塩基（アンモニアによる脱保護）の両者を含
む脱保護試剤に対して完全に安定であるが、オリゴヌク
レオチドに影響することなく選択的に切断することがで
きる。この過程は実質的に定量的に進行する。
合成ならびに緩和な酸（TCA/DCAでの脱トリチル化）お
よび緩和な塩基（アンモニアによる脱保護）の両者を含
む脱保護試剤に対して完全に安定であるが、オリゴヌク
レオチドに影響することなく選択的に切断することがで
きる。この過程は実質的に定量的に進行する。
本発明の固体支持体系は、固体支持体とこの支持体に
共有結合したヌクレオシドからなり、この場合ヌクレオ
シドはテトラアルキルアンモニウムフルオリド（裸のフ
ルオリドイオン）の作用によって支持体から選択的に切
断することができる。
共有結合したヌクレオシドからなり、この場合ヌクレオ
シドはテトラアルキルアンモニウムフルオリド（裸のフ
ルオリドイオン）の作用によって支持体から選択的に切
断することができる。
本発明の新規な支持体系においては、最初のヌクレオ
シドはシリルエーテル結合を介して支持体に結合され、
この系は好ましくは次式（１）によって表される。
シドはシリルエーテル結合を介して支持体に結合され、
この系は好ましくは次式（１）によって表される。
式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド
塩基であり、R2はＨ、OHまたはOR5（式中、R5は保護基
である）であり、R1は保護基であり、R3およびR4は別個
にそれぞれアルキル、アリール、シクロアルキル、アル
ケニル、アラールキル、シクロアルキルアルキル、アル
キルオキシ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、
アルケニルオキシおよびアラールキルオキシであり、Ｘ
は支持体への共有結合に使用される繋留基であって、ア
ルキル、アリール、シクロアルキル、アルケニル、アラ
ールキル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、
アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオ
キシ、アラールキルオキシおよびシクロアルキルアルキ
ルオキシによって提供され、Ｓは固体支持体である。
R3、R4およびＸ−Ｓ全体で最大限１個が、アルキルオキ
シ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニ
ルオキシ、アラールキルオキシおよびシクロアルキルア
ルキルオキシである。好ましい系においては、R1がトリ
チル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまた
はピキシルであり、基Ｂは好ましくはアデニン、グアニ
ン、シトシン、ウラシル、チミンまたはイノシンであ
る。また、R3、R4およびＸ−Ｓの１個が三級アルキルま
たは三級アルキルオキシ基、とくに10個以下の炭素原子
を有する基である系が好ましい。R3、R4およびＸ−Ｓの
他の２個はアルキル、アリール、アルキルオキシまたは
アリールオキシであることが好ましい。
塩基であり、R2はＨ、OHまたはOR5（式中、R5は保護基
である）であり、R1は保護基であり、R3およびR4は別個
にそれぞれアルキル、アリール、シクロアルキル、アル
ケニル、アラールキル、シクロアルキルアルキル、アル
キルオキシ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、
アルケニルオキシおよびアラールキルオキシであり、Ｘ
は支持体への共有結合に使用される繋留基であって、ア
ルキル、アリール、シクロアルキル、アルケニル、アラ
ールキル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、
アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオ
キシ、アラールキルオキシおよびシクロアルキルアルキ
ルオキシによって提供され、Ｓは固体支持体である。
R3、R4およびＸ−Ｓ全体で最大限１個が、アルキルオキ
シ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニ
ルオキシ、アラールキルオキシおよびシクロアルキルア
ルキルオキシである。好ましい系においては、R1がトリ
チル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまた
はピキシルであり、基Ｂは好ましくはアデニン、グアニ
ン、シトシン、ウラシル、チミンまたはイノシンであ
る。また、R3、R4およびＸ−Ｓの１個が三級アルキルま
たは三級アルキルオキシ基、とくに10個以下の炭素原子
を有する基である系が好ましい。R3、R4およびＸ−Ｓの
他の２個はアルキル、アリール、アルキルオキシまたは
アリールオキシであることが好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチド合成法は、（ａ）固体支
持体の選択、（ｂ）式１のシリルエーテルを介しての最
初のヌクレオシドの結合、（ｃ）固体支持体上の過剰の
反応性基の遮断、（ｄ）支持体上の最初のヌクレオシド
へのヌクレチドの縮合によるオリゴヌクレオチドの合
成、（ｅ）５′−保護基たとえば５′ジメトキシトリチ
ル基を除く、オリゴヌクレオチド上のすべての保護基の
除去、および酸で触媒された脱保護時に形成された非プ
リン部位の切断、（ｆ）たとえばテトラアルキルアンモ
ニウムフルオリドまたはヒドロキシドとの反応による支
持体からのオリゴヌクレオチドの選択的切断、ならびに
（ｇ）５′−保護基をアフィニティ−ハンドルとして用
いる逆相クロマトグラフィーによるオリゴヌクレオチド
の精製、からなる。
持体の選択、（ｂ）式１のシリルエーテルを介しての最
初のヌクレオシドの結合、（ｃ）固体支持体上の過剰の
反応性基の遮断、（ｄ）支持体上の最初のヌクレオシド
へのヌクレチドの縮合によるオリゴヌクレオチドの合
成、（ｅ）５′−保護基たとえば５′ジメトキシトリチ
ル基を除く、オリゴヌクレオチド上のすべての保護基の
除去、および酸で触媒された脱保護時に形成された非プ
リン部位の切断、（ｆ）たとえばテトラアルキルアンモ
ニウムフルオリドまたはヒドロキシドとの反応による支
持体からのオリゴヌクレオチドの選択的切断、ならびに
（ｇ）５′−保護基をアフィニティ−ハンドルとして用
いる逆相クロマトグラフィーによるオリゴヌクレオチド
の精製、からなる。
すなわち本発明は、便利で用途の広い、オリゴヌクレ
オチドの合成および精製を可能にする独特な固体支持体
系を提供するものである。それは固体支持体と、それに
シリコン置換基の一つを介して共有結合するシリル化ヌ
クレオシドからなる。
オチドの合成および精製を可能にする独特な固体支持体
系を提供するものである。それは固体支持体と、それに
シリコン置換基の一つを介して共有結合するシリル化ヌ
クレオシドからなる。
この固体支持体系の開発はきわめて有意義である。そ
れはオリゴヌクレオチドの便利な合成を可能にし、完全
長生成物の精製を容易にする。合成時の酸で触媒された
脱プリン化の結果として形成される夾雑物質は、生成物
がまだ支持体に繋留された状態で除去されるので、精製
は簡単になる。この除去は合成の完了後にオリゴヌクレ
オチドの様々な官能基を保護するすべての基が除去され
る際の脱保護工程で起こる。生成物はこの段階で、テト
ラアルキルアンモニウムフルオリドまたはヒドロキシド
の作用により、選択的に切断され、単純なRPCカートリ
ッジ上クロマトグラフィーで精製することができる。さ
らに、この固体支持体系はさらに、支持体上に合成され
た配列に相補性のDNAまたはRNAの固定化を促進するため
にも使用できる。この固体支持体系にはアフィニティー
マトリックスの観点からの様々な応用が可能なことは、
本技術分野の熟練者には明白であろう。
れはオリゴヌクレオチドの便利な合成を可能にし、完全
長生成物の精製を容易にする。合成時の酸で触媒された
脱プリン化の結果として形成される夾雑物質は、生成物
がまだ支持体に繋留された状態で除去されるので、精製
は簡単になる。この除去は合成の完了後にオリゴヌクレ
オチドの様々な官能基を保護するすべての基が除去され
る際の脱保護工程で起こる。生成物はこの段階で、テト
ラアルキルアンモニウムフルオリドまたはヒドロキシド
の作用により、選択的に切断され、単純なRPCカートリ
ッジ上クロマトグラフィーで精製することができる。さ
らに、この固体支持体系はさらに、支持体上に合成され
た配列に相補性のDNAまたはRNAの固定化を促進するため
にも使用できる。この固体支持体系にはアフィニティー
マトリックスの観点からの様々な応用が可能なことは、
本技術分野の熟練者には明白であろう。
本発明の方法における支持体としては、広範囲の多孔
性および非多孔性の固体支持体が使用できる。好ましい
支持体群には有機および無機物質が包含され、たとえば
ポリスチレン、架橋ポリスチレン、シリカ、多糖、架橋
多糖および各種のガラスが包含される。
性および非多孔性の固体支持体が使用できる。好ましい
支持体群には有機および無機物質が包含され、たとえば
ポリスチレン、架橋ポリスチレン、シリカ、多糖、架橋
多糖および各種のガラスが包含される。
固体支持体はもちろん、オリゴヌクレオチドの合成お
よび脱保護に使用される条件下に安定でなければならな
い。それらはヌクレオシドシリルエーテルの、シリコン
置換基の一つを介した共有結合の実現に必要な反応性基
を含有するように誘導化される。この目的で使用できる
反応性基には、たとえばヒドロキシル、カルボキシル、
アミノおよびチオール基がある。支持体上のヒドロキシ
ル基は、誘導化ヌクレオシドのクロロシラン官能基と反
応させることができる。また、支持体はアミノ基で誘導
化し、これを誘導化ヌクレオシドのシリコン置換基の一
つのカルボキシルまたはエポキシ基と反応させることが
できる。シリル化ヌクレオシドをシリコン置換基の一つ
を介して支持体に結合させるには、他に多くの方法があ
る。これらについては本技術分野の通常の熟練者であれ
ば容易に実現が可能であろう。固体支持体系をオリゴヌ
クレオチドの合成に使用する前に支持体およびヌクレオ
チド上の反応性基は遮断しなければならない。これは合
成時の副反応を回避するために重要である。ヌクレオシ
ドの場合は、これは環外性アミンをアミンまたはアミジ
ンに、５′−ヒドロキシル基を相当するジメトキシトリ
エステルに変換することによって容易に達成される。支
持体上の反応性基の遮断は使用される支持体に依存し、
本技術分野の通常の熟練者には明白であろう。
よび脱保護に使用される条件下に安定でなければならな
い。それらはヌクレオシドシリルエーテルの、シリコン
置換基の一つを介した共有結合の実現に必要な反応性基
を含有するように誘導化される。この目的で使用できる
反応性基には、たとえばヒドロキシル、カルボキシル、
アミノおよびチオール基がある。支持体上のヒドロキシ
ル基は、誘導化ヌクレオシドのクロロシラン官能基と反
応させることができる。また、支持体はアミノ基で誘導
化し、これを誘導化ヌクレオシドのシリコン置換基の一
つのカルボキシルまたはエポキシ基と反応させることが
できる。シリル化ヌクレオシドをシリコン置換基の一つ
を介して支持体に結合させるには、他に多くの方法があ
る。これらについては本技術分野の通常の熟練者であれ
ば容易に実現が可能であろう。固体支持体系をオリゴヌ
クレオチドの合成に使用する前に支持体およびヌクレオ
チド上の反応性基は遮断しなければならない。これは合
成時の副反応を回避するために重要である。ヌクレオシ
ドの場合は、これは環外性アミンをアミンまたはアミジ
ンに、５′−ヒドロキシル基を相当するジメトキシトリ
エステルに変換することによって容易に達成される。支
持体上の反応性基の遮断は使用される支持体に依存し、
本技術分野の通常の熟練者には明白であろう。
本発明の固体支持体系には多くの実施態様がある。し
かしながら、これらにはすべてに共通の特徴がある。そ
れは最初の塩基と固体支持体の間に、次式（１）によっ
て表されるように、テトラアルキルアンモニウムフルオ
リド（またはそれらの既知の均等化合物）によって切断
可能なシリルエーテルの結合を有することである。
かしながら、これらにはすべてに共通の特徴がある。そ
れは最初の塩基と固体支持体の間に、次式（１）によっ
て表されるように、テトラアルキルアンモニウムフルオ
リド（またはそれらの既知の均等化合物）によって切断
可能なシリルエーテルの結合を有することである。
式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド
塩基であり、R2はＨ、OHまたはOR5（R5は保護基であ
る）であり、R1は保護基であり、R3およびR4は別個にそ
れぞれアルキル、アリール、シクロアルキル、アルケニ
ル、アラールキル、シクロアルキルアルキル、アルキル
オキシ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アル
ケニルオキシおよびアラールキルオキシであり、Ｘは支
持体への共有結合に使用される繋留基であって、アルキ
ル、アリール、シクロアルキル、アルケニル、アラール
キル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、アリ
ールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキ
シ、アラールキルオキシおよびシクロアルキルアルキル
オキシによって提供され、Ｓは固体支持体である。R3、
R4およびＸ−Ｓ全体で最大限１個が、アルキルオキシ、
アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオ
キシ、アラールキルオキシおよびシクロアルキルアルキ
ルオキシである。好ましい系は、R1がトリチル、モノメ
トキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはピキシルで
あり、基Ｂは好ましくはアデニン、グアニン、シトシ
ン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。R3、R4お
よびＸ−Ｓの１個が三級アルキルまたは三級アルキルオ
キシ基である系も好ましい。R3、R4およびＸ−Ｓの他の
２個はアルキル、アリール、アルキルオキシまたはアリ
ールオキシであることが好ましい。本発明の好ましい系
は以下の系によって例示されるが、これらに限定される
ものではない。
塩基であり、R2はＨ、OHまたはOR5（R5は保護基であ
る）であり、R1は保護基であり、R3およびR4は別個にそ
れぞれアルキル、アリール、シクロアルキル、アルケニ
ル、アラールキル、シクロアルキルアルキル、アルキル
オキシ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アル
ケニルオキシおよびアラールキルオキシであり、Ｘは支
持体への共有結合に使用される繋留基であって、アルキ
ル、アリール、シクロアルキル、アルケニル、アラール
キル、シクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、アリ
ールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオキ
シ、アラールキルオキシおよびシクロアルキルアルキル
オキシによって提供され、Ｓは固体支持体である。R3、
R4およびＸ−Ｓ全体で最大限１個が、アルキルオキシ、
アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニルオ
キシ、アラールキルオキシおよびシクロアルキルアルキ
ルオキシである。好ましい系は、R1がトリチル、モノメ
トキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはピキシルで
あり、基Ｂは好ましくはアデニン、グアニン、シトシ
ン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。R3、R4お
よびＸ−Ｓの１個が三級アルキルまたは三級アルキルオ
キシ基である系も好ましい。R3、R4およびＸ−Ｓの他の
２個はアルキル、アリール、アルキルオキシまたはアリ
ールオキシであることが好ましい。本発明の好ましい系
は以下の系によって例示されるが、これらに限定される
ものではない。
本発明を次に以下の実施例によって例示する。
実施例１ ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−（三級ブチ
ル−４−グリシドキシフェニル−フェニル）シリル−
２′−デオキシチミジンの合成およびアミノ基で誘導化
された固体支持体へのその結合 ｐ−アリルオキシフェニル−ｔ−ブチル−フェニル−ク
ロロシラン（１） ４−ブロモフェニル−アリルエーテル（4.26g,20mmo
l）を窒素気相下に1,2−ジメトキシエタン（40ml）に溶
解した。混合物を−78℃に冷却し（ドライアイス／エタ
ノール）、ブチルリチウム（ヘキサン中1.6M,20mmol）
を、乾燥窒素でブチルリチウムボトルを加圧することに
よって撹拌しながら添加した。添加直後に白色の沈殿が
生成した（４−リチオ−フェニル−アリル−エーテ
ル）。30分後にｔ−ブチル−フェニル−ジクロロシラン
（4.66g,20mmol）を加え、混合物の温度を徐々に室温ま
で上昇させた。得られた混合物を、乾燥硫酸ナトリウム
上で濾過し（塩化リチウムの除去）、ロータリーエバポ
レーターで蒸発乾固した。得られた油状物を分別蒸留し
て精製した。沸点147〜155℃（1mmHg）、収量:1.88g（3
8％）。
ル−４−グリシドキシフェニル−フェニル）シリル−
２′−デオキシチミジンの合成およびアミノ基で誘導化
された固体支持体へのその結合 ｐ−アリルオキシフェニル−ｔ−ブチル−フェニル−ク
ロロシラン（１） ４−ブロモフェニル−アリルエーテル（4.26g,20mmo
l）を窒素気相下に1,2−ジメトキシエタン（40ml）に溶
解した。混合物を−78℃に冷却し（ドライアイス／エタ
ノール）、ブチルリチウム（ヘキサン中1.6M,20mmol）
を、乾燥窒素でブチルリチウムボトルを加圧することに
よって撹拌しながら添加した。添加直後に白色の沈殿が
生成した（４−リチオ−フェニル−アリル−エーテ
ル）。30分後にｔ−ブチル−フェニル−ジクロロシラン
（4.66g,20mmol）を加え、混合物の温度を徐々に室温ま
で上昇させた。得られた混合物を、乾燥硫酸ナトリウム
上で濾過し（塩化リチウムの除去）、ロータリーエバポ
レーターで蒸発乾固した。得られた油状物を分別蒸留し
て精製した。沸点147〜155℃（1mmHg）、収量:1.88g（3
8％）。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−（アリルオ
キシフェニル−ｔ−ブチル−フェニル）シリル−２′−
デオキシチミジン（２） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシチミジ
ン（1.09g,2.0mmol）およびイミダゾール（0.27、4.0mm
ol）を、乾燥ピリジン（10ml）と２回共蒸留した。混合
物をついで乾燥ピリジン（25ml）に溶解した。モノクロ
ロシラン（1.0g,3.0mmol）を添加し反応を50℃で一夜進
行させた。反応はTLC（トルエン／酢酸エチル1:1）で追
跡した。
キシフェニル−ｔ−ブチル−フェニル）シリル−２′−
デオキシチミジン（２） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシチミジ
ン（1.09g,2.0mmol）およびイミダゾール（0.27、4.0mm
ol）を、乾燥ピリジン（10ml）と２回共蒸留した。混合
物をついで乾燥ピリジン（25ml）に溶解した。モノクロ
ロシラン（1.0g,3.0mmol）を添加し反応を50℃で一夜進
行させた。反応はTLC（トルエン／酢酸エチル1:1）で追
跡した。
反応混合物を蒸発乾固し、メチレンクロリドに溶解
し、10％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム
上で乾燥し、濾過し蒸発させた。得られたシロップをフ
ラッシュクロマトグラフィーで精製した（１％ピリジン
含有トルエン／酢酸エチル3:1）。収量:1.50g（89.5
％）。
し、10％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム
上で乾燥し、濾過し蒸発させた。得られたシロップをフ
ラッシュクロマトグラフィーで精製した（１％ピリジン
含有トルエン／酢酸エチル3:1）。収量:1.50g（89.5
％）。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−（三級ブチ
ル−ｐ−グリシドキシフェニル−フェニル）シリル−
２′−デオキシチミジン（３） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔（ｐ−
アリルオキシフェニル）−三級ブチル−フェニル）シリ
ル−２′−デオキシチミジン（0.50g,0.60mmol）をクロ
ロホルム（10ml）に溶解した。撹拌した混合物に炭酸水
素ナトリウム（100mg）、ついでｍ−クロロ過安息香酸
（85％,120mg,0.60mmol）を加えた。反応は室温で数日
間進行させた。混合物をクロロホルムで希釈し、0.1M水
酸化ナトリウム、0.5M炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫
酸ナトリウム上で乾燥し蒸発させた。
ル−ｐ−グリシドキシフェニル−フェニル）シリル−
２′−デオキシチミジン（３） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔（ｐ−
アリルオキシフェニル）−三級ブチル−フェニル）シリ
ル−２′−デオキシチミジン（0.50g,0.60mmol）をクロ
ロホルム（10ml）に溶解した。撹拌した混合物に炭酸水
素ナトリウム（100mg）、ついでｍ−クロロ過安息香酸
（85％,120mg,0.60mmol）を加えた。反応は室温で数日
間進行させた。混合物をクロロホルムで希釈し、0.1M水
酸化ナトリウム、0.5M炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫
酸ナトリウム上で乾燥し蒸発させた。
残留物をついでフラッシュクロマトグラフィーで精製
した（１％ピリジン含有トルエン／酢酸エチル4:1）。
した（１％ピリジン含有トルエン／酢酸エチル4:1）。
収量：立体異性体の混合物として52mg（10％）。
グリシジルエーテル（３）の一級アミノ基で誘導化され
た固体支持体（４）への結合 グリシジルエーテル（３）（15mg）をエタノール（6m
l）に溶解した。この溶液をアミノ誘導化ポリスチレン
ビーズ（500mg,200μmol NH2/g）に添加した。この懸濁
液を40℃で一夜振盪した。支持体を濾過しエタノール
（50ml）およびアセトニトリル（50ml）で洗浄した。
た固体支持体（４）への結合 グリシジルエーテル（３）（15mg）をエタノール（6m
l）に溶解した。この溶液をアミノ誘導化ポリスチレン
ビーズ（500mg,200μmol NH2/g）に添加した。この懸濁
液を40℃で一夜振盪した。支持体を濾過しエタノール
（50ml）およびアセトニトリル（50ml）で洗浄した。
支持体をアセトニトリル（10ml）に懸濁しアセトニト
リル（10ml）中４−ジメチルアミノピリジン（３％w/
v）、無水酢酸（10％v/v）およびsym−コリジン（15％v
/v）の混合物を加えて支持体上の過剰の一級アミノ基お
よびグリシジルエーテルのアミノリシスで生成した二級
アミノ基を遮断した。室温に30分間置いた後、支持体を
アセトニトリル、エタノールで洗浄しジエチルエーテル
で乾燥した。支持体からのジメトキシトリチルの放出が
置換の程度5.7μmol/gを指示した。
リル（10ml）中４−ジメチルアミノピリジン（３％w/
v）、無水酢酸（10％v/v）およびsym−コリジン（15％v
/v）の混合物を加えて支持体上の過剰の一級アミノ基お
よびグリシジルエーテルのアミノリシスで生成した二級
アミノ基を遮断した。室温に30分間置いた後、支持体を
アセトニトリル、エタノールで洗浄しジエチルエーテル
で乾燥した。支持体からのジメトキシトリチルの放出が
置換の程度5.7μmol/gを指示した。
実施例２ ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔（ｐ−グ
リシドキシ−フェニル）三級ブチル−メチル〕−シリル
−２′−デオキシチミジンの合成およびアミノ基で誘導
化された固体支持体へのその結合 ｐ−アリルオキシフェニル−ｔ−ブチル−メチル−クロ
ロシラン（５） ４−ブロモフェニル−アリルエーテル（8.7g,41mmo
l）を乾燥窒素の気相下に乾燥1,2−ジメトキシエタン
（100ml）に溶解した。混合物を−78℃に冷却した（ド
ライアイス／エタノール）。ブチルリチウム（ヘキサン
中1.6M,40mmol）を、乾燥窒素でブチルリチウムボトル
を加圧することによって添加した。添加直後に白色の沈
殿が生成した（４−リチオ−フェニル−アリルエーテ
ル）。30分後に三級ブチル−メチルジクロロシラン（3.
4g,20mmol）を1,2−ジメトキシエタンに溶解して加え
た。混合物の温度を徐々に室温まで上昇させた。溶液を
硫酸ナトリウム上で濾過し蒸発乾固した。残留物を分別
蒸留して精製して標記化合物（５）を得た。収量:4.2
g、沸点91〜95℃。
リシドキシ−フェニル）三級ブチル−メチル〕−シリル
−２′−デオキシチミジンの合成およびアミノ基で誘導
化された固体支持体へのその結合 ｐ−アリルオキシフェニル−ｔ−ブチル−メチル−クロ
ロシラン（５） ４−ブロモフェニル−アリルエーテル（8.7g,41mmo
l）を乾燥窒素の気相下に乾燥1,2−ジメトキシエタン
（100ml）に溶解した。混合物を−78℃に冷却した（ド
ライアイス／エタノール）。ブチルリチウム（ヘキサン
中1.6M,40mmol）を、乾燥窒素でブチルリチウムボトル
を加圧することによって添加した。添加直後に白色の沈
殿が生成した（４−リチオ−フェニル−アリルエーテ
ル）。30分後に三級ブチル−メチルジクロロシラン（3.
4g,20mmol）を1,2−ジメトキシエタンに溶解して加え
た。混合物の温度を徐々に室温まで上昇させた。溶液を
硫酸ナトリウム上で濾過し蒸発乾固した。残留物を分別
蒸留して精製して標記化合物（５）を得た。収量:4.2
g、沸点91〜95℃。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔（ｐ−ア
リルオキシフェニル）−三級ブチル−メチル）シリル−
２′−デオキシチミジン（６） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシチミジ
ン（1.0g,1.8mmol）およびイミダゾール（270mg,3.9mmo
l）を、乾燥ピリジン（10ml）と２回共蒸留した。残留
物をついで乾燥ピリジン（25ml）に溶解し、モノクロロ
シラン（５）を添加した（0.73g,2.7mmol）。反応を50
℃で一夜進行させた。反応混合物を蒸発乾固し、メチレ
ンクロリドに溶解し、炭酸水素ナトリウム（10％）で洗
浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し蒸発させた。
フラッシュクロマトグラフィーで精製すると（１％ピリ
ジン含有トルエン／酢酸エチル3:1）。（６）0.28g（18
％）が得られた。収量は精製前の蒸発時における５′−
ジメトキシトリチル基の喪失により低かった（エバポレ
ーター夾雑）。
リルオキシフェニル）−三級ブチル−メチル）シリル−
２′−デオキシチミジン（６） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシチミジ
ン（1.0g,1.8mmol）およびイミダゾール（270mg,3.9mmo
l）を、乾燥ピリジン（10ml）と２回共蒸留した。残留
物をついで乾燥ピリジン（25ml）に溶解し、モノクロロ
シラン（５）を添加した（0.73g,2.7mmol）。反応を50
℃で一夜進行させた。反応混合物を蒸発乾固し、メチレ
ンクロリドに溶解し、炭酸水素ナトリウム（10％）で洗
浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し蒸発させた。
フラッシュクロマトグラフィーで精製すると（１％ピリ
ジン含有トルエン／酢酸エチル3:1）。（６）0.28g（18
％）が得られた。収量は精製前の蒸発時における５′−
ジメトキシトリチル基の喪失により低かった（エバポレ
ーター夾雑）。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔三級ブチ
ル−（ｐ−グリシドキシ−フェニル）メチル）シリル−
２′−デオキシチミジン（７） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔（ｐ−
アリルオキシフェニル）−ｔ−ブチル−メチル〕シリル
−２′−デオキシチミジン（50mg,64μmmol）をクロロ
ホルム（1ml）に溶解した。炭酸水素ナトリウム（11mg,
130μmmol）、およびｍ−クロロ過安息香酸（85％,13m
g,64μmmol）を加えて、反応混合物を室温で数日間（週
末）撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、水
酸化ナトリウム（0.1M）で洗浄し、炭酸水素ナトリウム
（0.5M）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し蒸発乾固
した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製す
ると（７）が立体異性体の混合物として得られた。収
量:4.6g（９％）。
ル−（ｐ−グリシドキシ−フェニル）メチル）シリル−
２′−デオキシチミジン（７） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔（ｐ−
アリルオキシフェニル）−ｔ−ブチル−メチル〕シリル
−２′−デオキシチミジン（50mg,64μmmol）をクロロ
ホルム（1ml）に溶解した。炭酸水素ナトリウム（11mg,
130μmmol）、およびｍ−クロロ過安息香酸（85％,13m
g,64μmmol）を加えて、反応混合物を室温で数日間（週
末）撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、水
酸化ナトリウム（0.1M）で洗浄し、炭酸水素ナトリウム
（0.5M）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し蒸発乾固
した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製す
ると（７）が立体異性体の混合物として得られた。収
量:4.6g（９％）。
グリシジルエーテル（７）のアミノ基で誘導化された固
体支持体（４）への結合 グリシジルエーテル（７）（4.6mg）をエタノール（2
ml）に溶解させ、アミノ誘導化ポリスチレンビーズ（16
2mg）に添加した。反応は40℃で一夜進行させた。支持
体を濾過しエタノールおよびアセトニトリルで洗浄し
た。支持体をアセトニトリル（3ml）に懸濁しアセトニ
トリル（3ml）中４−ジメチルアミノピリジン（３％w/
v）、無水酢酸（10％v/v）およびコリジン（15％v/v）
の混合物を加えた。30分間室温で振盪した後、支持体を
濾過し、アセトニトリル、エタノールで洗浄しジエチル
エーテルで乾燥した。支持体からのジメトキシトリチル
の放出が置換の程度5.0μmol/gを指示した。
体支持体（４）への結合 グリシジルエーテル（７）（4.6mg）をエタノール（2
ml）に溶解させ、アミノ誘導化ポリスチレンビーズ（16
2mg）に添加した。反応は40℃で一夜進行させた。支持
体を濾過しエタノールおよびアセトニトリルで洗浄し
た。支持体をアセトニトリル（3ml）に懸濁しアセトニ
トリル（3ml）中４−ジメチルアミノピリジン（３％w/
v）、無水酢酸（10％v/v）およびコリジン（15％v/v）
の混合物を加えた。30分間室温で振盪した後、支持体を
濾過し、アセトニトリル、エタノールで洗浄しジエチル
エーテルで乾燥した。支持体からのジメトキシトリチル
の放出が置換の程度5.0μmol/gを指示した。
実施例３ ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−（三級ブチ
ル−イミダゾリル−フェニル）−シリル−２′−デオキ
シチミジンの合成およびヒドロキシル基で誘導化された
固体支持体（９）へのその結合 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシチミジ
ン（100mg,0.18mmol）およびイミダゾール（35mg,0.5mm
ol）を乾燥ピリジン（5ml）と２回共蒸留した。残留物
を乾燥ピリジン（2.0ml）に溶解した。ｔ−ブチル−フ
ェニル−ジクロロシラン（38μ,0.18mmol）の添加
後、反応は室温で２時間、TLC（トルエン／酢酸エチル
1:1）によって反応の完了が明らかになるまで進行させ
た。反応混合物をヒドロキシル基で誘導化され、予めピ
リジンで洗浄されたポリスチレンビーズ（500mg）に添
加した。反応混合物を一夜室温で振盪した。支持体を濾
過しピリジン、エタノールで洗浄しジエチルエーテルで
乾燥した。
ル−イミダゾリル−フェニル）−シリル−２′−デオキ
シチミジンの合成およびヒドロキシル基で誘導化された
固体支持体（９）へのその結合 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシチミジ
ン（100mg,0.18mmol）およびイミダゾール（35mg,0.5mm
ol）を乾燥ピリジン（5ml）と２回共蒸留した。残留物
を乾燥ピリジン（2.0ml）に溶解した。ｔ−ブチル−フ
ェニル−ジクロロシラン（38μ,0.18mmol）の添加
後、反応は室温で２時間、TLC（トルエン／酢酸エチル
1:1）によって反応の完了が明らかになるまで進行させ
た。反応混合物をヒドロキシル基で誘導化され、予めピ
リジンで洗浄されたポリスチレンビーズ（500mg）に添
加した。反応混合物を一夜室温で振盪した。支持体を濾
過しピリジン、エタノールで洗浄しジエチルエーテルで
乾燥した。
ついで、アセトニトリル（4ml）中４−ジメチルアミ
ノピリジン（３％w/v）、無水酢酸（10％v/v）およびsy
m−コリジン（５％v/v）の混合物で処理した。室温に15
分間置いた後、支持体をアセトニトリル、エタノールで
洗浄しジエチルエーテルで乾燥した。支持体からのジメ
トキシトリチルの放出が置換の程度27μmol/gを指示し
た。
ノピリジン（３％w/v）、無水酢酸（10％v/v）およびsy
m−コリジン（５％v/v）の混合物で処理した。室温に15
分間置いた後、支持体をアセトニトリル、エタノールで
洗浄しジエチルエーテルで乾燥した。支持体からのジメ
トキシトリチルの放出が置換の程度27μmol/gを指示し
た。
実施例４ ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔三級ブチ
ル−（３−クロロプロピル）−フェニル〕−シリル−
２′−デオキシチミジンの合成およびアミノ基で誘導化
された固体支持体へのその結合 三級ブチル−３−クロロプロピル−メチル−クロロシラ
ン（10） ３−クロロプロピル−メチル−ジクロロシラン（4.0m
l,25mmol）を乾燥石油エーテル（20ml）に溶解し、０℃
に冷却した。三級ブチルリチウム（ペンタン中1.7M,15m
l,25mmol）を、乾燥窒素気相下に添加した。添加後、反
応混合物の温度を室温まで上昇させた。１時間後に反応
混合物を乾燥硫酸ナトリウム上で濾過し（塩化リチウム
の除去）蒸発させた。分別蒸留すると純粋な（10）3.9g
（73％）が得られた。沸点68〜72℃（5mm）。
ル−（３−クロロプロピル）−フェニル〕−シリル−
２′−デオキシチミジンの合成およびアミノ基で誘導化
された固体支持体へのその結合 三級ブチル−３−クロロプロピル−メチル−クロロシラ
ン（10） ３−クロロプロピル−メチル−ジクロロシラン（4.0m
l,25mmol）を乾燥石油エーテル（20ml）に溶解し、０℃
に冷却した。三級ブチルリチウム（ペンタン中1.7M,15m
l,25mmol）を、乾燥窒素気相下に添加した。添加後、反
応混合物の温度を室温まで上昇させた。１時間後に反応
混合物を乾燥硫酸ナトリウム上で濾過し（塩化リチウム
の除去）蒸発させた。分別蒸留すると純粋な（10）3.9g
（73％）が得られた。沸点68〜72℃（5mm）。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−〔三級ブチ
ル−（３−クロロプロピル）−メチル〕−シリル−２′
−デオキシチミジン（11） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシチミジ
ン（545mg,1mmol）を、乾燥ピリジン（5ml）と２回蒸留
した。残留物を乾燥ピリジン（3ml）に溶解した。イミ
ダゾール（150mg,2.2mmol）および三級ブチル−（３−
クロロプロピル）−モノクロロシラン（23mg,11mmol）
を添加し反応混合物を50℃で一夜撹拌した。混合物を蒸
発乾固し、フラッシュクロマトグラフィーで精製すると
（１％ピリジン含有トルエン／酢酸エチル3:1）、純粋
な（11）0.54g（75％）が立体異性体の混合物として得
られた。
ル−（３−クロロプロピル）−メチル〕−シリル−２′
−デオキシチミジン（11） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシチミジ
ン（545mg,1mmol）を、乾燥ピリジン（5ml）と２回蒸留
した。残留物を乾燥ピリジン（3ml）に溶解した。イミ
ダゾール（150mg,2.2mmol）および三級ブチル−（３−
クロロプロピル）−モノクロロシラン（23mg,11mmol）
を添加し反応混合物を50℃で一夜撹拌した。混合物を蒸
発乾固し、フラッシュクロマトグラフィーで精製すると
（１％ピリジン含有トルエン／酢酸エチル3:1）、純粋
な（11）0.54g（75％）が立体異性体の混合物として得
られた。
３−クロロプロピル−シリルエーテル（11）のアミノ基
誘導化固体支持体への結合 ３−クロロプロピル−シリルエーテル（11）（15mg,2
0μmol）を、触媒量のテトラｎ−ブチルアンモニウムヨ
ージド含有N,N−ジメチルホルムアミド（0.5ml）に溶解
した。この溶液をアミノ基誘導化ポリスチレンビーズ
（100mg）固体支持体に添加した。混合物を50℃で一夜
振盪した。支持体を濾過しDMF、メタノールで洗浄しジ
エチルエーテルで乾燥した。支持体をついでアセトニト
リル（4ml中）４−ジメチルアミノピリジン（３％w/
v）、無水酢酸（10％v/v）およびsym−コリジン（15％v
/v）の混合物で処理した。15分間室温に置いた後、支持
体を濾過しアセトニトリル、エタノールで洗浄しジエチ
ルエーテルで乾燥した。支持体からのジメトキシトリチ
ルの放出が置換の程度８μmol/gを指示した。
誘導化固体支持体への結合 ３−クロロプロピル−シリルエーテル（11）（15mg,2
0μmol）を、触媒量のテトラｎ−ブチルアンモニウムヨ
ージド含有N,N−ジメチルホルムアミド（0.5ml）に溶解
した。この溶液をアミノ基誘導化ポリスチレンビーズ
（100mg）固体支持体に添加した。混合物を50℃で一夜
振盪した。支持体を濾過しDMF、メタノールで洗浄しジ
エチルエーテルで乾燥した。支持体をついでアセトニト
リル（4ml中）４−ジメチルアミノピリジン（３％w/
v）、無水酢酸（10％v/v）およびsym−コリジン（15％v
/v）の混合物で処理した。15分間室温に置いた後、支持
体を濾過しアセトニトリル、エタノールで洗浄しジエチ
ルエーテルで乾燥した。支持体からのジメトキシトリチ
ルの放出が置換の程度８μmol/gを指示した。
実施例５ 支持体（４）上オリゴヌクレオチドの合成、脱保護およ
び切断 支持体（４）をGene AssemblerTM Plusに使用するた
めの反応カラムに充填した。オリゴヌクレオチドはPAC
−アミダイトを用い、標準0.2μmol反応サイクルによっ
て合成した。平均カップリング効率は各サイクルの最初
におけるジメトキシトリチルの放出によって判定して9
9.0〜99.5％の範囲であった。５′末端におけるジメト
キシトリチル基は合成の完結後にも、そのまま残されて
いた。反応カラムをエッペンドルフ管に取り、3000rpm
で１〜２分間遠心分離して支持体を乾燥した。濃アンモ
ニア（1.0ml）を加え、管をもう一度遠心分離して、液
体を反応カラムの内部に浸透させた。管を70℃に10分間
加熱した。反応カラムを第二の管に入れ遠心分離した。
アンモニア溶液を合わせて逆相カラムクロマトグラフィ
ーによって分析した。それは保護基に加えて、合成時に
形成された非プリン部位の切断によって生じた、DMTr基
を有する短いオリゴマーを含有していた。カラムリアク
ターを水、エタノールで洗浄しジエチルエーテルで乾燥
した。支持体からのオリゴヌクレオチドの切断は、DMF
中0.1MのTBAF（1.0ml）により70℃で30分間、または1.0
M水酸化ナトリウム（1.0ml）中70℃で15分間処理して行
った。
び切断 支持体（４）をGene AssemblerTM Plusに使用するた
めの反応カラムに充填した。オリゴヌクレオチドはPAC
−アミダイトを用い、標準0.2μmol反応サイクルによっ
て合成した。平均カップリング効率は各サイクルの最初
におけるジメトキシトリチルの放出によって判定して9
9.0〜99.5％の範囲であった。５′末端におけるジメト
キシトリチル基は合成の完結後にも、そのまま残されて
いた。反応カラムをエッペンドルフ管に取り、3000rpm
で１〜２分間遠心分離して支持体を乾燥した。濃アンモ
ニア（1.0ml）を加え、管をもう一度遠心分離して、液
体を反応カラムの内部に浸透させた。管を70℃に10分間
加熱した。反応カラムを第二の管に入れ遠心分離した。
アンモニア溶液を合わせて逆相カラムクロマトグラフィ
ーによって分析した。それは保護基に加えて、合成時に
形成された非プリン部位の切断によって生じた、DMTr基
を有する短いオリゴマーを含有していた。カラムリアク
ターを水、エタノールで洗浄しジエチルエーテルで乾燥
した。支持体からのオリゴヌクレオチドの切断は、DMF
中0.1MのTBAF（1.0ml）により70℃で30分間、または1.0
M水酸化ナトリウム（1.0ml）中70℃で15分間処理して行
った。
実施例６ 支持体（４）上で作成されたオリゴヌクレオチド（18マ
ー）のDMF中0.1MのTBAFで切断後の精製 TBAF溶液（1.0ml）を予め0.5M塩化ナトリウムで平衡
化した陰イオン交換カラム（Mono QR）に適用した。0.5
M塩化ナトリウムで洗浄し（テトラメチルアンモニウム
イオンおよびDMFの除去）した後、オリゴヌクレオチド
混合物を3.0M塩化ナトリウム（2.5ml）で溶出した。こ
の混合物の一部を取り、逆相クロマトグラフィーで分析
した。精製は使い捨てRPCカートリッジを用いて行い、
次の工程からなる。
ー）のDMF中0.1MのTBAFで切断後の精製 TBAF溶液（1.0ml）を予め0.5M塩化ナトリウムで平衡
化した陰イオン交換カラム（Mono QR）に適用した。0.5
M塩化ナトリウムで洗浄し（テトラメチルアンモニウム
イオンおよびDMFの除去）した後、オリゴヌクレオチド
混合物を3.0M塩化ナトリウム（2.5ml）で溶出した。こ
の混合物の一部を取り、逆相クロマトグラフィーで分析
した。精製は使い捨てRPCカートリッジを用いて行い、
次の工程からなる。
1. オリゴヌクレオチドの負荷。
2. 0.1M酢酸トリエチルアンモニウム、pH7.0中アセト
ニトリル（16.5％）で洗浄。これでDMTrをもたないすべ
ての物質が除去される。
ニトリル（16.5％）で洗浄。これでDMTrをもたないすべ
ての物質が除去される。
3. 水洗。
4. １％TFA/H2Oで４分間処理して５′−DMTr基の除
去。
去。
5. 水洗。
6. 生成物を0.1M酢酸トリエチルアンモニウム、pH7.0
中アセトニトリル（16.5％）で溶出。
中アセトニトリル（16.5％）で溶出。
ついで精製された物質をRPCで分析したところ、均一
な精製物が得られた。
な精製物が得られた。
実施例７ 水酸化ナトリウム溶液の一部を直接、逆相クロマトグ
ラフィーで分析した。50マーを使い捨てRPCカートリッ
ジ（実施例６参照）を用いて精製した。精製された物質
を逆相クロマトグラフィーで分析すると、ほぼ均一な
（＞97％）生成物が得られた。
ラフィーで分析した。50マーを使い捨てRPCカートリッ
ジ（実施例６参照）を用いて精製した。精製された物質
を逆相クロマトグラフィーで分析すると、ほぼ均一な
（＞97％）生成物が得られた。
引用文献 1. R.W.Ellis,Pharmaceutical Research.3（1986）19
5. 2. J.W.Engels,E.Uhlmann,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.28
（1989）716. 3. G.Zon.Pharmaceutical Research.5（1988）539. 4. M.J.Gait.Oligonucleotide Synthesis−apractical
approach,IRL press,Oxford,England. 5. R.B.Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85（1963）2149. 6. S.L.Beaucage,M.H.Caruthers,Tetrahedron Lett.22
（1981）1859. 7. N.D.Sinha,J.Biernat,H.Kster,Tetrahedron Let
t.24（1983）5843. 8. J.C.Shulhof,D.Molko,R.Teoule,Nucleic Acids Re
s.15（1987）397. 9. B.C.Froehler,P.G.Ng,M.D.Matteucci,Nucleic Acid
s Res.14（1986）5399. 10.P.J.Garegg,J.Lindh,T.Regberg,J.Stawinski,R.Str
mberg,C.Henrichsson,Tetrahedron Lett.27（1986）4
051. 11.A.M.Michelson,A.R.Todd,J.Chem.Soc.（1955）2632. 12.H.Schaller,H.G.Khorana,J.Am.Chem.Soc.85（1963）
3828.
5. 2. J.W.Engels,E.Uhlmann,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.28
（1989）716. 3. G.Zon.Pharmaceutical Research.5（1988）539. 4. M.J.Gait.Oligonucleotide Synthesis−apractical
approach,IRL press,Oxford,England. 5. R.B.Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85（1963）2149. 6. S.L.Beaucage,M.H.Caruthers,Tetrahedron Lett.22
（1981）1859. 7. N.D.Sinha,J.Biernat,H.Kster,Tetrahedron Let
t.24（1983）5843. 8. J.C.Shulhof,D.Molko,R.Teoule,Nucleic Acids Re
s.15（1987）397. 9. B.C.Froehler,P.G.Ng,M.D.Matteucci,Nucleic Acid
s Res.14（1986）5399. 10.P.J.Garegg,J.Lindh,T.Regberg,J.Stawinski,R.Str
mberg,C.Henrichsson,Tetrahedron Lett.27（1986）4
051. 11.A.M.Michelson,A.R.Todd,J.Chem.Soc.（1955）2632. 12.H.Schaller,H.G.Khorana,J.Am.Chem.Soc.85（1963）
3828.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/04 C07H 19/04 C07H 21/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】最初のヌクレオシドをシリルエーテル結合
を介して支持体に結合させることを特徴とする、式 〔式中、 Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であ
り、 R1は保護基であり、 R2はＨ、OHまたはOR5（式中、R5は保護基である）であ
り、 R3、R4およびＸはそれぞれ、アルキル、アリール、シク
ロアルキル、アルケニル、アラールキル、シクロアルキ
ルアルキル、アルキルオキシ、アリールオキシ、シクロ
アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アラールキルオキ
シであり、 Ｓは固体支持体である。 ただし、R3、R4およびＸの１個だけが、アルキルオキ
シ、アリールオキシ、シクロアルキルオキシ、アルケニ
ルオキシ、アラールキルオキシまたはシクロアルキルア
ルキルオキシである〕 で表されるオリゴヌクレオチド合成用の支持体。 - 【請求項２】R1がトリチル、モノメトキシトリチル、ジ
メトキシトリチルまたはピキシルであり、基Ｂはアデニ
ン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンまたはイノ
シンであることを特徴とする請求項１記載の支持体。 - 【請求項３】R3はアリール基であり、Ｘはアルキルまた
はアルキルオキシ鎖であり、R4は三級アルキルまたは三
級アルキルオキシ基であることを特徴とする請求項１ま
たは２に記載の支持体。 - 【請求項４】固体支持体（Ｓ）上でオリゴヌクレオチド
を合成する方法において、請求項１記載のオリゴヌクレ
オチド合成用の支持体のように最初のヌクレオシドをシ
リルエーテル結合を介して支持体（Ｓ）に結合させ、つ
いで以下の工程： （ｉ） 最初のヌクレオシド上へのヌクレオチドの縮
合、 （ii） オリゴヌクレオチド上の５′−保護基を除くす
べての保護基の除去および酸触媒脱保護時に形成された
非プリン部位の切断、 （iii） 支持体からのテトラアルキルアンモニウムフ
ルオリドまたはヒドロキシドによるオリゴヌクレオチド
の選択的切断、 （iv） ５′−保護基をアフィニティーハンドルとして
用いた、逆相クロマトグラフィーによるオリゴヌクレオ
チドの精製 を行うことを特徴とする方法。 - 【請求項５】５′−保護基はジメトキシトリチルである
ことを特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項６】請求項１〜３のいずれかに記載の支持体を
利用することを特徴とする請求項４または５に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9003743-3 | 1990-11-26 | ||
| SE9003743A SE9003743D0 (sv) | 1990-11-26 | 1990-11-26 | Method and means for oligonucleotide synthesis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05503715A JPH05503715A (ja) | 1993-06-17 |
| JP3161730B2 true JP3161730B2 (ja) | 2001-04-25 |
Family
ID=20380998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50010592A Expired - Lifetime JP3161730B2 (ja) | 1990-11-26 | 1991-11-25 | オリゴヌクレオチド合成の方法および手段 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5589586A (ja) |
| EP (1) | EP0514513B1 (ja) |
| JP (1) | JP3161730B2 (ja) |
| AT (1) | ATE133684T1 (ja) |
| DE (1) | DE69116864T2 (ja) |
| ES (1) | ES2084839T3 (ja) |
| SE (1) | SE9003743D0 (ja) |
| WO (1) | WO1992009615A1 (ja) |
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| SE9701783D0 (sv) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | Marek Kwiatkowski | In situ synthesis of oligonucleotides of inverse orientation |
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| FR2529892A1 (fr) * | 1982-07-09 | 1984-01-13 | Transgene Sa | Nouveau support pour la synthese des polynucleotides, en particulier par la methode triester et procede pour sa preparation |
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-
1990
- 1990-11-26 SE SE9003743A patent/SE9003743D0/xx unknown
-
1991
- 1991-11-25 EP EP91920800A patent/EP0514513B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-25 DE DE69116864T patent/DE69116864T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-25 AT AT91920800T patent/ATE133684T1/de not_active IP Right Cessation
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