KR0123559B1 - 주형-의존성 효소적 핵산 합성에 대한 프라이머로서의 올리고누클레오티드의 동시합성 및 직접 표지화를 위해 기능화된 담체물질 - Google Patents

주형-의존성 효소적 핵산 합성에 대한 프라이머로서의 올리고누클레오티드의 동시합성 및 직접 표지화를 위해 기능화된 담체물질

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KR0123559B1 KR1019940700659A KR19940070659A KR0123559B1 KR 0123559 B1 KR0123559 B1 KR 0123559B1 KR 1019940700659 A KR1019940700659 A KR 1019940700659A KR 19940070659 A KR19940070659 A KR 19940070659A KR 0123559 B1 KR0123559 B1 KR 0123559B1
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마르키빅츠 보이키흐
그뢰거 가브리엘
뢰쉬 루디
클로츠 마르기트
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콜프, 크나우어
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    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

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Abstract

본 발명에서는 표지화 그룹 또는 그것의 전구체를 함유하는 핵산 빌딩블록들과 함께 적하되는 중합체 담체들의 합성 및 사용방법이 설명된다. 이 방법으로 적하된 중합체 담체는 예를 들어 생거 및 동업자들에 따르는 서열화 분석에서 또는 중합효소 연쇄반응(PCR)에서와 같은, 주형-의존성 효소적 핵산 합성에 대한 프라이머로서 사용될 수 있는 올리고누클레오티드의 어셈블리에 대하여 고상 또는 액상으로서 작용한다.

Description

주형-의존성 효소적 핵산 합성에 대한 프라이머로서의 올리고누클레오티드의 동시합성 및 직접 표지화를 위해 기능화된 담체물질
제 1 도는 토실로 변형된 데옥시시티딘 담체의 합성, 변형된 올리고누클레오티드의 방출 및 표지 그룹(이경우 플루오레신)과의 반응을 도시한다.
제 2 도는 데옥시아데노신과 데옥시구아노신에 대한 동일 과정을 도시한다.
제 3 도는 할로겐화된 누클레오시드 유도체로 출발하는, 스페이서를 (이미)함유하는 데옥시우리딘 담체의 합성을 도시한다.
제 4a 도는 프라이머 RP를 포함하고 있는 pUC DNA의 서열화에 관련된 도면이다.
제 4b 도는 프라이머 A를 포함하고 있는 pUC DNA의 서열화에 관련된 도면이다.
제 4c 도는 프라이머 B를 포함하고 있는 pUC DNA의 서열화에 관련된 도면이다.
제 5a 도는 프라이머 D를 포함하고 있는 M13 DNA의 서열화에 관련된 도면이다.
제 5b 도는 프라이머 E를 포함하고 있는 M13 DNA의 서열화에 관련된 도면이다.
합성은 통상 화학적 수단에 의해 수행되는 것으로 가정해야 한다. 그러므로 후속적인 효소화 표지화, 예컨대 데옥시누클레오티딜-말단 트랜스페라아제에 의해 촉매되는 올리고누클레오티드와 5-브로모-dUTP와의 반응[Nucleosides Nucleotides 8, 805-813(1989)], 비오틴-dUTP와의 반응[Nucleic Acids Res. 16, 4077-4095(1988)] 또는 디곡시게닌-dUTP와의 반응[Biol. Chem. Hoppe Seyler 371, 917-927(1990)]에 의한 표지화는 추가의 처리단계에 대한 필요성에 의해 처음부터 복잡해진다. 그러나 무엇보다도 먼저, 이것은 통상 올리고누클레오티드 사슬의 3' 단부를 지나 구조적으로 변형된 누클레오티드-5' 3 인산염을 사용한 연장임이 주지되어야 한다. 이 방법에서 하나 이상의 누클레오티드 단위체는 보통(주형에 따라)3' 끝에 자동적으로 부착되어서, 이 방법으로 표지된 올리고누클레오티드는 처음부터 모든 주형-의존성 사슬연장에 대해 사용될 수 없다. 올리고누클레오티드의 3'끝에 비오티닐화된 데옥시우리딘 잔기를 효소적으로 부착시키기 위한 방법은 문헌에 기재되어 있다[DNA 3,3, pgs 269-277(1984)].
올리고누클레오티드의 화학적 또는 및 효소적 합성방법은 EP-A-O 325 970에 기재되어 있고, 이 방법은 규정된 기공도를 가지고 있는 담체상에서 수행된다.
데옥시올리고누클레오티드는 적절한 그룹을 핵산염기(nucleobase)상에, 당 잔기상에 또는 누클레오티드 내 결합(인산염 부분) 부분에 도입시킴에 의한 화학적 수단에 의하여 비-방사적으로 표지될 수 있다. 현재 이 방법은 거의 배타적으로 올리고누클레오티드의 합성 및 프로세싱동안 또는 그후에 수행된다. 이런 방법으로 당업자는 올리고누클레오티드 사슬의 5'-OH 끝[Nucleic Acid Res. 14, 6227-6245(1986); Nucleic Acids Res. 14, 7985-7994(1986)], 5'끝 또는 내부에 있는 핵산염기[Nucleic Acids Res. 15, 3131-3139(1987); J. Org. Chem. 55, 5931-5933(1990)] 또는 누클레오티드 내부의 [Nucleosides Nucleotides 10, 303-306(1991)] 인산염 그룹을 치환할 수 있다. N-4 위치에서 표지된 모노누클레오시드는 EP-A-O 423 839에 기재되어 있는데, 이것은 올리고누클레오티드 프로브의 합성을 위한 고상에 대하여 결합되도록 의도된 것이다. 대부분의 표지화 반응은 사슬의 화학적 합성후 반응들에 의하여 수행된다. 이 경우, 반응 파트너는 상대적으로 변하기 쉬운 올리고누클레오티드 사슬이어서 부반응이 일어날 상당한 위험이 있다. 일부의 경우에, 표지화 그룹은 적절한 아미도 포스파이트 유도체들이 시약으로서 사용되도록 도입된다. 그러한 시약은 보통 덜 안정하며, 제한된 기간 동안 용액으로만 저장될 수 있다. 최근에 올리고누클레오티드 사슬의 3'-OH 끝에 그룹의 도입을 가능하게 하는 CPG 담체물질들이 기재되어 왔다.(Belmont, California, p. 188).
그러나, 3'-OH 끝은 어떠한 추가의 사슬연장에 대해 상기 그룹들에 의하여 차단되므로 이런 방법으로 표지된 올리고누클레오티드는 주형-의존성 중합효소 반응의 프라이머로서 고려되지 않는다. 지금까지 주형-의존성 중합 요소 반응에 대해 사용되어 왔던 모든 올리고누클레오티드에 대해서는 5'-말단이 표지된 올리고누클레오티드가 독점적으로 사용되어 왔다. 이 경우 한편으로는 내부 표지화 그룹들이 혼성화를 간섭할 수 있고, 다른 한편으로는 주형-의존형 중합요소는, 만약 이것이 3' 끝 위치에 비-생물학적 치환체를 함유하고 있다면 3'끝을 지나 프라이머를 연장시키지 않는다고 추정된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 데옥시올리고누클레오티드가 DNA 중합효소에 의해 프라이머로서 수용되고 3'-말단 염기에 표지화 그룹, 예컨대 형광염료를 함유할때에 조차도 폴리누클레오티드 안으로 통합됨을 발견하였다. 이 경우, 데옥시올리고누클레오티드들은 5'-말단 표지화 그룹이 제공되어 있는 프라이머와 동일한 효율로 통합된다. 본 발명자들은 이 발견을 토대로 하여, 그것으로 인해 올리고누클레오티드 서열을 얻는 것이 가능해지고 올리고누클레오티드 합성동안 또는 합성후 적절한 가능성 그룹이 부가되어 있는 아미도포스파이트 유도체를 사용할 필요없이 표지된 형태로 사용되는 것이 가능해지는 바람직한 방법을 개발하였다.
그러므로 본 발명은 중합체 담체에 결합되어 있는 표지화 그룹에 의해 변형된 모노누클레오시드, 말단이 표지된 올리고누클레오티드의 합성을 위한 상기 모노누클레오시드의 사용, 및 중합요소-촉매된 사슬연장을 위한 프라이머로서의 이들 올리고누클레오티드의 사용에 관련된다.
본 발명은 화학적 올리고누클레오티드 합성을 위한 고상 또는 액상으로서의 표지화 상들의 제조 및 사용을 토대로 한다.
표지화 상들은 하기 설명되는 바와 같이, 그것들의 기능화의 유형에 의하여, 그것들 자체가 표지화 그룹이거나 그것의 전구체인 하나 또는 여러개의 치환체를, 올리고누클레오티드 사슬이 개시될때에 부착시키는 중합체 담체들로서 인지된다. 치환체들은, 올리고누클레오티드 합성 및 표지화 상으로부터의 올리고누클레오티드의 절단후에 그것의 3'-OH그룹이 중합효소를 이용한 주형-의존성 사슬연장에 대해 자유로와지도록 부착된다. 이 경우 담체물질들은 어떠한 원하는 비-교차결합된 또는 교차결합된 중합체일뿐만 아니라 유기 또는 무기물질, 바람직하게는 폴리스티렌 유도체, 실리카 겔 또는 제어된 기공유리 또는 적당한 고정그룹의 존재에 의해 누클레오시드 또는 누클레오티드에 연결될 수 있는(바람직하게는 스페이서를 경유하여) 폴리에틸렌 글리콜의 가용성 유도체, 예컨대 화학적 올리고누클레오티드 합성에 통상적인 담체들일 수 있다.
본 발명에서의 표지화 상들은 비-누클레오시드성 스페이서를 경유하여 누클레오시드 또는 누클레오티드 또는 표지화 그룹이 제공되어 있는 그것의 유도체 또는 전구체에 결합된, 상기 언급된 유형의 담체물질을 표시하기 위해 사용된다. 이 경우 모노누클레오시드가 바람직하다.
사용될 수 있는 비-누클레오시드성 스페이서는 누클레오시드 및 누클레오티드를 결합시키기 위한 화학적 올리고누클레오티드 합성에서의 통상적인 링크 및 예컨대 “긴사슬 알킬아민”스페이서 담체물질이다[Oligonucleotide, Synthesis, A practical approach; M.J. Gait, IRL Press 1984 Oxford].
본 발명에서 고정그룹은 수성매질중에서 또는 유기용매중에서 그것에 다른 화학적 그룹이 공유결합될 수 있는 담체의 화학적 그룹이다. 바람직한 고정 그룹은 아미노기, 히드록실기 또는 메르캅토기이다. NH2가 특히 바람직하다.
용어 표지화 그룹은, 올리고누클레오티드 사슬 자체에 고유하지 않은 고상 또는 액상 위에서 합성된 올리고누클레오티드에 특정한 구조적 특성을 부여할 수 있는 표지화상에 고정된 누클레오시드에 공유결합된, 및 필요에 따라 스페이서를 경유하여 결합된 모든 치환체를 나타낸다. 비-방사성 표지화 그룹이 바람직하다. 그러한 것들은 바람직하게는 형광성, 발광성, 항원성 또는 친화성-중재 그룹 및 복합체-형성그룹이다. 나아가, 이것들은 또한 필요에 따라 보호된 형태로 표지의 부착을 가능하게 하는 그러한 그룹, 예컨대 아미노기를 포함하는 것으로 인지된다. 보다 넓은 의미에서, 예컨대 DNA 또는 RNA(또는 단백질)을 특이적으로 결합시키거나 또는 절단하는 능력에 의해 올리고누클레오티드의 치료적 적용을 가능하게 하는 올리고누클레오티드 사슬의 치환체로서의 이들 그룹은 또한 본 발명의 범위내에서 표지화 그룹으로 표시되어야 한다. 특히 바람직한 표지화 그룹은 플루오레신, 디옥시게닌 및 비오틴과 같은 합텐이다. 합텐은 분자량이 500g/몰 이하이며, 그 자체로는 면역반응을 야기시키지 못하지만 거대분자 담체에 커플링된 후에는 면역 반응을 야기하는 면역학적 반응성 화학적 화합물이다.
본 발명의 범위내에서 올리고누클레오티드는 생물학적 누클레오티드 단위체들로 구성된 서열로서 뿐만 아니라 생물학적 DNA 또는 RNA에 비하여 구조적으로 변형된 및/또는 변형된 누클레오티드내 결합인 빌딩블록의 전체 또는 부분으로 구성된 서열로서 인지된다.
표지화 상의 이용에 의하여, 또한 문헌에 공지된 방법에 따라 및 문헌에 공지된 신쏜(synthon)을 사용하여 자동화된 방법으로 본 발명에 따르는 올리고누클레오티드를 제조하는 것이 가능하다. 이것은 문헌에 공지되어 있는 방법과 유사하게 동일 또는 다른 타입의 추가의 표지화 그룹이 마찬가지로 표지화 상에 의하여 도입된 것들 외에 올리고누클레오티드 사슬에서 어떠한 다른 원하는 위치들에서 합성이 일어나는 중에 도입되는 경우를 배제하지 않는다. 그러나, 표지화상위에서 합성된 올리고누클레오티드들은 통상의 생물학적 핵산 빌딩블록에 불과하는 정도이다.
올리고누클레오티드는 바람직하게는 원하는 서열의 3'에서 5'쪽으로 합성된다. 적절한 신쏜(실시예 참조)을 사용할때, 합성은 또한 어떠한 원하는 담체상에서 5'으로부터 3'쪽으로 수행될 수 있으며, 이때 하나 또는 여러개의 누클레오시드가 3'-말단에서 사용되고, 그것의 핵산염기는 본 발명의 범주내에서 표지화 그룹으로 대체된다.
본 발명에 따르는 올리고누클레오티드를 제조하기 위하여, 고정그룹(바람직하게는 아미노기)을 가지고 있는 담체물질이, 3'히드록실기에서 바람직하게 활성화되고 다른 반응성 그룹(예컨대 핵산염기의 5'OH 및 1차 아미노기)에 대해 통상적인 방식으로 보호된 모노누클레오시드와 반응된다. 이 모노누클레오시드는 바람직하게는 말단 표지화 그룹, 바람직하게는 반응성 및 보호기를 염기의 아미노기상에 또는 염기에 부착되어 있는 추가의 치환체상에 포함하고 있는 스페이서(spacer)를 갖는다.
만약 이 누클레오시드가 합성될 올리고누클레오티드의 다른 모노누클레오시드단위체에서는 발생하지 않는 그룹을 염기상에 가지고 있다면, 이 염기에서 완전한 올리고누클레오티드를 선택적으로 표지하는 것이 가능하다.
계속해서 5'-O-보호기(예컨대 디메톡시트리틸)가 이런 방식으로 제조되고, 바람직하게는 담체물질에 대하여 스페이서를 경유하여 결합되어 있는 보호된 모노 누클레오시드 결합을 함유하는 표지화 상으로 부터 절단된다. 계속해서 당해 기술 분야에 공지되어 있는 올리고누클레오티드 합성법이, 바람직하게는 포스포라미디트를 경유한 누클레오티드 빌딩블록의 커플링을 경유하는 고상방법에 의해, 원하는 누클레오티드 서열이 이루어질때까지 표지화 상에서 수행된다.
합성후에, 표지된 올리고누클레오티드 사슬은 필요하다면 보호기가 제거되기도 하고, 표지화 그룹 또는 그것의 전구체가 올리고누클레오티드 사슬의 3'단부에서(및 또한 다른 위치가 있다면 그 다른 위치들에서) 보유되는 방식으로 중합체로부터 절단된다.
만약 표지화 그룹이 표지화 그룹의 전구체만을 함유하거나, 또는 표지화 그룹의 전구체만이 합성도중에 3' 위치에 도입되었다면, 이것은 후속단계에서 실제의 표지화 그룹으로 전환될 수 있다.
본 발명의 범주내에서 3'말단에서 표지된 올리고누클레오티드는 DNA 또는 RNA중합요소에 의해 촉매된 주형-의존성 중합반응에서 프라이머로서 사용될 수 있다. 이것을 위해 주형-의존성 중합효소 반응의 다양한 변용예에 대해 문헌(예컨대 EP-A 0 200 362)에 기재된 통상의 반응조건들이 사용될 수 있다.
예를 들어 단일가닥 DNA의 서열분석에 대하여, 3'위치에서 플레오레신으로 본 발명에 따라 표지된 프라이머들을 사용하는 것이 가능하였다. 서열화는 파마시아 컴패니(Pharmacia Company)의 작업지시에 따라(Pharmacia-LKB AutoprimerTRSynthesis Kit(27-9290-01))생거 등의 디데옥시 방법[F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467(1977)]에 따라 수행될 수 있다. 이 방법으로 실시예 4에 따라 옥토푸스(octopus) DNA D3에서 뿐만이 아니라 pUC19-DNA의 약 50염기까지의 서열을 판독하는 것이 가능하였다.
M13mp18의 서열화는 마찬가지로 상응하여 보다 긴 서열의 판독을 유도하는 실시예 5에서 설명한다.
예를 들어 2가닥 M13mp18RF DNA의 141 및 145 염기의 부분들은, 각각 3'위치에서 플루오레신으로 표지된, 실시예 6에서 설명된 올리고누클레오티드 플라이머를 (비-표현된 역 프라이머와 함께) 사용함에 의해, 문헌에 기재되어 있는 지시사항을 따라 증폭될 수 있었다. 겔 전기영동 후에, 증폭된 DNA단편들은 에티디움 브롬화물 염색에 의해 가시화되었다. 플루오레신 잔기의 존재는 형광계로 검출되었다.
본 발명의 범주내에서 표지된 올리고누클레오티드를 얻기 위한 표지화상의 사용은, 이들 표지호상이 메리필드 합상[Merrifield Synthesis]의 목적에 대해 고상 또는 액체상으로서의 올리고누클레오티드의 합성을 가능하게 할 뿐만 아니라, 동시에 안정한 표지화 시약의 특성을 가지는 한 특히 유리하다. 그러므로, 이미 전에 올리고누클레오티드 합성 도중에 또는 후에 사용되어야만 했던 다른 표지화 시약을 사용하는 것은 불필요하다.
그러한 표지화 시약은 때로, 그것들이 아미도포스파이트 시약일때 특히 제한된 안정성을 가질 뿐이다. 또한, 표지화 상들이 사용될때 추가의 시약 또는 합성단계가 필요하지 않아도 자동화된 방법들로 올리고누클레오티드 사슬의 실제 합성을 기본적으로 수행하는 것이 가능하다는 것은 특히 유리하다. 언제나 그런 것은 아니지만, 표지화 그룹을 도입시키기 위해 필요한 필수 단계들은 그러므로 올리고누클레오티드 합성의 개시전에 전달된다.
그러므로 표지화 상의 한 배치를 사용하여 3'-말단으로서 적절한 표지된 누클레오시드(또는 여러개의 적절한 누클레오시드)를 갖는 다양한 수많은 원하는 서열들을 제조하는 것이 가능하다. 대조적으로 과거에는 PCR 진단법을 위해 예컨대 일련의 서열화 프라이머들 또는 증폭제(amplimer)와는 별도로 각각의 개별적인 올리고누클레오티드를 표지하는 것이 요구되었었다. 표지화상 및 그것에 의해 얻어진 3'-표지된 올리고누클레오티드의 사용은 프라이머로서 3'-말단 표지된 올리고누클레오티드를 사용하는 주형-의존성 중합효소 반응, 특히 생거 또는 PCR에 따르는 서열화 반응을 토대로 하는 모든 방법들의 합리화를 가능하게 한다.
이것은 n개의 서열화 프라이머들의 세트를 비-방사성 활성적으로 표지하기 위해 최소한 n개의 표지화 반응 또는 표지화 단계들이 더 이상 필요하지 않으며, 대신에 단지 4개의 표지화상이 필요하다는 사실의 결과이다. 만약 워블(wobble) 대합(pairing)이 사용된다면(I는 T 및 C와, U는 A 및 G와 대합함) 그 요구는 2개의 표지화 상으로 감소된다. 만약 표지화 상의 생성중에 표지화 반응을 위해 필요한 나머지 요구조건이 고려된다면 그때에는 올리고누클레오티드의 표지화를 위해 필요한 작업은 약 2/n 내지 4/n로 감소된다. 이것은 예를 들어 표지화 작업의 96-98%가 상이한 서열의 약 100개의 프라이머로 구성되는 세트의 제조에 대해 절약될 수 있음을 의미한다. 만약 대규모의 서열화 과정에 대해 1000개의 프라이머가 필요하다면 절약은 99.6 내지 99.8%로까지 증가한다.
본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
표지화 상들을 얻기 위한 보호되고 표지된 누클레오시드의 합성
a) 데옥시시티딘 담체(제 1 도)
aa) 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시시티딘의 합성
2'-데옥시시티딘 염산염(1.32g, 5mmol)을, 20ml의 무수 피리딘중에서 교반하면서, 염화 트리메틸실릴(2.5ml, 20mmol)과 1시간 동안 반응시킨다. 그런 다음 반응 혼합물을 수분을 축출시키면서 증발에 의하여 약 15ml의 부피로까지 농축시키고, p-톨루엔-술포닐 클로라이드(1.9g, 10mmol)를 첨가한다. 반응용기를 단단히 밀봉하여 이것을 장(cupboard)속에 60℃에서 밤새 보관한다. 얇은 막 크로마토그래피에 의한 이 혼합물의 조사결과 출발물질이 완전히 전환된 것으로 나타낸다. 반응부피는 디클로로메탄(50ml)의 첨가에 의해 증가하고, 유기상은 포화 중탄산 나트륨 수용액(60ml)을 넣어 흔들어줌으로써 추출한다. 수성층을 디클로로메탄(20ml)으로 2회 추출한다. 조합된 추출물을 물제트 진공하에 농축시키고 피리딘을 이용하여 약 15ml의 부피로까지 만든다. 농축된 수성 암모니아 용액(15ml)을 이것에 첨가하고, 탈실릴화의 과정을 얇은 막 크로마토그래피에 의하여 모니터한다. 반응은 4시간 후에 정량적이 된다. 그런 다음 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜서, 미정제 생성물인 4-N-p-톨루엔설포닐-2'-데옥시시티딘을 얻고, 이것을 무수 피리딘을 이용하여 (20ml씩 3회) 공증발시킴에 의해 농축시킨 후, 계속해서 순수 피리딘(20ml)에 다시 용해시킨다. 4.4'-디메톡시트리틸 클로라이드(1.70g, 5mmol)를 첨가한다. 트리틸화반응은 얇은 막 크로마토그래피에 의해 관찰하는데, 이것은 2시간내에 완료된다.
반응 혼합물은 디클로로메탄(50ml)과 0.5M 중탄산 나트륨 수용액(50ml) 사이에 분배된다. 수성층은 추가로 디클로로메탄으로 추출하고(50ml씩 2회), 유기 추출물을 무수 황산나트륨상에서 건조시켜 농축시킨다. 용출제로서 디클로로메탄/메탄올을 사용하는 실리카겔 컬럼상에서 크로마토그래피 정제 후에 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-p-톨루엔술포닐-2-데옥시시티딘을 얻는다. 생성물을 벤젠(20ml)에 용해시키고, 오일-펌프 진공에서 냉동 및 동결 건조시킨다. 순수한 생성물이 백색 고체물질로서 분리된다. 2.520g, 73.7%수율.
ab) 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시시티딘-3'-O-모노숙시네이트의 트리에틸암모늄 염의 합성
5'-O-디메톡시트리틸-4-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시시티딘(128mg, 0.187mmol), 숙신산 무수물(50mg, 0.5mmol) 및 4-N,N-디메틸아미노 피리딘(DMAP, 3mg, 0.02mmol)을 무수 디클로로메탄중에서 습기를 배제하면서 트리에틸아민(0.14ml, 1mmol)고 교반시킨다. 얇은 막 크로마토그래피에 의한 분석은 상기 반응이 2시간 이내에 완료됨을 나타낸다. 반응 혼합물은 중탄산 나트륨 수용액(10ml)과 디클로로메탄(10ml) 사이에 분배된다. 수성층을 디클로로메탄(10ml씩 2회)재추출하고, 조합된 추출물을 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켜 농축시킨다. 미정제 생성물의 나머지 잔류물을 1,4-디옥산(3ml)에 용해시키고 오일-펌프 진공하에 냉동 및 동결건조시킨다. 원하는 생성물은 백색 고체물질로서 형성된다:165mg, 99% 수율.
ac) 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시시티딘-3'-(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포라미다이트
5'-O-디메톡시트리틸-4-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시시티딘(1.368g, 2mmol)을 무수 디클로로메탄(10ml)중에서 디이소프로필에틸아민(2ml, 11.5mmol)의 존재하에 마그네틱 교반기로 교반하고, N,N-디이소프로필아미노-(2-시아노에톡시)-클로로포스핀(0.535ml, 2.40mmol)을 수분을 배제하면서 첨가한다. 반응은 TLC분석에 의해 나타나는 바, 약 15분 이내에 정량적으로 되었다. 반응을 메탄올(0.1ml)의 첨가에 의해 중지시키고 디클로로메탄올(30ml)을 반응 혼합물에 넣은 후, 중탄산 나트륨 수용액(20ml)을 넣고, 흔들어줌으로써 추출한다. 수성상을 디클로로메탄으로 (10ml씩 2회)재추출하고 조합된 추출물을 무수 황산 나트륨상에서 건조시켰다. 미정제 생성물을, 용출제로서 최종 조성이 10:85:5(부피비임)인 n-헥산-아세톤-트리에틸아민의 혼합물을 사용하여 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피기법을 이용하여 정제한다. 원하는 순수한 생성물은 벤젠(20ml)으로 부터의 동결건조에 의하여 백색분말로서 분리된다.
ad) 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-(2,2'-에틸렌디옥시)-디에틸아미노)-2'-데옥시시티딘의 합성 무수 2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아민(1.2ml, 12mmol)을 7.5ml의 피리딘중의 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시시티딘(205mg, 0.3mmol)의 용액에 첨가한다. 반응용기를 빈틈없이 밀봉하고 50℃의 오븐에 밤새 놓아둔다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 15ml의 물 및 7.5ml의 디클로로메탄으로 추출한다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발에 의해 농축시킨다. 추가의 정제는 디클로로메탄/메탄올의 구배를 이용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 수행한다. 무색 포움 170mg(이론적 수율의 85%)이 얻어진다.
ae) 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-[8-플루오레신-4-일)]티오우레이도-2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미노]-2'-데옥시시티딘의 합성
5'-O-디메톡시트리틸-4-N-(2,2'-에틸렌디옥시)-디에틸아미노)-2'-데옥시시티딘(66mg, 0.01mmol)을 1ml의 1ml의 DMF에 녹인다. 이 용액에 1.0ml의 봉산 나트륨 완충액(1M, pH 9.2) 및 플루오레신 이소티오시안산염(38mg, 0.01mmol)을 첨가하여 이 제제를 실온의 암실에 밤새 방치하여 둔다. 반응 혼합물을 붕산 나트륨 완충액(10ml) 및 디클로로메탄(10ml)으로 추출하고, 에멀션을 원심분리에 의하여 해유화(demulsify)시킨 후 유기층을 분리시킨다. 추출을 2번 더 반복한다. 조합된 유기상들을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 그 여액을 증발에 의해 농축시킨 후, 생성물을 아세톤과 포화 중탄산 나트륨 수용액의 혼합물을 사용하여 역 컬럼 크로마토그래피(Merck, RP-2 실리카겔)에 의해 정제한다. 119mg의 생성물을 오렌지색 오일로서 얻는다.
b) 데옥시아데노신 담체(제 2 도)
ba) 6-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시아데노신의 합성
데옥시아데노신(1.15g, 4.0mmol)을, 각 경우에 10ml씩의 무수 피리딘을 사용하여 공증발시키고, 계속해서 1시간 동안 실온에서 피리딘(120ml)중의 염화 트리메틸실릴(4ml, 32mmol)과 교반시킨다. 그런 다음 혼합물을 그 안의 수분을 배제시키면서 약 100ml의 부피로 증발에 의해 농축시킨다. p-톨루엔술포닐 클로라이드(1.83g, 9.5mmol) 및 디메틸아미노 피리딘(1.0g, 9.3mmol)을 첨가하고, 50분 동안 60℃에서 환류하에 수분을 배제시키면서 교반시킨다. 반응을 모니터하기 위하여 샘플을 취하여 농축 암모니아로 탈실릴화시키고 (약 2시간 동안), 회전증발시킨 후 디클로로메탄에 넣는다. 얇은 막 크로마토그래피(이동성 용매 염화 메틸렌/메탄올=9:1)에 의한 조사결과, 완전한 전환이 얻어질 수 없는 것으로 나타나고, 따라서 분해 생성물이 증가하자마자 반응을 정지시킨다. 반응부피는 디클로로메탄(100ml)의 첨가에 의해 증가되며, 혼합물은 계속해서 포화 중탄산 나트륨 용액(250ml)으로 흔들어 줌으로써 추출하고, 수성상은 다시 디클로로메탄으로 (50ml씩 2회) 추출한다. 유기 추출물을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 계속해서 물-제트 진공내에서 약 100ml로 증발에 의해 부피를 감소시킨다. 농축된 암모니아 수용액(100ml)을 첨가하고, 탈실릴화의 경로는 얇은막 크로마토그래피에 의해 모니터한다. 그 결과, 반응은 4시간 후에 완료된다. 다량의 분해 생성물을 형성되기 때문에, 미정제 생성물은 실리카겔 및 용출제로서 염화메틸렌/메탄올(10:1)을 사용하는 중력컬럼(Merck 7734)상에서 정제한다.
bb) 5'-O-디메톡시트리틸-6-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시아테노신의 합성
6-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시아테노신(4.0g, 9.8mmol)을 순수 피리딘으로 (15ml씩 3회) 공증발시키고, 계속해서 피리딘(50ml)중에 넣고, 여기에 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(3.75g, 11mol)를 아르곤하에 첨가한다. 얇은 막 크로마토그래피에 의한 모니터링은 반응이 2시간 후에 완료됨을 나타낸다. 디클로로메탄(50ml)을 첨가하고, 그 혼합물은 0.5M 중탄산 나트륨 용액으로 흔들어줌으로써 추출한다. 수성상을 디클로로메탄으로 (50ml씩 2회) 재추출하고, 조합된 유기 추출물을 황산 나트륨상에서 건조시킨 후 회전증발시킨다. 이 방법으로 얻은 미정제 생성물은, 용출제로서 염화메틸렌/메탄올을 사용하여 실리카겔 컬럼(Merck H60)상에서 크로마토그래픽적으로 정제한다.
bc) 5'-O-DMTr-6-N-p-톨루엔설포닐-2'-데옥시아데노신-3'-O-모노숙시네이트의 트리에틸암모늄염의 합성
5'-O-DMTr-6-N-p-톨루엔설포닐-2'-데옥시아데노신(200mg, 0.28mmol), 숙신산 무수물(70mg, 0.7mmol), 4-N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP, 45mg, 0.03mmol) 및 순수트리에틸아민(0.2ml, 1.4mmol)을 순수 염화 메틸렌중에 녹이고 실온에서 2시간 동안 교반시킨다. 반응 혼합물을 수성 중탄산 나트륨(10ml)과 디클로로메탄(10ml) 사이에 분배시키고, 수성상을 디클로로메탄으로 (10ml씩 2회)재추출한 다음, 조합된 유기층을 황산 나트륨상에서 건조시키고 회전 증발시킨다. 이 방법으로 얻어진 생성물은 정제없이 다음 단계에서 계속 처리한다.
bd) 5'-O-디메톡시트리틸-8-(2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미노)-2'-데옥시아데노신의 합성 무수 2,2-(에틸렌디옥시)-디메틸아민(0.5ml)을 0.5ml의 피리딘중의 5'-O-디메톡시트리틸-8-브로모-2'-데옥시아데노신(100mg, 0.15mol) 용액에 첨가한다. 반응용기를 빈틈없이 밀봉하여 밤새 70℃의 오븐에 넣어둔다. 계속해서 실시예 ad)에서 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-(2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미노)-2'-데옥시시티딘에 대한 정제과정과 유사한 과정으로 정제한다.
be) 5'-O-디메톡시트리틸-8-8-(플루오레신-4-일)티오우레이도-2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미노)2'-데옥시아데노신의 합성
1ml의 DMP중에 5'-O-디메톡시트리틸-8-N-(2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미노)-2'-데옥시아데노신(82mg, 0.12mmol)을 녹인다. 이 용액에 0.1ml의 붕산 나트륨 완충액(1M, pH 9.2) 및 플루오레신 이소티오시아네이트(47mg, 0.12mmol)를 첨가한다. 이 제제를 실온의 암실에 밤새 세워놓았다가 반응 혼합물을 붕산 나트륨 완충액(10ml) 및 디클로로메탄(10ml)로 추출한다. 에멀션을 원심분리에 의하여 해유화시키고 유기층을 분리시킨다. 추출은 2회 더 반복한다. 유기층을 조합하여 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과물을 증발에 의해 농축시킨 후, 생성물을 아세톤과 포화 중탄산 나트륨 수용액의 혼합물을 사용하여 역 컬럼크로마토그래피(Merck, RP-2 실리카겔)에 의해 정제하여, 97mg의 생성물을 오렌지색 오일로서 얻는다.
c) 데옥시구아노신 담체
5'-O-DMTr-2-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시구아노신의 합성을 bb)와 유사하게 수행한다(제 2 도).
d) 데옥시우리딘 담체(제 3 도)
da) 5'-O-디메톡시트리틸-5-브로모-2'-데옥시우리딘의 합성
5-브로모-2'데옥시우리딘(4.0g, 13mmol)을 순수 피리딘으로(15ml씩 3회) 공증발시키고, 계속해서 피리딘(50ml)중에 넣은 후, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(4.88g, 14.3mmol)을 아르곤 하에 첨가한다. 얇은막 크로마토그래피에 의한 모니터링 결과 반응이 2시간 후에 완료되는 것으로 나타난다. 디클로로메탄(50ml)을 첨가하고, 이 혼합물을 0.5M 중탄산 나트륨 용액으로 흔들어줌으로써 추출한다. 수성층을 디클로로메탄으로 (50ml씩 2회)재추출하고, 유기 추출물을 모아서 황산 나트륨 상에서 건조시키고 회전증발시킨다. 이 방법으로 얻어진 미정제 생성물은 용출제로서 염화 메틸렌/메탄올을 사용하여 실리카겔 컬럼상에서 크로마토그래피적으로 정제한다.
db) 5'-O-디메톡시트리틸-5-(2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미노)-2'-데옥시우리딘의 합성
5'-O-디메톡시트리틸-5-브로모-2'-데옥시우리딘(0.7g, 1.2mmol)을 수분을 배제하면서 순수 에탄올(10ml)에 녹인다. 건조한 2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아민(0.7ml, 4.8mmol)을 첨가하고, 혼합물을 24시간 동안 환류하에 가열한다. 계속해서 용액을 건고상태에 이를때까지 진공증발에 의해 농축시킨다. 오일상의 잔류물을 디클로로메탄(30ml)에 넣고 포화 염화 칼륨용액(30ml씩 2회)으로 추출하여 과잉량의 디아민을 대부분 제거한다. 유기층을 황산 나트륨 상에서 건조시키고 회전 증발시킨다. 잔류물을 소량(2-3ml)의 물로 소화시켜서 추가의 디아민을 제거한다.
물을 뽑아내어 버린다. 생성물을 분말점도에 이를때까지 건조기에서 오일-펌프 진공에서 오산화인상에서 건조시킨다.
[실시예 2]
보호된 표지 누클레오시드의 숙신산 에스테르를 이용한 올리고누클레오티드 합성을 위한 표지화 상의 제조를 위한 일반적 지시사항
적당한 방법으로 보호된 누클레오시드 숙신산염의 트리에틸암모늄명(0.185mmol, 예. 실시예 1bc), 담체물질(1.0g), N,N-디시클로헥실 카르보디민(200mg, 1mmol), 4-N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP, 6mg, 0.05mmol), 트리에틸아민(0.07ml, 0.5mmol)을 실온에서 무수 디클로로메탄(3ml)중에서 공기의 부재하에 밤새 흔들어준다. 그런 다음 담체를 여과하여 제거하고, 디클로로메탄(50ml)으로 세척한 후 아세트산 무수물(0.35ml), 트리에틸아민(1ml), 디클로로메탄(2ml)중의 DMAP(12mg)이 들어있는 플라스크에 넣고 2시간 동안 반응시킨다. 담체를 여과하여 제거하고, 계속해서 디클로로메탄, 메탄올, 디클로로메탄, 그리고 디에틸에테르(모두 25ml씩)로 세척한 후, 건조기에서 오일-펌프 진공으로 중량이 일정하게 유지될때까지 건조시킨다.
상술된 지시사항에 따라 18μmol/g(또는 26μmol/g 아데노신 유도체)을 로딩하면 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시시티딘(또는 -아데노신)을 가지는 LCAA-CPG 500A가 생성된다.
4-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시시티딘 또는 6-N-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시아데노신을 가지는 “장쇄 아미노알킬” 제어된 기공유리 담체(LCAA-CPG 500)의 유도
5'-O-디메톡시트리틸-p-톨루엔술포닐-2'-데옥시누클레오시드-3'-O-모노숙시네이트의 트리에틸 암모늄 염(0.186mmol), LCAA-CPG 500A(Pierce Company, 1000g), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(200mg, 1mmol), 4-N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP, 6mg, 0.05mmol) 및 트리에틸아민(0.07ml, 0.5mmol)을 실온에서 밤새 주의를 기울여가며 기계적으로, 수분을 배제하면서 흔들어준다. 담체를 여과분리하여 디클로로메탄(50ml)으로 세척하고, 미반응 히드록실기를 차단(masking)하기 위하여 반응 플라스크에 넣어서 2시간 동안 아세트산 무수물(0.35ml), 트리에틸아민(1ml), 디클로로메탄(2ml)중의 DMAP(12mg)와 함께 흔들어 준다. 담체를 여과분리하여 계속해서 디클로로메탄, 메탄올, 디클로로메탄 및 디에틸 에테르(각각 25ml씩)로 세척하고, 중량이 일정하게 보유될때까지 오일-펌프 진공하에 건조기에서 건조시킨다. 담체의 로딩은 문헌에 기재된 방법에 따라 산으로 처리한 후 적은 양의 담체의 샘플을 사용하여 수행되는, 디메톡시트리틸 양이온의 분광계 측정에 의하여 평가하고, 그 결과 시티딘 유도체에 대해서는 18μmol/g이고, 아데노신 유도체에 대해서는 26μmol/g이다.
반응은 아미노기가 적하된 다른 담체물질(예컨대 CPG 1400)을 사용하여 유사하게 진행시킨다.
5'-O-디메톡시트리틸-8-(8-플루오레신-4-일)티오우레이도-2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미노-2'-데옥시아데노신 또는 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-(8-플루오레신-4-일)티오우레이도-2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미도-2'-데옥시시티딘을 가지는 LCAA-CPG 500의 유도
5'-O-디메톡시트리틸-8-(8-플루오레신-4-일)티오우레이도-2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아미노-2'-데옥시아데노신(55mg, 0.05mmol)을 디클로로메탄/피리딘(1:1, 3.5ml)중에 녹인 후, 트리에틸아민(0.3ml), 4-N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP, 12mg) 및 숙신산 무수물(200mg)을 첨가하여, 이 혼합물을 실온의 암실에서 밤새 놓아두어 반응이 일어나도록 한다. 계속해서 반응 혼합물을 증발에 의해 농축시키고 디클로로메탄/중탄산 나트륨 수용액으로 추출한다. 황산 나트륨상에서 건조시킨 후, 유기층은 증발에 의해 농축시키고 피리딘으로 공-증발시킨다(co-evaporated). 이 방법으로 얻어진 미정제 생성물에 LCAA-CPG 500°A(300mg, Pierce Company), DMAP(6mg), 트리에틸아민(0.07ml), 디시클로헥실카르보니이미드(DCCI, 200-mg) 및 디클로로메탄(1.5ml)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 흔들어주고, 담체를 여과분리하여 디클로로메탄, 메탄올 및 디에틸 에테르 순으로 세척한다. 그런 다음 유도된 담체를 둥근바닥 플라스크에 넣고 아세트산 무수물(0.5ml), 피리딘(1ml), DMAP(12mg) 및 디클로로메탄(5ml)을 첨가한다. 담체를 3시간 후에 여과분리하여 세척한 후 오일-펌프 진공에서 건조기에서 건조시킨다. 담체의 적하량은 아데노신 유도체에 대해서는 19.6μmol/g이고, 시티딘 유도체에 대해서는 19.5μmol/g이다. 이들 담체를 사용하여 실시예 5에 기재된 프라이머 D 및 E를 합성하였다.
[실시예 3]
표지화 상을 사용하여 표지된 올리고누클레오티드를 합성하기 위한 일반적인 작업 지시사항
a) p-톨루엔술포닐기를 가지고 있는 올리고누클레오티드의 합성 및 2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아민과의 반응
올리고누클레오티드는 적당한 담체물질(0.2μmol의 양) 및 포스포라미디트가 사용되는, 제조업체의 프로토콜을 따라 파마시아(Pharmacia) LKB 컴패니(Sweden소재)로부터의 진 어셈블리 플러스(Gene Assembler Plus)를 사용하여 합성한다. 올리고누클레오티드를 에펜도르프 반응용기내에서 실온에서 농축 수성 암모니아로 처리함에 의해 1시간 이내에 담체로부터 절단분리해낸다. 모아진 용액을 스피드-박(Speed-vac) 증발기에서 건고상태로까지 농축시킨다. 무수 2,2'-(에틸렌디옥시)-디에틸아민(100μl)을 부분적으로 보호된 올리고누클레오티드에 첨가하고, 반응용기를 닫은 후 올리고누클레오티드를 실온에서 초음파 조에 넣은 채로 용해시킨다(5 내지 10분 동안). 반응요액을 밤새 80℃의 인큐베이터에 넣어둔다. p-톨루엔술포닐기를 제외하고 완전히 탈보호된 생성물은 아민용액으로 부터 침전된다. 반응용기를 원심분리하여 용액을 조심스럽게 제거한 후, 무수 에탄올(100μl)을 첨가하고, 침전을 초음파 조에 의해 세척하고(5 내지 10분간) 원심분리한다. 상층액은 버리고 세척 과정을 1회 반복한다. 미정제 생성물의 침전을 스피드 박 증발기에서 건조시켜서 추가의 실험에 사용한다.
b) 풀루오레신 이소티오시아네이트와 아미노알킬-올리고누클레오티드와의 반응
플루오레신 잔기를 올리고누클레오티드 안에 도입시키기 위한 방법은 본질적으로는 파마시아 LKB 컴패니의 프로토콜에 설명된 것과 동일하다(Pharmacia-LKB AutoprimerTMSynthesis Kit(27-9290-01)사용). 미정제된 올리고누클레오티드의 침전을 0.15M의 붕산 나트륨 완충액 pH 9.2(100μl)에 녹인 후, 무수 디메틸술폭시드(30μl)중의 플루오레신 이소티오시아네이트 이성체 Ⅰ(1mg)의 새로 제조한 용액을 상기 용액에 첨가한다. 반응은 실온의 암실에서 4 내지 20시간 진행시키고, 그 결과는 본질적으로 동일하다. 반응 혼합물을 NAP-10컬럼(Pharmacia-LKB)에 적용하고 재증류수(암모니아로 pH 8 내지 9.5로 조정되어 있음)로 세척한다. 올리고누클레오티드 함유 분액(1.3ml)을 모아서, 원하는 표지된 올리고누클레오티드를, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(20%, 7M요소)에 의해 또는 HPLC에 의해 분리하고, UV-Vis 분광계로 특성을 확인한다. 뱀 독중의 포스포디에스테라아제/소의 알칼리 포스파타아제로 절단하는 것은 문헌의 방법을 따라 수행한다[Anal. Biochem. 165, 442-447(1987)].
c) 플루오레신 처리된 데옥시누클레오티드를 가지고 있는 담체를 사용하는 올리고누클레오티드의 합성
올리고누클레오티드를 제조업체의 프로토콜에 따라 파마시아-LKB컴패니(Sweden소재)로부터의 진 어셈블러 플러스를 사용하여 적당한 포스포라미디트로 합성한다. 담체물질로서는 플루오레신-데옥시누클레오티드로 유도된 LCAA-CPG 500A담체(10mg, 0.2μmol)를 사용한다. 합성된 올리고누클레오티드의 절단 및 추가의 프로세싱은 파미시아사의 표준 프로토콜에 유사하게 수행된다. 추가의 정제는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(20%, 7M 요소)에 의해 또는 역상 HPLC에 의해 수행된다.
[실시예 4]
DNA 중합요소에 의해 촉매된 주형-의존성 사슬연장에 이용되는 3'-말단 표지된 올리고누클레오티드 서열화 조사는 실예로서 다음의 변형된 올리고누클레오티드를 사용하여 수행하였다:
프라이머 A:5'-CAGGAAACAGCTATAGX SEQ ID 1
프라이머 B:3'-XAGGAAACAGCTATGAC SEQ ID 2
(2개의 프라이머 모두 3a, b)에 따라 제조하였다)
X=플루오레신으로 표지된 시티딘
통상적인 방식으로 아미노 링커와 5'-위치에서 반응하였고 플루오레신으로 표지된 유사한 프라이머를 참조(대조)물질(프라이머 RP)로서 사용하였다(Pharmacia Company의 지시사항임). pUC 19 및 옥토푸스 DNA(D3)를 조사하고자 하는 DNA로서 사용하였다.
서열화는 파마시아 컴패니의 작업 지시사항을 따라 생거 디데옥시 방법에 따라 모든 프라이머에 대해 수행하였고, pUC 19 DNA에 대한 결과를 제4a, 4b도 및 4c도에 도시한다.
pUC 19 DNA는 다음의 프라이머를 사용하여 유사하게 서열화되었다:
프라이머 C:5'-TTTCACACAGGAAACAGCTATGY SEQ ID NO 3
Y=플루오레신으로 표지된 아데노신
[실시예 5]
M13표준 서열화 시스템에 이용되는 3'-말단 표지된 올리고누클레오티드
만능 M13 서열화 프라이머의 2개의 변이체를 서열화 조사에 대해 사용하였다:
프라이머 D:5'-TTGTAAAACGACGGCCY SEQ ID NO 4
(3c)에 따라 제조함)
프라이머 E:5'-AAAACGACGGCCAGTGX SEQ ID NO 5
(2개의 프라이머는 모두 3c)에 따라 제조하였다)
Y=플루오레신으로 표지된 아데노신
X=플루오레신으로 표지된 시티딘
M13mp18(Pharmacia Co.)을 조사하고자 하는 DNA로서 사용하였다.
2개의 프라이머에 대한 서열화를 파마시아 컴패니의 작업 지시사항을 따라 생거 디데옥시 방법에 따라 수행하였다(T7 서열화 키트를 사용함). 이 서열화 결과는 제5a도 및 5b도에 도시한다.
서열 프로토콜
SEQ ID NO 1
서열의 길이:17염기
서열의 유형:누클레오티드
가닥의 형태:단일가닥
위상:선형
특징:C가 3' 끝에서 플루오레신으로 표지됨
CAGGAAACAG CTATAGC17
SEQ ID NO 2
서열의 길이:17염기
서열의 유형:누클레오티드
가닥의 형태:단일가닥
위상:선형
특징:C가 3' 끝에서 플루오레신으로 표지됨
CAGTATCGAC AAAGGAC17
SEQ ID NO 3
서열의 길이:23염기
서열의 유형:누클레오티드
가닥의 형태:단일가닥
위상:선형
특징:A가 5' 끝에서 플루오레신으로 표지됨
AGTATCGACA AAGGACACAC TTT 23
SEQ ID NO 4
서열의 길이:17염기
서열의 유형:누클레오티드
가닥의 형태:단일가닥
위상:선형
특징:A가 3' 끝에서 플루오레신으로 표지됨
TTGTAAAACG ACGGCCA17
SEQ ID NO 5
서열의 길이:17염기
서열의 유형:누클레오티드
가닥의 형태:단일가닥
위상:선형
특징:C가 3' 끝에서 플루오레신으로 표지됨
AAAACGACGG CCAGTGC17

Claims (10)

  1. 표지화 그룹을 가지고 있는 누클레오시드 또는 누클레오티드 또는 그것의 유도체 또는 전구체가 고정그룹 및 에틸렌디옥시기를 함유하는 스페이서 그룹을 경유하여 공유결합되어 있는 중합체 담체.
  2. 제1항에 있어서, 누클레오시드, 누클레오티드 또는 그것의 유도체 또는 전구체가 그것의 3'-히드록실기를 경유하여 상의 고정그룹에 부착되는 것을 특징으로 하는 담체.
  3. 제 1 항에 있어서, 표지화 그룹이 핵산염기에 부착되는 것을 특징으로 하는 담체.
  4. 3'-말단 누클레오티드가 표지된 올리고누클레오티드의 합성에 사용되는 중합체 담체.
  5. 표지화 그룹을 가지고 있는 규정된 수 및 유형의 데옥시누클레오티드 또는 리보누클레오시드, 데옥시누클레오티드 또는 리보누클레오티드 또는 그것들의 유도체 또는 전구체를, 에틸렌디옥시기를 함유하는 스페이서 그룹을 경유하여 3' 끝에 가지고 있는, 최소한 하나의 표지화 그룹을 함유하고 있는 올리고누클레오티드.
  6. DNA 또는 RNA의 3'끝에서 출발하여 DNA 또는 RNA중합효소에 의해 촉매되는 주형-의존성 사슬연장 반응에서 프라이머로서 사용되는 올리고누클레오티드로서, 상기 올리고누클레오티드는 3'끝에 비-방사성 표지화 그룹을 가지고 있는 규정된 수 및 유형의 데옥시누클레오시드 또는 리보누클레오시드, 데옥시누클레오티드 또는 리보누클레오티드 또는 그것들의 유도체 또는 전구체를 가지는 것을 특징으로 하는 올리고누클레오티드.
  7. 제 6 항에 있어서, 반응이 효소적 핵산 서열화 과정의 일부인 것을 특징으로 하는 올리고노클레오티드.
  8. 제 6 항에 있어서, 반응이 중합효소 사슬반응의 일부인 것을 특징으로 하는 올리고누클레오티드.
  9. 주형핵산에 대한 프라이머의 혼성화 및 그것의 3' 끝에서 출발하는 상기 프라이머의 효소적 연장에 의한 표지된 핵산의 제조방법으로서, 상기 프라이머가 그것의 3'끝에 비-방사성 표지화 그룹을 가지고 있는 누클레오시드를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 중합체 담체상에서의 화학적 합성에 의한 말단-누클레오티드 표지된 올리고누클레오티드의 제조방법으로서, 제 1 항의 담체가 추가의 모노누클레오시드 단위체와의 연결에 의하여 신장되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1019940700659A 1991-08-28 1992-08-22 주형-의존성 효소적 핵산 합성에 대한 프라이머로서의 올리고누클레오티드의 동시합성 및 직접 표지화를 위해 기능화된 담체물질 KR0123559B1 (ko)

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