ES2271306T5 - Evolución de una nueva función molecular - Google Patents

Abstract

un método para desarrollar síntesis moldeada de ácido nucleico, el método comprende las etapas de: (a) suministrar (i) un molde que comprende una primer unidad reactiva covalentemente asociada con un primer oligonucleótido que define una primer secuencia de codon, y (ii) una unidad de transferencia que comprende una segunda unidad reactiva asociada con un segundo oligonucleótido que define una primer secuencia anti codón complementaria a la primer secuencia de codón de la plantilla. (b) Reasociación del primer codón y las primeras secuencias anti codón para llevar la primer unidad reactiva y la segunda unidad reactiva en proximidad reactiva; (c) Introducir una reacción entre la primera y segunda unidades reactivas para producir un producto de reacción.

Description

Evolución de una nueva función molecular

Información de prioridad

Esta solicitud reivindica la prioridad según el 35 U. S. C. § 119 (e) a las solicitudes de patente Provisionales Estadounidenses 60/277,081, presentada en Marzo 19, 2001, titulada “Síntesis Dirigida de Ácido Nucleico de Compuestos Químicos” 60/277, 094, presentada en Marzo 19, 2001, titulada “Enfoques Para Generar Nueva Función Molecular”; y 60/306, 691, presentada en Julio 20, 2001, titulada “Enfoque Para Generar Nueva Función Molecular” y el contenido completo de cada una de estas solicitudes se incorpora aquí como referencia.

Antecedentes de la invención

El “Enfoque Químico” clásico para generar moléculas con nuevas funciones se han utilizado extensivamente durante el último siglo en aplicaciones que varían de descubrimientos de drogas a metodología sintética a ciencia de materiales. En este enfoque (Figura 1, negro), los investigadores sintetizan o aíslan moléculas candidato, ensayan estos candidatos para las propiedades deseadas, determinan las estructuras de compuestos activos si se desconocen, se formulan relaciones de actividad-estructura basado en el ensayo y los datos estructurales, y luego se sintetiza una nueva generación de moléculas diseñadas para poseer propiedades mejoradas. Mientras que los métodos de la química combinatoria (ver, por ejemplo, A. V. Eliseev and J. M. Lehn. Combinatorial Chemistry In Biology 1999,243, 159-172; K.

W. Kuntz, M. L. Snapper and A. H. Hoveyda. Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3, 313-319; D. R. Liu and P. G. Schultz. Angew. Chem. Intl. Ed. Eng 1999, 38, 36) han incrementado el rendimiento de este enfoque, sus limitaciones fundamentales permanecen invariables. Varios factores limitan la efectividad del enfoque químico para generar la función molecular. Primero, nuestra capacidad para predecir exactamente los cambios estructurales que conducirán a nuevas funciones es a menudo inadecuado debido a las redisposiciones conformacionales de tenues de las moléculas, interacciones de solventes inesperadas, o requerimientos estereoquímicos desconocidos de unión o eventos de reacción. La complejidad resultante de la relación de actividad-estructura limita frecuentemente el éxito del ligando racional o diseño de catalizador, que incluye aquellos esfuerzos conducidos en una forma de alto rendimiento. Segundo, la necesidad de probar o seleccionar o tamizar, a diferencia de seleccionar, cada miembro de cada colección de candidatos que limita el número de moléculas que se pueden buscar en cada experimento. Finalmente, la falta de una vía para amplificar moléculas sintéticas coloca los requerimientos en la cantidad mínima de material que se debe producir para la caracterización, tamizado, y elucidación de la estructura. Como un resultado, puede ser difícil generar librerías de más de aproximadamente 106 compuestos sintéticos diferentes.

En contraste, la naturaleza genera proteínas con nuevas funciones que utilizan un método fundamentalmente diferente que supera muchas de estas limitaciones. En este evento (Figura 1 gris) una proteína con propiedades deseadas induce la supervivencia y amplificaciones de la información que codifica esa proteína. Esta información se diversifica a través de mutación espontánea y recombinación de ADN, y luego se traslada en una nueva generación de proteínas candidato utilizando la ribosoma. La energía de este proceso es bien apreciada (ver, F. Arnold Acc. Chem. Res. 1998, 31, 125; F.

H. Arnold et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 54-59; J. Minshull et al. Curr Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284-90) y se evidencia por el hecho de que las proteínas y ácidos nucleicos dominan las soluciones para muchos problemas químicos complejos a pesar de su limitada funcionalidad química. Claramente, diferente al enfoque químico lineal descrito anteriormente, las etapas utilizadas por la Naturaleza forman un ciclo de evolución molecular. Las proteínas que emergen de este proceso se han seleccionado directamente, a diferencia de simplemente tamizadas, para actividades deseadas. Debido a la información que codifica las proteínas de evolución (ADN) se pueden amplificar, una molécula de proteína sencilla con la actividad deseada en teoría conducir a la supervivencia y propagación del ADN que codifica su estructura. Las cantidades pequeñas de material necesarias para participar en un ciclo de evolución molecular permite librerías mucho más grandes en diversidad diferente aquellas sintetizadas por enfoque químicos para ser generados y seleccionados para la función deseada en volúmenes pequeños.

Reconociendo el poder y eficiencia del enfoque de la Naturaleza, los investigadores han utilizado la evolución molecular para generar muchas proteínas y ácidos nucleicos con la unión novedosa o propiedades catalíticas (ver, por ejemplo, J. Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284-90; C. Schmidt-Dannert et al. Trends Biotechnol. 1999, 17, 135-6; D.

S. Wilson et al. Annu. Rev. Biochem. 1999, 68, 611-47). Las proteínas y ácidos nucleicos evolucionadas por los investigadores han demostrado valor como herramientas de investigación, diagnostico, reactivos industriales, y terapéuticos y han expandido grandemente nuestro entendimiento de las interacciones moleculares que dota las proteínas y ácidos nucleicos con propiedades catalíticas o de unión (ver, M. Famulok et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 320-7).

A pesar del enfoque eficiente de la naturaleza para generar función, la evolución molecular de la naturaleza se limita a dos tipos de moléculas “naturales”-proteínas y ácidos nucleicos-debido por que la información en el ADN solo se puede traducir en proteínas o en otros ácidos nucleicos. Sin embargo, muchas moléculas sintéticas de interés no representan estructuras de ácido nucleico en general, y el uso de la síntesis de plantilla de ADN para traducir secuencias de ADN en

moléculas pequeñas sintéticas seria ampliamente útil solo si las moléculas sintéticas diferentes de los ácidos nucleicos y análogos de ácidos nucleicos se pudieran sintetizar en una forma de plantilla de ADN. Un enfoque ideal para generar moléculas funcionales podría emerger de los aspectos más potentes de la evolución molecular con la flexibilidad de la química sintética. Claramente, permitiendo la evolución de moléculas pequeñas sintéticas no naturales y polímeros, de forma similar a la forma en que la naturaleza evoluciona las biomoléculas, conduciría a métodos muchos más efectivos de descubrir nuevos ligandos sintéticos, receptores y catalizadores difíciles o imposibles de generar utilizando diseño racional.

Resumen de la invención

El reconocimiento de la necesidad para ser capaz de amplificar y evolucionar clases de moléculas además de sus ácidos nucleicos y proteínas conduce a la presente invención a suministrar métodos y composiciones para la síntesis dirigida a plantillas, amplificación y evolución de moléculas. En general, estos métodos utilizan una plantilla evolucionable para dirigir la síntesis de un compuesto químico o librerías de compuestos químicos (es decir, la plantilla codifica actualmente la síntesis de un compuesto químico). Basado en una librería codificada y sintetizada utilizando una plantilla tal como un ácido nucleico, se suministran métodos para amplificar, evolucionar, y tamizar la librería. En ciertas realizaciones de especial interés, los compuestos químicos son compuestos que no son, o no semejan, ácidos nucleicos o análogos de estos. En ciertas realizaciones, los compuestos químicos de estas librerías combinatorias codificadas con plantilla son polímeros y más preferiblemente son poliedros no naturales (es decir que excluyen péptidos naturales, proteínas y polinucleótidos). En otras realizaciones, los compuestos químicos son moléculas pequeñas.

En ciertas realizaciones, el método de sintetizar un compuesto o librerías de compuestos comprende suministrar primero uno o más plantillas de ácido nucleico, tal una o más plantillas de ácido nucleico tienen opcionalmente una unidad reactiva asociada a estas. Las plantillas de ácido nucleico se ponen en contacto luego con una o más unidades de transferencia diseñadas para tener una primera porción, un anti-codón, que hibridiza a una secuencia del ácido nucleico, y se asocia con una segunda porción, una unidad reactiva, que incluye un bloque de construcción del compuesto a ser sintetizado. Una vez estas unidades de transferencia han hibridizado a la plantilla de ácido nucleico en una forma de secuencia especifica, la síntesis del compuesto químico puede tener lugar debido a la interacción de porciones reactivas presentes en las unidades de transferencia y/o la plantilla de ácido nucleico. Significativamente, la secuencia del ácido nucleico puede luego ser determinada para decodificar la historia sintética del compuesto adherido y por lo tanto su estructura. Se apreciara que el método descrito aquí se puede utilizar para sintetizar una molécula a la vez o se pude utilizar para sintetizar miles a millones de compuestos que utilizan métodos combinatorios.

Se apreciará que las librerías sintetizadas de esta forma (es decir, que han sido codificadas por un ácido nucleico) tienen la ventaja de ser amplificables y evolucionables. Una vez se identifica la molécula, su plantilla de ácido nucleico a pesar de actuar como etiqueta utilizada para identificar el compuesto adherido también se puede amplificar utilizando técnicas de ADN estándar tal como la reacción de cadena de polimerasa (PCR). El ácido nucleico amplificado puede luego ser utiliza para sintetizar más el compuesto deseado. En ciertas realizaciones durante la etapa de amplificación se introducen mutaciones en el ácido nucleico con el fin de generar una población de compuestos químicos que se relacionan con el compuesto pariente pero se modifican en uno o más sitios. Los ácidos nucleicos mutados pueden luego ser utilizados para sintetizar una nueva librería de compuestos relacionados. De esta forma, la librería que se selecciona puede ser evolucionada para contener más compuestos con la actividad deseada o para contener compuestos con un grado mayor grado de actividad.

Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para sintetizar una amplia variedad de compuestos químicos. En ciertas realizaciones, los métodos se utilizan para sintetizar y evolucionar polímeros no naturales (es decir, que excluyen polinucleótidos y péptidos), que no se pueden amplificar y evolucionar utilizando técnicas estándar actualmente disponibles. En ciertas otras realizaciones, los métodos inventivos y composiciones se utilizan para la síntesis de moléculas pequeñas que no son típicamente poliméricas. En todavía otras realizaciones, el método se utiliza para la generación de polímeros de ácido nucleico no naturales.

La presente invención también suministra las moléculas de transferencia (por ejemplo, plantilla de ácido nucleico y/o unidades de transferencia) útiles en la práctica de los métodos inventivos. Esas moléculas de transferencia incluyen típicamente una porción capaz de hibridizar a una secuencia de ácido nucleico y una segunda porción con monómeros, otros bloques de construcción, o reactivos a ser incorporados en el compuesto final que se sintetiza. Se apreciara que alas dos porciones de la molécula de transferencia se asocian preferiblemente con otra ya sea directamente o a través de una porción ligadora. También se apreciara que la unidad reactiva y el anti-codón pueden estar presente en la misma molécula (por ejemplo, un nucleótido no natural que tiene funcionalidad incorporada en este).

La presente invención también suministra kits y composiciones útiles en la práctica de los métodos inventivos. Estos kits pueden incluir plantillas de ácido nucleico, moléculas de transferencia, monómeros, solventes, amortiguadores, enzimas, reactivos para PCR, nucleótidos, andamios de molécula pequeña, etc. El kit se puede utilizar en la síntesis de tipo particular de polímero no natural o molécula pequeña.

DEFINICIONES

El término anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina, ya sea natural o completa o parcialmente producida de forma sintética. Todos los derivados de esta que mantienen capacidad de unión específica también se incluyen en el término. El término también cubre cualquier proteína que tiene un dominio de unión que es homólogo o grandemente homólogo para un dominio de unión de inmunoglobulina. Estas proteínas se pueden derivar de fuentes naturales o producidas parcial o completamente de forma sintética. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE. Los derivados de la clase igG, sin embargo, se prefieren en la presente invención.

El término, asociado con, se utiliza para descubrir la interacción entre dos o más grupos, porciones, compuestos, monómeros, etc. Cuando dos o más entidades “se asocian con” otra como se describe aquí, ellas se enlazan mediante una interacción indirecta o directa covalente o no covalente. Preferiblemente, la asociación es covalente. La asociación covalente puede ser a través de una amida, ester, carbón-carbón, disulfuro, carbamato, éter, o enlace carbonato. La asociación covalente también puede incluir una porción ligadora tal como un ligador fotofotoclivable. Interacciones no covalentes deseables incluyen unión por hidrogeno, interacciones van der Waals, interacciones hidrófobas, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, etc. También, dos o más entidades o agentes “asociar” con otra al estar presente juntas en la misma composición.

Una macromolécula biológica es un polinucleótido (por ejemplo, ARN, ADN, híbrido de ARN/ADN), proteína, péptido, lípido, producto natural, o polisacárido. La macromolécula biológica puede ser de ocurrencia natural o de ocurrencia no natural. En una realización preferida, una macromolécula biológica tiene un peso molecular mayor de 500 g/mol.

El polinucleótido, ácido nucleótido, u oligonucleótido se refiere a un polímero de nucleótidos. El polímero puede incluir nucleosidos naturales (es decir, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, y desoxicitidina), análogos de nucleósido (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O (6)-metilguanina, y 2-tiocitidina), bases modificadas químicamente, bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas), bases intercaladas, azucares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxiribosa, arabinosa, y hexosa), o grupos fosfatos modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidita).

Una proteína comprende un polímero de residuos de aminoácidos ligados juntos por enlaces péptido. El término, como se utiliza aquí, se refiere a proteínas, polipéptidos, y péptidos de cualquier tamaño, estructura, o función. Típicamente, una proteína será al menos de tres aminoácidos de larga. Una proteína se puede referir a una proteína individual o una colección de proteínas. Una proteína se puede referir a una proteína de longitud completa o un fragmento de una proteína. Proteínas de la invención preferiblemente solo contienen aminoácidos naturales, aunque aminoácidos no naturales (es decir, compuestos que no ocurren en la naturaleza pero que se pueden incorporar en una cadena de polipéptido; ver, por ejemplo, http://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gif, que muestra estructuras de aminoácidos no naturales que se han incorporado exitosamente en canales de ión funcionales) y/o análogos de aminoácidos como son conocidos en la técnica que pueden ser empleados alternativamente. También, uno o más de los aminoácidos en una proteína inventiva se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química tal como un grupo carbohidrato, un grupo hidroxilo, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo de ácido graso, un ligador para conjugación, funcionalización, u otra modificación, etc. Una proteína también puede ser una molécula sencilla o puede ser un complejo multimolecular. Una proteína puede ser solo un fragmento de una proteína de ocurrencia natural o péptido. Un proteína puede ser de ocurrencia natural, recombinante, o sintética o cualquier combinación de estas.

El término molécula pequeña, como se utiliza aquí, se refiere a un compuesto orgánico no peptídico, no oligomerico ya sea sintetizado en el laboratorio o encontrado en la naturaleza. Moléculas pequeñas como se utiliza aquí, se puede referir a compuestos que son “de producción natural”, sin embargo, el término “molécula pequeña” no se limita a compuestos “como producto natural”. Por el contrario, una molécula pequeña se caracteriza típicamente en que esta posee una o más de las siguientes características que incluyen tener varios enlaces carbono-carbono, que tienen múltiples estereocentros, que tienen múltiples grupos funcionales, que tienen al menos dos tipos diferentes de grupos funcionales, y que tienen un peso molecular de menos de 1500, aunque esta caracterización no se pretende se limita para los propósitos de la presente invención.

El término andamio de molécula pequeña, como se utiliza aquí se refiere a un compuesto químico que tiene al menos un sitio para funcionalización. En una realización preferida, el andamio de molécula pequeña puede tener una multitud de sitios para funcionalización. Estos sitios de funcionalización se pueden proteger o enmascarar como lo apreciaría un experto en la técnica. Los sitios también se pueden encontrar en una estructura de anillo subyacente o estructura.

El término unidad de transferencia, como se utiliza aquí, se refiere a una molécula que comprende una porción anticodón asociada con una unidad reactiva, que incluye, pero no está limitada a un elemento básico, monómero, unidad de monómero, o reactivo utilizado en sintetizar las moléculas de ácido nucleico codificadas.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 representa el enfoque de la naturaleza (gris) y el enfoque químico clásico (negro) para generar la función molecular.

La Figura 2 representa ciertas reacciones de plantilla ADN para ácidos nucleicos y análogos de estos.

La Figura 3 representa el método general para sintetizar un polímero utilizando síntesis de plantilla de ácido nucleico.

La Figura 4 muestra un conjunto de codón de cuadro sin cuadro de cambio de tripleta y cuádruplo. Cada conjunto suministra nueve codones posibles.

La Figura 5 muestra métodos de tamizar una librería catalizador de formación de unión y clivaje-unión. Estos métodos toman ventaja de la afinidad natural de la estreptavidina para biotina.

La Figura 6A representa la síntesis dirigida por plantillas de ADN de horquilla (H) y de final de hélice (E). Se analizan las reacciones por desnaturalización del PAGE después de los tiempos de reacción indicados. Las plantillas contenidas en las líneas 3 y 4 se detienen con exceso de β-mercaptoetanol antes de reacción.

La Figura 6B representa reactivos ajustes (M) o desajustes (X) ligado a tioles (S) o a aminas primarias (N) se mezclan con un equivalente de plantilla funcionalizada con la variedad de electrófilos mostrados. Las reacciones con reactivos tiol se conducen en pH 7.5 bajo las siguientes condiciones: SIAB y SBAP: 37° C, 16 h; SIA: 25° C, 16 h, SMCC, GMBS, BMPS, SVSB: 25° C, 10 min. Se conducen reacciones con reactivos amina a 25º C pH 8.5 durante 75 minutos.

La Figura 7 representa (a) plantillas H ligadas con un grupo yodoacetamida que se reaccionan con reactivos tiol que contienen 0, 1, o 3 desajustes a 25º C. (b) las reacciones en (a) se repiten a la temperatura indicada durante 16 h. El reactivo calculado Tm: 38º C(ajustado), 28º C (desajuste único).

La Figura 8 representa una reacción desarrollada utilizando una plantilla E base 41 y un reactivo base 10 diseñado para hibridizar 1-30 bases del extremo 5’ de la plantilla. Los perfiles cinéticos en la gráfica muestran el promedio de dos ensayos (desviación <10%). El reactivo “n = 1 mis” contiene tres desajustes.

La Figura 9 representa la reacción n= 10 repetida en la Figura 8 en la que nueve bases luego del 5’-NH2-dT se remplazan con análogos de estructura mostrados. Cinco equivalentes de un oligonucleótido de ADN complementario al intervenir bases se agrega a la reacción “ADN + clamp”. Los reactivos se (o) o contiene tres desajustes (3). El gel muestra las reacciones a 25º C después de 25 min.

La Figura 10 representa las reacciones (mis) de desajuste n = 1, n = 10, y n = 1 descritas en la Figura 8 que se repiten con las concentraciones de reactivo y plantilla de 12.5, 25, 62.5 o 125 nM.

La Figura 11 representa un modelo de traducción, selección y amplificación de moléculas sintéticas que se unen a la estreptavidina a partir de una librería codificada por ADN.

La Figura 12 representa (a) líneas 1 y 5: PCT: librería amplificada antes de selección por unión de estreptavidina. Las líneas 2 y 6: librería amplificada PCR después de selección. Líneas 3 y 7: plantilla que codifica biotina autentica amplificada PCR. Línea 4: escala bp 20. LAs líneas 5-7 se digieren con Tsp45I. Las trazas de secuencia de ADN de las plantillas amplificadas antes y después de selección también se muestran, junto con las secuencias de las plantillas que codifican biotina y que codifican no biotina. (b) esquema general para la creación y evolución de librerías de moléculas no naturales que utilizan síntesis de plantilla de ADN, en donde –R1 representa la librería de producto de funcionalidad transferida partir de la librería de reactivo 1 y –R1B representa un producto seleccionado.

La Figura 13 representa reacciones de plantilla de ADN de ejemplo. Para todas las reacciones de acuerdo a condiciones específicas, los rendimientos de producto de las reacciones con plantilla de ajuste y secuencias de reactivo fueron mayores que 20 veces más que aquellas reacciones de control con secuencias de reactivo revueltas. Las reacciones se conducen a 25º C con un equivalente cada uno de plantilla y reactivo en concentración final de 60 mM a menos que se especifique otra cosa. Condiciones: a) 3 mM NaBH3CN, 0.1 M de MES amortiguador pH 6.0, 0.5 M de NaCl, 1.5 h ; b)

0.1 M de TAPS amortiguador pH 8.5, 300 mM de NaCl, 12 h ; c) 0.1 M pH 8.0 de TAPS amortiguador, 1 M de NaCl, 5° C, 1.5 h; d) 50 mM de MOPS amortiguador pH 7.5, 2.8 M de NaCl, 22 h; e) 120 nM 19,1.4 mM de Na2PdCl4, 0.5 M NaOAc amortiguador pH 5.0,18 h; f) Premezcla de Na2PdCl4 con dos equivalentes de P (p-SO3C6H4)3 en agua 15 min., luego agrega a los reactivos en 0.5 M de NaOAc amortiguador pH 5.0, 75 mM NaCl, 2 h (final [Pd] = 0.3 mM, [19] = 120 nM). La geometría de olefina de productos de 13 y las regioquímicas de productos de clicloadición de 14 y 16 se presumen pero no se verifican.

La Figura 14 representa el análisis por desnaturalización de poliacrilamida por electroforesis de gel de reacciones de plantilla de ADN representativas listadas en las figuras 13 y 15. Las estructuras de reactivos y plantillas corresponde al número en las figuras 13 y 15. Las líneas 1, 3, 5, 7, 9, 11: de reacción de reactivos de desajuste (complementario) y plantillas bajo las condiciones listadas en las figuras 13 y 15 (la reacción en 4 y 6 se media por el DMT-MM). Las líneas 2, 4, 6, 8, 10, 12: reacción de reactivos de desajuste (no complementarios) y plantillas bajo condiciones idénticas a aquellas en las líneas 1, 3, 5, 7, 9, y 11, respectivamente.

La Figura 15 representa la formación de enlace de amida de plantilla ADN por EDC y sulfo-NHS o por DMT-MM para una variedad de ácidos y amina carboxílicos sustituidos. En cada fila, los productos de reacción mediada por DMT-MM entre los reactivos y plantillas complementarias en secuencia son seguidas por los productos del EDC y las reacciones mediadas por sulfa-NHS. Condiciones: plantilla 60 nM, reactivo 120 nM, DMT-MM 50 mM en 0.1 M de amortiguador MOPS pH 7.0, 1 M NaCl, 16 h, 25° C; o plantilla 60 nM, reactivo 120 nM, EDC 20 mM, sulfo-NHS 15 mM, amortiguador MES 0.1 M pH 6.0, NaCl 1 M, 16 h, 25° C. en todos los casos, las reacciones de control con las secuencias de reactivo de desajuste producen poco o ningún producto detectable.

La Figura 16 representa (a) modelo conceptual para la síntesis de plantilla de ADN de distancia independiente. Como la distancia entre las grupos reactivos de un reactivo hibridizado y la plantilla (n) se incrementa, el índice de formación de unión se presume se reduce. Para aquellos valores en los que n en los que índice de formación de enlace es significativamente mayor que el índice de hibridación de reactivo-plantilla, el índice de formación de producto permanece constante. En ester régimen, la reacción de plantilla ADN muestra la independencia de distancia. (b) la desnaturalización de electroforesis de gel de poliacrilamida de una olefinación intencional de plantilla de ADN entre las bases complementarias 11 y 13 con la base cero (líneas 1-13) o diez bases (líneas 4-6) que separan los reactivos hibridizados. Aunque las constantes de índice de segundo orden evidentes para las reacciones n=0 y n= 10 difiere por tres veces (kapp (n=0) = 9.9 x 103 M-1 s-+ mientras que kapp (n = 10) = 3. 5 x 103 M-1s-1), el rendimiento del producto después de 13 h a ambas distancias fue cercanamente cuantitativo. Las reacciones de control que contienen desajustes de secuencia no producen rendimientos detectables (no mostrados).

La Figura 17 representa ciertas reacciones de construcciones de complejidad de plantilla de ADN.

La Figura 18 representa ciertos ligadores de ejemplo para uso en el método de la invención.

La Figura 19 representa ciertos ligadores de ejemplo adicional para uso en el método de la invención.

La Figura 20 representa un ligador de tioéster de ejemplo para uso en el método de la invención.

La Figura 21 representa reacciones de formación de unión de amida de plantilla de ADN en la que los reactivos y plantillas son complejos con cationes de dimetildidodecilamonio.

La Figura 22 representa el ensamble de unidades de transferencia junto con la plantilla de ácido nucleico y polimerización de las porciones anticodón de nucleótido.

La Figura 23 representa la polimerización de las unidades de dicarbamato junto con la plantilla de ácido nucleico para formar un policarbamato. Para iniciar la polimerización el monómero “inicio” que termina en un o-nitrobencilcarbamato se fotodesprotege para revelar las amina primaria que inicia la polimerización de carbamato. Luego la polimerización procede en la dirección 5’ a 3’ junto con la estructura de ADN, que cada ataque nucleofílico que resulta en el descubrimiento posterior de un nucleófilo amina nuevo. El ataque del monómero “parada” libera una acetamida diferente de una amina, terminando por lo tanto la polimerización.

La Figura 24 representa el clivaje del policarbamato a partir de la estructura de nucleótido. Las desililación del ligador enol éter que une la porción anticodón a la unidad de monómero y la elimiNaClón de fosfato dirigida por la liberación resultante de suministros de fenol que provee el policarbamato ligado covalentemente en su terminal carboxi para su ADN de hebra sencilla codificado.

La Figura 25 representa componentes de una librería de ácido nucleico de péptido funcionarizado evolucionable amplificable.

La Figura 26 representa reactivos de ensayo utilizado para optimizar reactivos y condiciones para acoplamiento de PNA de plantilla de ADN.

La Figura 27 representa un conjunto simple de monómero de PNA derivados de elementos fundamentales disponibles comercialmente útiles para evolucionar un sensor Ni2+ fluorescente basado en PNA.

La Figura 28 representa dos esquemas para la selección de un PNA funcionalizado biotin-terminado capaz de catalizar una reacción de aldol o retroaldol.

La Figura 29 representa la síntesis dirigida a plantilla de ADN de una librería de molécula pequeña combinatoria.

La Figura 30 muestra esquemáticamente como los andamios de molécula pequeña ligadas con ADN se pueden funcionalizar específicamente por secuencia mediante la reacción con reactivos sintéticos ligados a oligonucleótidos de ácido nucleico complementarios, este proceso se puede repetir para completar las transformaciones sintéticas que conducen a una molécula funcionarizada.

La Figura 31 muestra la funcionalización de un andamio de molécula pequeña de cefalosporina con varios reactivos.

La Figura 32 representa una forma de medir la proporción de reacción entre un nucleófilo fijo y un electrófilo hibridizado en distancias variantes junto con una plantilla de ácido nucleico para definir una ventana de reacción esencial en la que la síntesis de plantilla de ácido nucleico de estructuras no poliméricas puede tener lugar.

La Figura 33 representa tres estrategias ligadoras para síntesis de plantilla de ADN. En la estrategia del ligador de autoescindido, el enlace que conecta el producto del reactivo oligonucleótido se cliva como una consecuencia natural de la reacción. En las estrategias ligadoras de marcas útiles, y sin marcas, este enlace se cliva siguiendo la reacción de plantilla de ADN. Las reacciones descritas se analizan al desnaturalizar por electroforesis de gel de poliacrilamida (adelante). Las líneas 1-3 se visualizan utilizando UV sin teñido de ADN; las líneas 4-10 se visualizan al teñir con bromuro de etidio luego por transilumiNaClón UV. Condiciones: 1 a 3 un equivalente cada reactivo y plantilla, 0.1 M de amortiguador TAPS pH 8.5, 1 M NaCl, 25° C, 1.5 h; 4 a 3 equivalentes de 4, 0.1 M amortiguador MES pH 7.0, 1 M NaNO2, 10 mM AgNO3, 37° C, 8 h; 8 a 9: 0.1 M amortiguador CAPS pH 11.8, 60 mM BME, 37° C, 2 h; 11 a 12: 50 mM de NalO4 acuoso, 25° C, 2 h. R1 = NH(CH2)2NH-dansil; R2 = biotina.

La Figura 34 representa estrategias para purificar productos de síntesis de plantilla de ADN. Utilizando reactivos biotinilados de oligonucleótidos, productos que se dan a partir de un ligador de autoescindido se purifican parcialmente al lavar la reacción cruda con glóbulos ligados de avidina (superior). Los productos generados de reacciones de plantilla de ADN que utilizan los ligadores de marcas útiles o sin marca se pueden purificar al utilizar oligonucleótidos de reactivos biotinilados, que capturan los productos de reacción crudos con glóbulos ligados con avidina y eluir los productos deseados a al inducir clivaje legador (inferior).

La Figura 35 representa la generación de un grupo de plantilla inicial para una síntesis de librería de ejemplo.

La Figura 36 representa la síntesis de plantilla de ADN de una librería de péptido no natural.

La Figura 37 representa un aminoácido ligador de ADN de reactivos 5’.

La Figura 38 representa la síntesis de plantilla de una librería bicíclica orientada a diversidad evolucionable.

La Figura 39 representa la síntesis de tripéptido de multi-etapa de plantilla de ADN. Cada amida de plantilla de ADN de formación utiliza reactivos que contienen el ligador sulfona descrito en el texto: condiciones etapa 1: dos equivalentes activos 13 en 20 mM EDC, 15 mM sulfo-NHS, 0.1 M MES amortiguador pH 5.5, 1 M NaCl, 10 min, 25º C, luego se agrega a la plantilla en 0.1 M MOPS pH 7.5, 1M NaCl, 25° C, 1 h; etapas 2 y 3: dos equivalentes de reactivo, 50 mM DMT-MM, 0.1 M MOPS amortiguador pH 7.0, 1M NaCl, 6 h, 25° C. el producto deseado de cada etapa se purifica al capturar sobre glóbulos ligados con avidina y eluir con 0.1 M de amortiguador CAPS pH 11.8,60 mM BME, 37° C, 2 h. El progreso de cada reacción y purificaciones se sigue por desnaturalización de electroforesis de gel de poliacrilamida (inferior). Las líneas 3, 6 y 9: reacciones de control que utilizan reactivos que contienen secuencias de oligonucleótido revueltas.

La Figura 40 representa síntesis multietapa de plantilla de ADN no peptídica. Los ligadores de reactivos utilizados en las etapas 1, 2, y 3 fueron el ligador diol, ligador de autoescindido intencional, y ligador sulfona, respectivamente; ver figura 1 para condiciones de clivaje de ligador. Condiciones: 17 a 18: activa dos equivalentes 17 en 20 mM EDC, 15 mM sulfo-NHS, 0.1 M amortiguador MES pH 5.5, 1 M NaCl, 10 min, 25° C, luego se agrega a la plantilla en 0.1 M MOPS pH 7.5, 1M NaCl, 16° C, 8 h; 19 a 21: tres equivalentes 20, 0.1 M TAPS pH 9.0, 3 M NaCI, 48 h, 25° C; 22 a 23: tres equivalentes 22, 0.1 M TAPS pH 8.5, 1 M NaCI, 21 h, 25° C. El progreso de cada reacción y purificaciones se sigue por desnaturalización de electroforesis de gel de poliacrilamida (inferior). Las líneas 3, 6 y 9: reacciones de control que utilizan reactivos que contienen secuencias de oligonucleótido revueltas.

La Figura 41 representa el uso de ácidos nucleicos para dirigir la síntesis de nuevos polímeros y plásticos al adherir el ácido nucleico al ligando de un catalizador de polimerización. El ácido nucleico se puede convertir en una estructura compleja que puede afectar la selectividad y actividad del catalizador.

La Figura 42 representa el uso de catalizadores de polimerización metátesis de anillo abierto Grubb en plásticos evolucionantes. El esquema sintético de un ligando de dihidroimidazol unido al ADN se muestra así como también el monómero a ser utilizado en la reacción de polimerización.

La Figura 43 representa la evolución de plásticos a través de ciclos iterativos de diversificación de ligando, selección de amplificación para crear polímeros con propiedades deseadas.

La Figura 44 representa un esquema de ejemplo para la síntesis, selección in vitro, y amplificación de una librería de los compuestos.

La Figura 45 describe plantillas de ejemplo para uso en recombinación.

La Figura 46 representa varios desoxiribonucleótidos y ribonucleótidos de ejemplo que llevan modificaciones a grupos que no participan que la unión de hidrógeno Watson-Crick y son conocidos por ser insertados con secuencia de alta fidelidad opuesta a plantillas de ADN naturales.

La Figura 47 representa análogos 7-desazaadenosina y uridina de unión de metal.

La Figura 48 representa la síntesis del análogo (7).

La Figura 49 representa la síntesis del análogo (30).

La Figura 50 representa la síntesis de trifosfatos desoxiadenosina 8-modificados.

La Figura 51 representa los resultados de un ensayo que evalúa la aceptación de nucleótidos modificados por polimerasas ADN.

La Figura 52 representa la síntesis de derivados 7- desazaadenosina.

La Figura 53 representa ciertos trifosfatos de nucleótido de ejemplo.

La Figura 54 representa un método general para la generación de librerías de polímeros de unión de metal.

Las Figuras 55 y 56 representan esquemas de ejemplo para las selecciones in vitro para catalizadores de polímero no natural.

La Figura 57 representa un esquema de ejemplo para la selección in vitro de catalizadores parta reacciones Heck, reacciones hetero Diels-Alder y adiciones aldol.

Descripción de ciertas realizaciones de la invención

Como se discutió anteriormente, seria deseable ser capaz de evolucionar y amplificar compuestos químicos que incluyen, pero no están limitados a moléculas pequeñas y polímeros, en la misma forma que biopolímeros tal como polinucleótidos y proteínas que pueden amplificar y evolucionar. Se ha demostrado que la síntesis de plantilla de ADN suministra un medio posible de traducción de la información en una secuencia de ADN dentro de una molécula sintética. En general, las plantillas de ADN ligadas a un reactivo puede ser capaz de captar un segundo grupo reactivo ligado a una molécula de ADN complementaria para producir un producto. Debido a que la hibridización de ADN es de secuencia específica, el resultado de una reacción de plantilla de ADN es la traducción de una secuencia de ADN específica en un producto de reacción correspondiente. Como se muestra en la Figura 2 la capacidad de las plantillas de ácido nucleico de hebra sencilla para catalizar la oligomeración específica de secuencia de oligonucleótidos complementarios (T. Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7666; T. Inou et al. J. Mol. Biol. 1984, 178, 669-76) se ha demostrado. Ese descubrimiento se siguió prontamente por hallazgos de que las plantillas de ADN o ARN pueden catalizar la oligomerización de ADN o ARN complementario mono-, di-, tri-, o oligonucleótidos (T. Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7666; L. E. Orgel et al. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 109-118; H. Rembold et al. J Mol. Evol. 1994, 38, 205; L. Rodriguez et al. J. Mol. Evol. 1991, 33, 477; C. B. Chen et al. J. Mol. Biol. 1985, 181, 271). Las plantillas de ADN o ARN han sido por lo tanto mostradas para acelerar la formación de una variedad de análogos ácido nucleico no naturales, que incluyen ácidos nucleicos péptido (C. Bohler et al. Nature 1995, 376, 578), fosforotioato-(M. K. Herrlein et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10151-10152), fosforoselenato- (Y. Xu et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 9040-9041; Y. Xu et al. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 148-152) y fosforamidato- (A. Luther et al. Nature 1998, 396, 245-8) que contienen ácidos nucleicos, ácidos nucleicos no ribosa (M. Bolli et al. Chem. Biol. 1997, 4, 309-20), y analagos de ADN en el que se ha reemplazado un enlace fosfato con un grupo aminoetilo (Y. Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19-28). Las plantillas de ácido nucleico también puede catalizar acilación amina entre análogos de nucleótido (R. K. Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3, 49-56).

Sin embargo, aunque la capacidad de las plantillas de ácido nucleico para acelerar la formación de una variedad de análogos de ácido nucleico no natural se ha demostrado, casi todas estas reacciones mostraron previamente ser catalizadas por plantillas de ácido nucleico que se diseñan para proceder a través de estados de transición que semejan

cercanamente la estructura de la estructura de ácido nucleico natural (Figura 2), típicamente produce productos que preservan la misma estructura de seis enlaces espaciados entre unidades de nucleótido. La motivación detrás de este diseño presumiblemente fue la presunción de que el índice de mejoramiento suministrado por las plantillas de ácido nucleico depende de una alineación precisa de grupos reactivos, y la precisión de esta alineación se maximiza cuando los reactivos y productos imitan la estructura de las estructuras de ADN y ARN. La evidencia en apoyo de la hipótesis de que la síntesis de plantilla de ADN solo puede generar productos que semejan la estructura de ácido nucleico viene de la dificultad bien conocida de macrociclización en la síntesis orgánica (G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95102; R. B. Woodward et al. J Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3210-3213). El índice de mejoramiento de las reacciones de cierre de anillo intramolecular comparada con sus contrapartes intermoleculares es conocida por reducir rápidamente ya que los enlaces rotables se agregan entre grupos reactivos, tal como reactivos ligadores con un ligador de carbono 14 flexible produce fuertemente cualquier índice de aceleración (G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95-102).

En razón de que las moléculas sintéticas de interés no semejan en general estructuras de ácido nucleico, el uso de síntesis de plantilla de ADN para traducir secuencia de ADN en moléculas sintéticas pequeñas seria ampliamente útil solo si la molécula sintéticas diferentes a ácidos nucleicos y análogos de ácidos nucleicos se pudieran sintetizar en una forma de plantilla de ADN. La capacidad de síntesis de plantilla de ADN para traducir secuencias de ADN en moléculas pequeñas arbitrarias no naturales requiere por lo tanto demostrar que la síntesis de plantilla de ADN es un fenómeno mucho más general de lo que se ha descrito previamente.

Significativamente, por primera vez se ha demostrado aquí que esta síntesis de plantilla de ADN es en efecto un fenómeno general y se puede utilizar para una variedad de reacciones y condiciones para generar un rango diverso de compuestos, que incluyen específicamente para la primer vez, compuestos que no son, o no semejan, ácidos nucleicos

o análogos de estos. Más específicamente, la presente invención extiende la capacidad de amplificar y evolucionar librerías de compuestos químicos más allá de biopolímeros naturales. La capacidad de sintetizar compuestos químicos de estructuras arbitrarias permite a los investigadores escribir sus propios códigos genéticos incorporando un amplio rango de funcionalidad química dentro de una estructura novedosa y estructuras de cadena lateral, que permiten el desarrollo de catalizadores novedosos, drogas, y polímeros para mencionar unos pocos ejemplos. Por ejemplo, la capacidad de amplificar directamente y evolucionar estas moléculas mediante selección genética permite el descubrimiento de familias completamente nuevas de catalizadores artificiales que poseen actividad, biodisponibilidad solvente, o estabilidad térmica, u otras propiedades físicas (tal como fluorescencia, etiquetado por rotación, o fotolabilidad) que son difíciles o imposibles de lograr utilizando el conjunto limitado de elementos fundamentales de ácido nucleico y proteínas naturales. De forma similar, desarrollar métodos para amplificar y evolucionar directamente moléculas pequeñas sintéticas por ciclos reiterados de mutación y selección permite el aislamiento de ligando novedosos o drogas con propiedades superiores a aquellas aisladas por diseño racional tradicional o métodos de descubrimiento de droga de selección combinatoria. Adicionalmente, extender las aproximaciones descritas aquí a polímeros de importancia en ciencia material permitiría la evolución de nuevos plásticos.

En general, el método de la invención involucra 1) suministrar una o más plantillas de ácido nucleico, tal una o más plantillas de ácido nucleico opcionalmente tienen una unidad reactiva asociada a esta; y 2) poner en contacto una o más plantillas de ácido nucleico con uno o más unidades de transferencia diseñadas por tener una primer porción, un anticodón que hibridiza a una secuencia de un ácido nucleico, y se asocia a con una segunda porción, una unidad reactiva, que incluye funcionalidad específica, un elemento fundamental, reactivo, etc., para el compuesto a ser sintetizado se apreciara que en ciertas realizaciones de la invención, la unidad de transferencia comprende una porción que incorpora la capacidad de hibridización de la unidad anti-codón y la funcionalidad química de la unidad de reacción. Una vez estas unidades de transferencia han hibridizado a la plantilla de ácido nucleico en una forma de secuencia específica, la síntesis del compuesto químico puede tener lugar debido a la interacción de unidades reactivas presentes en las unidades de transferencia y/o la plantilla de ácido nucleico. Significativamente, la secuencia del ácido se puede determinar luego para decodificar la historia sintética del compuesto adherido y por lo tanto su estructura. Se apreciara que el método descrito aquí se puede utilizar para sintetizar una molécula de una vez o se puede utilizar para sintetizar cientos a millones utilizando métodos combinatorios.

Se apreciará que una variedad de compuestos químicos se pueden preparar y hacer evolucionar de acuerdo con el método de la invención. Es ciertas realizaciones de la invención, sin embargo, los métodos se utilizan para la síntesis de compuestos químicos que no son, o no se semejan a ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones de la invención, compuestos de moléculas pequeñas se pueden sintetizar al suministrar una plantilla que tiene una unidad reactiva (por ejemplo, elemento fundamental o andamio de molécula pequeña) asociado a este (unido directamente o a través de un ligador como se describe en más detalle en el ejemplo 5 aquí), y poner en contacto la plantilla simultáneamente o secuencialmente con una o más unidades de transferencia que tiene una o más unidades reactivas asociadas a esta. En ciertas otras realizaciones, los polímeros no naturales se pueden sintetizar al suministrar una plantilla y poner en contacto la plantilla simultáneamente con una o más unidades de transferencia que tiene una o más unidades reactivas asociadas a esta bajo condiciones para efectuar la reacción de las unidades reactivas adyacentes en cada una de las unidades de transferencia (ver, por ejemplo, Figura 3, y ejemplos 5 y 9, como se describe en mas detalle aquí).

Se discuten ciertas realizaciones en más detalle adelante; sin embargo, se apreciara que la presente invención no está destinada a ser limitada a aquellas realizaciones discutidas anteriormente. Por el contrario, la presente invención está destinada a abarcar estas realizaciones y equivalentes de esta.

Plantillas

Como se discutió anteriormente, una o más plantillas de ácido nucleico se utilizan en el método de la invención e hibridizan a las unidades de transferencia para dirigir la síntesis del compuesto químico. Como se apreciara por un experto en la técnica, cualquier plantilla de ácido nucleico se puede utilizar en los métodos y composiciones de la presente invención. Las plantillas que se pueden mutar y por o tanto evolucionar se pueden utilizar para guiar la síntesis de otros compuestos químicos o librerías de compuestos químicos como se describe en la presente invención. Como se describen más detalle aquí la plantilla evolucionable codifica la síntesis de un compuesto químico y se puede utilizar luego para decodificar la historia sintética del compuesto químico, para amplificar indirectamente el compuesto químico, y/o para evolucionar (es decir, diversificar, seleccionar y amplificar) el compuesto químico.

Las plantillas de ácido nucleico utilizadas en la presente invención se hacen de ADN, ARN, un hibrido de ADN y ARN, o un derivado de ADN y ARN, y puede ser sencilla o de doble hebra. La secuencia de la plantilla se utiliza en el método inventivo para codificar la síntesis de un compuesto químico, preferiblemente un compuesto que no es, o no se semeja, a un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico (por ejemplo, un polímero no natural o una molécula pequeña). En el caso de ciertos polímeros no naturales, la plantillad de ácidos nucleicos se utiliza para alinear las unidades de monómero en la secuencia ellas aparecerán en el polímero y las traerán en proximidad cercana con unidades de monómero adyacente junto con la plantilla de tal forma que ellas reaccionaran y se unirán mediante un enlace covalente. En el caso de una molécula pequeña, la plantilla se utiliza para llevar reactivos particulares dentro de la proximidad del andamio de la molécula pequeña con el fin de que ellas puedan modificar el andamio en una forma particular. En ciertas otras realizaciones, la plantilla se puede utilizar para generar polímeros no naturales mediante amplificación PCR de una librería de plantilla de ADN sintética que consiste de una región aleatoria de nucleótidos, como se describe en el ejemplo 9 aquí.

Como se apreciará por un experto en la técnica, la secuencia de la plantilla se puede diseñar en un número de formas sin ir más allá del alcance de la presente invención. Por ejemplo, la longitud del codón se debe determinar y la secuencia de codón se deben establecer. Si una longitud de codón de dos se utiliza, entonces utilizar las cuatro bases de ocurrencia natural solo 16 combinaciones posibles son disponibles para ser utilizadas en la codificación de la librería. Si la longitud del codón se incrementa a tres (el número natural usado en proteínas de codificación) el número de combinaciones posibles se incrementa a 64. otros factores a ser considerados en la determinación de la longitud del codón se desajustan, cambian de marco, complejidad de liberaría, etc. ya que la longitud del codón se incrementa hasta cierto alcance el número de desajustes se reduce; sin embargo, codones excesivamente largos hibridizarán a pesar de pares bases desajustados. En ciertas realizaciones de especial interés, la longitud del codón varía entre dos y diez bases.

Otro problema asociado con el uso de una plantilla de ácido nucleico es el cambio de cuadro. En la naturaleza, el problema de cambio de cuadro en la traducción de una proteína a partir de un mARN se evita mediante el uso de maquinaria compleja de ribosoma. Los métodos inventivos, sin embargo, no tomarán ventaja de tal maquinaria compleja. Por el contrario, el cambio de cuadro se puede remediar alargar cada codón de tal forma que la hibridización de un codón afuera el cuadro garantiza un desajuste. Por ejemplo, cada codón puede iniciar con una G, y posiciones posteriores se pueden restringir a T, C, y A (Figura 4). En otro ejemplo, cada codón puede empezar en un extremo con una G, y posiciones posteriores se pueden restringir a T, C, y A. Otra forma de evitar el cambio de cuadro es tener codones suficientemente largos de tal forma que la secuencia de codón solo se encuentra dentro de la secuencia de la plantilla (en cuadros). Secuencia espaciadoras también se pueden colocar entre los codones para evitar el cambio de cuadro.

Se apreciará que la plantilla puede variar grandemente en el número de bases. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la plantilla puede ser 10 a 10,000 bases de larga, preferiblemente entre 10 y 1,000 bases de larga. La longitud de la plantilla dependerá por supuesto de la longitud de los codones, complejidad de la librería, longitud del poliedro no natural a ser sintetizado, complejidad de la molécula pequeña a ser sintetizada, uso de secuencias de espacios, etc. la secuencia de ácido nucleico se puede preparar utilizando cualquier método conocido en la técnica para preparar secuencias de ácidos nucleicos. Estos métodos incluyen métodos in vivo e in Vitro que incluyen PCR, preparación de plásmidos, digestión de endonucleasa, síntesis de fase sólida, transcripción in Vitro, preparación de hebra, etc. En ciertas realizaciones, la plantilla de ácido nucleico se sintetiza utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

Como se discutió anteriormente, en ciertas realizaciones de la invención, el método se utiliza para sintetizar compuestos químicos que no son, o semejan, ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos. Aunque se ha demostrado que la síntesis de plantilla de ADN se puede utilizar para dirigir la síntesis de ácido nucleico y análogos de estos, no se ha demostrado previamente que el fenómeno de síntesis de plantilla de ADN es suficientemente general para extender a otros compuestos químicos complejos (por ejemplo, moléculas pequeñas, polímeros no naturales). Como se describe

en detalle aquí, se ha demostrado que la síntesis de plantilla de ADN es de hecho un fenómeno más general y que se puede utilizar una variedad de reacciones.

Así, en ciertas realizaciones de la presente invención, las plantillas ácido nucleico comprenden secuencias de bases que codifican las síntesis de un polímero no natural o molécula pequeña. El mensaje codificado en la plantilla de ácido nucleico empieza preferiblemente con un codón específico que lleva en el lugar un sitio reactivo químicamente del que la polimerización puede tener lugar, o en el caso de sintetizar una molécula pequeña el codón “inicio” puede codificar para un anti-codón asociado con un andamio de molécula pequeña o un primer reactivo. El codón de “inicio” de la presente invención es análogo al codón de “inicio”, ATG, encontrado en la Naturaleza, que codifica la metionina de aminoácido. Para dar un ejemplo para uso en la síntesis de una librería de polímero no natural, el codón de inicio puede codificar para una unidad de monómero de inicio que comprende una amina enmascarada por un grupo protector fotolábil, como se muestra adelante en el Ejemplo 5A.

En aún otras realizaciones de la invención, la plantilla de ácido nucleico en si misma se puede modificar para incluir un sitio de iniciación para síntesis de polímero (por ejemplo un nucleófilo) o un andamio de molécula pequeña. En ciertas realizaciones, la plantilla de ácido nucleico incluye una argolla de horquilla en uno de sus extremos que termina en un grupo reactivo utilizado para iniciar la polimerización de las unidades de monómero. Por ejemplo, la plantilla de ADN puede comprender una argollas de horquilla que termina en un grupo 5,-amino, que puede ser protegido o no. Puede comenzar a partir de la polimerización del grupo amino del polímero no natural. El grupo amino reactivo también se puede utilizar para ligar un andamio de molécula pequeña sobre una plantilla de ácido nucleico con el fin de sintetizar una librería de molécula pequeña.

Para terminar la síntesis del polímero no natural se debe incluir un codón de “parada” en la plantilla de ácido nucleico preferiblemente en el extremo de la secuencia codificadora. El codón de “parada” de la presente invención es análogo a los codones de “parada” (es decir, TAA, TAG, TGA) encontrado en trascripciones de mARN. En la naturaleza, estos codones conducen a la terminación de la síntesis de proteína. En ciertas realizaciones, un codón de “parada” se escoge que es compatible con el código genético artificial utilizado para codificar el polímero no natural. Por ejemplo, el codón de “parada” no debe entrar en conflicto con ningún otro de los codones utilizados para codificar la síntesis, y este debe ser del mismo formato general como los otros codones utilizados en la plantilla. El codón de “parada” puede codificar para una unidad de monómero que termina la polimerización al no suministrar un grupo reactivo para unión adicional. Por ejemplo, una unidad de monómero de parada puede contener un grupo reactivo bloqueado tal como una acetamida diferente de una mina primaria como se muestra en el Ejemplo 5A adelante. En aún otras realizaciones, la unidad de monómero de parada comprende un terminal biotinilado que suministra una forma conveniente de terminar la etapa de polimerización y purificar el polímero resultante.

Unidades de Transferencia

Como se describió anteriormente, en el método de la invención, también se suministran unidades de transferencia que comprenden un anticodón y una unidad reactiva. Se apreciará que los anticodones utilizados en la presente invención se diseñan para ser complementarios a los condones actuales dentro de la plantilla de ácido nucleico, y se deben diseñar con una plantilla de ácido nucleico y los codones utilizados en este. Por ejemplo, las secuencias utilizadas en la plantilla así como también la longitud de los codones sería necesario tomarlas en cuenta en el diseño de los anticodones. Cualquier molécula que sea complementaria con un codón utilizado en la plantilla se puede utilizar en los métodos inventivos (por ejemplo, nucleótidos o nucleótidos no naturales). En ciertas realizaciones, los codones comprenden una o más bases encontradas en la naturaleza (es decir, timidina, uracilo, guanidina, citosina, adenina). En ciertas otras realizaciones, el anticodón comprende uno o más nucleótidos encontrados normalmente en la naturaleza con una base, una azúcar, y un grupo fosfato opcional. En aún otras realizaciones, las bases son fuertes a lo largo de una estructura que no es la estructura de fosfato azúcar encontrada normalmente en la naturaleza (por ejemplo, nucleótidos no naturales).

Como se discutió anteriormente, el anticodón se asocia con un tipo particular de unidad reactiva para formar una unidad de transferencia. Se apreciará que esta unidad reactiva puede representar una entidad distinta o puede ser parte de la funcionalidad de la unidad anticodón (ver, ejemplo 9). En ciertas realizaciones, cada secuencia de anticodón se asocia con un tipo de monómero. Por ejemplo, la secuencia de anticodón ATTAG se puede asociar con un residuo de carbamato con una cadena lateral iso-butilo, y la secuencia de anticodón CATAG se puede asociar con un residuo de carbamato con una cadena lateral de fenilo. Este mapeo uno a uno de anticodón a unidades de monómero permite uno para decodificar cualquier polímero de la librería al secuenciar la plantilla de ácido nucleico utilizada en la síntesis y permite uno para sintetizar el mismo polímero o un polímero relacionado al conocer la secuencia del polímero original. Se apreciará por un experto en la técnica que al cambiar (por ejemplo mutar) la secuencia de la plantilla, unidades de monómero diferentes se llevarán en el lugar, permitiendo por lo tanto la síntesis de polímeros relacionados, que se pueden seleccionar posteriormente y evolucionar. En ciertas realizaciones preferidas, varios anticodones pueden codificar para una unidad de monómero como es el caso en la naturaleza.

En ciertas otras realizaciones de la presente invención en donde una librería de molécula pequeña se crea a diferencia de una librería de polímero, el anticodón se asocia con un reactivo utilizado para modificar el andamio de molécula

pequeña. En ciertas realizaciones, el reactivo se asocia con el anticodón a través de un ligador suficientemente largo para permitir al reactivo entrar en contacto con un andamio de molécula pequeña. El ligador debe preferiblemente ser de tal una longitud y composición para permitir las reacciones intramoleculares y minimizar las reacciones intermoleculares. Los reactivos incluyen una variedad de reactivos como se demuestra mediante el amplio rango de reacciones que se pueden utilizar en la síntesis de plantilla de ADN (ver ejemplo 2, 3 y 4 aquí) y puede ser cualquier grupo químico, catalizador(por ejemplo compuestos organometálicos), o porciones reactivas (por ejemplo, electrófilos, nuleófilos) conocidos en la técnica química.

Adicionalmente, la asociación entre el anticodón y la unidad de monómero o reactivo en la unidad de transferencia puede ser covalente o no covalente. En ciertas realizaciones de especial interés, la asociación es a través de un enlace covalente, y en ciertas realizaciones el enlace covalente es separable. El ligado se puede escindir por luz, oxidación, hidrólisis, exposición a ácidos, exposición a bases, reducción, etc. Para ejemplos de ligados utilizados en esta técnica, por favor ver Fruchtel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 17,1996, El anticodón y la unidad de monómero o reactivo también se puede asociar a través de interacciones no covalentes tales como iónicas, electrostáticas, uniones de hidrógeno, interacciones van der Waals, interacciones hidrófobas, apilamiento-pi, etc. y combinaciones de estos. Para dar un ejemplo, el anticodón se puede ligar a biotina, y la unidad de monómero ligar a estreptavidina. La propensión de la estreptavidina para unir biotina conduce a la asociación no covalente, entre el anticodón y la unidad de monómero para formar la unidad de transferencia.

Síntesis de Ciertos Compuestos de Ejemplo

Se apreciará que una variedad de compuestos y/o librerías se pueden preparar utilizando el método de la in. Como se discutió anteriormente, en ciertas realizaciones de especial interés, compuestos que no son, o no semejan, ácidos nucleicos o análogos de estos, se sintetizan de acuerdo con los métodos de la invención.

En ciertas realizaciones, los polímeros, específicamente polímeros no naturales, se preparan de acuerdo con el método de la presente invención. Los polímeros no naturales que se pueden crear utilizando el método inventivo y sistema incluyen cualquier polímero no natural. Polímeros no naturales de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, policarbamatos, poliureas, poliésteres, poliacrilato, polialquilleno (por ejemplo, polietileno, polipropileno), policarbonatos, polipéptidos con estereoquímica no natural, polipéptidos con aminoácidos no naturales, y combinaciones de estos. En ciertas realizaciones, los polímeros comprenden al menos 10 unidades de monómero. En ciertas otras realizaciones, los polímeros comprenden al menos 50 unidades de monómero. En aún otras realizaciones, los polímeros comprenden al menos 100 unidades de monómero. Los polímeros sintetizados que utilizan el sistema inventivo se pueden utilizar como catalizadores, farmacéuticos, queladores de metal, materiales, etc.

En la preparación de ciertos polímeros no naturales, las unidades de monómero adheridas a los anticodones y utilizadas en la presente invención pueden ser cualquier monómero u oligómero capaz de ser unidos para formar un polímero. Las unidades de monómero pueden ser carbamatos, aminoácidos D, aminoácidos no naturales, ureas, hidroxi ácidos, ésteres acrilatos, éteres etc. en ciertas realizaciones, las unidades de monómero tienen dos grupos reactivos utilizados para enlazar la unidad de monómero en la cadena de polímero creciente. Preferiblemente, los dos grupos reactivos no son el mismo de tal forma que la unidad de monómeros puede incorporar en le polímero en un sentido direccional, por ejemplo, en un extremo puede estar un electrófilo y en el otro extremo un nucleófilo. Los grupos reactivos pueden incluir, pero no están limitados a, ésteres, amidas, ácidos carboxílicos, grupos carbonilos activados, cloruros ácidos, aminas, grupos hidroxio, tioles, etc. En ciertas realizaciones, los grupos reactivos se enmascaran o protegen (Greene & Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition Wiley, 1999; incorporada aquí como referencia) de tal forma que la polimerización puede no tener lugar hasta un tiempo deseado cuando los grupos reactivos se desprotegen. Una vez las unidades de monómero se ensamblan junto a la plantilla de ácido nucleico, la iniciación de las secuencias de polimerización resultan en una cascada de etapas de polimerización y desprotección en donde la etapa de polimerización resulta en desprotección de un grupo reactivo a ser utilizado en la etapa de polimerización posterior (ver, figura 3).

Las unidades de monómero que van a ser polimerizadas pueden comprender dos o más unidades que dependen de la geometría junto con la plantilla de ácido nucleico. Como se apreciará por un experto en esta técnica, las unidades de monómero a se polimerizadas deben ser capaces de estirarse a lo largo de la plantilla de ácido nucleico y particularmente a través de la distancia medida por su anticodón de codificación y opcionalmente secuencia espaciadora. En ciertas realizaciones, la unidad de monómero comprende actualmente dos monómeros, por ejemplo, un dicarbamatpo, una diurea, un dipéptido, etc. En aún otras realizaciones, la unidad de monómero comprende actualmente tres o más monómeros.

Las unidades de monómero pueden contener cualquier grupo químico conocido en la técnica. Como se apreciará por un experto en esta técnica, los grupos reactivos químicos específicamente aquellos que pueden interferir con polimerización, hibridación, etc. se enmascaran utilizando grupos protectores conocidos (Greene & Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition Wiley, 1999;). En general, los grupos protectores utilizados para enmascarar estos grupos reactivos son ortogonales a aquellos en proteger los grupos utilizados en las etapas de polimerización.

En sintetizar un polímero no natural, en ciertas realizaciones se suministra una plantilla que codifica la secuencia de unidades de monómero. Las unidades de transferencia se le permiten entonces entrar en contacto con la plantilla bajo condiciones que permitan la hibridización de los anticodones a la plantilla. La polimerización de las unidades de monómero junto con la plantilla es luego permitida para que ocurra la formación del polímero no natural. El polímero sintetizado nuevamente puede luego ser rescindido a partir de anticodones y/o la plantilla. La plantilla se puede utilizar como una etiqueta para elucidar la estructura del polímero o se puede utilizar para amplificar y evolucionar el polímero no natural. Como se describirá en más detalle adelante, el presente método se puede utilizar para prepara una librería se polímeros no naturales. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, como redescribe en más detalle en el ejemplo 9 aquí, una librería de plantillas de ADN se puede utilizar para preparar polímeros no naturales. En general, el método toma ventaja del hecho de que ciertas polimerasas de ADN son capaces de afectar ciertos sustratos de trifosfato nucleótido modificados y que varios desoxiribonucelótidos y ribonucleótidos que llevan grupos modificados que no participan en la unión Watson-Crick son conocidos por estar insertados con las plantillas de ADN naturales opuestas de secuencia específica. de acuerdo con esto, el ADN de hebra sencilla que contiene nucleótidos modificados puede servir como plantilla eficiente para la incorporación catalizada de polimerasa ADN de nucleótidos naturales o modificados.

Se apreciará que los métodos inventivos también se pueden utilizar para sintetizar otras clases de compuestos químicos a pesar de polímeros no naturales. Por ejemplo, se pueden preparar moléculas pequeñas utilizando los métodos y composiciones suministradas por la presente invención. Estas moléculas pequeñas pueden ser productos naturales como, no poliméricos, y/o no oligoméricos. El interés sustancial en moléculas pequeñas se debe en parte a su uso como el ingrediente activo en muchas preparaciones farmacéuticas aunque ellas también se pueden utilizar como catalizadores, materiales, aditivos, etc.

En la síntesis de moléculas pequeñas que utilizan el método de la presente invención, también se suministra una plantilla evolucionable. La plantilla puede comprender un andamio de molécula pequeña sobre el cual la molécula pequeña se construye, o un andamio de molécula pequeña se puede agregar a la plantilla. El andamio de molécula pequeña puede ser cualquier compuesto químico son sitios para funcionalización. Por ejemplo, el andamio de molécula puede comprender un sistema de anillo (por ejemplo, el sistema de anillo esteroide ABSD encontrado en colesterol) con grupos funcionalizables de átomos que construyen los anillos. En otro ejemplo, la molécula pequeña puede ser la estructura subyacente de un agente farmacéutico tal como morfina o un antibiótico cefalosporina (ver ejemplos 5C y 5D adelante). Los sitios o grupos a ser funcionalizados en el andamio de molécula pequeña pueden ser protegidos utilizando métodos y grupos protectores conocidos en la técnica. Los grupos protectores utilizados en un andamio de molécula pequeña puede ser ortogonales a otro de tal formar que los grupos protectores se puede remover uno a la vez.

En esta realización, las unidades de transferencia comprenden un anticodón similar a aquellos descritos en la síntesis de polímero no natural; sin embargo, estos anticodones se asocian con reactivos o elementos fundamentales para ser utilizados en modificar, agregar a, o retirar del andamio de molécula pequeña. Los reactivos o elementos de construcción pueden ser electrófilos (por ejemplo acetilo, amidas, cloruros ácidos, ésteres, nitrilos, iminas, nucleófilos (por ejemplo, aminas, grupos hidroxilo, tioles), catalizadores (por ejemplo catalizadores organométalicos), cadenas laterales, etc. Ver, por ejemplo reacciones en medio acuoso y orgánico como se describe aquí en los ejemplos 2, y 4. Las unidades de transferencia se les permite entrar en contacto con la plantilla bajo condiciones de hibridización, y el reactivo adherido o elemento fundamental se le permite reaccionar con un sitio en el andamio de molécula pequeña. En ciertas realizaciones, los grupos protectores en la plantilla de molécula pequeña se remueven uno a la vez de los sitios a ser funcionalizados de tal forma que el reactivo de la unidad de transferencia reaccionará en solo la posición deseada del andamio. Como se apreciará por un experto en la técnica, el anticodón se puede asociar con el reactivo a través de una porción ligadora (ver, ejemplo 3). El ligador facilita el contacto del reactivo con el andamio de molécula pequeña y en ciertas realizaciones, dependiendo de la reacción deseada, las posiciones de ADN como un grupo saliente (estrategia de “autoescindible”) o puede enlazar grupos reactivos a la plantilla por vía de la estrategia ligadora con “sin marca” (que produce productos sin dejar atrás la funcionalidad química adicional), o una estrategia “de marca útil” en la que se deja el ligador atrás y se puede funcionalizar en etapas posteriores luego de clivaje de ligador). La condición de reacción, ligador, reactivo, y sitio a ser funcionalizado se escogen para evitar reacciones intermoleculares y reacciones intramoleculares aceleradas. También se apreciará que el método de la presente invención contempla el contacto secuencial y simultaneo de la plantilla con unidades de transferencia que dependen del compuesto particular a se sintetizado. En ciertas realizaciones de especial interés, la síntesis multietapa de compuestos químicos se suministra en el que la plantilla se pone en contacto secuencialmente con dos o más unidades retransferencia para facilitar la síntesis multietapa de compuestos químicos complejos.

Después de que los sitios en el andamio se han modificado, la molécula pequeña sintetizada nuevamente se liga as la plantilla que codificada es síntesis. Decodificar la etiqueta de plantilla permitirá elucidar la historia sintética y por lo tanto la estructura de la molécula pequeña. La plantilla se puede amplificar con el fin de crear más de la molécula pequeña deseada y/o la plantilla se puede evolucionar para crear moléculas pequeñas relacionadas. La molécula pequeña también se puede escindir a partir de la plantilla para purificación o selección.

Como se apreciará por un experto en esta técnica, una pluralidad de plantillas se puede utilizar para codificar la síntesis de una librería combinatoria de molécula pequeñas que utilizan el método descrito anteriormente. Esto permitiría la

amplificación y evolución de una librería de molécula pequeña, una prueba que no se ha cumplido antes de la presente invención.

Método para sintetizar Librerías de Compuestos

En el método inventivo, una plantilla de ácido nucleico, como se describió anteriormente, se suministra apara dirigir al síntesis de un polímero no natural, una molécula pequeña, o cualquier otro tipo de molécula de interés. En general, una pluralidad de plantillas de ácido nucleico se suministra en donde el número de secuencias diferentes suministra rangos de 2 a 1015. En una realización de la presente invención una pluralidad de plantillas de ácido nucleico se suministran, preferiblemente al menos 100 diferentes plantillas de ácido nucleico, más preferiblemente al menos 10000 plantillas diferentes de ácido nucleico, y más preferiblemente al menos 1.000.000 de plantillas de ácido nucleico diferentes. Cada plantilla suministrada comprende una secuencia de ácido nucleico única utilizada para codificar la síntesis de un polímero no natural particular o molécula pequeña. Como se describió anteriormente, la plantilla también puede tener funcionalidad tal como una amina primaria de la que se inicia polimerización o un andamio de molécula pequeña. En ciertas moléculas, las plantillas de ácido nucleico se suministran en un “recipiente” en ciertas otras realizaciones, las plantillas suministran en medio acuoso y se desarrollan reacciones posteriores en medio acuoso.

Se agregan a la plantilla unidades de transferencia con anticodones, como se describió anteriormente, asociadas con una unidad de monómero, como se describió anteriormente. En ciertas realizaciones, una pluralidad de unidades de transferencia se suministra de tal forma que hay anticodón para cada codón representado en la plantilla. En una realización preferida, ciertos anticodones se utilizan como sitios de inicio y parada. En general, un número suficientemente grande de unidades de transferencia se suministra de tal forma que todos los sitios de codón correspondientes en la plantilla se llenan después de hibridización.

A los anticodones de las unidades de transferencia se les permite hibridizar a la plantilla de ácido nucleico llevando por lo tanto las unidades de monómero juntas en una secuencia específica como se determina por la plantilla. En la situación en donde una librería de molécula pequeña está siendo sintetizada, los reactivos se llevan en proximidad a un andamio de molécula pequeña. Las condiciones de hibridización, como se apreciará por aquellos expertos en la técnica, podrían permitir preferiblemente para solo ajuste perfecto entre el codón y su anticodón. Los desajustes de pares bases sencillos se deben evitar. Las condiciones de hibridización pueden incluir, pero no están limitadas a temperatura, concentración de sal, pH, concentración de plantilla, concentración de anticodones, y solvente. Las condiciones de hibridización utilizadas en sintetizar la librería pueden depender de la longitud del codón/anticodón, la similitud entre los codones presentes en las plantillas, el contenido pares base G/C versus A/P, etc. (para información adicional con respecto a condiciones de hibridización, ver por favor, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch, y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames &

S. J. Higgins eds.1984); el tratado, Methods in Enzynaology (Academic Press, Inc., N.Y.) ; Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Jolm Wiley & Sons, Inc., New York, 1999);).

Después que ha ocurrido la hibridización de los anticodones a los codones en la plantilla, las unidades de monómero se polimerizan luego en el caso de síntesis de polímeros no naturales. La polimerización de las unidades de monómero pueden ocurrir espontáneamente o pueden necesitar ser iniciadas, por ejemplo, mediante la desprotección de un grupo reactivo tal como un nucleófilo o al suministrar luz de una cierta longitud de onda. En ciertas otras realizaciones, los polímeros se pueden cristalizar mediante polimerización de ADN capaz de efectuar polimerización de nucleótidos no naturales (ver, ejemplo 9). La polimerización preferiblemente ocurre en una dirección junto con la plantilla con unidades de monómero adyacentes que se llegan a unir a través de un enlace covalente. La terminación de la etapa de polimerización ocurre por la adiciones de una unidad de monómero que no es capaz de ser agregada. En el caso de las síntesis de moléculas pequeñas, se le permite a los reactivos reaccionar con el andamio de molécula pequeña. El reactivo puede reaccionar espontáneamente, o grupos protectores en el reactivo y/o el andamio de molécula pequeña pueden necesitar ser removidos. Otros reactivos (por ejemplo ácido, base, catalizador, gas de hidrógeno, etc.) también se pueden necesitar para efectuar la reacción (ver, ejemplos 5A-5E)

Después que se han creado los polímeros no naturales o moléculas pequeñas con la ayuda de la plantilla de ácido nucleico, ellas se pueden escindir a partir de plantillas de ácido nucleico y/o anticodones utilizado para sintetizarlos. En ciertas realizaciones, los polímeros o moléculas pequeñas se ensayan antes de ser completamente desechadas de las plantillas de ácido nucleico que los codifica. Una vez se selecciona el polímero o molécula pequeña la secuencia de plantilla o su complemento se puede determinar para elucidar la estructura del polímero adherido o molécula pequeña. Esta secuencia puede ser entonces amplificada y/o evolucionada para crear nuevas librerías de polímeros relacionados

o moléculas pequeñas que en cambio se puedan seleccionar y evolucionar.

Usos

Los métodos y composiciones de la presente invención representan una nueva forma para generar moléculas con propiedades deseadas. Esta aproximación lleva los métodos genéticos extremadamente poderosos, que los biólogos moleculares han tomado ventaja durante décadas, con la flexibilidad y poder de la química orgánica. La capacidad de prepara, amplificar y evolucionar polímeros no naturales mediante selección genética puede conducir a nuevas clases

de catalizadores que poseen actividad, biodisponibilidad, estabilidad, fluorescencia, fotolabilidad, u otras propiedades que son difíciles o imposibles de alcanzar utilizando el limitado conjunto de elementos fundamentales encontrados en las proteínas y ácidos nucleicos. De forma similar, desarrollar nuevos sistemas para preparar, amplificar y evolucionar moléculas pequeñas por ciclos reiterados de mutaciones y selección puede conducir al aislamiento de ligandos novedosos o drogas con propiedades superiores a aquellas aisladas por métodos de descubrimiento de drogas tradicionales más lentos (ver, Ejemplo 7)

Desarrollar la síntesis de librerías orgánicas en la escala de biología molecular es un aproximación diferente fundamentalmente de la síntesis de librería de fase sólida tradicional y lleva ventajas significativas. Una librería creada utilizando los métodos inventivos se puede seleccionar utilizando cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo ensayo de unión, ensayo catalítico). Por ejemplo, la selección basada en la unión a una molécula objetivo se puede llevar a cabo en la librería completa al pasar librería sobre una resina ligada covalentemente al objetivo. Estos biopolímeros que tienen afinidad para el objetivo unido a resina se pueden eluir con moléculas objetivo libres, y los compuestos seleccionados se pueden amplificar utilizando los métodos descritos anteriormente. Rounds posteriores de selección y amplificación pueden resultar en un grupo de compuestos enriquecidos con secuencias que unen la molécula objetivo. En ciertas realizaciones, la molécula objetivo imita un estado de transición de una reacción química, y los compuestos químicos seleccionados pueden servir como un catalizador para la reacción química. Debido a que la información que codifica la síntesis de cada molécula se une covalentemente a la molécula en un extremo, la librería completa se puede seleccionar de una vez y aún cada molécula se selecciona sobre una base individual.

Tal librería también se puede evolucionar al introducir mutaciones en el nivel de ADN que utiliza PCR propenso a error (Cadwell et al. PCR Methods Appl. 2: 28, 1992) o alo someter el adn a recombinación homóloga in vitro (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747,1994; Stemmer Nature 370: 389,1994; cada uno de los cuales se incorpora. El ciclo repetido de selección, amplificación, y mutación puede producir biopolímeros con afinidad de unión grandemente incrementada para moléculas objetivo o con propiedades catalíticas significativamente mejoradas. El grupo final de biopolímeros evolucionados que tienen las propiedades deseadas se pueden secuenciar al secuenciar el ácido nucleico escindido de los polímeros. Los polímeros de ácido nucleico libres se pueden purificar utilizando cualquier método conocido en la técnica que incluye HPLC, cromatografía de columna, FLPC, etc., y sus propiedades de unión i o propiedades catalíticas se pueden verificar en la ausencia de ácido nucleico unido covalentemente.

La polimerización de unidades de monómero generadas sintéticamente independientes de maquinaria ribosomal permite la incorporación de una enorme variedad de cadenas laterales con propiedades químicas, biofísicas, o biológicas novedosas. Terminar cada biopolímero con una cadena lateral de biotina, por ejemplo, permite la purificación fácil de solo los biopolímeros de longitud completa que se han traducido completamente al pasar la librería a través de una resina ligada por avidina. Se pueden seleccionar biopolímeros terminados en biotina para la catálisis actual de reacciones de ruptura de enlace al pasar estos biopolímeros sobre la resina ligada a través del sustrato a avidina (Figura 5). Aquellos biopolímeros que escinden el sustrato de catálisis autoeluirán a partir de una columna cargada con esta resina. De forma similar los biopolímeros terminados en biotina se pueden seleccionar para la catálisis de reacciones formadoras de enlace (Figura 5). Se liga un sustrato a la resina y el segundo sustrato se liga a avidina. Los biopolímeros que catalizan la formación de enlace entre los sustratos se seleccionan por su capacidad de ligar los sustratos juntos, resultando en la unión del biopolímero a la resina. Cadenas laterales novedosas también se pueden utilizar para introducir cofactores en los biopolímeros. Un cadena lateral que contiene un quemador de metal, por ejemplo, puede suministrar biopolímeros con propiedades catalíticas mediadas por metal, mientras que una cadena lateral que contiene flavina puede equipar biopolímeros con el potencial para catalizar reacciones rédox.

De esta forma los biopolímeros no naturales se pueden aislar ya que sirven como receptores artificiales para unir selectivamente moléculas o que catalizan reacciones químicas. La caracterización de estas moléculas suministraría penetración importante en la capacidad de los policarbamatos, poliureas, poliésteres, policarbonatos, polipéptidos con cadena lateral no natural y estereoquímicas, u otros polímeros no naturales para formar estructuras secundarias o terciarias con propiedades de unión o catalíticas.

Kits

También se suministran kits y composiciones para uso en los métodos inventivos. Los kits pueden contener cualquier elemento o composición útil en la práctica de la presente invención. Los kits pueden incluir, pero no se limitan a, plantillas, anti-codones, unidades de transferencia, unidades de monómero, elementos fundamentales. Reactivos, andamios de moléculas pequeñas, amortiguadores, solvente, enzimas (por ejemplo, polimerasa estable al calor, transcriptasa reversa, ligasa, endonucleasa de restricción, exonucleasa, fragmento Klenow, polimerasa, fosfatasa alquilina, quinasa polinucleótida), ligadores, grupos protectores, polinucleótidos, nucleósidos, nucleótidos, sales, ácidos, bases, soportes sólidos, o cualquier combinación de estos.

Como se apreciará por un experto en esta técnica, un kit para preparar polímeros no naturales podría contener ítems necesarios para preparar polímeros no naturales que utilizan los métodos inventivos, descritos aquí. Tal kit puede incluir

plantillas, anti-codones, unidades de transferencia, unidades de monómeros, o combinaciones de estos. Un kit para sintetizar moléculas pequeñas puede incluir plantillas, anti-codones, unidades de transferencia, elementos fundamentales, andamios de moléculas pequeñas, o combinaciones de estos.

El kit también se puede equipar con ítems necesarios para amplificar y/o evolucionar una plantilla de polinucleótido tal como una polimerasa estable al calor para PCR, nucleótidos, amortiguador, e iniciadores. El kit también puede incluir elementos utilizados comúnmente en el desarrollo de mezcla de ADN tal como polinucleótidos, ligasa, y nucleótidos.

En adición a las unidades de transferencia y plantillas descritas aquí, la presente invención también incluye composiciones que comprenden moléculas pequeñas complejas, andamios, o polímeros no naturales preparados por uno cualquiera o más de los métodos de la invención como se describe aquí.

EQUIVALENTES

Los ejemplos representativos que siguen se pretende que ayuden a ilustrar la invención, y no están destinados a, ni se deben constituir como, limitantes del alcance de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención y muchas realizaciones adicionales de esta, en adición a aquellas mostradas y descritas aquí, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de los contenidos completos de este documento, que incluyen los ejemplos que siguen y las referencias a la literatura científica y de patentes citada aquí.

Los siguientes ejemplos contienen información adicional importante, de ejemplo y guía que se pueden adaptar para la práctica de esta invención en sus varias realizaciones y los equivalentes de estas.

EJEMPLIFICACIÓN

Ejemplo 1: La Generalidad de Síntesis de Plantilla de ADN: Claramente, el implementar la aproximación de evolución de molécula pequeña descrita anteriormente requiere estabilizar la síntesis de plantilla de ADN. La presente invención, para la primera vez, establece la generalidad de esta aproximación y permite así la síntesis de una variedad de compuestos químicos que utilizan la síntesis de plantilla de ADN. Como se muestra en la Figura 6a, la capacidad de dos arquitecturas de ADN para soportar la síntesis de plantilla de ADN de fase-solución se establece. Las plantillas de horquilla (H) y extremo de hélice (C) que llevan grupos maleimidas electrofílicos reaccionan eficientemente con un equivalente de reactivo tiol ligado a un oligonucleótido de ADN complementario para producir el producto tioéter en minutos a 25ºC. Los índices de reacción de plantilla de ADN (Kapp = ~105 M-1s-1) es similar a las arquitecturas H y E a pesar de las diferencias significativas en la orientación relativa a sus grupos reactivos. En contraste, no se observa producto cuando se utiliza reactivos que contienen secuencia desparejas, o cuando utilizan plantillas pre-apagadas con exceso β-mercaptoetanol (Figura 6a). ambas plantillas soportan por lo tanto adición de plantilla de ADN de secuenciaespecífica de un tiol a una maleimida aunque las estructuras de los productos resultantes difieren marcadamente de la estructura de ADN natural. Se observan poco o ningunos productos de reacción intramolecular sin plantilla bajo las condiciones de reacción (pH 7.5, 25°C, 250 mM NaCl, 60 nM plantilla y reactivo).

Adicionalmente, las reacciones de plantilla de ADN de secuencia-específica atraviesan una variedad de tipos de reacción (SN2 sustituciones, adiciones a sistemas carbonilo a,β-no saturados, y adiciones a vinil sulfonas), nucleófilos (tioles y aminas), y estructuras reactivas todas proceden en buenos rendimientos con excelentes selectividad de secuencia (Figura 6b). Las masas de producto esperado se verifican mediante espectrometría de masa. En cada caso, reactivos parejos pero no desparejos usan producto eficientemente a pesar de variaciones considerables en su geometría de estado de transición, impedimento estérico y flexibilidad conformacional. Colectivamente estos hallazgos indican que la síntesis de plantilla de ADN es un fenómeno general capaz de soportar un rango de tipos de reacción, y no se limita a la creación de estructuras que semejan estructuras de ácido nucleico como se describió previamente.

Ya que la discriminación de secuencia es importante para la traducción de ADN en estructuras sintéticas, el índice de reacción o reactivo parejo comparado con aquel re un reactivo que lleva una base despareja sencilla cerca del centro de su oligonucleótido base 10 se mide. A 25ºC, el índice inicial de reacción o reactivos tiol parejos con plantillas H ligadas con yodoacetamida es 200 veces más rápido que aquel de los reactivos que llevan un desparejo único(kapp = 2.4 x 104

M-1

s-1 versus 1. 1 x 102 M-1s-1, Fig 7). Adicionalmente, pequeñas cantidades de productos de la hibridación de reactivos desparejos se puede eliminar al elevar la temperatura de reacción más allá del Tm de los reactivos desparejos (Figura 7). La reducción en el índice de formación de producto como temperatura se eleva, adicionalmente indica que la formación de producto procede por un mecanismo de plantilla de ADN diferente de un mecanismo intermolecular simple.

En adición a la reacción de especificidad de secuencia y generalidad, la síntesis de la plantilla de ADN también demuestra independencia de distancia destacada. Ambas plantilla H y E ligadas a grupos maleimida o a-yodoacetamida promueven la reacción de secuencia-específica con reactivos tiol parejos, pero no desparejos, hibridizados en cualquiern parte en las plantillas así examinadas (hasta 30 bases lejos del grupo reactivo en la plantilla). Los reactivos hibridizan una base lejos de la reacción con índices similares como aquellas bases hibridizadas 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, 20,

o 30 (Figura 8). En todos los casos, los índices de reacción de plantilla son varios cientos de veces mayores que en la

proporción de reacción sin plantilla (despareja) (kapp = 104-105M-1s-1 versus. 5 x 101 M-1s-1). En distancias participantes de 30 bases, se forman productos eficientemente presumiblemente a través de la transición de estados que semejan 200 miembros de anillos. Estos hallazgos contrastan de forma brillante con la dificultad bien conocida de macrociclización (ver, por ejemplo, G. Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95-102, R. B. Woodward et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3210-3213) en síntesis orgánica.

Para determinar la base de la distancia de independencia de la síntesis de plantilla de ADN, una serie de plantillas E modificadas se sintetiza primero en la que las bases que intervienen se reemplazan por una serie de análogos ADN diseñados para evaluar la contribución posible de (i) interacciones interbase, (ii) preferencias conformacionales de la estructura de ADN, (iii) la estructura de fosfato cargada, y (iv) estructura de hidrofilicidad. Las plantillas en que las bases que intervienen se reemplaza con cualquiera de los análogos en la Figura 9 tiene poco efecto sobre los índices de formación de producto. Estos hallazgos indican que los elementos estructurales de la estructura específica para ADN no son responsables para la independencia de la distancia observada de la síntesis de plantilla de ADN. Sin embargo, la adición de un oligonucleótido de ADN base 10 complementario “grapa” a la región de intervención de hebra sencilla reduce significativamente la formación de producto (Figura 9) sugiriendo que la flexibilidad de esta región es critica para la síntesis de plantilla de ADN eficiente.

Los índices de reacción independientes de la distancia se pueden explicar si los eventos que forman enlace en un formato de plantilla de ADN se aceleran suficientemente con relación a sus contrapartes sin plantilla de tal forma que la hibridización de ADN, diferente a la formación de enlace, es determinante de proporción. Si la hibridización de ADN es al menos limitante de índice parcial, entonces el índice de formación de producto se debe reducir ya que la concentración de reactivos se reduce debido a la hibridización, probablemente la formación de enlace de plantilla, es un proceso bimolecular. la reducción de la concentración de reactivos en el caso de la plantilla E con uno o diez bases que intervienen entre los grupos reactivo resulta en una reducción marcada en el índice de reacción observado (Figura 10). Esta observación sugiere que los efectos de proximidad en la síntesis de plantilla de ADN puede mejorar los índices de formación de enlace al punto que la hibridación de ADN se convierte en determinante de proporción.

Estos hallazgos dan la posibilidad de utilizar la síntesis de plantilla de ADN para traducir en una librería pot de ADN en librerías de solución-fase de moléculas sintéticas adecuadas para amplificación PCR y selección. La capacidad de la síntesis de ADN de plantillas para soportar una variedad de geometrías de estado de transición sugiere su potencial en dirigir un rango de reacciones sintéticas compatibles con aguas poderosas (ver, Li, C. J. Organic Reactions in Aqueous Media, Wiley and Sons, New York: 1997). La especificad de la secuencia descrita anteriormente sugiere que mezclas de reactivos pueden ser capaces de reaccionar predeciblemente con mezclas complementarias de plantilla. Finalmente, la independencia de la distancia observada sugiere que regiones diferentes de “codones” de ADN se pueden utilizar para codificar diferentes grupos en el mismo andamio sintético sin deteriorar proporciones de reacción. Como una demostración de esta aproximación, una librería de 1025 plantillas ligadas a maleimida se sintetiza, cada una con una secuencia de ADN diferente en una región que codifica 8 bases (Figura 11). Una de estas secuencias, 5'-TGACGGGT3', se escoge arbitrariamente para codificar la unión de un grupo biotina a la plantilla. Una librería de reactivos tiol ligada a 1025 oligonucleótidos diferentes también se genera. El reactivo ligado 3'-ACTGCCCA-5' contiene un grupo biotina, mientras que los otros 1024 reactivos no contienen biotina. Las proporciones equimolares de todas las 1025 plantillas y 1025 reactivos se mezclan en un pot durante 10 min a 25ºC y los productos resultantes se seleccionan in Vitro para unir a estreptavidina. Moléculas que sobreviven la selección se amplifican por PCR y se analizan por digestión de restricción y secuenciamiento de ADN.

La digestión con la endonucleasa de restricción Tsp451, que escinde el GTGAC y por lo tanto corta la plantilla que codifica biotina pero ninguna de las otras plantillas, revela una proporción 1: 1 de biotina que codifica a plantillas que codifican no biotina luego de selección (Figura 12). Esto representa un enriquecimiento 1000 veces comparado con la librería no seleccionada. El secuenciamiento del ADN del grupo amplificado PCR antes y después de selección sugiere un grado similar de enriquecimiento e indica que la plantilla que codifica biotina es el mayor producto de después de selección y amplificación (Figura 12) . la capacidad de síntesis de la plantilla de ADN para soportar la reacción de secuencia-específica simultánea de 1025 reactivos, cada uno de los cuales se enfrenta una proporción 1024: 1 de plantillas de ningún compañero a plantillas compañero, demuestra su potencial como un método para crear librerías sintéticas en un recipiente. La anterior traducción prueba de principio, selección y amplificación de un miembro de librerías sintético tienen un propiedad específica (afinidad de avidina en este ejemplo) dirige varios requerimientos clave para la evolución de librerías de moléculas pequeñas no naturales hacia las propiedades deseadas.

Tomados juntos, esos resultados sugieren que la síntesis de plantillas de ADN es un fenómeno sorprendentemente general capaz de dirigir a diferencia de codificar simplemente, un rango de reacciones químicas para formar productos no relacionados en estructura a estructuras de ácido nucleico. Para varias reacciones examinadas, el formato de plantilla de ADN acelera la proporción de formación de unión más allá de la proporción de una hibridización de oligonucleótido de ADN base 10 a su complemento, resultando en independencia de distancia sorprendente. La naturaleza facil de las reacciones de plantilla de ADN de larga disntacnia también pueden elevar en parte la tendencia del agua a contraer el volumen de reactivos no polares (ver, C.-J. Li et al. Organic Reactions in Aqueous Media, Wiley and Sons: New York, 1997) y de posible compactación del ADN de hebra sencilla que interviene entre los productos de

reacción. Estos hallazgos pueden tener implicaciones para evolucion prebiótica y para entender los mecanismos de ácidos nucleicos catalíticos con sustratos típicamente localizados para una hebra de ARN o ADN.

Métodos:

Síntesis de ADN. Se sintetizan oligonucleótidos de ADN en un sintetizador de ADN PerSeptive Biosystems Expedite 8909 que utiliza protocolos estándar y purifica por HPLC de fase reversa. Los oligonucleótidos se cuantifican espectrofotométricamente y mediante desnaturalización por electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) seguido por teñido con bromuro de etidio o Verde SYBR (sondas moleculares) y cuantificación utilizando un densitometro Stratagene Eagle Eye II. Las fosforamiditas permiten la síntesis del 5'-NH2-dT, 5'tetraclorofluoresceina, espaciador de estructura abásica, espaciador de estructura C3, espaciador de polietilenglicol 9-unido, espaciador de hidrocarburos saturados 12unido y grupos biotina 5’ se compran de Glen Research. Se sintetizan reactivos de oligonucleótido ligados a tiol en disulfuro C3 controlado en vidrio poroso (Glen Research).

Funcionalización de plantilla. Las plantillas que llevan grupos 5'-NH2-dT se transforman en una variedad de grupos electrofílicos funcionales mediante reacción con el éster electrofílo-NHS apropiado (Pierce). Se desarrollan reacciones en 200 mM de fosfato de sodio pH 7.2 con 2 mg/mL de ester electrofilo-NHS, 10% DMSO y hasta 100 100 μg de plantilla 5’amino a 25ºC durante 1h. se purifican los productos deseados mediante HPLC de fase reversa y se caracteriza por electroforesis de gel y espectrometría de masa MLDI.

Reacciones de síntesis de plantilla de ADN. Se inician reacciones al mezclar cantidades equimolar de reactivos y plantillas en amortiguador que contienen 50 mM de MOPS pH 7.5 y 250 mM NaCl en la temperatura deseada (25ºC a menos que se establezca otra cosa). Las concentraciones de los reactivos y plantillas fueron de 60 nM a menos que se indique otra cosa. En varios puntos de tiempo, se remueven alícuotas, se apagan con exceso de β- mercaptoetanol, y se analizan por desnaturalización PAGE. Los productos de reacción se cuantifican por densitometría utilizando su fluorescencia intrínseca o al teñir seguido por densitometría. Productos representativos también se verifican por espectrometría de masa MALDI.

Selección in Vitro para unión de avidina. Los productos de la reacción de traducción de librerías se aíslan por precipitación de etanol y se disuelven en amortiguador de unión (10 mM Tris pH 8,1 M NaCl, 10 mM EDTA). Los productos se incuban con 30 μg de glóbulos magnéticos ligados con estreptavidina (Roche Biosciences) durante 10 min a temperatura ambiente en 100 μL de volumen total. Los glóbulos se lavan 16 veces con amortiguador de unión y se eluyen por tratamiento con 1μmol libre de biotina en 100 uL de amortiguador de unión a 70ºC durante 10 minutos. Klas moléculas eluídas se aíslan por precipitación desde etanol y se amplifican por protocolos PCR estándar (2 mM MgCl2, hibridización a 55 ºC, 20 ciclos) utilizando los iniciadores 5'-TGGTGCGGAGCCGCCG y 5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCCCGGCTCC TCGGCTCGG. La secuencia de ADN automatizado utiliza el iniciador 5'- CCACTGTCCGTGGCGCGACCC.

Secuencia de ADN. Secuencia no suministradas en las Figuras con como sigue: reactivo ajustado en la Figura 6b reacciones SIAB y SBAP: 5'-CCCGAGTCGAAGTCGTACC-SH; reactivo desajustado en la Figura 6b reacciones SIAB y SBAP: 5'-GGGCTCAGCTTCCCCATAA-SH; reactivos desajustados para otras reacciones en las Figuras 6b, 6c, 6d, y 8a; 5'-FAAATCTTCCC- SH (F= tetraclorofluoresceína); los reactivos en las Figuras 6c y 6 contienen un desajuste: 5'-FAATTCTTACC-SH plantillas E en las Figuras 6a, 6b reacciones SMCC, GMBS, BMPS, y SVSB, y 8a: 5'- (NH2dT)-CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTTCGACTCG AGG; plantilla H en la Figura 6b reacciones SIAB, SBAP, y SIA: 5'- (NH2dT)- CGCGAGCGTACG CTCGCG ATGGTACGAATTC; oligonucleótido en la Figura 8b: 5'-ATTCGTACCA.

Ejemplo 2: Reacciones de Ejemplo para Uso en Síntesis de Plantilla de ADN:

Como se discutió anteriormente, se examina la generalidad de la química sintetiza de plantilla de ADN (ver, Liu et al. J Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961). Específicamente, la capacidad de la síntesis de plantilla de ADN para dirigir una recolección de modesta de reacciones químicas sin requerir la alineación precisa de grupos reactivos en conformaciones similares a ADN se demuestra. De hecho, la independencia de la distancia y fidelidad de secuencia de la síntesis de plantilla de ADN permite la traducción en un recipiente simultanea de una librería modelo de más de 1000 plantillas dentro de los productos tioéter correspondientes, uno de los cuales se enriquece mediante selección in Vitro para unir a la proteína de estreptavidina y amplificada por PCR.

Como se describe en detalle aquí, la generalidad de la síntesis de plantilla de ADN se ha expandido adicionalmente y se ha demostrado que una variedad de reacciones químicas se pueden utilizar para la construcción de moléculas pequeñas y en particular, para la primera vez, acoplamientos organometálicos de plantilla de ADN y enlaces carbonocarbono que forman reacciones diferentes a fotodimerización de pirimidina. Esas reacciones representan claramente una etapa importante hacia la evolución in vitro de moléculas sintéticas no naturales al permitir la construcción de plantilla de ADN de un conjunto mucho mas diverso de estructuras que se han logrado previamente.

La capacidad de la síntesis de plantilla de ADN para dirigir reacciones que requieren un activador no ligado con ADN, catalizador u otro reactivo en adición a los reactivos principales también se ha demostrado aquí. Para probar la capacidad de la síntesis de plantilla de ADN para mediar tales reacciones sin requerir imitación estructural de la estructura de plantilla de ADN, aminaciones reductivas de plantilla de ADN entre una plantilla ligada con amina (1) y bensaldehido- o reactivos ligados con glioxal (3) con concentraciones milimolares de NABH3CN a temperatura ambiente en una solución acuosa se pueden desarrollar. Significativamente, los productos formados eficientemente cuando las plantillas y secuencias de reactivos se complementan, mientras que las reacciones de control en las cuales las secuencias de reactivo no complementan aquella de la plantilla, o en la cual el NABH3CN se omite, no produce productos significativos (ver Figuras 13 y 14). Aunque afinaciones reductivas de plantilla de ADN para generar productos imitan cercanamente la estructura del ADN de doble hebra se han reportado previamente (ver, por ejemplo, X. Li et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 746 y Y. Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19), los anteriores resultados demuestran la aminación reductiva para generar estructuras no relacionadas con la estructura de fosforibosa para que tenga lugar eficientemente y secuencia-específica. Con relación a la Figura 15, las formulaciones de enlace de plantilla de ADN entre plantillas de ligadas a amina 4 y 5 reactivos ligados a carboxilato 6-9 mediados por 1-(3-dimetilaminopropil)-3etilcarbodiimida (EDC) y N-hydroxylsulfosuccinimida (sulfo-NHS) para generar productos amida en buenos rendimientos en pH 6.0, 25ºC (Figura 15). La formación de producto es secuencia-específica, dependiente de la presencia de EDC, y sorprendentemente insensible al lastre esterico de la amina o carboxilato. La formación de amina de plantilla de ADN eficiente también se mide por el activador estable al agua cloruro 4-(4, 6-dimetoxi-1, 3,5-trizin-2-yl)-4-metilmorfolino (DMT-MM) en cambio de EDC y sulfo-NHS (Figuras 14 y 15). La eficiencia y generalidad de la formulación de enlace amida de plantilla de ADN bajo estas condiciones juntas con un gran número de aminas quirales disponibles comercialmente y ácidos carboxílicos, hace esa reacción un candidato atractivo en la síntesis de plantilla de ADN futura de estructuralmente librerías de moléculas pequeñas diversas.

Se apreciará que las reacciones que forman enlaces carbono-carbono también son importantes en la síntesis biológica y química y así varias de tales reacciones se utilizan en el formato de plantilla de ADN. La reacción de reactivo ligado con nitroalcano (10) con plantilla de ligado-aldehído (11) (reacción nitro aldol o reacción Henry) y la adición de conjugado de diez a plantilla ligada a maleimida (12) (adición nitro-Michael) procede efectivamente y con alta especificidad de secuencia en pH 7.5-8.5, 25ºC (Figuras 13 y 14). Adicionalmente, la reacción Wittig de plantilla de especifica de secuencia entre el reactivo de fosforo estabilizado 13 y las plantillas ligadas aldehído 14 o 11 dados los productos de olefina correspondientes en rendimientos excelentes en pH 6.0-8.0, 25ºC (Figuras 13 y 14). De forma similar, la plantilla de ADN cicloadición 1,3-dipolar entre los reactivos ligados a nitron 15 y 16 y plantillas ligadas a olefina 12,17 o 18 también producen específicamente secuencias de productos en pH 7.5, 25ºC (Figuras 13 y 14).

En adición a las reacciones descritas anteriormente, las reacciones de acoplamiento organometalico también se pueden utilizar en la presente invención. Por ejemplo, las reacciones Heck de plantilla de ADN se desarrollan en la presencia de precatalizadores de Pd solubles en agua. En la presencia de 170 mM Na2PdCl4, el reactivo ligado a yoduro 19 y una variedad de plantillas ligadas a olefina que incluyen maleimida 12 acrlamida 17, vinil sulfona 18, o cinamamida 20 producen producto de acoplamiento Heck en rendimientos modestos en pH 5.0, 25ºC (Figuras 13 y 14). Para acoplamientos con olefinas 17, 18, y 20, agregar dos equivalentes de P (p-S03C6H4)3 por equivalente de Pd antes a la plantilla y reactivo adicional incrementa típicamente los rendimientos generales dos veces. Las reacciones de control que contienen desajustes de secuencia o que les falta precatalizador Pd no tienen rendimiento de producto. A nuestro conocimiento, la anterior adición de nitro aldol de plantilla de ADN, adición nitro Michael, olefinación Wittig, cicloadición dipolar, y acoplamiento Heck representan las primeras reacciones organometálicas de plantilla de ácido nucleico reportadas y reacciones formadoras de enlace carbono-carbono diferentes de fotodimeración de pirimidina.

Se descubrió previamente que las mismas reacciones de plantilla de ADN demuestran independencia de distancia, la capacidad para formar productos en una proporción independiente del número de bases intervinientes entre reactivos de hibridización. Se ha hecho hipótesis (Figura 16a) que la distancia de independencia se eleva cuando la proporción de formación de enlace en la reacción de plantilla de ADN es mayor que la proporción de hibridización de reactivo-plantilla. Aunque solo un subconjunto de químicas cae dentro de esta categoría, cualquier reacción de plantilla de ADN que produce rendimiento de productos comparables cuando el reactivo se hibridiza en varias distancias del extremo reactivo de la plantilla es de especial interés debido a que esta se puede codificar en una variedad de posiciones de plantilla. Para evaluar la capacidad que tiene las reacciones ADN de plantilla para desarrolladas anteriormente para tener lugar eficientemente cuando los reactivos se separan por distancias relevantes a la codificación de librería, los productos de aminacion reproductiva reductiva, formación de amida, adición de nitro-aldol, adición nitro-Michael, olefinación Wittig, cicloadición dipolar, y acoplamiento Heck cuando las bases son cero o diez de grupos reactivos de hibridizacion separados (Figura 16a, N=0 versus N=10) se comparan. Entre las reacciones descritas anteriormente o en trabajos previos, la formación de enlace amida, adición nitro-aldol, olefinación Wittig, el acoplamiento Heck, la adición de conjugado de tioles a maleimidas y la reacción SN2 entre tioles y amidas α-yodo demuestran la formación de producto comparable cuando los grupos reactivos se separan por cero a diez bases (Figura 16b). Estos hallazgos indican que estas reacciones se pueden codificar por nucleótidos que son distantes del extremo reactivo de la plantilla sin dañar significativamente la formación de producto.

En adición a la reacción SN2 de plantilla de ADN, la adición de conjugado, adición de sulfona vinilo formación de enlace amida, aminación reductiva, nitro-aldol (reacción Henry), nitro Michael, olefinación Wittig, cicloadición 1,3-dipolar y

reacción de acoplamiento Heck descritas directa y anteriormente, una variedad de reactivos adicionales también se puede utilizar en el método de la presente invención. Por ejemplo, como se describe en la Figura 17, reacciones sintéticas de plantilla de ADN acuosas poderosas incluyen, pero no están limitadas a, adición de aldol catalizadasácidos de Lewis, reacción de Mannich, reacciones de anulación Robinson, adiciones de indio alilo, zinc y estaño a cetonas y aldehídos, sustitución alílica asistida con Pd, cicloadiciones de Diels-Alder y reacciones hetero Diels-Alder se puede utilizar eficientemente en solvente acuoso y son reacciones de construcción de complejidad importante.

Tomados juntos, estos resultados se expande considerablemente al alcance de la reacción de la síntesis de plantilla de ADN. Una amplia variedad de reacciones proceden eficientemente y selectivamente solo cuando los reactivos correspondientes se programan con frecuencias complementarias. Al aumentar el reportero de las reacciones de plantilla de ADN conocidas incluye ahora la formación de enlaces carbono-carbono y reacciones organometálicas (adiciones nitro-aldol, adiciones nitro-Michael, olefinaciones Wittig, cicloadiciones dipolar, y acoplamientos Heck) en adición a la formación de enlaces amida reportadas previamente (ver, Schmidt et al. Nucleic Acids Res. 1997, 25, 4792; Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3, 49), formación de imina (Czlapinski et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8618), aminación reductiva (Li et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 746; Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19) recciones SN2 (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961; Xu et al. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 148; Herrlein et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10151) adición de conjugado de tioles (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961), y formación de fosfoéster o fosfonamida (Orgel et al. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 109; Luther et al. Nature, 1998, 396, 245), estos resultados pueden permitir la traducción especifica-de secuencia de librerías de ADN en librerías de productos sintéticos estructural y funcionalmente diversos. En razón a que las cantidades pequeñas de moléculas que codifican plantillas deseadas se pueden amplificar por PCR, los productos de reacciones de plantilla de ADN son menos críticas que los productos de transformaciones sintéticas tradicionales. A pesar de eso, muchas de las reacciones desarrolladas anteriormente proceden eficientemente. Adicionalmente, al demostrar que las síntesis de plantilla de ADN en la ausencia de proteínas pueden dirigir una gran variedad de reacción químicas, estos hallazgos soportan previamente la hipótesis propuesta de que la síntesis de plantilla de ácido nucleico puede tener información replicable traducida en algunas de sus moléculas funcionales más recientes tales como policétidos, terpenos y polipéptidos antes de la evolución de las enzimas basadas en proteína. La diversidad de química mostrada aquí es simplemente controlable al llevar reactivos en la proximidad por la hibridización de ADN sin los requerimientos estructurales obvios que suministran una base experimental para estas posibilidades. La traducción de información amplificable dentro de un amplio rango de estructuras es un requerimiento cable para aplicar la evolución molecular de la naturaleza al descubrimiento de moléculas no naturales con nuevas funciones.

Métodos para reacciones de ejemplo para uso en la síntesis de plantilla de ADN.

Las plantillas funcionalizadas y reactivos se preparan típicamente al hacer reaccionar oligonucleótidos terminados en 5'-NH2 (para la plantilla 1), oligonucleótidos terminados en 5'-NH2-(CH20) 2 (para todas las otras plantillas) o nucleótidos terminados en 3'-OP03-CH2CH (CH20H) (CH2)4NH2 ( para todos los reactivos) con los ésteres NHS apropiados (0.1 volúmenes de una solución de 20 mg/mL en DMF) en amortiguador de fosfato sodio 0.2 M, pH 7.2, 25ºC, 1 h para suministrar las estructuras de plantilla y reactivo mostradas en las Figuras 13 y 15. para los reactivos ligados con aminoácido 6-9, oligonucleótidos terminados en 3'-OPO3-CH2CH-(CH20H) (CH2)4NH2 en 0.2 M de amortiguador de fosfato de sodio, pH 7.2 se hacen reaccionar con 0.1 volúmenes en solución de 100 mM bis [2(succinimidiloxicarboniloxi) ethil] sulfona (BSOCOES, Pierce) en DMF durante 10 min a 25ºC, seguido por 0.3 volumenes de un aminoácido 300 mM en 300 mM de NaOH durante 30 min a 25ºC.

Los reactivos y plantillas funcionalizados se purifican por filtración de gel utilizando Sephadex G-25 seguido por HPLC de fase reversa (gradiente de acetato-acetonitrilo tietilamonio 0.1) y caracterizado por espectrometría de masa MALDI. Las reacciones de plantilla de ADN se conducen bajo las condiciones descritas en las Figuras 13 y 15 y los productos se caracterizan al desnaturalizar por electroforesis en gel de poliacrilamida y espectrometría de masas MALDI.

Las secuencias de plantillas de oligonucleótidos y reactivos son como sigue (dirección 5’ a 3’, n se refiere al número de bases entre los grupos reactivos cuando la plantilla y el reactivo se hibridizan como se muestra en la Figura 16). 1: TGGTACGAATTCGACTCGGG; 2 y 3 ajustados: GAGTCGAATTCGTACC; 2 y 3 desajustados: GGGCTCAGCTTCCCCA; 4 Y 5: GGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTT; 6-9 ajustado (n = 10):TCCCGAGTCG; 6 ajustado (n = 0): AATTCGTACC; 6-9 desajustado: TCACCTAGCA; 11, 12, 14, 17, 18, 20: GGTACGAATTCGACTCGGGA; 10, 13, 16, 19 ajustado: TCCCGAGTCGAATTCGTACC; 10, 13, 16, 19 desajustado: GGGCTCAGCTTCCCATAAT; 15 ajustado: AATTCGTACC; 15 desajustado: TCGTATTCCA; comparación de plantilla para n = 10 versus n = 0: TAGCGATTACGGTACGAATTCGACTCGGGA.

Productos de reacción cuantificados al desnaturalizar por electroforesis de gel de pliacrilamida seguido por teñido con bromuro de etidio, visualización UV, y densitometría basado en CCD del producto y las bandas de material de partida de plantilla. Lo cálculos de rendimiento asumen que la plantilla y los productos teñidos con igual intensidad por base; para aquellos casos en los que los productos son parcialmente de doble hebra durante la cuantificación, los cambios en la intensidad de teñido pueden resultar en rendimientos aparentemente mayores.

Ejemplo 3: Desarrollo de Ligadores de Ejemplo

Como se apreciara por un experto en la técnica, es frecuentemente útil dejar la porción de ADN de los reactivos ligados a productos durante el desarrollo de reacción para facilitar el análisis por electroforesis de gel. El uso de síntesis de plantillas de ADN para traducir librerías de ADN en librerías correspondientes de moléculas pequeñas sintéticas adecuadas para selección in vitro, sin embargo, requiere el desarrollo de ligadores escindibles que conecten grupos reactivos de reactivos con sus oligonucleótidos que codifican ADN. Como se describe aquí adelante tres tipos de ejemplos de ligadores se han desarrollado (ver, Figura 18). Para reactivos de un grupo de reactivo, seria deseable a la posición ADN como un grupo saliente de la porción reactiva. De acuerdo son esta estrategia de ligador “autoescindible” el enlace del grupo reactivo ADN se escinde como una consecuencia natural de la reacción. Como un ejemplo de esta aproximación, un reactivo de fosforano Wittig fluorescente (14, con referencia a la Figura 19) se sintetiza en el que el oligonucleótidos que codifica se adhiere a uno de los grupos arilofosfina (ver, Figura 19, izquierda). La reacción Wittig de plantilla de ADN con plantillas ligadas a aldehído resulta en la transferencia casi cuantitativa del grupo fluorescente a partir del reactivo Wittig a la plantilla y la liberación concomitante del producto alqueno a partir de la porción de ADN del reactivo. Adicionalmente, los reactivos que llevan más de un grupo reactivo se pueden ligar a sus oligonucleótidos que codifican ADN una de dos estrategias de ligador adicionales. En la estrategia de ligador “sin marca”, la reacción de plantilla de ADN de un grupo reactivo es seguido por el clivaje del ligador unido a través de un segundo grupo reactivo a productos de rendimiento sin dejar atrás la funcionalidad química adicional. Por ejemplo, se sintetiza una serie de reactivos de aminoácido que se conectan a través de un ligador decarbamoiletilsulfona a sus oligonucleótidos que codifican ADN (Figura 19, centro). Los productos de la formación de enlace amida de plantilla de ADN que utilizan estos reactivos de aminoácidos se tratan con amortiguador acuoso alcalino para efectuar la eliminación cuantitativa y descarboxilaciones espontánea del grupo carbamoilo. El producto saliente de este ligador sin marca es por lo tanto la porción de aminoácido transferida. En un otra realización de la invención, una tercera estrategia, una “marca útil” se puede utilizar en la teoría esta puede ser ventajosa para introducir grupos químicos útiles como una consecuencia del clivaje de ligador. En particular, una “marca útil” se puede funcionalizar en etapas posteriores y se deja detrás luego del clivaje de ligador. Por ejemplo, los reactivos de aminoácidos ligados a través de 1,2-dioles a sus oligonucleótidos que codifican ADN se genera. Luego de la formación de enlace amida, este ligador se escinde cuantitativamente mediante oxigenación con NaIO4 para dar productos que llevan aldehídos útiles (ver, Figura 19, derecha). En adición a los ligadores descritos directa y anteriormente, una variedad de ligadores adicionales se puede utilizar. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 20, un ligador de tioéster se puede generar mediante acoplamiento mediado por carbodiimida de ADN tiol-terminado con reactivos que contienen carboxilato y se pueden escindir con base acuosa. En razona a que el grupo carboxilato suministra la entrada en las reacciones de formación de enlace amida de plantilla de ADN descritas anteriormente, este ligador podría liberar un “marca útil” cuando se escinde (ver, Figura 20). Alternativamente, el ligador tioéster se puede utlizar como unligador autclivable durante una reacción de acilación de amina en la presencia de cationes Ag(I) (ver, Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3311-3320) ya que la porción de tiol-ADN del reactivo se libera como una consecuencia natural de la reacción. Se apreciara que un ligador de tioéter que se puede eliminar y oxidar en pH 11 para liberar una fuente de vinilo se puede utilizar como un ligador de “marca útil”. Como se demuestra aquí, el grupo vinilsulfona sirve como el sustrato en un número de reacciones de plantilla de ADN posteriores

Ejemplo 4: Reacciones de Ejemplo en Solventes orgánicos:

Como se demuestra aquí, una variedad de reacciones de plantilla de ADN puede ocurrir en medio acuoso. También se ha demostrado, como se discute adelante, que las reacciones de plantilla de ADN pueden ocurrir en solventes orgánicos, expandiendo grandemente así el alcance de la síntesis de plantilla de ADN. Específicamente, las plantillas y reactivos de ADN se han acomplejado con cationes de tetraalquilamonio de cadena larga (ver, Jost et al. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 2143; Mel’nilkov et al. Langmuir, 1999, 15, 1923-1928) para permitir al disolución cuantitativa de componente de reacción en solventes orgánicos anhidros que incluyen CH2Cl2, CHCl3, DMF y MeOH. Sorprendentemente, se ha encontrado que la síntesis de plantilla de ADN puede de hecho ocurrir en solventes orgánicos anhidros con alta selectividad de secuencia. Descrita en la Figura 21 está las reacciones de formación de enlace amida de plantilla de ADN en que los reactivos u plantillas se complejan con cationes de dimetildidodecilamonio en reicpientoes separados o después de prehibridización en agua, liofilizados hasta secado, disueltos en CH2Cl2, y mezclados juntos. Reacciones ajustadas, pero no desajustadas suministran productos cuando los reactivos se prehibridizan en solución acuosa y cuando ellos se mezclan por primera vez en CH2Cl2 (ver, Figura 21). La formación de amida de la plantilla de ADN y el acoplamiento Heck mediado por Pd en DMF anhidro también procede de secuenciaespecífica. Claramente, estas observaciones de la síntesis de plantilla de ADN de secuencia especifica en solventes orgánicos implica la presencia de al menos una estructura secundaria dentro de ADN tetraalquilamonio complejado en un medio orgánico, y podría permitir a los receptores de ADN y catalizadores ser involucrados hacia la estereoselectividad de ADN o propiedades catalíticas en solventes orgánicos. Específicamente, las reacciones de plantilla de ADN que son conocidas por ocurrir en medio acuosa, que incluyen adiciones de conjugado, cicloadiciones reacciones de desplazamiento, y acoplamientos mediados por Pd también se puede desarrollar los solventes orgánicos. En cierta otras realizaciones, las reacciones en solventes orgánicos se puede utilizar de tal forma que se desarrolle ineficiente o imposible en agua. Por ejemplo, cuando la metátesis de olefina Ru-catalizada en agua se ha reportado por Grubbs y colaboradores (ver, Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1627-1628; Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6601-6609; Mohr et al. Organometalli s 1996, 15, 4317-4325), el sistema de metátesis acuoso es un grupo sensible extremadamente funcional. La tolerancia de grupo funcional de metátesis de olefina Ru-catalizada en solventes orgánicas, sin embargo, es significativamente más robusta. Algunas reacciones de ejemplo utilizadas en solventes

orgánicos pero no están limitadas a cicloadición 1,3-dipolar entre nitrones y olefinas que pueden proceder a través de estados de transición que son menos polares que loe estados de fondo de materiales de partida.

Como se detalló anteriormente, la generalidad de la síntesis de plantilla de ADN se ha establecido al desarrollar varios tipos de reacción de plantilla de ADN distintos, ninguno de los cuales se limita a producir estructuras que semejen la estructura de ácido nucleico natural, y muchas de las cuales son altamente útiles en la formación de enlace carbonocarbono o reacciones sintéticas de construcción complejas. Se ha mostrado que la tendencia de la instancia de la síntesis de plantilla de ADN permite de diferentes regiones de una plantilla de ADN a cada reacción sintética diferente codificada. La síntesis de plantilla de ADN puede mantener la fidelidad de la secuencia a un en un formato de librería en le que más de 1000 plantillas y 1000 reactivos reaccionan simultáneamente en el recipiente. Como se describió anteriormente y como se describe adelante, se han desarrollado estrategias ligadoras, que junto con las reacciones desarrolladas como se describió anteriormente, han permitido la primer síntesis de plantilla de ADN multietapa de moléculas pequeñas sintéticas simples. adicionalmente, la síntesis de plantilla de ADN de secuencia específica en solvente orgánicos se ha demostrado, expandiendo adicionalmente el alcance de está aproximación.

Ejemplo 5: Síntesis de Ejemplo y Librerías de Compuestos

A) Síntesis de una librería de policarbamato: una realización de la estrategia descrita anteriormente es la creación de una librería de policarbamato amplificable. De dieciséis dinucleótidos posibles utilizados para codificar la librería, uno se asigna a una función del codón de inicio, y una se asigna para servir como un codón de parada. Un código genético artificial se crea luego asignando cada uno de los 14 dinucleótidos restantes a un monómero diferente. Por razones geométricas un monómero actualmente contiene un dicarbamato que contiene dos cadenas laterales. Dentro de cada monómero, el dicarbamato se une al dinucleótido correspondiente (análogos para un anticodón tARN) a través de un ligador de silil enol éter que libera el ADN nativo y el carbamato libre luego de tratamiento con fluoruro. La porción de dinucleótido existe como el fosfato 5’-2-metilimidazol, que se ha demostrado (Inoue et al. J. Mol. Biol. 162: 201,1982; Rembold et al. J Mol. Evol. 38: 205,1994; Chen et al. J. Mol. Biol. 181: 271, 1985; Acevedo et al. J. Mol. Biol. 197:187,1987; Inoue et al. J Am. Chem. Soc. 103: 7666,1981) para servir como un grupo saliente excelente para oligonomerización dirigida a plantillas de nucleótidos que aun es relativamente estable bajo condiciones acusas básicas

o neutras (Schwartz et al. Science 228:585,1985;). la porción de bicarbamato existe en una forma cíclica ligada a través de un ligador de viniloxicarbonato. El grupo vinilcarbonato se ha demostrado que estable en condiciones acuosas básicas o neutras (Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1563, 1977; Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1567, 1977; Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1571, 1977;) y se ha mostrado adicionalemente que suministra carbamatos en producciones muy altas luego de la adición de aminas (Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1563, 1977;).

Cuando se ataca por una amina a partir de una cadena de policarbamato, el ligador de carbonato de vinilo, conducido por la aromatización del m-pot, libera una amina libre. Esta amina libre siempre posteriormente como el nucleófilo para

5 atacar el siguiente viniloxicarbonato, propagando la polimerización de la cadena carbamato creciente. Tal una estrategia minimiza el potencial par reactividad cruzada y polimerización bi-direccional al asegurar que solo un nucleófilo está presente en cualquier tiempo durante la polimerización.

Utilizando el monómero descrito anteriormente, la traducción artificial de ADN en un policarbamato se puede ver como un proceso de tres etapas. En la primera etapa, las plantillas de ADN de hebra sencilla que codifican la librería se

10 utilizan para guiar el ensamble y polimerización de las porciones dinucleótidos de los monómeros, terminando con el monómero de “paradas” que posee un 3’ metil éter en cambio de un grupo 3’ hidroxilo (Figura 22).

Una vez sean ensamblado los nucleótidos y polimerizados en ADN de doble hebra, la terminación de monómero “inicio” en un o-nitrobencilcarbamato se fotodesprotege para revelar la amina primaria que inicia la polimerización de carbamato. La polimerización procede en la dirección 5’ a 3’ junto con la estructura de ADN, con cada ataque

15 nucleofílico que resulta en el posterior desenmascaramiento de un nuevo nucleófilo amina. El ataque del monómero “paradas” libera una acetamida diferente a una amina, por lo tanto, termina la polimerización (Figura 23). Debido a que el ADN existe en esta etapa en una forma de doble hebra estable, variables tales como temperatura y pH se pueden explorar para optimizar la eficiencia de polimerización.

Luego de la polimerización se escinde el policarbamato a partir de la estructura de fosfato del ADN luego del tratamiento

20 con fluoruro. La desilización del ligador enol éter y la eliminación del fosfato conducido por la liberación resultante de fenol suministra el policarbamato ligado covalentemente a su terminal carboxi a su ADN de hebra sencilla codificada (Figura 24).

En esta etapa el policarbamato se puede liberar completamente del ADN mediante hidrólisis base del ligado de éster. Elo policarbamato liberado se puede purificar por HPLC y reensayado para verificar que sus propiedades deseadas están intactas. El ADN libre se puede amplificar utilizando PCR, mutar con PCR propenso al error (Cadwell et al. PCR Methods Appl. 2:28,1992;) o mezcla de ADN (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747,1994; Stemmer Nature 370:389,1994; U.S. Patent 5, 811,238, issued September 22, 1998;) y/o secuenciada para revelar la estructura primaria del policarbamato.

5 Síntesis de unidades de monómero. Después que se sintetizan los monómeros, el ensamble y la polimerización de los monómeros en el andamio de ADN puede ocurrir espontáneamente. Ácido Shikimico 1, disponible comercialmente, biosintéticamente (Davis Adv. Enzymol. 16: 287,1955; incorporado aquí como referencia), o mediante síntesis corta a partir de D-manosa (Fleet et al. J Chem. Soc., Perkins Trans. I 905, 1984; Harvey et al. Tetrahedron Lett. 32: 4111,1991;), sirve como un punto de partida conveniente para la síntesis de monómero. Los grupos syn hidroxilo se

10 protegen como el p-metoxibencilideno, y el grupo hidroxilo restante como el tert-butildimetilsilil éter para producir 2. la proporción carboxilato del ácido shikímico se reduce luego completamente mediante reducción LAH, tosilación del alcohol resultante, y reducción adicional con LAH para dar 3.

Aminoácidos N-protegidos accesibles sintéticamente y disponibles comercialmente sirven como materiales de partida para la porción dicarbamato de cada monomero. Se protegen cadenas laterales reactivas como éteres fotolabiles, esteres, acetales, carbamatos, o tioéteres. Luego de la química previamente desarrollada (Cho et al. Science 261: 1303,1993;), un aminoácido 4 deseado se convierte en el alcohol amino correspondiente 5 a la mezcla con la formación

20 anhídrido con isobutilcloroformato seguido por reducción con borohidruro de sodio. El amino alcohol se convierte entonces al carbonato activo mediante tratamiento con p-nitrofenilcloroformato para producir 6 que luego se acopla a un segundo amino alcohol 7 para suministrar, siguiendo el grupo hidroxilo sililación y desprotección FMOC, carbamato 8.

El acoplamiento de carbamato 8 en el ligador derivado de ácido shikímico procede como sigue. El grupo hidroxilo alílico de 3 se desprotege con TBAF, se trata con anhídrido trifico para formar el triflato secundario, luego se desplaza con 5 aminocarbamato 8 para producir 9. la presencia del grupo metil vinílico en 3 debe asistir en la minimización de la cantidad no deseada de producto resultante de la adición de SN2’ (Magid Tetrahedron 36: 901,1980;). Las adiciones Michael de carbamatos desprotegidos a esteres a,β-no saturados se han documentado bien (Collado et al. Tetrahedron Lett. 35: 8037, 1994; Hirama et al. J. Am. Chem. Soc. 107: 1797, 1985; Nagasaka et al. Heterocycles 29: 155,1989; Shishido et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993,1987; Hirama et al. Heterocycles 28: 1229,1989;). Por analogía, la 10 amina secundaria se protege como el carbamato o-nitrobencilo (NBOC), u el compuestos resultante se desprotona en el carbamato de nitrógeno. Esta desprotección se puede desarrollar típicamente con hidruro de sodio o tert-butiloxi o potasio (Collado et al. Tetrahedron Lett. 35: 8037,1994; Hirama et al. J. Am. Chem. Soc. 107:1797,1985; Nagasaka et al. Heterocycles 29: 155,1989; Shishido et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993, 1987; Hirama et al. Heterocycles 28: 1229,1989;), aunque otras bases se pueden utilizar para minimizar la desprotonación de los protones nitrobencílicos. 15 Adiciones del carbamato desprotonado a cetona a,β-no saturada 10, seguido por el “traping” del enolato resultante con TBSCl, debe producir silil enol éter 11. La estereoselectividad previamente encontrada de las adiciones de conjugado a los enones 5-sustituido tal como 10 (House et al. J. Org. Chem. 33:949,1968; Still et al. Tetrahedron 37: 3981, 1981) siguiere que la formación preferencial de 11 sobre su diastereómero. Cetona 10, el precursor de ligador de fosfatocarbamato escindiable con fluoruro, se pude sintetizar a partir de 2 mediante una descarboxilación en pot (Barton et al.

20 Tetrahedron 41: 3901,1985); seguido por tratamiento con TBAF, oxidación Swem del alcohol resultante para producir 12, desprotección con DDQ, formación de éter nitrobencilo selectiva de alcohol menos oculto, y la reducción de grupo ahidroxilo con yoduro de samario (Molander In Organic Reactions, Paquette, Ed. 46: 211,1994;).

El grupo p-metoxibencilidieno de 11 se transforma en el PMB a-hidroxi sea utilizando cianoborohidruro de sodio y

cloruro de TMS (Johansson et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. l 2371, 1984); y el grupo TES desprotegido con 2% de HF

5 (condiciones que no deben afectar el TBS (Boschelli et al. Tetrahedron Lett. 26: 5239, 1985)), para suministrar 13. el

grupo PMB luego precedente (Johansson et al. J Chem. Soc. Perkin Trans. 12371, 1984; Sutherlin et al. Tetrahedron

Lett. 34: 4897,1993); debe permanecer en el alcohol secundario más oculto. Los dos grupos hidroxilos libres se pueden

macrociclizar mediante adición muy lenta de 13 a una solución de cloformato de p-nitrofenilo (u otro análogo fosgeno)

que suministra 14. el éter PMB se desprotege, y el alcohol resultante se convierte en un triflato y se elimina bajo 10 condiciones cinéticas con una base oculta estericamente para producir viniloxicarbonato 15. La fosfodesprotección del

nitrobencilo y nitrobencilocarbamato produce alcohol 16.

La síntesis de monómero se completa mediante acoplamiento secuencial de los tres componentes. Se sintetiza clorodiisopropilaminofosfina 17 mediante reacción de PCL con diisopropilamina (King et al. J Org. Chem. 49: 1784,1984) 5 Nucleósido unido a resina (o 3’-o-nitrobenciléter protegido) 18 se acopla a 17 para producir fosforamidita 19. Acoplamiento posterior de 19 con el nucleósido 20 (Inoue et al. J. Arm. Chem. Soc. 103: 7666,1981;) suministra 21. El alcohol 16 se hace reaccionar entonces con 21 para producir, después de oxidación cuidadosa utilizando MCPBA o I2 seguido por clivaje de la resina (o fosfoprotección), el monómero completo 22. Esta estrategia de acoplamiento secuencial de 17 con alcoholes ha sido utilizado exitosamente para generar fosfatos que llevan tres sustituyentes alcoxi

10 diferentes en rendimientos excelentes (Bannwarth et al. Helv. Chim. Acta 70: 175, 1987;).

Los monómeros de inicio y parada únicos utilizados para iniciar y terminar la polimerización de carbamato se pueden sintetizar mediante modificación simple del esquema anterior.

B) Ácidos Nucleicos-Péptido Funcionalizados Evolucionables (PNA): en otra realización una librería de ácido nucleicopéptido se crea. Orgel y colaborados han demostrado que los oligómeros de ácido nucleico-péptido (PNA) son capaces de polimerización eficiente en plantillas de ARN o ADN complementarias (Böhler et al. Nature 376: 578, 1995; Schmidt et al. Nucl. Acids Res. 25: 4792,1997;). Este hallazgo, junto con la síntesis reciente y caracterización de los ácidos nucleicos de péptido quiral que llevan cadenas laterales de aminoácido (Haaima et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1939-1942,1996; Püschl et al. Tetrahedron Lett. 39: 4707,1998;), permite la unión de la estructura de polímero y la hebra de ácido nucleico creciente dentro de una estructura sencilla. Es ente ejemplo, cada plantilla consiste de una horquilla de ADN que termina en un grupo amina 5’. La fase sólida y la síntesis de solución de tales moléculas se han descrito previamente (Uhlmann et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 2632,1996;). Cada extensión de monómero consiste de un trímero PNA ( o mayor) que llevan cadenas laterales que contiene funcionalidad de interés. El código genético artificial se escribe para asignar cada trinucleótido a un conjunto diferente de cadenas laterales. El ensamble, activación (con un grupo saliente apropiado y carboimida, por ejemplo), y polimerización de los dímeros PNA junto con la plantilla de ADN complementaria en la dirección carboxi a amino-terminal produce el polímero no natural (Figura 20). Escoger un monómero de (parada) con un terminal biotinilado suministra una forma conveniente de terminar la extensión y purificar los polímeros de longitud completa. Los polímeros resultantes ligados covalentemente a su ADN codificante, son fáciles para selección, secuenciamiento, o mutación.

La aproximación experimental que implementa una librería de ácido nucleico de péptido funcionalizado evolucionable comprende (i) mejorar y adaptar la química conocida para la polimerización dirigida a plantilla de lata eficiencia de PNA;

(ii)

definir un formato de codón (longitud y composición) adecuadas para acoplamiento PNA de un número de monómeros diversos en una hebra complementaria de ADN codificante libre infidelidad significativa, cambio de estructura, o iniciación falsa de polimerización; (iii) escoger un conjunto inicial de cadenas laterales que definen nuestro nuevo código genético y sintetizar monómeros correspondientes; y (iv) someter una librería de PNA funcionalizada a ciclos de selección, amplificación, y mutación y caracterizar las moléculas evolucionadas resultantes para entender la base de sus actividades novedosas.

(i)

Mejorar la química de acoplamiento: Mientras Orgel y colaboradores han reportado polimerización de PNA dirigida a plantilla, los rendimientos reportados y el número de acoplamientos exitosos son significativamente menores de lo que se pudiera desear. Una ruta promisoria hacia el mejoramiento de este proceso de acoplamiento clave es explorar nuevos reactivos de acoplamiento, temperaturas, y solventes que no se investigaron previamente (presumiblemente porque los esfuerzos previos se enfocaron en condiciones que pudieron haber existido en tierras prebióticas). El desarrollo de polímeros PNA funcionalizados evolucionables involucra emplear activadores (DCC, DIC, EDC, HATU/DIEA, HBTU/DIEA, ByBOP/DIEA, cloroacetonitrilo), grupos salientes (2-metilimidazol, imidazol, pentafluorofenol,

fenol, tiodenol, trifluoroacetato, acetato, ácidos toluenosulfónico, coenzima A, DMAP, ribosa), solventes (acuoso en varios valores pH, DMSO, cloroformo, TFE), y temperatura (0° C, 4° C, 25° C, 37° C, 55° C) en un gran tamiz combinatoria para aislar nuevas condiciones de acoplamiento. Cada pozo de placa de 384 pozos se asigna una combinación específica de un activador, grupo saliente, solvente, y temperatura. Los glóbulos de síntesis de fase sólida ligados covalentemente a las plantillas de horquillas de ADN se colocan en cada pozo, junto con un monómero de PNA etiquetado fluorescentemente a la plantilla. Un evento de acoplamiento exitoso resulta en un enlace covalente del fluoróforo a los glóbulos (figura 26); el acoplamiento sin plantilla no deseado se puede distinguir por reacciones de control con monómeros desajustados. Luego se lavan los glóbulos y se escinde el producto a partir de soporte sólido, cada pozo se ensaya con un lector de placa de fluorescencia.

(ii) Definir un formato de codón: Mientras que la naturaleza ha empleado exitosamente un codón de tripleta en la biosíntesis de proteína, un nuevo polímero ensamblado bajo condiciones muy diferentes sin la asistencia de enzimas puede requerir un formato de codón enteramente novedoso. El cambio de estructura se puede remediar mediante el alargamiento de cada codón de tal forma que hibridizar un codón de la estructura garantiza un desajuste (por ejemplo, al hincar cada codón con una g y al restringir las posiciones posteriores en el codón a T, C, y A). termodinámicamente, uno también podría esperar fidelidad para mejorar cada incremento de longitud de codón para un cierto punto. Los codones que son excesivamente largos, sin embargo, serán capaces de hibridizar a pesar de las bases desajustadas y más aún síntesis de monómeros complicados. Una longitud de codón óptima para la traducción artificial de alta fidelidad se puede definir utilizando un tamiz combinatorio basada en placa optimizado desarrollado anteriormente. La longitud y composición de cada codón en la plantilla se varía por síntesis de fase sólida de la horquilla de ADN apropiada. Estas horquillas de plantilla se les permite luego acoplar con monómeros de PNA etiquetados fluorescentemente de secuencia variante. El formato de codón ideal permite solo monómeros que llevan secuencias exactamente complementarias para acoplar con las plantilla, aún en la presencia de monómeros PNA (que se etiquetan diferentemente para facilitar el ensayo de acoplamiento ajustado versus desajustado). Los codones de tripleta y cuadrupleta en el que las dos bases se varían entre A, T, y C mientras que la base restante o bases se fijan como g para asegurar el registro apropiado durante la polimerización se estudian primero.

(iii) Escribir un nuevo código genético: Se escogen cadenas laterales que suministran funcionalidad interesante no necesariamente presente en biopolímeros naturales, que son accesibles sintéticamente, y que son compatibles con condiciones de acoplamiento. Por ejemplo, un código genético simple que se puede utilizar o para evaluar un PNA quelante Ni2 consiste de una variedad de cadenas laterales que llevan carboxilato protegidas así como también un conjunto de cadenas laterales pequeñas para equipar polímeros con flexibilidad conformacional y de diversidad estructural (figura 27). La selección exitosa de pan capaz de unir el Ni2 con alta afinidad se puede seguir por una expansión de si código genético para incluir un fluoróforo así como también un apagador fluorescente. Los polímeros resultantes pueden luego ser evolucionados hacia un sensor Ni+2 fluorescente que posee diferentes propiedades fluorescentes en la ausencia o presencia de níquel. Reemplazar la cadena lateral fluorescente con un “photocaged” puede permitíos la evolución de polímeros que quelan el Ni+2 en la presencia de ciertas longitudes de onda de luz o que liberan Ni+2 luego de fotólisis. Estos ejemplos simples demuestran la tremenda flexibilidad en las propiedades químicas potenciales de moléculas no naturales evolucionables conferidas por la libertad para incorporar elementos fundamentales sintéticos no limitados a aquellos compatibles con la maquinaria ribosomal.

(iv) Seleccionar polímeros no naturales deseados: Muchos de los métodos desarrollados PATRA la selección de moléculas biológicas se pueden aplicar a selecciones para PNA evolucionados con propiedades deseadas. Como los ácidos nucleicos o selecciones que exhiben fago, librerías de polímeros no naturales generados por método de polimerización de ADN descritos anteriormente se auto etiquetan y por lo tanto no necesitan ser espaciados especialmente o sintetizados en pines o glóbulos. La unión de Ni2 al PNA se puede hacer simplemente al pasar la librería entera que resulta de la traducción o de un oligonucleótido aleatorio a través de una resina Ni-NTA disponible comercialmente ("His-Tag") precargada con níquel. Las moléculas deseadas a la resina y se eluyen con EDTA. Este secuenciamiento de PNA después de varis ciclos de selección, mutagénesis y amplificación revela que de las cadenas laterales escogidas inicialmente pueden ensamblarse juntas para formar un receptor Ni2. adicionalmente, el aislamiento de un quemador PNA Ni2 representa el PNA equivalente de una etiqueta de histidina que puede probar ser útil para la purificación de polímeros no naturales posteriores. Luego los esfuerzos involucraran más selecciones ambiciosas. Por ejemplo, la fluorescencia del PNA en la presencia de ligandos específicos se puede seleccionar al clasificar FACS de polímeros traducidos ligados a través de sus plantillas de ADN a glóbulos. Aquellos glóbulos que tiene fluorescencia en la presencias, pero no en la ausencia, del ligando objetivo se aísla y caracteriza. Finalmente, el uso de un monómero de “parada” biotinilado como se describió anteriormente permite la selección directa para el catalizador de muchas reacciones de unión-rompimiento o unión-formación. Dos ejemplos descritos en la figura 28 destacan una selección para un PNA funcionalizado que cataliza el clivaje de retroaldol de fructuosa 1,6-bifosfato a 3-fosfato gliceraldehído y dihidroxiacetona fosfato, una etapa esencial en la glicólisis, así como también una selección del PNA que cataliza la reacción aldol.

C) Librerías Evolucionables de Moléculas Pequeñas: En aún otra realización de la presente invención, los métodos inventivos se utilizan en preparar moléculas no poliméricas no naturales evolucionables y amplificables que incluyen

andamios de drogas sintéticas. Los grupos nucleofílicos o electrofílicos se desenmascaran individualmente en un andamio de molécula pequeña adherido por simple unión covalente o a través de un soporte sólido común a una plantilla de oligonucleótido que codifica. Los reactivos electrofílicos o nucleofílicos ligados a secuencias de ácido nucleico cortas se hibridizan a las plantillas correspondientes. La reacción de secuencia-específica con el reactivo apropiado tiene lugar por catálisis de proximidad (figura 29).

Siguiendo la funcionalización sintética de todas las posiciones en una forma determinada por las secuencia del ADN adherido (figuras 30 y 31), los lechos codificados resultantes se pueden someter a un amplio rango de selecciones biológicas que sean desarrollado para probar compuestos en resina. (Gordon et al. J. Med. Chem. 37: 1385,1994; Gallop et al. J. Med. Chem. 37: 1233-1251, 1994 ;).

El ADN que codifica se escinde a partir de cada glóbulo identificado en la selección y sometido a PCR, mutagénesis, secuenciación, o recombinación homóloga antes de readherir a un soporte sólido. Principalmente, este sistema es más flexible cuando el ADN codificante se liga directamente al andamio sintético combinatorio sin un glóbulo interviniente. En este caso, las librerías completas de compuestos se pueden tamizar o seleccionar para actividades deseadas, su ADN codificante liberado, amplificado, mutado, y recombinado, y los compuestos nuevos sintetizados todos en una serie pequeña de un pot, reacciones masivamente paralelas. Sin un soporte de glóbulo, sin embargo, las reactividades de reactivos hibridizados debe ser altamente eficiente en razón a que solo una molécula de plantilla dirige la síntesis de la molécula pequeña completa.

El desarrollo de las librerías de molécula pequeña sintética evolucionables descansa en al catálisis química suministrada por la proximidad de los reactivos hibridizados por ADN. Se apreciará que las distancias aceptables entre los reactivos hibridizados y los grupos reactivos no enmascarados deben ser primero definidos par funcionalización de plantilla de ADN eficiente al hibridizar electrófilos radio etiquetados (ésteres activados en primer intento) unidos a oligonucleótidos cortos en distancias variantes a partir de un nucleófilo reactivo (una amina primaria) sobre una hebra de ADN. En puntos de tiempos dados, se someten alícuotas a electroforesis de gel y autorradiografía para monitorear el curso de la reacción. Graficar la reacción como una función de la distancia (envases) entre el nucleófilo y electrófilo definirá una ventana de distancia aceptable dentro del cual la catálisis basada en proximidad de una reacción hidridizada por ADN puede tener lugar. El ancho de esta ventana determinará el número de reacciones distintas que podemos codificar en una hebra de ADN (una ventana mayor permite más reacciones) así como también la naturaleza de los codones (una ventana más grande se requiere para codones más grandes) (figura 32).

Una vez las distancias aceptables entre los grupos funcionales en una andamio sintético combinatorio y se determinan los reactivos hibridizados, se determina el formato de codón. La naturaleza no polimérica de la síntesis de molécula pequeña simplifica la lectura de codón como cambio de estructura no es emisión y los codones relativamente grandes se pueden utilizar para asegurar que cada conjunto de reactivos hibridiza solo una región de la hebra de ADN codificante.

Una vez la distancia del ligador entre el grupo funcional y el andamio de molécula pequeña sintética y el formato de codón de ha determinado, uno puede sintetizar moléculas pequeñas basado en un andamio de molécula pequeña tal como el andamio de cefalosporina mostrado en la figura 31. La amina primaria del ácido 7-aminocefalosporánico se protege primero utilizando FMOC-Cl, y luego el grupo acetilo se hidroliza mediante tratamiento con base. La plantilla de ADN codificante se adhiere luego a través de enlace amida utilizando EDC y HOBt al grupo de ácido carboxílico. Una molécula de transferencia con un anticodón capaz de hibridizar a la plantilla de ADN adherida se permite luego hibridizar a la plantilla. La molécula de transferencia tiene asociado a través de un enlace de disulfuro una amina primaria que lleva R1. La activación del grupo hidroxilo primario en el andamio de cefalosporina con DSC luego de tratamiento con TCEP produce la amina unida covalentemente al andamio a través de un enlace de carbamato. El tratamiento adicional con otra unidad de transferencia que tiene una aminoácido conduce a la funcionalización de la amina primaria desprotegida del andamio de cefalosporina. Las moléculas similares a cefalosporina sintetizadas de esta forma puede ser entonces seleccionada, amplificada, y/o evolucionada utilizando los métodos inventivos y composiciones. La plantilla de ADN puede ser diversificada y evolucionada utilizando mezcla de ADN.

D) Síntesis de Molécula Pequeña de Multi-Etapa Programada por Plantillas de ADN: La evolución molecular requiere la traducción de secuencia-específica de un portador de información amplificable dentro de las estructuras de las moléculas evolucionables. Este requerimiento ha limitado los tipos de moléculas que se han evolucionado directamente en dos clases, proteínas y ácidos nucleicos, debido a que solo estas clases de moléculas se puede traducir a partir de secuencias de ácido nucleico. Como se describió general y anteriormente, una aproximación promisoria a la evolución de moléculas diferentes a proteínas y ácidos nucleicos utiliza síntesis de plantilla ADN como un método para traducir secuencias de ADN en moléculas pequeñas sintéticas. La síntesis de plantilla de ADN puede dirigir una amplia variedad de reacciones químicas poderosas con alta especificidad de secuencia y requerir imitación estructural de la estructura de ADN. La aplicación de esta aproximación a moléculas sintéticas de complejidad útil, sin embargo, requiere el desarrollo de métodos generales para permitir el producto de una reacción de plantilla de ADN para experimentar transformaciones de plantilla de ADN posteriores. Se describe aquí en detalle la primera síntesis de molécula pequeña

multi-etapa de plantilla de ADN. Junto con los avances recientes en el alcance de reacción de la síntesis de plantilla de ADN, esos hallazgos establecen la etapa para la evolución in vitro de librerías de molécula pequeña sintéticas.

La síntesis de molécula pequeña de plantilla de ADN multi-etapa enfrenta dos retos mayores más allá de aquellos asociados con loa síntesis de plantilla de ADN en general,. Primero, el ADN utilizado para dirigir reactivos a plantillas apropiadas se debe remover del producto de una reacción de plantillas de ADN a etapas sintéticas de plantilla de ADN posteriores con el fin de evitar la hibridización indeseada a la plantilla. Segundo, la síntesis multi-etapa requiere a menudo la purificación y aislamiento de productos intermedios, a unos métodos comunes utilizados para purificar y aislar productos de reacción que no son apropiados para síntesis multi-etapa en la escala biológica molecular. Para dirigir estos retos, se implementan tres estrategias distintas en síntesis orgánica de fase sólida, para ligar reactivos químicos con sus oligonucleótidos de ADN codificantes y dos aproximaciones generales para purificación de producto después de que se desarrolla cualquier etapa sintética de plantilla de ADN.

Cuando es posible, un ligador de reactivo-oligonucleótido ideal para la síntesis de plantilla de ADN posiciona el oligonucleótido como un grupo saliente del reactivo. De acuerdo con esta estrategia ligadora de “autoescindido”, el enlace de oligonucleótido-reactivo se escinde como una consecuencia química natural de la reacción (Figura 33). Como el primer ejemplo de esta aproximación aplica a la química de plantilla de ADN, un reactivo de fosforano Wittig dansilado

(1) se sintetiza en el que el oligonucleótido de ADN codificante se adhiere a uno de los grupos fosfito arilo (I. Hughes, Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7595). La olefinación Wttig con plantilla de ADN (como se describió anteriormente) con una plantilla ligada aldehído 2 resulta en la transferencia eficiente del grupo dansilo fluorescente a partir del reactivo a la plantilla de para suministrar olefina 3 (Figura 33). Como un segundo ejemplo de un ligador de autoescindido, el tioéster ligado a ADN 4, cuando se activa con Ag (I) en pH 7.0 (Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3311) de plantilla amino-terminada acilada 5 para producir el producto amida 6 (Figura 33). La biosíntesis de proteína ribosómica utiliza tARN aminoacilado en un formato ligador de autoescindido similar par mediar la formación de unión de péptido de plantilla de ARN. Para purificar los productos deseados lejos de los reactivos sin reaccionar y a partir de oligonucleótidos escindidos siguiendo las reacciones de plantilla de ADN que utilizan ligadores de autoescindido, los oligonucleótidos de reactivo biotinilado y las reacciones de lavado crudas con glóbulos magnéticos ligados a estreptavidina (Figura 34) se utilizan. Aunque esta aproximación no separa a las plantillas que han reaccionado de las plantillas que no han reaccionado, las plantillas que no han reaccionado se pueden remover en unas reacciones de plantilla de ADN y etapas de purificación posteriores (ver adelante).

Los reactivos que llevan más de un grupo funcional se pueden ligar a sus oligonucleótidos de ADN codificantes a través de una segunda y tercera estrategias ligadoras. En las aproximaciones de “ligador sin marca”, un grupo funcional de reactivo se reserva para la formación de unión de plantilla de ADN, mientras que el segundo grupo funcional se utiliza para unir un ligador que se puede escindir sin introducir funcionalidad química no deseada adicional. La reacción de plantilla de ADN es seguida por clivaje del ligador adherido a través del segundo grupo funcional para producir los productos deseados (Figura 33), por ejemplo, una serie de reactivos de aminoacilación tal como derivado de (D)-Phe 7 se sintetiza en el cual α-amina se conecta a través de un ligador de carbamoiletilsulfona (Zarling et al. J. Immunology 1980, 124, 913) a su oligonucleótido de ADN codificante. El producto entre (8) de la formación de enlace amida de plantilla de ADN (como se describe aquí) utiliza este reactivo y la plantilla amina-terminada (5) se trata con base acuosa para efectuar la eliminación cuantitativa y espontánea de descarboxilación del ligador, para producir producto 9 que contiene el grupo aminoácido claramente transferido (Figura 33). Este ligador de sulfona es estable en pH 7.5 o amortiguador más bajo a 25ºC durante más de 24 h a un experimento clivaje cuantitativo cuando se expone a pH 11.8 amortiguador durante 2 h a 37ºC.

En algunos casos puede ser ventajoso introducir nuevos grupos químicos como una consecuencia de un clivaje ligador. De acuerdo con esta tercera estrategia ligadora, el clivaje ligador genera una “marca útil” que se puede funcionalizar en etapas posteriores. Como un ejemplo de esta clase de ligador, los reactivos de aminoácido tal como el derivado (L)-Peh 10 se genera ligado a través de 1,2-dioles (Fruchart et al Tetrahedron Lett. 1999, 40, 6225) a sus oligonucleótidos de ADN codificantes. Luego de la formación de enlace amida de plantilla de ADN con una plantilla amina-terminada (5), este ligador se cliva cuantitativamente por oxidación con 50 mM de NAlO4 a acuoso en pH 5.0 para producir el producto 12 que contiene el grupo aldehído apropiado para funcionalización posterior (por ejemplo, en una olefinación Wittig de plantilla de ADN, aminación reductiva, o adición de nitroaldol (Figura 33).

Los productos deseados generados a partir de reaccione de plantilla de ADN que utilizan los ligadores de marca útiles o sin marca se pueden purificar fácilmente utilizando oligonucleótidos reactivos biotinilados (Figura 34). Los oligonucleótido de reactivo adjunto con los productos deseados se capturan primero en los glóbulos magnéticos ligados a estreptavidina. Cualquier enlace de plantilla que no ha reaccionado con el reactivo mediante por pares bases se remueve al lavar los glóbulos con amortiguador que contiene 4 m de cloruro de guanidina. Las moléculas biotiniladas restantes se unen a los glóbulos de estreptevidina de acuerdo con estas condiciones. El producto deseado se aísla luego en forma pura al eluir los glóbulos con amortiguador de clivaje ligador (en los ejemplos anteriores, amortiguador que contiene NaI04 o pH 11), mientras reacciona y los reactivos que han reaccionado permanecen unido a los glóbulos.

Integrar el repertorio recientemente expandido de reacciones sintéticas compatibles con síntesis de plantilla de ADN y las estrategias ligadoras descritas anteriormente, se puede conducir la síntesis de molécula pequeña de plantilla de ADN multietapa.

En una realización, una solución de síntesis de plantilla de ADN de fase de una librería de péptido no natural se describe generalmente adelante y se muestra generalmente en la Figura 35. como se muestra en la Figura 35, para generar el grupo de plantilla inicial para la librería, 30 oligonucleótidos 5’-amino biotinilados sinteticos del formato de secuencia mostrado en la Figura 35, se acilan con 1 de 30 aminoácidos naturales o no naturales diferentes utilizando procedimientos de acoplamiento EDC estándar. Cuatro bases que representan un “codón” dentro de cada iniciador amino acilado se diseñan la identidad de la cadena lateral (R1). El “código genético” para estas cadenas laterales se protege con grupos de protección lábiles similares a aquellos comúnmente utilizados en la síntesis de péptidos. Los treinta iniciadores de ADN amino acilados resultantes se hibridizan para una librería de oligonucleótido de plantilla de ADN generada por síntesis de ADN automatizada. La extensión de iniciador con polimerasa ADN seguida por desnaturalización de hebra y purificación con glóbulos magnéticos ligados a estreptavidina produce la librería de plantilla departida (ver, Figura 35). Como un ejemplo general, una síntesis de plantilla de ADN de fase de solución de una librería de péptido no natural se describe en la Figura 36. la librería de plantilla se somete a las tres reacciones de formación de enlace de péptido de plantilla de ADN utilizando reactivos de aminoácido adheridos a 10 oligonucleótidos de ADN codificantes bae a través del ligador de sulfona descrito anteriormente. Los productos de cada etapa se purifican mediante electroforesis de gel de poliacrilamida de desnaturalización preparativa antes de clivaje de ligador si se desea, aunque esto puede no ser necesario. Cada reactivo ligado a ADN se puede sintetizar al acoplar un oligonucleótido de ADN terminado en 3’-amino al aminoácido codificado a través del derivado de carbonato bis-NHS del ligador sulfona como se muestra en la Figura 37. los codones se escogen de nuevo de tal forma que los codones relacionados codifican aminoácidos similares químicamente. Luego de la reacción de formación de enlace de cada péptido, se utiliza anhídrido acético para tapar los materiales de partida que no han reaccionado y se utiliza amortiguador pH 11 para efectuar el clivaje de ligador para exponer un nuevo grupo amino para la siguiente reacción de formación de unión de péptido. Una ves se completa el tetrapeptido, aquellos miembros de la librería que llevan las cadenas laterales de carboxilato también se pueden ciclizar con su terminal amino para formar péptidos macrocíclicos, mientras que los miembros de péptidos lineales puede simplemente ser N-acetilados (ver Figura 36).

Se apreciará que un surtido virtualmente ilimitado de bloques fundamentales de aminoácidos se pueden incorporar en al librería de péptido no natural. En forma diferente las librerías de péptido generadas utilizan la maquinaria biosintética de proteína tal como librerías que exhiben fago (O'Neil et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 1995, 5, 443-9), librerías que exhiben mARN (Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1997, 94, 12297-12302) librerías que exhiben ribosomas (Roberts et al. Curr. Opim. Chem. Biol. 1999, 3, 268-73; Schaffitzel et al. J. Immunol Methods 1999, 231, 119-35) o librerías de péptido intracelular (Norman et al. Science 1999, 285, 591-5), los aminoácidos con cadenas laterales no proteinogénicas, estereoquímica de cadena lateral no natural o estructuras no péptidicas también se pueden incorporar en esta librería. Adicionalmente, también se pueden utilizar oligopéptidos di-, tri- como elementos fundamentales para generar miembros de librerías más grandes. La presencia de péptidos no naturales en esta librería puede conferir propiedades farmacológicas no mejoradas tal como resistencia a la proteasa comparada con péptidos generadas ribosómicamente. De forma similar, los miembros de librería macrocíclicos pueden producir ligandos de afinidad mayor debido a la perdida de entropía luego de unir sus objetivos que puede ser menor que sus contrapartes lineales más flexibles. Basado en la enorme variedad de aminoácidos comercialmente disponibles que se ajustan a estas descripciones, la diversidad máxima de esta librería de tetrapéptido lineal y cíclica no natural puede exceder 100 x 100 x 100 x 100 = 108 miembros.

Otro ejemplo de librería que utiliza la aproximación descrita anteriormente incluye la síntesis de plantilla de ADN de una librería macrobicíclica orientada a la diversidad que contiene 5 y 14 miembros de anillo (Figura 38). Los materiales de partida para esta librería consisten de plantillas de ADN aminoacilado con una variedad de derivados de lisinas protegidos de cadena lateral y análogos de lisina disponibles comercialmente (que incluyen cisteína aminoetilo, aminoetilserina, y 4-hidroxilisina). En la primera etapa, la formación de enlace de amida de plantilla de ADN con una variedad de aminoácidos ligados al ADN tiene lugar como se describe en la librería de péptido no natural, excepto que el ligador diol vecinal 16 descrito anteriormente se utiliza en cambio de él ligador de sulfona sintrasa. Luego de la formación de enlace amida, el ligador de diol se cliva oxdativamente con periodato de sodio. La desprotección de las aminas de cadena lateral de análogos es seguida ‘por la formación de enlace amida de plantilla de ADN catalizada por triofluoroacetato de plata entre las aminas libres y una librería de tioésteres derivados de acrílico. Las olefinas resultantes se tratan con una hidroxilamina para formar nitrones, que experimentan cicloadición 1,3-dipolar para producir la librería bicíclica (Figura 38). Los reactivos ligados a ADN para esta librería se preparan al acoplar análogos de lisina a iniciadores de plantilla 5’-amino-terminados (Figura 35), ligadores de diol aminoacilados a oligonucleótidos ADN terminados en 3’-amino (Figura 38), y ácidos acrílicos acoplados a oligonucleótidos de ADN terminados en 3’-diol (Figura 38).

Como solo un ejemplo de una librería especifica generada a partir de la primera aproximación general descrita anteriormente, los tres ciclos iterados de la formación de amida de plantilla de ADN, la escisión de ligador sin trazas, y la purificación con glóbulos ligados estreptavidina se utilizan para genera un tripéptido no natural (Figura 39). Cada reactivo de aminoácido se liga a un oligonucleótido de ADN base 10 de plantilla amino-terminada para dirigir la síntesis de tripéptido que contiene tres regiones de base 10 consecutivas que son complementarias a los tres reactivos, que imitan la estrategia que se podría utilizar en una síntesis de librería de molécula pequeña de plantilla de ADN multietapa. El primer reactivo de aminoácido (13) se combina con la plantilla y el activador cloruro de 4-(4, 6-dimetoxi-1, 3,5-triazin2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM) (Kunishima et al. Tetrahedron 2001, 57, 1551) para efectuar la formación de enlace de péptido de plantilla de ADN. El producto deseado se purifica al mezclar la reacción cruda con glóbulos magnéticos ligados a estreptavidina, con 4 M de cloruro de guanidinio, y eluir con amortiguador pH 11 para efectuar clivaje de ligador de sulfona, suministrando el producto 14. El grupo libre amina en 14 se elabora entonces en una segunda y tercera ronda de formación de amida de plantilla de ADN y el ligador de clivaje para producir el dipéptido 15 y el tripéptido 16 (Figura 39).

El progreso de cada reacción, purificación, y etapa de clivaje de ligador de sulfona es seguido por la desnaturalización de electroforesis de gel de poliacrilamida. El tripéptido final liado a la plantilla (16) se digiere con la endonucleasa de restricción EcoRI y el fragmentos de digestión que contiene el tripéptido se caracteriza por espectrometría de masa MALDI. Empesadno con 2nmol (~ 20 μg) de material de partida, se genera suficiente producto de tripéptido para servir como la plantilla para más de 106 selecciones in vitro y reacciones PCR (Kramer et al. in Current Protocols in Molecular Biology, Vol 3 (Ed.: F. M. Ausubel), Wiley, 1999, pp. 15.1) (que asume 1/10,000 moléculas de selección de supervivencia). No se genero producto significativo cuando la plantilla de material de partida se tapo con anhídrido acético, o cuando los reactivos de control que contienen secuencias desajustadas se utilizan en cambio de reactivos complementarios (Figura 39).

Una síntesis de molécula pequeña de plantilla de ADN multietapa no peptídica (Figura 40) que utiliza todas las tres estrategias ligadoras desarrolladas anteriormente también se desarrolla. Un plantilla base 30 amina-terminada se somete a formación de enlace amida de plantilla de ADN utilizando un reactivo donante de aminoacilo (17) que contiene el ligador diol y un oligonucleótido base 10 biotinilado para producir la amina 18. el producto deseado se aísla al capturar la reacción cruda en glóbulos de estreptavidina seguido por escindir el ligador con NalO4 para generar aldehído

19. la reacción Wittig de plantilla de ADN de 19 con el reactivo de fosforano de autoescindido biotinilado 20 produce fumaramida 21. los productos de la segunda plantilla de reacción de ADN se purifican parcialmente al lavar con glóbulos de estreptavidina para remover el reactivo que ha reaccionado y el que no ha reaccionado. En la tercera etapa de plantilla de ADN, se somete la fumaramida 21 a una adición de conjugado de plantilla de ADN (Gartner et al. J Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961) utilizando reactivo tiol 22 ligado a través de ligador de sulfona a un oligonucleótido biotinilado. El producto de adición conjugado (23) se purifica por inmovilización con glóbulos de estreptavidina. El clivaje de ligador con amortiguador pH 11 produce el producto final 24 en 5-10% de rendimiento general aislado para las tres reacciones formadoras de enlace, dos etapas de clivaje de ligador, y las tres purificaciones (Figura 40). Este producto final se digiere con EcoRI y la masa del fragmento de plantilla ligado a molécula pequeña se confirma por espectrometría de masa MALDI (masa exacta: 2568, masa observada: 2566±5). Como en el ejemplo del tripéptido, cada uno de los tres reactivos utilizados durante esta síntesis multietapa hibridizo en una única ubicación en la plantilla de ADN, y las reacciones de control con desajustes de secuencia no producto (Figura 40). Como se esperaba, las reacciones de control en las que se omite el reactivo Wittig (etapa 2) tampoco género producto luego de la tercera etapa. Tomadas juntas, la síntesis de plantilla de ADN de 16 y 24 demuestran la capacidad del ADN para dirigir la síntesis de multietapa programada de secuencia de las moléculas pequeñas oligoméricas y no oligómericas no relacionadas en estructura con los ácidos nucleicos.

La disponibilidad comercial de muchos sustratos para las reacciones de plantilla de ADN que incluyen aminas, ácidos carboxílicos, compuesto a-halo carbonilo, olefinas, alcoxiaminas, aldehídos, y nitroalcanos puede permitir la traducción de grandes librerías de ADN en diversas librerías de molécula pequeña. La selección de un pot directo de estas librerías para los miembros con unión deseada o actividad catalítica, seguido por amplificación PCR y diversificación de las moléculas activas que codifican ADN, puede permitir a las moléculas pequeñas o sintéticas evolucionar en una forma paralela a los métodos naturales poderosos utilizados para generar nueva función molecular. Adicionalmente, la síntesis de plantilla de ácido nucleico multietapa es un requerimientos de modelos propuestos previamente (A. I. Scott, Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4961; Li et al. Nature 1994, 369, 218; Tamura et al. Proc. Natl. Acad Sci USA 2001, 98, 1393) para la traducción prebiótica de información replicable en moléculas funcionales. Estos hallazgos demuestran que las plantillas de ácido nucleico de hecho son capaces de dirigir iterativamente o no iterativamente síntesis de molécula pequeña multietapa aun cuando la hibridización de reactivos en distancias ampliamente variantes a partir de moléculas crecientes (en los ejemplos anteriores, cero a veinte bases). Como se describe en más detalle adelante, las librerías de moléculas sintéticas pueden luego ser evolucionadas hacia ligandos activos y catalizadores a través de ciclos de traducción, selección, y amplificación y mutagénesis.

E) Evolucionar Plásticos: En otra realización de la presente invención, un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, derivados de estos) se adhiere a un catalizador de polimerización. En razón a que los ácidos nucleicos pueden doblarse

en estructuras complejas, el ácido nucleico se pude utilizar para dirigir y/o afectar la polimerización de una cadena de polímero creciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede influenciar la selección de unidades de monómero a ser polimerizadas así como también así como la reacción de polimerización tiene lugar (por ejemplo, estereoquímica, estereoregularidad, actividad). Los poliedros sintetizados se pueden seleccionar para propiedades específicas tal como molecular, peso, densidad, hidrofobicidad; estereorregularidad, estereoselectividad, etc., y el ácido nucleico que forma una parte integral del catalizador que dirige su síntesis se puede amplificar y evolucionar (Figura 41). Ciclos iterados de diversificación de ligando, selección, y amplificación permite la evolución cierta de catalizadores y polímeros hacia propiedades deseadas.

Para dar solo un ejemplo, una librería de moléculas de ADN se adhiere a el catalizador de polimerización de metátesis de abertura de anillo basada en rutenio de Grubbs (ROMP) a través de un ligando dihidroimidazol (Scholl et al. Org. Lett. 1 (6): 953,1999;) que crea un grupo grande diverso de moléculas catalíticas potenciales, cada una única por naturaleza del ligando funcionalizado. Indudablemente, la funcionalización del catalizador con un ligando (ADN-DHI) desohidroimidazol ADN relativamente grande alterara la actividad andel catalizador. Cada molécula de ADN tiene un potencial para doblar en una forma única estereoelectrónica que potencialmente tiene diferentes selectividades y/o actividades en la región de polimerización (Figura 42). Por lo tanto, la librería de ligandos de ADN se puede “traducir” en una librería de plásticos luego de la adición de varios monómeros. En ciertas realizaciones, los ligandos de ADN-DHI son capaces de insertarse covalentemente ellos mismo dentro del polímero creciente, creando de esta forma un polímero etiquetado con el ADN que codifica su creación, se utiliza. Al utilizar el esquema sintético mostrado en la Figura 42, se producen ligandos DHI que contienen dos manejos químicos, uno utilizado para unir el ADN al ligando, el otro utilizado para unir una olefina pedante a la estructura DHI. La proporción de metátesis se conoce por variar ampliamente basado en la sustitución de olefina así como también la identidad del catalizador. A través de la alteración de estas variables, la proporción de incorporación de olefina pedante se puede modular de tal forma que kmetatesis de olefina pedante <<kROMP, por lo tanto, permite a los polímeros moderar a altos pesos moleculares para ser formados antes de la inserción de etiqueta de ADN y que corresponde a la terminación del polímero. Eter vinílico se utiliza comúnmente en ROMP para funcionalizar el terminal polímero (Gordon et al. Chem. Biol. 7: 9- 16,2000;) así como también producir polímeros de peso molecular reducido.

La selección posterior de un polímero a partir de la librería basado en una propiedad deseada por electroforesis, filtración de gel, sedimentación centrifuga, partición en solventes de hidrofobicidades diferentes, etc. La amplificación y diversificación del ácido nucleico codificante por vía de técnicas tales como PCR propenso a error o mezcla de ADN seguido por adición a una estructura DHI permitirá la producción de otro grupo de catalizadores ROMP potenciales enriquecidos en actividad seleccionada (Figura 43). Ese método suministra una nueva aproximación para generar materiales poliméricos y catalizador que los crea.

Ejemplo 6: Caracterización de Librerías de Molécula Pequeña Sintéticas de Plantilla de ADN: las librerías bicíclico y de péptido no natural descritas anteriormente se caracterizan en varias etapas. Cada reactivo candidato se conjuga con su oligonucleótido de ADN de codificante, luego se somete a reacciones modelo con plantillas ajustadas y desajustadas. Los productos de estas reacciones se analizan al desnaturalizar electroforesis de gel de poliacrilamida para evaluar la eficiencia de la reacción, y mediante espectrometría de masas para verificar estructuras de productos anticipados. Una vez se identifica un conjunto de reactivos robustos, la síntesis de la plantilla de ADN multietapa completa de los miembros de librería sencilla representativa en una gran escala se desarrolla y los productos finales se caracterizan por espectrometría de masas.

Más específicamente, la fidelidad de la secuencia de cada síntesis de librería de plantilla de ADN multietapa se ensaya al seguir el destino de reactivos etiquetados químicamente sencillos a través del curso de reacciones de síntesis de librería de un pot. Por ejemplo, los productos que salen de elementos fundamentales que llevan un grupo cetona se capturan con una resina ligada hidracida disponible comercialmente y analizada por secuenciamiento de ADN para verificar la fidelidad de la secuencia durante la síntesis de plantilla de ADN. De forma similar, Cuando se utilizan plantillas de modelo no biotinilados, los grupos biotina que llevan elementos fundamentales se purifican después de que la síntesis de plantilla de ADN que utiliza glóbulos magnéticos de estreptavidina y que se somete a secuenciamiento de ADN (Liu et al. J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 6961-6963). Los codones que muestra una mayor propensión a hibridización con ADN desparejo se identifican por selección de esta forma y se remueven de código genético de estas librerías sintéticas.

Ejemplo 7: Selección In Vitro de Ligandos de Proteína de Librerías Sintéticas Evolucionables: Debido a que cada miembro de librería generada en esta aproximación se liga covalentemente a un oligonucleótido de ADN que codifica y dirige su síntesis, se pueden someter las librerías a ciertas selecciones in vitro. Aunque las selecciones directas para catalizadores de molécula pequeña de formación de enlace o reacciones de clivaje-enlace están en una aplicación potencial excitante de esta aproximación, la selección in vitro más simple que se puede utilizar para evolucionar estas librerías es una selección para unirse a una proteína objetivo. Una proteína objetivo inicial ideal para la selección de librerías sintética juega un papel biológico importante y posee ligandos conocidos de afinidades variantes para validar los métodos de selección.

Un receptor de especial interés para uso en la presente invención es el vector aVβ3. El receptor aVβ3 es un miembro de la familia integrina de los receptores de glicoproteína heterodiméricos de transmembrana (Miller et al. Drug Discov Today 2000, 5, 397-408; Berman et al. Membr Cell Biol. 2000,13, 207-44) el receptor de integrina aVβ3 se expresa en la superficie de muchos tipos de células tales como osteoclastos, células de músculo liso vascular, células endoteliales, y células de algunos tumores. Este receptor media varios procesos biológicos importantes que incluyen la adhesión de osteoclastos a la matriz del hueso (van der Pluijm et al. J Bone Miner. Res. 1994, 9, 1021-8) migración de célula lisa de músculo (Choi et al. J. Vasc. Surg. 1994, 19, 125-34) y angiogénesis inducida por tumor (Brooks et al. Cell 1994, 79, 1157-64) (el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos). Durante la angiogénesis inducida por tumor, células endoteliales invasivas se unen a componentes de matriz extracelular a través de sus receptores de integrina aVβ3. Varios estudios (Brooks et al. Cell 1994, 79, 1157-64; Brooks et al. Cell 1998, 92, 391-400; Friedlander et al. Science 1995, 270, 1500-2; Varner et al. Cell Adhes Commun 1995, 3, 367-74; Brooks et al. J Clin Invest 1995, 96, 1815-22) ha demostrado que la inhibición de este evento de unión de integrina con anticuerpos o péptidos sintéticos pequeños inducen apoptosis de las células vasculares angiogénicas proliferativas y pueden inhibir la metástasis de tumores.

Un número de ligandos de péptidos de afinidad variante y selectividades de receptor integrina aVβ3 se han reportado. Dos antagonistas de integrina aVβ3 de refeencia son el péptido lineal GRGDSPK (IC50 = 210 nM (Dechantsreiter et al. J Med. Chem. 1999, 42, 3033-40; Pfaff et al. J Biol. Chema. 1994, 269, 20233-8) y el péptido cíclico ciclo -RGDfV (Pfaff et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 20233-8) (f = (D)-Phe, IC50 = 10 nM). Mientras que los antagonistas de péptidos para las integrinas contienen comúnmente RGD, no todos los péptidos que contienen RGD son ligandos de integrina de alta afinidad. A diferencia, el contexto conformacional del RGD y otras secuencia de péptido pueden tener un profundo efecto en la afinidad de la integrina y especificidad (Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1328-1335; Geyer et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 7735-7743; Rai et al. Bioorg. Med. Chez. Lett 2001, 11, 1797-800; Rai et al. Curr. Med. Chem. 2001, 8, 101-19). Por esta razón, las aproximaciones combinatorias hacia el descubrimiento del antagonista receptor de integrina aVβ3 es especialmente promisorio.

El papel relevante biológicamente y medicinalmente importante del receptor de integrina aVβ3 junto con sus antagonistas péptidos conocidos es su disponibilidad comercial (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) hace al receptor integrina aVβ3 un objetivo inicial ideal para las librerías de moléculas pequeña sintéticas de plantillas de ADN. El receptor de integrina aVβ3 se puede inmovilizar por adsorción en posos de placa de microtítulo sin dañar su capacidad de unir al ligando o especificidad (Dechantsreiter et al. J. Med Chem. 1999, 42, 3033-40; Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1328-1335; Haubner et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7461-7472). Alternativamente, el receptor se puede inmovilizar mediante conjugación con éster NHS o grupos maleimida ligados covalentemente a glóbulos de sefarosa y se puede verificar la capacidad de la resina de afinidad de integrina resultante para mantener las propiedades de unión de ligandos conocidas.

Para desarrollar las selecciones de unión de proteína actuales, las librerías macrocíclicas o de péptido sintético ligadas a plantillas de ADN se disuelven en amortiguador de unión acuoso en un pot y se escinde en la presencia de receptor de integrina aVβ3 inmovilizado. Ningún ligador se lava a parte con el amortiguador. Estas moléculas que se pueden unir a través de sus plantillas de ADN adheridas a diferencias de otras porciones sintéticas se elimina al lavar la librería de unión con plantillas de ADN funcionalizadas que les falta los sitios de unión de iniciador PCR. Los ligandos restantes se unen al receptor de integrina aVβ3 inmovilizándose eluyen por desnaturalización o mediante la adición de ligando de péptido que contiene RGD de alta afinidad en exceso. Las plantillas de ADN que codifican y dirigen la síntesis de los ligadores de integrina aVβ3 se amplifican por PCR utilizando un iniciador diseñado par unir a una región 3’ constante de la plantilla y un grupo de iniciadores biotinilados funcionalizados en su extremo 5’ con los materiales de partida de librería (Figura 44). La purificación de los completos de hebra biotinilados de un ciclo de traducción de molécula sintética, selección, y amplificación produce una subpoblación de plantillas de ADN enriquecidas en secuencias que codifican los ligandos de integrina aVβ3 sintéticos.

Por razones similares a aquellas que hacen el receptor de integrina αv β3 un blanco inicial atractivo para la aproximación para generar moléculas sintéticas con propiedades deseadas, el factor de serina proteasa Xa también sirve como un blanco de proteína promisorio. La coagulación de la sangre involucra una cascada de complejo de reacciones catalizadas con enzima que finalmente generan fibrina, la base de los coágulos sanguíneos (Rai et al. Curr. Med Chem. 2001, 8, 101-109; Vacca et al. Curr. Opin. Chem Biol. 2000, 4, 394-400). La trombina es una serina proteasa que convierte el fibrinógeno en fibrina durante la coagulación de la sangre. La trombina, a su vez, es generada por la acción proteolítica del factor Xa sobre protrombina. En razón a que las enfermedades tromboembolíticas (coagulación de la sangre) tal como los ataques permanecen como una causa principal de muerte en el mundo (Vacca et al. Curr. Opin. Chem Biol. 2000, 4, 394-400) el desarrollo de drogas que inhiban la trombina o el factor Xa es un área principal de la investigación farmacéutica. La inhibición del factor Xa es una nueva aproximación que se considera para evitar los efectos colaterales asociados con la inhibición de la trombina, que también esta involucrada en la hemostasis normal (Maignan et al. J. Med. Chem. 2000, 43, 3226-32; Leadley et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1999, 34, 791-9; Becker et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2753-8; Choi-Sledeski et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2539-44; Choi-Sledeski et al. J. Med. Chem. Lett. 1999, 42, 3572-87; Erwing et al. J. Med Chem. 1999, 42, 3557-71; Bostwick et al. Thromb Haemost 1999, 81, 157-60). Aunque muchos agentes incluyendo heparina, hirudina, e hirulog se han desarrollado para controlar la producción de trombina, estos agentes generalmente tienen las ventaja de requerir

inyección intravenosa o subcutánea varias veces al día además de los posibles efectos colaterales, y la búsqueda de inhibidores sintéticos Xa de factor de molécula pequeña permanece como el objeto de gran esfuerzo de la investigación

Entre los inhibidores de factor Xa con afinidades de unión conocidas están una serie de tripéptidos que finalizan con el aldehído arginina (Marlowe et al. Bioorg. Med Chem. Lett. 2000, 10, 13-16) que pueden ser fácilmente incluidos en la librería de péptido no natural moldeada con ADN de 15 nM a 60 μM (Marlowe et al. Bioorg. Med Chem. Lett. 2000, 10, 13-16) y por lo tanto suministra controles positivos ideales para validar y calibrar una selección in vitro para ligandos de factor Xa sintéticos (ver adelante). Tanto el factor Xa como el factor activo Xa inmovilizado sobre resina están comercialmente disponibles (Protein Engineering Technologies, Denmark).El factor de unión de resina Xa se utiliza para seleccionar miembros tanto de las librerías de péptido como bicíclicas no naturales moldeadas con ADN con afinidad por el factor Xa de una manera análoga al receptor a las selecciones que se une al receptor de integrina.

Luego de la amplificación PCR de los moldes de ADN que codifican las moléculas sintéticas seleccionadas, las rondas adicionales de traducción, selección, y amplificación son conducidas para enriquecer la librería por los ligadores de mas alta afinidad. La exigencia de la selección es gradualmente incrementada al incrementar la concentración de sal de los amortiguadores de unión y de lavado, disminuyendo la duración de la unión, elevando las temperaturas de unión y de lavado, e incrementando la concentración de los aditivos de lavado, tales como el ADN de molde o las proteínas no relacionadas. De manera importante, las selecciones in vitro también pueden seleccionar por la especificidad en la adición a la afinidad de unión. Para eliminar aquellas moléculas que poseen propiedades de unión indeseadas, los miembros de librería unidos a la integrina αv β3 inmovilizada o al factor Xa son lavados con proteínas no blanco tales como otras integrinas u otras serinas proteasas, dejando solamente aquellas moléculas que se unen a la proteína blanco pero no se unen a las proteínas no blanco.

Los ciclos iterados de traducción, selección, y amplificación dan como resultado un enriquecimiento de la librería en lugar de una evolución de la librería, lo que requiere la diversificación entre las rondas de selección. La diversificación de estas librerías sintéticas se logra en al menos dos formas, ambas análogas a los métodos utilizados por la naturaleza para diversificar proteínas. La mutagénesis de punto aleatorio es desarrollada al conducir la etapa de amplificación PCR bajo PCR propensas a error (Caldwell et al. PCR Methods Applic. 1992, 2, 28-33). En razón a que el código genético de estas moléculas se escribe para asignar codones relacionados a grupos químicos relacionaos, similares a la forma en que se construye el código genético de proteína natural, las mutaciones de punto aleatorio en los modos que codifican las moléculas seleccionadas diversificaran la progenie hacia los análogos químicamente relacionados. Además de la mutagénesis de punto, las librerías sintéticas en esta aproximación también se diversifican utilizando la recombinación. Los moldes al ser recombinados tiene la estructura mostrada en la figura 45, en la cual los codones se separan mediante sitios de clivaje de endonucleasa de restricción no palindrómica de base cinco tales como aquellos escindidos por Avall (G/GWCC, W = A o T), Sau961 (G/GNCC, N = A, G, T, o C), Ddel (C/cNAG), o hindi (G/ANTC). Luego de las selecciones, los moldes que codifican las moléculas deseadas son enzimáticamente digeridos con estas enzimas de restricción comercialmente disponibles. Los fragmentos digeridos son entonces recombinados en moldes intactos con ADN ligasa T4. En razón a que los sitios de restricción que separan los codones son no palindromicos, los fragmentos de molde solo pueden reensamblarse para formar moldes recombinados intactos (figura 45). La traducción moldeada con ADN de los moldes recombinados suministra moléculas pequeñas recombinadas. De esta manera, los grupos funcionales entre las moléculas pequeñas sintéticas con las actividades deseadas son recombinados de manera análoga a la recombinación de los residuos de aminoácido entre las proteínas en la naturaleza. Se apreciara bien que la recombinación explora el espacio de secuencia en una molécula mucho mas eficientemente que la mutagénesis de punto sola (Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284-90; Bogarad et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 2591-5; Stemmer, W. Nature 1994, 370, 389-391).

La evolución de la molécula pequeña utilizando mutaciones de recombinación ofrece dos ventajas potenciales sobre el simple enriquecimiento. Si la diversidad total de la librería es mucho menos que el número de moléculas hechas (típicamente 1012 a 1015), cada miembro posible de la librería esta presente al inicio de la selección. En este caso, la diversificación es aun útil por que las condiciones de selección casi siempre cambian en la medida de que las rondas de evolución progresan. Por ejemplo, las últimas rondas de selección probablemente serán conducidas bajo mayores exigencias, y pueden involucrar contra selecciones contra la unión de proteínas no blanco. La diversificación le da a los miembros de la librería que han sido descartados durante las rondas tempranas de selección la oportunidad de reaparecer en las últimas rondas bajo condiciones de selección alteradas en los cuales su ajuste relativo a otros miembros puede ser mayor. Además, es muy posible utilizar esta aproximación para generar una librería sintética que tenga una diversidad teórica mayor de 1015 moléculas. En este caso, la diversificación le permite a las moléculas que nunca existieron en la librería original emerger en las ultimas rondas de selecciones sobre la base de su similaridad para seleccionar las moléculas, similar a la manera en la cual la evolución de la proteína busca la bastedad de el espacio de secuencia de la proteína sobre el subconjunto pequeño en un momento.

Ejemplo 8: Caracterización de los Compuestos Evolucionados: Luego de rondas múltiples de selección, amplificación, diversificación, y traducción, las moléculas que sobreviven la selección se caracterizaran por su capacidad a unirse a la proteína blanco. Para identificar las secuencias de ADN que codifican las moléculas sintéticas evolucionadas que sobreviven la selección los moldes de PCR amplificado son clonados en vectores, transformados en células, y secuenciados como clones individuales. La secuenciación de ADN de estos moldes subclonados revela la

identidad de las moléculas sintéticas que sobreviven a la selección. Para ganar información general acerca de los grupos funcionales que son seleccionados durante las rondas de evolución, las poblaciones de molde son secuenciadas en grupos para revelar la distribución de A, G, T y C en cada posición del codón. El diseño juicioso de cada uno de los códigos genéticos de los grupos funcionales permite que sea reconectada información considerable de la secuenciación de la población. Por ejemplo, un G en la primera posición de un codón puede designar un grupo cargado, mientras que un C en esta posición puede codificar un sustituyente hidrófobo.

Para validar la selección de unión de integrina y comparar miembros de librería seleccionados con ligandos de integrina αv β3 conocidos, también están incluidos los análogos GRGDSPK lineal y RGDfV cíclico (cíclico iso-ERGDfV) en la librería de péptido cíclica moldeada con ADN. Las condiciones de selección se ajustan hasta verificación de que las librerías que contienen estos ligandos de integrina conocidos sufren enriquecimiento de moldes de ADN que codifican los ligandos conocidos luego de la selección para unión de integrina. Además, el grado de enriquecimiento de las secuencias de molde que codifican estos ligandos de integrina αv β3 conocidos están correlacionados con sus afinidades conocidas y con el enriquecimiento y afinidad de ligandos de integrina αv β3 recientemente descubiertos.

Una vez que el enriquecimiento de las secuencias de molde que codifican los ligandos conocidos y de nueva integrina se confirman, los ligandos novedosos evolucionados se sintetisarán mediante síntesis moldeada sin ADN y ensayada para su actividad y especificidad antagonista al receptor de integrina αv β3. Los ensayos estándar de unión in vitro a los receptores de integrina (Dechantsreiter et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033-40) son desarrollados al competir la unión de fibrinógeno biotinilado (1 ligando de integrina natural) a el receptor de integrina inmovilizado con el ligando a ser ensayado. La inhibición de la unión al fibrinógeno se cuantifica mediante la incubación con un anticuerpo anti biotina conjugado a fosfatasa alcalina y un sustrato de fosfato alcalino cromogénico. La comparación de las afinidades de unión de los miembros de librería aleatoriamente escogidos antes y después de la selección validará la evolución de la librería hacia la unión del blanco. Los ensayos para unir proteínas no blanco revelan la capacidad de estas librerías a ser evolucionadas hacia la especificidad de unión además de la afinidad de unión.

De manera similar, la selección para la unión del factor Xa es validada al incluir los inhibidores de tripéptido de factor Xa conocidos en el diseño de la librería y verificar que una ronda de la selección del factor Xa y la amplificación PCR de como resultado el enriquecimiento de sus moldes ADN asociados. Los miembros de librería sintéticos evolucionados para unir el factor Xa son ensayados in vitro por su capacidad para inhibir la actividad del factor Xa. La inhibición del factor Xa puede ser fácilmente ensayada espectrofotométricamente utilizando el sustrato cromogénico comercialmente disponible S-2765 (Chromogenix, Italy).

Aunque la secuencia de ADN sola de un miembro de librería de péptido no natural probablemente revele la identidad exacta del péptido correspondiente, la etapa final en la síntesis de librería bicíclica es una cicloadición 1,3-dipolar intramolecular moldeadas en ADN que puede producir pares diastereoméricos de regioisómeros. Aunque el modelamiento sugiere fuertemente que solo el regioisómero mostrado en la figura 38 se puede formar por razones estéricas, la selectividad facial es menos cierta. La pureza diastereomerica no se requiere para las elecciones in vitro descritas anteriormente en razón a que cada molécula se selecciona sobre una base de molécula simple. Sin embargo, se puede ser útil caracterizar la diastereoselectividad de la cicloadición bipolar. Para lograr esto, se desarrolla la síntesis moldeada sin ADN de los miembros de librería bicíclica seleccionada, los diastereómeros son separados mediante HPLC preparativo Quiral, y se determina la estequiometría de producto mediante difracción nOe o de rayos X.

Ejemplo 9: Traducción de ADN en Polímeros No Naturales Utilizando ADN Polimerasa: Una aproximación alternativa a traducir ADN en polímeros no naturales, evolucionables tiene la ventaja de la capacidad de algunas ADN de polimerasas a aceptar ciertos sustratos de nucleótido trifosfato modificado (D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556; D. M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377-91; T. Gourlain et al. Nucleic acids Res. 2001, 29, 1898-1905; S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73; K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int, Ed 1998, 37, 2872-2875). Varios desoxirribonucleótidos (figura 45) y ribonucleótidos que llevan modificaciones a los grupos que no participan en la unión de hidrogeno de Watson-Crick son conocidos por ser insertados con plantillas de ADN natural opuestas de alta fidelidad de secuencia. De manera importante, el ADN de hebra simple que contienen los nucleótidos modificados puede servir como plantillas suficientes para la incorporación catalizada de ADN polimerasa de nucleótidos naturales o modificados. En uno de los ejemplos anteriores de la incorporación de nucleótido modificado mediante ADN polimerasa, Toole y otros recortaron la aceptación de 5-(1-pentinil)-desoxiuridina 1 mediante ADN polimerasa Vent bajo condiciones PCR (J. A. Latham et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 2817-22). Varios derivados de desoxiuridinas 5-funcionalizadas adicionales (2-7) fueron subsecuentemente encontrados por ser aceptados por ADN polimerasa termoestables adecuadas para PCR (K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed 1998, 37, 2872-2875). La primer purina funcionalisada aceptada por la ADN polimerasa, el análogo desoxiadenosina 8, se incorporo en el ADN mediante la ADN polimerasa T7 junto con el análogo 7 desoxiuridina (D. M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377-91). Las librerías de ADN que contienen tanto 7 como 8 fueron sucesivamente seleccionadas para actividad de clivamiento de ARN independiente de metal (D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556-63). Williams y otros ensayaron recientemente varios derivados de desoxiuridina para la aceptación de ADN polimerasa Taq y concluyo que la aceptación es la mas grande cuando se utilizan uridinas C5 modificadas que llevan alquino rígido o grupos trans alqueno tales como 9 y 10 (S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73). Un estudio similar (T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898-1905) sobre las 7-deaza-desoxiadenosinas C7 funcionalisadas reveló la aceptación

de la ADN polimerasa Taq de 7-aminopropil- (11), cis-7-aminopropil- (12), y 7-aminopropinil-7-deazadesoxiadenosina (13).

Los nucleótidos funcionalizados incorporados por las ADN polimerasas hasta la fecha, mostrados en la figura 46, se han enfocado en agregar funcionalidades ácidas y básicas “similares a proteínas” al ADN. Aunque equipando los ácidos nucleicos con funcionalidad de ácido general y base general tal como los grupos de amina primaria y carboxilato se podrían incrementar la capacidad de los catalizadores de ácido nucleico, los grupos funcionales presentes en las bases de ácido nucleico naturales ya han demostrado la capacidad de servir como ácido y bases generales. La ribozima delta de hepatitis por ejemplo, se cree que utiliza la amina endocíclica modulada pKa-de la citosina 75 como un ácido general (S Nakano et al. Sciense 2000, 287, 1493-7) y la actividad de peptidil transferasa del ribosoma puede similarmente confiar en la catálisis de base general o ácido general (G. W. Muth et al. Sciencie 2000, 289, 947-50; P Nissen et al. Science 2000, 289, 920-930; N. Ban et al. Science 2000, 289, 905-920). Aunque el ultimo caso permanece como el objeto de un debate en desarrollo (N. Polacek et al. Nature 2001, 411, 498-501). Equipar las bases de ADN con ácidos Bronsted adicionales y grupos básicos, por lo tanto, puede no expandir profundamente el alcance de la catálisis de ADN.

Como contraste con la funcionalidad de ácido y base general simple, los centros quirales de metal expandirían considerablemente el alcance químico de los ácidos nucleicos. La funcionalidad objetivo al unir centros de metal químicamente potentes ya ha sido incorporada en los polímeros de ácido nucleico. El ADN natural ha demostrado una capacidad de doblarse en estructuras tridimensionales complejas capaces de unir estereoespecíficamente moléculas blanco (C. H Lin et al. Chem. Biol. 1997, 4, 817-32; C. H. Lin et al. Chem. Biol. 1998, 5, 555-72; P. Schultze et al. J. Mol. Biol. 1994, 235, 1532-47) o catalizando el fosfodiéster y uniendo la manipulación (S. W. Santoro et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4262-6; R. R. Breaker et al. Cheam. Biol. 1995, 2, 655-60; Y. Li et al. Biochemistry 2000, 39, 310614; Y. Li et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 2746-51). Depuración de ADN (T. L. Sheppard et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 2000, 97, 7802-7807) and porphyrin metallation (Y Li et al. Biochemistry 1997, 36, 5589-99; Lie et al. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743-7). Los ácidos nucleicos no naturales aumentaron con la capacidad de unir metales con agua químicamente potentes tales como Cu, La, Ni, Pd, Rh, Ru, o Sc podían poseer propiedades catalíticas grandemente expandidas. Por ejemplo, los oligonucleotidos que se unen a Pd doblados en una estructura bien definida podían poseer la capacidad de catalizar reacciones de acoplamiento mediadas por Pd con un alto grado de regioespecificidad o estereoespecificidad. De manera similar, los ácidos nucleicos no naturales que forman los sitios de unión Sc quiral pueden servir como cicloadición enantioselectiva acoplada con selecciones in vitro para actividades catalíticas que posibilitarían por lo tanto la devolución directa de los catalizadores deseados de las librerías aleatorias.

La evolución de los catalizadores en esta aproximación está dirigida a la dificultad de diseñar racionalmente sitios catalíticos activos con propiedades químicas especificas que han inspirado resientes aproximaciones combinatoriales

(K. W. Kuntz et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 313-319; M. B. Francis et al. Angew. Chem. Biol. 1998, 2, 422-8) para el descubrimiento de catalizadores organometálicos. Por ejemplo, Hoveyda y otros identificaron catalizadores de epoxidacion en enantioselectiva basados en Ti mediante selección en serie de ligandos de péptido (K. D. Shimizu et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36) la selección en serie también fue utilizada por Jacobsen y otros para identificar los ligandos de péptido que forman los catalizadores de epoxidacion en antioselectiva cuando se compleja con cationes de metal (M. B. Francis et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999,38, 937-941). Recientemente, una librería de péptidos que contiene cadenas laterales de fosfina fue seleccionada por la capacidad de catalizar la adición de éster de malonato a ciclopentenil acetato en la presencia de Pd (S. R. Gilbertson et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6522-6523). La aproximación habitual difiere fundamentalmente de los esfuerzos de descubrimiento de catalizador combinatoriales previos, sin embargo, por que ésta posibilita al catalizador con las propiedades deseadas de emerger espontáneamente de librerías de solución-fase de un pot después de ciclos de evolución de la diversificación, amplificación, traducción, y selección. Esta estrategia le permite hasta 1015 diferentes catalizadores ser generados y seleccionados por las propiedades deseadas en un experimento simple. La compatibilidad de nuestra aproximación con las selecciones in vitro de un pote permite la selección directa de los catalizadores de reacción en lugar de la selección de un fenómeno asociado con la catálisis tal como la unión o generación de calor. Además, las propiedades difíciles de seleccionar rápidamente tal como la estereoespecificidad del sustrato o la selectividad del metal pueden ser directamente seleccionadas utilizando nuestra aproximación (ver adelante).

Los intermedios clave para un número de análogos de uridina C5 funcionalizados y análogos de 7-deazaadenosina C7funcionalizados han sido sintetizados para la incorporación en polímeros de ADN no naturales. Además, se ha completado la síntesis de análogos de adenosina C8 funcionalizados como desoxirribonucleótidos tifosfatos. En razón a que existe solo información limitada sobre la capacidad de las ADN polimerasas a aceptar los nucleótidos modificados, nosotros escogimos sintetizar análogos que fueran sintetizados que no solamente llevaran funcionalidad de unión a metal a los ácidos nucleicos sino también suministraran interioridades en los determinantes de la aceptación de ADN polimerasa.

La estrategia para la síntesis de uridina que se une a metal y análogos de 7-desazaadenosina se muestra en la figura

47. Ambas rutas terminan con formación de unión de amida entre los esteres NHS de los grupos funcionales que se unen a metal y los desoxirribonucleótidos trifosfatos amino modificados (7 y 13). Los análogos 7 y 13 así como también los derivados acetilados de 7 han sido previamente mostrados (D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556

63; D. M. Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377-91; J. A. Latham et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 281722; T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898-1905; S.E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73; K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872-2875) para ser tolerado por las ADN polimerasas, incluyendo ADN polimerasas termoestables adecuadas para PCR. Esta aproximación convergente permite una amplia variedad de ligandos que se unen a metal que sean rápidamente incorporados en su análogo de nucleótido. La síntesis de 7 se ha completado luego de un ruta previamente reportada (K. Sakthivel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872-2875) (fig.48, Phillips, Chorba, Liu, unpublished results).El acoplamiento Heck de 5-yodo-2´-desoxiuridina (22) comercialmente disponible con N-aliltrifluoroacetamida suministrada 23. El grupo 5´-trifosfato se instalo mediante tratamiento de 23 con trimetilfosfato, POCl3 y esponja de protón (1,8-bis(dimetilamino)-naftaleno)seguido por tri-nbutilamonio pirofosfato, y el grupo trifluoroacetamida entonces removido con amonio acuoso para lograr 7.

Varias etapas hacia la síntesis de 13 se han completado, el intermedio clave para los análogos de 7-deazaadenosina (figura 49). Siguiendo una ruta conocida (J. Davoll. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 131-138) se sintetizo dietoxietilcianoacetato (24) de bromoacetal 25 y etil cianoacetato (26). La condensación de 24 con tiourea suministró pirimidina 27 que fue desfulzurisada con niquel Raney y luego ciclizada hasta pirrolopirimidina 28 con HCl acuoso diluido. El tratamiento de 28 con POCl3 logro 4-cloro-7-dezaadenina (29). El grupo aril yoduro que servirá como un compañero acoplante Sonogashira para la instalación de la amina propargilica en 13 se instaló al hacer reaccionar 29 con N-iodosuccinimida para generar 4-cloro-7-yodo-7-deazaadenina (30) con un rendimiento total del 13% de bromoacetal 25.

Como análogos funcionalizados alternativos que sondearán ambos los requisitos estructurales de la aceptación del ADN polimerasa y suministrar funcionalidad que se une a metal potencial, seis desoxiadenosina trifosfatos 8-modificado (Figura 50) han sido sintetizados. Todos los grupos funcionales fueron instalados mediante adición de 8-bromodesoxiadenosina (31), que se preparó mediante brominacion de desoxiadenosina en la presencia de ScCl3, que encontramos que incrementaba grandemente el rendimiento del producto. Metil (32), etil (33), y vinil adenosina (34) fueron sintetizadas mediante acoplamiento Stille mediado con Pd del correspondiente reactivo de alquil estaño y 31 (P. Mamos et al. Tetrahedron lett. 1992, 33, 2413-2416). Metilamino (35) (E. Nandanan et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 1625-1638), etilamino (36), e histaminoadenosina (37) se prepararon mediante tratamiento con 23 con la correspondiente amina en agua o etanol. Los 5´-nucleótido trifosfato de 32-37 fueron sintetizados como se describió anteriormente.

La capacidad de las ADN polimerasas termoestables adecuadas para amplificación PCR para aceptar estos trifosfatos de nucleótido modificado que contienen funcionalidad que se une a metal. Los trifosfatos de nucleótido no naturales fueron purificados mediante HPLC de intercambio de Ion y agregados a reacciones PCR que contienen ADN polimerasa Taq, tres trifosfatos desoxinucleotidos naturales, ADN de plantilla de pUC19, y dos iniciadores de ADN. Los iniciadores fueron escogidos para generar los productos PCR que varían de 50 a 200 pares base de longitud. Las reacciones del PCR de control contenían los cuatro desoxinucleotidos trifosfatos y ningún nucleótido no natural. Las reacciones PCR fueron analizadas mediante agarosa o electroforesis de gel de acrilamida desnaturalizante. El derivado de uridina aminomodificado 7 fue eficientemente incorporado mediante ADN polimerasa Taq sobre 30 ciclos PCR, aunque el trifosfato de 23 no fue un sustrato de polimerasa eficiente (Figura 51). Los hallazgos previos sobre la aceptación de 7 mediante ADN polimerasa Taq están en conflicto con ambos de no aceptación (K. Sakthivel. Et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 1998, 37, 2872-2875) y los de aceptación (S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73) reportados.

Síntesis de Desoxiribonucleotido Trifosfato que se Une a Metal no Natural: la síntesis de uridina C5-funcionalizada, 7deazaadenosina C7-funcionalizada, y adenosina desoxinucleotido trifosfatos C8 funcionalizados se completara. La síntesis de derivados de 7-deazaadenosina de 4-cloro-7-yodo deazaadenina (30) procede mediante glicosilación de 30 con cloruro de desoxiribosil protegido (38) seguido por amonolisis para lograr 7-yodo-adenosina (39) (Figura 31) (Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898-1905). El cloruro de desoxiribosil protegido (38) se puede generar de desoxirribosa como se muestra en la figura 52. El acoplamiento Sonogashira mediado por Pd (Seela et al. Helv. Chem. Acta 1999, 82, 1878-1898) de 39 con N-propiniltrifluoroacetamida suministra 40, que es luego convertido al 5´nucleótido trifosfato y desprotegido con amonio como se describió anteriormente para producir 13.

Para generar rápidamente una conexión de uridina que se une a metal y análogos de adenosina, una variedad de grupos que se une a metal como esteres NHS se acoplara al intermedio de uridina C5-modificado 7 (ya sintetizado) e intermedio de 7-deazaadenosina C7-modificada 13. Los grupos de unión que se unen a metal que serán examinados inicialmente se muestran en la Figura 47 e incluyen fosfinas, grupos tiopiridilo, y porciones de hemi-salen. Si nuestros ensayos de aceptación de polimerasa inicial (ver la siguiente sección) de trifosfatos de adenosinas 8-modificadas 32-37 (Figura 50) sugieren que una variedad de análogos de adenosina 8-modificada se acepta por las polimerasas termoestables, alquil y vinil trifluoroacetamidas serán acopladas a 8-bromo-deoxiadenosina (31) para generar trifosfatos de nucleótido tal como 41 y 42 (figura 53). Estos intermedios son entonces acoplados con los esteres NHS mostrados en la figura 46 para generar una variedad de trifosfatos desoxiadenosina 8-funcionalizados que se unen a metal.

Evaluacion de Nucleótidos No Naturales: Cada desoxirribonucleótido trifosfato funcionalisado es luego ensayado para su adecuabilidad como un bloque de construcción de una librería de polímero no natural evolucionable en dos etapas. Primero, la aceptación simple mediante ADN polimerasa termoestables se mide mediante amplificación PCR de

fragmentos de plásmido de ADN pUC19 de longitud variante. Las reacciones PCR contienen iniciadores sintéticos designados para unir en los extremos del fragmento una pequeña cantidad de ADN de plantilla de pUC19, una ADN polimerasa termoestable, (Taq, Pfu o Vent), tres desoxirribonucleótido trifosfato naturales, y los nucleótidos trifosfato no naturales para ser ensayados. La incorporación completamente exitosa de nucleótido no natural da como resultado la producción de productos de ADN de cualquier longitud en una proporción similar a aquella de la reacción de control. Aquellos nucleótidos que permiten al menos la incorporación de 10 o más nucleótidos no naturales en una molécula de producto simple con al menos eficiencia modesta son sometidos a la segunda etapa de evaluación.

Nucleótidos no naturales aceptados por ADN polimerasa termoestables son evaluados por sus posibles propiedades mutagénicas. Si las ADN polimerasas insertan un nucleótido no natural opuesto una base de plantilla incorrecta (nonWatson-Crick), insertan un nucleótido natural incorrecto opuesto a un nucleótido no natural en la plantilla, la fidelidad de la amplificación de librería y traducción está comprometida. Para evaluar esta posibilidad, los productos PCR generados en el ensayo anterior son sometidos a secuenciación de ADN utilizando cada uno de los iniciadores PCR. Las desviaciones de la secuencia de la plantilla pCU19 implican que uno o ambos de los mecanismos mutagénicos tienen lugar. Las proporciones de error de menos del 0.7% por base de 30 ciclos PCR son aceptables, en la medida en que el PCR propenso a error genera errores en aproximadamente esta proporción (Caldwell et al. PCT Methods Applic. 1992, 2, 28-33) habiendo sido exitosamente utilizado para evolucionar librerías de ácido nucleico.

Los pares de análogos de adenosina no natural promisorios y los análogos de uridina no natural también son ensayados juntos por su capacidad para soportar polimerización de ADN en una reacción PCR que contiene tanto los trifosfatos de nucleótido modificado junto con dGTP y dCPT. La formación de producto PCR exitosa con dos nucleótido trifosfatos no naturales posibilita la incorporación de dos bases que se unen a metal no naturales en la misma molécula de polímero. Los nucleótidos funcionalizados que son especialmente interesantes aun no son compatibles con AD polimerasa termoestables Taq, Pfu, o Vent pueden aun ser utilizados en las librerías suministradas que ellas son aceptadas por una ADN polimerasa comercialmente disponible tal como el fragmento Klenow de ADN polimerasa de E. coli l, ADN polimerasa T7, ADN polimerasa T4 o hanscriptasa inversa M-MuLV. En este caso, los ensayos requieren conducir la etapa de extensión iniciadora de la reacción PCR a 25-37º C, y se debe agregar polimerasa fresca en cada ciclo luego de la etapa de desnaturalización a 94º C. la secuenciación de ADN para evaluar las posibles propiedades mutagénicas de los nucleótidos no naturales se desarrolla aun como se describió anteriormente.

Generar Librerías de Polímeros que se Unen a Metal: con base en los resultados de los ensayos de nucleótido no natural anteriores, varias librerías de secuencia de ácido nucleico diferentes ∼1015 se harán conteniendo uno o dos de la polimerasa más compatible de los nucleótidos que se unen a metal no naturales químicamente promisorios. Las librerías son generadas mediante filtración amplificación PCR de una librería de molde de ADN sintético que consiste de una región aleatoria de 20 a 40 nucleótidos flanqueada por dos regiones iniciadoras constantes de 15 bases (Figura 54). Las regiones iniciadoras que contienen sitios de clivaje de endonucleasa de restricción para permitir la clonación en vectores para secuenciación de grupos de ADN o miembros de librería individuales. Un iniciador contiene un manejo químico tal como un grupo amina primario o un grupo tiol en su terminal 5´ y se convierte en una hebra codificante de la librería. Otro iniciador contiene un biotinilado T en su terminal 5´ y se vuelve una hebra no codificante. La reacción PCR incluye uno o dos desoxirribonucleótidos trifosfatos que se unen a metales no naturales, tres o dos desoxirribonucleótidos trifosfatos naturales y ADN polimerasa compatible con el o los nucleótidos no naturales. Luego de la reacción PCR para generar la forma de doble hebra de la librería y la purificación de gel para remover los iniciadores no utilizados, los miembros de librería duplex son químicamente desnaturalizados. Las hebras no codificantes son removidas mediante varios lavados con glóbulos magnéticos ligados a estreptavidina para asegurar que ninguna hebra biotinilada permanezca en la librería. Las librerías de hasta 1015 diferentes miembros son generadas mediante este método, excediendo de lejos la diversidad combinada de los esfuerzos de catalizador combinatorios previos.

Cada librería es luego incubada en solución acuosa con un metal de interés proveniente de la siguiente lista no limitante de sales de metal compatible en agua (Fringueli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439-455; Zaitoun et al. J. Phys. Chem. B 1997, 1857-1860): ScCl3, CrCl3, MnCl2, FeCl2, FeCl3, CoCl2, NiCl2, CuCl2, ZnCl2, GaCl3, YCl3, RuCl3, RhCl3, PdCl2, AgCl, CdCl2, lnCl2, La(OTf)3, Ce(OTf)3, Pr(OTf)3, Nd(OTf)3, Sm(OTf)3, Eu(OTf)3, Gd(OTf)3, Tb(OTf)3, Dy(OTf)3, Ho(OTf)3, Er(OTf)3, Tm(OTf)3, Yb(OTf)3, Lu(OTf)3, lrCl3, PtCl2, AuCl, HgCl2, HgCl, PbCl2, o BiCl3. Los metales son escogidos con base en las reacciones químicas específicas a ser catalizadas. Por ejemplo, las librerías destinadas a reacciones tales como consideraciones aldolo o reacciones Diles-Alder hetero que son conocidas (Fringuelli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439-455) para ser catalizadas mediante ácido Lewis son incubadas con ScCl3 o con uno de los triflatos de lantanido, aunque aquellos objetivos en las olefinas deficientes en electrón acoplante con haluro de arilos son incubadas con PdCl2. la librería metalada es luego purificada alejándose de las sales de metal no unidas mediante filtración de gel utilizando cartuchos de sefadex o acrilamida, que separan los oligonucleotidos de ADN 25 bases o mas de los componentes de molécula pequeña no unidos.

La capacidad de la librería de polímero (o los miembros de librería individuales) para unir metales de interés se verifica al tratar la librería metalizada libre de metales no unidos con reactivos de tensión de metal tales como ditiooxamida, dimetilglioxima, KSCN (Francis et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 422-8) o EDTA (Zaitoun et al. J. Phys. Chem. B 1997, 101, 1857-1860) que se colorean a manera distinta en la presencia de diferentes metales. El nivel aproximado de

unión de metal se mide mediante comparación espectrofotométrica con soluciones de metales libres de concentración conocida y con soluciones de oligonucleótidos recontrol positivo que contienen un grupo EDTA (que se puede introducir utilizando una fosforamidita comercialmente disponible de Glen Research).

Selecciones In Vitro para Catalizadores de Polímeros No Naturales: Las librerías metalizadas de polímeros no naturales evolucionables que contienen grupos que se unen a metal son sometidas a selecciones de solución-fase de un pote para actividades catalíticas de interés. Los miembros de librería que catalizan virtualmente cualquier reacción que origina la formación de enlace entre dos moléculas de sustito o que da como resultado una ruptura de enlace en dos moléculas de producto son seleccionados utilizando los esquemas propuestos en las figuras 54 y 55. Para seleccionar los catalizadores formadores de enlace por ejemplo, hetero Diles-Alder, acoplamiento Heck, reacción aldol, o catalizadores de metatesis de olefina) los miembros de librería son covalentemente ligados a un sustrato a través de sus terminales 5´ amino o tiol. El otro sustrato de la reacción se sintetiza como un derivado ligado a biotina. Cuando se diluyen las soluciones del conjugado librería-sustrato se hacen reaccionar con el conjugado de sustrato-biotina, aquellos miembros de librería que catalizan la formación de enlacé causan que el grupo biotina se una covalentemente a ellos mismos. Los catalizadores que forman enlace activo pueden ser entonces separados de los miembros de librería inactivos al capturar el anterior con estreptavidina inmovilizada y lavar los polímeros inactivos (Figura 55).

De una manera análoga los miembros de librería que catalizan las reacciones de clivaje de enlace tal como las reacciones de retro-aldol, hidrólisis de amida reacciones de eliminación, o dihidroxilacion de olefina seguido por clivaje de periodato también se pueden seleccionar. En este caso, los miembros de librería metalizada son covalentemente ligados a sustratos biotinilados de tal forma que la reacción de la ruptura del enlace origina la desconexión de la porción de biotina de los miembros de librería (Figura 56). Luego de la incubación bajo condiciones de reacción los catalizadores activos, pero ningún miembro de librería inactivo, induce la perdida de sus grupos biotina. Los glóbulos ligados a estreptavidina se pueden entonces utilizar para capturar polímeros inactivos, aunque los catalizadores activos son capaces de eludirse de los glóbulos. La formación de unión relacionada y las secciones de clivaje de enlace han sido utilizadas exitosamente en evolución de ARN y ADN catalítico (Jaschke et al. Curr. Opin. Chem Biol. 2000, 4, 25762) aunque estas selecciones no se seleccionan explícitamente para catálisis de cambio múltiple de sus porciones de sustrato (Jaschke et al. Curr. Opin. Chem Biol. 2000, 4, 257-62; Jaeger et al. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 14712-7; Bartel. Et al. Science, 1993, 261, 1411-8; Sen et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 680-7).

Los catalizadores de tres importantes y diversas reacciones formadoras de enlace serán inicialmente evolucionadas: el acoplamiento Heck, la cicloadición Diels-Alder hetero, y la adición aldol. Todas las tres reacciones son compatibles con agua (Kobayashi et al J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8287-8288; Fringuelli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439455; Li et al. Organic Reactions in Aqueous Media: Wiley and Sons: New York, 1997) y son conocidas por ser catalizadas por metales. Como los sustratos de acoplamiento Heck ambos deficientes en electrones y olefinas inactivadas serán utilizados juntos con los yoduros de arilo y los cloruros de arilo. Las reacciones Heck con los cloruros de arilo en solución acuosa, así como también las reacciones Heck a temperatura ambiente con cloruros de arilo no activados no han sido reportadas a nuestro conocimiento. Las librerías para la evolución del catalizador de acoplamiento Heck utiliza PdCl2 como una fuente de metal. Los sustratos Diels-Alder hetero incluyen dienos y aldeanos simples, mientras que los sustratos de adición aldol consisten de aldehídos y ambos éteres silil enol así como también cetonas simples. Los esquemas de selección representativos para el acoplamiento Heck, Diles-Alder hetero y los catalizadores de adición de aldol son mostrados en la figura 57. la exigencia de estas selecciones se puede incrementar entre rondas de selección al disminuir los tiempos de reacción, disminuyendo las temperaturas de reacción, o utilizando menos sustratos activados (por ejempolo, menos cloruros de arilo pobres en electrones (Littke et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6989-7000) o simples cetonas en lugar de silil enol éteres).

Polímeros No Naturales Evolucionantes: Diversificación y Selección, para Estereoespecificidad.

Luego de cada ronda de selección, los miembros de librería activos son amplificados mediante PCR con los nucleótidos no naturales y sometidos a rondas adicionales de selección para enriquecer la librería para los catalizadores deseados, estas librerías son realmente evolucionadas al introducir una etapa de diversificación antes de cada ronda de selección. Las librerías son diversificadas mediante mutagenesis aleatoria utilizando PCR propenso a error (Caldwell et al. PCR Methods Aplicc. 1992, 2, 28-33) o mediante métodos de purga de ADN modificado que recombinan fragmentos de ácido nucleico pequeños, no homólogos. En razón a que el PCR propenso a error es inherentemente menos eficiente que el PCR normal, la diversificación del PCR propenso a error se conducira solo con dATP, dTTp, dCTP, y dGTP natural y utilizaqndo iniciadores a los que les faltan manejos químicos o grupos de biotina. Los productos mutagenisados resultantes son luego sometidos a traducción PCR en polímeros de ácido nucleico no naturales que utilizan reacciones PCR estándar que contienen el o los nucleótidos no naturales, el iniciador biotinilado, y el iniciador amino o thiol terminado.

Además a simplemente evolucionar los catalizadores activos, las selecciones in vitro descritas anteriormente son utilizadas para evolucionar librerías de polímero no natural en reacciones potentes difíciles de lograr utilizando otras aproximaciones de descubrimiento de catalizador. Una característica posibilitante de estas selecciones es la capacidad de seleccionar los miembros de librería que son biotinilados o para miembros que no son biotinilados. La especificidad del sustrato entre los catalizadores puede por lo tanto ser evolucionada al seleccionar los catalizadores activos en la

presencia del sustrato deseado y luego seleccionar en el mismo pot para catalizadores inactivos en la presencia de uno

o más sustratos indeseados. Si los sustratos deseados o indeseados difieren mediante la configuración de uno o más estereocentros, los catalizadores enantioselectivos o diastereoselectivos pueden emerger de las rondas de selección. Similarmente, la selectividad de metal puede evolucionar al seleccionar los catalizadores activos en la presencia de metales deseados y seleccionar los catalizadores inactivos en la presencia de metales no deseados. Por el contrario, los catalizadores con amplia tolerancia de sustrato pueden evolucionar al variar las estructuras de sustrato entre rondas sucesivas de selección.

Finalmente, las observaciones de la síntesis de moldeado de ADN con secuencia especifica en DMF yCH2Cl2 sugiere que los complejos de cation de ADN-tetraalquilamonio pueden formar estructuras de pares base en solventes orgánicos. Este hallazgo eleva la posibilidad de evolucionar nuestro catalizador de ácido nucleico no natural en solventes orgánicos que utilizan versiones ligeramente modificadas de las selecciones descritas anteriormente. El actual enlace que forma reacciones de selección de Quilibaje de unión se conducirá en solventes orgánicos, las reacciones crudas serán precipitadas con etanol para remover los cationes de tetraalquilamonio, y la separación de avidina inmovilizada de miembros de librería biotinilada y no biotinilada en solución acuosa se desarrollara. La amplificación de PCR de miembros seleccionados tendrá lugar entonces como se describió anteriormente. La evolución exitosa de los catalizadores de reacción que funcionan en solventes orgánicos se expandiría considerablemente tanto el alcance de las reacciones que se puedan catalizar como la utilidad de los catalizadores de polímero no naturales evolucionados resultantes.

Polímeros no naturales evolucionados caracterizantes: las librerías sometidas a varias rondas de evolución son caracterizadas por su capacidad de totalizar las reacciones de interés tanto como grupos de secuencias mezcladas o como miembros de librería individuales. Los miembros individuales son extricados de grupos evolucionados al ligar secuencias amplificadas de PCR en vectores de ADN, transformar las soluciones diluidas de vectores ligados en células bacteriales competentes, y escoger colonias simples de transfonantes. Los ensayos de grupo o secuencias individuales son conducidos tanto en un formato de cambio simple como en un formato catalítico de cambio múltiple real. Para los ensayos de cambio simple, la velocidad a la cual el catalizador de formación de base ligado a sustrato efectuara su propia biotinilacion en la presencia de un sustrato biotinilado libre se medirá, o la velocidad a la cual los catalizadores de ruptura de enlace biotinilado efectuaran la perdida de sus grupos biotina. Múltiples ensayos de cambio son conducidos al incubar catalizadores evolucionados con pequeñas versiones de molécula de sustratos y analizar la velocidad de formación de producto mediante tlc, RMN, espectrometría de mas, HPLC, o espectrofotometría.

Una vez que los catalizadores de cambio múltiple son evolucionados y verificados por distintos métodos, los estudios mecanisticos detallados pueden ser conducidos sobre el catalizador. Las secuencias de ADN que corresponden al catalizador son reveladas mediante productos PCR de secuenciación o vectores de ADN que contienen las plantillas de catalizadores activos. Las preferencias de metal son evaluadas por catalizadores metalizantes con una amplia variedad de cationes de metal y medición de los cambios resultantes en la actividad. La especificidad del sustrato y la estereoselectividad de estos catalizadores es evaluada al medir las velocidades de cambio de una serie de análogos de sustrato. Las diaestereoselectividades y las enantioselectividades de la formación de producto son reveladas al comparar los productos de reacción con aquellos de estereoquímica conocidos. Los estudios previos sugieren que los sitios activos enterrados dentro de ambientes quirales grandes a menudo poseen altos grados de estereoselectividad. Por ejemplo, los catalizadores basados en péptido generados en aproximaciones combinatoriales han demostrado pobre a excelente estereoselectividades que se correlacionan con el tamaño del ligando de péptido. (Jarvo et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11638-11643) mientras que los catalizadores basados en ARN y los catalizadores basados en anticuerpo frecuentemente demuestran excelentes estéreoselectividades (Jaschke et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257-262; Seelig et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2000, 39, 4576-4579; Hilvert, D. Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 751-93; Barbas. Et al. Science 1997, 278, 2085-92; Zhong et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 3738-3741; Zhong et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8131-8132; List et al. Org. Lett. 1999, 1, 59-61) las selecciones directas de los sustratos estéreoselectivamente descritos anteriormente debe mejorar adicionalmente esta propiedad entre los catalizadores evolucionados.

Los estudios de función de estructura sobre los catalizadores evolucionados son mayor mente facilitados por la facilidad de la síntesis de ADN automatizada. Las modificaciones estructurales específicas de sitio son introducidas al sintetizar secuencias de ADN que corresponden a catalizadores “mutados” en cuyas bases de interés son cambiadas a otras bases. Cambiando las bases no naturales en un catalizador a una base natural (U* a C o A* a G) y ensayando los mutantes resultantes se pueden identificar los sitios de unión a metal químicamente importantes en cada catalizador. El polímero mínimo requerido para la catálisis eficiente se determina al sintetizar y ensayar progresivamente las versiones truncadas de los catalizadores activos. Finalmente, las estructuras tridimensionales de la mayoría de los catalizadores evolucionados de interés en complejos con metales son resueltas en colaboración con espectroscopistas RMN macromoleculares o cristalógrafos de rayos X.

Claims (46)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método in vitro para desarrollar síntesis moldeada de ácido nucleico en etapas múltiples, comprendiendo el método las etapas de:

   (a)suministrar, en una solución individual, (i) un molde que comprende una primera unidad reactiva covalentemente asociada con un primer oligonucleótido que define una pluralidad de diferentes secuencias de codones y que definen una primera secuencia de codón y, (ii) una pluralidad de diferentes unidades de transferencia que comprende una secuencia anticodón y una unidad reactiva, la cual incluye una primera unidad de transferencia que comprende una segunda unidad reactiva asociada covalentemente con un segundo oligonucleótido que define una primera secuencia anticodón complementaria a la primera secuencia de codón de la plantilla; y

   (b)reasociar del primer codón y las primeras secuencias anticodón para llevar la primera unidad reactiva y la segunda unidad reactiva en proximidad reactiva, induciendo por lo tanto una reacción entre la primera y segunda unidades reactivas para producir un producto de reacción independientemente de la maquinaria ribosómica, en donde el producto de reación no es un ácido nucleico.
2. 2. Un método para desarrollar síntesis moldeada de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas de:

   (1)

   producir una librería de compuestos por un método que comprende

   (a)

   suministrar (i) un molde amplificable que comprende una primera unidad reactiva asociada con un primer oligonucleótido que define una primera secuencia de codon, y (ii) una primer unidad de transferencia que comprende una segunda unidad reactiva asociada con un segundo oligonucleótido que define una secuencia anticodón complementeria a la primera secuencia de codón, y

   (b)

   reasociar las secuencias de codón y anticodón para llevar la primera unidad reactiva y la segunda unidad reactiva en proximidad reactiva, induciendo por tanto una reacción entre la primera y segunda unidades reactivas para producir un producto de reacción independientemente de la maquinaria ribosómica, en donde el producto de reación no es un ácido nucleico;

   (2)

   identificar a partir de la biblioteca un compuesto asociado con un molde que actúa para identificar el compuesto; y

   (3)

   amplificar el molde identificado en la etapa 2.

3. 3. Un método para desarrollar síntesis moldeada de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas de:

   (a)

   suministrar, en una solución individual, (i) un molde que comprende una primera unidad reactiva asociada con un primer oligonucleótido que define una pluralidad de diferentes secuencias de codones y que definen una primera secuencia de codón, (ii) una pluralidad de diferentes unidades de transferencia que comprende una secuencia anticodón y una unidad reactiva, la cual incluye una primera unidad de transferencia que comprende una segunda unidad reactiva asociada covalentemente con un segundo oligonucleótido que define una primera secuencia anticodón complementaria a la primera secuencia de codón de la plantilla; y

   (b)

   reasociar la primera secuencia de codón y la primera secuencia anticodón para llevar la primera unidad reactiva y la segunda unidad reactiva en proximidad reactiva, induciendo por lo tanto una reacción entre la primera y segunda unidades reactivas para producir un producto de reacción independientemente de la maquinaria ribosómica, en donde el producto de reación no es un ácido nucleico;

   (c)

   seleccionar un producto de reacción asociado con el molde; y

   (d)

   seleccionar la secuencia del molde para facilitar por tanto la identificación del producto de reacción.

4. 4.

   El método de la reivindicación 2, en donde el molde comprende adicionalemte una segunda, diferente secuencia de codón.

5. 5.

   El método de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente una segunda unidad de transferencia capaz de reasociarse a la segunda secuencia de codón diferente del molde.

6. 6.

   El método de la reivindicación 5, en donde la primera y segunda unidades de transferencia se proveen juntas en la etapa (a).

7. 7.

   El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa adicional de de seleccionar un producto de reacción asociado con el molde.

8. 8.

   El método de la reivindicación 7, en donde el producto de reacción es unido covalentemente al molde.

9. 9.

   El método de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente la etapa adicional de amplificar el molde.

10. 10.

    El método de la reivindicación 7, que comprende además la etapa adicional de determinar la secuencia del molde para facilitar de esta manera la identificación del producto de reacción.

11. 11.

    El método de la reivindicación 2, que comprende además la etapa adicional de determinar la secuencia del molde para facilitar de esta manera la identificación del producto de reacción.

12. 12.

    El método de la reivindicación 2 o reivindicación 3, en donde la primera unidad reactiva esta covalentemente unida al primer oligonucleótido.

13. 13.

    El método de la reivindicación 2, en donde la primera unidad reactiva esta no covalentemente unida al primer oligonucleótido.

14. 14.

    El método de la reivindicación 13, en donde la primer unidad reactiva está unida a el primer oligonucleótido por vía del tercer oligonucleótido que se hibridaza al primer oligonucleótido.

15. 15.

    El método de la reivindicación 2, en donde el molde es amplificado por una reacción en cadena de polimerasa.

16. 16.

    El método de la reivindicación 2, en donde el producto de reacción esta covalentemente unido al molde.

17. 17.

    El método de la reivindicación 2, en donde el producto de reacción esta no covalentemente unido al molde.

18. 18.

    El método de la reivindicación 3, en donde la primera unidad reactiva está unida no covalentemente al primer oligonucleótido.

19. 19.

    El método de la reivindicación 18, en donde la primera unidad reactiva está unida no covalentemente al primer oligonucleótido por vía de una secuencia de oligonucleótido que hibridaza al primer oligonucleótido.

20. 20.

    El método de la reivindicación 3, en donde el producto de reacción esta covalentemente unido al molde.

21. 21.

    El método de la reivindicación 3, que comprende además la etapa adicional de amplificar el molde.

22. 22.

    El método de la reivindicación 3, en donde la primera unidad reactiva comprende una molécula pequeña de andamio capaz de reaccionar con una pluralidad de reactivos.

23. 23.

    Un método para desarrollar síntesis moldeada de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas de:

    (a)

    suministrar (i) un molde que comprende una molécula pequeña de andamio asociada con un primer oligonucleótido que define una primera secuencia de codón y una segunda secuencia de codón diferente, comprendiendo la molécula pequeña de andamio una pluralidad de sitios para la modificación, (ii) una primera unidad de transferencia que comprende una primera unidad reactiva covalentemente unida a un segundo oligonucleótido que define una primera secuencia anti codón complementeria a la primera secuencia de codón, y (iii) una segunda unidad de transferencia que comprende una segunda unidad reactiva asociada con un tercer oligonucleótido que define una segunda secuencia anticodón capaz de fusionarse con la segunda secuencia diferente de codón del molde; y.

    (b)

    reasociar las secuencias de codón y las secuencias anticodón para poner la molécula pequeña de andamio y las unidades reactivas en proximidad reactiva, induciendo por lo tanto reacciones de formación de enlaces covalentes e independientemente de la maquinaria ribosómmica, en donde la molécula pequeña de andamio modificada no es un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico.

24. 24.

    El método de la reivindicación 23, en donde la molécula pequeña de andamio está covalentemente unida al primer oligonucleótido.

25. 25.

    El método de la reivindicación 23, que comprende además la etapa adicional de seleccionar una molécula pequeña de andamio modificada asociada con el molde.

26. 26.

    El método de la reivindicación 25, en donde la molécula pequeña de andamio modificada está covalentemente unida al molde.

27. 27.

    El método de la reivindicación 25, que comprende además la etapa de amplificar el molde.

28. 28.

    El método de la reivindicación 25, que comprende además la etapa de determinar la secuencia del molde para facilitar la identificación de la molécula pequeña de andamio modificada.

29. 29.

    El método de la reivindicación 27, que comprende además la etapa de determinar la secuencia del molde para facilitar la identificación de la molécula pequeña de andamio modificada.

30. 30.

    El método de la reivindicación 23, en donde la primera y segunda unidades de transferencia son suministradas juntas en la etapa (b).

31. 31.

    El método de la reivindicación 23, en donde la molécula pequeña de andamio es capaz de reaccionar con una pluralidad de reactivos.

32. 32.

    Un método para producir una pluralidad de productos de reacción en una solución simple, comprendiendo el método las etapas de:

    (a)

    suministrar, en una solución individual, (i) una pluralidad de moldes que comprende una pluralidad de primeras unidades reactivas asociadas con una pluralidad correspondiente de primeros oligonucleótidos, en donde cada primer oligonucleótido define almenos una secuencia de codón y (ii) una pluralidad de unidades de transferencia que comprende una pluralidad de segundas unidades reactivas covalentemente unidas a una pluralidad correspondiente de segundos oligonucleótidos, en donde los segundos oligonucleótidos definen cada uno una secuencia anticodón complementaria a una secuencia de codón; y

    (b)

    reasociar los oligonucleótidos que tienen secuencias de codón y anticodón complementarias para llevar la primera y segunda unidades reactivas en proximidad reactiva; induciendo por lo tanto reacciones que forman unión covalente entre las unidades reactivas independientemente de la maquinaria ribosómica para producir una pluralidad de diferentes productos de reacción, en donde los productos de reacción no son ácidos nucleicos.

33. 33.

    El método de la reivindicación 32, que comprende además la etapa de seleccionar un producto de reacción que tiene una propiedad deseada.

34. 34.

    El método de la reivindicación 33, en donde al menos un producto de reacción se une a una molécula blanco.

35. 35.

    El método de la reivindicación 32, en donde las primeras unidades reactivas asociadas con cada molde son diferentes.

36. 36.

    El método de la reivindicación 1, en donde uno de los oligonucleótidos comprende además un par de secuencias complementarias que se reasocian una con la otra para producir una horquilla.

37. 37.

    El método de la reivindicación 1, en donde la unidad reactiva está ligada por vía de un ligador al segundo oligonucleótido.

38. 38.

    El método de la reivindicación 1, en donde el producto de reacción permanece unido mediante un ligador al segundo oligonucleótido de la primera unidad de transferencia.

39. 39.

    El método de la reivindicación 37, en donde la priemra unidad de transferencia comprende un ligador que cuando se escinde no deja átomos sobre el producto de reacción.

40. 40.

    El método de la reivindicación 37, en donde la primera unidad de transferencia comprende un ligador que cuando se escinde deja un grupo químico sobre el producto de reacción.

41. 41.

    El método de la reivindicación 37, en donde el producto de reacción es automáticamente escindido del segundo oligonucleótido durante o después de la formación del producto de la reacción.

42. 42.

    El método de la reivindicación 1, en donde el molde es ADN o ARN.

43. 43.

    El método de la reivindicación 1, en donde al menos uno del molde y la unidad de transferencia es inmovilizado sobre una superficie.

44. 44.

    El método de la reivindicación 1, en donde la primera unidad reactiva y la segunda unidad reactiva reaccionan espontáneamente luego de la reasociación de los oligonucleótidos.

45. 45.

    El método de la reivindicación 1, en donde la primera unidad reactiva y la segunda unidad reactiva reaccionan luego de la exposición a un catalizador.

    5 46. El método de la reivindicación 1, en donde la primera unidad reactiva y la segunda unidad reactiva reaccionan en un solvente acuoso para producir un producto de reacción.
46. 47. El método de la reivindicación 1, en donde la primera unidad reactiva y la segunda unidad reactiva reaccionan en un solvente orgánico para producir un producto de reacción.