ES2271306T3 - Evolucion de una nueva funcion molecular. - Google Patents
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Abstract
un método para desarrollar síntesis moldeada de ácido nucleico, el método comprende las etapas de: (a) suministrar (i) un molde que comprende una primer unidad reactiva covalentemente asociada con un primer oligonucleótido que define una primer secuencia de codon, y (ii) una unidad de transferencia que comprende una segunda unidad reactiva asociada con un segundo oligonucleótido que define una primer secuencia anti codón complementaria a la primer secuencia de codón de la plantilla. (b) Reasociación del primer codón y las primeras secuencias anti codón para llevar la primer unidad reactiva y la segunda unidad reactiva en proximidad reactiva; (c) Introducir una reacción entre la primera y segunda unidades reactivas para producir un producto de reacción.
Description
Evolución de una nueva función molecular.
Esta solicitud reivindica la prioridad según el
35 U. S. C. \NAK 119 (e) a las solicitudes de patente
Provisionales Estadounidenses 60/277,081, presentada en Marzo 19,
2001, titulada "Síntesis Dirigida de Acido Nucleico de Compuestos
Químicos" 60/277, 094, presentada en Marzo 19, 200, titulada
"Enfoques Para Generar Nueva Función Molecular"; y 60/306, 691,
presentada en Julio 20,2001, titulada "Enfoque Para Generar Nueva
Función Molecular" y el contenido completo de cada una de estas
solicitudes se incorpora aquí como referencia.
El "Enfoque Químico" clásico para generar
moléculas con nuevas funciones se han utilizado extensivamente
durante el último siglo en aplicaciones que varían de
descubrimientos de drogas a metodología sintética a ciencia de
materiales. En este enfoque (Figura 1, negro), los investigadores
sintetizan o aíslan moléculas candidato, ensayan estos candidatos
para las propiedades deseadas, determinan las estructuras de
compuestos activos si se desconocen, se formulan relaciones de
actividad-estructura basado en el ensayo y los datos
estructurales, y luego se sintetiza una nueva generación de
moléculas diseñadas para poseer propiedades mejoradas. Mientras que
los métodos de la química combinatoria (ver, por ejemplo, A. V.
Eliseev and J. M. Lehn. Combinatorial Chemistry In Biology 1999,
243, 159-172; K. W. Kuntz, M. L. Snapper and A. H.
Hoveyda. Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3,
313-319; D. R. Liu and P. G. Schultz. Angew. Chem.
Intl. Ed. Eng 1999, 38, 36) han incrementado el rendimiento de este
enfoque, sus limitaciones fundamentales permanecen invariables.
Varios factores limitan la efectividad del enfoque químico para
generar la función molecular. Primero, nuestra capacidad para
predecir exactamente los cambios estructurales que conducirán a
nuevas funciones es a menudo inadecuado debido a las redisposiciones
conformacionales de tenues de las moléculas, interacciones de
solventes inesperadas, o requerimientos estereoquímicos desconocidos
de unión o eventos de reacción. La complejidad resultante de la
relación de actividad-estructura limita
frecuentemente el éxito del ligando racional o diseño de
catalizador, que incluye aquellos esfuerzos conducidos en una forma
de alto rendimiento. Segundo, la necesidad de probar o seleccionar o
tamizar, a diferencia de seleccionar, cada miembro de cada colección
de candidatos que limita el número de moléculas que se pueden buscar
en cada experimento. Finalmente, la falta de una vía para amplificar
moléculas sintéticas coloca los requerimientos en la cantidad mínima
de material que se debe producir para la caracterización, tamizado,
y elucidación de la estructura. Como un resultado, puede ser difícil
generar librerías de más de aproximadamente 10^{6} compuestos
sintéticos diferentes.
En contraste, la naturaleza genera proteínas con
nuevas funciones que utilizan un método fundamentalmente diferente
que supera muchas de estas limitaciones. En este evento (Figura 1
gris) una proteína con propiedades deseadas induce la supervivencia
y amplificaciones de la información que codifica esa proteína. Esta
información se diversifica a través de mutación espontánea y
recombinación de ADN, y luego se traslada en una nueva generación de
proteínas candidato utilizando la ribosoma. La energía de este
proceso es bien apreciada (ver, F. Arnold Acc. Chem. Res. 1998, 31,
125; F. H. Arnold et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3,
54-59; J. Minshull et al. Curr Opin. Chem.
Biol. 1999, 3, 284-90) y se evidencia por el hecho
de que las proteínas y ácidos nucleicos dominan las soluciones para
muchos problemas químicos complejos a pesar de su limitada
funcionalidad química. Claramente, diferente al enfoque químico
lineal descrito anteriormente, las etapas utilizadas por la
Naturaleza forman un ciclo de evolución molecular. Las proteínas que
emergen de este proceso se han seleccionado directamente, a
diferencia de simplemente tamizadas, para actividades deseadas.
Debido a la información que codifica las proteínas de evolución
(ADN) se pueden amplificar, una molécula de proteína sencilla con la
actividad deseada en teoría conducir a la supervivencia y
propagación del ADN que codifica su estructura. Las cantidades
pequeñas de material necesarias para participar en un ciclo de
evolución molecular permite librerías mucho más grandes en
diversidad diferente aquellas sintetizadas por enfoque químicos para
ser generados y seleccionados para la función deseada en volúmenes
pequeños.
Reconociendo el poder y eficiencia del enfoque
de la Naturaleza, los investigadores han utilizado la evolución
molecular para generar muchas proteínas y ácidos nucleicos con la
unión novedosa o propiedades catalíticas (ver, por ejemplo, J.
Minshull et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3,
284-90; C. Schmidt-Dannert et
al. Trends Biotechnol. 1999, 17, 135-6; D. S.
Wilson et al. Annu. Rev. Biochem. 1999, 68,
611-47). Las proteínas y ácidos nucleicos
evolucionadas por los investigadores han demostrado valor como
herramientas de investigación, diagnostico, reactivos industriales,
y terapéuticos y han expandido grandemente nuestro entendimiento de
las interacciones moleculares que dota las proteínas y ácidos
nucleicos con propiedades catalíticas o de unión (ver, M. Famulok
et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2,
320-7).
A pesar del enfoque eficiente de la naturaleza
para generar función, la evolución molecular de la naturaleza se
limita a dos tipos de moléculas "naturales"-proteínas y ácidos
nucleicos-debido por que la información en el ADN
solo se puede traducir en proteínas o en otros ácidos nucleicos. Sin
embargo, muchas moléculas sintéticas de interés no representan
estructuras de ácido nucleico en general, y el uso de la síntesis de
plantilla de ADN para traducir secuencias de ADN en moléculas
pequeñas sintéticas seria ampliamente útil solo si las moléculas
sintéticas diferentes de los ácidos nucleicos y análogos de ácidos
nucleicos se pudieran sintetizar en una forma de plantilla de ADN.
Un enfoque ideal para generar moléculas funcionales podría emerger
de los aspectos más potentes de la evolución molecular con la
flexibilidad de la química sintética. Claramente, permitiendo la
evolución de moléculas pequeñas sintéticas no naturales y polímeros,
de forma similar a la forma en que la naturaleza evoluciona las
biomoléculas, conduciría a métodos muchos más efectivos de descubrir
nuevos ligandos sintéticos, receptores y catalizadores difíciles o
imposibles de generar utilizando diseño racional.
El reconocimiento de la necesidad para ser capaz
de amplificar y evolucionar clases de moléculas a pesar de sus
ácidos nucleicos y proteínas conduce a la presente invención a
suministrar métodos y composiciones para la síntesis dirigida a
plantillas, amplificación y evolución de moléculas. En general,
estos métodos utilizan una plantilla evolucionable para dirigir la
síntesis de un compuesto químico o librerías de compuestos químicos
(es decir, la plantilla codifica actualmente la síntesis de un
compuesto químico). Basado en una librería codificada y sintetizada
utilizando una plantilla tal como un ácido nucleico, se suministran
métodos para amplificar, evolucionar, y tamizar la librería. En
ciertas modalidades de especial interés, los compuestos químicos son
compuestos que no son, o no semejan, ácidos nucleicos o análogos de
estos. En ciertas modalidades, los compuestos químicos de estas
librerías combinatorias codificadas con plantilla son polímeros y
más preferiblemente son poliedros no naturales (es decir que
excluyen péptidos naturales, proteínas y polinucleótidos). En otras
modalidades, los compuestos químicos son moléculas
pequeñas.
pequeñas.
En ciertas modalidades, el método de sintetizar
un compuesto o librerías de compuestos comprende suministrar primero
uno o más plantillas de ácido nucleico, tal una o más plantillas de
ácido nucleico tienen opcionalmente una unidad reactiva asociada a
estas. Las plantillas de ácido nucleico se ponen en contacto luego
con una o más unidades de transferencia diseñadas para tener una
primera porción, un anti-codón, que hibridiza a una
secuencia del ácido nucleico, y se asocia con una segunda porción,
una unidad reactiva, que incluye un bloque de construcción del
compuesto a ser sintetizado. Una vez estas unidades de transferencia
han hibridizado a la plantilla de ácido nucleico en una forma de
secuencia especifica, la síntesis del compuesto químico puede tener
lugar debido a la interacción de porciones reactivas presentes en
las unidades de transferencia y/o la plantilla de ácido nucleico.
Significativamente, la secuencia del ácido nucleico puede luego ser
determinada para decodificar la historia sintética del compuesto
adherido y por lo tanto su estructura. Se apreciara que el método
descrito aquí se puede utilizar para sintetizar una molécula a la
vez o se pude utilizar para sintetizar miles a millones de
compuestos que utilizan métodos combinatorios.
Se apreciara que las librerías sintetizadas de
esta forma (es decir, que han sido codificadas por ácido nucleico)
tienen la ventaja de ser amplificables y evolucionables. Una vez se
identifica la molécula, su plantilla de ácido nucleico a pesar de
actuar como etiqueta utilizada para identificar el compuesto
adherido también se puede amplificar utilizando técnicas de ADN
estándar tal como la reacción de cadena de polimerasa (PCR). El
ácido nucleico amplificado puede luego ser utiliza para sintetizar
más el compuesto deseado. En ciertas modalidades durante la etapa de
amplificación se introducen mutaciones en el ácido nucleico con el
fin de generar una población de compuestos químicos que se
relacionan con el compuesto pariente pero se modifican en uno o más
sitios. Los ácidos nucleicos mutados pueden luego ser utilizados
para sintetizar una nueva librería de compuestos relacionados. De
esta forma, la librería que se selecciona puede ser evolucionada
para contener más compuestos con la actividad deseada o para
contener compuestos con un grado mayor grado de actividad.
Los métodos de la presente invención se pueden
utilizar para sintetizar una amplia variedad de compuestos químicos.
En ciertas modalidades, los métodos se utilizan para sintetizar y
evolucionar polímeros no naturales (es decir, que excluyen
polinucleótidos y péptidos), que no se pueden amplificar y
evolucionar utilizando técnicas estándar actualmente disponibles. En
ciertas otras modalidades, los métodos inventivos y composiciones se
utilizan para la síntesis de moléculas pequeñas que no son
típicamente poliméricas. En todavía otras modalidades, el método se
utiliza para la generación de polímeros de ácido nucleico no
naturales.
La presente invención también suministra las
moléculas de transferencia (por ejemplo, plantilla de ácido nucleico
y/o unidades de transferencia) útiles en la práctica de los métodos
inventivos. Esas moléculas de transferencia incluyen típicamente una
porción capaz de hibridizar a una secuencia de ácido nucleico y una
segunda porción con monómeros, otros bloques de construcción, o
reactivos a ser incorporados en el compuesto final que se sintetiza.
Se apreciara que alas dos porciones de la molécula de transferencia
se asocian preferiblemente con otra ya sea directamente o a través
de una porción ligadora. También se apreciara que la unidad reactiva
y el anti-codón pueden estar presente en la misma
molécula (por ejemplo, un nucleótido no natural que tiene
funcionalidad incorporada en este).
La presente invención también suministra kits y
composiciones útiles en la práctica de los métodos inventivos. Estos
kits pueden incluir plantillas de ácido nucleico, moléculas de
transferencia, monómeros, solventes, amortiguadores, enzimas,
reactivos para PCR, nucleótidos, andamios de molécula pequeña, etc.
El kit se puede utilizar en la síntesis de tipo particular de
polímero no natural o molécula pequeña.
El término anticuerpo se refiere a una
inmunoglobulina, ya sea natural o completa o parcialmente producida
de forma sintética. Todos los derivados de esta que mantienen
capacidad de unión específica también se incluyen en el término. El
término también cubre cualquier proteína que tiene un dominio de
unión que es homólogo o grandemente homólogo para un dominio de
unión de inmunoglobulina. Estas proteínas se pueden derivar de
fuentes naturales o producidas parcial o completamente de forma
sintética. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El
anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de
inmunoglobulina, que incluye cualquiera de las clases humanas: IgG,
IgM, IgA, IgD, y IgE. Los derivados de la clase igG, sin embargo, se
prefieren en la presente invención.
El término, asociado con, se utiliza para
descubrir la interacción entre dos o más grupos, porciones,
compuestos, monómeros, etc. Cuando dos o más entidades "se asocian
con" otra como se describe aquí, ellas se enlazan mediante una
interacción indirecta o directa covalente o no covalente.
Preferiblemente, la asociación es covalente. La asociación covalente
puede ser a través de una amida, ester,
carbón-carbón, disulfuro, carbamato, éter, o enlace
carbonato. La asociación covalente también puede incluir una porción
ligadora tal como un ligador fotofotoclivable. Interacciones no
covalentes deseables incluyen unión por hidrogeno, interacciones van
der Waals, interacciones hidrófobas, interacciones magnéticas,
interacciones electrostáticas, etc. También, dos o más entidades o
agentes "asociar" con otra al estar presente juntas en la misma
composición.
Una macromolécula biológica es un polinucleótido
(por ejemplo, ARN, ADN, hibrido ARN/ADN), proteína, péptido, lípido,
producto natural, o polisacárido. La macromolécula biológica puede
ser de ocurrencia natural o de ocurrencia no natural. En una
modalidad preferida, una macromolécula biológica tiene un peso
molecular mayor de 500 g/mol.
El polinucleótido, ácido nucleótido, u
oligonucleotido se refiere a un polímero de nucleótidos. El polímero
puede incluir nucleosidos naturales (es decir, adenosina, timidina,
guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina,
desoxiguanosina, y desoxicitidina), análogos de nucleosido (por
ejemplo, 2-aminoadenosina,
2-tiotimidina, inosina,
pirrolo-pirimidina, 3-metil
adenosina, 5-metilcitidina,
C5-bromouridina, C5-fluorouridina,
C5-yodouridina,
C5-propinil-uridina,
C5-propinil-citidina,
C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina,
7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina,
8-oxoguanosina,
O(6)-metilguanina, y
2-tiocitidina), bases modificadas químicamente,
bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas),
bases intercaladas, azucares modificados (por ejemplo,
2'-fluororibosa, ribosa,
2'-desoxiribosa, arabinosa, y hexosa), o grupos
fosfatos modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces
5'-N-fosforamidita).
Una proteína comprende un polímero de residuos
de aminoácidos ligados juntos por enlaces péptido. El término, como
se utiliza aquí, se refiere a proteínas, polipéptidos, y péptidos de
cualquier tamaño, estructura, o función. Típicamente, una proteína
será al menos de tres aminoácidos de larga. Una proteína se puede
referir a una proteína individual o una colección de proteínas. Una
proteína se puede referir a una proteína de longitud completa o un
fragmento de una proteína. Proteínas de la invención preferiblemente
solo contienen aminoácidos naturales, aunque aminoácidos no
naturales (es decir, compuestos que no ocurren en la naturaleza pero
que se pueden incorporar en una cadena de polipéptido; ver, por
ejemplo,
http://www.cco.caltech.edu/\simdadgrp/Unnatstruct.gif, que
muestra estructuras de aminoácidos no naturales que se han
incorporado exitosamente en canales de ión funcionales) y/o análogos
de aminoácidos como son conocidos en la técnica que pueden ser
empleados alternativamente. También, uno o más de los aminoácidos en
una proteína inventiva se pueden modificar, por ejemplo, mediante la
adición de una entidad química tal como un grupo carbohidrato, un
grupo hidroxilo, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo
isofarnesilo, un grupo de ácido graso, un ligador para conjugación,
funcionalización, u otra modificación, etc. Una proteína también
puede ser una molécula sencilla o puede ser un complejo
multimolecular. Una proteína puede ser solo un fragmento de una
proteína de ocurrencia natural o péptido. Un proteína puede ser de
ocurrencia natural, recombinante, o sintética o cualquier
combinación de estas.
El término molécula pequeña, como se utiliza
aquí, se refiere a un compuesto orgánico no peptídico, no
oligomerico ya sea sintetizado en el laboratorio o encontrado en la
naturaleza. Moléculas pequeñas como se utiliza aquí, se puede
referir a compuestos que son "de producción natural", sin
embargo, el término "molécula pequeña" no se limita a
compuestos "como producto natural". Por el contrario, una
molécula pequeña se caracteriza típicamente en que esta posee una o
más de las siguientes características que incluyen tener varios
enlaces carbono-carbono, que tienen múltiples
estereocentros, que tienen múltiples grupos funcionales, que tienen
al menos dos tipos diferentes de grupos funcionales, y que tienen un
peso molecular de menos de 1500, aunque esta caracterización no se
pretende se limita para los propósitos de la presente invención.
El término andamio de molécula pequeña, como se
utiliza aquí se refiere a un compuesto químico que tiene al menos un
sitio para funcionalización. En una modalidad preferida, el andamio
de molécula pequeña puede tener una multitud de sitios para
funcionalización. Estos sitios de funcionalización se pueden
proteger o enmascarar como lo apreciaría un experto en la técnica.
Los sitios también se pueden encontrar en una estructura de anillo
subyacente o estructura.
El término unidad de transferencia, como se
utiliza aquí, se refiere a una molécula que comprende una porción
anti-codón asociada con una unidad reactiva, que
incluye, pero no está limitada a un elemento básico, monómero,
unidad de monómero, o reactivo utilizado en sintetizar las moléculas
de ácido nucleico codificadas.
La Figura 1 describe el enfoque de la naturaleza
(gris) y el enfoque químico clásico (negro) para generar la función
molecular.
La Figura 2 describe ciertas reacciones de
plantilla ADN para ácidos nucleicos y análogos de estos.
La Figura 3 describe el método general para
sintetizar un polímero utilizando síntesis de plantilla de ácido
nucleico.
La Figura 4 muestra un conjunto de codón de
cuadro sin cuadro de cambio de tripleta y cuádruplo. Cada conjunto
suministra nueve codones posibles.
La Figura 5 muestra métodos de tamizar una
librería catalizador de formación de unión y
clivaje-unión. Estos métodos toman ventaja de la
afinidad natural de la estreptavidina para biotina.
La Figura 6A describe la síntesis dirigida por
plantillas de ADN de horquilla (H) y de final de hélice (E). Se
analizan las reacciones por desnaturalización del PAGE después de
los tiempos de reacción indicados. Las plantillas contenidas en las
líneas 3 y 4 se apagan con exceso de
\beta-mercaptoetanol antes de reacción.
La Figura 6B describe reactivos ajustes (M) o
desajustes (X) ligado a tioles (S) o a aminas primarias (N) se
mezclan con un equivalente de plantilla funcionalizada con la
variedad de electrófilos mostrados. Las reacciones con reactivos
tiol se conducen en pH 7.5 bajo las siguientes condiciones: SIAB y
SBAP: 37°C, 16 h; SIA: 25°C, 16 h, SMCC, GMBS, BMPS, SVSB: 25°C, 10
min. Se conducen reacciones con reactivos amina a 25ºC pH 8.5
durante 75 minutos.
La Figura 7 describe (a) plantillas H ligadas
con un grupo yodoacetamida que se reaccionan con reactivos tiol que
contienen 0, 1, o 3 desajustes a 25ºC. (b) las reacciones en (a) se
repiten a la temperatura indicada durante 16 h. El reactivo
calculado Tm: 38ºC (ajustado), 28ºC (desajuste único).
La Figura 8 describe una reacción desarrollada
utilizando una plantilla E base 41 y un reactivo base 10 diseñado
para hibridizar 1-30 bases del extremo 5' de la
plantilla. Los perfiles cinéticos en la gráfica muestran el promedio
de dos ensayos (desviación <10%). El reactivo "n = 1 mis"
contiene tres desajustes.
La Figura 9 describe la reacción n= 10 repetida
en la Figura 8 en la que nueve bases luego del
5'-NH2-dT se remplazan con análogos
de estructura mostrados. Cinco equivalentes de un oligonucleótido de
ADN complementario al intervenir bases se agrega a la reacción
"ADN + clamp". Los reactivos se (o) o contiene tres desajustes
(3). El gel muestra las reacciones a 25ºC después de 25 min.
La Figura 10 describe las reacciones (mis) de
desajuste n = 1, n = 10, y n = 1 descritas en la Figura 8 que se
repiten con las concentraciones de reactivo y plantilla de 12.5, 25,
62.5 o 125 nM.
La Figura 11 describe un modelo de traducción,
selección y amplificación de moléculas sintéticas que se unen a la
estreptavidina a partir de una librería codificada por ADN.
La Figura 12 describe (a) líneas 1 y 5: PCT:
librería amplificada antes de selección por unión de estreptavidina.
Las líneas 2 y 6: librería amplificada PCR después de selección.
Líneas 3 y 7: plantilla que codifica biotina autentica amplificada
PCR. Línea 4: escala bp 20. LAs líneas 5-7 se
digieren con Tsp45I. Las trazas de secuencia de ADN de las
plantillas amplificadas antes y después de selección también se
muestran, junto con las secuencias de las plantillas que codifican
biotina y que codifican no biotina. (b) esquema general para la
creación y evolución de librerías de moléculas no naturales que
utilizan síntesis de plantilla de ADN, en donde -R_{1} representa
la librería de producto de funcionalidad transferida partir de la
librería de reactivo 1 y -R_{1B} representa un producto
seleccionado.
La Figura 13 describe reacciones de plantilla de
ADN de ejemplo. Para todas las reacciones de acuerdo a condiciones
específicas, los rendimientos de producto de las reacciones con
plantilla de ajuste y secuencias de reactivo fueron mayores que 20
veces más que aquellas reacciones de control con secuencias de
reactivo revueltas. Las reacciones se conducen a 25ºC con un
equivalente cada uno de plantilla y reactivo en concentración final
de 60 mM a menos que se especifique otra cosa. Condiciones: a) 3 mM
NaBH_{3}CN, 0.1 M de MES amortiguador pH 6.0, 0.5 M de NaCl, 1.5
h; b) 0.1 M de TAPS amortiguador pH 8.5, 300 mM de NaCl, 12 h; c)
0.1 M pH 8.0 de TAPS amortiguador, 1 M de NaCl, 5°C, 1.5 h; d) 50 mM
de MOPS amortiguador pH 7.5, 2.8 M de NaCl, 22 h; e) 120 nM 19,1.4
mM de Na_{2}PdCl_{4}, 0.5 M NaOAc amortiguador pH 5.0,18 h; f)
Premezcla de Na_{2}PdCl_{4} con dos equivalentes de P
(p-SO_{3}C_{6}H_{4})_{3} en agua 15
min., luego agrega a los reactivos en 0.5 M de NaOAc amortiguador pH
5.0, 75 mM NaCl, 2 h (final [Pd] = 0.3 mM, [19] = 120 nM). La
geometría de olefina de productos de 13 y las regioquímicas de
productos de clicloadición de 14 y 16 se presumen pero no se
verifican.
La Figura 14 describe el análisis por
desnaturalización de poliacrilamida por electroforesis de gel de
reacciones de plantilla de ADN representativas listadas en las
figuras 13 y 15. Las estructuras de reactivos y plantillas
corresponde al número en las figuras 13 y 15. Las líneas 1, 3, 5, 7,
9, 11: de reacción de reactivos de desajuste (complementario) y
plantillas bajo las condiciones listadas en las figuras 13 y 15 (la
reacción en 4 y 6 se media por el DMT-MM). Las
líneas 2, 4, 6, 8, 10, 12: reacción de reactivos de desajuste (no
complementarios) y plantillas bajo condiciones idénticas a aquellas
en las líneas 1, 3, 5, 7, 9, y 11, respectivamente.
La Figura 15 describe la formación de enlace de
amida de plantilla ADN por EDC y sulfo-NHS o por
DMT-MM para una variedad de ácidos y amina
carboxílicos sustituidos. En cada fila, los productos de reacción
mediada por DMT-MM entre los reactivos y plantillas
complementarias en secuencia son seguidas por los productos del EDC
y las reacciones mediadas por sulfa-NHS.
Condiciones: plantilla 60 nM, reactivo 120 nM,
DMT-MM 50 mM en 0.1 M de amortiguador MOPS pH 7.0, 1
M NaCl, 16 h, 25°C; o plantilla 60 nM, reactivo 120 nM, EDC 20 mM,
sulfo-NHS 15 mM, amortiguador MES 0.1 M pH 6.0, NaCl
1 M, 16 h, 25°C. en todos los casos, las reacciones de control con
las secuencias de reactivo de desajuste producen poco o ningún
producto detectable.
La Figura 16 describe (a) modelo conceptual para
la síntesis de plantilla de ADN de distancia independiente. Como la
distancia entre las grupos reactivos de un reactivo hibridizado y la
plantilla (n) se incrementa, el índice de formación de unión se
presume se reduce. Para aquellos valores en los que n en los que
índice de formación de enlace es significativamente mayor que el
índice de hibridación de reactivo-plantilla, el
índice de formación de producto permanece constante. En ester
régimen, la reacción de plantilla ADN muestra la independencia de
distancia. (b) la desnaturalización de electroforesis de gel de
poliacrilamida de una olefinación intencional de plantilla de ADN
entre las bases complementarias 11 y 13 con la base cero (líneas
1-13) o diez bases (líneas 4-6) que
separan los reactivos hibridizados. Aunque las constantes de índice
de segundo orden evidentes para las reacciones n=0 y n= 10 difiere
por tres veces (kapp (n=0) = 9.9 x 10_{3} M^{-1} s^{-+}
mientras que kapp (n = 10) = 3. 5 x 10^{3} M^{-1}s^{-1}), el
rendimiento del producto después de 13 h a ambas distancias fue
cercanamente cuantitativo. Las reacciones de control que contienen
desajustes de secuencia no producen rendimientos detectables (no
mostrados).
La Figura 17 describe ciertas reacciones de
construcciones de complejidad de plantilla de ADN.
La Figura 18 describe ciertos ligadores de
ejemplo para uso en el método de la invención.
La Figura 19 describe ciertos ligadores de
ejemplo adicional para uso en el método de la invención.
La Figura 20 describe un ligador de tioéster de
ejemplo para uso en el método de la invención.
La Figura 21 describe reacciones de formación de
unión de amida de plantilla de ADN en la que los reactivos y
plantillas son complejos con cationes de dimetildidodecilamonio.
La Figura 22 describe el ensamble de unidades de
transferencia junto con la plantilla de ácido nucleico y
polimerización de las porciones anticodón de nucleótido.
La Figura 23 describe la polimerización de las
unidades de dicarbamato junto con la plantilla de ácido nucleico
para formar un policarbamato. Para iniciar la polimerización el
monómero "inicio" que termina en un
o-nitrobencilcarbamato se fotodesprotege para
revelar las amina primaria que inicia la polimerización de
carbamato. Luego la polimerización procede en la dirección 5' a 3'
junto con la estructura de ADN, que cada ataque nucleofílico que
resulta en el descubrimiento posterior de un nucleófilo amina nuevo.
El ataque del monómero "parada" libera una acetamida diferente
de una amina, terminando por lo tanto la polimerización.
La Figura 24 describe el clivaje del
policarbamato a partir de la estructura de nucleótido. Las
desililación del ligador enol éter que une la porción anticodón a la
unidad de monómero y la elimiNaClón de fosfato dirigida por la
liberación resultante de suministros de fenol que provee el
policarbamato ligado covalentemente en su terminal carboxi para su
ADN de hebra sencilla codificado.
La Figura 25 describe componentes de una
librería de ácido nucleico de péptido funcionarizado evolucionable
amplificable.
La Figura 26 describe reactivos de ensayo
utilizado para optimizar reactivos y condiciones para acoplamiento
de PNA de plantilla de ADN.
La Figura 27 describe un conjunto simple de
monómero de PNA derivados de elementos fundamentales disponibles
comercialmente útiles para evolucionar un sensor Ni^{2+}
fluorescente basado en PNA.
La Figura 28 describe dos esquemas para la
selección de un PNA funcionalizado biotin-terminado
capaz de catalizar una reacción de aldol o retroaldol.
La Figura 29 describe la síntesis dirigida a
plantilla de ADN de una librería de molécula pequeña
combinatoria.
La Figura 30 muestra esquemáticamente como los
andamios de molécula pequeña ligadas con ADN se pueden funcionalizar
específicamente por secuencia mediante la reacción con reactivos
sintéticos ligados a oligonucleótidos de ácido nucleico
complementarios, este proceso se puede repetir para completar las
transformaciones sintéticas que conducen a una molécula
funcionarizada.
La Figura 31 muestra la funcionalización de un
andamio de molécula pequeña de cefalosporina con varios
reactivos.
La Figura 32 describe una forma de medir la
proporción de reacción entre un nucleófilo fijo y un electrófilo
hibridizado en distancias variantes junto con una plantilla de ácido
nucleico para definir una ventana de reacción esencial en la que la
síntesis de plantilla de ácido nucleico de estructuras no
poliméricas puede tener lugar.
\newpage
La Figura 33 describe tres estrategias ligadoras
para síntesis de plantilla de ADN. En la estrategia del ligador de
autoclivado, el enlace que conecta el producto del reactivo
oligonucleótido se cliva como una consecuencia natural de la
reacción. En las estrategias ligadoras de marcas útiles, y sin
marcas, este enlace se cliva siguiendo la reacción de plantilla de
ADN. Las reacciones descritas se analizan al desnaturalizar por
electroforesis de gel de poliacrilamida (adelante). Las líneas
1-3 se visualizan utilizando UV sin teñido de ADN;
las líneas 4-10 se visualizan al teñir con bromuro
de etidio luego por transilumiNaClón UV. Condiciones: 1 a 3 un
equivalente cada reactivo y plantilla, 0.1 M de amortiguador TAPS pH
8.5, 1 M NaCl, 25°C, 1.5 h; 4 a 3 equivalentes de 4, 0.1 M
amortiguador MES pH 7.0, 1 M NaNO_{2}, 10 mM AgNO_{3}, 37°C, 8
h; 8 a 9: 0.1 M amortiguador CAPS pH 11.8, 60 mM BME, 37°C, 2 h; 11
a 12: 50 mM de NalO_{4} acuoso, 25°C, 2 h. R_{1} =
NH(CH_{2})_{2}NH-dansil; R_{2} =
biotina.
La Figura 34 describe estrategias para purificar
productos de síntesis de plantilla de ADN. Utilizando reactivos
biotinilados de oligonucleótidos, productos que se dan a partir de
un ligador de autoclivado se purifican parcialmente al lavar la
reacción cruda con glóbulos ligados de avidina (superior). Los
productos generados de reacciones de plantilla de ADN que utilizan
los ligadores de marcas útiles o sin marca se pueden purificar al
utilizar oligonucleótidos de reactivos biotinilados, que capturan
los productos de reacción crudos con glóbulos ligados con avidina y
eluir los productos deseados a al inducir clivaje legador
(inferior).
La Figura 35 describe la generación de un grupo
de plantilla inicial para una síntesis de librería de ejemplo.
La Figura 36 describe la síntesis de plantilla
de ADN de una librería de péptido no natural.
La Figura 37 describe un aminoácido ligador de
ADN de reactivos 5'.
La Figura 38 describe la síntesis de plantilla
de una librería bicíclica orientada a diversidad evolucionable.
La Figura 39 describe la síntesis de tripéptido
de multi-etapa de plantilla de ADN. Cada amida de
plantilla de ADN de formación utiliza reactivos que contienen el
ligador sulfona descrito en el texto: condiciones etapa 1: dos
equivalentes activos 13 en 20 mM EDC, 15 mM
sulfo-NHS, 0.1 M MES amortiguador pH 5.5, 1 M NaCl,
10 min, 25ºC, luego se agrega a la plantilla en 0.1 M MOPS pH 7.5,
1M NaCl, 25°C, 1 h; etapas 2 y 3: dos equivalentes de reactivo, 50
mM DMT-MM, 0.1 M MOPS amortiguador pH 7.0, 1M NaCl,
6 h, 25°C. el producto deseado de cada etapa se purifica al capturar
sobre glóbulos ligados con avidina y eluir con 0.1 M de amortiguador
CAPS pH 11.8,60 mM BME, 37°C, 2 h. El progreso de cada reacción y
purificaciones se sigue por desnaturalización de electroforesis de
gel de poliacrilamida (inferior). Las líneas 3, 6 y 9: reacciones de
control que utilizan reactivos que contienen secuencias de
oligonucleótido revueltas.
La Figura 40 describe síntesis multietapa de
plantilla de ADN no peptídica. Los ligadores de reactivos utilizados
en las etapas 1, 2, y 3 fueron el ligador diol, ligador de
autoclivado intencional, y ligador sulfona, respectivamente; ver
figura 1 para condiciones de clivaje de ligador. Condiciones: 17 a
18: activa dos equivalentes 17 en 20 mM EDC, 15 mM
sulfo-NHS, 0.1 M amortiguador MES pH 5.5, 1 M NaCl,
10 min, 25°C, luego se agrega a la plantilla en 0.1 M MOPS pH 7.5,
1M NaCl, 16°C, 8 h; 19 a 21: tres equivalentes 20, 0.1 M TAPS pH
9.0, 3 M NaCl, 48 h, 25°C; 22 a 23: tres equivalentes 22, 0.1 M TAPS
pH 8.5, 1 M NaCl, 21 h, 25°C. El progreso de cada reacción y
purificaciones se sigue por desnaturalización de electroforesis de
gel de poliacrilamida (inferior). Las líneas 3, 6 y 9: reacciones de
control que utilizan reactivos que contienen secuencias de
oligonucleótido revueltas.
La Figura 41 describe el uso de ácidos nucleicos
para dirigir la síntesis de nuevos polímeros y plásticos al adherir
el ácido nucleico al ligando de un catalizador de polimerización. El
ácido nucleico se puede convertir en una estructura compleja que
puede afectar la selectividad y actividad del catalizador.
La Figura 42 describe el uso de catalizadores de
polimerización metátesis de anillo abierto Grubb en plásticos
evolucionantes. El esquema sintético de un ligando de
dihidroimidazol unido al ADN se muestra así como también el monómero
a ser utilizado en la reacción de polimerización.
La Figura 43 describe la evolución de plásticos
a través de ciclos iterativos de diversificación de ligando,
selección de amplificación para crear polímeros con propiedades
deseadas.
La Figura 44 describe un esquema de ejemplo para
la síntesis, selección in vitro, y amplificación de una
librería de los compuestos.
La Figura 45 describe plantillas de ejemplo para
uso en recombinación.
La Figura 46 describe varios
desoxiribonucleótidos y ribonucleótidos de ejemplo que llevan
modificaciones a grupos que no participan que la unión de hidrógeno
Watson-Crick y son conocidos por ser insertados con
secuencia de alta fidelidad opuesta a plantillas de ADN
naturales.
La Figura 47 describe análogos
7-desazaadenosina y uridina de unión de metal.
La Figura 48 describe la síntesis del análogo
(7).
La Figura 49 describe la síntesis del análogo
(30).
La Figura 50 describe la síntesis de trifosfatos
desoxiadenosina 8-modificados.
La Figura 51 describe los resultados de un
ensayo que evalúa la aceptación de nucleótidos modificados por
polimerasas ADN.
La Figura 52 describe la síntesis de derivados
7- desazaadenosina.
La Figura 53 describe ciertos trifosfatos de
nucleótido de ejemplo.
La Figura 54 describe un método general para la
generación de librerías de polímeros de unión de metal.
Las Figuras 55 y 56 describen esquemas de
ejemplo para las selecciones in vitro para catalizadores de
polímero no natural.
La Figura 57 describe un esquema de ejemplo para
la selección in vitro de catalizadores parta reacciones Heck,
reacciones hetero Diels-Alder y adiciones aldol.
Como se discutió anteriormente, seria deseable
ser capaz de evolucionar y amplificar compuestos químicos que
incluyen, pero no están limitados a moléculas pequeñas y polímeros,
en la misma forma que biopolímeros tal como polinucleótidos y
proteínas que pueden amplificar y evolucionar. Se ha demostrado que
la síntesis de plantilla de ADN suministra un medio posible de
traducción de la información en una secuencia de ADN dentro de una
molécula sintética. En general, las plantillas de ADN ligadas a un
reactivo puede ser capaz de captar un segundo grupo reactivo ligado
a una molécula de ADN complementaria para producir un producto.
Debido a que la hibridización de ADN es de secuencia específica, el
resultado de una reacción de plantilla de ADN es la traducción de
una secuencia de ADN específica en un producto de reacción
correspondiente. Como se muestra en la Figura 2 la capacidad de las
plantillas de ácido nucleico de hebra sencilla para catalizar la
oligomeración específica de secuencia de oligonucleótidos
complementarios (T. Inoue et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103,
7666; T. Inou et al. J. Mol. Biol. 1984, 178,
669-76) se ha demostrado. Ese descubrimiento se
siguió prontamente por hallazgos de que las plantillas de ADN o ARN
pueden catalizar la oligomerización de ADN o ARN complementario
mono-, di-, tri-, o oligonucleótidos (T. Inoue et al. J. Am.
Chem. Soc. 1981, 103, 7666; L. E. Orgel et al. Acc. Chem.
Res. 1995, 28, 109-118; H. Rembold et al. J
Mol. Evol. 1994, 38, 205; L. Rodriguez et al. J. Mol. Evol.
1991, 33, 477; C. B. Chen et al. J. Mol. Biol. 1985, 181,
271). Las plantillas de ADN o ARN han sido por lo tanto mostradas
para acelerar la formación de una variedad de análogos ácido
nucleico no naturales, que incluyen ácidos nucleicos péptido (C.
Bohler et al. Nature 1995, 376, 578), fosforotioato-(M. K.
Herrlein et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117,
10151-10152), fosforoselenato- (Y. Xu et al.
J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 9040-9041; Y. Xu et
al. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 148-152) y
fosforamidato- (A. Luther et al. Nature 1998, 396,
245-8) que contienen ácidos nucleicos, ácidos
nucleicos no ribosa (M. Bolli et al. Chem. Biol. 1997, 4,
309-20), y analagos de ADN en el que se ha
reemplazado un enlace fosfato con un grupo aminoetilo (Y. Gat et
al. Biopolymers 1998, 48, 19-28). Las plantillas
de ácido nucleico también puede catalizar acilación amina entre
análogos de nucleótido (R. K. Bruick et al. Chem. Biol. 1996,
3, 49-56).
Sin embargo, aunque la capacidad de las
plantillas de ácido nucleico para acelerar la formación de una
variedad de análogos de ácido nucleico no natural se ha demostrado,
casi todas estas reacciones mostraron previamente ser catalizadas
por plantillas de ácido nucleico que se diseñan para proceder a
través de estados de transición que semejan cercanamente la
estructura de la estructura de ácido nucleico natural (Figura 2),
típicamente produce productos que preservan la misma estructura de
seis enlaces espaciados entre unidades de nucleótido. La motivación
detrás de este diseño presumiblemente fue la presunción de que el
índice de mejoramiento suministrado por las plantillas de ácido
nucleico depende de una alineación precisa de grupos reactivos, y la
precisión de esta alineación se maximiza cuando los reactivos y
productos imitan la estructura de las estructuras de ADN y ARN. La
evidencia en apoyo de la hipótesis de que la síntesis de plantilla
de ADN solo puede generar productos que semejan la estructura de
ácido nucleico viene de la dificultad bien conocida de
macrociclización en la síntesis orgánica (G. Illuminati et
al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95-102; R. B.
Woodward et al. J Am. Chem. Soc. 1981, 103,
3210-3213). El índice de mejoramiento de las
reacciones de cierre de anillo intramolecular comparada con sus
contrapartes intermoleculares es conocida por reducir rápidamente ya
que los enlaces rotables se agregan entre grupos reactivos, tal como
reactivos ligadores con un ligador de carbono 14 flexible produce
fuertemente cualquier índice de aceleración (G. Illuminati et
al. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 95-102).
En razón de que las moléculas sintéticas de
interés no semejan en general estructuras de ácido nucleico, el uso
de síntesis de plantilla de ADN para traducir secuencia de ADN en
moléculas sintéticas pequeñas seria ampliamente útil solo si la
molécula sintéticas diferentes a ácidos nucleicos y análogos de
ácidos nucleicos se pudieran sintetizar en una forma de plantilla de
ADN. La capacidad de síntesis de plantilla de ADN para traducir
secuencias de ADN en moléculas pequeñas arbitrarias no naturales
requiere por lo tanto demostrar que la síntesis de plantilla de ADN
es un fenómeno mucho más general de lo que se ah descrito
previamente.
\newpage
Significativamente, para la primer vez se ha
demostrado aquí que esta síntesis de plantilla de ADN es en efecto
un fenómeno general y se puede utilizar para una variedad de
reacciones y condiciones para generar un rango diverso de
compuestos, que incluyen específicamente para la primer vez,
compuestos que no son, o no semejan, ácidos nucleicos o análogos de
estos. Más específicamente, la presente invención extiende la
capacidad de amplificar y evolucionar librerías de compuestos
químicos más allá de de biopolímeros naturales. La capacidad de
sintetizar compuestos químicos de estructuras arbitrarias permite a
los investigadores escribir sus propios códigos genéticos
incorporando un amplio rango de funcionalidad química dentro de una
estructura novedosa y estructuras de cadena lateral, que permiten el
desarrollo de catalizadores novedosos, drogas, y polímeros para
mencionar unos pocos ejemplos. Por ejemplo, la capacidad de
amplificar directamente y evolucionar estas moléculas mediante
selección genética permite el descubrimiento de familias
completamente nuevas de catalizadores artificiales que poseen
actividad, biodisponibilidad solvente, o estabilidad térmica, u
otras propiedades físicas (tal como fluorescencia,
spin-etiquetado, o fotolabilidad) que son difíciles
o imposibles de lograr utilizando el conjunto limitado de elementos
fundamentales de ácido nucleico y proteínas naturales. De forma
similar, desarrollar métodos para amplificar y evolucionar
directamente moléculas pequeñas sintéticas por ciclos reiterados de
mutación y selección permite el aislamiento de ligando novedosos o
drogas con propiedades superiores a aquellas aisladas por diseño
racional tradicional o métodos de descubrimiento de droga de
selección combinatoria. Adicionalmente, extender las aproximaciones
descritas aquí a polímeros de importancia en ciencia material
permitiría la evolución de nuevos plásticos.
En general, el método de la invención involucra
1) suministrar una o más plantillas de ácido nucleico, tal una o más
plantillas de ácido nucleico opcionalmente tienen una unidad
reactiva asociada a esta; y 2) poner en contacto una o más
plantillas de ácido nucleico con uno o más unidades de transferencia
diseñadas por tener una primer porción, un
anti-codón que hibridiza a una secuencia de un ácido
nucleico, y se asocia a con una segunda porción, una unidad
reactiva, que incluye funcionalidad específica, un elemento
fundamental, reactivo, etc., para el compuesto a ser sintetizado se
apreciara que en ciertas modalidades de la invención, la unidad de
transferencia comprende una porción que incorpora la capacidad de
hibridización de la unidad anti-codón y la
funcionalidad química de la unidad de reacción. Una vez estas
unidades de transferencia han hibridizado a la plantilla de ácido
nucleico en una forma de secuencia específica, la síntesis del
compuesto químico puede tener lugar debido a la interacción de
unidades reactivas presentes en las unidades de transferencia y/o la
plantilla de ácido nucleico. Significativamente, la secuencia del
ácido se puede determinar luego para decodificar la historia
sintética del compuesto adherido y por lo tanto su estructura. Se
apreciara que el método descrito aquí se puede utilizar para
sintetizar una molécula de una vez o se puede utilizar para
sintetizar cientos a millones utilizando métodos combinatorios.
Se apreciara que una variedad de compuestos
químicos se pueden preparar y evolucionar de acuerdo con el método
de la invención. Es ciertas modalidades de la invención, sin
embargo, los métodos se utilizan para la síntesis de compuestos
químicos que no son, o no se semejan a ácidos nucleicos o análogos
de de ácidos nucleicos. Por ejemplo, en ciertas modalidades de la
invención, compuestos de moléculas pequeñas se pueden sintetizar al
suministrar una plantilla que tiene una unidad reactiva (por
ejemplo, elemento fundamental o andamio de molécula pequeña)
asociado a este (unido directamente o a través de un ligador como se
describe en más detalle en el ejemplo 5 aquí), y poner en contacto
la plantilla simultáneamente o secuencialmente con una o más
unidades de transferencia que tiene una o más unidades reactivas
asociadas a esta. En ciertas otras modalidades, los polímeros no
naturales se pueden sintetizar al suministrar una plantilla y poner
en contacto la plantilla simultáneamente con una o más unidades de
transferencia que tiene una o más unidades reactivas asociadas a
esta bajo condiciones para efectuar la reacción de las unidades
reactivas adyacentes en cada una de las unidades de transferencia
(ver, por ejemplo, Figura 3, y ejemplos 5 y 9, como se describe en
mas detalle aquí).
Se discuten ciertas modalidades en más detalle
adelante; sin embargo, se apreciara que la presente invención no
está destinada a ser limitada a aquellas modalidades discutidas
anteriormente. Por el contrario, la presente invención está
destinada a abarcar estas modalidades y equivalentes de esta.
Como se discutió anteriormente, una o más
plantillas de ácido nucleico se utilizan en el método de la
invención e hibridizan a las unidades de transferencia para dirigir
la síntesis del compuesto químico. Como se apreciara por un experto
en la técnica, cualquier plantilla de ácido nucleico se puede
utilizar en los métodos y composiciones de la presente invención.
Las plantillas que se pueden mutar y por o tanto evolucionar se
pueden utilizar para guiar la síntesis de otros compuestos químicos
o librerías de compuestos químicos como se describe en la presente
invención. Como se describen más detalle aquí la plantilla
evolucionable codifica la síntesis de un compuesto químico y se
puede utilizar luego para decodificar la historia sintética del
compuesto químico, para amplificar indirectamente el compuesto
químico, y/o para evolucionar (es decir, diversificar, seleccionar y
amplificar) el compuesto químico.
Las plantillas de ácido nucleico utilizadas en
la presente invención se hacen de ADN, ARN, un hibrido de ADN y ARN,
o un derivado de ADN y ARN, y puede ser sencilla o de doble hebra.
La secuencia de la plantilla se utiliza en el método inventivo para
codificar la síntesis de un compuesto químico, preferiblemente un
compuesto que no es, o no se semeja, a un ácido nucleico o un
análogo de ácido nucleico (por ejemplo, un polímero no natural o una
molécula pequeña). En el caso de ciertos polímeros no naturales, la
plantillad de ácidos nucleicos se utiliza para alinear las unidades
de monomero en la secuencia ellas aparecerán en el polímero y las
traerán en proximidad cercana con unidades de monomero adyacente
junto con la plantilla de tal forma que ellas reaccionaran y se
unirán mediante un enlace covalente. En el caso de una molécula
pequeña, la plantilla se utiliza para llevar reactivos particulares
dentro de la proximidad del andamio de la molécula pequeña con el
fin de que ellas puedan modificar el andamio en una forma
particular. En ciertas otras modalidades, la plantilla se puede
utilizar para generar polímeros no naturales mediante amplificación
PCR de una librería de plantilla de ADN sintética que consiste de
una región aleatoria de nucleótidos, como se describe en el ejemplo
9 aquí.
Como se apreciara por experto en la técnica, la
secuencia de la plantilla se puede diseñar en un número de formas
sin ir más allá del alcance de la presente invención. Por ejemplo,
la longitud del codón se debe determinar y la secuencia de codón se
deben establecer. Si una longitud de codón de dos se utiliza,
entonces utilizar las cuatro bases de ocurrencia natural solo 16
combinaciones posibles son disponibles para ser utilizadas en la
codificación de la librería. Si la longitud del codón se incrementa
a tres (el número natural usado en proteínas de codificación) el
número de combinaciones posibles se incrementa a 64. otros factores
a ser considerados en la determinación de la longitud del codón se
desajustan, cambian de marco, complejidad de liberaría, etc. ya que
la longitud del codón se incrementa hasta cierto alcance el número
de desajustes se reduce; sin embargo, codones excesivamente largos
hibridizarán a pesar de pares bases desajustados. En ciertas
modalidades de especial interés, la longitud del codón varía entre
dos y diez bases.
Otro problema asociado con el uso de una
plantilla de ácido nucleico es el cambio de cuadro. En la
naturaleza, el problema de cambio de cuadro en la traducción de una
proteína a partir de un mARN se evita mediante el uso de maquinaria
compleja de ribosoma. Los métodos inventivos, sin embargo, no
tomarán ventaja de tal maquinaria compleja. Por el contrario, el
cambio de cuadro se puede remediar alargar cada codón de tal forma
que la hibridización de un codón afuera el cuadro garantiza un
desajuste. Por ejemplo, cada codón puede iniciar con una G, y
posiciones posteriores se pueden restringir a T, C, y A (Figura 4).
En otro ejemplo, cada codón puede empezar en un extremo con una G, y
posiciones posteriores se pueden restringir a T, C, y A. Otra forma
de evitar el cambio de cuadro es tener codones suficientemente
largos de tal forma que la secuencia de codón solo se encuentra
dentro de la secuencia de la plantilla (en cuadros). Secuencia
espaciadoras también se pueden colocar entre los codones para evitar
el cambio de cuadro.
Se apreciara que la plantilla puede variar
grandemente en el número de bases. Por ejemplo, en ciertas
modalidades, la plantilla puede ser 10 a 10,000 bases de larga,
preferiblemente entre 10 y 1,000 bases de larga. La longitud de la
plantilla dependerá por supuesto de la longitud de los codones,
complejidad de la librería, longitud del poliedro no natural a ser
sintetizado, complejidad de la molécula pequeña a ser sintetizada,
uso de secuencias de espacios, etc. la secuencia de ácido nucleico
se puede preparar utilizando cualquier método conocido en la técnica
para preparar secuencias de ácidos nucleicos. Estos métodos incluyen
métodos in vivo e in Vitro que incluyen PCR,
preparación de plásmidos, digestión de endonucleasa, síntesis de
fase sólida, transcripción in Vitro, preparación de hebra,
etc. En ciertas modalidades, la plantilla de ácido nucleico se
sintetiza utilizando un sintetizador de ADN automatizado.
Como se discutió anteriormente, en ciertas
modalidades de la invención, el método se utiliza para sintetizar
compuestos químicos que no son, o semejan, ácidos nucleicos o
análogos de ácidos nucleicos. Aunque se ha demostrado que la
síntesis de plantilla de ADN se puede utilizar para dirigir la
síntesis de ácido nucleico y análogos de estos, no se ha demostrado
previamente que el fenómeno de síntesis de plantilla de ADN es
suficientemente general para extender a otros compuestos químicos
complejos (por ejemplo, moléculas pequeñas, polímeros no naturales).
Como se describe en detalle aquí, se ha demostrado que la síntesis
de plantilla de ADN es de hecho un fenómeno más general y que una
variedad de reacciones se puede utilizar.
Así, en ciertas modalidades de la presente
invención, las plantillas ácido nucleico comprenden secuencias de
bases que codifican las síntesis de un polímero no natural o
molécula pequeña. El mensaje codificado en la plantilla de ácido
nucleico empieza preferiblemente con un codón específico que lleva
en el lugar un sitio reactivo químicamente del que la polimerización
puede tener lugar, o en el caso de sintetizar una molécula pequeña
el codón "inicio" puede codificar para un
anti-codón asociado con un andamio de molécula
pequeña o un primer reactivo. El codón de "inicio" de la
presente invención es análogo al codón de "inicio", ATG,
encontrado en la Naturaleza, que codifica la metionina de
aminoácido. Para dar un ejemplo para uso en la síntesis de una
librería de polímero no natural, el codón de inicio puede codificar
para una unidad de monomero de inicio que comprende una amina
enmascarada por un grupo protector fotolabil, como se muestra
adelante en el Ejemplo 5A.
En aún otras modalidades de la invención, la
plantilla de ácido nucleico en si misma se puede modificar para
incluir un sitio de iniciación para síntesis de polímero (por
ejemplo un nucleófilo) o un andamio de molécula pequeña. En ciertas
modalidades, la plantilla de ácido nucleico incluye una argolla de
horquilla en uno de sus extremos que termina en un grupo reactivo
utilizado para iniciar la polimerización de las unidades de
monómero. Por ejemplo, la plantilla de ADN puede comprender una
argollas de horquilla que termina en un grupo 5,-amino, que puede
ser protegido o no. Puede comenzar a partir de la polimerización del
grupo amino del polímero no natural. El grupo amino reactivo también
se puede utilizar para ligar un andamio de molécula pequeña sobre
una plantilla de ácido nucleico con el fin de sintetizar una
librería de molécula pequeña.
Para terminar la síntesis del polímero no
natural se debe incluir un codón de "parada" en la plantilla de
ácido nucleico preferiblemente en el extremo de la secuencia
codificadora. El codón de "parada" de la presente invención es
análogo a los codones de "parada" (es decir, TAA, TAG, TGA)
encontrado en trascripciones de mARN. En la naturaleza, estos
codones conducen a la terminación de la síntesis de proteína. En
ciertas modalidades, un codón de "parada" se escoge que es
compatible con el código genético artificial utilizado para
codificar el polímero no natural. Por ejemplo, el codón de
"parada" no debe entrar en conflicto con ningún otro de los
codones utilizados para codificar la síntesis, y este debe ser del
mismo formato general como los otros codones utilizados en la
plantilla. El codón de "parada" puede codificar para una unidad
de monómero que termina la polimerización al no suministrar un grupo
reactivo para unión adicional. Por ejemplo, una unidad de monómero
de parada puede contener un grupo reactivo bloqueado tal como una
acetamida diferente de una mina primaria como se muestra en el
Ejemplo 5A adelante. En aún otras modalidades, la unidad de monómero
de parada comprende un terminal biotinilado que suministra una forma
conveniente de terminar la etapa de polimerización y purificar el
polímero resultante.
Como se describió anteriormente, en el método de
la invención, también se suministran unidades de transferencia que
comprenden un anticodón y una unidad reactiva. Se apreciará que los
anticodones utilizados en la presente invención se diseñan para ser
complementarios a los condones actuales dentro de la plantilla de
ácido nucleico, y se deben diseñar con una plantilla de ácido
nucleico y los codones utilizados en este. Por ejemplo, las
secuencias utilizadas en la plantilla así como también la longitud
de los codones sería necesario tomarlas en cuenta en el diseño de
los anticodones. Cualquier molécula que sea complementaria con un
codón utilizado en la plantilla se puede utilizar en los métodos
inventivos (por ejemplo, nucleótidos o nucleótidos no naturales). En
ciertas modalidades, los codones comprenden una o más bases
encontradas en la naturaleza (es decir, timidina, uracilo,
guanidina, citosina, adenina). En ciertas otras modalidades, el
anticodón comprende uno o más nucleótidos encontrados normalmente en
la naturaleza con una base, una azúcar, y un grupo fosfato opcional.
En aún otras modalidades, las bases son fuertes a lo largo de una
estructura que no es la estructura de fosfato azúcar encontrada
normalmente en la naturaleza (por ejemplo, nucleótidos no
naturales).
Como se discutió anteriormente, el anticodón se
asocia con un tipo particular de unidad reactiva para formar una
unidad de transferencia. Se apreciará que esta unidad reactiva puede
representar una entidad distinta o puede ser parte de la
funcionalidad de la unidad anticodón (ver, ejemplo 9). En ciertas
modalidades, cada secuencia de anticodón se asocia con untito de
monómero. Por ejemplo, la secuencia de anticodón ATTAG se puede
asociar con un residuo de carbamato con una cadena lateral
iso-butilo, y la secuencia de anticodón CATAG se
puede asociar con un residuo de carbamato con una cadena lateral de
fenilo. Este mapeo uno a uno de anticodón a unidades de monómero
permite uno para decodificar cualquier polímero de la librería al
secuenciar la plantilla de ácido nucleico utilizada en la síntesis y
permite uno para sintetizar el mismo polímero o un polímero
relacionado al conocer la secuencia del polímero original. Se
apreciará por un experto en la técnica que al cambiar (por ejemplo
mutar) la secuencia de la plantilla, unidades de monómero diferentes
se llevarán en el lugar, permitiendo por lo tanto la síntesis de
polímeros relacionados, que se pueden seleccionar posteriormente y
evolucionar. En ciertas modalidades preferidas, varios anticodones
pueden codificar para una unidad de monómero como es el caso en la
naturaleza.
En ciertas otras modalidades de la presente
invención en donde una librería de molécula pequeña se crea a
diferencia de una librería de polímero, el anticodón se asocia con
un reactivo utilizado para modificar el andamio de molécula pequeña.
En ciertas modalidades, el reactivo se asocia con el anticodón a
través de un ligador suficientemente largo para permitir al reactivo
entrar en contacto con un andamio de molécula pequeña. El ligador
debe preferiblemente ser de tal una longitud y composición para
permitir las reacciones intramoleculares y minimizar las reacciones
intermoleculares. Los reactivos incluyen una variedad de reactivos
como se demuestra mediante el amplio rango de reacciones que se
pueden utilizar en la síntesis de plantilla de ADN (ver ejemplo 2, 3
y 4 aquí) y puede ser cualquier grupo químico,
catalizador(por ejemplo compuestos organometálicos), o
porciones reactivas (por ejemplo, electrófilos, nuleófilos)
conocidos en la técnica química.
Adicionalmente, la asociación entre el anticodón
y la unidad de monómero o reactivo en la unidad de transferencia
puede ser covalente o no covalente. En ciertas modalidades de
especial interés, la asociación es a través de un enlace covalente,
y en ciertas modalidades el enlace covalente es separable. El ligado
se puede clivar por luz, oxidación, hidrólisis, exposición a ácidos,
exposición a bases, reducción, etc. Para ejemplos de ligados
utilizados en esta técnica, por favor ver Fruchtel et al.
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 17,1996, El anticodón y la unidad de
monómero o reactivo también se puede asociar a través de
interacciones no covalentes tales como iónicas, electrostáticas,
uniones de hidrógeno, interacciones van der Waals, interacciones
hidrófobas, apilamiento-pi, etc. y combinaciones de
estos. Para dar un ejemplo, el anticodón se puede ligar a biotina, y
la unidad de monómero ligar a estreptavidina. La propensión de la
estreptavidina para unir biotina conduce a la asociación no
covalente, entre el anticodón y la unidad de monómero para formar la
unidad de transferencia.
Se apreciará que una variedad de compuestos y/o
librerías se pueden preparar utilizando el método de la in. Como se
discutió anteriormente, en ciertas modalidades de especial interés,
compuestos que no son, o no semejan, ácidos nucleicos o análogos de
estos, se sintetizan de acuerdo con los métodos de la invención.
En ciertas modalidades, los polímeros,
específicamente polímeros no naturales, se preparan de acuerdo con
el método de la presente invención. Los polímeros no naturales que
se pueden crear utilizando el método inventivo y sistema incluyen
cualquier polímero no natural. Polímeros no naturales de ejemplo
incluyen, pero no están limitados a, policarbamatos, poliureas,
poliésteres, poliacrilato, polialquilleno (por ejemplo, polietileno,
polipropileno), policarbonatos, polipéptidos con estereoquímica no
natural, polipéptidos con aminoácidos no naturales, y combinaciones
de estos. En ciertas modalidades, los polímeros comprenden al menos
10 unidades de monómero. En ciertas otras modalidades, los polímeros
comprenden al menos 50 unidades de monómero. En aún otras
modalidades, los polímeros comprenden al menos 100 unidades de
monómero. Los polímeros sintetizados que utilizan el sistema
inventivo se pueden utilizar como catalizadores, farmacéuticos,
queladores de metal, materiales, etc.
En la preparación de ciertos polímeros no
naturales, las unidades de monómero adheridas a los anticodones y
utilizadas en la presente invención pueden ser cualquier monómero u
oligómero capaz de ser unidos para formar un polímero. Las unidades
de monómero pueden ser carbamatos, aminoácidos D, aminoácidos no
naturales, ureas, hidroxi ácidos, ésteres acrilatos, éteres etc. en
ciertas modalidades, las unidades de monómero tienen dos grupos
reactivos utilizados para enlazar la unidad de monómero en la cadena
de polímero creciente. Preferiblemente, los dos grupos reactivos no
son el mismo de tal forma que la unidad de monómeros puede
incorporar en le polímero en un sentido direccional, por ejemplo, en
un extremo puede estar un electrófilo y en el otro extremo un
nucleófilo. Los grupos reactivos pueden incluir, pero no están
limitados a, ésteres, amidas, ácidos carboxílicos, grupos carbonilos
activados, cloruros ácidos, aminas, grupos hidroxio, tioles, etc. En
ciertas modalidades, los grupos reactivos se enmascaran o protegen
(Greene & Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd
Edition Wiley, 1999; incorporada aquí como referencia) de tal forma
que la polimerización puede no tener lugar hasta un tiempo deseado
cuando los grupos reactivos se desprotegen. Una vez las unidades de
monómero se ensamblan junto a la plantilla de ácido nucleico, la
iniciación de las secuencias de polimerización resultan en una
cascada de etapas de polimerización y desprotección en donde la
etapa de polimerización resulta en desprotección de un grupo
reactivo a ser utilizado en la etapa de polimerización posterior
(ver, figura 3).
Las unidades de monómero a ser polimerizadas
pueden comprender dos o más unidades que dependen de la geometría
junto con la plantilla de ácido nucleico. Como se apreciará por un
experto en esta técnica, las unidades de monómero a se polimerizadas
deben ser capaces de estirarse a lo largo de la plantilla de ácido
nucleico y particularmente a través de la distancia medida por su
anticodón de codificación y opcionalmente secuencia espaciadora. En
ciertas modalidades, la unidad de monómero comprende actualmente dos
monómeros, por ejemplo, un dicarbamatpo, una diurea, un dipéptido,
etc. En aún otras modalidades, la unidad de monómero comprende
actualmente tres o más monómeros.
Las unidades de monómero pueden contener
cualquier grupo químico conocido en la técnica. Como se apreciará
por un experto en esta técnica, los grupos reactivos químicos
específicamente aquellos que pueden interferir con polimerización,
hibridación, etc. se enmascaran utilizando grupos protectores
conocidos (Greene & Wuts Protective Groups in Organic Synthesis,
3rd Edition Wiley, 1999;). En general, los grupos protectores
utilizados para enmascarar estos grupos reactivos son ortogonales a
aquellos en proteger los grupos utilizados en las etapas de
polimerización.
En sintetizar un polímero no natural, en ciertas
modalidades se suministra una plantilla que codifica la secuencia de
unidades de monómero. Las unidades de transferencia se le permiten
entonces entrar en contacto con la plantilla bajo condiciones que
permitan la hibridización de los anticodones a la plantilla. La
polimerización de las unidades de monómero junto con la plantilla es
luego permitida para que ocurra la formación del polímero no
natural. El polímero sintetizado nuevamente puede luego ser clivado
a partir de anticodones y/o la plantilla. La plantilla se puede
utilizar como una etiqueta para elucidar la estructura del polímero
o se puede utilizar para amplificar y evolucionar el polímero no
natural. Como se describirá en más detalle adelante, el presente
método se puede utilizar para prepara una librería se polímeros no
naturales. Por ejemplo, en ciertas modalidades, como redescribe en
más detalle en el ejemplo 9 aquí, una librería de plantillas de ADN
se puede utilizar para preparar polímeros no naturales. En general,
el método toma ventaja del hecho de que ciertas polimerasas de ADN
son capaces de afectar ciertos sustratos de trifosfato nucleótido
modificados y que varios desoxiribonucelótidos y ribonucleótidos que
llevan grupos modificados que no participan en la unión
Watson-Crick son conocidos por estar insertados con
las plantillas de ADN naturales opuestas de secuencia específica. de
acuerdo con esto, el ADN de hebra sencilla que contiene nucleótidos
modificados puede servir como plantilla eficiente para la
incorporación catalizada de polimerasa ADN de nucleótidos naturales
o modificados.
Se apreciará que los métodos inventivos también
se pueden utilizar para sintetizar otras clases de compuestos
químicos a pesar de polímeros no naturales. Por ejemplo, se pueden
preparar moléculas pequeñas utilizando los métodos y composiciones
suministradas por la presente invención. Estas moléculas pequeñas
pueden ser productos naturales como, no poliméricos, y/o no
oligoméricos. El interés sustancial en moléculas pequeñas se debe en
parte a su uso como el ingrediente activo en muchas preparaciones
farmacéuticas aunque ellas también se pueden utilizar como
catalizadores, materiales, aditivos, etc.
En la síntesis de moléculas pequeñas que
utilizan el método de la presente invención, también se suministra
una plantilla evolucionable. La plantilla puede comprender un
andamio de molécula pequeña sobre el cual la molécula pequeña se
construye, o un andamio de molécula pequeña se puede agregar a la
plantilla. El andamio de molécula pequeña puede ser cualquier
compuesto químico son sitios para funcionalización. Por ejemplo, el
andamio de molécula puede comprender un sistema de anillo (por
ejemplo, el sistema de anillo esteroide ABSD encontrado en
colesterol) con grupos funcionalizables de átomos que construyen los
anillos. En otro ejemplo, la molécula pequeña puede ser la
estructura subyacente de un agente farmacéutico tal como morfina o
un antibiótico cefalosporina (ver ejemplos 5C y 5D adelante). Los
sitios o grupos a ser funcionalizados en el andamio de molécula
pequeña pueden ser protegidos utilizando métodos y grupos
protectores conocidos en la técnica. Los grupos protectores
utilizados en un andamio de molécula pequeña puede ser ortogonales a
otro de tal formar que los grupos protectores se puede remover uno a
la
vez.
vez.
En esta modalidad, las unidades de transferencia
comprenden un anticodón similar a aquellos descritos en la síntesis
de polímero no natural; sin embargo, estos anticodones se asocian
con reactivos o elementos fundamentales para ser utilizados en
modificar, agregar a, o retirar del andamio de molécula pequeña. Los
reactivos o elementos de construcción pueden ser electrófilos (por
ejemplo acetilo, amidas, cloruros ácidos, ésteres, nitrilos, iminas,
nucleófilos (por ejemplo, aminas, grupos hidroxilo, tioles),
catalizadores (por ejemplo catalizadores organométalicos), cadenas
laterales, etc. Ver, por ejemplo reacciones en medio acuoso y
orgánico como se describe aquí en los ejemplos 2, y 4. Las unidades
de transferencia se les permite entrar en contacto con la plantilla
bajo condiciones de hibridización, y el reactivo adherido o elemento
fundamental se le permite reaccionar con un sitio en el andamio de
molécula pequeña. En ciertas modalidades, los grupos protectores en
la plantilla de molécula pequeña se remueven uno a la vez de los
sitios a ser funcionalizados de tal forma que el reactivo de la
unidad de transferencia reaccionará en solo la posición deseada del
andamio. Como se apreciará por un experto en la técnica, el
anticodón se puede asociar con el reactivo a través de una porción
ligadora (ver, ejemplo 3). El ligador facilita el contacto del
reactivo con el andamio de molécula pequeña y en ciertas
modalidades, dependiendo de la reacción deseada, las posiciones de
ADN como un grupo saliente (estrategia de "autoclivable") o
puede enlazar grupos reactivos a la plantilla por vía de la
estrategia ligadora con "sin marca" (que produce productos sin
dejar atrás la funcionalidad química adicional), o una estrategia
"de marca útil" en la que se deja el ligador atrás y se puede
funcionalizar en etapas posteriores luego de clivaje de ligador). La
condición de reacción, ligador, reactivo, y sitio a ser
funcionalizado se escogen para evitar reacciones intermoleculares y
reacciones intramoleculares aceleradas. También se apreciará que el
método de la presente invención contempla el contacto secuencial y
simultaneo de la plantilla con unidades de transferencia que
dependen del compuesto particular a se sintetizado. En ciertas
modalidades de especial interés, la síntesis multietapa de
compuestos químicos se suministra en el que la plantilla se pone en
contacto secuencialmente con dos o más unidades retransferencia para
facilitar la síntesis multietapa de compuestos químicos
complejos.
Después que los sitios en el andamio se han
modificado, la molécula pequeña sintetizada nuevamente se liga as la
plantilla que codificada es síntesis. Decodificar la etiqueta de
plantilla permitirá elucidar la historia sintética y por lo tanto la
estructura de la molécula pequeña. La plantilla se puede amplificar
con el fin de crear más de la molécula pequeña deseada y/o la
plantilla se puede evolucionar para crear moléculas pequeñas
relacionadas. La molécula pequeña también se puede clivar a partir
de la plantilla para purificación o selección.
Como se apreciará por un experto en la técnica,
una pluralidad de plantillas se puede utilizar para codificar la
síntesis de una librería combinatoria de molécula pequeñas que
utilizan el método descrito anteriormente. Esto permitiría la
amplificación y evolución de una librería de molécula pequeña, una
prueba que no se ha cumplido antes de la presente invención.
En el método inventivo, una plantilla de ácido
nucleico, como se describió anteriormente, se suministra apara
dirigir al síntesis de un polímero no natural, una molécula pequeña,
o cualquier otro tipo de molécula de interés. En general, una
pluralidad de plantillas de ácido nucleico se suministra en donde el
número de secuencias diferentes suministra rangos de 2 a 10^{15}.
en una modalidad de la presente invención una pluralidad de
plantillas de ácido nucleico se suministran, preferiblemente al
menos 100 diferentes plantillas de ácido nucleico, más
preferiblemente al menos 10000 plantillas diferentes de ácido
nucleico, y más preferiblemente al menos 1.000.000 de plantillas de
ácido nucleico diferentes. Cada plantilla suministrada comprende una
secuencia de ácido nucleico única utilizada para codificar la
síntesis de un polímero no natural particular o molécula pequeña.
Como se describió anteriormente, la plantilla también puede tener
funcionalidad tal como una amina primaria de la que se inicia
polimerización o un andamio de molécula pequeña. En ciertas
moléculas, las plantillas de ácido nucleico se suministran en una
"pot" en ciertas otras modalidades, las plantillas suministran
en medio acuoso y se desarrollan reacciones posteriores en medio
acuoso.
Se agrega a la plantilla unidades de
transferencia con anticodones, como se describió anteriormente,
asociadas con una unidad de monómero, como se describió
anteriormente. En ciertas modalidades, una pluralidad de unidades de
transferencia se suministra de tal forma que hay anticodón para cada
codón representado en la plantilla. En una modalidad preferida,
ciertos anticodones se utilizan como sitios de inicio y parada. En
general, un número suficientemente grande de unidades de
transferencia se suministra de tal forma que todos los sitios de
codón correspondientes en la plantilla se llenan después de
hibridización.
Los anticodones de las unidades de transferencia
se les permite hibridizar a la plantilla de ácido nucleico llevando
por lo tanto las unidades de monómero juntas en una secuencia
específica como se determina por la plantilla. En la situación en
donde una librería de molécula pequeña está siendo sintetizada, los
reactivos se llevan en proximidad a un andamio de molécula pequeña.
Las condiciones de hibridización, como se apreciará por aquellos
expertos en la técnica, podrían permitir preferiblemente para solo
ajuste perfecto entre el codón y su anticodón. Los desajustes de
pares bases sencillos se deben evitar. Las condiciones de
hibridización pueden incluir, pero no están limitadas a temperatura,
concentración de sal, pH, concentración de plantilla, concentración
de anticodones, y solvente. Las condiciones de hibridización
utilizadas en sintetizar la librería pueden depender de la longitud
del codón/anticodón, la similitud entre los codones presentes en las
plantillas, el contenido pares base G/C versus A/P, etc. (para
información adicional con respecto a condiciones de hibridización,
ver por favor, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed.
by Sambrook, Fritsch, y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory
Press: 1989); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S. J.
Higgins eds.1984); el tratado, Methods in Enzynaology (Academic
Press, Inc., N.Y.); Ausubel et al. Current Protocols in
Molecular Biology (Jolm Wiley & Sons, Inc., New York,
1999);).
Después que ha ocurrido la hibridización de los
anticodones a los codones en la plantilla, las unidades de monómero
se polimerizan luego en el caso de síntesis de polímeros no
naturales. La polimerización de las unidades de monómero pueden
ocurrir espontáneamente o pueden necesitar ser iniciadas, por
ejemplo, mediante la desprotección de un grupo reactivo tal como un
nucleófilo o al suministrar luz de una cierta longitud de onda. En
ciertas otras modalidades, los polímeros se pueden cristalizar
mediante polimerización de ADN capaz de efectuar polimerización de
nucleótidos no naturales (ver, ejemplo 9). La polimerización
preferiblemente ocurre en una dirección junto con la plantilla con
unidades de monómero adyacentes que se llegan a unir a través de un
enlace covalente. La terminación de la etapa de polimerización
ocurre por la adiciones de una unidad de monómero que no es capaz de
ser agregada. En el caso de las síntesis de moléculas pequeñas, se
le permite a los reactivos reaccionar con el andamio de molécula
pequeña. El reactivo puede reaccionar espontáneamente, o grupos
protectores en el reactivo y/o el andamio de molécula pequeña pueden
necesitar ser removidos. Otros reactivos (por ejemplo ácido, base,
catalizador, gas de hidrógeno, etc.) también se pueden necesitar
para efectuar la reacción (ver, ejemplos 5A-5E).
Después que se han creado los polímeros no
naturales o moléculas pequeñas con la ayuda de la plantilla de ácido
nucleico, ellas se pueden clivar a partir de plantillas de ácido
nucleico y/o anticodones utilizado para sintetizarlos. En ciertas
modalidades, los polímeros o moléculas pequeñas se ensayan antes de
ser completamente desechadas de las plantillas de ácido nucleico que
los codifica. Una vez se selecciona el polímero o molécula pequeña
la secuencia de plantilla o su complemento se puede determinar para
elucidar la estructura del polímero adherido o molécula pequeña.
Esta secuencia puede ser entonces amplificada y/o evolucionada para
crear nuevas librerías de polímeros relacionados o moléculas
pequeñas que en cambio se puedan seleccionar y evolucionar.
Los métodos y composiciones de la presente
invención representan una nueva forma para generar moléculas con
propiedades deseadas. Esta aproximación lleva los métodos genéticos
extremadamente poderosos, que los biólogos moleculares han tomado
ventaja durante décadas, con la flexibilidad y poder de la química
orgánica. La capacidad de prepara, amplificar y evolucionar
polímeros no naturales mediante selección genética puede conducir a
nuevas clases de catalizadores que poseen actividad,
biodisponibilidad, estabilidad, fluorescencia, fotolabilidad, u
otras propiedades que son difíciles o imposibles de alcanzar
utilizando el limitado conjunto de elementos fundamentales
encontrados en las proteínas y ácidos nucleicos. De forma similar,
desarrollar nuevos sistemas para preparar, amplificar y evolucionar
moléculas pequeñas por ciclos reiterados de mutaciones y selección
puede conducir al aislamiento de ligandos novedosos o drogas con
propiedades superiores a aquellas aisladas por métodos de
descubrimiento de drogas tradicionales más lentos (ver, Ejemplo
7).
Desarrollar la síntesis de librerías orgánicas
en la escala de biología molecular es un aproximación diferente
fundamentalmente de la síntesis de librería de fase sólida
tradicional y lleva ventajas significativas. Una librería creada
utilizando los métodos inventivos se puede seleccionar utilizando
cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo ensayo de
unión, ensayo catalítico). Por ejemplo, la selección basada en la
unión a una molécula objetivo se puede llevar a cabo en la librería
completa al pasar librería sobre una resina ligada covalentemente al
objetivo. Estos biopolímeros que tienen afinidad para el objetivo
unido a resina se pueden eluir con moléculas objetivo libres, y los
compuestos seleccionados se pueden amplificar utilizando los métodos
descritos anteriormente. Rounds posteriores de selección y
amplificación pueden resultar en un grupo de compuestos enriquecidos
con secuencias que unen la molécula objetivo. En ciertas
modalidades, la molécula objetivo imita un estado de transición de
una reacción química, y los compuestos químicos seleccionados pueden
servir como un catalizador para la reacción química. Debido a que la
información que codifica la síntesis de cada molécula se une
covalentemente a la molécula en un extremo, la librería completa se
puede seleccionar de una vez y aún cada molécula se selecciona sobre
una base individual.
Tal una librería también se puede evolucionar al
introducir mutaciones en el nivel de ADN que utiliza PCR de
pron-error (Cadwell et al. PCR Methods Appl.
2: 28, 1992) o alo someter el adn a recombinación homóloga in
vitro (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747,1994;
Stemmer Nature 370: 389,1994; cada uno de los cuales se incorpora.
El ciclo repetido de selección, amplificación, y mutación puede
producir biopolímeros con afinidad de unión grandemente incrementada
para moléculas objetivo o con propiedades catalíticas
significativamente mejoradas. El grupo final de biopolímeros
evolucionados que tienen las propiedades deseadas se pueden
secuenciar al secuenciar el ácido nucleico clivado de los polímeros.
Los polímeros de ácido nucleico libres se pueden purificar
utilizando cualquier método conocido en la técnica que incluye HPLC,
cromatografía de columna, FLPC, etc., y sus propiedades de unión i o
propiedades catalíticas se pueden verificar en la ausencia de ácido
nucleico unido covalentemente.
La polimerización de unidades de monómero
generadas sintéticamente independientes de maquinaria ribosomal
permite la incorporación de una enorme variedad de cadenas laterales
con propiedades químicas, biofísicas, o biológicas novedosas.
Terminar cada biopolímero con una cadena lateral de biotina, por
ejemplo, permite la purificación fácil de solo los biopolímeros de
longitud completa que se han traducido completamente al pasar la
librería a través de una resina ligada por avidina. Se pueden
seleccionar biopolímeros biotín-terminados para la
catálisis actual de reacciones de ruptura de enlace al pasar estos
biopolímeros sobre la resina ligada a través del sustrato a avidina
(Figura 5). Aquellos biopolímeros que clivan el sustrato de
catálisis autoeludirán a partir de una columna cargada con esta
resina. De forma similar los biopolímeros
biotín-terminados se pueden seleccionar para la
catálisis de reacciones formadoras de enlace (Figura 5). Se liga un
sustrato a la resina y el segundo sustrato se liga a avidina. Los
biopolímeros que catalizan la formación de enlace entre los
sustratos se seleccionan por su capacidad de ligar los sustratos
juntos, resultando en la unión del biopolímero a la resina. Cadenas
laterales novedosas también se pueden utilizar para introducir
cofactores en los biopolímeros. Un cadena lateral que contiene un
quemador de metal, por ejemplo, puede suministrar biopolímeros con
propiedades catalíticas mediadas por metal, mientras que una cadena
lateral que contiene flavina puede equipar biopolímeros con el
potencial para catalizar reacciones redox.
De esta forma los biopolímeros no naturales se
pueden aislar ya que sirven como receptores artificiales para unir
selectivamente moléculas o que catalizan reacciones químicas. La
caracterización de estas moléculas suministraría penetración
importante en la capacidad de los policarbamatos, poliureas,
poliésteres, policarbonatos, polipéptidos con cadena lateral no
natural y estereoquímicas, u otros polímeros no naturales para
formar estructuras secundarias o terciarias con propiedades
catalícas o propiedades de unión.
Kits y composiciones para uso en los métodos
inventivos también se suministra. Los kits pueden contener cualquier
elemento o composición util en la práctica de la presente invención.
Los kits pueden incluir, pero no se limitan a, plantillas,
anti-codones, unidades de transferencia, unidades de
monomero, elementos fundamentales. Reactivos, andamios de moléculas
pequeñas, amortiguadores, solvente, enzimas (por ejemplo, polimerasa
estable al calor, transcriptasa reversa, ligasa, endonucleasa de
restricción, exonucleasa, fragmento Klenow, polimerasa, fosfatasa
alquilina, quinasa polinucleótida), ligadores, grupos protectores,
polinucleótidos, nucleósidos, nucleótidos, sales, ácidos, bases,
soportes sólidos, o cualquier combinación de estos.
Como se apreciara por un experto en esta
técnica, un kit para preparar polímeros no naturales podría contener
ítems necesarios para preparar polímeros no naturales que utilizan
los métodos inventivos, descritos aquí. Tal un kit puede incluir
plantillas, anti-codones, unidades de transferencia,
unidades de monómeros, o combinaciones de estos. Un kit para
sintetizar moléculas pequeñas puede incluir plantillas,
anti-codones, unidades de transferencia, elementos
fundamentales, andamios de moléculas pequeñas, o combinaciones de
estos.
El kit también se puede equipar con ítems
necesarios para amplificar y/o evolucionar una plantilla de
polinucleótido tal como una polimerasa estable al calro para PCR,
nucleotidos, amortiguador, e inciadores. El kit también puede
incluir elementos utilizados comúnmente en el desarrollo de mezcla
de ADN tal como polinucleótidos, ligasa, y nucleotidos.
En adición a las unidades de transferencia y
plantillas descritas aquí, la presente invención también incluye
composiciones que comprenden moléculas pequeñas complejas, andamios,
o polímeros no naturales preparados por uno cualquiera o más de los
métodos de la invención como se describe aquí.
Los ejemplos representativos que siguen se
pretende que ayuden a ilustrar la invención, y no están destinados
a, ni se deben constituir como, limitantes del alcance de la
invención. De hecho, varias modificaciones de la invención y muchas
modalidades adicionales de esta, en adición a aquellas mostradas y
descritas aquí, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica
a partir de los contenidos completos de este documento, que incluyen
los ejemplos que siguen y las referencias a la literatura científica
y de patentes citada aquí.
Los siguientes ejemplos contienen información
adicional importante, de ejemplo y guía que se pueden adaptar para
la práctica de esta invención en sus varias modalidades y los
equivalentes de estas.
Claramente, implementar la aproximación de
evolución de molécula pequeña descrita anteriormente requiere
estabilizar la síntesis de plantilla de ADN. La presente invención,
para la primer vez, establece la generalidad de esta aproximación y
permite así la síntesis de una variedad de compuestos químicos que
utilizan la síntesis de plantilla de ADN. Como se muestra en la
Figura 6a, la capacidad de dos arquitecturas de ADN para soportar la
síntesis de plantilla de ADN de fase-solución se
establece. Las plantillas de horquilla (H) y extremo de hélice (C)
que llevan grupos maleimidas electrofílicos reaccionan
eficientemente con un equivalente de reactivo tiol ligado a un
oligonucleótido de ADN complementario para producir el producto
tioéter en minutos a 25ºC. Los índices de reacción de plantilla de
ADN (K_{app} = \sim10^{5} M^{-1}s^{-1}) es similar a las
arquitecturas H y E a pesar de las diferencias significativas en la
orientación relativa a sus grupos reactivos. En contraste, no se
observa producto cuando se utiliza reactivos que contienen secuencia
desparejas, o cuando utilizan plantillas
pre-apagadas con exceso
\beta-mercaptoetanol (Figura 6a). ambas plantillas
soportan por lo tanto adición de plantilla de ADN de
secuencia-específica de un tiol a una maleimida
aunque las estructuras de los productos resultantes difieren
marcadamente de la estructura de ADN natural. Se observan poco o
ningunos productos de reacción intramolecular sin plantilla bajo las
condiciones de reacción (pH 7.5, 25°C, 250 mM NaCl, 60 nM plantilla
y reactivo).
\newpage
Adicionalmente, las reacciones de plantilla de
ADN de secuencia-específica atraviesan una variedad
de tipos de reacción (S_{N}2 sustituciones, adiciones a sistemas
carbonilo \alpha,\beta-no saturados, y adiciones
a vinil sulfonas), nucleófilos (tioles y aminas), y estructuras
reactivas todas proceden en buenos rendimientos con excelentes
selectividad de secuencia (Figura 6b). Las masas de producto
esperado se verifican mediante espectrometría de masa. En cada caso,
reactivos parejos pero no desparejos usan producto eficientemente a
pesar de variaciones considerables en su geometría de estado de
transición, impedimento estérico y flexibilidad conformacional.
Colectivamente estos hallazgos indican que la síntesis de plantilla
de ADN es un fenómeno general capaz de soportar un rango de tipos de
reacción, y no se limita a la creación de estructuras que semejan
estructuras de ácido nucleico como se describió previamente.
Ya que la discriminación de secuencia es
importante para la traducción de ADN en estructuras sintéticas, el
índice de reacción o reactivo parejo comparado con aquel re un
reactivo que lleva una base despareja sencilla cerca del centro de
su oligonucleótido base 10 se mide. A 25ºC, el indice inicial de
reacción o reactivos tios parejos con plantillas H ligadas con
yodoacetamida es 200 veces más rápido que aquel de los reactivos que
llevan un desparejo único(k_{app} = 2.4 x 10^{4}
M^{-1}s^{-1} versus 1. 1 x 10^{2} M^{-1}s^{-1}, Fig 7).
Adicionalmente, pequeñas cantidades de productos de la hibridación
de reactivos desparejos se puede eliminar al elevar la temperatura
de reacción más allá del T_{m} de los reactivos desparejos (Figura
7). La reducción en el índice de formación de producto como
temperatura se eleva, adicionalmente indica que la formación de
producto procede por un mecanismo de plantilla de ADN diferente de
un mecanismo intermolecular simple.
En adición a la reacción de especificidad de
secuencia y generalidad, la síntesis de la plantilla de ADN también
demuestra independencia de distancia destacada. Ambas plantilla H y
E ligadas a grupos maleimida o
\alpha-yodoacetamida promueven la reacción de
secuencia-específica con reactivos tiol parejos,
pero no desparejos, hibridizados en cualquier parte en las
plantillas así examinadas (hasta 30 bases lejos del grupo reactivo
en la plantilla). Los reactivos hibridizan una base lejos de la
reacción con índices similares como aquellas bases hibridizadas 2,
3, 4, 6, 8, 10, 15, 20, o 30 (Figura 8). En todos los casos, los
indices de reacción de plantilla son varios cientos de veces mayores
que en la proporción de reacción sin plantilla (despareja)
(k_{app} = 10^{4}-10^{5}M^{-1}s^{-1}
versus. 5 x 10^{1} M^{-1}s^{-1}). En distancias participadoras
de 30 bases, se forman productos eficientemente presumiblemente a
través de la transición de estados que semejan 200 miembros de
anillos. Estos hallazgos contrastan de forma brillante con la
dificultad bien conocida de macrociclización (ver, por ejemplo, G.
Illuminati et al. Acc. Chem. Res. 1981, 14,
95-102, R. B. Woodward et al. J. Am. Chem.
Soc. 1981, 103, 3210-3213) en síntesis orgánica.
Para determinar la base de la distancia de
independencia de la síntesis de plantilla de ADN, una serie de
plantillas E modificadas se sintetiza primero en la que las bases
que intervienen se reemplazan por una serie de análogos ADN
diseñados para evaluar la contribución posible de (i) interacciones
interbase, (ii) preferencias conformacionales de la estructura de
ADN, (iii) la estructura de fosfato cargada, y (iv) estructura de
hidrofilicidad. Las plantillas en que las bases que intervienen se
reemplaza con cualquiera de los análogos en la Figura 9 tiene poco
efecto sobre los índices de formación de producto. Estos hallazgos
indican que los elementos estructurales de la estructura específica
para ADN no son responsables para la independencia de la distancia
observada de la síntesis de plantilla de ADN. Sin embargo, la
adición de un oligonucleótido de ADN base 10 complementario
"grapa" a la región de intervención de hebra sencilla reduce
significativamente la formación de producto (Figura 9) sugiriendo
que la flexibilidad de esta región es critica para la síntesis de
plantilla de ADN eficiente.
Los índices de reacción independiente de
distancia se pueden explicar si los eventos que forman enlace en un
formato de plantilla de ADN se aceleran suficientemente con relación
a sus contrapartes sin plantilla de tal forma que la hibridización
de ADN, diferente a la formación de enlace, es determinante de
proporción. Si la hibridización de ADN es al menos limitante de
indice parcial, entonces el índice de formación de producto se debe
reducir ya que la concentración de reactivos se reduce debido a la
hibridización, probablemente la formación de enlace de plantilla, es
un proceso bimolecular. la reducción de la concentración de
reactivos en el caso de la plantilla E con uno o diez bases que
intervienen entre los grupos reactivo resulta en una reducción
marcada en el índice de reacción observado (Figura 10). Esta
observación sugiere que los efectos de proximidad en la síntesis de
plantilla de ADN puede mejorar los indices de formación de enlace al
punto que la hibridación de ADN se convierte en determinante de
proporción.
Estos hallazgos dan la posibilidad de utilizar
la síntesis de plantilla de ADN para traducir en una librería pot de
ADN en librerías de solución-fase de moléculas
sintéticas adecuadas para amplificación PCR y selección. La
capacidad de la síntesis de ADN de plantillas para soportar una
variedad de geometrías de estado de transición sugiere su potencial
en dirigir un rango de reacciones sintéticas compatibles con aguas
poderosas (ver, Li, C. J. Organic Reactions in Aqueous Media, Wiley
and Sons, New York: 1997). La especificad de la secuencia descrita
anteriormente sugiere que mezclas de reactivos pueden ser capaces de
reaccionar predeciblemente con mezclas complementarias de plantilla.
Finalmente, la independencia de la distancia observada sugiere que
regiones diferentes de "codones" de ADN se pueden utilizar para
codificar diferentes grupos en el mismo andamio sintético sin
deteriorar proporciones de reacción. Como una demostraron de esta
aproximación, una librería de 1025 plantillas ligadas a maleimida se
sintetiza, cada una con una secuencia de ADN diferente en una región
que codifica 8 bases (Figura 11). Una de estas secuencias,
5'-TGACGGGT-3', se escoge
arbitrariamente para codificar la unión de un grupo biotina a la
plantilla. Una librería de reactivos tiol ligada a 1025
oligonucleótidos diferentes también se genera. El reactivo ligado
3'-ACTGCCCA-5' contiene un grupo
biotina, mientras que los otros 1024 reactivos no contienen biotina.
Las proporciones equimolares de todas las 1025 plantillas y 1025
reactivos se mezclan en un pot durante 10 min a 25ºC y los productos
resultantes se seleccionan in Vitro para unir a
estreptavidina. Moléculas que sobreviven la selección se amplifican
por PCR y se analizan por digestión de restricción y secuenciamiento
de ADN.
La digestión con la endonucleasa de restricción
Tsp451, que cliva el GTGAC y por lo tanto corta la plantilla que
codifica biotina pero ninguna de las otras plantillas, revela una
proporción 1:1 de biotina que codifica a plantillas que codifican no
biotina luego de selección (Figura 12). Esto representa un
enriquecimiento 1000 veces comparado con la librería no
seleccionada. El secuenciamiento del ADN del grupo amplificado PCR
antes y después de selección sugiere un grado similar de
enriquecimiento e indica que la plantilla que codifica biotina es el
mayor producto de después de selección y amplificación (Figura 12).
la capacidad de síntesis de la plantilla de ADN para soportar la
reacción de secuencia-específica simultánea de 1025
reactivos, cada uno de los cuales se enfrenta una proporción 1024: 1
de plantillas de ningún compañero a plantillas compañero, demuestra
su potencial como un método para crear librerías sintéticas en un
pot. La anterior traducción prueba de principio, selección y
amplificación de un miembro de librerías sintético tienen un
propiedad específica (afinidad de avidina en este ejemplo) dirige
varios requerimientos clave para la evolución de librerías de
moléculas pequeñas no naturales hacia las propiedades deseadas.
Tomados juntos, esos resultados sugieren que la
síntesis de plantillas de ADN es un fenómeno sorprendentemente
general capaz de dirigir a diferencia de codificar simplemente, un
rango de reacciones químicas para formar productos no relacionados
en estructura a estructuras de ácido nucleico. Para varias
reacciones examinadas, el formato de plantilla de ADN acelera la
proporción de formación de unión más allá de la proporción de una
hibridización de oligonucleótido de ADN base 10 a su complemento,
resultando en independencia de distancia sorprendente. La naturaleza
fácil de las reacciones de plantilla de ADN de larga distancia
también pueden elevar en parte la tendencia del agua a contraer el
volumen de reactivos no polares (ver, C.-J. Li et al. Organic
Reactions in Aqueous Media, Wiley and Sons: New York, 1997) y de
posible compactación del ADN de hebra sencilla que interviene entre
los productos de reacción. Estos hallazgos pueden tener
implicaciones para evolución prebiótica y para entender los
mecanismos de ácidos nucleicos catalíticos con sustratos típicamente
localizados para una hebra de ARN o ADN.
Síntesis de ADN. Se sintetizan oligonucleótidos
de ADN en un sintetizador de ADN PerSeptive Biosystems Expedite 8909
que utiliza protocolos estándar y purifica por HPLC de fase reversa.
Los oligonucleótidos se cuantifican espectrofotométricamente y
mediante desnaturalización por electroforesis de gel de
poliacrilamida (PAGE) seguido por teñido con bromuro de etidio o
Verde SYBR (sondas moleculares) y cuantificación utilizando un
densitometro Stratagene Eagle Eye II. Las fosforamiditas permiten la
síntesis del 5'-NH_{2}-dT,
5'tetraclorofluoresceina, espaciador de estructura abásica,
espaciador de estructura C3, espaciador de polietilenglicol
9-unido, espaciador de hidrocarburos saturados
12-unido y grupos biotina 5' se compran de Glen
Research. Se sintetizan reactivos de oligonucleótido ligados a tiol
en disulfuro C3 controlado en vidrio poroso (Glen Research).
Funcionalización de plantilla. Las plantillas
que llevan grupos 5'-NH_{2}-dT se
transforman en una variedad de grupos electrofílicos funcionales
mediante reacción con el éster electrofílo-NHS
apropiado (Pierce). Se desarrollan reacciones en 200 mM de fosfato
de sodio pH 7.2 con 2 mg/mL de ester
electrofilo-NHS, 10% DMSO y hasta 100 100 \mug de
plantilla 5'amino a 25ºC durante 1h. se purifican los productos
deseados mediante HPLC de fase reversa y se caracteriza por
electroforesis de gel y espectrometría de masa MLDI.
Reacciones de síntesis de plantilla de ADN. Se
inician reacciones al mezclar cantidades equimolar de reactivos y
plantillas en amortiguador que contienen 50 mM de MOPS pH 7.5 y 250
mM NaCl en la temperatura deseada (25ºC a menos que se establezca
otra cosa). Las concentraciones de los reactivos y plantillas fueron
de 60 nM a menos que se indique otra cosa. En varios puntos de
tiempo, se remueven alícuotas, se apagan con exceso de
\beta-mercaptoetanol, y se analizan por
desnaturalización PAGE. Los productos de reacción se cuantifican por
densitometría utilizando su fluorescencia intrínsica o al teñir
seguido por densitometría. Productos representativos también se
verifican por espectrometría de masa MALDI.
Selección in Vitro para unión de avidina.
Los productos de la reacción de traducción de librerías se aíslan
por precipitación de etanol y se disuelven en amortiguador de unión
(10 mM Tris pH 8,1 M NaCl, 10 mM EDTA). Los productos se incuban con
30 \mug de glóbulos magnéticos ligados con estreptavidina (Roche
Biosciences) durante 10 min a temperatura ambiente en 100 \muL de
volumen total. Los glóbulos se lavan 16 veces con amortiguador de
unión y se eluyen por tratamiento con 1\mumol libre de biotina en
100 uL de amortiguador de unión a 70ºC durante 10 minutos. Klas
moléculas eluadas se aíslan por precipitación de etanol y se
amplifican por protocolos PCR estándar (2 mM MgCl2, hibridización a
55ºC, 20 ciclos) utilizando los iniciadores
5'-TGGTGCGGAGCCGCCG y
5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCCCGGCTCC TCGGCTCGG. La
secuencia de ADN automatizado utiliza el iniciador
5'-CCACTGTCCGTGGCGCGACCC.
Secuencia de ADN. Secuencia no suministradas en
las Figuras con como sigue: reactivo ajustado en la Figura 6b
reacciones SIAB y SBAP:
5'-CCCGAGTCGAAGTCGTACC-SH; reactivo
desajustado en la Figura 6b reacciones SIAB y SBAP:
5'-GGGCTCAGCTTCCCCATAA-SH; reactivos
desajustados para otras reacciones en las Figuras 6b, 6c, 6d, y 8a;
5'-FAAATCTTCCC- SH (F= tetraclorofluoresceina);
reactivos en las Figuras 6c y 6 contienen un desajuste:
5'-FAATTCTTACC-SH plantillas E en
las Figuras 6a, 6b reacciones SMCC, GMBS, BMPS, y SVSB, y 8a:
5'-(NH_{2}dT)-
CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTTCGACTCG AGG;
plantilla H en la Figura 6b reacciones SIAB, SBAP, y SIA:
5'-(NH_{2}dT)- CGCGAGCGTACG CTCGCG ATGGTACGAATTC; oligonucleótido
en la Figura 8b: 5'-ATTCGTACCA.
Como se discutió anteriormente, la generalidad
de la química sintetiza de plantilla de ADN se examina (ver, Liu
et al. J Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961). Específicamente, la
capacidad de la síntesis de plantilla de ADN para dirigir una
recolección de modesta de reacciones químicas sin requerir la
alineación precisa de grupos reactivos en conformaciones similares a
ADN se demuestra. De hecho, la independencia de la distancia y
fidelidad de secuencia de la síntesis de plantilla de ADN permite la
traducción en un pot simultanea de una librería modelo de más de
1000 plantillas dentro de los productos tioéter correspondientes,
uno de los cuales se enriquece mediante selección in Vitro
para unir a la proteína de estreptavirina y amplificada por PCR.
Como se describe en detalle aquí, la generalidad
de la síntesis de plantilla de ADN se ha expandido adicionalmente y
se ha demostrado que una variedad de reacciones químicas se pueden
utilizar para la construcción de moléculas pequeñas y en particular,
para la primera vez, acoplamientos organometalicos de plantilla de
ADN y enlaces carbono-carbono que forman reacciones
diferentes a fotodimerización de pirimidina. Esas reacciones
representan claramente una etapa importante hacia la evolución in
vitro de moléculas sintéticas no naturales al permitir la
construcción de plantilla de ADN de un conjunto mucho mas diverso de
estructuras que se han logrado previamente.
La capacidad de la síntesis de plantilla de ADN
para dirigir reacciones que requieren un activador no ligado con
ADN, catalizador u otro reactivo en adición a los reactivos
principales también se ha demostrado aquí. Para probar la capacidad
de la síntesis de plantilla de ADN para mediar tales reacciones sin
requerir imitación estructural de la estructura de plantilla de ADN,
aminaciones reductivas de plantilla de ADN entre una plantilla
ligada con amina (1) y bensaldehido- o reactivos ligados con glioxal
(3) con concentraciones milimolares de NABH_{3}CN a temperatura
ambiente en una solución acuosa se pueden desarrollar.
Significativamente, los productos formados eficientemente cuando las
plantillas y secuencias de reactivos se complementan, mientras que
las reacciones de control en las cuales las secuencias de reactivo
no complementan aquella de la plantilla, o en la cual el
NABH_{3}CN se omite, no produce productos significativos (ver
Figuras 13 y 14). Aunque afinaciones reductivas de plantilla de ADN
para generar productos imitan cercanamente la estructura del ADN de
doble hebra se han reportado previamente (ver, por ejemplo, X. Li
et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 746 y Y. Gat et
al. Biopolymers 1998, 48, 19), los anteriores resultados
demuestran la aminación reductiva para generar estructuras no
relacionadas con la estructura de fosforibosa para que tenga lugar
eficientemente y secuencia-específica. Con relación
a la Figura 15, las formulaciones de enlace de plantilla de ADN
entre plantillas de ligadas a amina 4 y 5 reactivos ligados a
carboxilato 6-9 mediados por
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDC) y N-hydroxylsulfosuccinimida
(sulfo-NHS) para generar productos amida en buenos
rendimientos en pH 6.0, 25ºC (Figura 15). La formación de producto
es secuencia-específica, dependiente de la presencia
de EDC, y sorprendentemente insensible al lastre esterico de la
amina o carboxilato. La formación de amina de plantilla de ADN
eficiente también se mide por el activador estable al agua cloruro
4-(4,
6-dimetoxi-1,3,5-trizin-2-yl)-4-metilmorfolino
(DMT-MM) en cambio de EDC y
sulfo-NHS (Figuras 14 y 15). La eficiencia y
generalidad de la formulación de enlace amida de plantilla de ADN
bajo estas condiciones juntas con un gran número de aminas quirales
disponibles comercialmente y ácidos corboxiíicos, hace esa reacción
un candidato atractivo en la síntesis de plantilla de ADN futura de
estructuralmente librerías de moléculas pequeñas diversas.
Se apreciara que las reacciones que forman
enlaces carbono-carbono también son importantes en
la síntesis biológica y química y así varias de tales reacciones se
utilizan en el formato de plantilla de ADN. La reacción de reactivo
ligado con nitroalcano (10) con plantilla de
ligado-aldehido (11) (reacción nitro aldol o
reacción Henry) y la adición de conjugado de diez a plantilla ligada
a maleimida (12) (adición nitro-Michael) procede
efectivamente y con alta especificidad de secuencia en pH
7.5-8.5, 25ºC (Figuras 13 y 14). Adicionalmente, la
reacción Wittig de plantilla de especifica de secuencia entre el
reactivo de fosforo estabilizado 13 y las plantillas ligadas
aldehido 14 o 11 dados los productos de olefina correspondientes en
rendimientos excelentes en pH 6.0-8.0, 25ºC (Figuras
13 y 14). De forma similar, la plantilla de ADN cicloadición
1,3-dipolar entre los reactivos ligados a nitron 15
y 16 y plantillas ligadas a olefina 12,17 o 18 también producen
específicamente secuencias de productos en pH 7.5, 25ºC (Figuras 13
y 14).
En adición a las reacciones descritas
anteriormente, las reacciones de acoplamiento organometalico también
se pueden utilizar en la presente invención. Por ejemplo, las
reacciones Heck de plantilla de ADN se desarrollan en la presencia
de precatalizadores de Pd solubles en agua. En la presencia de 170
mM Na_{2}PdCl_{4}, el reactivo ligado a yoduro 19 y una variedad
de plantillas ligadas a olefina que incluyen maleimida 12 acrlamida
17, vinil sulfona 18, o cinnamamida 20 producen producto de
acoplamiento Heck en rendimientos modestos en pH 5.0, 25ºC (Figuras
13 y 14). Para acoplamientos con olefinas 17, 18, y 20, agregar dos
equivalentes de P
(p-S0_{3}C_{6}H_{4})_{3} por
equivalente de Pd antes a la plantilla y reactivo adicional
incrementa típicamente los rendimientos generales dos veces. Las
reacciones de control que contienen desajustes de secuencia o que
les falta precatalizador Pd no tienen rendimiento de producto. A
nuestro conocimiento, la anterior adición de nitro aldol de
plantilla de ADN, adición nitro Michael, olefinación Wittig,
cicloadición dipolar, y acoplamiento Heck representan las primeras
reacciones organometalicas de plantilla de ácido nucleico reportadas
y reacciones formadoras de enlace carbono-carbono
diferentes de fotodimeración de pirimidina.
Se descubrió previamente que las mismas
reacciones de plantilla de ADN demuestran independencia de
distancia, la capacidad para formar productos en una proporción
independiente del número de bases intervinientes entre reactivos de
hibridización. Se ha hecho hipótesis (Figura 16a) que la distancia
de independencia se eleva cuando la proporción de formación de
enlace en la reacción de plantilla de ADN es mayor que la proporción
de hibridización de reactivo-plantilla. Aunque solo
un subconjunto de químicas cae dentro de esta categoría, cualquier
reacción de plantilla de ADN que produce rendimiento de productos
comparables cuando el reactivo se hibridiza en varias distancias del
extremo reactivo de la plantilla es de especial interés debido a que
esta se puede codificar en una variedad de posiciones de plantilla.
Para evaluar la capacidad que tiene las reacciones ADN de plantilla
para desarrolladas anteriormente para tener lugar eficientemente
cuando los reactivos se separan por distancias relevantes a la
codificación de librería, los productos de aminación reproductiva
reductiva, formación de amida, adición de
nitro-aldol, adición nitro-Michael,
olefinación Wittig, cicloadición dipolar, y acoplamiento Heck cuando
las bases son cero o diez de grupos reactivos de hibridización
separados (Figura 16a, N=0 versus N=10) se comparan. Entre las
reacciones descritas anteriormente o en trabajos previos, la
formación de enlace amida, adición nitro-aldol,
olefinación Wittig, el acoplamiento Heck, la adición de conjugado de
tioles a maleimidas y la reacción S_{N}2 entre tioles y amidas
\alpha-yodo demuestran la formación de producto
comparable cuando los grupos reactivos se separan por cero a diez
bases (Figura 16b). Estos hallazgos indican que estas reacciones se
pueden codificar por nucleótidos que son distantes del extremo
reactivo de la plantilla sin dañar significativamente la formación
de producto.
En adición a la reacción S_{N}2 de plantilla
de ADN, la adición de conjugado, adición de sulfona vinilo formación
de enlace amida, aminación reductiva, nitro-aldol
(reacción Henry), nitro Michael, olefinación Wittig, cicloadición
1,3-dipolar y reacción de acoplamiento Heck
descritas directa y anteriormente, una variedad de reactivos
adicionales también se puede utilizar en el método de la presente
invención. Por ejemplo, como se describe en la Figura 17, reacciones
sintéticas de plantilla de ADN acuosas poderosas incluyen, pero no
están limitadas a, adición de aldol catalizadas-ácidos Lewis,
reacción Mannich, reacciones de anulación Robinson, adiciones de
indio alilo, zinc y estaño a cetonas y aldehídos, sustitución
alílica asistida con Pd, cicloadiciones Diels-Alder
y reacciones hetero Diels-Alder se puede utilizar
eficientemente en solvente acuoso y son reacciones de construcción
de complejidad importante.
Tomados juntos, estos resultados se expande
considerablemente al alcance de la reacción de la síntesis de
plantilla de ADN. Una amplia variedad de reacciones proceden
eficientemente y selectivamente solo cuando los reactivos
correspondientes se programan con frecuencias complementarias. Al
aumentar el reportero de las reacciones de plantilla de ADN
conocidas incluye ahora la formación de enlaces
carbono-carbono y reacciones organometálicas
(adiciones nitro-aldol, adiciones
nitro-Michael, olefinaciones Wittig, cicloadiciones
dipolar, y acoplamientos Heck) en adición a la formación de enlaces
amida reportadas previamente (ver, Schmidt et al. Nucleic
Acids Res. 1997, 25, 4792; Bruick et al. Chem. Biol. 1996, 3,
49), formación de imina (Czlapinski et al. J. Am. Chem. Soc.
2001, 123, 8618), aminación reductiva (Li et al. J. Am. Chem.
Soc. 2002, 124, 746; Gat et al. Biopolymers 1998, 48, 19)
reacciones S_{N}2 (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001,
123, 6961; Xu et al. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 148; Herrlein
et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10151) adición de
conjugado de tioles (Gartner et al. J. Am. Chem. Soc. 2001,
123, 6961), y formación de fosfoéster o fosfonamida (Orgel et
al. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 109; Luther et al. Nature,
1998, 396, 245), estos resultados pueden permitir la traducción
especifica-de secuencia de librerías de ADN en
librerías de productos sintéticos estructural y funcionalmente
diversos. En razón a que las cantidades pequeñas de moléculas que
codifican plantillas deseadas se pueden amplificar por PCR, los
productos de reacciones de plantilla de ADN son menos críticas que
los productos de transformaciones sintéticas tradicionales. A pesar
de eso, muchas de las reacciones desarrolladas anteriormente
proceden eficientemente. Adicionalmente, al demostrar que las
síntesis de plantilla de ADN en la ausencia de proteínas pueden
dirigir una gran variedad de reacción químicas, estos hallazgos
soportan previamente la hipótesis propuesta de que la síntesis de
plantilla de ácido nucleico puede tener información replicable
traducida en algunas de sus moléculas funcionales más recientes
tales como policétidos, terpenos y polipéptidos antes de la
evolución de las enzimas basadas en proteína. La diversidad de
química mostrada aquí es simplemente controlable al llevar reactivos
en la proximidad por la hibridización de ADN sin los requerimientos
estructurales obvios que suministran una base experimental para
estas posibilidades. La traducción de información amplificable
dentro de un amplio rango de estructuras es un requerimiento cable
para aplicar la evolución molecular de la naturaleza alo
descubrimiento de moléculas no naturales con nuevas funciones.
Las plantillas funcionalizadas y reactivos se
preparan típicamente al hacer reaccionar oligonucleótidos terminados
en 5'-NH_{2} (para la plantilla 1),
oligonucleótidos terminados en
5'-NH_{2}-(CH_{2}O)_{2} (para todas las
otras plantillas) o nucleótidos terminados en
3'-OPO_{3}-CH_{2}CH
(CH_{2}OH)(CH_{2})_{4}NH_{2} (para todos los
reactivos) con los ésteres NHS apropiados (0.1 volúmenes de una
solución de 20 mg/mL en DMF) en amortiguador de fosfato sodio 0.2 M,
pH 7.2, 25ºC, 1 h para suministrar las estructuras de plantilla y
reactivo mostradas en las Figuras 13 y 15. para los reactivos
ligados con aminoácido 6-9, oligonucleótidos
terminados en
3'-OPO_{3}-CH_{2}CH-(CH_{2}OH)(CH_{2})_{4}NH_{2}
en 0.2 M de amortiguador de fosfato de sodio, pH 7.2 se hacen
reaccionar con 0.1 volúmenes en solución de 100 mM bis
[2-(succinimidiloxicarboniloxi) ethil] sulfona (BSOCOES, Pierce) en
DMF durante 10 min a 25ºC, seguido por 0.3 volúmenes de un
aminoácido 300 mM en 300 mM de NaOH durante 30 min a 25ºC.
Los reactivos y plantillas funcionalizados se
purifican por filtración de gel utilizando Sephadex
G-25 seguido por HPLC de fase reversa (gradiente de
acetato-acetonitrilo tietilamonio 0.1) y
caracterizado por espectrometría de masa MALDI. Las reacciones de
plantilla de ADN se conducen bajo las condiciones descritas en las
Figuras 13 y 15 y los productos se caracterizan al desnaturalizar
por electroforesis de gel de poliacrilamida y espectrometría de masa
MALDI.
Las secuencias de plantillas de oligonucleótidos
y reactivos son como sigue (dirección 5' a 3', n se refiere al
número de bases entre los grupos reactivos cuando la plantilla y el
reactivo se hibridizan como se muestra en la Figura 16). 1:
TGGTACGAATTCGACTCGGG; 2 y 3 ajustados: GAGTCGAATTCGTACC; 2 y 3
desajustados: GGGCT
CAGCTTCCCCA; 4 Y 5: GGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTT; 6-9 ajustado (n = 10): TCCCGAGTCG; 6 ajustado (n = 0): AATTCGTACC; 6-9 desajustado: TCACCTAGCA; 11, 12, 14, 17, 18, 20: GGTACGAATTC
GACTCGGGA; 10, 13, 16, 19 ajustado: TCCCGAGTCGAATTCGTACC; 10, 13, 16, 19 desajustado: GGGCT
CAGCTTCCCATAAT; 15 ajustado: AATTCGTACC; 15 desajustado: TCGTATTCCA; comparación de plantilla para n = 10 versus n = 0: TAGCGATTACGGTACGAATTCGACTCGGGA.
CAGCTTCCCCA; 4 Y 5: GGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTT; 6-9 ajustado (n = 10): TCCCGAGTCG; 6 ajustado (n = 0): AATTCGTACC; 6-9 desajustado: TCACCTAGCA; 11, 12, 14, 17, 18, 20: GGTACGAATTC
GACTCGGGA; 10, 13, 16, 19 ajustado: TCCCGAGTCGAATTCGTACC; 10, 13, 16, 19 desajustado: GGGCT
CAGCTTCCCATAAT; 15 ajustado: AATTCGTACC; 15 desajustado: TCGTATTCCA; comparación de plantilla para n = 10 versus n = 0: TAGCGATTACGGTACGAATTCGACTCGGGA.
Productos de reacción cuantificados al
desnaturalizar por electroforesis de gel de pliacrilamida seguido
por teñido con bromuro de ehidio, visualización UV, y densitometría
basado en CCD del producto y las bandas de material de partida de
plantilla. Lo cálculos de rendimiento asumen que la plantilla y los
productos teñidos con igual intensidad por base; para aquellos casos
en los que los productos son parcialmente de doble hebra durante la
cuantificación, los cambios en la intensidad de teñido pueden
resultar en rendimientos aparentemente mayores.
Como se apreciara por un experto en la técnica,
es frecuentemente útil dejar la porción de ADN de los reactivos
ligados a productos durante el desarrollo de reacción para facilitar
el análisis por electroforesis de gel. El uso de síntesis de
plantillas de ADN para traducir librerías de ADN en librerías
correspondientes de moléculas pequeñas sintéticas adecuadas para
selección in vitro, sin embargo, requiere el desarrollo de
ligadores clivables que conecten grupos reactivos de reactivos con
sus oligonucleótidos que codifican ADN. Como se describe aquí
adelante tres tipos de ejemplos de ligadores se han desarrollado
(ver, Figura 18). Para reactivos de un grupo de reactivo, seria
deseable a la posición ADN como un grupo saliente de la porción
reactiva. De acuerdo son esta estrategia de ligador
"autoclivable" el enlace del grupo reactivo ADN se cliva como
una consecuencia natural de la reacción. Como un ejemplo de esta
aproximación, un reactivo de fosforano Wttig fluorescente (14, con
referencia a la Figura 19) se sintetiza en el que el
oligonucleótidos que codifica se adhiere a uno de los grupos
arilofosfina (ver, Figura 19, izquierda). La reacción Wittig de
plantilla de ADN con plantillas ligadas a aldehído resulta en la
transferencia casi cuantitativa del grupo fluorescente a partir del
reactivo Wittig a la plantilla y la liberación con comitante del
producto alqueno a partir de la porción de ADN del reactivo.
Adicionalmente, los reactivos que llevan más de un grupo reactivo se
pueden ligar a sus oligonucleótidos que codifican ADN una de dos
estrategias de ligador adicionales. En la estrategia de ligador
"sin marca", la reacción de plantilla de ADN de un grupo
reactivo es seguido por el clivaje del ligador unido a través de un
segundo grupo reactivo a productos de rendimiento sin dejar atrás la
funcionalidad química adicional. Por ejemplo, se sintetiza una serie
de reactivos de aminoácido que se conectan a través de un ligador
decarbamoiletilsulfona a sus oligonucleótidos que codifican ADN
(Figura 19, centro). Los productos de la formación de enlace amida
de plantilla de ADN que utilizan estos reactivos de aminoácidos se
tratan con amortiguador acuoso alcalino para efectuar la eliminación
cuantitativa y descarboxilaciones espontánea del grupo carbamoilo.
El producto saliente de este ligador sin marca es por lo tanto la
porción de aminoácido transferida. En un otra modalidad de la
invención, una tercera estrategia, una "marca útil" se puede
utilizar en la teoría esta puede ser ventajosa para introducir
grupos químicos útiles como una consecuencia del clivaje de ligador.
En particular, una "marca útil" se puede funcionalizar en
etapas posteriores y se deja detrás luego del clivaje de ligador.
Por ejemplo, los reactivos de aminoácidos ligados a través de
1,2-dioles a sus oligonucleótidos que codifican ADN
se genera. Luego de la formación de enlace amida, este ligador se
cliva cuantitativamente mediante oxigenación con NaIO_{4} para dar
productos que llevan aldehídos útiles (ver, Figura 19, derecha). En
adición a los ligadores descritos directa y anteriormente, una
variedad de ligadores adicionales se puede utilizar. Por ejemplo,
como se muestra en la Figura 20, un ligador de tioéster se puede
generar mediante acoplamiento mediado por carbodiimida de ADN
tiol-terminado con reactivos que contienen
carboxilato y se pueden clivar con base acuosa. En razona a que el
grupo carboxilato suministra la entrada en las reacciones de
formación de enlace amida de plantilla de ADN descritas
anteriormente, este ligador podría liberar un "marca util"
cuando se cliva (ver, Figura 20). Alternativamente, el ligador
tioéster se puede utilizar como un ligador autoclivable durante una
reacción de acilación de amina en la presencia de cationes
Ag(I) (ver, Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121,
3311-3320) ya que la porción de
tiol-ADN del reactivo se libera como una
consecuencia natural de la reacción. Se apreciara que un ligador de
tioéter que se puede eliminar y oxidar en pH 11 para liberar una
fuente de vinilo se puede utilizar como un ligador de "marca
útil". Como se demuestra aquí, el grupo vinilsulfona sirve como
el sustrato en un número de reacciones de plantilla de ADN
posteriores.
Como se demuestra aquí, una variedad de
reacciones de plantilla de ADN puede ocurrir en medio acuoso.
También se ha demostrado, como se discute adelante, que las
reacciones de plantilla de ADN pueden ocurrir en solventes
orgánicos, expandiendo grandemente así el alcance de la síntesis de
plantilla de ADN. Específicamente, las plantillas y reactivos de ADN
se han acomplejado con cationes de tetraalquilamonio de cadena larga
(ver, Jost et al. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 2143;
Mel'nilkov et al. Langmuir, 1999, 15,
1923-1928) para permitir al disolución cuantitativa
de componente de reacción en solventes orgánicos anhidros que
incluyen CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3}, DMF y MeOH.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la síntesis de plantilla de
ADN puede de hecho ocurrir el solventes orgánicos anhidros con al ta
selectividad de secuencia. Descrita en la Figura 21 está las
reacciones de formación de enlace amida de plantilla de ADN en que
los reactivos u plantillas se completan con cationes de
dimetildidodecilamonio en recipientes separados o después de
prehibridización en agua, liofilisados hasta secado, disueltos en
CH_{2}Cl_{2}, y mezclados juntos. Reacciones ajustadas, pero no
desajustadas suministran productos cuando los reactivos se
prehibridizan en solución acuosa y cuando ellos se mezclan por
primera vez en CH_{2}Cl^{2} (ver, Figura 21). La formación de
amida de la plantilla de ADN y el acoplamiento Heck mediado por Pd
en DMF anhidro también procede de
secuencia-específica. Claramente, estas
observaciones de la síntesis de plantilla de ADN de secuencia
especifica en solventes orgánicos implica la presencia de al menos
una estructura secundaria dentro de ADN tetraalquilamonio complejado
en un medio orgánico, y podría permitir a los receptores de ADN y
catalizadores ser involucrados hacia la esteroselectividad de ADN o
propiedades catalíticas en solventes orgánicos. Específicamente, las
reacciones de plantilla de ADN que son conocidas por ocurrir en
medio acuosa, que incluyen adiciones de conjugado, cicloadiciones
reacciones de desplazamiento, y acoplamientos mediados por Pd
también se puede desarrollar los solventes orgánicos. En cierta
otras modalidades, las reacciones en solventes orgánicos se puede
utilizar de tal forma que se desarrolle ineficiente o imposible en
agua. Por ejemplo, cuando la metátesis de olefina
Ru-catalizada en agua se ha reportado por Grubbs y
colaboradores (ver, Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120,
1627-1628; Lynn et al. J. Am. Chem. Soc.
2000, 122, 6601-6609; Mohr et al.
Organometalli s 1996, 15, 4317-4325), el sistema de
metatesis acuoso es un grupo sensible extremadamente funcional. La
tolerancia de grupo funcional de metátesis de olefina
Ru-catalizada en solventes orgánicas, sin embargo,
es significativamente más robusta. Algunas reacciones de ejemplo
utilizadas en solventes orgánicos pero no están limitadas a
cicloadición 1,3-dipolar entre nitrones y olefinas
que pueden proceder a través de estados de transición que son menos
polares que loe estados de fondo de materiales de partida.
Como se detalló anteriormente, la generalidad de
la síntesis de plantilla de ADN se ha establecido al desarrollar
varios tipos de reacción de plantilla de ADN distintos, ninguno de
los cuales se limita a producir estructuras que semejen la
estructura de ácido nucleico natural, y muchas de las cuales son
altamente útiles en la formación de enlace
carbono-carbono o reacciones sintéticas de
construcción complejas. Se ha mostrado que la tendencia de la
instancia de la síntesis de plantilla de ADN permite de diferentes
regiones de una plantilla de ADN a cada reacción sintética diferente
codificada. La síntesis de plantilla de ADN puede mantener la
fidelidad de la secuencia a un en un formato de librería en le que
más de 1000 plantillas y 1000 reactivos reaccionan simultáneamente
en el pot. Como se describió anteriormente y como se describe
adelante, se han desarrollado estrategias ligadoras, que junto con
las reacciones desarrolladas como se describió anteriormente, han
permitido la primer síntesis de plantilla de ADN multietapa de
moléculas pequeñas sintéticas simples. adicionalmente, la síntesis
de plantilla de ADN de secuencia específica en solvente orgánicos se
ha demostrado, expandiendo adicionalmente el alcance de está
aproximación.
A) Síntesis de una librería de policarbamato:
una modalidad de la estrategia descrita anteriormente es la creación
de una librería de policarbamato amplificable. De dieciséis
dinucleótidos posibles utilizados para codificar la librería, uno se
asigna a una función del codón de inicio, y una se asigna para
servir como un codón de parada. Un código genético artificial se
crea luego asignando cada uno de los 14 dinucleótidos restantes a un
monomero diferente. Por razones geométricas un monomero actualmente
contiene un dicarbamato que contiene dos cadenas laterales. Dentro
de cada monomero, el dicarbamato se une al dinucleótido
correspondiente (análogos para un anticodón tARN) atraves de un
ligador de silil enol éter que libera el ADN nativo y el carbamato
libre luego de tratamiento con fluoruro. La porción de dinucleótido
existe como el fosfato
5'-2-metilimidazol, que se ha
demostrado (Inoue et al. J. Mol. Biol. 162: 201,1982; Rembold
et al. J Mol. Evol. 38: 205,1994; Chen et al. J. Mol.
Biol. 181: 271, 1985; Acevedo et al. J. Mol. Biol.
197:187,1987; Inoue et al. J Am. Chem. Soc. 103: 7666,1981)
para servir como un grupo saliente excelente para oligonomerización
dirigida a plantillas de nucleótidos que aun es relativamente
estable bajo condiciones acusas básicas o neutras (Schwartz et
al. Science 228:585,1985;). la porción de bicarmato existe en
una forma cíclica ligada a través de un ligador de
viniloxicarbonato. El grupo vinilcarbonato se ha demostrado que
estable en condiciones acuosas básicas o neutras (Olofson et
al. Tetrahedron Lett. 18:1563, 1977; Olofson et al.
Tetrahedron Lett. 18:1567, 1977; Olofson et al. Tetrahedron
Lett. 18:1571, 1977;) y se ha mostrado adicionalmente que suministra
carbamatos en producciones muy altas luego de la adición de aminas
(Olofson et al. Tetrahedron Lett. 18:1563, 1977;).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se ataca por una amina a partir de una
cadena de policarbamato, el ligador de carbonato de vinilo,
conducido por la aromatización del m-pot, libera una
amina libre. Esta amina libre siempre posteriormente como el
nucleófilo para atacar el siguiente viniloxicarbonato, propagando la
polimerización de la cadena carbamato creciente. Tal una estrategia
minimiza el potencial par reactividad cruzada y polimerización
bi-direccional al asegurar que solo un nucleófilo
está presente en cualquier tiempo durante la polimerización.
Utilizando el monomero descrito anteriormente,
la traducción artificial de ADN en un policarbamato se puede ver
como un proceso de tres etapas. En la primera etapa, las plantillas
de ADN de hebra sencilla que codifican la librería se utilizan para
guiar el ensamble y polimerización de las porciones dinucleótidos de
los monómeros, terminando con el monomero de "paradas" que
posee un 3' metil éter en cambio de un grupo 3' hidroxilo (Figura
22).
Una vez sean ensamblado los nucleótidos y
polimerizados en ADN de doble hebra, la terminación de monomero
"inicio"en un o-nitrobencilcarbamato se
fotodesprotege para revelar la amina primaria que inicia la
polimerización de carbamato. La polimerización procede en la
dirección 5' a 3' junto con la estructura de ADN, con cada ataque
nucleofílico que resulta en el posterior desenmascaramiento de un
nuevo nucleófilo amina. El ataque del monomero "paradas" libera
una acetamida diferente a una amina, por lo tanto, termina la
polimerización (Figura 23). Debido a que el ADN existe en esta etapa
en una forma de doble hebra estable, variables tales como
temperatura y pH se pueden explorar para optimizar la eficiencia de
polimerización.
Luego de la polimerización se cliva el
policarbamato a partir de la estructura de fosfato del ADN luego del
tratamiento con fluoruro. La desilización del ligador enol éter y la
eliminación del fosfato conducido por la liberación resultante de
fenol suministra el policarbamato ligado covalentemente a su
terminal carboxi a su ADN de hebra sencilla codificada (Figura
24).
En esta etapa el policarbamato se puede liberar
completamente del ADN mediante hidrólisis base del ligado de éster.
Elo policarbamato liberado se puede purificar por HPLC y reensayado
para verificar que sus propiedades deseadas están intactas. El ADN
libre se puede amplificar utilizando PCR, mutar con PCR de
error-pron (Cadwell et al. PCR Methods Appl.
2:28,1992;) o mezcla de ADN (Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:10747,1994; Stemmer Nature 370:389,1994; U.S. Patent 5, 811,238,
issued September 22, 1998;) y/o secuenciada para revelar la
estructura primaria del policarbamato.
Síntesis de unidades de monomero. Después que se
sintetizan los monómeros, el ensamble y la polimerización de los
monómeros en el andamio de ADN puede ocurrir espontáneamente. Acido
Shikimico 1, disponible comercialmente, biosintéticamente (Davis
Adv. Enzymol. 16: 287,1955; incorporado aquí como referencia), o
mediante síntesis corta a partir de D-manosa (Fleet
et al. J Chem. Soc., Perkins Trans. I 905, 1984; Harvey et
al. Tetrahedron Lett. 32: 4111,1991;), sirve como un punto de
partida conveniente para la síntesis de monomero. Los grupos syn
hidroxilo se protegen como el p-metoxibencilideno, y
el grupo hidroxilo restante como el
tert-butildimetilsilil eter para producir 2. la
proporción carboxilato del ácido y shikimico se reduce luego
completamente mediante reducción LAH, tosilación del alcohol
resultante, y reducción adicional con LAH para dar 3.
Aminoácidos N-protegidos
accesibles sintéticamente y disponibles comercialmente sirven como
materiales de partida para la porción dicarbamato de cada monomero.
Se protegen cadenas laterales reactivas como éteres fotolabiles,
esteres, acetales, carbamatos, o tioéteres. Luego de la química
previamente desarrollada (Cho et al. Science 261:
1303,1993;), un aminoácido 4 deseado se convierte en el alcohol
amino correspondiente 5 a la mezcla con la formación anhídrido con
isobutilcloroformato seguido por reducción con borohidruro de sodio.
El amino alcohol se convierte entonces al carbonato activo mediante
tratamiento con p-nitrofenilcloroformato para
producir 6 que luego se acopla a un segundo amino alcohol 7 para
suministrar, siguiendo el grupo hidroxilo sililación y desprotección
FMOC, carbamato 8.
El acoplamiento de carbamato 8 en el ligador
derivado de ácido shikimico procede como sigue. El grupo hidroxilo
de alilico de 3 se desprotege con TBAF, se trata con anhídrido
trifico para formar el triflato secundario, luego se desplaza con
aminocarbamato 8 para producir 9. la presencia del grupo metil
vinilico en 3 debe asistir en la minimización de la cantidad no
deseada de producto resultante de la adición de S_{N}2' (Magid
Tetrahedron 36: 901,1980;). Las adiciones Michael de carbamatos
desprotegidos a esteres \alpha,\beta-no
saturados se han documentado bien (Collado et al. Tetrahedron
Lett. 35: 8037, 1994; Hirama et al. J. Am. Chem. Soc. 107:
1797, 1985; Nagasaka et al. Heterocycles 29: 155,1989;
Shishido et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993,1987;
Hirama et al. Heterocycles 28: 1229,1989;). Por analogía, la
amina secundaria se protege como el carbamato
o-nitrobencilo (NBOC), u el compuestos resultante se
desprotona en el carbamato de nitrógeno. Esta desprotección se puede
desarrollar tipicamente con hidruro de sodio o
tert-butiloxi o potasio (Collado et al.
Tetrahedron Lett. 35: 8037,1994; Hirama et al. J. Am. Chem.
Soc. 107:1797,1985; Nagasaka et al. Heterocycles 29:
155,1989; Shishido et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 993,
1987; Hirama et al. Heterocycles 28: 1229,1989;), aunque
otras bases se pueden utilizar para minimizar la desprotonación de
los protones nitrobencilicos. Adiciones del carbamato desprotonado a
cetona \alpha,\beta-no saturada 10, seguido por
el "trapiing" del elonato resultante con TBSCl, debe
producir silil enol éter 11. La estereoselectividad previamente
encontrada de las adiciones de conjugado a los enones
5-sustituido tal como 10 (House et al. J.
Org. Chem. 33:949,1968; Still et al. Tetrahedron 37: 3981,
1981) siguiere que la formación preferencial de 11 sobre su
diastereomero. Cetona 10, el precursor de ligador de
fosfato-carbamato clivable con fluoruro, se pude
sintetizar a partir de 2 mediante una descarboxilación en pot
(Barton et al. Tetrahedron 41: 3901,1985); seguido por
tratamiento con TBAF, oxidación Swem del alcohol resultante para
producir 12, desprotección con DDQ, formación de eter nitrobencilo
selectiva de alcohol menos oculto, y la reducción de grupo
\alpha-hidroxilo con yoduro de samario (Molander
In Organic Reactions, Paquette, Ed. 46: 211, 1994;).
El grupo p-metoxibencilidieno de
11 se transforma en el PMB \alpha-hidroxi sea
utilizando cianoborohidruro de sodio y cloruro TMS (Johansson et
al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. l 2371, 1984); y el grupo TES
desprotegido con 2% de HF (condiciones que no deben afectar el TBS
(Boschelli et al. Tetrahedron Lett. 26: 5239, 1985)), para
suministrar 13. el grupo PMB luego precedente (Johansson et
al. J Chem. Soc. Perkin Trans. 12371, 1984; Sutherlin et
al. Tetrahedron Lett. 34: 4897,1993); debe permanecer en el
alcohol secundario más oculto. Los dos grupos hidroxilos libres se
pueden macrociclizar mediante acidion muy lenta de 13 a una solución
de cloformato de p-nitrofenilo (u otro análogo
fosgeno) que suministra 14. el eter PMB se desprotege, y el alcohol
resultante se convierte en un triflato y se elimina bajo condiciones
cinéticas con una base oculta estericamente para producir
viniloxicarbonato 15. La fosfodesprotección del nitrobencilo y
nitrobencilocarbamato produce alcohol 16.
La síntesis de monomero se completa mediante
acoplamiento secuencial de los tres componentes. Se sintetiza
clorodiisopropilaminofosfina 17 mediante reacción de PCL con
diisopropilamina (King et al. J Org. Chem. 49: 1784,1984)
Nucleósido unido a resina (o
3'-o-nitrobenciléter protegido) 18
se acopla a 17 para producir fosforamidita 19. Acoplamiento
posterior de 19 con el nucleósido 20 (Inoue et al. J. Arm.
Chem. Soc. 103: 7666,1981;) suministra 21. El alcohol 16 se hace
reaccionar entonces con 21 para producir, después de oxidación
cuidadosa utilizando MCPBA o I_{2} seguido por clivaje de la
resina (o fosfoprotección), el monómero completo 22. Esta estrategia
de acoplamiento secuencial de 17 con alcoholes ha sido utilizado
exitosamente para generar fosfatos que llevan tres sustituyentes
alcoxi diferentes en rendimientos excelentes (Bannwarth et
al. Helv. Chim. Acta 70: 175, 1987;).
Los monómeros de inicio y parada únicos
utilizados para iniciar y terminar la polimerización de carbamato se
pueden sintetizar mediante modificación simple del esquema
anterior.
B) Acidos Nucleicos-Péptido
Funcionalizados Evolucionables (PNA): en otra modalidad una librería
de ácido nucleico-péptido se crea. Orgel y
colaborados han demostrado que los oligómeros de ácido
nucleico-péptido (PNA) son capaces de polimerización
eficiente en plantillas de ARN o ADN complementarias (Böhler et
al. Nature 376: 578, 1995; Schmidt et al. Nucl. Acids
Res. 25: 4792,1997;). Este hallazgo, junto con la síntesis reciente
y caracterización de los ácidos nucleicos de péptido quiral que
llevan cadenas laterales de aminoácido (Haaima et al. Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1939-1942,1996; Püschl
et al. Tetrahedron Lett. 39: 4707,1998;), permite la unión de
la estructura de polímero y la hebra de ácido nucleico creciente
dentro de una estructura sencilla. Es ente ejemplo, cada plantilla
consiste de una horquilla de ADN que termina en un grupo amina 5'.
La fase sólida y la síntesis de solución de tales moléculas se han
descrito previamente (Uhlmann et al. Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 35: 2632,1996;). Cada extensión de monómero consiste de un
trímero PNA (o mayor) que llevan cadenas laterales que contiene
funcionalidad de interés. El código genético artificial se escribe
para asignar cada trinucleótido a un conjunto diferente de cadenas
laterales. El ensamble, activación (con un grupo saliente apropiado
y carboimida, por ejemplo), y polimerización de los dímeros PNA
junto con la plantilla de ADN complementaria en la dirección carboxi
a amino-terminal produce el polímero no natural
(Figura 20). Escoger un monómero de (parada) con un terminal
biotinilado suministra una forma conveniente de terminar la
extensión y purificar los polímeros de longitud completa. Los
polímeros resultantes ligados covalentemente a su ADN codificante,
son fáciles para selección, secuenciamiento, o mutación.
La aproximación experimental que implementa una
librería de ácido nucleico de péptido funcionalizado evolucionable
comprende (i) mejorar y adaptar la química conocida para la
polimerización dirigida a plantilla de lata eficiencia de PNA; (ii)
definir un formato de codón (longitud y composición) adecuadas para
acoplamiento PNA de un número de monómeros diversos en una hebra
complementaria de ADN codificante libre infidelidad significativa,
cambio de estructura, o iniciación falsa de polimerización; (iii)
escoger un conjunto inicial de cadenas laterales que definen nuestro
nuevo código genético y sintetizar monómeros correspondientes; y
(iv) someter una librería de PNA funcionalizada a ciclos de
selección, amplificación, y mutación y caracterizar las moléculas
evolucionadas resultantes para entender la base de sus actividades
novedosas.
(i) Mejorar la química de acoplamiento: Mientras
Orgel y colaboradores han reportado polimerización de PNA dirigida a
plantilla, los rendimientos reportados y el número de acoplamientos
exitosos son significativamente menores de lo que se pudiera desear.
Una ruta promisoria hacia el mejoramiento de este proceso de
acoplamiento clave es explorar nuevos reactivos de acoplamiento,
temperaturas, y solventes que no se investigaron previamente
(presumiblemente porque los esfuerzos previos se enfocaron en
condiciones que pudieron haber existido en tierras prebióticas). El
desarrollo de polímeros PNA funcionalizados evolucionables involucra
emplear activadores (DCC, DIC, EDC, HATU/DIEA, HBTU/DIEA,
ByBOP/DIEA, cloroacetonitrilo), grupos salientes
(2-metilimidazol, imidazol, pentafluorofenol, fenol,
tiodenol, trifluoroacetato, acetato, ácidos toluenosulfónico,
coenzima A, DMAP, ribosa), solventes (acuoso en varios valores pH,
DMSO, cloroformo, TFE), y temperatura (0°C, 4°C, 25°C, 37°C, 55°C)
en un gran tamiz combinatoria para aislar nuevas condiciones de
acoplamiento. Cada pozo de placa de 384 pozos se asigna una
combinación específica de un activador, grupo saliente, solvente, y
temperatura. Los glóbulos de síntesis de fase sólida ligados
covalentemente a las plantillas de horquillas de ADN se colocan en
cada pozo, junto con un monómero de PNA etiquetado fluorescentemente
a la plantilla. Un evento de acoplamiento exitoso resulta en un
enlace covalente del fluoróforo a los glóbulos (figura 26); el
acoplamiento sin plantilla no deseado se puede distinguir por
reacciones de control con monómeros desajustados. Luego se lavan los
glóbulos y se cliva el producto a partir de soporte sólido, cada
pozo se ensaya con un lector de placa de fluorescencia.
(ii) Definir un formato de codón: Mientras que
la naturaleza ha empleado exitosamente un codón de tripleta en la
biosíntesis de proteína, un nuevo polímero ensamblado bajo
condiciones muy diferentes sin la asistencia de enzimas puede
requerir un formato de codón enteramente novedoso. El cambio de
estructura se puede remediar mediante el alargamiento de cada codón
de tal forma que hibridizar un codón de la estructura garantiza un
desajuste (por ejemplo, al hincar cada codón con una g y al
restringir las posiciones posteriores en el codón a T, C, y A).
termodinámicamente, uno también podría esperar fidelidad para
mejorar cada incremento de longitud de codón para un cierto punto.
Los codones que son excesivamente largos, sin embargo, serán capaces
de hibridizar a pesar de las bases desajustadas y más aún síntesis
de monómeros complicados. Una longitud de codón óptima para la
traducción artificial de alta fidelidad se puede definir utilizando
un tamiz combinatorio basada en placa optimizado desarrollado
anteriormente. La longitud y composición de cada codón en la
plantilla se varía por síntesis de fase sólida de la horquilla de
ADN apropiada. Estas horquillas de plantilla se les permite luego
acoplar con monómeros de PNA etiquetados fluorescentemente de
secuencia variante. El formato de codón ideal permite solo monómeros
que llevan secuencias exactamente complementarias para acoplar con
las plantilla, aún en la presencia de monómeros PNA (que se
etiquetan diferentemente para facilitar el ensayo de acoplamiento
ajustado versus desajustado). Los codones de tripleta y cuadrupleta
en el que las dos bases se varían entre A, T, y C mientras que la
base restante o bases se fijan como g para asegurar el registro
apropiado durante la polimerización se estudian primero.
(iii) Escribir un nuevo código genético: Se
escogen cadenas laterales que suministran funcionalidad interesante
no necesariamente presente en biopolímeros naturales, que son
accesibles sintéticamente, y que son compatibles con condiciones de
acoplamiento. Por ejemplo, un código genético simple que se puede
utilizar o para evaluar un PNA quelante Ni^{2} consiste de una
variedad de cadenas laterales que llevan carboxylato protegidas así
como también un conjunto de cadenas laterales pequeñas para equipar
polímeros con flexibilidad conformacional y de diversidad
estructural (figura 27). La selección exitosa de pan capaz de unir
el Ni^{2} con alta afinidad se puede seguir por una expansión de
si código genético para incluir un fluoróforo así como también un
apagador fluorescente. Los polímeros resultantes pueden luego ser
evolucionados hacia un sensor Ni^{2} fluorescente que posee
diferentes propiedades fluorescentes en la ausencia o presencia de
níquel. Reemplazar la cadena lateral fluorescente con un
"photocaged" puede permitíos la evolución de polímeros que
quelan el Ni^{2} en la presencia de ciertas longitudes de onda de
luz o que liberan Ni^{2} luego de fotólisis. Estos ejemplos
simples demuestran la tremenda flexibilidad en las propiedades
químicas potenciales de moléculas no naturales evolucionables
conferidas por la libertad para incorporar elementos fundamentales
sintéticos no limitados a aquellos compatibles con la maquinaria
ribosomal.
(iv) Seleccionar polímeros no naturales
deseados: Muchos de los métodos desarrollados PATRA la selección de
moléculas biológicas se pueden aplicar a selecciones para PNA
evolucionados con propiedades deseadas. Como los ácidos nucleicos o
selecciones que exhiben fago, librerías de polímeros no naturales
generados por método de polimerización de de ADN descritos
anteriormente se auto etiquetan y por lo tanto no necesitan ser
espaciados especialmente o sintetizados en pines o glóbulos. La
unión de Ni^{2} al PNA se puede hacer simplemente al pasar la
librería entera que resulta de la traducción o de un oligonucleótido
aleatorio a trv es de una resina Ni-NTA disponible
comercialmente ("His-Tag") precargada con
níquel. Las moléculas deseadas a la resina y se eluyen con EDTA.
Este secuenciamiento de PNA después de varios ciclos de selección,
mutagénesis y amplificación revela que de las cadenas laterales
escogidas inicialmente pueden ensamblarse juntas para formar un
receptor Ni^{2}. adicionalmente, el aislamiento de un quemador PNA
Ni^{2} representa el PNA equivalente de una etiqueta de histidina
que puede probar ser útil para la purificación de polímeros no
naturales posteriores. Luego los esfuerzos involucraran más
selecciones ambiciosas. Por ejemplo, la fluorescencia del PNA en la
presencia de ligandos específicos se puede seleccionar al clasificar
FACS de polímeros traducidos ligados a través de sus plantillas de
ADN a glóbulos. Aquellos glóbulos que tiene fluorescencia en la
presencias, pero no en la ausencia, del ligando objetivo se aísla y
caracteriza. Finalmente, el uso de un monómero de "parada"
biotinilado como se describió anteriormente permite la selección
directa para el catalizador de muchas reacciones de
unión-rompimiento o unión-formación.
Dos ejemplos descritos en la figura 28 destacan una selección para
un PNA funcionalizado que cataliza el clivaje de retroaldol de
fructuosa 1,6-bifosfato a 3-fosfato
gliceraldehído y dihidroxiace-
tona fosfato, una etapa esencial en la glicólisis, así como también una selección del PNA que cataliza la reacción aldol.
tona fosfato, una etapa esencial en la glicólisis, así como también una selección del PNA que cataliza la reacción aldol.
C) Librerías Evolucionables de Moléculas
Pequeñas: En aún otra modalidad de la presente invención, los
métodos inventivos se utilizan en preparar moléculas no poliméricas
no naturales evolucionables y amplificables que incluyen andamios de
drogas sintéticas. Los grupos nucleofílicos o electrofílicos se
desenmascaran individualmente en un andamio de molécula pequeña
adherido por simple unión covalente o a través de un soporte sólido
común a una plantilla de oligonucleótido que codifica. Los reactivos
electrofílicos o nucleofílicos ligados a secuencias de ácido
nucleico cortas se hibridizan a las plantillas correspondientes. La
reacción de secuencia-específica con el reactivo
apropiado tiene lugar por catálisis de proximidad (figura 29).
Siguiendo la funcionalización sintética de todas
las posiciones en una forma determinada por las secuencia del ADN
adherido (figuras 30 y 31), los lechos codificados resultantes se
pueden someter a un amplio rango de selecciones biológicas que sean
desarrollado para probar compuestos en resina. (Gordon et al.
J. Med. Chem. 37: 1385,1994; Gallop et al. J. Med. Chem. 37:
1233-1251, 1994;).
El ADN que codifica se cliva a partir de cada
glóbulo identificado en la selección y sometido a PCR, mutagénesis,
secuenciación, o recombinación homóloga antes de readherir a un
soporte sólido. Principalmente, este sistema es más flexible cuando
el ADN codificante se liga directamente al andamio sintético
combinatorio sin un glóbulo interviniente. En este caso, las
librerías completas de compuestos se pueden tamizar o seleccionar
para actividades deseadas, su ADN codificante liberado, amplificado,
mutado, y recombinado, y los compuestos nuevos sintetizados todos en
una serie pequeña de un pot, reacciones masivamente paralelas. Sin
un soporte de glóbulo, sin embargo, las reactividades de reactivos
hibrizados debe ser altamente eficiente en razón a que solo una
molécula de plantilla dirige la síntesis de la molécula pequeña
completa.
El desarrollo de las librerías de molécula
pequeña sintética evolucionables descansa en al catálisis química
suministrada por la proximidad de los reactivos hibridizados por
ADN. Se apreciará que las distancias aceptables entre los reactivos
hibridizados y los grupos reactivos no enmascarados deben ser
primero definidos par funcionalización de plantilla de ADN eficiente
al hibridizar electrófilos radio etiquetados (ésteres activados en
primer intento) unidos a oligonucleótidos cortos en distancias
variantes a partir de un nucleófilo reactivo (una amina primaria)
sobre una hebra de ADN. En puntos de tiempos dados, se someten
alícuotas a electroforesis de gel y autoradiografía para monitorear
el curso de la reacción. Graficar la reacción como una función de la
distancia (envases) entre el nucleófilo y electrófilo definirá una
ventana de distancia aceptable dentro del cual la catálisis basada
en proximidad de una reacción hidridizada por ADN puede tener lugar.
El ancho de esta ventana determinará el número de reacciones
distintas que podemos codificar en una hebra de ADN (una ventana
mayor permite más reacciones) así como también la naturaleza de los
codones (una ventana más grande se requiere para codones más
grandes) (figura 32).
Una vez las distancias aceptables entre los
grupos funcionales en una andamio sintético combinatorio y se
determinan los reactivos hibridizados, se determina el formato de
codón. La naturaleza no polimérica de la síntesis de molécula
pequeña simplifica la lectura de codón como cambio de estructura no
es emisión y los codones relativamente grandes se pueden utilizar
para asegurar que cada conjunto de reactivos hibridiza solo una
región de la hebra de ADN codificante.
Una vez la distancia del ligador entre el grupo
funcional y el andamio de molécula pequeña sintética y el formato de
codón de ha determinado, uno puede sintetizar moléculas pequeñas
basado en un andamio de molécula pequeña tal como el andamio de
cefalosporina mostrado en la figura 31. La amina primaria del ácido
7-aminocefalosporánico se protege primero utilizando
FMOC-Cl, y luego el grupo acetilo se hidroliza
mediante tratamiento con base. La plantilla de ADN codificante se
adhiere luego a través de enlace amida utilizando EDC y HOBt al
grupo de ácido carboxílico. Una molécula de transferencia con un
anticodón capaz de hibridizar a la plantilla de ADN adherida se
permite luego hibridizar a la plantilla. La molécula de
transferencia tiene asociado a través de un enlace de disulfuro una
amina primaria que lleva R_{1}. La activación del grupo hidroxilo
primario en el andamio de cefalosporina con DSC luego de tratamiento
con TCEP produce la amina unida covalentemente al andamio a través
de un enlace de carbamato. El tratamiento adicional con otra unidad
de transferencia que tiene una aminoácido conduce a la
funcionalización de la amina primaria desprotegida del andamio de
cefalosporina. Las moléculas similares a cefalosporina sintetizadas
de esta forma puede ser entonces seleccionada, amplificada, y/o
evolucionada utilizando los métodos inventivos y composiciones. La
plantilla de ADN puede ser diversificada y evolucionada utilizando
mezcla de ADN.
D) Síntesis de Molécula Pequeña de
Multi-Etapa Programada por Plantillas de ADN: La
evolución molecular requiere la traducción de
secuencia-específica de un portador de información
amplificable dentro de las estructuras de las moléculas
evolucionables. Este requerimiento ha limitado los tipos de
moléculas que se han evolucionado directamente en dos clases,
proteínas y ácidos nucleicos, debido a que solo estas clases de
moléculas se puede traducir a partir de secuencias de ácido
nucleico. Como se describió general y anteriormente, una
aproximación promisoria a la evolución de moléculas diferentes a
proteínas y ácidos nucleicos utiliza síntesis de plantilla ADN como
un método para traducir secuencias de ADN en moléculas pequeñas
sintéticas. La síntesis de plantilla de ADN puede dirigir una amplia
variedad de reacciones químicas poderosas con alta especificidad de
secuencia y requerir imitación estructural de la estructura de ADN.
La aplicación de esta aproximación a moléculas sintéticas de
complejidad útil, sin embargo, requiere el desarrollo de métodos
generales para permitir el producto de una reacción de plantilla de
ADN para experimentar transformaciones de plantilla de ADN
posteriores. Se describe aquí en detalle la primera síntesis de
molécula pequeña multi-etapa de plantilla de ADN.
Junto con los avances recientes en el alcance de reacción de la
síntesis de plantilla de ADN, esos hallazgos establecen la etapa
para la evolución in vitro de librerías de molécula pequeña
sintéticas.
La síntesis de molécula pequeña de plantilla de
ADN multi-etapa enfrenta dos retos mayores más allá
de aquellos asociados con loa síntesis de plantilla de ADN en
general,. Primero, el ADN utilizado para dirigir reactivos a
plantillas apropiadas se debe remover del producto de una reacción
de plantillas de ADN a etapas sintéticas de plantilla de ADN
posteriores con el fin de evitar la hibridización indeseada a la
plantilla. Segundo, la síntesis multi-etapa requiere
a menudo la purificación y aislamiento de productos intermedios, a
unos métodos comunes utilizados para purificar y aislar productos de
reacción que no son apropiados para síntesis
multi-etapa en la escala biológica molecular. Para
dirigir estos retos, se implementan tres estrategias distintas en
síntesis orgánica de fase sólida, para ligar reactivos químicos con
sus oligonucleótidos de ADN codificantes y dos aproximaciones
generales para purificación de producto después de que se desarrolla
cualquier etapa sintética de plantilla de ADN.
Cuando es posible, un ligador de
reactivo-oligonucleótido ideal para la síntesis de
plantilla de ADN posiciona el oligonucleótido como un grupo saliente
del reactivo. De acuerdo con esta estrategia ligadora de
"autoclivado", el enlace de
oligonucleótido-reactivo se cliva como una
consecuencia química natural de la reacción (Figura 33). Como el
primer ejemplo de esta aproximación aplica a la química de plantilla
de ADN, un reactivo de fosforano Wittig dansilado (1) se sintetiza
en el que el oligonucleótido de ADN codificante se adhiere a uno de
los grupos fosfito arilo (I. Hughes, Tetrahedron Lett. 1996, 37,
7595). La olefinación Wttig con plantilla de ADN (como se describió
anteriormente) con una plantilla ligada aldehído 2 resulta en la
transferencia eficiente del grupo dansilo fluorescente a partir del
reactivo a la plantilla de para suministrar olefina 3 (Figura 33).
Como un segundo ejemplo de un ligador de autoclivado, el tioester
ligado a ADN 4, cuando se activa con Ag (I) en pH 7.0 (Zhang et
al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3311) de plantilla
amino-terminada acilada 5 para producir el producto
amida 6 (Figura 33). La biosíntesis de proteína ribosomal utiliza
tARN aminoacilado en un formato ligador de autoclivado similar par
mediar la formación de unión de péptido de plantilla de ARN. Para
purificar los productos deseados lejos de los reactivos sin
reaccionar y a partir de oligonucleótidos clivados siguiendo las
reacciones de plantilla de ADN que utilizan ligadores de
autoclivado, los oligonucleótidos de reactivo biotinilado y las
reacciones de lavado crudas con glóbulos magnéticos ligados a
estreptavidina (Figura 34) se utilizan. Aunque esta aproximación no
separa a las plantillas que han reaccionado de las plantillas que no
han reaccionado, las plantillas que no han reaccionado se pueden
remover en unas reacciones de plantilla de ADN y estapas de
purificación posteriores (ver adelante).
Los reactivos que llevan más de un grupo
funcional se pueden ligar a sus oligonucleótidos de ADN codificantes
a través de una segunda y tercera estrategias ligadoras. En las
aproximaciones de "ligador sin marca", un grupo funcional de
reactivo se reserva para la formación de unión de plantilla de ADN,
mientras que el segundo grupo funcional se utiliza para unir un
ligador que se puede clivar sin introducir funcionalidad química no
deseada adicional. La reacción de plantilla de ADN es seguida por
clivaje del ligador adherido a través del segundo grupo funcional
para producir los productos deseados (Figura 33), por ejemplo, una
serie de reactivos de aminoacilación tal como derivado de
(D)-Phe 7 se sintetiza en el cual
\alpha-amina se conecta a través de un ligador de
carbamoiletilsulfona (Zarling et al. J. Immunology 1980, 124,
913) a su oligonucleótido de ADN codificante. El producto entre (8)
de la formación de enlace amida de plantilla de ADN (como se
describe aquí) utiliza este reactivo y la plantilla
amina-terminada (5) se trata con base acuosa para
efectuar la eliminación cuantitativa y espontánea de
descarboxilación del ligador, para producir producto 9 que contiene
el grupo aminoácido claramente transferido (Figura 33). Este ligador
de sulfona es estable en pH 7.5 o amortiguador más bajo a 25ºC
durante más de 24 h a un experimento clivaje cuantitativo cuando se
expone a pH 11.8 amortiguador durante 2 h a 37ºC.
En algunos casos puede ser ventajoso introducir
nuevos grupos químicos como una consecuencia de un clivaje ligador.
De acuerdo con esta tercera estrategia ligadora, el clivaje ligador
genera una "marca útil" que se puede funcionalizar en etapas
posteriores. Como un ejemplo de esta clase de ligador, los reactivos
de aminoácido tal como el derivado (L)-Peh 10 se
genera ligado a través de 1,2-dioles (Fruchart et
al Tetrahedron Lett. 1999, 40, 6225) a sus oligonucleótidos de
ADN codificantes. Luego de la formación de enlace amida de plantilla
de ADN con una plantilla amina-terminada (5), este
ligador se cliva cuantitativamente por oxidación con 50 mM de
NAlO_{4} a acuoso en pH 5.0 para producir el producto 12 que
contiene el grupo aldehído apropiado para funcionalización posterior
(por ejemplo, en una olefinación Wittig de plantilla de ADN,
aminación reductiva, o adición de nitroaldol (Figura 33).
Los productos deseados generados a partir de
reaccione de plantilla de ADN que utilizan los ligadores de marca
útiles o sin marca se pueden purificar fácilmente utilizando
oligonucleótidos reactivos biotinilados (Figura 34). Los
oligonucleótido de reactivo adjunto con los productos deseados se
capturan primero en los glóbulos magnéticos ligados a
estreptavidina. Cualquier enlace de plantilla que no ha reaccionado
con el reactivo mediante por pares bases se remueve al lavar los
glóbulos con amortiguador que contiene 4 m de cloruro de guanidina.
Las moléculas biotiniladas restantes se unen a los glóbulos de
estreptevidina de acuerdo con estas condiciones. El producto deseado
se aísla luego en forma pura al eluir los glóbulos con amortiguador
de clivaje ligador (en los ejemplos anteriores, amortiguador que
contiene NaIO4 o pH 11), mientras reacciona y los reactivos que han
reaccionado permanecen unido a los glóbulos.
Integrar el repertorio recientemente expandido
de reacciones sintéticas compatibles con síntesis de plantilla de
ADN y las estrategias ligadoras descritas anteriormente, se puede
conducir la síntesis de molécula pequeña de plantilla de ADN
multietapa.
En una modalidad, una solución de síntesis de
plantilla de ADN de fase de una librería de péptido no natural se
describe generalmente adelante y se muestra generalmente en la
Figura 35. como se muestra en la Figura 35, para generar el grupo de
plantilla inicial para la librería, 30 oligonucleótidos
5'-amino biotinilados sintéticos del formato de
secuencia mostrado en la Figura 35, se acilan con 1 de 30
aminoácidos naturales o no naturales diferentes utilizando
procedimientos de acoplamiento EDC estándar. Cuatro bases que
representan un "codon" dentro de cada iniciador amino acilado
se diseñan la identidad de la cadena lateral (R1). El "código
genético" para estas cadenas laterales se protege con grupos de
protección labiles similares a aquellos comúnmente utilizados en la
síntesis de péptidos. Los treinta iniciadores de ADN amino acilados
resultantes se hibridizan para una librería de oligonucleótido de
plantilla de ADN generada por síntesis de ADN automatizada. La
extensión de iniciador con polimerasa ADN seguida por
desnaturalización de hebra y purificación con glóbulos magnéticos
ligados a estreptavidina produce la librería de plantilla departida
(ver, Figura 35). Como un ejemplo general, una síntesis de plantilla
de ADN de fase de solución de una librería de péptido no natural se
describe en la Figura 36. la librería de plantilla se somete a las
tres reacciones de formación de enlace de péptido de plantilla de
ADN utilizando reactivos de aminoácido adheridos a 10
oligonucleótidos de ADN codificantes base a través del ligador de
sulfona descrito anteriormente. Los productos de cada etapa se
purifican mediante electroforesis de gel de poliacrilamida de
desnaturalización preparativa antes de clivaje de ligador si se
desea, aunque esto puede no ser necesario. Cada reactivo ligado a
ADN se puede sintetizar al acoplar un oligonucleótido de ADN
terminado en 3'-amino al aminoácido codificado a
través del derivado de carbonato bis-NHS del ligador
sulfona como se muestra en la Figura 37. los codones se escogen de
nuevo de tal forma que los codones relacionados codifican
aminoácidos similares químicamente. Luego de la reacción de
formación de enlace de cada péptido, se utiliza anhídrido acético
para tapar los materiales de partida que no han reaccionado y se
utiliza amortiguador pH 11 para efectuar el clivaje de ligador para
exponer un nuevo grupo amino para la siguiente reacción de formación
de unión de péptido. Una ves se completa el tetrapeptido, aquellos
miembros de la librería que llevan las cadenas laterales de
carboxilato también se pueden ciclizar con su terminal amino para
formar péptidos macrocíclicos, mientras que los miembros de péptidos
lineales puede simplemente ser N-acetilados (ver
Figura 36).
Se apreciara que un surtido virtualmente
ilimitado de elementos fundamentales d aminoácidos se pueden
incorporar en al librería de péptido no natural. En forma diferente
las librerías de péptido generadas utilizan la maquinaria
biosintética de proteína tal como librerías que exhiben fago (O'Neil
et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 1995, 5,
443-9), librerías que exhiben mARN (Roberts et
al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1997, 94,
12297-12302) librerías que exhiben ribosomas
(Roberts et al. Curr. Opim. Chem. Biol. 1999, 3,
268-73; Schaffitzel et al. J. Immunol Methods
1999, 231, 119-35) o librerías de péptido
intracelular (Norman et al. Science 1999, 285,
591-5), los aminoácidos con cadenas laterales no
proteinogénicas, estereoquímica de cadena lateral no natural o
estructuras no péptidicas también se pueden incorporar en esta
librería. Adicionalmente, también se pueden utilizar oligopéptidos
di-, tri- como elementos fundamentales para generar miembros de
librerías más grandes. La presencia de péptidos no naturales en esta
librería puede conferir propiedades farmacológicas no mejoradas tal
como resistencia a la proteasa comparada con péptidos generadas
ribosomalmente. De forma similar, los miembros de librería
macrocíclicos pueden producir ligandos de afinidad mayor debido a la
perdida de entropía luego de unir sus objetivos que puede ser menor
que sus contrapartes lineales más flexibles. Basado en la enorme
variedad de aminoácidos comercialmente disponibles que se ajustan a
estas descripciones, la diversidad máxima de esta librería de
tetrapéptido lineal y cíclica no natural puede exceder 100 x 100 x
100 x 100 = 10^{8} miembros.
Otro ejemplo de librería que utiliza la
aproximación descrita anteriormente incluye la síntesis de plantilla
de ADN de una librería macrobicíclica orientada a la diversidad que
contiene 5 y 14 miembros de anillo (Figura 38). Los materiales de
partida para esta librería consisten de plantillas de ADN
aminoacilado con una variedad de derivados de lisinas protegidos de
cadena lateral y análogos de lisina disponibles comercialmente (que
incluyen cisteina aminoetilo, aminoetilserina, y
4-hidroxilisina). En la primera etapa, la formación
de enlace de amida de plantilla de ADN con una variedad de
aminoácidos ligados al ADN tiene lugar como se describe en la
librería de péptido no natural, excepto que el ligador diol vicinal
16 descrito anteriormente se utiliza en cambio de él ligador de
sulfona sintrasa. Luego de la formación de enlace amida, el ligador
de diol se cliva oxdativamente con periodato de sodio. La
desprotección de las aminas de cadena lateral de análogos es seguida
``por la formación de enlace amida de plantilla de ADN catalizada
por triofluoroacetato de plata entre las aminas libres y una
librería de tioésteres derivados de acrílico. Las olefinas
resultantes se tratan con una hidroxilamina para formar nitrones,
que experimentan cicloadición 1,3-dipolar para
producir la librería bicíclica (Figura 38). Los reactivos ligados a
ADN para esta librería se preparan al acoplar análogos de licina a
iniciadores de plantilla
5'-amino-terminados (Figura 35),
ligadores de diol aminoacilados a oligonucleótidos ADN terminados en
3'-amino (Figura 38), y ácidos acrílicos acoplados a
oligonucleótidos de ADN terminados en 3'-diol
(Figura 38).
Como un ejemplo de una librería especifica
generada a partir de la primera aproximación general descrita
anteriormente, los tres ciclos iterados de la formación de amida de
plantilla de ADN, el clivaje de ligador sintrasas, y la purificación
con glóbulos ligados estreptavidina se utilizan para genera un
tripéptido no natural (Figura 39). Cada reactivo de aminoácido se
liga a un oligonucleótido de ADN base 10 de plantilla
amino-terminada para dirigir la síntesis de
tripéptido que contiene tres regiones de base 10 consecutivas que
son complementarias a los tres reactivos, que imitan la estrategia
que se podría utilizar en una síntesis de librería de molécula
pequeña de plantilla de ADN multietapa. El primer reactivo de
aminoácido (13) se combina con la plantilla y el activador cloruro
de 4-(4, 6-dimetoxi-1,
3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino
(DMT-MM) (Kunishima et al. Tetrahedron 2001,
57, 1551) para efectuar la formación de enlace de péptido de
plantilla de ADN. El producto deseado se purifica al mezclar la
reacción cruda con glóbulos magnéticos ligados a estreptavidina, con
4 M de cloruro de guanidinio, y eluir con amortiguador pH 11 para
efectuar clivaje de ligador de sulfona, suministrando el producto
14. El grupo libre amina en 14 se elabora entonces en una segunda y
tercera ronda de formación de amida de plantilla de ADN y el ligador
de clivaje para producir el dipéptido 15 y el tripéptido 16 (Figura
39).
El progreso de cada reacción, purificación, y
etapa de clivaje de ligador de sulfona es seguido por la
desnaturalización de electroforesis de gel de poliacrilamida. El
tripéptido final liado a la plantilla (16) se digiere con la
endonucleasa de restricción EcoRI y el fragmentos de digestión que
contiene el tripéptido se caracteriza por espectrometría de masa
MALDI. Empezando con 2 nmol (\sim 20 \mug) de material de
partida, se genera suficiente producto de tripéptido para servir
como la plantilla para más de 10^{6} selecciones in vitro y
reacciones PCR (Kramer et al. in Current Protocols in
Molecular Biology, Vol 3 (Ed.: F. M. Ausubel), Wiley, 1999, pp.
15.1) (que asume 1/10,000 moléculas de selección de supervivencia).
No se genero producto significativo cuando la plantilla de material
de partida se tapo con anhídrido acético, o cuando los reactivos de
control que contienen secuencias desajustadas se utilizan en cambio
de reactivos complementarios (Figura 39).
Una síntesis de molécula pequeña de plantilla de
ADN multietapa no peptídica (Figura 40) que utiliza todas las tres
estrategias ligadoras desarrolladas anteriormente también se
desarrolla. Un plantilla base 30 amina-terminada se
somete a formación de enlace amida de plantilla de ADN utilizando un
reactivo donante de aminoacilo (17) que contiene el ligador diol y
un oligonucleótido base 10 biotinilado para producir la amina 18. el
producto deseado se aísla al capturar la reacción cruda en glóbulos
de estreptavirina seguido por clivar el ligador con NalO_{4} para
generar aldehído 19. la reacción Wittig de plantilla de ADN de 19
con el reactivo de fosforano de autoclivado biotinilado 20 produce
fumaramida 21. los productos de la segunda plantilla de reacción de
ADN se purifican parcialmente al lavar con glóbulos de
estreptavidina para remover el reacitovo el reactivo que ha
reaccionado y el que no ha reaccionado. En la tercera etapa de
plantilla de ADN, se somete la fumaramida 21 a una adición de
conjugado de plantilla de ADN (Gartner et al. J Am. Chem.
Soc. 2001, 123, 6961) utilizando reactivo tiol 22 ligado a través de
ligador de sulfona a un oligonucleótido biotinilado. El producto de
adición conjugado (23) se purifica por inmovilización con glóbulos
de estreptavidina. El clivaje de ligador con amortiguador pH 11
produce el producto final 24 en 5-10% de rendimiento
general aislado para las tres reacciones formadoras de enlace, dos
etapas de clivaje de ligador, y las tres purificaciones (Figura 40).
Este producto final se digiere con EcoRI y la masa del fragmento de
plantilla ligado a molécula pequeña se confirma por espectrometría
de masa MALDI (masa exacta: 2568, masa observada: 2566\pm5). Como
en el ejemplo del tripéptido, cada uno de los tres reactivos
utilizados durante esta síntesis multietapa hibridizo en una única
ubicación en la plantilla de ADN, y las reacciones de control con
desajustes de secuencia no producto (Figura 40). Como se esperaba,
las reacciones de control en las que se omite el reactivo Wittig
(etapa 2) tampoco género producto luego de la tercera etapa. Tomadas
juntas, la síntesis de plantilla de ADN de 16 y 24 demuestran la
capacidad del ADN para dirigir la síntesis de multietapa programada
de secuencia de las moléculas pequeñas oligoméricas y no
oligómericas no relacionadas en estructura con los ácidos
nucleicos.
La disponibilidad comercial de muchos sustratos
para las reacciones de plantilla de ADN que inlcuyen aminas, ácidos
carboxílicos, compuesto \alpha-halo carbonilo,
olefinas, alcoxiaminas, aldehídos, y nitroalcanos puede permitir la
traducción de grandes librerías de ADN en diversas librerías de
molécula pequeña. La selección de un pot directo de estas librerías
para los miembros con unión deseada o actividad catalítica, seguido
por amplificación PCR y diversificación de las moléculas activas que
codifican ADN, puede permitir a las moléculas pequeñas o sintéticas
evolucionar en una forma paralela a los métodos naturales poderosos
utilizados para generar nueva función molecular. Adicionalmente, la
síntesis de plantilla de ácido nucleico multietapa es un
requerimientos de modelos propuestos previamente (A. I. Scott,
Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4961; Li et al. Nature 1994, 369,
218; Tamura et al. Proc. Natl. Acad Sci USA 2001, 98, 1393)
para la traducción prebiótica de información replicable en moléculas
funcionales. Estos hallazgos demuestran que las plantillas de ácido
nucleico de hecho son capaces de dirigir iterativamente o no
iterativamente síntesis de molécula pequeña multietapa aun cuando la
hibridización de reactivos en distancias ampliamente variantes a
partir de moléculas crecientes (en los ejemplos anteriores, cero a
veinte bases). Como se describe en más detalle adelante, las
librerías de moléculas sintéticas pueden luego ser evolucionadas
hacia ligandos activos y catalizadores a través de ciclos de
traducción, selección, y amplificación y mutagénesis.
E) Evolucionar Plásticos: En otra modalidad de
la presente invención, un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN,
derivados de estos) se adhiere a un catalizador de polimerización.
En razón a que los ácidos nucleicos pueden doblarse en estructuras
complejas, el ácido nucleico se pude utilizar para dirigir y/o
afectar la polimerización de una cadena de polímero creciente. Por
ejemplo, el ácido nucleico puede influenciar la selección de
unidades de monómero a ser polimerizadas así como también así como
la reacción de polimerización tiene lugar (por ejemplo,
estereoquímica, estereoregularidad, actividad). Los poliedros
sintetizados se pueden seleccionar para propiedades específicas tal
como molecular, peso, densidad, hodrofobicidad; estereoregularidad,
estereoselectividad, etc., y el ácido nucleico que forma una parte
integral del catalizador que dirige su síntesis se puede amplificar
y evolucionar (Figura 41). Ciclos iterados de diversificación de
ligando, selección, y amplificación permite la evolución cierta de
catalizadores y polímeros hacia propiedades deseadas.
Para dar un ejemplo, una librería de moléculas
de ADN se adhiere a el catalizador de polimerización de metátesis de
abertura de anillo basada en rutenio de Grubbs (ROMP) a través de un
ligando dihidroimidazol (Scholl et al. Org. Lett. 1 (6):
953,1999;) que crea un grupo grande diverso de moléculas catalíticas
potenciales, cada una única por naturaleza del ligando
funcionalizado. Indudablemente, la funcionalización del catalizador
con un ligando (ADN-DHI) desohidroimidazol ADN
relativamente grande alterara la actividad andel catalizador. Cada
molécula de ADN tiene un potencial para doblar en una forma única
estereoelectrónica que potencialmente tiene diferentes
selectividades y/o actividades en la región de polimerización
(Figura 42). Por lo tanto, la librería de ligandos de ADN se puede
"traducir" en una librería de plásticos luego de la adición de
varios monómeros. En ciertas modalidades, los ligandos de
ADN-DHI son capaces de insertarse covalentemente
ellos mismo dentro del polímero creciente, creando de esta forma un
polímero etiquetado con el ADN que codifica su creación, se utiliza.
Al utilizar el esquema sintético mostrado en la Figura 42, se
producen ligandos DHI que contienen dos manejos químicos, uno
utilizado para unir el ADN al ligando, el otro utilizado para unir
una olefina pedante a la estructura DHI. La proporción de metátesis
se conoce por variar ampliamente basado en la sustitución de olefina
así como también la identidad del catalizador. A través de la
alteración de estas variables, la proporción de incorporación de
olefina pedante se puede modular de tal forma que k_{metatesis \ de
\ olefina \ pedante} <<k_{ROMP}, por lo tanto, permite a
los polímeros moderar a altos pesos moleculares para ser formados
antes de la inserción de etiqueta de ADN y que corresponde a la
terminación del polímero. Eter vinílico se utiliza comúnmente en
ROMP para funcionalizar el terminal polímero (Gordon et al.
Chem. Biol. 7: 9-16, 2000;) así como también
producir polímeros de peso molecular reducido.
La selección posterior de un polímero a partir
de la librería basado en una propiedad deseada por electroforesis,
filtración de gel, sedimentación centrifuga, particionamiento en
solventes de hidrofobicidades diferentes, etc. La amplificación y
diversificación del ácido nucleico codificante por vía de técnicas
tales como error-prone PCR o mezcla de ADN seguido
por adición a una estructura DHI permitirá la producción de otro
grupo de catalizadores ROMP potenciales enriquecidos en actividad
seleccionada (Figura 43). Ese método suministra una nueva
aproximación para generar materiales poliméricos y catalizador que
los crea.
Las librerías bicíclico y de péptido no natural
descritas anteriormente se caracterizan en varias etapas. Cada
reactivo candidato se conjuga con su oligonucleótido de ADN de
codificante, luego se somete a reacciones modelo con plantillas
ajustadas y desajustadas. Los productos de estas reacciones se
analizan al desnaturalizar electroforesis de gel de poliacrilamida
para evaluar la eficiencia de la reacción, y mediante espectrometría
demás para verificar estructuras de productos anticipados. Una vez
se identifica un conjunto de reactivos robustos, la síntesis de la
plantilla de ADN multietapa completa de los miembros de librería
sencilla representativa en una gran escala se desarrolla y los
productos finales se caracterizan por espectrometría de masa.
Más específicamente, la fidelidad de la
secuencia de cada síntesis de librería de plantilla de ADN
multietapa se ensaya al seguir el destino de reactivos etiquetados
químicamente sencillos a través del curso de reacciones de síntesis
de librería de un pot. Por ejemplo, los productos que salen de
elementos fundamentales que llevan un grupo cetona se capturan con
una resina ligada hidracida disponible comercialmente y analizada
por secuenciamiento de ADN para verificar la fidelidad de la
secuencia durante la síntesis de plantilla de ADN. De forma similar,
Cuando se utilizan plantillas de modelo no biotinilados, los grupos
biotina que llevan elementos fundamentales se purifican después de
que la síntesis de plantilla de ADN que utiliza glóbulos magnéticos
de estreptavidina y que se somete a secuenciamiento de ADN (Liu
et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123,
6961-6963). Los codones que muestra una mayor
propensión a hibridización con ADN desparejo se identifican por
selección de esta forma y se remueven de código genético de estas
librerías sintéticas.
Debido a que cada miembro de librería generada
en esta aproximación se liga covalentemente a un oligonucleótido de
ADN que codifica y dirige su síntesis, se pueden someter las
librerías a ciertas selecciones in vitro. Aunque las
selecciones directas para catalizadores de molécula pequeña de
formación de enlace o reacciones de clivaje-enlace
están en una aplicación potencial excitante de esta aproximación, la
selección in vitro más simple que se puede utilizar para
evolucionar estas librerías es una selección para unirse a una
proteína objetivo. Una proteína objetivo inicial ideal para la
selección de librerías sintética juega un papel biológico importante
y posee ligandos conocidos de afinidades variantes para validar los
métodos de selección.
Un receptor de especial interés para uso en la
presente invención es el vector \alpha_{V}\beta_{3}. El
receptor \alpha_{V}\beta_{3} es un miembro de la familia
integrina de los receptores de glicoproteína heterodiméricos de
transmembrana (Miller et al. Drug Discov Today 2000, 5,
397-408; Berman et al. Membr Cell Biol. 2000,
13, 207-44) el receptor de integrina
\alpha_{V}\beta_{3} se expresa en la superficie de muchos
tipos de células tales como osteoclastos, células de músculo liso
vascular, células endoteliales, y células de algunos tumores. Este
receptor media varios procesos biológicos importantes que incluyen
la adhesión de osteoclastos a la matriz del hueso (van der Pluijm
et al. J Bone Miner. Res. 1994, 9, 1021-8)
migración de célula lisa de músculo (Choi et al. J. Vasc.
Surg. 1994, 19, 125-34) y angiogénesis inducida por
tumor (Brooks et al. Cell 1994, 79, 1157-64)
(el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos). Durante la angiogénesis
inducida por tumor, células endoteliales invasivas se unen a
componentes de matriz extracelular a través de sus receptores de
integrina \alpha_{V}\beta_{3}. Varios estudios (Brooks et
al. Cell 1994, 79, 1157-64; Brooks et al.
Cell 1998, 92, 391-400; Friedlander et al.
Science 1995, 270, 1500-2; Varner et al. Cell
Adhes Commun 1995, 3, 367-74; Brooks et al. J
Clin Invest 1995, 96, 1815-22) ha demostrado que la
inhibición de este evento de unión de integrina con anticuerpos o
péptidos sintéticos pequeños inducen apoptosis de las células
vasculares angiogénicas proliferativas y pueden inhibir la
metástasis de tumor.
Un número de ligandos de péptidos de afinidad
variante y selectividades de receptor integrina
\alpha_{V}\beta_{3} se han reportado. Dos antagonistas de
integrina \alpha_{V}\beta_{3} benchmark son el péptido
lineal GRGDSPK (IC_{50} = 210 nM (Dechantsreiter et al. J
Med. Chem. 1999, 42, 3033-40; Pfaff et al. J
Biol. Chema. 1994, 269, 20233-8) y el péptido
cíclico ciclo -RGDfV (Pfaff et al. J. Biol. Chem. 1994, 269,
20233-8) (f = (D)-Phe, IC_{50} =
10 nM). Mientras que los antagonistas de péptidos para las
integrinas contienen comúnmente RGD, no todos los péptidos que
contienen RGD son ligandos de integrina de alta afinidad. A
diferencia, el contexto conformacional del RGD y otras secuencia de
péptido pueden tener un profundo efecto en la afinidad de la
integrina y especificidad (Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc.
1997, 119, 1328-1335; Geyer et al. J. Am.
Chem. Soc. 1994, 116, 7735-7743; Rai et al.
Bioorg. Med. Chez. Lett 2001, 11, 1797-800; Rai
et al. Curr. Med. Chem. 2001, 8, 101-19). Por
esta razón, las aproximaciones combinatorias hacia el descubrimiento
del antagonista receptor de integrina \alpha_{V}\beta_{3} es
especialmente provisorio.
El papel relevante medicinalmente y
biológicamente importante del receptor de integrina
\alpha_{V}\beta_{3} junto con sus antagonistas péptidos
conocidos es su disponibilidad comercial (Chemicon International,
Inc., Temecula, CA) hace al receptor integrina
\alpha_{V}\beta_{3} un objetivo inicial ideal para las
librerías de moléculas pequeña sintéticas de plantillas de ADN. El
receptor de integrina \alpha_{V}\beta_{3} se puede
inmovilizar por adsorción en posos de placa de microtítulo sin dañar
su capacidad de unir al ligando o especificidad (Dechantsreiter
et al. J. Med Chem. 1999, 42, 3033-40;
Wermuth et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119,
1328-1335; Haubner et al. J. Am. Chem. Soc.
1996, 118, 7461-7472). Alternativamente, el receptor
se puede inmovilizar mediante conjugación con éster NHS o grupos
maleimida ligados covalentemente a glóbulos de sefarosa y la
capacidad de la resina de afinidad de integrina resultante para
mantener las propiedades de unión de ligandos conocidas se pueden
verificar.
Para desarrollar las selecciones de unión de
proteína actuales, las librerías macrocíclicas o de péptido
sintético ligadas a plantillas de ADN se disuelven en amortiguador
de unión acuoso en un pot y se cliva en la presencia de receptor de
integrina \alpha_{V}\beta_{3} inmovilizado. Ningún ligador
se lava a parte con el amortiguador. Estas moléculas que se pueden
unir a través de sus plantillas de ADN adheridas a diferencias de
otras porciones sintéticas se elimina al lavar la librería de unión
con plantillas de ADN funcionalizadas que les falta los sitios de
unión de iniciador PCR. Los ligandos restantes se unen al receptor
de integrina \alpha_{V}\beta_{3} inmovilizadose eluyen por
desnaturalización o mediante la adición de ligando de péptido que
contiene RGD de alta afinidad en exceso. Las plantillas de ADN que
codifican y dirigen la síntesis de los ligadores de integrina
\alpha_{V}\beta_{3} se amplifican por PCR utilizando un
iniciador diseñado par unir a una región 3' constante de la
plantilla y un grupo de iniciadores biotinilados funcionalizados en
su extremo 5' con los materiales de partida de librería (Figura 44).
La purificación de los completos de hebra biotinilados de un ciclo
de traducción de molécula sintética, selección, y amplificación
produce una subpoblación de plantillas de ADN enriquecidas en
secuencias que codifican los ligandos de integrina
\alpha_{V}\beta_{3} sintéticos.
Por razones similares a aquellas que hacen el
receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{3} un blanco inicial
atractivo para la aproximación para generar moléculas sintéticas con
propiedades deseadas, el factor de serina proteasa Xa también sirve
como un blanco de proteína promisorio. La coagulación de la sangre
involucra una cascada de complejo de reacciones catalizadas con
enzima que finalmente generan fibrina, la base de los coágulos
sanguíneos (Rai et al. Curr. Med Chem. 2001, 8,
101-109; Vacca et al. Curr. Opin. Chem Biol.
2000, 4, 394-400). La trombina es una serina
proteasa que convierte el fibrinógeno en fibrina durante la
coagulación de la sangre. La trombina, a su vez, es generada por la
acción proteolítica del factor Xa sobre protrombina. En razón a que
las enfermedades tromboembolíticas (coagulación de la sangre) tal
como los ataques permanecen como una causa principal de muerte en el
mundo (Vacca et al. Curr. Opin. Chem Biol. 2000, 4,
394-400) el desarrollo de drogas que inhiban la
trombina o el factor Xa es un área principal de la investigación
farmacéutica.
La inhibición del factor Xa es una nueva
aproximación que se considera para evitar los efectos colaterales
asociados con la inhibición de la trombina, que también esta
involucrada en la hemostasis normal (Maignan et al. J. Med.
Chem. 2000, 43, 3226-32; Leadley et al. J.
Cardiovasc. Pharmacol. 1999, 34, 791-9; Becker et
al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 2753-8;
Choi-Sledeski et al. Bioorg. Med. Chem. Lett.
1999, 9, 2539-44; Choi-Sledeski
et al. J. Med. Chem. Lett. 1999, 42, 3572-87;
Erwing et al. J. Med Chem. 1999, 42, 3557-71;
Bostwick et al. Thromb Haemost 1999, 81,
157-60). Aunque muchos agentes incluyendo heparina,
hirudina, e hirulog se han desarrollado para controlar la producción
de trombina, estos agentes generalmente tienen las ventaja de
requerir inyección intravenosa o subcutánea varias veces al día
además de los posibles efectos colaterales, y la búsqueda de
inhibidores sintéticos Xa de factor de molécula pequeña permanece
como el objeto de gran esfuerzo de la investigación.
Entre los inhibidores de factor Xa con
afinidades de unión conocidas están una serie de tripéptidos que
finalizan con el aldehído arginina (Marlowe et al. Bioorg.
Med Chem. Lett. 2000, 10, 13-16) que pueden ser
fácilmente incluidos en la librería de péptido no natural moldeada
con ADN de 15 nM a 60 \muM (Marlowe et al. Bioorg. Med
Chem. Lett. 2000, 10, 13-16) y por lo tanto
suministra controles positivos ideales para validar y calibrar una
selección in vitro para ligandos de factor Xa sintéticos (ver
adelante). Tanto el factor Xa como el factor activo Xa inmovilizado
sobre resina están comercialmente disponibles (Protein Engineering
Technologies, Denmark).El factor de unión de resina Xa se utiliza
para seleccionar miembros tanto de las librerías de péptido como
bicíclicas no naturales moldeadas con ADN con afinidad por el factor
Xa de una manera análoga al receptor a las selecciones que se une al
receptor de integrina.
Luego de la amplificación PCR de los moldes de
ADN que codifican las moléculas sintéticas seleccionadas, las rondas
adicionales de traducción, selección, y amplificación son conducidas
para enriquecer la librería por los ligadores de mas alta afinidad.
La exigencia de la selección es gradualmente incrementada al
incrementar la concentración de sal de los amortiguadores de unión y
de lavado, disminuyendo la duración de la unión, elevando las
temperaturas de unión y de lavado, e incrementando la concentración
de los aditivos de lavado, tales como el ADN de molde o las
proteínas no relacionadas. De manera importante, las selecciones
in vitro también pueden seleccionar por la especificidad en
la adición a la afinidad de unión. Para eliminar aquellas moléculas
que poseen propiedades de unión indeseadas, los miembros de librería
unidos a la integrina \alpha_{v}\beta_{3} inmovilizada o al
factor Xa son lavados con proteínas no blanco tales como otras
integrinas u otras serinas proteasas, dejando solamente aquellas
moléculas que se unen a la proteína blanco pero no se unen a las
proteínas no blanco.
Los ciclos iterados de traducción, selección, y
amplificación dan como resultado un enriquecimiento de la librería
en lugar de una evolución de la librería, lo que requiere la
diversificación entre las rondas de selección. La diversificación de
estas librerías sintéticas se logra en al menos dos formas, ambas
análogas a los métodos utilizados por la naturaleza para
diversificar proteínas. La mutagénesis de punto aleatorio es
desarrollada al conducir la etapa de amplificación PCR bajo PCR
propensas a error (Caldwell et al. PCR Methods Applic. 1992,
2, 28-33). En razón a que el código genético de
estas moléculas se escribe para asignar codones relacionados a
grupos químicos relacionados, similares a la forma en que se
construye el código genético de proteína natural, las mutaciones de
punto aleatorio en los modos que codifican las moléculas
seleccionadas diversificaran la progenie hacia los análogos
químicamente relacionados. Además de la mutagénesis de punto, las
librerías sintéticas en esta aproximación también se diversifican
utilizando la recombinación. Los moldes al ser recombinados tiene la
estructura mostrada en la figura 45, en la cual los codones se
separan mediante sitios de clivaje de endonucleasa de restricción no
palindrómica de base cinco tales como aquellos clivados por Avall
(G/GWCC, W = A o T), Sau961 (G/GNCC, N = A, G, T, o C), Ddel
(C/cNAG), o hindi (G/ANTC). Luego de las selecciones, los moldes que
codifican las moléculas deseadas son enzimáticamente digeridos con
estas enzimas de restricción comercialmente disponibles. Los
fragmentos digeridos son entonces recombinados en moldes intactos
con ADN ligasa T4. En razón a que los sitios de restricción que
separan los codones son no palindromicos, los fragmentos de molde
solo pueden reensamblarse para formar moldes recombinados intactos
(figura 45). La traducción moldeada con ADN de los moldes
recombinados suministra moléculas pequeñas recombinadas. De esta
manera, los grupos funcionales entre las moléculas pequeñas
sintéticas con las actividades deseadas son recombinados de manera
análoga a la recombinación de los residuos de aminoácido entre las
proteínas en la naturaleza. Se apreciara bien que la recombinación
explora el espacio de secuencia en una molécula mucho mas
eficientemente que la mutagénesis de punto sola (Minshull et
al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 284-90;
Bogarad et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96,
2591-5; Stemmer, W. Nature 1994, 370,
389-391).
La evolución de la molécula pequeña utilizando
mutaciones de recombinación ofrece dos ventajas potenciales sobre el
simple enriquecimiento. Si la diversidad total de la librería es
mucho menos que el número de moléculas hechas (típicamente 10^{12}
a 10^{15}), cada miembro posible de la librería esta presente al
inicio de la selección. En este caso, la diversificación es aun útil
por que las condiciones de selección casi siempre cambian en la
medida de que las rondas de evolución progresan. Por ejemplo, las
últimas rondas de selección probablemente serán conducidas bajo
mayores exigencias, y pueden involucrar contra selecciones contra la
unión de proteínas no blanco. La diversificación le da a los
miembros de la librería que han sido descartados durante las rondas
tempranas de selección la oportunidad de reaparecer en las últimas
rondas bajo condiciones de selección alteradas en los cuales su
ajuste relativo a otros miembros puede ser mayor.
Además, es muy posible utilizar esta
aproximación para generar una librería sintética que tenga una
diversidad teórica mayor de 10^{15} moléculas. En este caso, la
diversificación le permite a las moléculas que nunca existieron en
la librería original emerger en las ultimas rondas de selecciones
sobre la base de su similaridad para seleccionar las moléculas,
similar a la manera en la cual la evolución de la proteína busca la
bastedad de el espacio de secuencia de la proteína sobre el
subconjunto pequeño en un momento.
Luego de rondas múltiples de selección,
amplificación, diversificación, y traducción, las moléculas que
sobreviven la selección se caracterizaran por su capacidad a unirse
a la proteína blanco. Para identificar las secuencias de ADN que
codifican las moléculas sintéticas evolucionadas que sobreviven la
selección los moldes de PCR amplificado son clonados en vectores,
transformados en células, y secuenciados como clones individuales.
La secuenciación de ADN de estos moldes subclonados revela la
identidad de las moléculas sintéticas que sobreviven a la selección.
Para ganar información general acerca de los grupos funcionales que
son seleccionados durante las rondas de evolución, las poblaciones
de molde son secuenciadas en grupos para revelar la distribución de
A, G, T y C en cada posición del codón. El diseño juicioso de cada
uno de los códigos genéticos de los grupos funcionales permite que
sea reconectada información considerable de la secuenciación de la
población. Por ejemplo, un G en la primera posición de un codón
puede designar un grupo cargado, mientras que un C en esta posición
puede codificar un sustituyente hidrófobo.
Para validar la selección de unión de integrina
y comparar miembros de librería seleccionados con ligandos de
integrina \alpha_{v}\beta_{3} conocidos, también están
incluidos los análogos GRGDSPK lineal y RGDfV cíclico (cíclico
iso-ERGDfV) en la librería de péptido cíclica
moldeada con ADN. Las condiciones de selección se ajustan hasta
verificación de que las librerías que contienen estos ligandos de
integrina conocidos sufren enriquecimiento de moldes de ADN que
codifican los ligandos conocidos luego de la selección para unión de
integrina. Además, el grado de enriquecimiento de las secuencias de
molde que codifican estos ligandos de integrina
\alpha_{v}\beta_{3} conocidos están correlacionados con sus
afinidades conocidas y con el enriquecimiento y afinidad de ligandos
de integrina \alpha_{v}\beta_{3} recientemente
descubiertos.
Una vez que el enriquecimiento de las secuencias
de molde que codifican los ligandos conocidos y de nueva integrina
se confirman, los ligandos novedosos evolucionados se sintetizarán
mediante síntesis moldeada sin ADN y ensayada para su actividad y
especificidad antagonista al receptor de integrina
\alpha_{v}\beta_{3}. Los ensayos estándar de unión in
vitro a los receptores de integrina (Dechantsreiter et
al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033-40) son
desarrollados al competir la unión de fibrinógeno biotinilado (1
ligando de integrina natural) a el receptor de integrina
inmovilizado con el ligando a ser ensayado. La inhibición de la
unión al fibrinógeno se cuantifica mediante la incubación con un
anticuerpo anti biotina conjugado a fosfatasa alcalina y un sustrato
de fosfato alcalino cromogénico. La comparación de las afinidades de
unión de los miembros de librería aleatoriamente escogidos antes y
después de la selección validará la evolución de la librería hacia
la unión del blanco. Los ensayos para unir proteínas no blanco
revelan la capacidad de estas librerías a ser evolucionadas hacia la
especificidad de unión además de la afinidad de unión.
De manera similar, la selección para la unión
del factor Xa es validada al incluir los inhibidores de tripéptido
de factor Xa conocidos en el diseño de la librería y verificar que
una ronda de la selección del factor Xa y la amplificación PCR de
como resultado el enriquecimiento de sus moldes ADN asociados. Los
miembros de librería sintéticos evolucionados para unir el factor Xa
son ensayados in vitro por su capacidad para inhibir la
actividad del factor Xa. La inhibición del factor Xa puede ser
fácilmente ensayada espectrofotométricamente utilizando el sustrato
cromogénico comercialmente disponible S-2765
(Chromogenix, Italy).
Aunque la secuencia de ADN sola de un miembro de
librería de péptido no natural probablemente revele la identidad
exacta del péptido correspondiente, la etapa final en la síntesis de
librería bicíclica es una cicloadición 1,3-dipolar
intramolecular moldeadas en ADN que puede producir pares
diastereoméricos de regioisómeros. Aunque el modelamiento sugiere
fuertemente que solo el regioisómero mostrado en la figura 38 se
puede formar por razones estéricas, la selectividad facial es menos
cierta. La pureza diastereomerica no se requiere para las elecciones
in vitro descritas anteriormente en razón a que cada molécula
se selecciona sobre una base de molécula simple. Sin embargo, se
puede ser útil caracterizar la diastereoselectividad de la
cicloadición bipolar. Para lograr esto, se desarrolla la síntesis
moldeada sin ADN de los miembros de librería bicíclica seleccionada,
los diastereómeros son separados mediante HPLC preparativo Quiral, y
se determina la estequiometría de producto mediante difracción nOe o
de rayos X.
Una aproximación alternativa a traducir ADN en
polímeros no naturales, evolucionables tiene la ventaja de la
capacidad de algunas ADN de polimerasas a aceptar ciertos sustratos
de nucleótido trifosfato modificado (D. M. Perrin et al. J.
Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556; D. M. Perrin et al.
Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377-91; T.
Gourlain et al. Nucleic acids Res. 2001, 29,
1898-1905; S. E. Lee et al. Nucleic Acids
Res. 2001, 29, 1565-73; K. Sakthievel et al.
Angew. Chem. Int, Ed 1998, 37, 2872-2875). Varios
desoxirribonucleótidos (figura 45) y ribonucleótidos que llevan
modificaciones a los grupos que no participan en la unión de
hidrogeno de Watson-Crick son conocidos por ser
insertados con plantillas de ADN natural opuestas de alta fidelidad
de secuencia. De manera importante, el ADN de hebra simple que
contienen los nucleótidos modificados puede servir como plantillas
suficientes para la incorporación catalizada de ADN polimerasa de
nucleótidos naturales o modificados. En uno de los ejemplos
anteriores de la incorporación de nucleótido modificado mediante ADN
polimerasa, Toole y otros recortaron la aceptación de
5-(1-pentinil)-desoxiuridina 1
mediante ADN polimerasa Vent bajo condiciones PCR (J. A. Latham
et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 2817-22).
Varios derivados de desoxiuridinas 5-funcionalizadas
adicionales (2-7) fueron subsecuentemente
encontrados por ser aceptados por ADN polimerasa termoestables
adecuadas para PCR (K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed
1998, 37, 2872-2875). La primer purina
funcionalisada aceptada por la ADN polimerasa, el análogo
desoxiadenosina 8, se incorporo en el ADN mediante la ADN polimerasa
T7 junto con el análogo 7 desoxiuridina (D. M. Perrin et al.
Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 377-91). Las
librerías de ADN que contienen tanto 7 como 8 fueron sucesivamente
seleccionadas para actividad de clivamiento de ARN independiente de
metal (D. M. Perrin et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123,
1556-63). Williams y otros ensayaron recientemente
varios derivados de desoxiuridina para la aceptación de ADN
polimerasa Taq y concluyo que la aceptación es la mas grande cuando
se utilizan uridinas C5 modificadas que llevan alquino rígido o
grupos trans alqueno tales como 9 y 10 (S. E. Lee et al.
Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73). Un estudio
similar (T. Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29,
1898-1905) sobre las
7-deaza-desoxiadenosinas C7
funcionalisadas reveló la aceptación de la ADN polimerasa Taq de
7-aminopropil- (11),
cis-7-aminopropil- (12), y
7-aminopropinil-7-deazadesoxiadenosina
(13).
Los nucleótidos funcionalizados incorporados por
las ADN polimerasas hasta la fecha, mostradas en la figura 46, se
han enfocado en agregar funcionalidades ácidas y básicas
"similares a proteínas" al ADN. Aunque equipando los ácidos
nucleicos con funcionalidad de ácido general y base general tal como
los grupos de amina primaria y carboxilato se podrían incrementar la
capacidad de los catalizadores de ácido nucleico, los grupos
funcionales presentes en las bases de ácido nucleico naturales ya
han demostrado la capacidad de servir como ácido y bases generales.
La ribozima delta de hepatitis por ejemplo, se cree que utiliza la
amina endocíclica modulada pK_{a-} de la citosina 75 como un ácido
general (S Nakano et al. Sciense 2000, 287,
1493-7) y la actividad de peptidil transferasa del
ribosoma puede similarmente confiar en la catálisis de base general
o ácido general (G. W. Muth et al. Sciencie 2000, 289,
947-50; P Nissen et al. Science 2000, 289,
920-930; N. Ban et al. Science 2000, 289,
905-920). Aunque el ultimo caso permanece como el
objeto de un debate en desarrollo (N. Polacek et al. Nature
2001, 411, 498-501). Equipar las bases de ADN con
ácidos Bronsted adicionales y grupos básicos, por lo tanto, puede no
expandir profundamente el alcance de la catálisis de ADN.
Como contraste con la funcionalidad de ácido y
base general simple, los centros quirales de metal expandirían
considerablemente el alcance químico de los ácidos nucleicos. La
funcionalidad objetivo al unir centros de metal químicamente
potentes ya ha sido incorporada en los polímeros de ácido nucleico.
El ADN natural ha demostrado una capacidad de doblarse en
estructuras tridimensionales complejas capaces de unir
estereoespecíficamente moléculas blanco (C. H Lin et al.
Chem. Biol. 1997, 4, 817-32; C. H. Lin et al.
Chem. Biol. 1998, 5, 555-72; P. Schultze et
al. J. Mol. Biol. 1994, 235, 1532-47) o
catalizando el fosfodiéster y uniendo la manipulación (S. W. Santoro
et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1997, 94,
4262-6; R. R. Breaker et al. Cheam. Biol.
1995, 2, 655-60; Y. Li et al. Biochemistry
2000, 39, 3106-14; Y. Li et al. Proc Natl.
Acad. Sci. USA 1999, 96, 2746-51). Depuración de ADN
(T. L. Sheppard et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 2000, 97,
7802-7807) and porphyrin metallation (Y Li et
al. Biochemistry 1997, 36, 5589-99; Lie et
al. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743-7). Los
ácidos nucleicos no naturales aumentaron con la capacidad de unir
metales con agua químicamente potentes tales como Cu, La, Ni, Pd,
Rh, Ru, o Sc podían poseer propiedades catalíticas grandemente
expandidas. Por ejemplo, los oligonucleotidos que se unen a Pd
doblados en una estructura bien definida podían poseer la capacidad
de catalizar reacciones de acoplamiento mediadas por Pd con un alto
grado de regioespecificidad o estereoespecificidad. De manera
similar, los ácidos nucleicos no naturales que forman los sitios de
unión Sc quiral pueden servir como cicloadición enantioselectiva
acoplada con selecciones in vitro para actividades
catalíticas que posibilitarían por lo tanto la devolución directa de
los catalizadores deseados de las librerías
aleatorias.
aleatorias.
La evolución de los catalizadores en esta
aproximación está dirigida a la dificultad de diseñar racionalmente
sitios catalíticos activos con propiedades químicas especificas que
han inspirado resientes aproximaciones combinatoriales (K. W. Kuntz
et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3,
313-319; M. B. Francis et al. Angew. Chem.
Biol. 1998, 2, 422-8) para el descubrimiento de
catalizadores organometálicos. Por ejemplo, Hoveyda y otros
identificaron catalizadores de epoxidación en enantioselectiva
basados en Ti mediante selección en serie de ligandos de péptido (K.
D. Shimizu et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36) la
selección en serie también fue utilizada por Jacobsen y otros para
identificar los ligandos de péptido que forman los catalizadores de
epoxidación en antioselectiva cuando se compleja con cationes de
metal (M. B. Francis et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
1999,38, 937-941). Recientemente, una librería de
péptidos que contiene cadenas laterales de fosfina fue seleccionada
por la capacidad de catalizar la adición de ester de malonato a
ciclopentenil acetato en la presencia de Pd (S. R. Gilbertson et
al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6522-6523). La
aproximación habitual difiere fundamentalmente de los esfuerzos de
descubrimiento de catalizador combinatoriales previos, sin embargo,
por que ésta posibilita al catalizador con las propiedades deseadas
de emerger espontáneamente de librerías de
solución-fase de un pote después de ciclos de
evolución de la diversificación, amplificación, traducción, y
selección. Esta estrategia le permite hasta 10^{15} diferentes
catalizadores ser generados y seleccionados por las propiedades
deseadas en un experimento simple. La compatibilidad de nuestra
aproximación con las selecciones in vitro de un pote permite
la selección directa de los catalizadores de reacción en lugar de la
selección de un fenómeno asociado con la catálisis tal como la unión
o generación de calor. Además, las propiedades difíciles de
seleccionar rápidamente tal como la estereoespecificidad del
sustrato o la selectividad del metal pueden ser directamente
seleccionadas utilizando nuestra aproximación (ver adelante).
Los intermedios claves para un número de
análogos de uridina C5 funcionalizados y análogos de
7-deazaadenosina C7-funcionalizados
han sido sintetizados para la incorporación en polímeros de ADN no
naturales. Además, se ha completado la síntesis de análogos de
adenosina C8 funcionalizados como desoxirribonucleótidos tifosfatos.
En razón a que existe solo información limitada sobre la capacidad
de las ADN polimerasas a aceptar los nucleótidos modificados,
nosotros escogimos sintetizar análogos que fueran sintetizados que
no solamente llevaran funcionalidad de unión a metal a los ácidos
nucleicos sino también suministraran interioridades en los
determinantes de la aceptación de ADN polimerasa.
La estrategia para la síntesis de uridina que se
une a metal y análogos de 7-deazaadenosina se
muestra en la figura 47. Ambas rutas terminan con formación de unión
de amida entre los esteres NHS de los grupos funcionales que se unen
a metal y los desoxirribonucleótidos trifosfatos amino modificados
(7 y 13). Los análogos 7 y 13 así como también los derivados
acetilados de 7 han sido previamente mostrados (D. M. Perrin et
al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556-63; D. M.
Perrin et al. Nucleosides Nucleotides 1999, 18,
377-91; J. A. Latham et al. Nucleic Acids
Res. 1994, 22, 2817-22; T. Gourlain et al.
Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1898-1905; S.E. Lee
et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 1565-73;
K. Sakthievel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37,
2872-2875) para ser tolerado por las ADN
polimerasas, incluyendo ADN polimerasas termoestables adecuadas para
PCR. Esta aproximación convergente permite una amplia variedad de
ligandos que se unen a metal que sean rápidamente incorporados en su
análogo de nucleótido. La síntesis de 7 se ha completado luego de un
ruta previamente reportada (K. Sakthivel et al. Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2872-2875) (fig. 48,
Phillips, Chorba, Liu, unpublished results).El acoplamiento Heck de
5-yodo-2'-desoxiuridina
(22) comercialmente disponible con
N-aliltrifluoroacetamida suministrada 23. El grupo
5'-trifosfato se instalo mediante tratamiento de 23
con trimetilfosfato, POCl_{3} y esponja de protón
(1,8-bis(dimetilamino)-naftaleno)seguido
por tri-n-butilamonio pirofosfato, y
el grupo trifluoroacetamida entonces removido con amonio acuoso para
lograr 7.
Varias etapas hacia la síntesis de 13 se han
completado, el intermedio clave para los análogos de
7-deazaadenosina (figura 49). Siguiendo una ruta
conocida (J. Davoll. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82,
131-138) se sintetizo dietoxietilcianoacetato (24)
de bromoacetal 25 y etil cianoacetato (26). La condensación de 24
con tiourea suministró pirimidina 27 que fue desfulzurisada con
níquel Raney y luego ciclizada hasta pirrolopirimidina 28 con HCl
acuoso diluido. El tratamiento de 28 con POCl_{3} logro
4-cloro-7-dezaadenina
(29). El grupo aril yoduro que servirá como un compañero acoplante
Sonogashira para la instalación de la amina propargilica en 13 se
instaló al hacer reaccionar 29 con N-iodosuccinimida
para generar
4-cloro-7-yodo-7-deazaadenina
(30) con un rendimiento total del 13% de bromoacetal 25.
Como análogos funcionalizados alternativos que
sondearan ambos los requisitos estructurales de la aceptación del
ADN polimerasa y suministrar funcionalidad que se une a metal
potencial, seis desoxiadenosina trifosfatos
8-modificado (Figura 50) han sido sintetizados.
Todos los grupos funcionales fueron instalados mediante adición de
8-bromo-desoxiadenosina (31), que se
preparó mediante brominación de desoxiadenosina en la presencia de
ScCl_{3}, que encontramos que incrementaba grandemente el
rendimiento del producto. Metil (32), etil (33), y vinil adenosina
(34) fueron sintetizadas mediante acoplamiento Stille mediado con Pd
del correspondiente reactivo de alquil estaño y 31 (P. Mamos et
al. Tetrahedron lett. 1992, 33, 2413-2416).
Metilamino (35) (E. Nandanan et al. J. Med. Chem. 1999, 42,
1625-1638), etilamino (36), e histaminoadenosina
(37) se prepararon mediante tratamiento con 23 con la
correspondiente amina en agua o etanol. Los
5'-nucleótido trifosfato de 32-37
fueron sintetizados como se describió anteriormente.
La capacidad de las ADN polimerasas
termoestables adecuadas para amplificación PCR para aceptar estos
trifosfatos de nucleótido modificado que contienen funcionalidad que
se une a metal. Los trifosfatos de nucleótido no naturales fueron
purificados mediante HPLC de intercambio de Ion y agregados a
reacciones PCR que contienen ADN polimerasa Taq, tres trifosfatos
desoxinucleotidos naturales, ADN de plantilla de pUC19, y dos
iniciadores de ADN. Los iniciadores fueron escogidos para generar
los productos PCR que varían de 50 a 200 pares base de longitud. Las
reacciones del PCR de control contenían los cuatro desoxinucleotidos
trifosfatos y ningún nucleótido no natural. Las reacciones PCR
fueron analizadas mediante agarosa o electroforesis de gel de
acrilamida desnaturalizante. El derivado de uridina aminomodificado
7 fue eficientemente incorporado mediante ADN polimerasa Taq sobre
30 ciclos PCR, aunque el trifosfato de 23 no fue un sustrato de
polimerasa eficiente (Figura 51). Los hallazgos previos sobre la
aceptación de 7 mediante ADN polimerasa Taq están en conflicto con
ambos de no aceptación (K. Sakthivel. et al. Angew. Chem.
Int. Ed Engl. 1998, 37, 2872-2875) y los de
aceptación (S. E. Lee et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29,
1565-73) reportados.
Síntesis de Desoxiribonucleotido Trifosfato que
se Une a Metal no Natural: la síntesis de uridina
C5-funcionalizada, 7-deazaadenosina
C7-funcionalizada, y adenosina desoxinucleotido
trifosfatos C8 funcionalizados se completara. La síntesis de
derivados de 7-deazaadenosina de
4-cloro-7-yodo
deazaadenina (30) procede mediante glicosilación de 30 con cloruro
de desoxiribosil protegido (38) seguido por amonolisis para lograr
7-yodo-adenosina (39) (Figura 31)
(Gourlain et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29,
1898-1905). El cloruro de desoxiribosil protegido
(38) se puede generar de desoxirribosa como se muestra en la figura
52. El acoplamiento Sonogashira mediado por Pd (Seela et al.
Helv. Chem. Acta 1999, 82, 1878-1898) de 39 con
N-propiniltrifluoroacetamida suministra 40, que es
luego convertido al 5'nucleótido trifosfato y desprotegido con
amonio como se describió anteriormente para producir 13.
Para generar rápidamente una conexión de uridina
que se une a metal y análogos de adenosina, una variedad de grupos
que se une a metal como esteres NHS se acoplara al intermedio de
uridina C5-modificado 7 (ya sintetizado) e
intermedio de 7-deazaadenosina
C7-modificada 13. Los grupos de unión que se unen a
metal que serán examinados inicialmente se muestran en la Figura 47
e incluyen fosfinas, grupos tiopiridilo, y porciones de
hemi-salen. Si nuestros ensayos de aceptación de
polimerasa inicial (ver la siguiente sección) de trifosfatos de
adenosinas 8-modificadas 32-37
(Figura 50) sugieren que una variedad de análogos de adenosina
8-modificada se acepta por las polimerasas
termoestables, alquil y vinil trifluoroacetamidas serán acopladas a
8-bromo-deoxiadenosina (31) para
generar trifosfatos de nucleótido tal como 41 y 42 (figura 53).
Estos intermedios son entonces acoplados con los esteres NHS
mostrados en la figura 46 para generar una variedad de trifosfatos
desoxiadenosina 8-funcionalizados que se unen a
metal.
Evaluación de Nucleótidos No Naturales: Cada
desoxirribonucleótido trifosfato funcionalizado es luego ensayado
para su adecuabilidad como un bloque de construcción de una librería
de polímero no natural evolucionable en dos etapas. Primero, la
aceptación simple mediante ADN polimerasa termoestables se mide
mediante amplificación PCR de fragmentos de plásmido de ADN pUC19 de
longitud variante. Las reacciones PCR contienen iniciadores
sintéticos designados para unir en los extremos del fragmento una
pequeña cantidad de ADN de plantilla de pUC19, una ADN polimerasa
termoestable, (Taq, Pfu o Vent), tres desoxirribonucleótido
trifosfato naturales, y los nucleótidos trifosfato no naturales para
ser ensayados. La incorporación completamente exitosa de nucleótido
no natural da como resultado la producción de productos de ADN de
cualquier longitud en una proporción similar a aquella de la
reacción de control. Aquellos nucleótidos que permiten al menos la
incorporación de 10 o más nucleótidos no naturales en una molécula
de producto simple con al menos eficiencia modesta son sometidos a
la segunda etapa de evaluación.
Nucleótidos no naturales aceptados por ADN
polimerasa termoestables son evaluados por sus posibles propiedades
mutagénicas. Si las ADN polimerasas insertan un nucleótido no
natural opuesto una base de plantilla incorrecta
(non-Watson-Crick), insertan un
nucleótido natural incorrecto opuesto a un nucleótido no natural en
la plantilla, la fidelidad de la amplificación de librería y
traducción esta comprometida. Para evaluar esta posibilidad, los
productos PCR generados en el ensayo anterior son sometidos a
secuenciación de ADN utilizando cada uno de los iniciadores PCR. Las
desviaciones de la secuencia de la plantilla pCU19 implican que uno
o ambos de los mecanismos mutagénicos tienen lugar. Las proporciones
de error de menos del 0.7% por base de 30 ciclos PCR son aceptables,
en la medida en que el PCR propenso a error genera errores en
aproximadamente esta proporción (Caldwell et al. PCT Methods
Applic. 1992, 2, 28-33) habiendo sido exitosamente
utilizado para evolucionar librerías de ácido nucleico.
Los pares de análogos de adenosina no natural
promisorios y los análogos de uridina no natural también son
ensayados juntos por su capacidad para soportar polimerización de
ADN en una reacción PCR que contiene tanto los trifosfatos de
nucleótido modificado junto con dGTP y dCPT. La formación de
producto PCR exitosa con dos nucleótido trifosfatos no naturales
posibilita la incorporación de dos bases que se unen a metal no
naturales en la misma molécula de polímero. Los nucleótidos
funcionalizados que son especialmente interesantes aun no son
compatibles con AD polimerasa termoestables Taq, Pfu, o Vent pueden
aun ser utilizados en las librerías suministradas que ellas son
aceptadas por una ADN polimerasa comercialmente disponible tal como
el fragmento Klenow de ADN polimerasa de E. coli l, ADN
polimerasa T7, ADN polimerasa T4 o hanscriptasa inversa
M-MuLV. En este caso, los ensayos requieren conducir
la etapa de extensión iniciadora de la reacción PCR a
25-37ºC, y se debe agregar polimerasa fresca en cada
ciclo luego de la etapa de desnaturalización a 94ºC. la
secuenciación de ADN para evaluar las posibles propiedades
mutagénicas de los nucleótidos no naturales se desarrolla aun como
se describió anteriormente.
Generar Librerías de Polímeros que se Unen a
Metal: con base en los resultados de los ensayos de nucleótido no
natural anteriores, varias librerías de secuencia de ácido nucleico
diferentes \sim10^{15} se harán conteniendo uno o dos de la
polimerasa mas compatible de los nucleótidos que se unen a metal no
naturales químicamente promisorios. Las librerías son generadas
mediante filtración amplificación PCR de una librería de molde de
ADN sintético que consiste de una región aleatoria de 20 a 40
nucleótidos flanqueada por dos regiones iniciadoras constantes de 15
bases (Figura 54). Las regiones iniciadoras que contienen sitios de
clivaje de endonucleasa de restricción para permitir la clonación en
vectores para secuenciación de grupos de ADN o miembros de librería
individuales. Un iniciador contiene un manejo químico tal como un
grupo amina primario o un grupo tiol en su terminal 5' y se
convierte en una hebra codificante de la librería. Otro iniciador
contiene un biotinilado T en su terminal 5' y se vuelve una hebra no
codificante. La reacción PCR incluye uno o dos
desoxirribonucleótidos trifosfatos que se unen a metales no
naturales, tres o dos desoxirribonucleótidos trifosfatos naturales y
ADN polimerasa compatible con el o los nucleótidos no naturales.
Luego de la reacción PCR para generar la forma de doble hebra de la
librería y la purificación de gel para remover los iniciadores no
utilizados, los miembros de librería duplex son químicamente
desnaturalizados. Las hebras no codificantes son removidas mediante
varios lavados con glóbulos magnéticos ligados a estreptavidina para
asegurar que ninguna hebra biotinilada permanezca en la librería.
Las librerías de hasta 10^{15} diferentes miembros son generadas
mediante este método, excediendo de lejos la diversidad combinada de
los esfuerzos de catalizador combinatorios previos.
Cada librería es luego incubada en solución
acuosa con un metal de interés proveniente de la siguiente lista no
limitante de sales de metal compatible en agua (Fringueli et
al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001, 439-455;
Zaitoun et al. J. Phys. Chem. B 1997,
1857-1860): ScCl_{3}, CrCl_{3}, MnCl_{2},
FeCl_{2}, FeCl_{3}, CoCl_{2}, NiCl_{2}, CuCl_{2},
ZnCl_{2}, GaCl_{3}, YCl_{3}, RuCl_{3}, RhCl_{3},
PdCl_{2}, AgCl, CdCl_{2}, lnCl_{2},
La(OTf)_{3}, Ce(OTf)_{3},
Pr(OTf)_{3}, Nd(OTf)_{3},
Sm(OTf)_{3}, Eu(OTf)_{3},
Gd(OTf)_{3}, Tb(OTf)_{3},
Dy(OTf)_{3}, Ho(OTf)_{3},
Er(OTf)_{3}, Tm(OTf)_{3},
Yb(OTf)_{3}, Lu(OTf)_{3},
lrCl_{3}, PtCl_{2}, AuCl, HgCl_{2}, HgCl, PbCl_{2}, o
BiCl_{3}. Los metales son escogidos con base en las reacciones
químicas específicas a ser catalizadas. Por ejemplo, las librerías
destinadas a reacciones tales como consideraciones aldolo o
reacciones Diles-Alder hetero que son conocidas
(Fringuelli et al. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2001,
439-455) para ser catalizadas mediante ácido Lewis
son incubadas con ScCl_{3} o con uno de los triflatos de
lantanido, aunque aquellos objetivos en las olefinas deficientes en
electrón acoplante con haluro de arilos son incubadas con PdCl2. la
librería metalada es luego purificada alejándose de las sales de
metal no unidas mediante filtración de gel utilizando cartuchos de
sefadex o acrilamida, que separan los oligonucleotidos de ADN 25
bases o mas de los componentes de molécula pequeña no unidos.
La capacidad de la librería de polímero (o los
miembros de librería individuales) para unir metales de interés se
verifica al tratar la librería metalizada libre de metales no unidos
con reactivos de tensión de metal tales como ditiooxamida,
dimetilglioxima, KSCN (Francis et al. Curr. Opin. Chem. Biol.
1998, 2, 422-8) o EDTA (Zaitoun et al. J.
Phys. Chem. B 1997, 101, 1857-1860) que se colorean
a manera distinta en la presencia de diferentes metales. El nivel
aproximado de unión de metal se mide mediante comparación
espectrofotométrica con soluciones de metales libres de
concentración conocida y con soluciones de oligonucleótidos
recontrol positivo que contienen un grupo EDTA (que se puede
introducir utilizando una fosforamidita comercialmente disponible
de Glen Research).
Selecciones In Vitro para Catalizadores
de Polímeros No Naturales: Las librerías metalizadas de polímeros no
naturales evolucionables que contienen grupos que se unen a metal
son sometidas a selecciones de solución-fase de un
pote para actividades catalíticas de interés. Los miembros de
librería que catalizan virtualmente cualquier reacción que origina
la formación de enlace entre dos moléculas de sustito o que da como
resultado una ruptura de enlace en dos moléculas de producto son
seleccionados utilizando los esquemas propuestos en las figuras 54 y
55. Para seleccionar los catalizadores formadores de enlace por
ejemplo, hetero Diles-Alder, acoplamiento Heck,
reacción aldol, o catalizadores de metatesis de olefina) los
miembros de librería son covalentemente ligados a un sustrato a
través de sus terminales 5' amino o tiol. El otro sustrato de la
reacción se sintetiza como un derivado ligado a biotina. Cuando se
diluyen las soluciones del conjugado
librería-sustrato se hacen reaccionar con el
conjugado de sustrato-biotina, aquellos miembros de
librería que catalizan la formación de enlacé causan que el grupo
biotina se una covalentemente a ellos mismos. Los catalizadores que
forman enlace activo pueden ser entonces separados de los miembros
de librería inactivos al capturar el anterior con estreptavidina
inmovilizada y lavar los polímeros inactivos (Figura 55).
De una manera análoga los miembros de librería
que catalizan las reacciones de clivaje de enlace tal como las
reacciones de retro-aldol, hidrólisis de amida
reacciones de eliminación, o dihidroxilación de olefina seguido por
clivaje de periodato también se pueden seleccionar. En este caso,
los miembros de librería metalizada son covalentemente ligados a
sustratos biotinilados de tal forma que la reacción de la ruptura
del enlace origina la desconexión de la porción de biotina de los
miembros de librería (Figura 56). Luego de la incubación bajo
condiciones de reacción los catalizadores activos, pero ningún
miembro de librería inactivo, induce la perdida de sus grupos
biotina. Los glóbulos ligados a estreptavidina se pueden entonces
utilizar para capturar polímeros inactivos, aunque los catalizadores
activos son capaces de eludirse de los glóbulos. La formación de
unión relacionada y las secciones de clivaje de enlace han sido
utilizadas exitosamente en evolución de ARN y ADN catalítico
(Jaschke et al. Curr. Opin. Chem Biol. 2000, 4,
257-62) aunque estas selecciones no se seleccionan
explícitamente para catálisis de cambio múltiple de sus porciones de
sustrato (Jaschke et al. Curr. Opin. Chem Biol. 2000, 4,
257-62; Jaeger et al. J. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1999, 96, 14712-7; Bartel. Et al.
Science, 1993, 261, 1411-8; Sen et al. Curr.
Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 680-7).
Los catalizadores de tres importantes y diversas
reacciones formadores de enlace serán inicialmente evolucionadas: el
acoplamiento Heck, la cicloadición Diels-Alder
hetero, y la adición aldol. Todas las tres reacciones son
compatibles con agua (Kobayashi et al J. Am. Chem. Soc. 1998,
120, 8287-8288; Fringuelli et al. Eur. J.
Org. Chem. 2001, 2001, 439-455; Li et al.
Organic Reactions in Aqueous Media: Wiley and Sons: New York, 1997)
y son conocidas por ser catalizadas por metales. Como los sustratos
de acoplamiento Heck ambos deficientes en electrones y olefinas
inactivadas serán utilizados juntos con los yoduros de arilo y los
cloruros de arilo. Las reacciones Heck con los cloruros de arilo en
solución acuosa, así como también las reacciones Heck a temperatura
ambiente con cloruros de arilo no activados no han sido reportadas a
nuestro conocimiento. Las librerías para la evolución del
catalizador de acoplamiento Heck utiliza PdCl_{2} como una fuente
de metal. Los sustratos Diels-Alder hetero incluyen
dienos y aldeanos simples, mientras que los sustratos de adición
aldol consisten de aldehídos y ambos éteres silil enol así como
también cetonas simples. Los esquemas de selección representativos
para el acoplamiento Heck, Diles-Alder hetero y los
catalizadores de adición de aldol son mostrados en la figura 57. la
exigencia de estas selecciones se puede incrementar entre rondas de
selección al disminuir los tiempos de reacción, disminuyendo las
temperaturas de reacción, o utilizando menos sustratos activados
(por ejemplo, menos cloruros de arilo pobres en electrones (Littke
et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123,
6989-7000) o simples cetonas en lugar de silil enol
éteres).
Luego de cada ronda de selección, los miembros
de librería activos son amplificados mediante PCR con los
nucleótidos no naturales y sometidos a rondas adicionales de
selección para enriquecer la librería para los catalizadores
deseados, estas librerías son realmente evolucionadas al introducir
una etapa de diversificación antes de cada ronda de selección. Las
librerías son diversificadas mediante mutagenesis aleatoria
utilizando PCR propenso a error (Caldwell et al. PCR Methods
Aplicc. 1992, 2, 28-33) o mediante métodos de purga
de ADN modificado que recombinan fragmentos de ácido nucleico
pequeños, no homólogos. En razón a que el PCR propenso a error es
inherentemente menos eficiente que el PCR normal, la diversificación
del PCR propenso a error se conducirá solo con dATP, dTTp, dCTP, y
dGTP natural y utilizando iniciadores a los que les faltan manejos
químicos o grupos de biotina. Los productos mutagenisados
resultantes son luego sometidos a traducción PCR en polímeros de
ácido nucleico no naturales que utilizan reacciones PCR estándar que
contienen el o los nucleótidos no naturales, el iniciador
biotinilado, y el iniciador amino o thiol terminado.
Además a simplemente evolucionar los
catalizadores activos, las selecciones in vitro descritas
anteriormente son utilizadas para evolucionar librerías de polímero
no natural en reacciones potentes difíciles de lograr utilizando
otras aproximaciones de descubrimiento de catalizador. Una
característica posibilitante de estas selecciones es la capacidad de
seleccionar los miembros de librería que son biotinilados o para
miembros que no son biotinilados. La especificidad del sustrato
entre los catalizadores puede por lo tanto ser evolucionada al
seleccionar los catalizadores activos en la presencia del sustrato
deseado y luego seleccionar en el mismo pot para catalizadores
inactivos en la presencia de uno o más sustratos indeseados. Si los
sustratos deseados o indeseados difieren mediante la configuración
de uno o más estereocentros, los catalizadores enantioselectivos o
diastereoselectivos pueden emerger de las rondas de selección.
Similarmente, la selectividad de metal puede evolucionar al
seleccionar los catalizadores activos en la presencia de metales
deseados y seleccionar los catalizadores inactivos en la presencia
de metales no deseados. Por el contrario, los catalizadores con
amplia tolerancia de sustrato pueden evolucionar al variar las
estructuras de sustrato entre rondas sucesivas de selección.
Finalmente, las observaciones de la síntesis de
moldeado de ADN con secuencia especifica en DMF y CH_{2}Cl_{2}
sugiere que los complejos de cation de
ADN-tetraalquilamonio pueden formar estructuras de
pares base en solventes orgánicos. Este hallazgo eleva la
posibilidad de evolucionar nuestro catalizador de ácido nucleico no
natural en solventes orgánicos que utilizan versiones ligeramente
modificadas de las selecciones descritas anteriormente. El actual
enlace que forma reacciones de selección de Quilibaje de unión se
conducirá en solventes orgánicos, las reacciones crudas serán
precipitadas con etanol para remover los cationes de
tetraalquilamonio, y la separación de avidina inmovilizada de
miembros de librería biotinilada y no biotinilada en solución acuosa
se desarrollara. La amplificación de PCR de miembros seleccionados
tendrá lugar entonces como se describió anteriormente. La evolución
exitosa de los catalizadores de reacción que funcionan en solventes
orgánicos se expandiría considerablemente tanto el alcance de las
reacciones que se puedan catalizar como la utilidad de los
catalizadores de polímero no naturales evolucionados
resultantes.
Polímeros no naturales evolucionados
caracterizantes: las librerías sometidas a varias rondas de
evolución son caracterizadas por su capacidad de totalizar las
reacciones de interés tanto como grupos de secuencias mezcladas o
como miembros de librería individuales. Los miembros individuales
son extricados de grupos evolucionados al ligar secuencias
amplificadas de PCR en vectores de ADN, transformar las soluciones
diluidas de vectores ligados en células bacteriales competentes, y
escoger colonias simples de transfonantes. Los ensayos de grupo o
secuencias individuales son conducidos tanto en un formato de cambio
simple como en un formato catalítico de cambio múltiple real. Para
los ensayos de cambio simple, la velocidad a la cual el catalizador
de formación de base ligado a sustrato efectuara su propia
biotinilación en la presencia de un sustrato biotinilado libre se
medirá, o la velocidad a la cual los catalizadores de ruptura de
enlace biotinilado efectuaran la perdida de sus grupos biotina.
Múltiples ensayos de cambio son conducidos al incubar catalizadores
evolucionados con pequeñas versiones de molécula de sustratos y
analizar la velocidad de formación de producto mediante tlc, RMN,
espectrometría de mas, HPLC, o espectrofotometría.
Una vez que los catalizadores de cambio múltiple
son evolucionados y verificados por distintos métodos, los estudios
mecanisticos detallados pueden ser conducidos sobre el catalizador.
Las secuencias de ADN que corresponden al catalizador son reveladas
mediante productos PCR de secuenciación o vectores de ADN que
contienen las plantillas de catalizadores activos. Las preferencias
de metal son evaluadas por catalizadores metalizantes con una amplia
variedad de cationes de metal y medición de los cambios resultantes
en la actividad. La especificidad del sustrato y la
estereoselectividad de estos catalizadores es evaluada al medir las
velocidades de cambio de una serie de análogos de sustrato. Las
diaestereoselectividades y las enantioselectividades de la formación
de producto son reveladas al comparar los productos de reacción con
aquellos de estereoquímica conocidos. Los estudios previos sugieren
que los sitios activos enterrados dentro de ambientes quirales
grandes a menudo poseen altos grados de estereoselectividad. Por
ejemplo, los catalizadores basados en péptido generados en
aproximaciones combinatoriales han demostrado pobre a excelente
estereoselectividades que se correlacionan con el tamaño del ligando
de péptido. (Jarvo et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121,
11638-11643) mientras que los catalizadores basados
en ARN y los catalizadores basados en anticuerpo frecuentemente
demuestran excelentes estéreoselectividades (Jaschke et al.
Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 257-262; Seelig
et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2000, 39,
4576-4579; Hilvert, D. Annu. Rev. Biochem. 2000, 69,
751-93; Barbas. et al. Science 1997, 278,
2085-92; Zhong et al. Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 1999, 38, 3738-3741; Zhong et al. J.
Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8131-8132; List et
al. Org. Lett. 1999, 1, 59-61) las selecciones
directas de los sustratos estéreoselectivamente descritos
anteriormente debe mejorar adicionalmente esta propiedad entre los
catalizadores evolucionados.
Los estudios de función de estructura sobre los
catalizadores evolucionados son mayor mente facilitados por la
facilidad de la síntesis de ADN automatizada. Las modificaciones
estructurales específicas de sitio son introducidas al sintetizar
secuencias de ADN que corresponden a catalizadores "mutados" en
cuyas bases de interés son cambiadas a otras bases. Cambiando las
bases no naturales en un catalizador a una base natural (U* a C o A*
a G) y ensayando los mutantes resultantes se pueden identificar los
sitios de unión a metal químicamente importantes en cada
catalizador. El polímero mínimo requerido para la catálisis
eficiente se determina al sintetizar y ensayar progresivamente las
versiones truncadas de los catalizadores activos. Finalmente, las
estructuras tridimensionales de la mayoría de los catalizadores
evolucionados de interés en complejos con metales son resueltas en
colaboración con espectroscopistas RMN macromoleculares o
cristalografos de rayos X.
Claims (67)
1. un método para desarrollar síntesis moldeada
de ácido nucleico, el método comprende las etapas de:
(a) suministrar (i) un molde que comprende una
primer unidad reactiva covalentemente asociada con un primer
oligonucleótido que define una primer secuencia de codon, y (ii) una
unidad de transferencia que comprende una segunda unidad reactiva
asociada con un segundo oligonucleótido que define una primer
secuencia anti codón complementaria a la primer secuencia de codón
de la plantilla.
(b) Reasociación del primer codón y las primeras
secuencias anti codón para llevar la primer unidad reactiva y la
segunda unidad reactiva en proximidad reactiva;
(c) Introducir una reacción entre la primera y
segunda unidades reactivas para producir un producto de
reacción.
2. Un método para desarrollar síntesis moldeada
de ácido nucleico, el método comprende las etapas de:
(a) suministrar (i)un molde amplificable
que comprende una primer unidad reactiva asociada con un fuste
oligonucleótido que define una primer secuencia de codon, y (ii) una
primer unidad de transferencia que comprende una segunda unidad
reactiva asociada con un segundo oligonucleótido que define una
secuencia anti codón complementaria a la primer secuencia de
codón.
(b) Reasociar las secuencias de codón y anti
codón para llevar la primer unidad reactiva y la segunda unidad
reactiva en proximidad reactiva;
(c) Inducir una reacción entre la primera y
segunda unidades reactivas para producir un producto de
reacción.
(d) amplificar el molde.
3. Un método para desarrollar síntesis moldeada
de ácido nucleico, el método comprende la etapas de:
(a) suministrar (i)un molde que comprende
una primer unidad reactiva asociada con un primer oligonucleótido
que define una primer secuencia de codón y una segunda, diferente
secuencia de codon, y (ii) una primer unidad de transferencia que
comprende una segunda unidad reactiva asociada con un segundo
oligonucleótido que define una primer secuencia anti codón
complementaria a la primer secuencia de codón del molde.
(b) Reasociar la primer secuencia de codón y la
primer secuencia anti codón para llevar la primer unidad reactiva y
la segunda unidad reactiva en proximidad reactiva;
(c) Inducir una reacción entre la primera y
segunda unidades reactivas para producir un producto de
reacción.
(d) seleccionara el producto de reacción
asociado con el molde.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la segunda unidad reactiva esta
covalentemente unida al segundo oligonucleótido.
5. El método de la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en donde el molde comprende además una segunda
secuencia de codón diferente.
6. El método de la reivindicación 5, que
comprende además suministrar una segunda unidad de transferencia
capas de reasociarse a la segunda secuencia de codón diferente del
molde.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la
primera y segunda unidades de transferencia son suministradas juntas
en la etapa (b).
8. El método de la reivindicación 1, que
comprende además la etapa adicional de seleccionar el producto de
reacción asociadas con el molde.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el
producto de reacción esta covalentemente unido alo molde.
10. El método de la reivindicación 8, que
comprende además la etapa adicional de amplificar el molde.
11. El método de la reivindicación 8, que
comprende además la etapa adicional de determinar la secuencia del
molde para facilitar de esta manera la identificación del producto
de reacción.
12. El método de la reivindicación 2 o la
reivindicación 3, que comprende además la etapa adicional de
determinar la secuencia del molde para facilitar de esta manera la
identificación del producto de reacción.
13. El método de la reivindicación 2 o la
reivindicación 3, en donde la primer unidad reactiva esta
covalentemente unida al primer oligonucleótido.
14. El método de la reivindicación 2, en donde
la primer unidad reactiva esta no covalentemente unida al primer
oligonucleótido.
15. El método de la reivindicación 14, en donde
la primer unidad reactiva está unida a el primer oligonucleótido por
vía del tercer oligonucleótido que se hibridaza al primer
oligonucleótido.
16. El método de la reivindicación 2, en donde
el molde es amplificado por una reacción de cadena de
polimerasa.
17. El método de la reivindicación 2, que
comprende además la etapa adicional de seleccionar el producto de
reacción asociado con la plantilla.
18. El método de la reivindicación 17, en donde
el producto de reacción esta covalentemente unido al molde.
19. El método de la reivindicación 17, en donde
el producto de reacción esta no covalentemente unido al molde.
20. El método de la reivindicación 3, que
comprende además suministrar una segunda unidad de transferencia que
comprende un tercer oligonucleótido que comprende una segunda
secuencia anti codón capas de reasociarse al la segunda secuencia de
codón diferente del molde.
21. El método de la reivindicación 20, en donde
la segunda unidad de transferencia comprende además la tercer unidad
reactiva.
22. El método de la reivindicación 21, que
comprende además, antes de la etapa (d), las etapas de:
(e) reasociar la segunda secuencia de codón a la
segunda secuencia de codón diferente del molde; y (f) inducir la
reacción entre la tercer unidad reactiva y el producto de reacción,
para producir de esta manera un producto de reacción modificado a
ser seleccionado en la etapa (d).
23. El método de la reivindicación 22, en donde
la etapa (e) precede la etapa (c).
24. El método de la reivindicación 3, en donde
la primer unidad reactiva esta covalentemente unida al primer
oligonucleótido.
25. El método de la reivindicación 3, en donde
la primer unidad reactiva esta no covalentemente unida al primer
oligonucleótido.
26. El método de la reivindicación 25, en donde
la primer unidad reactiva esta no covalentemente unida al primer
oligonucleótido por vía de una secuencia de oligonucleótido que
hibridaza al primer oligonucleótido.
27. El método de la reivindicación 3, en donde
la segunda unidad reactiva esta covalentemente unida al segundo
oligonucleótido.
28. El método de la reivindicación 3, en donde
el producto de reacción esta covalentemente unido al molde.
29. El método de la reivindicación 3, que
comprende además la etapa adicional de amplificar el molde.
30. El método de la reivindicación 3, que
comprende además la etapa adicional de determinar la secuencia del
molde para facilitar de esta manera la identificación del producto
de reacción.
31. El método de la reivindicación 3, en donde
la primer unidad reactiva comprende una molécula de andamio capas de
reaccionar con una pluralidad de reactivos.
32. Un método para desarrollar síntesis moldeada
de ácido nucleico, el método comprende las etapas de:
(a) suministrar (i)un molde que comprende
una molécula de andamio asociada con un primer oligonucleótido que
define una primer secuencia de codón y una segunda secuencia de
codón diferente, la molécula de andamio comprende una pluralidad de
sitios para la modificación, y (ii) una primer unidad de
transferencia que comprende una unidad reactiva covalentemente unida
a un segundo oligonucleótido que define una primer secuencia anti
codón complementaria a la primer secuencia de codón.
(b) Reasociar la primer secuencia de codón y la
primer secuencia anti codón para llevar la molécula de andamio y la
unidad reactiva en proximidad reactiva;
(c) Inducir la reacción formadora de unión
covalente entre la unidad reactiva y ala molécula de andamio para
producir una molécula de andamio modificada.
33. El método de la reivindicación 32, en donde
la molécula de andamio esta covalentemente unida al primer
oligonucleótido.
34. El método de la reivindicación 32, en donde
la unidad reactiva esta covalentemente unida al segundo
oligonucleótido.
35. El método de la reivindicación 32, que
comprende además suministrar una segunda unidad de transferencia que
comprende una unidad reactiva asociada con un tercer oligonucleótido
que define una segunda secuencia anti codón capas de reasociarse a
la segunda secuencia de codón diferente del molde.
36. El método de la reivindicación 32, que
comprende además la etapa de reasociar la segunda secuencia anti
codón de la segunda unidad de transferencia a la segunda secuencia
de codón diferente del molde.
37. El método de la reivindicación 36, que
comprende además la etapa de inducir un enlace covalente entre la
molécula de andamio modificada y la segunda unidad reactiva.
38. El método de la reivindicación 32, que
comprende además la etapa adicional de seleccionar una molécula de
andamio modificada asociada con el molde.
39. El método de la reivindicación 38, en donde
la molécula de andamio modificada esta covalentemente unida al
molde.
40. El método de la reivindicación 38, que
comprende además la etapa de amplificar el molde.
41. El método de la reivindicación 38, que
comprende además la etapa de determinar la secuencia del molde para
facilitar la identificación de la molécula de andamio
modificada.
42. El método de la reivindicación 40, que
comprende además la etapa de determinar la secuencia del molde para
facilitar la identificación de la molécula de andamio
modificada.
43. El método de la reivindicación 36, en donde
la primer y segunda unidad de transferencia se suministran juntas en
la etapa (b).
44. El método de la reivindicación 32, en donde
la molécula andamio es capas de reaccionar con una pluralidad de
reactivos.
45. Un método para producir una pluralidad de
productos de reacción en una solución simple, el método comprende
las etapas de:
(a) suministrar una pluralidad de moldes que
comprende una pluralidad de primeras unidades reactivas asociadas
con una pluralidad correspondiente de primeros oligonucleótidos, en
donde cada primer oligonucleótido define al menos una secuencia de
codón.
(b) suministrar una pluralidad de unidades de
transferencia que comprende pluralidad de segundas unidades
reactivas covalentemente unidas a una pluralidad correspondiente de
segundos oligonucleótidos, en donde los segundos oligonucleótidos
define cada uno una secuencia anti codón complementaria a la
secuencia de codón.
(c) reasociar los oligonucleótidos que tienen
codón complementario y secuencias anti codón para llevar la primera
y segunda unidades reactivas en proximidad reactiva; y
(d) inducir reacciones que forman unión
covalente entre las unidades reactivas sin la ayuda de una ribosoma
para producir una pluralidad de diferentes productos de
reacción.
46. El método de la reivindicación 45, que
comprende además la etapa de seleccionar un producto de reacción que
tiene una propiedad deseada.
47. El método de la reivindicación 46, en donde
al menos un producto de reacción se une a una molécula blanco.
48. El método de la reivindicación 47, en donde
la molécula blanco es una proteína.
49. El método de la reivindicación 47, en donde
la molécula blanco es inmovilizada sobre una soporte sólido.
50. El método de la reivindicación 45, en donde
las primeras unidades reactivas asociadas con cada molde son
diferentes.
51. El método de la reivindicación 1, en donde
al menos una de las unidades reactivas está unida adyacente a una
región terminal de su oligonucleótido correspondiente.
52. El método de la reivindicación 1, en donde
cada una de las unidades reactivas está unida adyacente a una región
terminal de su oligonucleótido correspondiente.
53. El método de la reivindicación 1, en donde
en el molde el codón esta dispuesto a al menos 10 bases alejado de
su unidad reactiva.
54. El método de la reivindicación 1, en donde
en el molde el codón esta dispuesto a al menos 20 bases alejado de
su unidad reactiva.
55. El método de la reivindicación 1, en donde
uno de los oligonucleótidos comprende además un par de secuencias
complementarias que se reasocian una con la otra para producir una
orquilla.
56. El método de la reivindicación 1, en donde
en el molde suministrado en la etapa (a) comprende además una
secuencia de oligonucleótido que identifica la primer unidad
reactiva.
57. El método de la reivindicación 1, en donde
la unidad reactiva de la unidad de transferencia esta ligada por vía
de un ligador al segundo oligonucleótido.
58. El método de la reivindicación 1, en donde
el producto de reacción permanece unido a un ligador al segundo
oligonucleótido de la unidad de transferencia.
59. El método de la reivindicación 57, en donde
la unidad de transferencia comprende un ligador que cuando se cliva
no deja átomos sobre el producto de reacción.
60. El método de la reivindicación 57, en donde
la unidad de transferencia comprende un ligador que cuando se cliva
deja un átomo sobre el producto de reacción.
61. El método de la reivindicación 57, en donde
el producto de reacción es automáticamente clivado del segundo
oligonucleótido durante o después de la formación del producto de la
reacción.
62. El método de la reivindicación 1, en donde
el molde es ADN o ARN.
63. El método de la reivindicación 1, en donde
al menos uno del molde y la unidad de transferencia es inmovilizada
sobre una superficie.
64. El método de la reivindicación 1, en donde
la primer unidad reactiva y la segunda unidad reactiva reaccionan
espontáneamente luego del reasocio de los oligonucleótidos.
65. El método de la reivindicación 1, en donde
la primer unidad reactiva y la segunda unidad reactiva reaccionan
luego de la exposición a un catalizador.
66. El método de la reivindicación 1, en donde
la primer unidad reactiva y la segunda unidad reactiva reaccionan en
un solvente acuoso para producir un producto de reacción.
67. El método de la reivindicación 1, en donde
la primer unidad reactiva y la segunda unidad reactiva reaccionan en
un solvente orgánico para producir un producto de reacción.
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