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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von unbekannten
PNA-Sequenzinformationen von PNA-Molekülen einer bestimmten PNA-Molekülspezies
und auf Verfahren für
das Auswählen,
Identifizieren, Akkumulieren und Amplifizieren von PNA-Molekülen oder
Herstellen von PNA-Molekülen,
die PNA/Zielmolekülkomplexe
bilden können.
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Hintergrund der Erfindung
und Stand der Technik
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Einsträngige Nukleinsäuren wie
RNA oder einsträngige
DNA sind in der Lage, eine dreidimensionale Struktur vergleichbar
mit dem Falten von Proteinen zu bilden, welche im wesentlichen durch
die Nukleinsäuresequenz
bestimmt wird. Diese dreidimensionale Strukturen beruhen hauptsächlich auf
intramolekularen Basenpaar-Wechselwirkungen und fördern die
Fähigkeit,
die Oberflächenstruktur
von Zielmolekülen
zu erkennen und an Zielmoleküle
zu binden, welche zu der dreidimensionalen Struktur der Nukleinsäure passende
Oberflächenstrukturen
aufweisen. Solche Nukleinsäuren,
welche in der Lage sind, wegen der dreidimensionalen Übereinstimmung
an Zielmoleküle
zu binden, werden Aptamere genannt. Die Zielmoleküle können von
irgendwelcher Art sein, wie kleine organische Moleküle (z. B.
Coffein), große
organische Moleküle
(z. B. synthetische Polymere), Peptide, Proteine, Enzyme, Aminosäuren, Saccharide,
Nukleotide, Oligo- und Polynukleo tide, Hormone, Polysaccharide oder
Oberflächenstrukturen
von Zellen oder Viren. Aptamere können sogar in der Lage sein,
zwischen Enantiomeren zu unterscheiden und die Anwesenheit oder
Abwesenheit von funktionellen Gruppen wie Methyl- oder Hydroxyl-Gruppen
zu erkennen. Entsprechend können
Aptamere insbesondere bei therapeutischen und/oder diagnostischen
Anwendungen verwendet werden (Jayasena, S. D., Aptamers: An emerging
class of molecules that rival antibodies in diagnostics, Clin. Chem.
1999, 45 (9), 1628–50;
Herman, T. und Patel, D. J., Adaptive recognition by nucleic acid
aptamers, Science 2000, 287 (5454), 820–5).
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Um
Aptamere zu identifizieren, die in der Lage sind, an ein definiertes
Zielmolekül
zu binden, ist es bekannt, Auswahlverfahren auf Basis einer Nukleinsäure-Bibliothek
anzuwenden, welche dann mit Zielmolekülen einer definierten Zielmolekülspezies
kontaktiert wird. Bindende Nukleinsäuren werden amplifiziert und akkumuliert,
bis die Konzentration der bindenden Nukleinsäuren ausreichend zum Klonen
und/oder Sequenzieren sind. Mit den erhaltenen Sequenzinformationen
können
die Aptamere für
die definierte Zielmolekülspezies
im Produktionsmaßstab
generiert und für
die vorgesehene Anwendung benutzt werden. Ein solches Verfahren
ist das sogenannte SELEX-Verfahren, beschrieben in den Veröffentlichungen
Tuerk, C., Gold, L., Systematic evolution of ligands by exponential
enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase., Science
1990, 249 (4968), 505–10
und Ellington, A. D. und Szostak, J. W., In vitro selection of RNA
molecules that bind spezific ligands, Nature 1990, 346 (6287), 818–22.
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Peptid-Nukleinsäuren (PNA)
sind synthetische Moleküle,
welche in der Lage sind, mit oligomeren oder polymeren Nukleinsäuren zu
hybridisieren. PNA-Moleküle ähneln derartigen
Nukleinsäuren,
unterscheiden sich aber in der Rückgratkette,
welche aus einer peptidischen achiralen Struktur auf Basis von N-(2-Aminoethyl)glycin-Monomeren
an Stelle von Ribosephosphat-Monomeren aufgebaut ist. Die natürlichen
Basen werden dadurch an die Rückgratkette
durch Carboxymethylen-Einheiten angehängt. Bemerkenswerterweise ist die
Rückgratkette
von PNA-Molekülen
elektrisch neutral, während
die Rückgratkette
von Nukleinsäuren
geladen ist. Weiterhin sind PNA-Moleküle beständig gegen Zersetzen durch
Nukleasen, Proteasen oder Peptidasen. Schließlich haben PNA-Moleküle eine
vergleichsweise geringe Toxizität
in biologischen Systemen gezeigt, falls überhaupt. Zusätzlich wird
Bezug genommen auf die Veröffentlichung
McMahon, B. M. et al., Pharmacokinetics and tissue distribution
of a peptide nucleic acid after intravenous administration, Antisense
Nucleic Acid Drug Dev. 2002, 12 (2), 65–70.
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Entsprechend
wäre es
vorteilhaft, PNA-Molekülspezies
zu erhalten und zu identifizieren, welche wie Aptamere funktionieren,
insbesondere für
therapeutische und/oder diagnostische Zwecke, oder welche bestimmte
andere Eigenschaften liefern einschließlich, aber nicht begrenzt
auf katalytische Funktionen, da PNA-Moleküle in biologischen Umgebungen
hochstabil sind und keine Ladung aufweisen, was eine Anzahl von
Zielmolekülen
für PNA-Aptamere
zugänglich
macht, welche aus Auswahlprozessen mit natürlichen Nukleinsäuren auf
Grund von unspezifischer Bindung auf Basis von elektrostatischen
Wechselwirkungen ent zogen werden. Eine Möglichkeit, solch eine PNA-Molekülspezies
mit Bindungseigenschaften oder anderen funktionellen Eigenschaften
zu erhalten, wäre
es, eine Bibliothek mit PNA-Molekülen einer Vielzahl von unterschiedlichen
PNA-Molekülspezies
in Kontakt mit einem gewünschten
Zielmolekül
zu bringen und die ungebundene PNA von den PNA/Zielmolekülkomplexen
zu trennen. Ein Hauptproblem dabei ist das Identifizieren von erhaltenen
PNA-Molekülen
mit den gewünschten
Eigenschaften, da die Menge der PNA für die Analyse durch Gewichtmessung
oder Strukturbestimmung mit Standardverfahren (z. B. Massenspektrometrie
oder -spektroskopie) nicht ausreichend ist. Daher muss die gewählte PNA-Molekülspezies
vor der Analyse amplifiziert werden. Weiterhin gibt es derzeit keine
Technologien, welche Mittel für
das Amplifizieren von PNA oder ihre Sequenzierung liefern. Daher
sind Verfahren wie SELEX für
PNA nicht anwendbar, somit beinhalten sie ein Amplifizieren der
Bibliothekskomponenten.
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Versuche,
PNA-Sequenzinformationen auf natürliche
Nukleinsäuren
zu übertragen,
sind von Schmidt, J. G., Information transfer from peptide nucleic
acids to RNA by template-directed synthesis, Nucleic Acids Res.
1997, 25 (23), 4797–802,
berichtet worden. Jedoch macht der geringe Wirkungsgrad dieser chemischen Kopplungsverfahren
diese Verfahren für
praktische Prozesse unbenutzbar. Im Ergebnis ist diese Technologie in
den letzten Jahren verfolgt worden, weil ein dringender Bedarf für ein Verfahren
besteht, das das Amplifizieren von PNA mit vernünftigem Wirkungsgrad innerhalb
einer akzeptablen Zeitdauer erlaubt. Weiterhin besteht in der Praxis
ein Bedarf für
einen Prozess zum Auswählen,
Amplifi zieren und Sequenzieren von PNA-Molekülen, welche wie Aptamere funktionieren
oder andere funktionelle Eigenschaften liefern.
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Wie
Nukleinsäuren
sequenziert werden, ist bekannt (Sanger F. et al., DNA-sequencing
with chain-terminating inhibitors, Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74,
5463–5467
und Hunkapiller, T. et al., Large-scale und automated DNA sequence
determination, Science 1991, 254, 59–67). Jedoch sind diese Prozesse
wegen der unterschiedlichen Rückgratkettenchemie
auf PNA nicht übertragbar.
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Die
Synthese von PNA ist an sich weiterhin bekannt durch Verwenden amplifizierter
DNA als Matrize (Rosenbaum, D. M. and Liu, D. R., Efficient and
sequence-specific DNA-templated polymerization of peptide nucleic
acid aldehydes, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125 (46), 13924–5) oder
durch Sequenzieren der erhaltenen Nukleinsäure mit den PNA-Sequenzinformationen
und darauf folgender chemischer Synthese von PNA durch Standardverfahren
(Christensen, L. et al., Solidphase synthesis of peptide nucleic
acids, J. Pept. Sci. 1995, 1 (3), 175–83 und Thomson, S. A. et al.,
Fmoc mediated synthesis of peptide nucleic acids, Tetrahedron 1995, 51,
6179–94).
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Die
US-6,399,364 offenbart ein
Verfahren, bei dem die Schritte des Hybridisierens von Proben mit
einem Target, des Trennens gebundener Proben von ungebundenen Proben
durch Koppeln des Targets an die feste Phase, des Freigebens gebundener
Proben von Targets und des Sequenzierens der Proben, um die Sequenz
des Targets zu bestimmen, durchgeführt werden. Die
US 2004/191812 A1 offenbart
die Verwendung einer Bibliothek von PNA- Molekülen zum Auswählen von
Aptameren in einem SELEX-Prozess.
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Technische Aufgabe der Erfindung
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Es
ist eine erste Aufgabe der Erfindung, Mittel zum Sequenzieren von
PNA-Oligomeren oder -Polymeren zu liefern.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Mittel zum Auswählen und
Bestimmen der Sequenz von PNA-Oligomeren oder -Polymeren zu liefern,
welche in der Lage sind, ein definiertes Zielmolekül zu binden.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Mittel zum Identifizieren,
Akkumulieren und/oder Erzeugen von PNA-Molekülen zu liefern, welche in der
Lage sind, an ein definiertes Zielmolekül zu binden.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Mittel zum wirksamen Trennen
von ungebundenen PNA-Molekülen von
PNA/Zielmolekülkomplexen
zu liefern.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, PNA-Moleküle zu liefern, welche mit hoher
Affinität
an definierte Zielmoleküle
binden.
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Zusammenfassung der Erfindung und bevorzugte
Ausführungsformen
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Zum
Lösen der
ersten erwähnten
Aufgabe liefert die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz
von PNA-Molekülen
einer bestimmten PNA-Molekülspezies,
wobei die PNA-Moleküle
mit einer oder mehreren verschiedenen Nukleinsäure-Molekülspezies mit Nukleinsäure-Molekülen mit
wenigstens einem Nukleotid kontaktiert werden, wobei die Nukleinsäure-Moleküle wenigstens
teilweise eine Nukleinsäure-Sequenz aufweisen,
die zu wenigstens einer Teilsequenz des PNA-Moleküls komplementär ist, wobei
die Nukleinsäure-Moleküle mit komplementären Sequenzen
sich an die PNA-Moleküle
unter Bildung von Nukleinsäure/PNA-Hybriden binden,
wobei die Nukleinsäure-Moleküle mit nicht-komplementären Sequenzen
von den Nukleinsäure/PNA-Hybriden
getrennt, wobei die Nukleinsäure-Moleküle mit nicht-komplementären Sequenzen optional
enzymatisch zersetzt werden, wobei danach die Nukleinsäure/PNA-Hybride
in einsträngige
Nukleinsäure-Moleküle und PNA-Moleküle zersetzt
werden, wobei die einsträngigen
Hybrid-Nukleinsäure-Moleküle einem
Sequenzierungsprozess unterworfen werden, was Hybrid-Sequenzinformationen über die
einsträngige Hybrid-Nukleinsäure-Sequenz
liefert, und wobei die Hybrid-Sequenzinformationen optional in die
komplementären
PNA-Sequenzinformationen umgesetzt werden.
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Die
Erfindung beruht auf der Tatsache, dass PNA mit hoher Affinität und Stringenz
mit Nukleinsäuren hybridisieren
kann, und dass hybridisierende Nukleinsäuren mit Standardprozessen
sequenziert werden können,
wodurch zur Sequenz der PNA komplementäre Sequenzinformationen erhalten
werden.
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Die
Sequenzlänge
der PNA kann wenigstens 5, vorzugsweise wenigstens 10, höchst vorzugsweise wenigstens
15 sein.
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Die
Sequenzlänge
der Nukleinsäure-Moleküle kann
wenigstens 2, vorzugsweise wenigstens 3, höchst vorzugsweise wenigstens
4 sein. Das Verfahren nach der Erfindung kann in einer Vielzahl
von Ausführungsformen
durchgeführt
werden, welche sich im wesentlichen in der Sequenzlänge der
mit dem unbekannten PNA-Molekül
kontaktierten Nukleinsäure-Moleküle unterscheiden.
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In
einer Ausführungsform
ist die Sequenzlänge
der Nukleinsäure-Moleküle wenigstens
gleich der Sequenzlänge
der PNA-Moleküle,
wobei die Bindung der komplementären
PNA-Moleküle
und Nukleinsäure-Moleküle unter
Hybridisierungsbedingungen ausgeführt wird, wodurch die Nukleinsäure/PNA-Hybride ohne Ligation
der an die PNA-Moleküle
gebundenen Nukleinsäure-Moleküle gebildet
werden. In dieser einfachsten Ausführungsform kann das Nukleinsäure-Molekül länger als
das PNA-Molekül
sein, wobei die Überhangsequenzen
z. B. für
das Amplifizieren der Nukleinsäure-Moleküle nach
dem Trennen, für
das Immobilisieren oder für das
Erfassen mit Standardroutinen benutzt werden können.
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Die
Erfindung kann weiterhin Mittel für die spezifische enzymatische
Zersetzung von nicht-hybridisierten
Oligonukleotiden aufweisen. Beispiele für die enzymatische Zersetzung
sind die Verwendung von Nukleasen (z. B. DNaseI), Verwendung von
einsträngigen
spezifischen Nukleasen (z. B. aber nicht beschränkt auf S1-Nuklease und Mungobohnen-Nuklease),
Verwendung von Restrikti ons-Enzymen entweder vom Typ II (z. B. XbaI,
HindIII etc.) oder vom Typ IIs (z. B. MlyI, BseRI etc.). In den
folgenden Beispielen werden weitere Einzelheiten einige der Zersetzungsprozesse
angegeben.
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In
der Praxis ist es vorteilhaft, erst eine Nukleinsäure-Bibliothek
zu erhalten oder zu bilden, wobei die Nukleinsäure-Moleküle oder partielle Sequenzen
davon randomisiert sind. Der randomisierte Teil sollte eine Länge entsprechend
der Sequenzlänge
der untersuchten PNA haben (diese ist entweder bekannt, da die PNA aus
einer PNA-Bibliothek
stammen kann, oder kann mit Standardverfahren für die Molekulargewichts-Messung
bestimmt werden).
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Sequenzlänge
der PNA-Moleküle
größer als
eine gesamte Sequenzlänge
oder eine randomisierte partielle Sequenzlänge der Nukleinsäure-Moleküle, vorzugsweise
um einen Faktor 2 oder mehr, höher
vorzugsweise um einen Faktor 3 oder mehr, höchst vorzugsweise um einen Faktor
4 oder mehr, wobei sich benachbart zueinander an die PNA-Moleküle bindende
Nukleinsäure-Moleküle chemisch
oder enzymatisch ligiert werden, vorzugsweise enzymatisch, wodurch
der Nukleinsäure/PNA-Hybrid gebildet
wird. In dieser Ausführungsform
kann die Gesamtsequenzlänge
der Nukleinsäure-Moleküle größer sein
als die Sequenzlänge
der PNA, vorausgesetzt die randomisierte Sequenzlänge ist
wie oben. Falls die randomisierte Sequenzlänge ein halb oder mehr als
ein halb mal der Sequenzlänge
der PNA-Moleküle
ist, dann binden typischerweise zwei unterschiedliche Nukleinsäure-Moleküle der randomisierten
Bibliothek benach bart zueinander. Dann muss die Ligation zwischen
diesen beiden Nukleinsäure-Molekülen durchgeführt werden. Die Überhänge können wiederum
für das
Amplifizieren, Immobilisieren, Erfassen etc. benutzt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Gesamtsequenzlänge
der in der randomisierten Nukleinsäure-Bibliothek enthaltenen
Nukleinsäure-Moleküle kleiner
sein als die Sequenzlänge
der PNA, wobei Gesamtsequenz randomisiert ist. Dann binden sich
zwei, drei, vier, fünf,
sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehr Nukleinsäure-Moleküle benachbart
zueinander an die PNA. Dann werden n – 1 Ligationsreaktionen (n
= Zahl der bindenden Nukleinsäure-Moleküle) zur
Herstellung des Hybrids ausgeführt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Gesamtlänge
der Nukleinsäure-Moleküle Eins,
d. h. die Nukleinsäure-Molekül-Bibliothek
weist eine Mischung aller Nukleinsäure-Monomere auf. Wieder müssen n – 1 Ligationsreaktionen
zur Herstellung des Hybrids ausgeführt werden.
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Die
Ligationsreaktionen können
mit irgendeinem bekannten Prozess ausgeführt werden, obwohl die enzymatische
Ligation bevorzugt wird. Beispiele für chemische Ligationsreaktionen
sind der Cyanbromid (CNBr)-Prozess und der 1-(3-(Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid
(EDC)-Prozess.
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Mit
Bezug auf die enzymatische Ligation wird bevorzugt, diese unter
Verwendung eines Ligationsenzyms ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus "DNA-Ligase
I, DNA-Ligase II, DNA-Ligase III, DNA-Ligase IV, DNA-Ligase V, T4-DNA-Ligase,
Taq-DNA-Ligase,
T4-RNA-Ligase, T4-RNA-Ligase II, ThermoPhage einsträngige DNA-Ligase,
Rma-DNA-Ligase, Tsc-DNA-Ligase, E.coli-DNA-Ligase, LdMNPV-DNA-Ligase, LigTK, Mth-Ligase,
PBCV-1-DNA-Ligase, Pfu-DNA-Ligase, Sealase, T4-ATP-Ligase, Vaccinia-Ligase,
Tfi-DNA-Ligase, Tth-DNA-Ligase, Band IV, DREL, gp24.1, 952, RM378
RNA-Ligase, TbMP52, Rc11p, DNA-Ligase D, XRCC4-Ligase, T7-DNA-Ligase, Bst-Ligase,
DraRn1", vorzugsweise
unter Verwendung von T4-RNA-Ligase, auszuführen. In den folgenden Beispielen
werden weitere Einzelheiten von einigen der Standardprozesse angegeben.
Standardprozesse für
enzymatische Ligationsreaktionen sind dem Fachmann gut bekannt und
müssen
hier nicht im Detail beschrieben werden.
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Der
grundlegende Prozess des Auswählens
und Identifizierens gemäß der Erfindung
beinhaltet die folgenden Schritte:
- a) in einer
Lösung
mit wenigstens einer Zielmolekülspezies
und PNA-Molekülen
einer Vielzahl von unterschiedlichen PNA-Molekülspezies bilden PNA-Moleküle einer
PNA-Spezies mit einer Bindungsaffinität zu dem Zielmolekül PNA/Zielmolekülkomplexe
mit den Zielmolekülen
der Zielspezies;
- b) das Trennen der Vielzahl von nicht-gebundenen PNA-Molekülspezies
von den PNA/Zielmolekülkomplexen
wird bewirkt;
- c) das Isolieren der PNA-Molekülspezies mit Bindungsaffinität zu dem
Zielmolekül
von dem PNA/Zielmolekülkomplex
und das Bestimmen der PNA-Sequenz wird bewirkt;
- d} Bestimmen der PNA-Sequenz.
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Falls
die Menge der ausgewählten
PNA-Moleküle
mit Bindungsaffinität
zu dem Zielmolekül
für das
Sequenzieren zu gering ist, werden die ausgewählten PNA-Moleküle vor dem
Sequenzieren amplifiziert.
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Falls
der Auswahlwirkungsgrad des Prozesses zu gering ist, um die Anwesenheit
von PNA-Molekülen, welche
nicht an das Zielmolekül
binden, ausreichend zu reduzieren, kann eine zusätzliche Auswahlrunde durchgeführt werden,
wie im folgenden beschrieben:
- a) in einer Lösung mit
wenigstens einer Zielmolekülspezies
und PNA-Molekülen
einer Vielzahl von unterschiedlichen PNA-Molekülspezies bilden PNA-Moleküle einer
PNA-Spezies mit einer Bindungsaffinität zu dem Zielmolekül PNA/Zielmolekülkomplexe
mit den Zielmoleküle
der Zielspezies;
- b) das Trennen der Vielzahl von nicht-gebundenen PNA-Molekülspezies
von den PNA/Zielmolekülkomplexen
wird bewirkt;
- c) das Isolieren der PNA-Molekülspezies mit Bindungsaffinität zu dem
Zielmolekül
von dem PNA/Zielmolekülkomplex;
- d) das Amplifizieren der Sequenzinformationen der PNA-Moleküle mit Bindungsaffinität zu dem
Zielmolekül wird
bewirkt;
- e) Kontaktieren amplifizierter PNA-Moleküle mit Bindungsaffinität zu den
Zielmolekülen
mit Ziel molekülen wie
in a) beschrieben, Trennen der PNA-Moleküle wie in b) beschrieben und
Isolieren der PNA-Molekülspezies
mit Bindungsaffinität
zu dem Zielmolekül
von dem PNA/Zielmolekülkomplex
wie in c) beschrieben;
- f) entweder Fortsetzen des Prozesses für weitere Auswahlrunden wie
in d) beschrieben oder Weitergehen zu Schritt g);
- g) Bestimmen der PNA-Sequenz.
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Die
Erfindung liefert weiterhin Mittel zum Identifizieren von PNA-Molekülen mit
bestimmten Eigenschaften wie Bindungsaffinitäten oder katalytischen Eigenschaften
entweder nach einem einzelnen Auswahlschritt und folgendem Identifizieren
von ausgewählten
PNA-Molekülen,
wobei die Sequenzinformationen von der PNA auf Nukleinsäuren, RNA
oder DNA übertragen
werden. Dies liefert die Möglichkeit
des Amplifizierens der Sequenzinformationen der PNA durch Amplifizieren
der erhaltenen Nukleinsäure
mit Standardverfahren (Mullis, K. B. und Faloona, F. A., Specific
synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, Methods
Enzymol. 1987, 155, 335–50)
und ihr darauf folgendes Sequenzieren, während die erhaltene Sequenz
in komplementäre
PNA-Sequenzinformationen umgesetzt werden kann. Diese Informationen
können für eine chemische
De-Novo-Synthese von PNA-Molekülen
benutzt werden, welche in der Lage sind, ein definiertes Zielmolekül zu binden
oder weitere Eigenschaften zu liefern.
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Alternativ
kann die amplifizierte DNA für
die Synthese von PNA-Molekülen
in einer matrizenab hängigen
Weise benutzt werden, welche einem Amplifizieren von PNA-Molekülen für eine darauf
folgende Auswahlrunde gleicht.
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Die
Erfindung kann weiterhin Mittel für das Trennen von Nukleinsäure/PNA-Hybriden
von nicht-hybridisierten
Nukleinsäuren
in der Reihenfolge der Größe von wenigstens
10E4, vorzugsweise 10E6, höher
vorzugsweise 10E8, höchst
vorzugsweise 10E10 durch affinitätsbezogene
Verfahren unter Verwendung von entweder mit der PNA oder der Nukleinsäure verbundenen
Affinitätstags,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend z. B. aus "Biotin-Streptavidin-System, Strep-Tag,
Digoxigenin, His-Tag etc." und
einer Matrix ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus z. B. "Agarose, Sepharose, Magnetbeads etc.", welche den entsprechenden
Bindungspartner für
den Affinitäts-Tag tragen, umfassen,
wobei diese Verfahren ebenso die Verwendung von spezifisch spaltbaren
funktionellen Gruppen in den Linkerketten zu den Affinitäts-Tags
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus z. B. "reduktiven, spaltbaren Disulfidgruppen,
photolabilen Gruppen, pH-sensitiven Gruppen etc." für
die spezifische Eluierung von Nukleinsäure/PNA-Hybriden aus der Matrix
beinhalten.
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Die
Erfindung kann weiterhin Mittel zum Trennen von Nukleinsäure/PNA-Hybriden
von nicht-hybridisierten Nukleinsäuren in der Reihenfolge der
Größe von wenigstens
10E4, vorzugsweise 10E6, höher
vorzugsweise 10E8, höchst
vorzugsweise 10E10 unter Verwendung von chromatographischen oder
elektrophoretischen Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus "HPLC, Ionen-Chromatographie,
Kapillar-Elektrophorese, träger freie
Elektrophorese, Kapillar-Gel-Elektrophorese, mizelläre elektrokinetische
Kapillar-Chromatographie, Kapillar-Elektrochromatographie, Nicht-Gel-Siebung,
Affinitäts-Kapillar-Elektrophorese, Kapillar-Ionen-Elektrophorese,
HPLC, LC, Ionen-Chromatographie" umfassen.
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Die
Trennverfahren und auch die Zersetzungs-Verfahren können mit
allen obenerwähnten
Verfahren zum Erzeugen der PNA-komplementären DNA kombiniert werden.
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Es
ist vorteilhaft, falls die einsträngigen Hybrid-Nukleinsäure-Moleküle, vorzugsweise
mit PCR, vor dem Sequenzierungsprozess amplifiziert werden.
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Die
Erfindung umfasst weiterhin Mittel zum Amplifizieren von generierter
komplementärer
DNA durch eine Vielzahl von Verfahren betreffend unterschiedliche
Methoden zur Erzeugung von Primer-Hybridisierungsstellen entweder
durch Ligation von terminalen Linker-Oligonukleotiden am 5'- und/oder 3'-Ende der generierten
komplementären
Nukleinsäuren,
wobei Verfahren zum Reduzieren des Hintergrunds durch direkt ligierte Linker-Oligonukleotide
unter Verwendung von Restriktions-Endonukleasen beteiligt sind,
oder durch Verwendung von Nukleinsäure/PNA-Chimären, wobei
die Nukleinsäuren
in den Chimären
durch terminale Nukleotidyl-Transferasen elongiert werden, um Primer-Hybridisierungsstellen
zu liefern, oder durch Verwendung von Nukleinsäure/PNA-Chimären, wobei
die Nukleinsäuren
in den Chimären
Haarnadelschleifen bilden, um Start-Oligonukleotide zu liefern, die durch
Nukleinsäure-Fragmente
und Ligation elongiert sind, wo bei die Haarnadelschleifen durch
Restriktions-Endonukleasen
oder durch einsträngige
spezifische Nukleasen aus der Gruppe bestehend aus "S1-Nuklease, Mungobohnen-Nuklease
etc." geschnitten
werden können.
In den folgenden Beispielen werden weitere Einzelheiten einiger
der erwähnten
Prozesse angegeben.
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Die
Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zum Trennen ungebundener
PNA-Moleküle
aus einer Lösung
mit wenigstens einer Zielmolekülspezies
und PNA-Molekülen
einer Vielzahl von unterschiedlichen PNA-Molekülspezies, wobei die PNA-Moleküle einer
PNA-Molekülspezies
mit einer Bindungsaffinität
zu der Zielmolekülspezies
PNA/Zielmolekülkomplexe
mit den Zielmolekülen
dieser Zielmolekülspezies
bilden, wobei die Lösung
eine ionische Verbindung aufweist, die zum Fördern wenigstens einer partiellen
elektrischen Ladung an entweder ungebundenen PNA-Molekülen oder
PNA/Zielmolekülkomplexen
wirksam ist, wobei die Lösung
einem elektrophoretischen Trennverfahren unter Anwendung eines elektrisch
Felds auf die Lösung
unterworfen wird, und wobei die PNA/Zielmolekülkomplexe oder die ungebundenen
PNA-Moleküle
mit einer durch die ionische Verbindung geförderten, partiellen elektrischen
Ladung eine elektrische Migrationskomponente einer Translation im
elektrischen Feld erhalten, wodurch sie von Komponenten in der Lösung mit
einem unterschiedlichen Ladungs-/Größenverhältnis oder keiner elektrischen
Ladung abgetrennt werden.
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Dieser
Aspekt beruht auf der Erkenntnis, dass ionische Verbindungen in
der Lösung
mit ungebundenen PNA-Molekülen
und PNA/Zielmolekülkomplexen in
der Lage sind, mit einer von beiden Gruppen in Beziehung zu treten
und nur dadurch eine elektrische Ladung auf die betreffende Gruppe
zu übertragen.
Typischerweise fördert
die ionische Verbindung wenigstens eine partielle elektrische Ladung
an den PNA/Zielmolekülkomplexen.
Dies erlaubt Trennverfahren aufgrund der Anwendung eines elektrischen
Felds, worauf normalerweise PNA-Moleküle wegen der neutralen Rückgratkette
im Gegensatz zu Nukleinsäuren
nicht reagieren.
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Die
ionische Verbindung kann insbesondere ein ionisches Detergens sein,
vorzugsweise ein ionisches Detergens ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus "Benzethoniumchlorid,
Benzethoniumhydroxid, Cetylpyridiniumbromid, Cetylpyridiniumchlorid,
Cetyltrimethylammoniumbromid, Cetyltrimethylammoniumchlorid, (2-Hydroxyethyl)trimethylammonium-Salze,
Denatoniumbenzoate, Denatonium-Saccharide, Dodecylsulfate (vorzugsweise
Natriumdodecylsulfat (SDS), aber auch Lithiumdodecylsulfat und Ammoniumdodecylsulfat), Hexadecyltrimethylammoniumbromid
(CTAB), Hexadecyltrimethylammoniumchlorid (CTAC), Lauroylsarcosin, N,N-Dimethyldecylamin-N-oxid
(DDAO), N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid (LDAO), Natrium-bis-(2-ethylhexyl)-sulfosuccinat,
Butansulfonate, Chenodeoxycholate, Cholate, Decanesulfonate, Deoxycholate
(DOC), Natriumdocusat, Dodecanesulfonate, Glycocholate, Glycodeoxycholate,
Heptansulfonate, Hexadecansulfonate, Octansulfonate, Octylsulfate,
Propansulfonate, Taurochenodeoxycholate, Taurocholate, Taurodehydrocholate, Taurodeoxycholate,
Taurolithocholate, Tauroursodeoxycholate, Tetradecylsulfate, tert-Octyl-phenylpropan-sulfonsäure (TOPPS),
Triton X-100, 3-(Cyclohexylamino)-1-propan-sulfonsäure (CAPS), 4'-Amino-7-benzamido-taurocholsäure (BATC)" und vorzugsweise
Natriumdodecylsulfat (SDS) oder ein mono-, bi- oder tri-Nukleotid
aus der Gruppe bestehend aus z. B. aber nicht beschränkt auf "Adenosin, Cytosin,
Guanin, Thymin, Uracil, Desoxyadenosin, Desoxycytosin, Desoxyguanin,
Desoxythymin" oder
Oligonukleotide bzw. Desoxyoligonukleotide mit einer Länge von
fünf, vorzugsweise
vier, höher
vorzugsweise drei, höchst
vorzugsweise zwei Monomeren.
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Das
Trennverfahren kann ausgewählt
werden aus der Gruppe bestehend aus "Kapillar-Elektrophorese, Kapillar-Gel-Elektrophorese,
mizelläre
elektrokinetische Kapillar-Chromatographie, Kapillar-Elektrochromatographie,
Nicht-Gel-Siebung, Affinitäts-Kapillar-Elektrophorese,
Kapillar-Ionen-Elektrophorese, HPLC, LC, Ionen-Chromatographie", bevorzugt ist die
Kapillar-Elektrophorese.
Zur Übersicht
von elektrophoretischen Trennverfahren und Einzelheiten solcher
Verfahren, welche im Stand der Technik üblich sind, wird Bezug genommen
auf z. B. Righetti, P. G., Electrophoresis: the march of pennies
the march of dimers, J. Chromatogr. A 2005, 1079 (1–2), 24–40.
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Die
Konzentration der ionischen Verbindung, insbesondere ein Detergens,
kann unterhalb der kritischen mizellären Konzentration (CMC) liegen,
vorzugsweise unterhalb 8 mmol/l, höher vorzugsweise unterhalb
5 mmol/l, noch höher
vorzugsweise im Bereich von 0,01–3 mmol/l, höchst vorzugsweise
im Bereich von 0,1–1
mmol/l.
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Definitionen
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Eine
Zielmolekülspezies
kann irgendeine Spezies sein und ist nicht beschränkt auf
die Gruppe bestehend aus "kleinen
organischen Molekülen,
Peptiden, Proteinen, Enzymen, Aminosäuren, Hormonen, Polysacchariden
und Oberflächenstrukturen
von Zellen oder Viren".
Insbesondere kann die Zielmolekülspezies
auch nicht-biologisch sein und irgendeine molekulare Struktur aufweisen,
für die
ein Bedarf zur Erfassung besteht, z. B. Explosionsstoffe, umweltgefährdende
Substanzen und dergleichen.
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Ein
PNA-Molekül
besteht aus einer Rückgratkette
mit wenigstens zwei Monomeren, wobei jedes der Monomere eine Nukleotid-Base
Adenin, Cytosin, Guanin, Uracil oder Thymin trägt. Ein PNA-Molekül ist in
der Lage, mit einer Oligo- oder Polynukleinsäure mit natürlicher Struktur zu hybridisieren.
Die Monomere in einem PNA-Molekül
können
unterschiedlich oder identisch sein. Vorzugsweise sind die Monomere
identisch und sind N-(2-Aminoethyl)glycin, wobei die Nukleotid-Basen über Carboxymethylen-Einheiten
an die Rückgratkette
angehängt
sind.
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Ungebundene
PNA-Moleküle
sind Moleküle,
welche nicht an ein Zielmolekül
gebunden sind. Vorzugsweise sind ungebundene PNA-Moleküle auch
nicht an eine andere Verbindung in der Lösung gebunden.
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Eine
Molekülspezies
ist definiert durch eine singuläre
spezifische chemische Struktur. Alle Moleküle einer Molekülspezies
haben eine identische spezifische chemische Struktur. Vorzugs weise
haben alle Moleküle
einer Molekülspezies
weiterhin die gleiche dreidimensionale Struktur.
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Die
Moleküle
von unterschiedlichen Molekülspezies
unterscheiden sich voneinander in der dreidimensionalen Struktur
und optional in der chemischen Struktur.
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Ein
PNA-Molekül
bindet sich an ein Zielmolekül
mit einer Bindungsaffinität,
falls die dreidimensionale Struktur des PNA-Moleküls zur dreidimensionalen
Struktur des Zielmoleküls
oder zu einer partiellen Struktur davon passt. Typische Affinitätswerte
sind besser als 10 μM.
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Ein
PNA/Zielmolekülkomplex
beinhaltet typischerweise keine kovalenten Bindungen, sondern vielmehr
Wasserstoff-Bindungen, elektrostatische, hydrophobische und/oder
Van-der-Waals-Wechselwirkungen.
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Die
Sequenzlänge
eines PNA-Moleküls
ist definiert als die Zahl der im Molekül vorhandenen Rückgrat-Monomere.
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Eine
Akkumulation einer Molekülspezies
ist die Zunahme der Konzentration der Molekülspezies in einer Lösung und/oder
die Zunahme der Anzahl der Moleküle
der Spezies in einer Probe.
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Eine
PNA-Bibliothek umfasst PNA-Moleküle
einer Vielzahl von unterschiedlichen PNA-Molekülspezies. Die PNA-Molekülspezies
unterscheiden sich typischerweise nur in der Sequenz der an die
Rückgratkette angehängten Nukleotid-Basen.
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Unterschiedliche
Nukleinsäurespezies
unterscheiden sich in der Sequenz der an die Rückgratkette angehängten Nukleotid-Basen.
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Eine
Hybridisierung zwischen PNA-Molekülen und Nukleinsäure-Molekülen findet
durch Wasserstoffbindung zwischen Paaren von an der Nukleinsäure und
der PNA vorhandenen Nukleotid-Basen statt, falls die Sequenzen der
Nukleotid-Basen der PNA und der Nukleinsäure zueinander passen. Vorzugsweise
ist die Übereinstimmung
vollständig
und eine 100%-Übereinstimmung
mit der kürzeren
von beiden, falls zutreffend.
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Das
Amplifizieren von Nukleinsäuren
umfasst die Zunahme der Anzahl von identischen Nukleinsäuren in
einer Probe, vorzugsweise durch dem Fachmann bekannte PCR-Verfahren.
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Im
folgenden werden die Erfindung und Komponenten davon durch nicht-einschränkende Beispiele beschrieben.
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Beispiel 1: Trennen von PNA und PNA/Zielmolekülkomplexen
durch Kapillar-Elektrophorese
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Das
Trennen von PNA und einem Komplex von Dihydrofolatreduktase (DHFR)
mit daran gebundener PNA wird unter Verwendung einer kovalent mit
Polyacrylamid beschichteten Kapillare mit einem Innendurchmesser
von 75 μm,
einer Gesamtlänge
von 70 cm und einer effektiven Länge
(Injektionsstelle bis Detektor) von 51 cm durchgeführt. Der
Trenn-Puffer enthält
20 mmol/l Dinatriumhydrogenphosphat, eingestellt auf pH 7,3, und wenigstens
0,2 mmol/l Natriumdodecylsulfat (SDS). Die angelegte Spannung ist
430 V/cm (Anode bis Detektorseite). Die Kapillare ist durch Luftströmung auf
28°C temperiert.
Die Proben werden 5 s lang hydrodynamisch injiziert und durch Absorption
bei 200 nm erfasst.
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1A zeigt das Trennen einer Mischung von
10 μmol/l
randomisierter 18mer-PNA und 4 mg/ml DHFR in Trenn-Puffer mit entweder
0,6 mmol/l oder 0,2 mmol/l SDS. In diesem Experiment ist nicht auf
Anwesenheit von DHFR/PNA-Komplexen getestet worden, aber die Experiments
sind dennoch repräsentativ
für das Trennen
von ungebundener PNA aus Komplexen, da nicht komplex gebundene DHFR
und komplex gebundene DHFR sich im wesentlichen identisch verhalten.
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Unter
Verwendung von 0,6 mmol/l SDS konnte DHFR nach 8,8 min erfasst werden,
unter Verwendung von 0,2/l konnte DHFR nach 9,9 min erfasst werden.
Höhere
Konzentrationen von SDS (jedoch unterhalb der kritischen mizellären Konzentration)
hatten keinen wesentlichen Effekt auf die Migrationsgeschwindigkeit.
PNA konnte bei diesen Trennbedingungen überhaupt nicht erfasst werden. 1B zeigt die Überprüfung von langsamer bzw. keiner
Migration von PNA. Dies wurde durch Injizieren von PNA allein durchgeführt, während in einem
Zeitraum von 20 min bei den oben erwähnten Trennbedingungen kein
Signal erfasst werden konnte. Die injizierte Menge von PNA war ausreichend,
um ein Spannungssignal von 0,2 Volt zu erzeugen, was durch hydrodynamisches
Drücken
der PNA durch die Kapillare (nicht gezeigt) überprüft wurde.
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Beispiel 2: Trennen von PNA und PNA/Zielmolekülkomplexen
durch HPLC
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Das
Trennen von PNA und DHFR/PNA-Komplexen durch HPLC wird unter Verwendung
einer C18-Umkehrphasen-Matrix in einer Säule mit einem Innendurchmesser
of 1 mm und einer Länge
of 10 cm (Teilchendurchmesser = 2 μm) durchgeführt. Die mobilen Phasen sind
0,1 mol/l Triethylammoniumacetat (pH 7) und Acetonitril bei einem
Durchfluss von 40 μl/min.
Die Substanzen werden durch Absorption bei 254 nm und 280 nm erfasst.
Das injizierte Volumen ist 5 μl.
Das Trennen wird isocratisch mit 10% Acetonitril gestartet. Unter
diesen Trennbedingungen werden Proteinfraktionen in einem Zeitraum
von 2 bis 6 min nach Probeninjektion erfasst. Jedoch bleibt die
freie PNA auf der Säule
und kann zusammen mit allen Probenkomponenten durch Erhöhen der
Acetonitril-Konzentration in der mobilen Phase in einem einzigen
Schritt zu 90% eluiert und entnommen werden.
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Beispiel 3: Synthese eines PNA-Oligomers
oder -Polymers und Bildung einer PNA-Bibliothek
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Die
Synthese einer 18mer-PNA mit der Sequenz CCG ATT AAC GCT TGT ACC
C wird unter Verwendung von den in der Druckschrift Thomson, S.
A. et al., Fmoc mediated synthesis of peptide nucleic acids, Tetrahedron
1995, 51, 6179–94
beschriebenen Syntheseprozessen durchgeführt. Auf die gleiche Weise
werden unterschiedliche 18mer-PNAs,
die sich nur in der Nukleotid-Basensequenz unterscheiden, synthetisiert.
Die unterschiedli chen 18mer-PNAs werden dann in einer die PNA-Bibliothek bildenden
Lösung
zusammengebracht.
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Beispiel 4: Inkubation der PNA-Bibliothek
mit einem Zielmolekül
und Trennen der Komplexe von ungebundener PNA
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Eine
Lösung
mit der PNA-Bibliothek gemäß Beispiel
3 wird mit DHFR unter Bedingungen kontaktiert, die vorzugsweise ähnlich zu
denen bei späteren
Anwendungen für
die ausgewählten
PNA-Moleküle sind
und die vorwiegend ähnlich
zu denen wie bei üblichen
SELEX-Experimenten sind, wie beschrieben in den Druckschriften Tuerk,
C., Gold, L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:
RNA ligands to bacteriophage T4 DNA Polymerase, Science 1990, 249
(4968), 505–10
und Ellington, A. D. und Szostak, J. W., In vitro selection of RNA
molecules that bind specific ligands, Nature 1990, 346 (6287), 818–22. Dann
wird die Lösung
einer Kapillar-Elektrophorese
oder HPLC als Trennprozess gemäß Beispiel
1 oder 2 unterworfen. Danach werden die isolierten Komplexe in DHFR
und PNA entweder durch Inkubation bei hoher Temperatur, durch pH-Verschiebung, kompetitiv
(durch Zugabe bestehender Liganden) oder alternativ durch Zersetzung von
DHFR unter Verwendung von Proteasen oder Proteinasen (z. B. Proteinase
K) zersetzt.
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Beispiel 5: Hybridisieren von PNA mit
einer Oligonukleotid-Bibliothek und komplementäres Nukleinsäure-Amplifizieren
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Das
Isolieren einer komplementären
einsträngigen
DNA aus einer Oligonukleotid-Bibliothek wurde durch Hybridisieren
von passenden Oligonukleotiden zu einer biotinylierten 18mer-PNA
durchgeführt.
12 nmol der Oligonukleotid-Bibliothek (5'GAA TTC CAG ATC TCT NNN NNN NNN NNN
NNN NNN GAT ATC AGG ATC CCA3')
wurden in 120 μl
Puffer (10 mmol/l Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,5) gelöst. Unterschiedliche
Mengen von PNA (wenigstens 105 Moleküle) wurden
zur Reaktionslösung
zugefügt.
Die Mischung wurde auf 95°C erhitzt,
und die Röhren
wurden in einen mit heißem
Wasser (92°C)
gefüllten,
thermisch isolierten Behälter
(Dewar) gebracht. Der Behälter
wurde zusätzlich
mit Styropor isoliert und während
eines Zeitraums von circa fünf Tagen
auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die erzeugten PNA/DNA-Hybride wurden nacheinander durch unterschiedliche
Verfahren isoliert, und die DNA wurde amplifiziert. 2 zeigt
das Prinzip der PNA-Identifizierung durch Hybridisieren zu komplementärer einsträngiger DNA
aus einer Bibliothek mit 18 randomisierten Nukleotid-Bereichen (grau)
und bekannten Primerbereichen (schraffiert). Nach dem Hybridisieren
der PNA (schwarz) zu passenden Sequenzen (weiß) muss die restliche einsträngige DNA
entfernt werden. Das Amplifizieren von PNA-komplementärer PNA
wird durch PCR unter Verwendung der bekannten Primerbereiche (schraffiert)
durchgeführt.
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Isolieren
durch PNA/DNA-Hybride durch Immobilisieren auf einer festen Phase
und anschließendes Waschen:
20 μl einer
Agarose-Matrix-Suspension mit immobilisiertem Streptavidin wurden
der Hybridisierlösung
mit der Oligonukleotid-Bibliothek und den PNA/DNA-Hybriden zugefügt. Die
Mischung wurde 6 bis 15 h lang geschüttelt, und die Suspension wurde
zu einer Mikrosäule
(oder alternativ in eine Filter-Pipettenspitze) übertragen. Die nicht hybridisierte
DNA wurde durch einen Durchfluss von wenigstens 100 Säulenvolumina Waschpuffer
(0,3 mol/l NaCl, 60 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0), 2 mmol/l EDTA, 1%
(Gew./Vol.) SDS) durch die Säule
entfernt. Danach wurde die Matrix mit 1 ml 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,5) gewaschen.
Die PNA/DNA-Hybride wurden von der Matrix durch Reduzieren der Disulfidbindung
im Biotinylisierungs-Linker auf der PNA mit 10 mmol/l Tris-HCl (pH
8,5), 20 mmol/l DTT 2 h lang bei Raumtemperatur spezifisch abgespalten.
Die Lösung kann
zum Amplifizieren der DNA durch Gelfiltrierung (Sephadex G-25) angefertigt
werden.
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Isolieren
durch PNA/DNA-Hybride durch Immobilisieren auf einer festen Phase
und anschließendes Entfernen
von freier einsträngiger
DNA in einem elektrischen Feld: 20 μl einer Agarose-Matrix-Suspension mit immobilisiertem
Streptavidin (mit Streptavidin beschichtete magnetische Beads können alternativ
benutzt werden) wurden der Hybridisierungs-Lösung mit der Oligonukleotid-Bibliothek
und den PNA/DNA-Hybriden zugefügt.
Die Mischung wurde 6 bis 15 h lang geschüttelt, und die Suspension wurde
zu einem mit Puffer (TBE) gefüllten
Rohr mit 1% fester Agarose im Bodenteil übertragen. Die Agarose-Matrix
mit gebundenen PNA/DNA-Hybriden wird in das Rohr zum Absetzen auf
der Agarose übertragen.
Das Rohr mit einem Innendurchmesser von 5 mm wurde zwischen zwei
Pufferbehältern
fixiert, und ein elektrisches Feld mit einer Spannungsdifferenz
von 100 V wurde an das Rohr 1 bis 5 Stunden lang angelegt, was zu
einer Migration der freien DNA in die Agarose und dann in den Anoden-Pufferbehälter führt. Danach
wurde die Matrix mit 1 ml 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,5) gewaschen.
Die PNA/DNA-Hybride
wurden von der Matrix durch Reduzieren der Disulfidbindung im Biotinylisierungs-Linker
auf der PNA mit 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,5), 20 mmol/l DTT 2 h lang
bei Raumtemperatur spezifisch abgespalten. Die Lösung kann zum Amplifizieren
der DNA durch Gelfiltrierung (Sephadex G-25) angefertigt werden. Dieses Trennverfahren
kann auch zusätzlich
zu vorherigen Waschvorgängen
angewandt werden. 3 zeigt eine schematische Darstellung
der Vorrichtung zum Entfernen von nicht-hybridisierter einsträngiger DNA
unter Verwendung eines elektrischen Felds. Auf Agarose-Matrix immobilisierte
PNA/DNA-Hybride wurden von freier einsträngiger DNA mit einer angelegten
Spannung getrennt, was zur Migration von einsträngiger DNA in die feste Agarose
in der Säule
führt und
die Diffusion von einsträngiger
DNA zurück
in den oberen Pufferbehälter
verhindert.
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Spezifische
enzymatische Zersetzung von nicht-bybridisierter einsträngiger DNA
mit S1-Nuklease:
Die spezifische enzymatische Zersetzung von nicht-bybridisierter
einsträngiger
DNA mit S1-Nuklease wurde in 10 mmol/l Tris-Essigsäure (pH
8,3), 50 mmol/l Kaliumacetat, 5 mmol/l Magnesiumacetat, 1 μg/ml BSA,
0,01 Vol.-% Tween 20 durchgeführt.
Die Muster enthielten PNA (N-CCG
ATT AAC GCT TGC ACC-C) und die Oligonukleotide Pos2(3)D2-1rev (5'ATT TAT GAG GAG TCC
GGT GCA AGC GTT AAT CGG GAT ATC AGG ATC CCA3'), Pos3(3)rev (5'GGA CTC CTC ATA AAT3'), Pos4 (5'TGG GAT CCT GAT ATC3') in Konzentrationen von jeweils 1 μmol/l. Die
Reaktionen wurden 2 min lang bei 90°C inkubiert und danach langsam
auf Raumtemperatur abgekühlt.
Nach Zugabe von S1-Nuklease
(50 oder 100 Einheiten) wurden die Proben 3 h lang bei 20°C inkubiert.
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4 zeigt
das Prinzip der spezifischen Zersetzung von nicht-hybridisierter
einsträngiger
DNA durch einsträngige
spezifische Nukleasen. Die PNA (ausgefüllt) schützt den mittleren Teil (leer),
und die komplementären
Oligonukleotide (kreuzweise schraffiert) schützen die Primerbereiche (schraffiert)
der einsträngigen
DNA gegen Hydrolyse durch einsträngige
spezifische Nukleasen (A). Falls keine übereinstimmende PNA vorhanden
ist, kann der mittlere Bereich abgebaut (B) werden.
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5 zeigt
eine experimentelle Auswertung der spezifischen Zersetzung von einsträngiger DNA
mit S1-Nuklease. Die Proben mit einsträngiger DNA und äquimolaren
Mengen von PNA und Schutz-Oligonukleotiden
für die
Primerbereiche die DNA ist gegen Zersetzung mit 50 bzw. 100 Einheiten
S1-Nuklease (Bahnen 1 und 3) geschützt. Ohne PNA werden die einsträngigen Segmente
hydrolysiert (Bahnen 2 und 4). Nur die zweisträngigen Primerbereiche bleiben
intakt (Bahn 1: mit PNA, 50 Einheiten S1-Nuklease; Bahn 2: ohne
PNA, 50 Einheiten S1-Nuklease; Bahn 3: mit PNA, 100 Einheiten S1-Nuklease;
Bahn 4: ohne PNA, 100 Einheiten S1-Nuklease; Bahn 5: ohne PNA, keine
Nuklease; M: DNA-Standard, pUC19/MspI.) Das Trennen der DNA wurde
in 15% Polyacrylamid (29:1, Acrylamid:Bisacrylamid) unter nativen
Bedingungen durchgeführt.
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Spezifische
enzymatische Zersetzung von nicht-hybridisierter einsträngiger DNA
mit Mungobohnen-Nuklease: Die spezifische Zersetzung von nicht-hybridisierter
einsträngiger
DNA mit Mungobohnen-Nuklease wurde in 10 mmol/l Tris-Essigsäure (pH
8,3), 50 mmol/l Kaliumacetat, 5 mmol/l Magnesiumacetat, 1 μg/ml BSA,
0,01 Vol.-% Tween 20 (Zn2+ im Enzym-Speicherpuffer
vorhanden) durchgeführt.
Die Proben enthielten PNA (N-CCG ATT AAC GCT TGC ACC-C) und die
Oligonukleotide Pos2(5)D2-1rev (5'ATT CTA TCA CGA GTC GGT GCA AGC GTT
AAT CGG GAT ATG AGG ATC CCA3'),
Pos3(5)rev (5'GAC
TCG TGA TAG AAT3'),
Pos4(5) (5'TGG GAT
CCT CAT ATC3') in
Konzentrationen von jeweils 1 μmol/l.
Die Reaktionen wurden 2 min lang bei 90°C inkubiert and langsam auf
Raumtemperatur abgekühlt.
Nach Zugabe von Mungobohnen-Nuklease (20 oder 10 Einheiten) wurden
die Proben 15 h lang bei 20°C
inkubiert.
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6 zeigt
eine experimentelle Auswertung der spezifischen Zersetzung von einsträngiger DNA
mit Mungobohnen-Nuklease. Die Proben mit einsträngiger DNA und äquimolare
Mengen von PNA werden gegen Zersetzung mit 20 bzw. 10 Einheiten
Mungobohnen-Nuklease (mit + bezeichnete Bahnen) geschützt. Ohne PNA
werden die einsträngigen
Segmente hydrolysiert (mit – bezeichnete
Bahnen). (+: mit PNA; –:
ohne PNA; M: DNA-Standard, pUC19/MspI) Das Trennen der DNA wurde
in 15% Polyacrylamid (29:1, Acrylamid:Bisacrylamid) unter nativen
Bedingungen durchgeführt.
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Spezifische
enzymatische Zersetzung von nicht-hybridisierter einsträngiger DNA
mit Restriktions-Enzym Typ II: Die einsträngige DNA enthält eine
Restriktionsstelle für
ein Restriktions-En zym Typ II in den Primerbereichen (7;
schraffiert) der einsträngigen
DNA-Bibliothek. Somit ist das Restriktions-Enzym nur in der Lage,
zweisträngige
DNA zu hydrolysieren, die Restriktion kann nur durchgeführt werden,
nachdem der Rückwärts-Primer
(kreuzweise schraffiert) durch eine DNA-Polymerase (schwarzes Ellipsoid)
(A) elongiert worden ist. Die Reaktion wird in einem Primer-Elongationsmix
vor den Temperaturzyklen für
das Amplifizieren durchgeführt.
Wenn die Primer-Elongation durch eine hybridisierte PNA (schwarz
ausgefüllt)
im mittleren Bereich (leer) blockiert wird, bleibt die DNA an der
Restriktionsstelle einsträngig,
und keine Hydrolysierung findet statt (B).
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Spezifische
enzymatische Zersetzung von nicht-hybridisierter einsträngiger DNA
mit Restriktions-Enzym Typ IIs: Die Sequenz der einsträngigen DNA
enthält
eine Erkennungsstelle für
ein Restriktions-Enzym Typ IIs in den Primerbereichen der einsträngigen DNA-Bibliothek
(8; schraffiert). Die Restriktion der DNA findet in
der Hybridisierungsstelle für
die PNA (leer) statt und kann durch eine hybridisierte PNA (schwarz
ausgefüllt) blockiert
werden. Die Reaktion wird in einem Primer-Elongationsmix vor den
Temperaturzyklen durchgeführt. Polymerasen
(schwarzes Ellipsoid) elongieren den Primer (kreuzweise schraffiert),
wodurch zweisträngige DNA
erzeugt wird, welche durch Restriktions-Enzyme an der Erkennungsstelle
(A) geschnitten werden kann. Die PNA (B; schwarz ausgefüllt) blockiert
die Primer-Elongation durch Polymerasen, die DNA bleibt einsträngig und
wird vom Enzym (B) nicht hydrolysiert. Die Funktion der spezifischen
Restriktion wurde in 10 mmol/l Tris-Essigsäure (pH 8,3), 30 mmol/l Kaliumacetat,
5 mmol/l Magnesiumacetat, 1 μg/ml
BSA, 0,01 Vol.-% Tween 20 durchgeführt. Die Reaktionen enthielten
weiterhin 200 μmol/l
dNTPs (jeweils) und 8 Einheiten/ml DeepVentR(exo–)-DNA-Polymerase
(NEB), PNA (N-CCG ATT AAC GCT TGC ACC-C) und die Oligonukleotide Pos2(3)D2-1rev
(5'ATT TAT GAG GAG
TCC GGT GCA AGC GTT AAT CGG GAT ATC AGG ATC CCA3') und Pos4 (5'TGG GAT CCT GAT ATC3') in Konzentrationen von 1 μmol/l. Alle
Komponenten der Reaktion außer dem
Restriktions-Enzym
wurden 2 min lang auf 90°C
erhitzt und vor der Zugabe von 5 oder 10 Einheiten MlyI und 15 h
langer Inkubation auf 41°C
abgekühlt.
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9 zeigt
die PAGE-Analyse der Restriktionsprodukte mit PNA und ohne PNA mit
0, 5 oder 10 Einheiten des Restriktions-Enzyms MlyI. Die Restriktion
der 48 bp-DNA führt
zu Fragmenten von 29 bp- und 19 bp-DNA. Die Anwesenheit der PNA
blockiert die Restriktion, die DNA bleibt intakt und hat eine höhere scheinbare
Länge wegen
der hybridisierten und ungeladenen PNA.
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Spezifische
enzymatische Zersetzung von nicht-hybridiserter einsträngiger DNA mit nicht-sequenzspezifischen
Nukleasen (z. B. DNaseI): Da ein PNA/DNA-Hybrid für die meisten
Nukleasen kein Substrat ist, kann die Zersetzung von nicht-hybridiserter
einsträngiger
DNA durch Inkubation mit DNasen nach Schützen der notwendigen Primerbereiche
mit PNA durchgeführt
werden. Falls es eine passende PNA (10, schwarz ausgefüllt) für den mittleren
Bereich (A, leer) gibt, werden die Primerbereiche (A, schraffiert)
durch die entsprechende PNA (A, schwarz) geschützt. Die Inkubation mit Nuklease
zerstört alle
Bereiche der nicht zu einer passenden PNA hybridisierten DNA (B).
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Trennen
von einsträngiger
DNA und PNA/DNA-Hybriden mit HPLC: Die HPLC-Trennung von einsträngiger DNA
und PNA/DNA-Hybriden wurde unter Verwendung einer C4-Umkehrphasen-Matrix
in einer Säule mit
einem Innendurchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 25 cm (Teilchendurchmesser
= 5 μm)
durchgeführt.
Die mobilen Phasen waren 0,1 Mol/l Triethylammoniumacetat (pH 7)
und Acetonitril bei einem Durchfluss von 1,3 ml/min. Die Substanzen
wurden durch Absorption bei 254 nm erfasst. Das Injektionsvolumen
war 20 μl.
Die Trennung wurde mit einem Gradienten von 10 bis 15% Acetonitril
20 min lang ausgeführt. 11 zeigt die
Chromatogramme für
die Trennung von 48 nt einsträngiger
DNA und PNA/DNA-Hybriden unter Verwendung von HPLC. Das Chromatogramm
A zeigt die Trennung einer Probe ausschließlich mit 48 nt einsträngiger DNA
(5'GAA TTC CAG ATC
TCT GGT GCA AGC GTT AAT CGG GAT ATC AGG ATC CCA3'). Die Chromatogramme C und D zeigen
die Trennung von Proben mit einer Mischung von 48 nt einsträngiger DNA
(5'GAA TTC CAG ATC
TCT GGT GCA AGC GTT AAT CGG GAT ATC AGG ATC CCA3') und 18mer-PNA (N-CCG ATT AAC GCT TGC ACC-C) in einem
molaren Verhältnis
von DNA zu PNA von 2:1 unter Verwendung von unterschiedlichen Lösungsgradienten
mit 10–15%
Acetonitril (A und B) und 10–14%
Acetonitril (C). Nach der Trennung konnte die DNA aus PNA/DNA-Hybriden
durch PCR amplifiziert werden.
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Puffersystem
mit Wachstrennung für
das Zersetzen und das folgende Amplifizieren von einsträngiger DNA
in einem geschlossenen System: Zwei Pufferkammern mit einem Volumen
von jeweils 25 μl
wur den in einem 200 μl-Reaktionsrohr
durch Trennen mit einer Wachsschicht generiert. Dies liefert die
Möglichkeit
des automatischen Mischens der Puffer durch Erhöhen der Temperatur und ohne
Intervention ins System durch Erhöhen der Temperatur (12).
Die untere Kammer enthielt 40 mmol/l Tris-Essigsäure (pH 8,7), 10 mmol/l Kaliumacetat,
5 mmol/l Magnesiumacetat, 10 mmol/l Ammoniumsulfat, 0,01 Vol.-%
Tween 20, 2 μg/ml
BSA, 4 mmol/l EDTA, 400 μmol/l
dNTPs (jeweils), 2 μmol/l
der Primer Pos3(5) (5'ATT
CTA TCA CGA GTC3')
und Pos4(5) (5'TGG
GAT CCT CAT ATC3')
und 0,4 Einheiten DeepVentR(exo–)-DNA-Polymerase
(NEB). Nach Zugabe von 40 μl
25:1 (Volumen/Gewicht) Heptadecan/Paraffinwachs (Tm = 73–80°C; Aldrich
411671-1) wird das Rohr auf 20°C
temperiert, um das Wachs zu verfestigen. Die Lösung für die obere Kammer mit 10 mmol/l Kaliumacetat
(pH 4,6), 100 mmol/l NaCl, 100 μmol/l
Zinksulfat, 5 mmol/l Magnesiumsulfat, 105 Hybriden
von PNA (N-CCG ATT AAC GCT TGC ACC-C) und dem Oligonukleotid Pos2(5)D2-1rev
(5'ATT CTA TCA CGA GTC
GGT GCA AGC GTT AAT CGG GAT ATG AGG ATC CCA3'), 0,8 μmol/l der Oligonukleotide Pos3(5)rev (5'GGA CTC CTC ATA AAT3') und Pos4(5) (5'TGG GAT CCT CAT ATC3') kann ohne Mischen
der Puffersysteme auf die Wachsschicht gegeben werden. Die spezifische
Zersetzung der einsträngigen
DNA in der oberen Kammer kann durch Zugabe von Nuklease initiiert
werden. Nach Zersetzen wurde die Wachsschicht durch Erhöhen der
Temperatur auf 27°C
während
5 min und Mischen der Kammern ohne Intervention in das System geschmolzen.
Die wesentlichen Metallionen für
die Funktion der Nukleasen sind an EDTA gebunden (welche in der
unteren Kammer vorhanden ist), solange die Dissoziationskonstanten
ihrer ent sprechenden EDTA-Komplexe niedriger sind als die des Magnesium-EDTA-Komplexes.
Die folgende PCR (96°C
primäre
Denaturierung; 35 Zyklen von 94°C;
45 s; 40°C,
1 min; 72°C,
30 s; endgültige
Elongation 72°C,
1 min) wurde zum Amplifizieren der DNA benutzt.
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Immobilisierte
Nukleasen für
die Zersetzung von einsträngiger
DNA und folgende Entfernung der Enzyme: Die Verwendung immobilisierter
Nukleasen zum spzifischen Zersetzen von einsträngiger DNA erleichtert die
folgende Entfernung der Nukleasen vor dem PCR-Amplifizieren.
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Chemische
Synthese von PNA-komplementärer
DNA unter Verwendung von Cyanbromid: Für die chemische Ligation von
komplementärer
DNA auf einer PNA-Matrize wurden 24 Nukleotide lange einsträngige DNA
benutzt, welche mit neun Nukleotiden (13; leer)
jeweils auf einer 18mer-PNA (schwarz ausgefüllt) hybridisierten. Um die
unterschiedlichen Phosphorylierungszustände zu testen, wurde entweder
das Oligonukleotidpaar mit einer Phosphorylierung an der X-Position
(ApPos2(5)D2-1rev (5'ATT
CTA TCA CGA GTC GGT GCA AGC-Pho3')
und BPos2(5)D2-1rev (5'GTT
AAT CGG GAT ATG AGG ATC CCA3'))
oder mit einer Phosphorylierung an der Y-Position (APos2(5)D2-1rev
(5'ATT CTA TCA CGA
GTC GGT GCA AGC3') pBPos2(5)D2-1rev
(5'Pho-GTT AAT CGG
GAT ATG AGG ATC CCA3'))
in der Reaktion benutzt. Die chemische Ligation mit Cyanbromid wurde
in 250 mmol/l MES/Triethylamin-Puffer (pH 7,5) mit ggf. 20 mmol/l
Magnesiumchlorid durchgeführt.
Die Proben enthielten weiterhin 10 pmol 18mer-PNA (N-CCG ATT AAC
GCT TGC ACC-C) bzw. 10 pmol des Oligonukleotids D2-1rev (5'GGT GCA AGC GTT AAT
CGG3') als Matrize
und 10 pmol jedes Oligonukleotids eines Paars in einem Volumen von
9 μl. Alle
Reaktionen wurden auf 94°C
2 min lang erhitzt und langsam auf 4°C abgekühlt. Die Ligation wurde durch
Zugabe von 1 μl
10 mol/l Cyanbromid in Acetonitril initiiert. Nach 4 min Inkubation
bei 4°C
wurden die Proben sofort in flüssigem
Stickstoff eingefroren und lyophilisiert. Die Reste wurden in 10 μl Wasser
zwecks weiterer Analyse in einer denaturierenden 15%-PAGE (29:1,
Acrylamid:Bisacrylamid) aufgelöst.
-
14 zeigt
die PAGE-Analyse der Ligationsreaktionen mit Phosphorylierung entweder
am 5'- oder am 3'-Ende der benachbarten
DNA. Es ist offensichtlich, dass höhere Ausbeuten in Proben mit
Magnesiumionen unter Verwendung von einsträngiger DNA mit 3'-Phosphorylierung
und 5'-OH an nebeneinander
befindlichen Enden und DNA als Matrize erhalten wurden. Jedoch wurden
auch mit einer PNA-Matrize erfassbare Mengen der Ligationsprodukte
erhalten. (Mit "+" bezeichnete Bahnen:
Proben mit 10 mmol/l Magnesiumchlorid; PNA: Proben mit einer PNA-Matrize;
DNA: Proben mit einer DNA-Matrize; –: Proben ohne Matrize)
-
Chemische
Synthese von PNA-komplementärer
DNA unter Verwendung von EDC: Für
die chemische Synthese von DNA auf einer PNA-Matrize wurden zwei
24 Nukleotide lange einsträngige
DNA benutzt, welche mit neun Nukleotiden jeweils auf einer 18mer-PNA
(14) hybridisierten. Um die unterschiedlichen Phosphorylierungszustände zu testen,
wurde entweder das Oligonukleotidpaar ApPos2(5)D2-1rev (5'ATT CTA TCA CGA GTC
GGT GCA AGCPho3')
und BPos2(5)D2-1rev (5'GTT
AAT CGG GAT ATG AGG ATC CCA3')
oder das Oligonukleotidpaar ApPos2(5)D2-1rev (5'ATT CTA TCA CGA GTC GGT GCA AGC-Pho3') pBPos2(5)D2-1rev
(5'Pho-GTT AAT CGG
GAT ATG AGG ATC CCA3')
bei den Reaktionen benutzt. Die chemische Ligation unter Verwendung
von EDC wurde in 100 mmol/l MES/NaOH (pH 6) mit 20 mmol/l Magnesiumchlorid
durchgeführt.
Die Proben enthielten weiterhin 100 pmol 18mer-PNA (N-CCG ATT AAC
GCT TGC ACC-C) bzw. 100 μmol
des Oligonukleotids D2-1rev (5'GGT
GCA AGC GTT AAT CGG3')
Matrize und 100 μmol
jedes Oligonukleotids eines eingesetzten Oligonukleotidpaars in
einem Volumen von 50 μl.
Alle Reaktionen wurden auf 94°C
2 min lang erhitzt und langsam auf 10°C abgekühlt. Die Ligation wurde durch
Zugabe von 50 μl
400 mmol/l EDC-Lösung
initiiert und 19 h lang bei 10°C
inkubiert. Die folgende denaturierende PAGE-Analyse (15% Polyacrylamid;
29:1, Acrylamid:Bisacrylamid) ist in 15 dargestellt.
(PNA: Proben mit einer PNA-Matrize; DNA: Proben mit einer DNA-Matrize; –: Proben
ohne Matrize.)
-
Matrizenabhängige Kopplung
von PNA-hybridisierten einsträngigen
DNA-Fragmenten mit Ligasen: Die Synthese von PNA-komplementärer DNA
durch Kopplung von einsträngigen
DNA-Fragmenten in einer matrizenabhängigen Weise auf einer PNA
kann durch Schließen
der Lücken
zwischen hybridisierenden Fragmenten unter Verwendung von Ligasen
realisiert werden. Diese Ligasen könnten ein- oder zweisträngig sein (zum Beispiel, aber
nicht beschränkt
auf: DNA-Ligase I, DNA-Ligase II, DNA-Ligase III, DNA-Ligase IV, DNA-Ligase
V, T4-DNA-Ligase,
Taq DNA-Ligase, T4 RNA-Ligase, T4-RNA-Ligase II, ThermoPhage einsträngige DNA-Ligase,
Rma-DNA-Ligase, Tsc-DNA-Ligase, E.coli-DNA-Ligase, LdMNPV-DNA-Ligase, LigTK, Mth-Li gase,
PBCV-1 DNA-Ligase, Pfu DNA-Ligase, Sealase, T4-ATP-Ligase, Vaccinia-Ligase,
Tfi-DNA-Ligase,
Tth-DNA-Ligase, Band IV, DREL, gp24.1, P52, RM378-RNA-Ligase, TbMP52,
Rc11p, DNA-Ligase D, XRCC4-ligase, T7 DNA-Ligase, Bst-Ligase, DraRn1).
-
Enzymatische
Ligation von PNA-komplementärer
DNA unter Verwendung von T4-RNA-Ligase und einsträngiger DNA
mit einem Überhang:
Die Oligonukleotide APos2(5)D2-1rev (5'ATT CTA TCA CGA GTC GGT GCA AGC3') und pBPos2(5)D2-1rev
(5'Pho-GTT AAT CGG
GAT ATG AGG ATC CCA3'),
hybridisiert mit jeweils neun Nukleotiden auf einem Matrizen-Molekül, das aus
PNA (N-CCG ATT AAC GCT TGC ACC-C) bestanden und enzymatisch mit
500 Einheiten/ml T4-RNA Ligase in 50 mmol/l HEPES/NaOH (pH 8), 10
mmol/l Magnesiumchlorid, 100 μmol/l
ATP und 10 μg/ml
BSA ligiert wurden. Die Konzentrationen für die Oligonukleotide und die
PNA waren 1 μmol/l.
Alle Komponenten außer
der T4-RNA-Ligase und der BSA wurden auf 94°C 2 min lang erhitzt und langsam
auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die Ligationsreaktionen wurden durch Zugabe von BSA und T4-RNA-Ligase
vor einer Inkubation von 15 h bei Raumtemperatur gestartet. Die
Ligationsprodukte wurden durch eine denaturierende PAGE (15% Polyacrylamid;
29:1, Acrylamid:Bisacrylamid) analysiert, welche in 16 gezeigt
ist. Es ist offensichtlich, dass ein Ligationsprodukt von 48 nt
unter Verwendung einer PNA-Matrize (Bahn 1) erhalten wurde. Kein
Ligationsprodukt konnte nach Verwendung einer DNA-Matrize (Bahn
2) oder ohne eine Matrize (Bahn 3) erfasst werden. Bahn 4 enthält eine
48 nt-einsträngige
DNA als Referenz.
-
Enzymatische
matrizenabhängige
Ligation von hexamer- und pentamer-einsträngiger DNA mit T4-RNA-Ligase: Die matrizenabhängige Ligation
von hexamer- und pentamer-einsträngiger
DNA wurde in 50 mol/l HEPES/NaOH (pH 8), 10 mmol/l Magnesiumchlorid,
100 μmol/l
ATP und 10 μg/ml
BSA mit 330 Einheiten/ml T4-RNA-Ligase realisiert. Die verwendeten
Oligonukleotide für
die hexamer-einsträngige
DNA-Ligation waren 6mer-A (5'Pho-GGT
GCA3'), 6mer-B (5'Pho-AGC GTT3'), 6mer-C (5'Pho-AAT CGG3') (17B),
und für
die pentamere Ligation wurden die Oligonukleotide 5mer-A (5'GCA AG3'), 5mer-B (5'Pho-CGT TA3') und 5mer-C (5'Pho-ATC GG3') benutzt (17A). In einer Reaktion waren entweder
die hexamer- oder die pentamer-Oligonukleotide in Konzentrationen
von jeweils 2 μmol/l
vorhanden. Zusätzlich
enthielten die Reaktionsmischungen 2 μmol/l PNA (N-CCG ATT AAC GCT
TGC ACC-C). Alle Komponenten außer
der T4-RNA-Ligase und der BSA wurden auf 94°C 2 min lang erhitzt und vor
der Zugabe of T4-RNA-Ligase
und BSA auf Raumtemperatur abgekühlt,
um die Reaktion zu starten. Nach Inkubation von 15 h bei Raumtemperatur
wurden die Reaktionsmischungen gel-filtriert (Sephadex G-25), und
die Eluentenvolumina wurden durch Lyophilisierung reduziert, falls
notwendig. Die Ligationsprodukte konnten auf einer denaturierenden
20%-PAGE (29:1,
Acrylamid:Bisacrylamid) mit 8 mol/l Urea und 10% Formamid bei ~50°C und folgender
Silberfärbung
analysiert werden.
-
Die
Ligation von Pentameren (18; linker
Teil des Gels) ergab 15 nt- und 10 nt-einsträngige DNA, die Ligation von
Hexameren (rechter Teils des Gels) ergab 18 nt- und 12 nt-einsträngige DNA,
was aus der Ligation von drei bzw. zwei einsträngigen DNA-Fragmenten auf einer
Matrize resultierte. Kein Produkt ist in Proben ohne eine Matrize
oder ohne Ligase erfasst worden (mit "–" bezeichnete Bahnen).
15 nt- und 18 nt-einsträngige
DNA dienten als Referenz im Gel. (+: Proben mit Ligase; Proben ohne
Ligase; +PNA: Proben mit einer PNA-Matrize; 5mer: Ligation mit pentamer-einsträngiger DNA;
6mer: Ligation mit hexamer-einsträngiger DNA.)
-
Enzymatische
matrizenabhängige
Ligation von tetramer-einsträngiger
DNA in eine Lücke
mit T4-RNA-Ligase:
Für die
Ligation von tetramer-einsträngiger
DNA auf einer PNA-Matrize wurden die Oligonukleotide 4mer-Lig5' (5'CAT TAG TTG GTG CAA3') und 4mer-Lig3' (5'Pho-TAA TCG GGA TCT
GAG3') (19; leer)
benutzt, welche mit jeweils sieben Nukleotiden auf einer PNA-Matrize
(N-Bio-CCG ATT AAC GCT TGC ACC-C) (schwarz ausgefüllt) hybridisierten,
was eine Lücke
von vier Nukleotiden ließ.
Die Lücke
wurde mit passender 5'-phosphorylierter
tetramer-einsträngiger
DNA aus einer randomisierten Bibliothek (4mer-deg; 5'Pho-NNN N3') aufgefüllt. Die
Reaktion wurde durchgeführt
in 50 mmol/l HEPES/NaOH (pH 8), 10 mmol/l Magnesiumchlorid, 100 μmol/l ATP
und 10 μg/ml
BSA mit 330 Einheiten/ml T4-RNA-Ligase durchgeführt. Die Konzentrationen der
Oligonukleotide waren 10 nM für
4mer-Lig5' und 4mer-Lig3' und 1 μmol/l für 4mer-deg. Alle
Komponenten der Reaktion außer
der T4-RNA-Ligase und der BSA wurden auf 94°C 2 min lang erhitzt und langsam
auf 25°C
abgekühlt.
Die Ligation wurde durch Zugabe von T4-RNA-Ligase und BSA gestartet, und
die Mischungen wurden dann bei 25°C
15 h lang inkubiert. Die Reaktionslösung wurde in ein mit Streptavidin
beschichtetes 200 μl-PCR- Rohr übertragen
und 7 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Reaktionslösung wurde
das Rohr zweimal mit 200 μl
Waschpuffer (0,2 mol/l NaCl, 10 mmol/l Tris-HCl (pH 7.5), 1 mmol/l
EDTA, 0,1 Vol.-% Tween 20) gewaschen, und die DNA von immobilisierten
PNA/DNA-Hybriden wurde durch Zugabe eines Primer-Elongationsmixes
(20 mmol/l Tris-HCl, 10 mmol/l Ammoniumsulfat, 10 mmol/l Kaliumchlorid,
2 mmol/l Magnesiumsulfat, 0,1% Triton X-100, jeweils 200 μmol/l dNTP
und 1 μmol/l
des Primers 4mer-Lig5' (5'CAT TAG TTG GTG CAA3') bzw. 4mer-Lig3'rev (S5'CTC AGA TCC CGA TTA3')) und folgende Temperaturzyklen
(96°C primäre Denaturierung;
30 Zyklen von 96°C,
1 min; 38°C,
1 min; 72°C,
30 s; endgültige
Elongation 72°C,
1 min) amplifiziert. 34 Basenpaare lange Amplifizierungsprodukte
wurden in einer PAGE-Analyse der Amplifizierungsreaktion mit 15%
Polyacrylamid unter nativen Bedingungen (20) erfasst.
Die DNA wurde in geeignete Vektor-DNA durch T-Überhang subkloniert und dann
sequenziert. (Bahn 1: Ligation mit PNA; Bahn 2: Ligation ohne PNA-Matrize;
Bahn 3: negative Kontrolle für
PCR.)
-
Matrizenabhängige Elongation
von PNA-hybridisierter einsträngiger
DNA mit tetramer- und trimer-einsträngiger DNA: Die Elongation
des Oligonukleotids APos2(5) (-3)D2-1rev (5'ATT CTA TCA CGA GTC GGT GCA3') wurde unter Verwendung
der PNA (N-CCG ATT AAC GCT TGC ACC-C) als Matrize für die Ligation von
Fragmenten von 5'-phosphorylierter
4mer-(4mer-deg; 5'Pho-NNN
N3') oder 3mer-einsträngiger DNA (3mer-deg;
5'Pho-NNN3') (21)
durchgeführt.
Die Reaktion wurde in 50 mmol/l HEPES/NaOH (pH 8), 10 mmol/l Manganchlorid,
100 μmol/l
ATP, 20 mmol/l DTT, 2 mmol/l Spermin, 10 μg/ml BSA mit 330 Einheiten/ml T4-RNA-Ligase durchgeführt. Die
Konzentrationen der Oligonukleotide waren 0,8 μmol/l APos2(5) (-3)D2-1rev, 1 μmol/l PNA
und 40 μmol/l
des Oligonukleotids 4mer-deg bzw. 69 μmol/l 3mer-deg. Alle Komponenten
außer
der T4-RNA-Ligase und der BSA wurden auf 70°C 2 min lang erhitzt und auf
Raumtemperatur abgekühlt.
Die Ligationsreaktion wurde durch Zugabe von BSA und T4-RNA-Ligase
gestartet. Die Proben wurden bei Raumtemperatur 5 Tage lang inkubiert.
Die Ligationsprodukte wurden in 50 μl PCR-Proben (20 mmol/l Tris-HCl,
10 mmol/l Ammoniumsulfat, 10 mmol/l Kaliumchlorid, 2 mmol/l Magnesiumsulfat,
0,1% Triton X-100, jeweils 200 μmol/l
dNTP und 1 μmol/l
jedes Primers) mit 1 μl
der Ligationsreaktion unter Verwendung der Primer APos2(5) (-3)D2-1rev
(5'ATT CTA TCA CGA
GTC GGT GCA3') (leer)
und 4mer-Lig3'rev (schraffiert) (5'CTC AGA TCC CGA TTA3') (96°C primäre Denaturierung;
10 Zyklen von 96°C,
2 min; 10°C,
5 min; 15°C,
5 min; 20°C,
5 min; 50°C,
1 min; 40 Zyklen von 96°C,
1 min; 40°C,
1 min; 72°C,
30 s; endgültige
Elongation 72°C, 1
min) (P: Phosphorylierung, schraffiert: für das Amplifizieren des Ligationsprodukts
benutzter Rückwärts-Primer)
amplifiziert. Die 41 Basenpaare langen Amplifizierungsprodukte wurden
in einer PAGE mit 15% Polyacrylamid unter nativen Bedingungen analysiert,
und die 41 Basenpaare lange DNA konnte erfasst werden (22).
Die DNA wurde in eine geeignete Vektor-DNA durch T-Überhang
subkloniert und dann sequenziert. Es ist offensichtlich in 22,
dass die Amplifizierungsprodukte ausschließlich in Proben erhalten werden, welche
eine PNA-Matrize enthielten (Bahnen 2 und 4). Obwohl nur fünf Nukleotide
nach dem Sequenzieren geprüft
werden konnten, muss eine Spanne von zwölf Nukleotiden in einer matrizenabhängigen Weise
für ein erfolgreiches
PCR-Amplifizieren mit den verwendeten Primern generiert worden sein.
(Bahn 1: negative Kontrolle für
PCR; Bahn 2: Reaktion mit trimer-einsträngiger DNA und PNA-Matrize;
Bahn 3: Reaktion mit trimer-einsträngiger DNA ohne PNA-Matrize;
Bahn 4: Reaktion mit tetramer-einsträngiger DNA und PNA-Matrize;
Bahn 5: Reaktion mit tetramer-einsträngiger DNA
ohne PNA-Matrize.)
-
Matrizenabhängige Synthese
of PNA-komplementärer
DNA mit einsträngigen
DNA-Fragmenten ohne Überhang:
Die Synthese von PNA-komplementärer
DNA kann durch enzymatische oder chemische Kopplung der einsträngigen DNA-Fragmente
mit einer Länge
von neun bis zwei Nukleotiden auf einer PNA-Matrize durchgeführt werden
(23A). Während ein Bedarf für ein Starter-Oligonukleotid
mit wenigstens drei Nukleotiden unter Verwendung von dimeren Fragmente
(23B) besteht.
-
Das
Amplifizieren von cDNA kann entweder unter Verwendung von Primern,
welche auf die Kanten der generierten cDNA abzielen (23C), oder durch Ligation von Oligonukleotiden,
die als Linker zum Schaffen von Primerbereichen wirken (23D), durchgeführt werden. Das Amplifizieren
durch direkt gebundene Linker-Oligonukleotide kann unter Verwendung
von Primern umgangen werden, die in die DNA verlängert sind (23E),
die durch bekannte Segmente der PNA generiert worden ist.
-
Restriktion
von direkt ligierten Linker-Oligonukleotiden durch Restriktions-Endonukleasen:
Ein weiteres Verfahren zum Verhindern des Ampli fizierens von direkt
gebundenen Linker-Oligonukleotiden ist ihre Hydrolyse unter Verwendung
von Nukleasen (24). Nur ein einzelnes 5'-phosphoryliertes Oligonukleotid wird als
Linker benutzt und kann an beiden Enden der generierten DNA ligiert
werden. Mit der Ligation von zwei Linker-Oligonukleotiden direkt
zueinander wird eine Restriktionsstelle für eine Restriktions-Endonuklease generiert.
Nach der Synthese eines komplementären Strangs durch DNA-Polymerasen
können
die Fragmente hydrolysiert werden, um ihr Amplifizieren in eine
PCR zu verhindern.
-
Matrizenabhängige Elongation
von PNA-hybridisierter einsträngiger
DNA mit Pyrophosphaten: Die Synthese von PNA-komplementärer DNA
kann durch Elongation eines Initiierungs-Nukleotids mit einer Länge von
wenigstens drei Nukleotiden durchgeführt werden, welche an dem C-Ende
der PNA hybridisiert. Die Elongation kann durch enzymatische und
matrizenabhängige
Kopplung von adenylierten Desoxyribonukleotiden (A-5'pp5'-dN) oder adenylierten
Ribonukleotiden (A-5'pp5'-N) ausgeführt werden,
die ein intermediäres
Produkt beim Prozess der Ligation gemäß der Referenz England, T.
E. et al., Dinucleoside pyrophosphates are substrates for T4-induced
RNA ligase, Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74 (11), 4839–42, darstellen.
- (1) A-5'pp5'-dN + dNnOH → dNnpdN + AMP (katalysiert durch Ligase) oder
(2) A-5'pp5'-N + NnOH → NnpN + AMP (katalysiert durch Ligase)
-
Matrizenabhängige Elongation
von PNA-hybridisierter einsträngiger
DNA mit 3',5'-Bisphosphatnukleosiden:
Die Synthese von PNA-komplementärer DNA
kann durch Elongation eines Initiierungs-Oligonukleotids mit einer Länge von
wenigstens drei Monomeren, welches am C-Ende der PNA hybridisiert,
durchgeführt
werden. Die Elongation kann durch matrizenabhängige enzymatische Kopplung
von 2'-Deoxynukleosid-3',5'-Bisphosphaten oder
Nukleosid-3',5'-Bisphosphaten (25A) ausgeführt werden. Bei fortschreitender
Elongation ist eine intermediäre
Dephosphorylierung der resultierenden phosphorylierten 3'-Enden (B) notwendig.
Dies kann zum Beispiel durch Kinase-Kinasen (z. B. T4-Polynukleotid-Kinase)
(C) realisiert werden.
-
Lineares
Amplifizieren von PNA-Sequenzinformationen durch die Ligase-Kettenreaktion:
Die Verwendung von thermostabilen Ligasen bietet die Möglichkeit
eines linearen Amplifizierens von komplementärer DNA auf einer PNA-Matrize.
Die Synthese von cDNA wird durch wiederkehrende Änderungen der Temperatur zwischen
einer Denaturierungs-Temperatur zum Trennen der DNA von der PNA-Matrize
und einer Anlagerungs- und Ligations-Temperatur zum Hybridisieren
und Anlagern der einsträngigen
DNA-Fragmente auf der Matrize ausgeführt.
-
Verwenden
von PNA/DNA-Chimären
mit terminalen DNA-aufbauenden Haarnadelschleifen für die Ligation
und zum Liefern von Primerbereichen: Das Verwenden von PNA/DNA-Chimären mit
flankierenden DNA-Segmenten (26A,
leer), welche DNA-Haarnadelschleifen an jedem Ende der PNA (A, schwarz
ausgefüllt)
bilden, kann als Initiierungs-Oligonukleotide für die matrizenabhängige Ligation
von einsträngigen DNA-Fragmenten
(A, schraffiert) auf der PNA dienen. Weiterhin können diese Nukleotide Primerbereiche
für das
folgende Amplifizieren der Ligationsprodukte nach dem Schneiden
entweder der Stammbereiche mit Restriktions-Enzymen (B) oder der
einsträngigen
Segmente mit einsträngigen
spezifischen Nukleasen (S1-Nuklease, Mungobohnen-Nuklease etc.)
(C) liefern.
-
Verwenden
von PNA/DNA-Chimären
mit terminaler DNA elongiert durch Terminal-Nukleotidyl-Transferasen
zum Liefern von Hybridisierungbereichen: Angehängte Nukleotide (27;
leer) am C-Ende einer PNA (schwarz ausgefüllt) können mit einer Art von Monomeren
unter Verwendung von Terminal-Nukleotidyl-Transferasen
elongiert werden. Diese generierten DNA-Schwänze (kreuzweise schraffiert)
liefern Hybridisierungsstellen für
Initiierungs-Oligonukleotide (schraffiert), welche durch einsträngige DNA-Fragmente
(leer) unter Verwendung von Ligasen elongiert werden können. Zusätzlich können die
generierten DNA-Schwänze als
Hybridisierungsbereiche für
Primer (grau) für
das folgende Amplifizieren der Ligationsprodukte durch PCR dienen.
-
Verwenden
von chemisch vor-aktivierten Bausteinen oder Monomeren: Die Ligation
von einsträngigen DNA-Fragmenten
oder Monomeren auf einer PNA-Matrize
kann unter Verwendung von chemisch vor-aktivierten Bausteinen durchgeführt werden.
Diese Bausteine können
zum Beispiel durch Aktivieren einer Phosphat-Gruppe am 5'- oder 3'-Ende der einsträngigen DNA
unter Verwendung von Carbodiimiden (z. B. EDC) und Imidazol oder
NHS (28) generiert werden. Alternativ können an
der Kante einer PNA hybridisierte Primer-Oligonukleotide durch Zugabe
von chemisch vor-akti vierten Monomeren oder einsträngigen DNA-Fragmenten
in einer Weise elongiert werden, welche oben erwähnt wurde.
-
Beispiel 6: Erhalten von PNA-Sequenzinformationen
-
Hach
Hybridisierung oder Generierung von komplementären einsträngigen Nukleinsäuren gemäß Beispiel
5 werden die Nukleinsäuren
sequenziert gemäß der Referenz
Sanger F. et al., DNA-sequencing with chain-terminating inhibitors,
Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74, 5463–5467 und Hunkapiller, T.,
Large-scale und automated DNA sequence determination, Science 1991,
254, 59–67.
Die dadurch erhaltenen Sequenzinformationen werden in komplementäre Sequenzinformationen
umgesetzt, welche die Sequenzinformationen der PNA sind. Mit diesen
PNA-Sequenzinformationen können
PNA-Moleküle
mit solch einer Sequenz gemäß Beispiel
3 synthetisiert werden.
-
Legende der Figuren
-
Fig.
1
| Retentionszeit | |
| Retentionszeit | |
Fig.
2
| Hybridisieren | |
| Trennen | |
| Amplifizieren | |
| Klonen und Sequenzieren | |
Fig.
4
Fig.
5
| 50 Einheiten | |
| 100 Einheiten | |
Fig.
6
| 20 Einheiten | |
| 10 Einheiten Mungobohnen-Nuklease | |
Fig.
7
| Restriktionsstelle | Restriktionsstelle |
| Polymerase | Polymerase |
| Restriktions-Enzym | |
Fig.
8
| Erkennungsstelle | |
| Polymerase | Polymerase |
| Restriktions-Enzym | |
Fig.
9
Fig.
10
Fig.
11
| Retentionszeit | %
Acetonitril |
| Retentionszeit | %
Acetonitril |
| Retentionszeit | %
Acetonitril |
Fig.
12
| Puffer
A; pH 4,5 | Puffer
A:Puffer B |
| S1-Nuklease | 1:1 |
| Wachs | |
| Puffer
B; pH 8,7 | |
| Primer,
Polymersae, | |
| ... | |
Fig.
13
| CNBr,
EDC oder | |
| Ligase | |
| Matrize | Matrize |
Fig.
24
| Ligation | Restriktion |
| Eine
Art von Linker | Restriktionsstelle |
Fig.
25
| wenigstens | |
| trimere
einsträngige
DNA | |
| Biophosphat-Nukleosid | |
| Ligase | Kinase |
Fig.
26
| Restriktions-Endonuklease | |
| Einsträngige | |
| spezifische Nuklease | |