DE69333073T2

DE69333073T2 - Verwendungen von fluoreszierenden n-nukleosiden und dessen analogen

Info

Publication number: DE69333073T2
Application number: DE69333073T
Authority: DE
Inventors: J. Michael CONRAD
Original assignee: Chromagen Inc San Diego; Chromagen Inc
Current assignee: Chromagen Inc San Diego; Chromagen Inc
Priority date: 1992-02-12
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2013-02-13
Also published as: CA2129105A1; WO1993016094A2; EP0628051B1; EP0628051A1; DE69333073D1; WO1993016094A3; US5763167A; ATE244259T1; JPH07504087A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von fluoreszierenden strukturellen Analoga oder Strukturanaloga der nichtfluoreszierenden Nukleoside, die in DNA und RNA üblicherweise gefunden werden.
Hintergrund der Erfindung
Die sechs üblicherweise vorkommenden N-Nukleoside, die in der Zusammensetzung von DNA und RNA aus allen Quellen vorherrschen, sind Adenosin, Thymidin, Uridin, Cytidin, Guanosin und Inosin. Diese Nukleotide zeigen keine Absorption von Licht bei Wellenlängen > 290 nm und sind unter physiologischen Bedingungen effekativ nicht-fluoreszierend.
Nukleotidseequenzen werden gewöhnlich bei verschiedenen Anwendungen eingesetzt, einschließlich diagnostischen und therapeutischen Sonden, die an Ziel-DNA und -RNA hybridisieren, und bei der Amplifizierung von Zielsequenzen. Es ist oftmals notwendig, oder nützlich, Nukleotidsequenzen zu markieren.
Die Hybridisierung von spezifischen DNA- oder RNA-Sequenzen umfasst typischerweise das Rnhybridisieren von Oligonukleotiden von 5 Basen bis mehr als 10000 Basen (10 kb). Die Hauptanzahl von Oligonukleotid-Sonden, die gegenwärtig im Rahmen der Forschung eingesetzt werden, ist radioaktiv markiert; jedoch werden aufgrund von (a) der kurzen Halbwertszeiten der Isotope, die gemeinhin verwendet werden, (b) der Sicherheitserfordernisse und (c) der Kosten der Handhabung und Entsorgung von radioaktiven Sonden bequeme und empfindliche, nicht auf Isotopen beruhende Nachweismethoden für diagnostische Hybridisierungsmethoden benötigt, um eine weitverbreitete Akzeptanz und Anwendung zu erzielen.
Im allgemeinen hängen alle nicht auf Isotopen beruhenden Methoden zum Nachweisen oder Detektieren von Hybridisierungssonden, die gegenwärtig zur Verfügung stehen, von irgendeiner Art von Derivatisierung der Nukleotide ab, um einen Nachweis zu ermöglichen, entweder durch Antikörperbindung oder enzymatische Behandlung oder durch die Fluoreszenz oder Chemolumineszenz eines daran gebundenen „Reporter"-Moleküls. In den meisten Fällen sind Oligonukleotide derivatisiert worden, indem einzelne oder eine Mehrzahl von Molekülen der gleichen Reportergruppe, im allgemeinen an speziellen cyclischen oder exocyclischen Positionen, eingebaut wurden.
Auf der einfachsten Ebene sind Nicht-Nukleosid-Linkermoleküle und Markierungen an das 3'- oder 5'-Ende von existierenden Oligonukleotiden durch enzymatische oder chemische Methoden angefügt worden. Die Modifizierung von Nukleosidresten, die sich innerhalb der Sequenz eines DNA- oder RNA-Strangs befinden, hat sich als eine schwierige Prozedur erwiesen, da die Reaktionsbedingungen mild genug sein müssen, um die RNA- oder DNA-Oligomere intakt zu lassen, und dennoch Reaktionsprodukte liefern müssen, die an normalen Watson-Crick-Basenpaarungsund Stapelungs-Wechselwirkungen teilnehmen können.
Es sind zahlreiche Methoden sowohl für die cyclische als auch exocyclische Derivatisierung des N-Nukleosids beschrieben worden, einschließlich Hapten-Markierung, Amino- und Thiolderivatisierung, Markierung mit Photobiotin und anderen biotinylierenden Mitteln, dU-Biotin-Markierung, 11-Digoxigenin-ddUTP-Markierung, AAIF, Bisulfitmodifizierung von Cytosin, Fluorophor-Derivatisierung von DNA-Sonden, direkte Enzymmarkierung und Acridiniumester-Markierung. Es ist über Verfahren zur Derivatisierung des Furanoserings und an der Phosphodiester-Hauptkette von Oligonukleotiden berichtet worden. Diese umfassen die Einführung von Internukleotidverknüpfungs-Reportergruppen und von glycosidischen Reportergruppen.
Um nicht-radioaktive nachweisbare Oligonukleotide zu erzeugen, ist es erforderlich gewesen, die Nukleoside, die typischerweise in DNA- und RNA-Sonden verwendet werden, chemisch zu modifizieren, was die Herstellung solcher Sonden teuer und arbeitsaufwändig gemacht hat; in vielen Fällen hat sich auch die Detektionchemie als beschwerlich und teuer bei der Verwendung erwiesen, was hauptsächlich für deren Versagen, in klinischen Laboratorien eine Anwendung in signifikantem Ausmaß zu finden, verantwortlich gewesen ist. Bei deren Anwendungen bei Hybridisierungen sind auch andere Einschränkungen von chemisch derivatisierten Sonden, wie folgt, ersichtlich geworden:

(1) chemisch derivatisierte dNTPs sind im allgemeinen für eine Verwendung als Stamm-Desoxynukleotidtriphosphate bei einer PCR-Amplifizierung nicht kosteneffizient. Folglich ist die Markierung von amplifizierter DNA auf (i) die Amplifizierung unter Verwendung von zuvor markierten Primern oder (ii) das Hybridisieren mit markierten Hybridisierungssonden beschränkt. Die Verwendung der Erstgenannten führt während der Amplifizierung häufig zu falschen Positivergebnissen aufgrund einer nicht-spezifischen Anhybridisierung von Primern an Nicht-Ziel-Abschnitte von DNA während der Amplifizierung oder eine Verunreinigung durch in der Laborumgebung vorhandene Amplicons, die von früheren Amplifizierungsexperimenten übrig geblieben sind. Die Kosten und technischen Schwierigkeiten bei der Weiterbehandlung nach der Hybridisierung haben die Anwendungen von markierten Hybridisierungssonden bei der Forschung stark eingeschränkt.
(2) Bei vielen Oligomeren, die mit derivatisierten Nukleosiden hergestellt worden sind, wird die Basenpaarung aufgrund der Einführung von sperrigen oder keine Wasserstoffbrücken ausbildenden Basen an ungeeigneten Stellen in einer Sequenz behindert. Aufgrund der inhärenten Hintergrund-Chemolumineszenz von vielen klinischen Proben sind sogar die Acridinium ester-Sonden nicht in der Lage gewesen, ihre theoretischen Empfindlichkeitsniveaus zu erreichen. Die Erfordernisse einer Weiterbehandlung nach der Hybridisierung sind eine Einschränkung für solche Verfahren geblieben.
(3) Es hat sich als schwierig erwiesen, nicht-radioaktiv markierte Sonden bereitzustellen, die in großen Mengen nicht teuer hergestellt werden können.
(4) Chemolumineszierende Sonden haben eine kurze Lebensdauer und so getestete Proben sind schwierig genau zu quantifizieren oder „erneut zu testen".
(5) Ruf eine Hybridisierung kann in den meisten Fällen nur geschlossen werden, sie ist nicht-quantitativ oder nur halbquantitativ und ist nicht-automatisierbar.

Diese Einschränkungen haben Anwendungen von DNA- und RNA-Hybridisierungssonden beim Testen in klinischen Laboratorien und bei therapeutischen Verwendungen behindert.
Formycin A (im allgemeinen als Formycin bezeichnet), das als Prototyp dienende fluoreszierende Nukleosidanalog, wurde ursprünglich als ein Antitumor-Antibiotikum aus den Kulturfiltraten von Nocardia interforma (Hori et al. [1966] J. Antibiotics, Ser. A 17: 96–99) isoliert und seine Struktur wurde als 7-Amino-3-b-D-ribofuranosyl-(1H-pyrazolo-[4,3d]-pyrimidin)) (5 und 6) identifiziert. Dieses Antibiotikum, das auch aus Kulturbrühen von Streptomyces lavendulae (Aizawa et al. [1965] Agr. Biol. Chem. 29: 375–376) und Streptomyces gummaensis (Japanisches Patent Nr. 10,928, erteilt in 1967 an Nippon Kayaku Co., Ltd.) isoliert worden ist, ist eines von zahlreichen mikrobiellen C-Ribonukleosidanaloga der N-Nukleoside, die in RNA aus allen Quellen üblicherweise gefunden werden. Die anderen natürlich vorkommenden C-Ribonukleoside, die aus Mikroorganismen isoliert worden sind, (4) umfassen Formycin B (Koyama et al. [1966] Tetrahedron Lett. 597–602; Aizawa et al., a. a. O.; Umezawa et al. [1965] Antibiotics Ser. A 18: 178–181), Oxoformycin B (Ishizuka et al. [1968] J. Antibiotics 21: 1–4; Sawa et al. [1968] Antibiotics 21: 334–339), Pseudouridin (Uematsu und Suahdolnik [1972] Biochemistry 11: 4669-4674), Showdomycin (Darnall et al. [1967] PNAS 57: 548–553), Pyrazomycin (Sweeny et al. [1973] Cancer Res. 33: 2619–2623) und Minimycin (Kusakabe et al. [1972] J. Antibiotics 25: 44-47). Formycin, Formycin B und Oxoformycin B sind Pyrazolopyrimidinnukleoside und sind Strukturanaloga von Adenosin, Inosin bzw. Hypoxanthin; über ein Pyrazopyrimidin-Strukturanalog von Guanosin, das ausgehend von natürlichen Quellen erhalten wird, ist in der Literatur nicht berichtet worden. Eine sorgfältige zusammenfassende Übersicht über die Biosynthese dieser Verbindungen steht in Ochi et al. (1974) J. Antibiotics xxiv: 909–916 zur Verfügung.
Da bekannt war, dass mehrere der C-Nukleoside als antibiotische, antivirale oder Antitumor-Verbindungen wirksam sind, sind deren chemische Derivatisierung und physikalischen Eigenschaften intensiv untersucht und mit den Strukturen und Synthesen der N-Nukleoside, die üblicherweise in DNA und RNR gefunden werden, verglichen worden. In den späten sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurde festgestellt, dass mehrere Strukturanaloga der sechs üblicherweise vorkommenden N-Nukleoside unter physiologischen Bedingungen fluoreszierend waren; die Fluoreszenz resultiert bei den Analoga aus einer molekularen Steifheit der Heterocyclusstruktur selbst; nicht alle Strukturanaloga eines gegebenen Typs, z. B. die C-Nukleoside, sind fluoreszierend; ebensowenig ist Fluoreszenz eine exklusive oder ureigene Eigenschaft von irgendeiner besonderen Klasse von Strukturanaloga. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass nur einige wenige der Pyrazolo- und Pyrrolopyrimidine und – purine fluoreszierend sind und dass sie diese Eigenschaft mit einigen anderen Nukleosidderivaten und Strukturanaloga, einschließlich, aber nicht beschränkt auf mehrere substituierte N-Nukleoside, Azanukleoside, Ethenonukleoside und Deazanukleoside, deren Strukturen in den 5–11 gezeigt sind, gemein haben. Über jene Strukturen in den 5–11, die von Rahmen umgeben gezeigt sind, ist entweder bereits früher berichtet worden oder sie haben sich während der Ausarbeitung der Erfindung als fluoreszierend erwiesen.
Nicht-charakterisierte Oligomere, die fluoreszierende Analoga enthalten, wurden durch Ward und Kollegen für physikalische Untersuchungen unter Verwendung der damals zur Verfügung stehenden Nukleosidpolymerase-Enzyme hergestellt (Ward et al., [1969], J. Biol. Chem. 244: 3243–3250; Ward et al., [1969] ebenda 1228-1237).
EP-A-0235301 und US-A-3960840 offenbaren das fluoreszierende Nukleosid 1,N⁶-Ethenoadenosin und dessen Verwendung als fluoreszierende Sonde.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis eines Ziel-Nukleotids in einer Probe, die Probe unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Oligonukleotid-Sonde, die mit dem Ziel spezifisch hybridisiert, in Kontakt zu bringen und eine Hybridisierung nachzuweisen, indem eine Fluoreszenz oder eine Änderung der Fluoreszenz beobachtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde ein fluoreszierendes Nukleosid anstelle von einem beliebigen der sechs üblicherweise vorkommenden nicht-fluoreszierenden Nukleoside umfasst.
Bei einer Verwendung der Erfindung kann die Fluoreszenz der Oligonukleotid-Sonde als ein diagnostisches Hilfsmittel verwendet werden, um spezifische Gensequenzen nachzuweisen und zu identifizieren. Diese Methodik unterscheidet sich von anderen nicht-radioaktiven Methoden zum Nachweis von Sonden, indem sie keine Nukleotide einsetzt, die an Enzyme oder andere reaktive Proteine gekoppelt worden sind, und keine Weiterbehandlung nach der Hybridisierung für den Nachweis einer Hybridisierung erfordert.
Für eine Verwendung im Rahmen der Erfindung weisen fluoreszierende Strukturanaloga der üblicherweise vorkommenden Nukleoside und deren Derivate, die bei der Synthese, Markierung und dem Nachweis von Oligonukleotiden nützlich sind, die Strukturformeln der 5–11 auf. Die üblicherweise vorkommenden Nukleoside bilden in charakteristischer Weise Wasserstoffbrükkenbindungen in einer speziellen Donor/Akzeptor-Beziehung, die als Watson-Crick-Basenpaarung bezeichnet wird, wie in 4 gezeigt. Wo sinnvoll, werden spezielle fluoreszierende Nukleosidanaloga bereitgestellt, die in der Lage sind, das Muster der Watson-Crick-Wasserstoffbrückenbindungsbildung analog zu jenem eines speziellen üblicherweise vorkommenden Nukleosids zu reproduzieren, z. B. wie für A:T und Formycin: T in 4 durch die Donor/Akzeptor-Muster angegeben.
Unter einem noch anderen Aspekt werden Verfahren zum Synthetisieren und zur Verwendung von Polynukleotid-Sonden unter Verwendung von einem oder mehreren der fluoreszierenden Strukturanaloga und/oder von deren derivatisierten Formen bereitgestellt. Solche Sonden können verwendet werden, um eine Probe zu screenen, die eine Mehrzahl von einzelsträngigen oder doppelsträngigen Polynukleotidketten enthält, und werden die gewünschte Sequenz, sofern sie vorhanden ist, durch Hybridisierung markieren, nachweisen und identifizieren. Es ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung, dass die fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden im Rahmen von „Lösungshybridisierungs"-Methoden, wie in den 12 bis 18 gezeigt, verwendet werden können.
Gemäß den vorangegangenen Gegenständen umfasst die Erfindung aus sich selbst heraus fluoreszierende Nukleoside, die verwendet werden können, um daraus hergestellte Oligonukleotide zu markieren, zu modifizieren oder zu identifizieren, die Verwendungen von solchen aus sich selbst heraus fluoreszierenden Oligonukleotiden als Hybridisierungssonden und Verfahren zum Nachweisen von Nukleotidsequenzen.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die stabile Fluoreszenzemission der Fluorophore und Verwendung von zeitaufgelöster Spektroskopie oder Photonenzählung, um die Menge eines Fluorophors, die in einer Probe vorhanden ist, nachzuweisen und zu quantifizieren.
Zusätzliche Formeln, Vorteile, Verwendungsmethoden und neue Merkmale der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung erläutert und werden den Fachleuten auf diesem Gebiet nach einer Überprüfung des Folgenden zum Teil ersichtlich oder können durch praktische Ausführung der Erfindung erlernt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die sechs üblicherweise vorkommenden N-Nukleoside, die in DNA und RNA vorherrschen.
2 zeigt die allgemeinen Strukturen der üblicherweise vorkommenden N-Nukleoside und deren Derivatisierungsstellen, R_n.
3 zeigt die allgemeine Struktur des Furanoserings von sowohl den Purin- als auch Pyrimidinnukleosiden und die üblichen Stellen, R_n, für eine Derivatisierung.
4 zeigt die Watson-Crick-Basenpaarung zwischen den normalerweise vorkommenden N-Nukleotiden A:T und G:C und die Ba senpaarung zwischen Formycin: T, Formycin: U, 2,6-Diaminopurin: T und 5-Aminoformycin B:C.
5 zeigt Strukturanaloga der üblicherweise vorkommenden N-Nukleoside, die aus biologischen Quellen abgeleitet worden sind.
6 zeigt die Pyrazolo-[4,3d]-pyrimidinnukleosidanaloga.
7 zeigt die Pyrazolo-[3,4d]-pyrimidinnukleosidanaloga.
8 zeigt die Pyrazolo-[1,5a]-1,3,5-triazinnukleosidanaloga.
9 zeigt die Azapyrimidin- und Azapurinnukleosidanaloga.
10 zeigt die Deazapyrimidin- und Deazapurinnukleosidanaloga.
11 zeigt Beispiele von einigen fluoreszierenden Strukturanaloga, die (I) nicht-H-bindend und (II) Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Analoga sind.
12 ist ein Diagramm einer symmetrischen RNR-Synthese unter Verwendung von FTP oder ATP.
13 ist ein Diagramm einer Promotor-gesteuerten asymmetrischen RNA-Sondensynthese unter Verwendung von viralen Promotoren und viralen RNA-Polymerasen.
14 ist ein Diagramm, das ein Beispiel der Methode einer Einschritt-Markierung von ssDNA, die an der EcoRI-Stelle von pUC/M13-Plasmidvektoren und unter Verwendung von dF₁₀₅ insertiert wird, zeigt.
15 ist ein Diagramm, das die Notwendigkeit zeigt, asymmetrische DNA- oder RNA-Sonden für eine schnelle und quantitative Hybridisierung der Sonde an Ziel-DNA zu verwenden. Wie gezeigt, ermöglichen asymmetrische Sonden signifikante Zunahmen bei den Hybridisierungseffizienzen im Vergleich zu symmetrischen Sonden.
16 ist ein Diagramm, das die Umwandlung des Ribonukleotidanalogs Formycin A in dessen 2'-Desoxytriphosphat- oder Phosphoramidit-Formen zeigt.
17 ist ein Diagramm eines Nachweises einer Ziel-DNA-Sequenz bei einer Hybridisierung von genomischer DNA mit fluoreszierenden Sonden.
18 ist ein Diagramm eines Nachweises eines amplifizierten DNA-Abschnitts durch in Lösung erfolgende Hybridisierung einer fluoreszierenden Sonde.
19 zeigt ein Flussdiagramm, dass diagrammartig das Trennschema darstellt, das verwendet wurde, um Reaktionsprodukte von nicht umgesetzten Reagenzien nach der enzymatischen Substitutionsreaktion von ATP gegen FTP in,RNA-Sonden abzutrennen.
20 zeigt ein Schema des Mechanismus zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit durch die Verwendung eines Sonden„Cocktails", der eine Mehrzahl von Sonden von unterschiedlichen Sequenzen enthält.
Die 21A, 21B und 21C zeigen spezielle fluoreszierende Nukleosidanaloga, die hinsichtlich ihrer Klasse, Struktur, chemischen Bezeichnung, Absorptionsspektren, Emissionsspektren und Syntheseverfahren identifiziert und charakterisiert worden sind.
Kurze Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO. 1 ist ein erfindungsgemäßes synthetisches Oligonukleotid.
SEQ ID NO. 2 ist ein synthetisches Oligonukleotid und die komplementäre Sequenz zu SEQ ID NO. 1.
SEQ ID NO. 3 ist ein synthetisches Oligonukleotid und ein fluoreszierendes Analog von SEQ ID NO. 2.
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
Offenbart und beansprucht werden Verfahren zur Verwendung der fluoreszierenden Nukleoside in beispielsweise Nukleinsäuresonden und diagnostischen Kits. Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht sich auf die Verwendung von aus sich selbst heraus fluoreszierenden Nukleosidanaloga bei der chemischen und enzymatischen Synthese von DNA-Hybridisierungssonden, einschließlich einer Festphasensynthese, Matrizen-gesteuerten enzymatischen Polymerisation und Amplifizierung unter Verwendung von Polymerasekettenreaktionsmethoden. Eine andere Ausführungsform betrifft die Verwendung von selbstfluoreszierenden DNA-Hybridisierungssonden bei der Identifizierung von speziellen DNA-Sequenzen, z. B. Genkartierung und den Nachweis und die Diagnose von Infektionskrankheiten und genetisch bedingten Krankheiten.
Offenbart werden Nukleosidanaloga, die fluoreszierend sind und die natürlich vorkommende Nukleoside bei der Synthese von Oligonukleotid-Sonden ersetzen können. Bei einer Verwendung als Hybridisierungssonden kann die Fluoreszenz von solchen Oligonukleotiden bei verschiedenen Prozeduren, um spezielle Gensequenzen nachzuweisen und zu identifizieren, verwendet werden. Diese Methodik unterscheidet sich von anderen nicht-radioaktiven Methoden zum Nachweis von Sonden dahingehend, dass sie keine Nukleotide einsetzt, die an Enzyme oder andere reaktive Proteine gekoppelt worden sind. Folglich werden hier Anwendungen von aus sich selbst heraus fluoreszierenden Nukleosidanaloga bei der Entwicklung von Hybridisierungstechniken für automatisierbare klinische Routine-Diagnosen beschrieben.
Die fluoreszierenden Analoga gehören drei allgemeinen Typen an: (A) C-Nukleosid-Analoga (B) N-Nukleosid-Analoga und (C) N-Azanukleotid- und N-Deazanukleotidanaloga. Alle diese Verbindungen haben drei Merkmale gemein: 1) sie sind Strukturanaloga der üblichen Nukleoside, die in der Lage sind, natürlich vorkommende Nukleoside bei einer enzymatischen oder chemischen Synthese von Oligonukleotiden zu ersetzen; 2) sie sind von Natur aus fluoreszierend, wenn sie durch Licht der geeigneten Wellenlänge(n) angeregt werden, und erfordern keine zusätzlichen chemischen oder enzymatischen Prozesse für deren Nachweis; und 3) sie unterscheiden sich spektral von den Nukleosiden, die man in natürlich vorkommender DNA üblicherweise antrifft. Es sind mindestens 125 spezielle Verbindungen der Erfindung identifiziert worden. Diese Verbindungen, die hinsichtlich ihrer Klasse, Struktur, chemischen Bezeichnung, Absorptionsspektren, Emissionsspektren und Syntheseverfahren charakterisiert worden sind, sind tabellarisch aufgelistet, wie in den 21A–21C gezeigt.
Definitionen: Die folgenden Definitionen werden für ein leichtes Verständnis der Beschreibung angegeben:
„blicherweise vorkommende Nukleoside" sind die in 1 gezeigten sechs monomeren N-Nukleotide, die in natürlich vorkommender DNA und RNA vorherrschen, in eine klassische Watson-Crick-Basenpaarung eintreten und unter physiologischen Bedingungen effektiv nicht-fluoreszierend sind. Die jeweiligen Ein-Buchstaben-Symbole bei der Sequenz-Kurzschrift sind A, C, G, T, U und I für Adenosin, Cytidin, Guanidin, Thymidin, Uridin bzw. Inosin.
„Strukturanaloga" der üblicherweise vorkommenden Nukleoside sind strukturell verwandte Moleküle, die die normalen Purinoder Pyrimidinbasen nachahmen, indem ihre Strukturen (die Arten von Atomen und deren Anordnung) zu den üblicherweise vorkommenden Basen ähnlich sind, diese aber bestimmte Modifizie rangen oder Substitutionen aufweisen können, die die grundlegende biologische Aktivität oder biochemischen Funktionen nicht beeinflussen. Solche Basenanaloga umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Imidazol und dessen 2,4- und/oder 5-substituierte Derivate; Indol und dessen 2-, 3-, 4-, 5-, 6-und/oder 7-substituierte Derivate; Benzimidazol und dessen 3-, 4- und/oder 5-substituierte Derivate; Indazol und dessen 3-, 4-, 5-, 6- und/oder 7-substituierte Derivate; Pyrazol und dessen 3-, 4- und/oder 5-substituierte Derivate; Triazol und dessen 4- und/oder 5-substituierte Derivate; Tetrazol und dessen 5-substituierte Derivate; Benzotriazol und dessen 4-, 5-, 6-und/oder 7-substituierte Derivate; 8-Azaadenin und dessen substituierte Derivate; 6-Azathymin und dessen substituierte Derivate; 6-Azauracil und dessen substituierte Derivate; 5-Azacytosin und dessen substituierte Derivate; 8-Azahypoxanthin und dessen substituierte Derivate; Pyrazolopyrimidin und dessen substituierte Derivate; 3-Deazauracil; Orotsäure; 2,6-Dioxo-1,2,3,6-tetrahydro-4-pyrimidincarbonsäure; Barbitursäure; Harnsäure; Ethenoadenosin; Ethenocytidin; ein Allopurinol (4-Hydroxypyrazolo-[3,4d]-pyrimidin); oder deren geschützte Derivate, wie nachfolgend beschrieben. Basenanaloga können auch ein jegliches der C-Nukleoside, wie sie in den 4 und 5 gezeigt sind, in denen die normale C-N-Bindung zwischen der Base und dem Furanosering durch eine C-C-Bindung ersetzt ist, sein; solche Basen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Uracil, wie bei dem C-Nukleosid Pseudouridin; 1-Methyluracil; 1,3-Dimethyluracil; 5(4)-Carbomethoxy-1,2,3-triazol; 5(4)-Carboxamido-1,2,3-triazol; 3(5)-Carboxymethylpyrazol; 3(5)-Carbomethoxypyrazol; 5-Carboethoxy-l-methylpyrazol; Maleimid (in dem C-Nukleosid Showdomycin); und 3(4)-Carboxamido-4 (3)-hydroxypyrazol (in dem C-Nukleosid Pyrazomycin); und ein jegliches der anderen Analoga, die in den 5 bis 11 aufgelistet sind oder daraus gefolgert werden können; oder deren geschützte Derivate.
„Fluorophor" bezieht sich auf eine Substanz oder einen Abschnitt davon, die bzw. der in der Lage ist, Fluoreszenz in einem nachweisbaren Bereich zu emittieren. Für die fluoreszierenden Strukturanaloga der Nukleotide tritt diese Fluoreszenz typischerweise bei Wellenlängen vom nahen Ultraviolett (> 300 nm) bis hinein in die sichtbaren Wellenlängen auf. Die Fluoreszenz wird vorzugsweise bei Wellenlängen zwischen 300 nm und 700 nm und am meisten bevorzugt bei den sichtbaren Wellenlängen zwischen 300 nm und 500 nm auftreten.
„Fluoreszierende Strukturanaloga" sind synthetische oder biochemisch erzeugte monomere Strukturanaloga der sechs üblicherweise vorkommenden N-Nukleoside (1), wie sie in den 5 bis 11 gezeigt sind, die zu einer klassischen Watson-Crick-Basenpaarung in der Lage sein können oder nicht abhängig von der Struktur des Monomers und/oder dem Oligonukleotid, in dem sie verwendet werden, die aber spektral einzigartig sind und sich von den üblicherweise vorkommenden Nukleosiden unterscheiden in ihren Fähigkeiten zur selektiven Anregung und Emission unter physiologischen Bedingungen. Beispielsweise ist das C-Nukleosid Formycin A ein Strukturanalog von Adenosin, das äquivalente Donor/Akzeptor-Wasserstoffbrückenbindungen bilden kann, das aber ein Anregungsmaximum in Oligonukleotiden bei 303 nm und ein Emissionsmaximum bei 405 nm (Stokes-Verschiebung = 102 nm) aufweist.
„Derivatisierte" Nukleosidanaloga sind fluoreszierende Strukturanaloga, bei denen reaktive oder dem Schutz dienende funktionelle Gruppen kovalent oder auf andere Weise an den Positionen R₄ bis R₉ des Heterocyclus und/oder den Positionen R₁₀ (5' ), R₁₂ (3') und R₁₄ (2') der glycosidischen Gruppierung gebunden sind. Derivate an der glycosidischen 2'-Position können Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Akzeptoren oder – Donoren umfassen, die die aus sich selbst heraus erfolgende Fluoreszenzemission des fluoreszierenden Strukturanalogs selbst verstärken oder aufnehmen und bei längeren Wellenlängen erneut emittieren.
Ein „Polynukleotid", „Oligonukleotid" oder „Oligomer" ist eine Nukleotidkettenstruktur, die wenigstens zwei üblicherweise vorkommende Nukleotide oder fluoreszierende Strukturanaloga enthält. Die „fluoreszierende Oligonukleotid-Sonde" oder „fluoreszierende Hybridisierungssonde", die hier bereitgestellt wird, ist eine Nukleotidkettenstruktur, wie oben, die wenigstens zwei Monomere enthält, von denen wenigstens eines fluoreszierend ist.
„Hybridisierung" ist die paarweise erfolgende, auf Hybridisierung beruhende Aneinanderlagerung („annealing") durch Watson-Crick-Basenpaarung von zwei komplementären, einzelsträngigen Molekülen (siehe 4), die DNA : DNA, DNA : RNR oder RNA : RNA sein kann, und bei der die zwei Stränge aus unterschiedlichen Quellen stammen können. Die Aneinanderlagerung oder Hybridisierung ist spezifisch (i) für komplementäre Basenpaare, bei denen die Wasserstoffbrückenbindungsdonoren und -akzeptoren wie in 4 orientiert sind, und (ii) für die komplementäre genetische Sequenz des speziellen Gens, der Ziel-DNR oder Ziel-RNR (im Folgenden „Ziel-DNA/RNA"), an die die Sonde hybridisiert werden soll. Vergleiche beispielsweise das Wasserstoffbrückenbindungsmuster von Adenosin und Formycin (4)
„DNA/RNA-Schmelztemperatur" und „Tm" beziehen sich auf die Temperatur, bei welcher Wasserstoffbrückenbindungen zwischen hybridisierten Strängen von DNA oder RNA zerstört werden und die Stränge in einzelne Stränge dissoziieren, wodurch die Struktur des Doppelstrangs oder Hybrids zerstört wird.
„Analoge fluoreszierende Sequenz" bezieht sich auf die Nukleosidsequenz eines Polynukleotids, das durch eine beliebige der enzymatischen oder chemischen Methoden, die im Rahmen der Erfindung beschrieben werden, synthetisiert worden ist, bei der aber bestimmte üblicherweise vorkommende Nukleoside explizit durch fluoreszierende Nukleosidanaloga ersetzt worden sind, z. B. die Substitution von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) durch Formycin A-5'-triphosphat (FTP), wenn RNA-Polymerase verwendet wird, um RNR-Sonden zu produzieren, die zu einer vorgeschriebenen DNA-Matrize komplementär sind. Bei einer analogen fluoreszierenden Sequenz ist das fluoreszierende Nukleosidanalog in der Oligonukleotidkette durch Substitution an einigen oder allen Positionen eingefügt worden, an denen das entsprechende üblicherweise vorkommende Nukleotid in der Sequenz vorgekommen wäre, wie durch z. B. die Matrize im Falle einer enzymatischen Synthese vorgeschrieben wird. Ähnliche programmierte Substitutionen können unter Verwendung von 3'-O-Phosphoramiditen der individuellen fluoreszierenden Analoga während einer Standard-Phosphotriester-Synthese vorgenommen werden. Folglich können beispielsweise die komplementäre Sequenz des Chlamydia tracheomatis-MOMP-Gens oder dessen fluoreszierende analoge Sequenz enzymatisch unter Verwendung von dATP bzw. dFTP in Gegenwart von DNA-Polymerase, cCTP, dTTP und dGTP synthetisiert werden: MOMP-GENSEQUENZ (SEQ ID NO. 1):
KOMPLEMENTÄRE SEQUENZ (SEQ ID NO. 2):
ANALOGE FLUORESZIERENDE SEQUENZ (SEQ ID NO. 3):
wobei die in der analogen Sequenz unterstrichenen fluoreszierenden Desoxyformycin A (F)-Reste die Strukturanaloga der Desoxyadenosin (A)-Reste in den gleichen relativen Positionen in der komplementären Sequenz sind.
„FRET-Akzeptor" oder „Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Akzeptor" bezieht sich auf eine Substanz, einen Substituenten, ein Chromophor oder Fluorophor, z. B. eine Dansyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Pyrenyl-, Methylumbelliferon- oder Cumaringruppierung, die, der bzw. das in der Lage ist, von fluoreszierenden Strukturanalog-Donoren emittiertes Licht zu absorbieren und jene Energie bei anderen, längeren Wellenlängen erneut zu emittieren. Im Kontert der vorliegenden Erfindung können solchen sekundären Fluorophore selektiv als eine zweite Markierung angeregt werden oder können als Fluoreszenz-Akzeptor verwendet werden, um die primäre Fluoreszenz des Strukturanalog-Energiedonors zu verbreitern und zu verstärken.
A. Strukturen, Quellen, Synthese und Derivatisierung der fluoreszierenden Nukleosidanaloga
Kurz zusammengefasst, umfasst die Erfindung die heterocyclischen Pyrimidin- oder Purin-Strukturanaloga der üblicherweise vorkommenden Nukleosidbasen (B), die unter physiologischen Bedingungen fluoreszierend sind und die durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff- oder Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung an den Satz von Furanoseringen (in den 4–9 als F bezeichnet) von Ribose (R₁₂=R₁₄=OH) , Desoxyribose (R₁₂=H, R₁₄=OH oder R₁₂=OH, R₁₄=H) oder Didesoxyribose (R₁₂=R₁₄=H) und deren Derivaten gebunden sind, wie nachfolgend beschrieben und/oder wie sie für eine Person, die mit der Nukleotidchemie vertraut ist, offensichtlich sind.
Für die Erfindung werden Formycin, 2-Aminopurinribonukleosid und 2,6-Diaminoribonukleosid, von denen alle (i) die gleichen oder verwandte Basenpaarungs-Wasserstoffbrückenbindungen wie Adenosin bilden und (ii) Adenosin spezifisch bei einer Watson-Crick-Basenpaarung wie auch bei einer großen Vielzahl von enzymatischen Reaktionen, einschließlich Nukleinsäurereplikation, -ligation und -phosphorylierung, ersetzen können, als repräsentative Beispiele des Satzes von fluoreszierenden Nukleo siden und Nukleosidanaloga (4) verwendet. Damit in Zusammenhang stehende Eigenschaften und parallele Ansprüche gelten im Rahmen der Erfindung für alle anderen fluoreszierenden Analoga von Guanosin, Cytidin, Thymidin, Uridin, Inosin und deren Derivate.
1. Strukturen der Nukleosidanaloga.Die generischen Purin- und Pyrmidinstrukturen von jedem Typ von Strukturanalog zu den üblicherweise vorkommenden Nukleosiden sind oben auf jeder der 5 bis 11 angegeben, worunter sich repräsentative Beispiele von jeder Analog-Klasse befinden. In den 6 und 7 sind lediglich Beispiele der Purinanaloga angegeben, da die bekannten Pyrimidinanaloga bereits in 5 veranschaulicht worden sind. Mit Ausnahme der N-Nukleosidanaloga, die lediglich Substitutionen an R₄, R₆ und R₉ aufweisen, zeigen die generischen Strukturen oben auf jeder Seite ein Oval, das den Teil der Struktur einkreist, wo Substitutionen an der heterocyclischen Base das Analog von den üblicherweise vorkommenden N-Nukleosiden, die in 1 gezeigt sind, unterscheiden.
2. Furanosegruppierungen, die den fluoreszierenden Nukleosidanaloga gemein sind.
Die Numerierung der Zucker-Kohlenstoffatome in Furanose ist 1' bis 5' ist in 2 angegeben, folglich ist die Base B an das C1 des Zuckers gebunden. Die Furanosegruppierung eines jeglichen fluoreszierenden Heterocyclus, der im Rahmen dieser Erfindung beansprucht wird, hat mit allen anderen Analoga den Satz F von Glycosiden und substituierten Glycosiden, wie folgt, gemein: im Prinzip können Substitutionen an einem jeglichen der 5 Zucker-Kohlenstoffatome vorgenommen werden; die Untergruppe F wird durch Derivate und/oder Substitutionen an den Positionen R₁₀,R₁₁, R₁₂, R₁₃ und R₁₄, die (i) den Fachleuten auf diesem Gebiet offensichtlich sind und (ii) die Furanosylderivate von allen fluoreszierenden Nukleosidanaloga, die im Rahmen dieser Erfindung beansprucht werden, sind, definiert. Diese umfassen alle Phosphor-Substitutionen (z. B. Triphosphat, Thiophosphat, Aminophosphat u. s. w.) und alle dem Schutz dienenden Substitutionen (z. B. Dimethoxytrityl) an der Position R₁₀. Für alle Glycoside F in den 5 bis 11 sind R₁₀, R₁₁ R₁₂, R₁₃ und R₁₄, wie folgt, definiert: R₁₁ und R₁₃ = H; R₁₄ = H, OH oder OR_i; R₁₂ und R₁₀ sind entweder H, OH, OR_m oder NHR_k, wobei (a) R_i-Schutzgruppen typischerweise Niederaryl- oder -al-kylether, z. B. Methyl, tert.-Butyl, Benzyl, o-Nitrobenzyl, p-Nitrobenzyl, o-Nitrophenyl oder Triphenylmethyl; oder ein Niederalkyl- oder -arylester, wie Acetyl, Benzoyl oder p-Nitrobenzoyl, oder ein Alkyl; Acetal, wie Tetrahydropyranyl; oder ein Silylether, wie Trimethylsilyl oder tert.-Butyldimethylsi-lyl; oder ein Sulfonsäureester, wie p-Toluolsulfonyl oder Methansulfonyl; oder Halogenid, wie Brom, Fluor oder Iod, sind. Zusätzliche Beispiele von geeigneten Blockierungsgruppen können in Green, T. W. (1981) Protective Groups in Organic Synthesis, New York: Wiley & Sons., gefunden werden. Alternativ kann R ein FRET-Derivat sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf solche Fluorophore, wie 7-[3-(Chlordimethylsi-1y1)propoxy]-4-methylcumarin, O-4-Methylcumarinyl-N-[3-triethoxysilyl)propylcarbamat und N-3-Triethoxysilylpropyl)dansylamid; (b) Rm für eine geeignete dem Schutz dienende, substituierende oder reaktive Linkergruppe, einschließlich 2'- oder 3'-Amido, 2'- oder 3'-Azido, 2',3'-ungesättigt, und die Untergruppe von Phosphor-Derivaten, die an chemischen oder enzymatischen Synthesen von Oligonukleotiden mit einer Phosphatester-, Thiophosphatester- oder Aminophosphatester-Hauptkette beteiligt sind, steht; (c) R_k eine jegliche geläufige, Standard-Stickstoffschutzgruppe ist, wie jene, die in der Peptidchemie gewöhnlich verwendet werden (Geiger, R., W. Konig [1981] in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Band 3, E. Gross, J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, New York, S. 1–99); dies umfasst, ist aber nicht beschränkt auf säurelabile Schutzgruppen, wie Formyl, tert.-Butyloxycarbonyl, Benzyloxy carbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, Furfuryloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, 2-Phenylpropyl-(2)oxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)propyl-(2)-oxycarbonyl, Triphenylmethyl, p-Anisyldiphenylmethyl, Di-p-anisyldiphenylmethyl, 2-Nitrophenylsulfenyl oder Diphenylphosphinyl; basenlabile Schutzgruppen, wie Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl,4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl und 2-Cyan-tert.-butyloxycarbonyl; wie auch andere, wie Chloracetyl, Acetoacetyl, 2-Nitrobenzoyl, Dithiasuccinoyl, Maleoyl, Isonicotinyl, 2-Bromethyloxycarbonyl und 2,2,2-Trichlorethyloxycarbonyl; alternativ kann Rk auch eine jegliche reaktive Gruppe, die mit einer detektierbaren Markierung derivatisierbar ist (NH₂, SH = 0, und welches eine optionale Verbindungsgruppierung umfassen kann, einschließlich einer Amid-, Thioether- oder Disulfid-Verbindung, oder eine Kombination davon mit zusätzlichen variablen reaktiven Gruppen R₁ bis R₃, wie R₁-(CHz)_x-R₂, wobei x eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 einschließlich ist; und R₁, R₂ und R₃ H, OH; Alkyl, Acyl, Amid, Thioether oder Disulfid sind), oder ein jeglicher Linker oder Abstandshalter, der als ein homodifunktionaler oder heterodifunktionaler Linker wirkt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf solche reaktiven Gruppen, wie Hydrazide, Maleimidazole, oxidierbare Diole und Succinimidylgruppen, sein. Es kann höchstens einer von R₁₂ und R₁₀ NHRk sein.
Es wird Bezug genommen auf Phosphoramidite mit der Formel:
worin B ein beliebiges der hier beschriebenen fluoreszierenden Nukleosidanaloga ist und R₁₀ R₁₁ R₁₁ R₁₂ wie für den Satz von Glycosiden F, wie oben, definiert sind und R₁₄ entweder H oder OH sein kann. R₁₆ = Niederalkyl, bevorzugt Niederalkyl, wie Methyl oder Isopropyl, oder heterocyclisch, wie Morpholino, Pyrrolidono oder 2,2,6,6-Tetramethylpyrrolidono; R₁₅ = Methyl, p-Cyanethyl, p-Nitrophenyl, o-Chlornitrophenyl oder p-Chlorphenyl. Alle anderen Gruppen R sind wie zuvor, einschließlich jenen, die für Spacer- oder Linkerarme von 1 bis 25 Kohlenstoffatomen Länge stehen, Vor der Synthese des Phosphoramidits an R₁₂ kann, um (i) jegliche reaktiven Substituenten an dem Heterocyclus, die für dessen Teilnahme an Watson-Crick-Basenpaarungen wichtig sind, zu bewahren und (ii) das Rmidit mit der DNA- oder RNA-Kettenzusammenbau-Chemie verträglich machen, die Basengruppierung B in dem Phosphoramidit geschützt werden, was im allgemeinen eine Acylierung oder Amidierung der exocyclischen Aminogruppen umfasst, und umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Acetyl, Benzoyl, Isobutryl, Succinyl, Phthaloyl oder p-Anisoyl; solche Amidingruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Dimethylformamidin, Di-nbutylformamidin oder Dimethylacetamidin; wenn B mit anderen reaktiven Gruppen, wie Carboxyl, Hydroxyl oder Mercapto, substituiert ist, werden diese ebenso in geeigneter Weise geschützt.
Die Erfindung umfasst die Synthese von Oligonukleotiden an einem Festphasen-Träger, wobei das Oligomer umgesetzt wird mit den geschützten fluoreszierenden Nukleosidanalog-Phosphoramiditen, wie in den 5 bis 11 veranschaulicht und derivatisiert wie in der obigen Struktur. Zusätzlich umfasst die Erfindung die neuen fluoreszierenden Oligonukleotide, in deren Sequenzen wenigstens ein als Phosphoramidit in der obigen Struktur derivatisiertes fluoreszierendes Nukleosidanalog, enthalten ist. Darüber hinaus besteht noch ein anderer Aspekt der Erfindung darin, fluoreszierende Oligonukleotide bereitzustellen, die durch die Umsetzungen der vorerwähnten fluoreszierenden Analog-3'-O-phosphoramidite, die an einen festen Träger gebunden werden oder durch einen solchen gebunden worden sind, hergestellt werden.
2. Quellen und andere Herstellungsmöglichkeiten für die fluoreszierenden Strukturanaloga. Formycin A wird als Ribonukleotid aus den Kulturbrühen von Nocardia interforma isoliert. Das Antibiotikum wird auch aus Kulturbrühen von Streptomyces lavendulae und Streptomyces gummaensis isoliert und ist eines von zahlreichen mikrobiellen C-Ribonukleosid-Analoga der N-Nukleoside, die in RNA aus allen Quellen üblicherweise gefunden werden. Die anderen natürlicherweise vorkommenden C-Ribonukleoside, die aus Mikroorganismen isoliert worden sind (5), umfassen Formycin B, Oxoformycin B, Pseudouridin, Showdowmycin, Pyrazomycin und Minimycin. Formycin A, Formycin B und Oxoformycin B sind C-Nukleoside oder Pyrazolopyrimidinnukleoside der in 6 gezeigten Klasse 'und sind Strukturanaloga von Adenosin, Inosin bzw. Hypoxanthin; über ein Pyrazopyrimdin-Strukturanalog von Guanosin, das aus natürlichen Quellen erhalten wird, ist in der Literatur nicht berichtet worden, kann aber chemisch ausgehend von 2-Chlorformycin B oder dessen Desoxy-Form synthetisiert werden. Eine sorgfältige Übersicht über die Biosynthese dieser Verbindungen steht in Ochi et al. (1974), J. Antibiotics xxiv: 909–916, zur Verfügung. Die Synthese der N₄- und N₆-Derivate der C-Nukleoside ist in Lewis und Townsend ([1980] J. Am. Chem. Soc. 102: 2817) beschrieben. Entsprechende Synthesen für die isomeren Aminopyrazolo-[3,4d]-pyrimidine finden sich in Wierchowski et al. (alle anderen sind in Ribose- und mehrere in Desoxy- und Didesoxy-Formen kommerziell erhältlich, einschließlich der Azanukleotide und Deazanukleotide, oder können de novo synthetisiert werden, z. B. 7-Deazaadenin (Gerster et al. [1967] J. Med. Chem. 10: 326)). C-Nukleosidanaloga der Pyrazolo-s-triazin-Klasse (z. B. Pyrazolo-[1,5a]-1,3,5-triazin) wurden ausgehend von Aminopyrazol-C-Nukleosid hergestellt, wie ursprünglich beschrieben (Fox et al. [1976] J. Heterocycl. Chem. 13: 175).
Produktion der Desoxy-, Didesoxy- und phosphorylierten Formen der fluoreszierenden Ribonukleosidanaloga. In der Literatur stehen chemische Synthesen für die Derivatisierung als 2'-Desoxy-Formen und 3'-Desoxy-Formen von N-Nukleosiden, Ethenonukleosiden wie auch C-Nukleosiden zur Verfügung (Robins et al. [1973] Can. J. Chem. 51: 1313; Jain et al [1973] J. Org. Chem. 38: 3719; DeClerq et al. [1987] J. Med. Chem. 30: 481). Ähnliche Verfahren bestehen für die Desoxy-Formen der Azanukleotide, Deazanukleotide und werden in den gleichen oder zusätzlichen Quellen (z. B. Robins et a1. [1977] Can. J. Chem. 55: 1251; DeClerq et al. a. a. O.) gefunden. Protokolle und Vorgehensweisen für die Synthese der 3'-Azido-, 3'-Amino-, 2',3'ungesättigten und 2',3'-Didesoxy-Analoga sind wie berichtet (Lin et al. [1987] J. Med. Chem. 30: 440; Serafinowski, P. [1987] Synthesis 10: 879). Das Schützen oder die Derivatisierung des 2'-OH mit Silyl- oder FRET-Gruppierungen kann erfolgen wie bei Peterson und Anderson ([1989] Silicon Compounds: Register and Review, Petrarch Systems, Inc., 5. 60–70).
Hier wird über die neue Anwendung eines cyclischen Schutzverfahrens aus der Umwandlung von Ribose zu Desoxyribose von C-Nukleosiden berichtet, durch welche nur die 2'-Desoxy-Form des Analogs hergestellt wird und mittels welcher hohe Ausbeuten erhalten werden können ohne die schwierige Reinigung, die erforderlich ist, um die zwei Isomere zu trennen, die unter Verwendung der Acetoxyisobutyrylhalogenid-Verfahren, die oben aufgeführt worden sind, hergestellt werden.
Für enzymatische Synthesen können Mono- und Triphosphat-Formen der Nukleosidanaloga durch enzymatische Phosphorylierung mit z. B. Polynukleotidkinase unter Verwendung von etablierten Vor gehensweisen, oder durch chemische Phosphorylierung hergestellt werden. Im allgemeinen werden die 5'-Monophosphate chemisch durch POCl₂ hergestellt (Smith und Khorana [1958] J. Am. Chem. Soc. 80: 1141; Yoshikawa et al. [1967] Tetrahedron Lett. 5095). Die entsprechenden Triphosphate können gemäß denselben Autoren oder Michelson ([1964] Biochim. Biophys. Acta 91: 1) oder Hoard und Ott ([1965] J. Am. Chem. Soc. 87: 1785) chemisch synthetisiert werden. D. h., die Monophosphate werden mit Carbodiimid (CDI), gefolgt von Tributylammoniumpyrophosphat, behandelt, wodurch die triphosphorylierte Form erhalten wird. Wenn gewünscht wird, Analoga mit exponierten Aminogruppen zu phosphorylieren, können solche Substituenten durch Behandlung mit Ethyltrifluorthioacetat gemäß der Vorgehensweise von Thayer et al. ([1974] Biochem. J. 139: 609) thioacetyliert werden.
B. Synthese von fluoreszierenden Oligonukleotiden
Die Erfindung präsentiert Synthesemethoden für das Einführen von einem oder mehreren der fluoreszierenden Nukleosidanaloga der üblicherweise vorkommenden Nukleotide in synthetische Oligonukleotide.
1. Verwendung von fluoreszierenden Phosphoramiditen. Fluoreszierende Phosphoramidite können ausgehend von Ribose- und Desoxyribose-Monomeren der fluoreszierenden Nukleosidanaloga hergestellt werden. Gemäß der Erfindung werden fluoreszierende Reste in chemisch synthetisierte Oligonukleotide eingeführt, indem zuerst das geschützte 3'-O-Phosphoramidit eines Nukleosidanalogs hergestellt wird, z. B. 2'-Desoxyformycin A; das entsprechende Standard-Phosphoramidit, in diesem Falle Desoxyadenosin-3'-O-phosphoramidit, wird dann durch dieses Phosphoramidit ersetzt und dieses mit dem Oligonukleotid, das an einem festen Träger unter Verwendung einer chemischen Standard-Phosphotriestersynthese synthetisiert wird, umgesetzt.
Die β-Cyanethyl-Derivate können selektiv an einer jeglichen gewünschten Position in einem chemisch synthetisierten Oligonu kleotid insertiert werden, wodurch Oligomere von vorgeschriebenen Sequenzen von 60 oder mehr Basen Länge, und die eine beliebige vorher festgelegte Anzahl von fluoreszierenden Basen tragen, hergestellt werden.
Es wurden beispielsweise nicht-selbsthybridisierende Oligonukleotide synthetisiert, die die perfekt alternierenden Sequenzen [AC]_x und [FC]_x aufwiesen, wobei x die Anzahl von AC- und FC-Dimerpaaren ist und x Werte von x = 10, 15, 20, 25, 30 hatte, die nahezu identische Werte für die Ausbeuten sowohl der repetitiven (> 98%) als auch der Gesamt-Synthese ergaben und Oligomere produzierten, die sich nur darin unterschieden, dass [FC]x fluoreszierend war, wohingegen [AC]_x dies nicht war. Beide Oligomere hybridisierten spezifisch mit komplementären al-ternierenden Oligomeren der Sequenz [TG]_x, aber nicht mit sich selbst oder mit nicht-komplementären Sequenzen, wie [AG]_x und [TC]_x, wie durch (i) Ethidiumbromidanfärbung in Agarosegelen und (ii) das Schmelzverhalten der Hybride angezeigt wird. Äquivalente Werte der Schmelzübergangstemperaturen in 0,075 M NaCl für die [FC]_x: [TG]_x- und [AC]_x: [TG]_x-Hybride variierten für einen gegebenen Wert von x (Länge des Oligonukleotids) um weniger als 1°C. Ein Aspekt der Erfindung umfasst speziell die Synthese von 3'-O-Phosphoramiditen der fluoreszierenden Nukleotide und von deren fluoreszierenden Strukturanaloga, die Verwendung von Amiditen, um stark fluoreszierende Oligonukleotide mit vorgeschriebenen Sequenzen zu synthetisieren, und die Verwendungen von solchen Oligonukleotiden als Amplifizierungsprimer, fluoreszierende Oligonukleotid-Markierungen oder -„tags" und Hybridisierungssonden.
2. Verwendung von fluoreszierenden Polyribonukleotiden und Polydesoxyribonukleotiden. Fluoreszierende Polyribonukleotide und Polydesoxyribonukleotide mit vorgeschriebenen Sequenzen können enzymatisch unter Verwendung von DNA-Matrizen aus verschiedenen Quellen, einschließlich jenen, die durch chemische Synthese, Klonierungstechniken hergestellt oder ausgehend von genomischer RNA erhalten worden sind, synthetisiert werden. Repräsentative Synthesen von RNA-Oligonukleotiden unter Verwendung von drei derartigen DNA-Matrizen, E. coli-RNA-Polymerase, den rNTPs Cytidin, Uridin und Guanosin zusammen mit dem Ribosetriphosphat von entweder Formycin A oder Adenosin, sind in 12 veranschaulicht. Eine repräsentative asymmetrische Synthese einer RNA-Sonde unter Verwendung einer Matrize, die richtungsabhängige (direktionale) virale Promotoren trägt, den viralen RNA-Polymerasen, den rNTPs Cytidin, Uridin und Guanosin zusammen mit dem Ribosetriphosphat von entweder Formycin A oder Adenosin ist in 13 veranschaulicht. Symmetrische Polydesoxyribonukleotide sind hergestellt worden, indem in Standard-DNA-Polymerasesynthesen und bei DNA-Amplifizierungen unter Verwendung von thermostabilen DNA-Polymeraseenzymen und der Polymerasekettenreaktion Desoxyadenosintriphosphat (dATP) durch 2'-Desoxyformycin A-5'-triphosphat (FTP) ersetzt wurde; die entsprechenden asymmetrischen Synthesen wurden unter Verwendung der gleichen Reagenzien und Vorgehensweisen, aber mit den folgenden Modifizierungen erzielt: (i) Synthesen unter Verwendung einer solchen DNA-Polymerase, wie Klenow-Fragment oder modifizierte T7-DNA-Polymerase, setzten eine Matrize ein, in die eine Primerstelle, wie die M13-Vorwärtsprimer-Sequenz, in einen Strang eines Doppelstrangs am Beginn der Sequenz, die als Matrize verwendet werden sollte, eingebaut worden war, und der entsprechende Primer wurde verwendet, um alle Synthesen zu initiieren; (ii) Primer, die komplementär zu nur einem Strang einer Matrize waren, wurden bei der Amplifizierung verwendet, wie bei asymmetrischer PCR gewöhnlich beschrieben wird; oder (iii) paarweise vorliegende Primer, bei denen einer von jedem Paar von Primern an einen Linker, wie Biotin, gekoppelt war, wurden bei Standard-DNA-Amplifizierungen, wie PCR, verwendet, aber ein Strang wurde präferentiell durch nachfolgende Isolierung entfernt, wie durch die Verwendung einer avidinylierten Säule oder von ma gnetischen Körnchen („beads"). Vergleichbare Synthesen können durch andere Substitutionen erfolgen, einschließlich z. B. den fluoreszierenden N-Nukleosiden, 2-Aminopurin und 2,6-Aminopurin (die ebenfalls Adenosin-5'-triphosphat ersetzen) und einem der fluoreszierenden C-Nukleosidtriphosphate von Formycin B oder 5-Aminoformycin B (die Inosintriphosphat bzw. Guanosintriphosphat ersetzen) in entweder deren Ribose- oder Desoxyribose-Formen.
C. Markierung von fluoreszierenden Polynukleotiden
RNA und DNA können durch mehrere Methoden enzymatisch markiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf (i) 5'-DNA-Endmarkierung unter Verwendung von sowohl der Vorwärts-Phosphorylierungsreaktion (Richardson, C. C. [1965] PNAS 54: 158) als auch der Austauschkinasereaktion (Van de Sande et al. [1973] Biochemistry 12: 5050); (ii) Markierung mittels gemischter Primer durch Verlängern von Hexanukleotiden gemischter Sequenz, die an Restriktionsfragmente durch Hybridisierung angelagert werden (Feinberg, A., B. Vogelsein [1983] Anal. Biochem. 132: 6; Feinberg, A., B. Vogelstein [1984] Anal. Biochem. 137: 266); (iii) 3'-DNA-Endmarkierung unter Verwendung des Enzyms terminale Desoxynukleotidyltransferase, um die repetitive Addition (Okayama et al. [1987] Methods Enzymol. 154: 3; Heidecker, G. J. Messing [1987] Methods Enzymol. 154: 28), von Mononukleotid-Einheiten der Desoxytriphosphate oder einzelne Additionen von Desoxytriphosphaten, von mehreren der fluoreszierenden Nukleosidanaloga an das terminale 3'-Hydroxyl von DNA-Initiatoren zu katalysieren, einschließlich nicht-fluoreszierenden Sonden von vorgeschriebener Sequenz, z.B, der Chlamydia trachomatis-MOMP-Gensonde, die wie nachfolgend beschrieben, synthetisiert wurde; (iv) Ligase-Markierung, bei der nicht-fluoreszierende „mit kohäsiven oder klebrigen Enden versehene" („sticky-ended") oder „geschnittene" („nikked") RNA- oder DNA-Oligonukleotide markiert werden durch Ligation mit den geeigneten fluoreszierenden RNA- oder DNA- Oligomeren (Pharmacia LKB [1989] Analects 17.2; Helfman, D. M. [1987] Methods Enzymol, 152: 343); (iv) Nick-Translation, bei der DNA-Polymerase verwendet wird, um die Triphosphate der fluoreszierenden Analoga zufallsgesteuert in einen existierenden DNA-Strang in einem Doppelstrang einzubauen (Meinkoth, J., G. M. Wahl [1987] Methods Enzymol. 152: 91).
D. Charakterisierung von fluoreszierenden Oligonukleotiden mit vorgeschriebenen Sequenzen
Es wurden Hybridisierungs-, thermisches Schmelzen-, Agarosegel-Charakterisierungs- und Fluoreszenznachweis-Untersuchungen verwendet, um Oligonukleotide mit vorgeschriebenen Sequenzen zu charakterisieren. In einigen Fällen waren die fluoreszierenden Oligonukleotide komplementär zu bekannten Sequenzen von Ziel-DNA aus klinisch bedeutenden Pathogenen oder Mutationen, z. B. der M0MP-Gensequenz aus Chlamydia trachamatis. Bei diesen Untersuchungen waren die für eine enzymatische Synthese der fluoreszierenden Oligonukleotide verwendeten Matrizen die klonierten Fragmente, die auch für eine spätere Verwendung als Ziel-DNA bei nachfolgenden Hybridisierungsuntersuchungen bestimmt waren. Eine Hybridisierung der Oligonukleotide mit Ziel-DNR führt zu einem Quenchen der Fluoreszenz der Strukturanaloga in einer fluoreszierenden Sonde, welche Fluoreszenz nach Denaturierung des Hybrids wiederhergestellt wird, wodurch bewiesen wird, dass eine Hybridisierung stattgefunden hat. Die Selbsthybridisierung des synthetischen Oligonukleotids Po-ly(rFrU), die nachfolgend ausführlich diskutiert wird, ist repräsentativ für die Ergebnisse, die in solchen Experimenten erhalten wurden, und ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren umfasst vier grundlegende Schritte. Zu Beginn werden die fluoreszierenden Strukturanaloga chemisch oder biologisch synthetisiert und, wo geeignet, weiter derivatisiert, wie erforderlich, um eine fluoreszierende Oligonukleotid-Sonde zu synthetisieren. Als zweites wird ein DNA- oder RNA-Sondenmolekül, das zu einer Nukleinsäureprobe von Interesse komplementär ist, konstruiert, so dass es fluoreszierende Nukleosidanaloga aufweist, die (i) zufällig oder an speziellen Stellen innerhalb von dessen Länge verteilt sein können oder (ii) als terminale Markierungen angefügt sein können, wie nachfolgend beschrieben. Als drittes wird die Nukleinsäureprobe dann von nicht-umgesetzten Monomeren abgetrennt und kann dann direkt charakterisiert, als eine extrinsische, nicht-spezifische Markierung für das Markieren („tagging") von spezifischen Hybridisierungssonden verwendet oder direkt als Hybridisierungssonde verwendet werden. In dem letzten Falle kann eine Hybridisierung an einer festen Phase, an welcher entweder die Ziel-DNA/RNA oder die fluoreszierende Sonde immobilisiert worden ist, wie bei Southern-Blot-Transferen oder „Dot-Blot"-Techniken, stattfinden oder sie kann in Lösung erfolgen (hier „Lösungshybridisierung" oder „in Lösung erfolgende Hybridisierung"), wonach Sonden/Ziel-Hybride von nicht-hybridisierten Sonden durch einfaches Waschen oder Filtration abgetrennt werden. Schließlich wird die Fluoreszenz der an die Ziel-DNA/RNA hybridisierten Oligonukleotide nachgewiesen und quantifiziert.
E. Konstruktion von fluoreszierenden Sondenmolekülen
Gemäß der Erfindung wird bzw. werden ein oder mehrere der nicht-fluoreszierenden üblicherweise vorkommenden Nukleoside spezifisch durch ein vorher ausgewähltes fluoreszierendes Nukleosidanalog oder eine Mischung von fluoreszierenden Analoga ersetzt und diese Letzteren werden dann in DNA- oder RNA-Oligonukleotide eingebaut, um vorgeschriebene Sequenzen zu erzeugen. Die vorgeschriebenen Sequenzen können so ausgewählt werden, dass sie hinsichtlich ihrer Watson-Crick-Basenpaarung äquivalent sind zu einer Nukleotidsequenz, die ausgehend von normalerweise vorkommenden Nukleotiden konstruiert worden ist, und zu einer gegebenen DNA- oder RNA-Zielsequenz komplementär sind; man sagt, dass solche fluoreszierenden Sonden zu der komplementären Sequenz der Ziel-DNA oder -RNA analog sind. Die fluoreszierende Sonde kann entweder durch enzymatische oder chemische Synthese für nachfolgende Anwendungen, wie als (i) Hybridisierungssonden, (ii) Amplimere für einen direkten Nachweis von amplifizierbaren Gensequenzen, die zu einem gegebenen Satz von Primern komplementär sind, oder (iii) als nichtspezifische „universelle" Markierungen, die an spezifische Hybridisierungssonden durch z. B. Ligation angeheftet werden können, synthetisiert werden.
Fluoreszierende Nukleosidanaloga der üblicherweise vorkommenden Ribo-, Desoxy- oder Didesoxyribonukleotide können in Nukleinsäurepolymere eingebaut werden unter Verwendung von einer von mehreren ansonsten konventionellen enzymatischen und chemischen Techniken, einschließlich, abernicht beschränkt auf jene, die hier beschrieben werden.
1. Enzymatische Synthesen. Enzymatische Synthesen umfassen:

(a) die Verwendung des Enzyms DNase I, um'kleine „Brüche" („nicks") in einen Strang eines doppelsträngigen DNA-Doppelstrangs einzuführen. Die Holoenzym-Form von E. coli-DNA-Polymerase I kann dann verwendet werden, um diese Brüche unter Verwendung einer Mischung von fluoreszierenden Nukleotidanalog-Triphosphaten, z. B. Desoxyformycin-5'-triphosphat (FTP), mit üblicherweise vorkommenden Desoxynukleotidtriphosphaten in der Reaktionsmischung zu verlängern und zu reparieren. Diese Methode führt eine große Anzahl von Fluorophoren zufallsgesteuert über die gesamte Länge des DNA-Polymers, einschließlich beider Stränge der Doppelhelix, ein. In der Praxis kann das üblicherweise vorkommende Nukleotid, in diesem Falle dAdenosin-5'-triphosphat (dATP) vollständig eliminiert werden und das dFTP ersatzweise an dessen Stelle eingesetzt werden ohne signifikanten Verlust an Syntheseausbeute, Verlust an Hybridisierungsspezifität oder Festigkeit der Doppelstrangbildung, wie anhand der Werte der DNA-Schmelztemperatur gemessen wird.
(b) die Verwendung von verschiedenen Enzymen, einschließlich des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und der T4-DNA-Polymerase, um überhängende einzelsträngige Regionen von DNA, die durch die früheren Wirkungen von Restriktionsenzymen erzeugt worden sind, aufzufüllen. Diese Methode konzentriert die fluoreszierenden Analoga an dem Ende jedes DNA-Strangs. In ähnlicher Weise können fluoreszierende DNA-Oligonukleotide, die zu einer speziellen DNA-Matrize komplementär sind, synthetisiert werden (i) durch Verwendung von DNA-Fragmenten und E. coli-DNA-Polymerase oder (ii) durch Konstruieren eines rekombinanten Plasmids, das die Primerstelle für einen spezifischen Primer, wie den M13-Vorwärtsprimer, unmittelbar 5' von der gewünschten DNA-Matrizensequenz enthält. Die DNA-Polymerase wird ein komplementäres DNA-Molekül unter Verwendung von Desoxyribonukleotiden oder anderen Desoxy-Analoga, einschließlich z. B. dFTP als Ersatz für dATP, die in der Reaktionsmischung vorhanden sind, synthetisieren.
(c) eine Einbaumethode, die ebenfalls eine terminale Konzentrierung von fluoreszierenden Analoga erzeugt, umfasst die Verwendung des „tailing"-Enzyms terminale Desoxynukleotidtransferase, um ein Homopolymer oder einen „Schwanz" von fluoreszierenden Desoxy-Analoga an das 3'-Ende von DNA-Oligomeren anzufügen. In der Praxis sind die Ausbeuten, die bei der Synthese von Homopolymeren erhalten werden, wenn die üblicherweise vorkommenden Nukleoside durch fluoreszierende Analoga ersetzt werden, signifikant geringer als die Ausbeute, die bei der Synthese von Heteropolymeren erhalten wird. Alternativ kann ein einzelnes fluoreszierendes Nukleosidanalog an das 3'-OH eines jeglichen Oligomers angefügt werden unter Verwendung desselben Enzyms, aber der Didesoxy-Form eines fluoreszierenden Analogs oder eines 2'-geschützten fluoreszierenden Analogs, einschließlich der FRET-geschützten Analoga, auf genau die gleiche Weise, auf die z. B. Didesoxy-ATP (Cordecy pin) verwendet wird. Ein drittes alternatives Verfahren zur Endmarkierung von Hybridisierungssonden setzt die Wirkung von DNA-Ligase oder RNA-Ligase ein, durch welche nicht-spezifische doppel- oder einzelsträngige fluoreszierende Oligonukleotide kovalent entweder an das 3'-Ende oder das 5'-Ende von spezifischen Hybridisierungssonden gekoppelt werden können; die auf diese Weise verwendeten fluoreszierenden Oligonukleotide nehmen nicht notwendigerweise an der Watson-Crick-Basenpaarung, die die Spezifität einer Sonde bestimmt, teil, sondern können allein als eine generische oder universelle fluoreszierende „Markierung" („tag") wirken. Bei jeder der vorangegangenen Methoden sind die DNA-Sonden doppelsträngig und müssen zu einer einzelsträngigen Form unter Verwendung von entweder Wärme oder einer Alkalibehandlung vor deren Verwendung für eine Hybridisierung denaturiert werden.
(c) ein Einbauverfahren, das auch als ein Standardverfahren zur Produktion von fluoreszierenden Sonden mit einer vorgeschriebenen Länge und Sequenz verwendet weiden kann unter Verwendung von Standardmethoden der DNA-Amplifizierung oder – Replikation und von einer von mehreren verfügbaren DNA-Polymerasen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die thermostabilen DNA-Polymerasen, z. B. Taq-Polymerase, modifizierte T7-DNA-Polymerase, Klenow-Fragment und T4-DNA-Polymerase, aber ersatzweise eines der fluoreszierenden Desoxyribonukleotidanaloga, z. B. 2'-Desoxyformycin A-5-triphosphat oder 5-Aminodesoxyformycin B-5'-triphosphat anstelle von ATP bzw. GTP, in der Mischung von Nukleotidtriphosphaten einsetzt. Die fluoreszierenden Oligonukleotide sind hinsichtlich Ausbeute und Länge zu dem nicht-fluoreszierenden Oligomer, das mit den üblicherweise vorkommenden Nukleotiden hergestellt wird, äquivalent und hybridisieren an Ziel-Matrizen-DNA und zeigen die gleiche thermische Stabilität und das gleiche Anfärbungsvermögen mit Ethidiumbromid, wie dies die nicht-fluoreszierenden Kontrollen tun, hat sich ein hybri der Doppelstrang einmal gebildet. Bei solchen Amplifizierungen kann die Produktion von fluoreszierenden Oligonukleotiden direkt als Nachweis für das Vorliegen einer bestimmten Sequenz herangezogen werden oder die Identität kann des weiteren durch (i) Hybridisierung mit einer definierten komplementären Sonde oder (ii) Sequenzieren, um die analoge Sequenz zu ermitteln, bestimmt werden; und
(e) die Verwendung von fluoreszierenden RNA-Oligonukleotiden, die zu einer speziellen DNA-Matrize komplementär sind, die (i) symmetrisch durch Verwendung von DNA-Fragmenten und z. B. E. coli-RNA-Polymerase, wie in 12 veranschaulicht, oder (ii) asymmetrisch, wie in 13 gezeigt, durch Konstruieren eines rekombinanten Plasmids, das den Promotor für eine spezielle DNA-abhängige RNA-Polymerase unmittelbar 5' zu der gewünschten DNA-Sequenz enthält, die als Matrize verwendet wird, z. B. einer DNA-Matrize, die einen T7-RNA-Polymerase-Promotor unmittelbar 5' zu dem Fragment eines klonierten Chlamydia-MOMP-Genfragments, das die Sequenz aufweist, die als Zielsequenz für eine Hybridisierung mit der Sonde verwendet werden wird, enthält, synthetisiert werden. Für die meisten Anwendungen ist die asymmetrische Synthese das bevorzugte Verfahren und die entsprechende DNA-abhängige RNA-Polymerase wird ein RNA-Molekül unter Verwendung von Ribonukleotiden, z. B. FTP als Ersatz für ATP und UTP anstelle von TTP, synthetisieren, das das analoge komplementäre Molekül zu einem und nur einem der zwei Stränge der Matrize ist. Die resultierenden einzelsträngigen Sonden können direkt in einer nachfolgenden Hybridisierungsreaktion ohne einen Denaturierungsschritt verwendet werden.

2. Chemische Synthesen. Die geschützten fluoreszierenden Desoxynukleosidanalog-3'-O-phosphoramidite, typischerweise jene, in denen R₁₀ = Dimethoxytrityl, R₁₆ = Isopropyl und R₁₅ = Methyl oder p-Cyanethyl, werden an das 5'-OH eines wachsenden Oligonu kleotids, das an einen festen Träger angeheftet ist, unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-DNA-Synthesetechniken (siehe Atkinson, T. und M. Smith [1984] in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, M. J. Gait, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 35–82) gekoppelt. An eine feste Phase gebundenes Oligonukleotid, das bereits mit Säure gewaschen worden ist, um die Schutzgruppe von der 5'-OH-Gruppe zu entfernen, wird mit dem 5'-Trityl-geschützten Desoxynukleosidanalog-3'-O-phosphoramidit in wasserfreiem Acetonitril in Gegenwart von Tetrazol unter Argon umgesetzt, wobei überschüssige Reagenzien weggewaschen werden und dann das Phosphat-Produkt zu dem gewünschten Phosphat mit einer Lösung von Iod in wässrigem THF oxidiert wird und mit wasserfreiem Acetonitril gewaschen wird. Nach einer Wäsche mit Säure, um den neuen 5'-Terminus von der Schutzgruppe zu befreien, kann der Zyklus so viele Male wie notwendig, um die gewünschte Länge und Sequenz zu erhalten, wiederholt werden; zusätzliche Nukleotide, die angefügt werden, können die üblicherweise vorkommenden Nukleotide sein oder sie können zusätzliche fluoreszierende Nukleosidanaloga sein. Dementsprechend können ein oder mehrere Fluorophore innerhalb einer gegebenen Sonde eingebaut werden bis zu und einschließlich einer vollständigen Substitution von z. B. allen A-Resten in einer gewünschten Sequenz durch Formycin-Reste. Die Kopplungen können manuell in einem Minireaktor-Fläschchen unter Verwendung einer Kopplungsdauer von 10 min oder an einem Pharmacia LKB-Gene Assembler-Gerät oder einem ähnlichen Instrument unter Verwendung der programmierten Syntheseprotokolle ausgeführt werden. Das fluoreszierende Oligonukleotid wird dann isoliert, indem die DNA von dem porösen Glasträger durch Inkubation bei 55°C über Nacht in NH₄OH:Ethanol (3 : 1) abgespalten wird. Die fluoreszierende DNA enthaltende Ammoniumhydroxidlösung kann dann in einem Speed-Vac-Gerät schnell getrocknet und dann von fehlgeschlagenen Sequenzen an einer QEAE-HPLC-Säule unter Verwendung eines flachen Salz- und pH-Gradienten abgetrennt werden. Für die Nukleosidanalog- Phosphoramidite sind die Ausbeuten vergleichbar mit jenen, die mit Standard-Amiditen erhalten werden, basierend auf der repetitiven Ausbeute, berechnet aus der Tritylkationen-Freisetzung beim Schutzgruppenentfernungsschritt.
Um spezielle Veranschaulichungsbeispiele, wie Sondenmoleküle, die ein fluoreszierendes Nukleosidanalog enthalten, zu konstruieren und zu verwenden sind, bereitzustellen, folgen Beispiele, die Vorgehensweisen, einschließlich die beste Weise, um die Erfindung praktisch auszuführen, veranschaulichen. Diese Beispiele sollte nicht als einschränkend verstanden werden. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und alle Lösemittelanteile oder -verhältnisse sind auf das Volumen bezogen, sofern nicht anders angegeben.
Beispiel 1 - Chemische Umwandlung von Formycin A zu 2'-Desoxy-Formycin A und Herstellung des 5'-Triphosphats und 3'-O-(2-Cyanethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidits
16 zeigt das erfinderische Schema, das verwendet wird, um das 2'-Desoxy-5'-triphosphat oder das 2'-Desoxy-3'-O-phosphoramidit von Formycin A herzustellen. Obwohl die erste Phase zuvor durch die Umsetzung mit a-Acetoxyisobutyrylhalogeniden bewerkstelligt worden ist, wie von De Clerq et al. ([1987] J. Med. Chem. 30: 481) beschrieben, erzeugt das Verfahren sowohl die 3'- als auch die 2'-Desoxyform, die schwierig zu trennen sind und in geringer Ausbeute produziert werden. Die Erfindung setzt einen 3',5'-Disila-Schutz ein, der zuvor erfolgreich bei der Umwandlung von Adenosin zu 2'-Desoxyadenosin eingesetzt worden ist ([1981] J. Am. Chem. Soc. 103: 932). Das Verfahren scheint auf die entsprechende Umwandlung von vielen fluoreszierenden Nukleosidanaloqa allgemein anwendbar zu sein.
(I) 7-Amino-3-[3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropyl-l,3-disiloxandilyl)-ß-D-ribofuranosylpyrazolo-[4,3d]-pyrimidin.
1, 3-Dichlor-1, 1, 3, 3-tetraisopropyl-1, 3-disoloxan (0,9 g, 2,85 mmol) wurde zu einer Suspension von Formycin A, das umfassend dehydratisiert worden war, (0,66 g, 2,5 mmol) in wasserfreiem Pyridin zugesetzt und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 24 h gerührt. Das Lösemittel wurde unter Vakuum bei T = 40°C entfernt und das Produkt zwischen Ethylacetat und Wasser extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wurde, nacheinander, mit (i) kalter 1 N HCl, H₂O, wässrigem NaHCO₃ (gesättigt) und wässriger NaCl (gesättigt) gewaschen, gefolgt von einem Eindampfen zu einem Gummi. Nach einer Flash-Chromatographie an Kieselgel und schrittweiser Elution mit (i) 2,5% Methanol-Chloroform und (ii) 5% Methanol-Chloroform, wurde durch Protonen-NMR und Elementaranalyse gezeigt, dass das Produkt, das als ein einzelner Fleck bei einer Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (R_f = 0,80 in 20% Methanol-Chloroform) lief, das cyclische geschützte 3' , 5' -Produkt war.
(II) 7-Amino-3-[3',5'-O-(1,1,3,3-tetraiso ropyl-l,3-disiloxandilyl)-2'-(phenoxythiocarbonyl)-β-D-ribofuranosyl]- pyrazolo-[4,3d]-pyrimidin. 480 mg des Disila-geschützten Formycins A (0, 93 mmol) wurden mit DMAP (0, 9 g, 7, 6 mmol) in wasserfreiem McCN gelöst. Nach einer tropfenweise Zugabe von 200 ml Phenoxythiocarbonylchlorid durch eine trockene Spritze, die in einer Glasschliffverbindung montiert war, wurden die Reaktanten 24 h bei Raumtemperatur gerührt, wonach das Lösemittel unter Vakuum entfernt wurde und das Produkt erneut zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt wurde. Die Ethylacetatphase wurde gewaschen, wie oben, das Lösemittel verdampft und der Rückstand mittels Flash-Chromatographie aufgetrennt und mit Chloroform-MeCN (50/50) eluiert. Vereinigte Fraktionen des gewünschten Produkts wurden durch Protonen-NMR und Elementaranalyse identifiziert und einer zweiten Produktionsrunde, wie nachfolgend beschrieben, unterworfen.
(III) 7-Amino-3-(2'-desoxy-β-D-ribofuranosyl)pyrazolo[4,3d]-pyrimidin (2'-Desoxyformycin A). 240 mg des aus der in II oben beschriebenen Vorgehensweise erhaltenen Produkts wurden zu 12,5 mg (NH₄)₂SO₄ in einem großen Überschuss von Hexamethyldisilazan zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei > 60°C über Nacht unter Rückfluss gekocht. Nach Eindampfen unter Vakuum wurde das rohe Trisilyl-Derivat in Toluol gelöst und mit Azobisisobutyronitril und Tributylzinnhydrid durch Erwärmen unter N₂ über Nacht umgesetzt, um eine vollständige Reduktion zu erzielen. Das Produkt wurde in TBAF in THF bei 80°C über Nacht von den Schutzgruppen befreit und nach Eindampfen zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt. Die Wasserphase wurde auf konzentriert und auf eine Dowex 50W-X8-Säule, die mit Wasser äquilibriert worden war, aufgetragen und dann mit 15% NH₄OH eluiert. Es wurde durch Protonen-NMR und Elementaranalyse gezeigt, dass das Hauptprodukt (R_f = 0,3 in 20% Methanol-Chloroform) identisch war mit dem gereinigten 2'-Desoxyformycin A, das unter Verwendung des Verfahrens von De'Clerq et al., a. a. O. hergestellt worden war.
(IV) 7-Amino-3-(2'-desoxy-β-D-ribofuranosyl)pyrazolo-[4,3d]- pyrimidin-5'-triphosphat (2'-Desoxyformycin A-5'-triphosphatl. 28 mg (0,11 mmol) 2'-Desoxyformycin A wurde zu einem mit einem Glasstopfen verschlossenen Teströhrchen hinzugesetzt und mit 0,2 ml Aceton von Reagenzienqualität und 0,1 ml Phosphoroxychlorid gemischt. Die heterogene Reaktionsmischung wurde 24 h bei 4°C aufbewahrt, während welcher Zeit sich die Lösung tiefgelb färbte. Nach Abkühlen und Zugabe von 3 ml kaltem Aceton wurden 6 mmol konzentriertes NH₄OH schnell zugesetzt, während gemischt wurde. Nach Verdampfen des Acetons und Absenkung des pH auf weniger als 2 wurde die Mischung 1,5 h unter Rückfluss gekocht, dann verdünnt und direkt auf Dowex-l-formiat aufgetragen, von welchem 2'-Desoxyformycin A-MP mit 0,75 M Ameisensäure eluiert wurde. 2'-Desoxyformycin A-MP wurde durch das Verfahren von Yoshikawa et al. ([1967] Tetrahedron Lett. 5095) in das Triphosphat umgewandelt.
(V) 7-Amino-3-(2'-DESOXY-β-D-ribofuranosyl)pyrazolo-[4,3d]- pyrimidin-3'-O-phosphoramidit (2'-Desoxyformycin A-3'-O-phosphoramidit). 2-Desoxyformycin A wurde durch Standardverfahren behandelt, um einen 5'-O-Schutz mit DMT und Benzoylierung der 7-Aminogruppe zu erzielen. Zu 0,3 mmol des Produkts und 25 mg Diisopropylammoniumtetrazolid in 1,5 ml CH₂Cl₂ wurde eine Lösung, die 0,33 mmol O-Cyanethyl-N,N-N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit enthielt, hinzugesetzt. Die Mischung wurde 4 h gemischt und zwischen CH₂Cl₂ und gekühlter (in) gesättigter NaHCO₃-Lösung verteilt. Die CH₂Cl₂-Phase wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und aufkonzentriert. Eine Reinigung durch Filtration durch ein 2 Zoll-Bett von basischem Aluminiumoxid in einer 25 mm-Säule unter Elution mit 9 : 1 CHCl₂/Et₃N lieferte das Phosphoramidit, das zu einem Schaum getrocknet werden konnte. Die Identität des Produkts wurde durch Protonen-NMR, Elementaranalyse, Fluoreszenz des Heterocyclus und Verwendung bei einer Oligonukleotidsynthese verifiziert.
Beispiel 2 – Vollständige enzymatische Substitution von ATP oder dATP in RNA- oder DNA-Sonden durch FTP oder 2'-dFTP
A. Symmetrische Synthese von Riboseoligomeren. RNA-Oligonukleotide wurden ausgehend von drei DNA-Matrizen synthetisiert (10) unter Verwendung von (i) FTP als Ersatz für ATP und (ii) einer gereinigten E. coli-RNA-Polymerase, wie ursprünglich von Ward et a1. ([1969] J. Biol. Chem. 12: 3242) beschrieben, mit der Ausnahme, dass man die Synthese drei Stunden bei 37°C ablaufen ließ, bevor die Reaktion gestoppt wurde; FTP ersetzte wirksam ATP, aber kein anderes der anderen drei normalen Nukleotide CTP, UTP oder GTP.
Am Ende der Synthese wurden die Reaktionsprodukte von nichtumgesetzten Reagenzien durch Trennung bei 4°C an Sephadex G-50 in normaler Kochsalzlösung bei pH 7 abgetrennt. Das Schema für die Trennung von Reaktionsprodukten von nicht-umgesetzten Reagenzien ist als Flussdiagramm in 19 gezeigt.
Bei der Reaktion ist FTP ein wirksames Substrat für RNA-Polymerase sowohl mit nativer als auch denaturierter DNA wie auch mit synthetischen Desoxynukleotidpolymer-Matrizen. Bei Proben, die CTP, UTP, GTP, RNA-Polymerase, eine der DNA-Matrizen und entweder FTP oder ATP enthielten, eluierte ein Produkt von hohem Molekulargewicht ausgehend von jeder der Proben im Hohlraumvolumen, während die Menge von monomerem NTP in der zurückgehaltenen Fraktion von jeder Probe entsprechend um > 70% verringert war. Aus Enzym-freien Kontrollen eluierte keine andere Fraktion von hohem Molekulargewicht als die kleine Menge von Matrize und die nicht-umgesetzten rNTPS waren nicht verringert; in ähnlicher Weise enthielten Matrizen-freie Kontrollen nur nicht-umgesetzte rNTPs, die in dem zurückgehaltenen Volumen mit Standard-Ribonukleotidtriphosphaten coeluierten. Ähnliche Ergebnisse wurden mit verschiedenen DNA-Matiizen aus natürlichen und synthetischen Quellen, einschließ-lach den alternierenden Copolymeren poly d(AC), poly(AG) und poly(ACGT), erhalten. Darüber hinaus wurden vergleichbare Ausbeuten an Oligomer von hohem Molekulargewicht aus Synthesen, bei denen (i) die N-Nukleosid-Analoga 2,6-Diaminoadenosin-5'triphosphat oder 2-Diaminoadenosin-5'-triphosphat in der Reaktionsmischung ATP ersetzten oder (ii) die C-Nukleoside Formycin B-5'-triphosphat (F_bTP) oder -Aminoformycin B-5'-triphosphat (aF_bTP) in der Reaktionsmischung GTP ersetzten, und unter Verwendung von poly(TG) oder poly(GC) als DNA-Matrize erhalten. Unabhängig von der Matrize waren die Ausbeuten, die durch Ersetzen von ATP oder GTP durch mehrere der Deaza- und Aza-Nukleosidanaloga erhalten wurden, dramatisch niedriger.
B. Asymmetrische Synthese von RNA- oder DNA-Sonden. In vitro sind DNA-abhängige RNA-Polymerasetranskriptionssysteme für die Synthese von RNAs für eine Verwendung als Substrate und Hybridisierungssonden ein recht übliches Hilfsmittel der Molekularbiologie. Sie werden hier in einzigartiger Weise auf die Entwicklung von selbst-fluoreszierenden Sonden und deren Herstellung angewendet. Das entwickelte Verfahren ist allgemein einsetzbar und auf jedes der Phagenpolymerasesysteme, einschließlich SP6, T7 und T3, anwendbar. Im vorliegenden Falle setzt die Erfindung ein Paar von Promotoren ein, die sich getrennt auf alternierenden Strängen eines doppelsträngigen Plasmids und an gegenüberliegenden Enden eines Polylinkers befinden, wie in 13 gezeigt. Die Vektoren werden verwendet, um (i) Promotoren anzufügen, die in der Lage sind, eine asymmetrische Synthese durch Verwendung einer viralen Polymerase, die einen der Promotoren erkennt, zu bewirken, und (ii) eine Mehrzahl von Kopien einer Matrize für eine Verwendung bei einer asymmetrischen Herstellung einer fluoreszierenden Sonde oder einer nicht-fluoreszierenden Kopie der Sonden-Zielsequenz zu replizieren. Eine Kopie der DNA-Zielsequenz wird in den Polylinker in dessen doppelsträngiger Form und an einer Restriktionsstelle, die an einen der Promotoren angrenzt, insertiert. Die Replikation des Plasmids in kompetenten Zellen liefert große Mengen der Matrize für eine Transkription. Es sind zwei getrennte, aber parallele Methoden für die asymmetrische Synthese von DNA-Sonden entwickelt worden. In dem ersten Falle werden ssDNA-Sonden ausgehend von Matrizen, bei denen eine Primerbindungsstelle an dem 5'-Ende. von einem Matrizenstrang angefügt ist, wie in 14 gezeigt, synthetisiert. Bei solchen Synthesen kann der Primer nicht-fluoreszierend sein oder kann unter Verwendung von fluoreszierenden Analog-Phosphoramiditen synthetisiert werden, wie auf der rechten Seite der Figur gezeigt. Eine Variation davon besteht in einer asymmetrischen Amplifizierung und Trennung, bei welchen beide Stränge einer Matrize repliziert werden können durch Amplifizierung als fluoreszierende Oligomere, aber unter Verwendung eines Paars von Primern, bei denen einer, und nur einer, einen vorübergehenden (oder transienten) Affinitätslinker, wie Biotin, der nachfolgend verwendet werden kann, um die denaturierten Sinn- und Antisinnstränge zu trennen, trägt.
Sowohl für RNA- als auch DNA-Sonden hat es sich als praktisch erwiesen, eine Referenz-Matrize, -Sondensequenz und -Zielsequenz zu ermitteln, gegenüber welchen alle Transkriptions- und Sondennachweis-Empfindlichkeiten kalibriert werden. Die α-Kette des Translationselongationsfaktors von Xenopus (Xef-1α) dient diesem Zweck und es wird eine asymmetrische RNA-Sondensynthese hier als repräsentativ für alle RNA- und DNA-Synthesen verwendet. Die Xef-1α-mRNA ist ein Haupttranskriptionsprodukt des Xenopus-Embryos, das einen hohen Prozentsatz von nicht-mitochondrialen RNA-Transkripten, die unmittelbar nach dem mittleren Blastula-Übergang auftreten, umfasst. Das Gen für Xef-1α wurde isoliert und an die Enden des Klons während der Konstruktion der cDNA-Bibliothek EcoRI-Linkerstellen angefügt. Das 1705 Nukleotide-Fragment wurde in ein pSP72-Plasmid insertiert, das einen T7-Promotor auf einem Strang und einen SP6-Promotor auf dem Komplementärstrang trug. Nach Plasmidreplikation und Matrizenlinearisierunq erzeugte eine Transkription mit T7-RNA-Polymerase, den rNTPs Cytidin, Uridin und Guanosin zusammen mit dem Ribosetriphosphat von entweder Formycin A oder Adenosin 1749 Basen lange Oligomere, die 489 F- bzw. A-Reste enthielten. Es wurden niemals Transkripte von weniger als voller Länge beobachtet und in jedem Falle wurden die analogen und Kontroll-Oligomere in vergleichbaren Mengen, produziert und waren im allgemeinen im physikalischen Verhalten ununterscheidbar abgesehen davon, dass die analoge Sequenz permanent fluoreszierend war.
Es gibt zwei einzigartige Merkmale dieses neuen Herstellungssystems. (1) Die Synthese des Antisinn-Strangs, z. B. unter Verwendung von SP6 und den üblicherweise vorkommenden nichtfluoreszierenden rNTPs, liefert standardisierte Zielsequenzen in hoher Ausbeute. Bei der entsprechenden asymmetrischen Synthese von DNA-Sonden können unterschiedliche Primerstellen auf komplementären Matrizensträngen verwendet werden, um das gleiche Ziel zu erreichen. (2) Es kann eine Mischung von Plasmiden, die mehrere unterschiedliche Plasmide enthält, verwendet werden, um einen „Cocktail" von linearisierten Matrizen zu erzeugen, ausgehend von welchen der entsprechende „Cocktail" von Sonden (siehe Beispiel 7 unten), die an eine Mehrzahl von Stellen auf einer genomischen Sequenz binden können, gleichzeitig transkribiert werden kann.
Beispiel 3 – Die Fluoreszenz von Nukleosidanalog-RNA-Sonden und Nachweis von deren Hybridisierung in Lösung
Die wirksame Nutzung von FTP bei der poly d(AT)-gesteuerten Synthese in Beispiel 1 erzeugte ein Polymer von ungefähr 300-500 Basen Länge, das, wenn es hydrolysiert und/oder sequenziert wurde, sich als ein perfekt alternierendes Replikationsprodukt der DNA-Matrize, aber mit der Sequenz: poly(FU) erwies. Wie ausgehend von dieser Sequenz vorhergesagt, konnte das Produkt an gleiche Ketten durch einen einzigen thermischen Zyklus anhybridisiert werden, wodurch das mutmaßliche Produkt poly(FU):poly(FU) erzeugt wurde; anders als das in vergleichbarer Weise behandelte poly(FC), das, wie erwartet, keinen Hinweis auf eine Selbsthybridisierung zeigte, wurden die infolge Hybridisierung aneinander gelagerten Hybride von po-ly(FU):poly(FU) mit Ethidiumbromid in Agarosegelen angefärbt und ergaben sowohl bei Absorption als auch Fluoreszenz einen scharfen thermischen Übergang, was nachweist, dass die Sonden sowohl wirksam als auch spezifisch hybridisieren konnten. Die Absorptions- und Emissionsspektren der gereinigten poly(FU), poly(FC), poly(FG), poly(UFb), poly(CaFb) und poly(FCGU) unterscheiden sich von jenen von gereinigten poly(AU)-, poly(AC)-, poly(AG)-, poly(TG)- und poly(ACGT)-Kontrollen in vier Hin sichten: (i) das Absorptionsmaximum im fernen UV ist für die Analog-enthaltenden Produkte leicht verschoben zu 265 nm verglichen mit 260 nm für die Kontrollen; (ii) es gibt eine signifikante, hochgradig strukturierte Absorption (3 Peaks bei Raumtemperatur) zwischen 290 nm und 320 nm mit einer vernachlässigbaren Absorption bei 340 nm; (iii) bei 303 nm tritt ein Anregungsmaximum auf; und (iv) es gibt eine breite Emissionsbande, die sich in die sichtbaren Wellenlängen erstreckt mit einem Peak bei 405 nm (Stokes-Verschiebung = 102 nm). Es ist eine wichtige Eigenschaft, dass die Fluoreszenz z. B. in dem poly(FU):poly(FU)-Hybrid vollständig gequencht wird und nicht nachgewiesen werden kann, bis die Stränge durch Erhöhen des pH der Lösung auf Werte > pH 10 denaturiert werden. Einmal denaturiert, ist die Fluoreszenz des Oligomers vollständig integrierbar mit einer relativen Fluoreszenzintensität > 40% der Peakintensität über den Bereich von 360 nm bis 460 nm.
Beispiel 4 – Hybridisierung von fluoreszierenden Sonden an Ziel-RNAs und Ziel-DNAs: Verwendungen von Linkern, um einen Festphasen-Nachweis zu ermöglichen
Die synthetische Matrize poly(TG) wurde verwendet, um die komplementären RNA-Sonden poly(AC) und poly(FC) zu produzieren, von denen keine selbst-komplementär ist und bei denen keinerlei Hybride durch Hybridisierung aneinander gelagert oder nachgewiesen werden konnten; von den beiden war nur poly(FC) fluoreszierend. In einem parallelen Experiment wurde eine po- ly(AC)-Matrize amplifiziert unter Verwendung der biotinylierten synthetischen 22-meren Primer ^5αBIOTIN-(TG)₁₁3' zusammen mit Standard-Polymerasekettenreaktion (PCR)-Methoden, um die DNA-Amplimere mit der Sequenz ^5αBIOTIN-poly(TG)^3'herzustellen, dann von den nicht-umgesetzten Primern durch Größenauftrennung auf einem Gel und/oder QEAE-Ionenaustauschchromatographie abgetrennt, wonach die Polymere unter Verwendung von ³²P-ATP und des Enzyms Polynukleotidkinase radioaktiv markiert wurden. Wenn sie separat, aber in äquimolaren Mengen mit den biotinylierten Amplimeren ^5αBIOTIN-poly(TG)^3'gemischt wurden, bildeten beide RNA-Sonden, poly(AC) und poly(FC), Hybride, die durch (i) Ethidiumbromidanfärbung und (ii) Schmelzverhalten charakterisiert werden konnten; wie erwartet, wurde die Fluoreszenz der poly(FC)-Sonde durch Hybridisierung gequencht. Die Hybride konnten dann über die ^5αBI0TIN-Gruppierung an avidinylierte Körnchen adsorbiert werden, gewaschen werden, um nichthybridisiertes poly(FC) zu entfernen, und gleiche Aliquots hinsichtlich Radioaktivität und Fluoreszenz untersucht werden. Vor einer Denaturierung der gewaschenen Probe war die nachweisbare Fluoreszenz in der Lösung vernachlässigbar; nach einer Denaturierung in Puffer mit hohem pH lag die Menge an po-ly(FC), die hybridisiert worden war, wenn dies ausgehend von der Fluoreszenz von standardisierten Verdünnungen der Sonde abgeschätzt wurde, innerhalb von 1% der Menge der Ziel-DNA, ^5αBIOTIN-poly(TG)^3', wie durch die Menge an radioaktiver Markierung in der Probe verglichen mit standardisierten Verdünnungen gemessen wurde.
Beispiel 5 – Hybridisierung von fluoreszierenden Sonden, die ausgehend von Nukleosidanalog-3'-O-phosphoramiditen synthetisiert worden sind, an Ziel-DNAs
Bei einer Validierung der Verwendung der Phosphoramidite der fluoreszierenden Nukleosidanaloga wurden n-mere, die in der Länge um ein Mehrfaches von 5 Basen von 25-meren bis 60-meren variierten und die Sequenz (AC)_x oder (FC)_x, wobei x = 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5 oder 30, aufwiesen, parallel unter Verwendung von entweder dAdenosin-3'-O-phosphoramidit oder dF-3'-O-phosphoramidit zusammen mit dC-3'-O-phosphoramidit in einem Pharmacia LKB Gene Assembler-Gerät synthetisiert. Nach Abspaltung von der festen Phase und Reinigung an (von) QEAE-Sepharose konnten die fluoreszierenden Oligomere (FC)_x von definierter Länge an die radioaktiv markierten Amplimere von poly(TG) aus den Beispielen 2 und 3 oben hybridisiert werden, wie anhand des DNA-Schmelzverhaltens, der Ethidiumbromidanfärbung und des Wiederauftretens (sofern gequencht) von Fluoreszenz nach einer Denaturierung des Hybrids ermittelt wurde.
Beispiel 6 – Assay auf Chlamydia trachomatis unter Verwendung einer RNA-Sonde, in der FTP ersatzweise eingebaut war
Chlamydia trachomatis ist ein obligatorisches intrazelluläres Pathogen, das in seinen aktiven infektiösen Stadien 3 × 10³ bis 4 × 10³ Kopien von ribosomaler RNA (rRNA) und eine Kopie von genomischer DNA/Bakterium enthält. Es wurde ein Primerpaar, von denen einer einen 5'-biotinylierten T7-Promotor, der sich 5' von der hybridisierenden Primersequenz befand, enthielt, verwendet, um ein DNA-Segment von 150 Basenpaaren des MOMP-Gens aus einem Zuchtstamm von C. trachomatis L2 zu amplifizieren. Ungefähr 500 ng des DNA-Fragments, das den T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende enthielt, wurden mit T7-RNA-Polymerase in Gegenwart von rCTP, rUTP, rGTP und mit entweder rFTP oder rATP (+ Kontrolle) transkribiert. Die Reaktion wurde durch Hitzeinaktivierung des Enzyms für 3 min bei 100°C gestoppt. Nicht eingebaute rNTPs wurden von der markierten RNA durch eine Größenauftrennungs-Gelchromatographie an einer Sephadex G-25-Säule abgetrennt, wonach die Sondenkonzentration aus deren Absorption bei 260 nm abgeschätzt wurde. Unter Verwendung eines einfachen Fluoreszenz-Spektrophotometers mit zwei Monochromatoren konnten so wenig wie 5 × 10^-14 mol der RNR-Sonde gegenüber Hintergrund nachgewiesen werden, wenn 20 nm-Spalte sowohl für den Anregungs- als auch den Emissionsmo nochromator verwendet wurden. Ein hinsichtlich Empfindlichkeit gestaltetes Photonenzählungsfluorimeter (siehe Beispiel 9 unten) ist in der Lage, zwischen 5 × 10^-16 und 5 × 10^-17' mol derselben Sonde nachzuweisen, was äquivalent ist zu der Menge von ribosomaler RNA, die ausgehend von zwischen 5000 und 50000 der Bakterien erwartet wird. Zweihundert Mikroliter von entweder (i) genomischer C. trachomatis-DNA oder (ii) der amplifizierten Ziel-DNA wurden mit 200 μl einer 1/200-Verdünnung der Sonde in Hybridisierungspuffer (0,15 M NaCl, 0,02 M Natriumcitrat, 0,02 M HEPES, 0,004 M EDTR, pH 7,4) gemischt und die Mischung 3 min gekocht, wonach man sie langsam im Verlauf von einer Stunde auf Raumtemperatur abkühlen ließ. Ein Aliquot der genomischen DNA-Probe wurde in ein Ultrafiltrations-Mikroröhrchen oder eine Filterplatte mit 96 Vertiefungen (Porengröße = 0,1 μm) eluiert, wie in 17 veranschaulicht, fünfmal mit 0,15 M NaCl, 0,02 M Natriumcitrat, pH 7,4, gewaschen, wonach die Probe in zwei Teile geteilt wurde, eine Hälfte in Puffer von hohem pH denaturiert wurde und beide Aliquots gescannt wurden, um den Fluoreszenzhintergrund bzw.'die Fluoreszenz der hybridisierten Sonde zu messen. Ziel-DNA-Amplimere wurden in ähnlicher Weise behandelt mit der Ausnahme, dass das 5'biotinylierte Primerende der Ziel-DNA-Segmente zuerst an avidinylierte magnetische Körnchen (2,8 μm Durchmesser) adsorbiert wurde, so dass die Probe ohne Materialverlust gewaschen werden konnte (18). Bei jeder dieser Behandlungen kann die Fluoreszenz der Sonde nachgewiesen werden bei Verdünnungen der Probe, die weniger als 1 x 10-¹⁶ mol Ziel-DNA enthalten, was grob äquivalent ist zu der Empfindlichkeit, die benötigt wird, um weniger als 10000 Bakterien nachzuweisen, wenn eine einzelne Sonde von ähnlicher Größe verwendet wird, um rRNA aus infektiösen Chlamydia nachzuweisen. Die hier verwendete Sonde ist ungefähr 150 Basen lang, enthält ungefähr 38 Formycinreste pro Sonde und bindet nur an eine einzelne Zielstelle auf jeder Kopie der ribosomalen NA. Es ist ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung, dass das Erhöhen der Anzahl von Fluorophoren in ei ner Sonde oder einem Sonden-„Cocktail" auch die Nachweisempfindlichkeit erhöht. Mit dem Dreizehnfachen an Formycinresten pro Sonde als der 150 Basen-M0MP-Gensonde können 1 × 10^-18 mol der Xef-1α-Sonde in einem Fluoreszenz-Spektrophotometer mit zwei Monochromatoren nachgewiesen werden, wohingegen weniger als 1 × 10^-20 mol unter Verwendung der Photonenzählungs-Technologie, die in Beispiel 9 beschrieben wird, nachgewiesen werden.
Beispiel 7 – Nachweis einer Mehrzahl von Zielstellen
Ein wichtiger Aspekt der asymmetrischen Synthesen hinsichtlich sowohl diagnostischer als auch therapeutischer, z. B. Antisinn, Anwendungen von Nukleinsäuresonden besteht in der Fähigkeit für eine gleichzeitige Synthese von Sonden-„Cocktails", die Sonden umfassen können, die sich in der Länge unterscheiden oder sich in den Lagen oder Anzahlen von Zielstellen auf RNA oder genomischer DNA, an die sie binden werden, unterscheiden. Die Verwendung von Sonden-Cocktails bei drei unterschiedlichen Typen von diagnostischen Zielstrukturen veranschaulicht die breite Bedeutung dieses Merkmals.
A. Nukleinsäuren mit einer einzigen Zielsequenz, die in einer Mehrzahl von Kopien vorliegen. Bei einigen Pathogenspezies ist in jedem Organismus eine Mehrzahl von rRNA-Kopien vorhanden; z. B. enthält jedes Bakterium von Chlamydia ungefähr 2 × 10⁴ rRNA-Moleküle pro Organismus. Da die rRNA von Chlamydia typischerweise zwischen 3000 und 5000 Nukleotide lang ist, kann die Empfindlichkeit in einem diagnostischen Assaysignifikant erhöht werden durch die Verwendung eines Sonden-Cocktails, der für Zielsequenzen auf rRNA spezifisch ist und aus so viel wie 5 bis 10 unterschiedlichen Sondensequenzen hergestellt ist, von denen jede an unterschiedliche Abschnitte der Ziel-rRNA oder Ziel-DNA binden kann, wie anhand der Sonden (a) bis (e) in der unteren Hälfte des in 20 gezeigten Diagramms gezeigt, wobei (a), (b), (c), (d) und (e) analoge komplementäre Sonden sind, die für unterschiedliche Zielsequenzen eines einzelnen DNA-Strangs spezifisch sind.
Bei einer Verwendung von rRNA-Sequenzen als diagnostische Zielstrukturen gibt es zwei Nachteile: (i) rRNA-Sequenzen sind hochgradig konserviert; folglich sind nur kurze variable Sequenzen für den Nachweis und die Identifizierung von infektiösen Pathogenen nützlich. Eine Folge davon für die diagnostische Empfindlichkeit besteht darin, dass nur begrenzte Anzahlen von „Reporter"-Markierungen an jeder Sonde verwendet werden können, wodurch die Empfindlichkeit begrenzt wird; und (ii) nur einige wenige Pathogene tragen rRNA in hohen Kopienzahlen und viele, wie die DNA-Viren, tragen überhaupt keine rRNA; folglich ist die Anzahl von Diagnostikverfahren, bei denen diese Strategie eingesetzt werden kann, begrenzt.
B. Eine Mehrzahl von unterschiedlichen Zielsequenzen auf einem einzelnen DNA-Strang. Die Genome von allen Organismen sind signifikant größer als die rRNA und enthalten typischerweise zahlreichere und größere einzigartige Abschnitte, die als Zielsequenzen für die Hybridisierung von Nukleinsäuresonden dienen können. Es ist beispielsweise das vollständige Genom von Chlamydia trachomatis isoliert worden und es besteht aus einer relativ kleinen doppelsträngigen DNA mit einem Molekulargewicht von > 660 × 10⁶ oder geringfügig mehr als 1 × 10⁶ Basenpaaren. Jedes Bakterium enthält auch ein 4,4 × 10⁶ Dalton-Plasmid, das > 7 kBasen enthält. Anders als die rRNA dieser Spezies ist das Plasmid tatsächlich für Chlamydia in deren Gesamtheit einzigartig – es kann mit DNA aus z. B. Neisseria gonorrhea keine Kreuzhybridisierung nachgewiesen werden – es tritt keine Kreuzhybridisierung zwischen den verschiedenen Restriktionsfragmenten des Plasmids selbst auf. Sogar wenn kein anderer Abschnitt der genomischen Chlamydia-DNA für eine Verwendung als Hybridisierungsziele ausgewählt wird, ist ein Cocktail, der für die Mehrzahl von Restriktionsfragmenten des Chlamydia-Plasmids allein spezifisch ist, hinsichtlich der Länge äquivalent zu mehr als 4 Xef-lα-Sonden und kann bei Niveaus äquivalent zu zwischen 100 und 1000 Bakterien nachgewiesen werden.
C. Eine Mehrzahl von Kopien einer einzelnen Zielsequenz auf einem einzelnen DNA-Strang. Es ist erst unlängst entdeckt worden, dass flankierende Sequenzen auf jeder Seite von mehreren Genen moderate bis lange Abschnitte von Tandemwiederholungen enthalten. Ribosomale Genwiederholungen sind bei den Arten von auf DNA basierender Diagnose, die im Rahmen dieser Erfindung beschrieben werden, von besonderem Interesse. Wie die ribosomalen Gene liegen sie in hohen Kopienzahlen vor, was die Nachweisempfindlichkeit verbessert, aber die Spacer- oder Abstandshalterregionen zwischen Genen sind zusätzlich normalerweise von Spezies zu Spezies hochgradig variabel, da sie keinen Selektionsdrücken unterliegen. Eine Mehrzahl von Kopien derselben einzigartigen Sequenz auf einem einzelnen DNA-Strang repräsentiert einen besonderen Fall, bei dem die Hybridisierungsziele ein Cocktail von Loci auf jedem Genom sind; d.h, eine einzelne Sondensequenz kann eine Mehrzahl von Zielstellen derselben Sequenz und auf demselben DNA-Strang durch Hybridisierung nachweisen. Sie sind als spezies- und gattungsspezifische Sondenziele ideal geeignet.
Ein repräsentatives Beispiel für solche Sonden und Ziele wurde für die verschiedenen Spezies des Protozoenparasiten Eimeria, der bei verschiedenen Haustieren Kokzidiose hervorruft, erzeugt. Genomische DNA aus E. tenella wurde mit mehreren verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und die Fragmente wurden in geeignet geschnittene asymmetrische Plasmidvektoren ligiert und verwendet, um Escherichia coli zu transformieren. Kolonien wurden auf Wiederholungssequenzen durch Hybridisierung mit genomischer Eimeria tenella-DNA, die durch „Random- Priming" mit ³⁵S markiert worden war, gescreent. Stark hybridisierende Klone wurden gepickt und einem differenziellen Screening mit markierter genomischer DNA aus E. mitis, E. maxima, E, acervulina und E. tenella wie auch DNA aus den eng verwandten Gattungen Plasmodium, Trypanosoma und Sarcocystis unterworfen. Die Hauptmenge der Klone ergab Signale von gleicher Intensität mit DNA aus den anderen Gattungen. Einige Klone wurden jedoch spezifisch durch die Eimeria erkannt und ein Klon wurde nur durch E. tenella erkannt.
Die vollständige Sequenz des Inserts bei dem letztgenannten K1on enthält 334 Basenpaare. Eine physische/physikalische Charakterisierung der Restriktionsfragmente zeigt an, dass die Sequenz in auf Tandem-Weise wiederholten Einheiten von ungefähr 738 Basenpaaren vorhanden ist und dass ein Minimum von 30 Genen auf Tandem-Weise verknüpft ist und alle sich auf einem Chromosom zu befinden scheinen. Asymmetrische Sonden, die unter Verwendung der Tandemwiederholung als Matrize synthetisiert worden sind, enthalten 179 Formycin -Reste pro Matrizensequenz.
Sogar wenn kein anderer Abschnitt der genomischen Eimeria-DNA für eine Verwendung als Hybridisierungsziel ausgewählt wird, ist eine einzelne Sequenz-Sonde, die nur für die Mehrzahl von Kopien der Tandemwiederholung auf dem Eimeria-Genom spezifisch ist, in der Länge äquivalent zu mehr als 11 Xef-la-Sonden. Da die infektiösen Partikel bei Eimeria Oozysten sind, von denen jede 8 Genome enthält, macht ein solcher Ziel-Cocktail es möglich, weniger als 10 Oozysten nachzuweisen. Die Bedeutung von Tandemwiederholungs-Zielsequenzen erstreckt sich jedoch weit über die Empfindlichkeit oder einfach den Nachweis dieser einzelnen Gattung hinaus, da Tandemwiederholungssequenzen in genomischer DNA einer großen Vielzahl von Spezies und Gattungen auftreten und sich bei jenen Spezies unterscheiden, wodurch eine breite Basis für die Gestaltung von diagnostischen Assays für eine große Vielzahl von Pathogenen, einschließlich jenen, für die keine rRNA-Zielsequenzen existieren, bereitgestellt wird.
Beispiel 8 – Die Verwendung von nicht-spezifischen und nichthybridisierenden fluoreszierenden Oligomeren als universelle fluoreszierende „Markierungen" ("tags") durch Ligation oder chemische Verknüpfung
Eine einfache Modifizierung der Matrize, um an dem 3'-Terminus, 5'-Terminus oder beiden 3'- und 5'-Termini ein „kohäsives oder klebriges Ende" („sticky end") zu erzeugen, z. B. an ⁵ACGT-polyd (AT) , polyd (AT) -TGCA³ bzw. ^SACGT-polyd (AT) -TGCA³, ermöglicht die Synthese von RNA-Sonden mit allen der obigen Eigenschaften, die aber auch entweder (i) an gleiche Stränge, um längere fluoreszierende Sonden herzustellen, oder (ii) an andere Hybridisierungssequenzen, die für eine vorgeschriebene Ziel-DNA spezifisch sind, ligiert werden könnten. Das Letztere ist eine besonders nützliche Weise, auf welche eine universelle Markierung für ein jegliches kloniertes'DNA-Fragment produziert werden kann, und ermöglicht, dass eine gegebene Sonde durch zwei nicht-hybridisierende, aber stark fluoreszierende Sequenzen an deren Enden identifiziert werden kann ohne die Notwendigkeit, das Hybrid für einen Nachweis zu denaturieren, wie bei der einfachen poly(FU)-Sonde oben festgestellt wurde. Äquivalente nicht-hybridisierende universelle Sonden können leicht durch chemische Synthese unter Verwendung z. B. der Etheno-Analog-Phosphoramidite, z. B, von 1,N₆-Etheno-Adenosin-3'-O-phosphoramidit (eA), hergestellt werden, um nichtspezifische Markierungen zu synthetisieren, die nachfolgend mit einer beliebigen Hybridisierungssonde verknüpft werden können. Im allgemeinen können die 3'- oder 5'-Termini von solchen universellen Sonden auch für eine chemische, anstelle einer enzymatischen Anheftung an andere Oligomere oder feste Phasen, durch die Addition von z. B. 5'-Aminohexyl-, 5'-Sulfhy drylhexyl-, 3'-Aminohexylamino-, N-Hydroxysuccinimidestern und anderen derartigen Linkern, bereitstehen.
Beispiel 9 –Quantifizierung einer lumineszierenden Sonde unter Verwendung von zeitaufgelöster Fluorimetrie
Ein neues Verfahren zum Nachweis von fluoreszierenden Nukleosidanaloga, fluoreszierenden Oligonukleotiden oder analogen Sequenzen, von der Menge einer gebundenen fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonde ist basierend auf der Verwendung von Photonenzählung entwickelt worden, um die Menge eines Fluorophors in einer Probe zu messen, und wird hier nachfolgend beschrieben. Dieses Verfahren unterscheidet sich von zeitaufgelöster Spektroskopie darin, dass das Verfahren die gesamte Fluoreszenzemission von einem Fluorophor oder einer Nukleinsäuresonde unabhängig von der Wellenlänge der Emission integriert und ist sowohl eine neue Kombination von Zeit- und spektraler Integration als auch eine neue Anwendung der Photonenzählung für die Identifizierung, den Nachweis und die Quantifizierung von Nukleinsäure-Zielsequenzen für diagnostische'Assays und therapeutische Behandlungen.
Der fundamentale experimentelle Parameter, der bei einer jeglichen Lumineszenzmessung verwendet wird, ist die Intensität der Lumineszenz 1, deren Einheiten Mole Photonen pro Sekunde pro Liter ist. Da die hier verwendeten fluoreszierenden Nukleosidanaloga für alle praktischen Zwecke permanent fluoreszierend sind und im Verlauf einer typischen Messung nicht lichtbedingt ausbleichen, kann die Lumineszenz oder Fluoreszenz, die in pro Sekunde pro Mol Fluorophor emittierten Molen Photonen gemessen wird, als ein Index für die Menge an Fluorophor, und folglich Sonde, in einer Probe verwendet werden. Die bevorzugte Instrumentierung für solche Messungen, die bei Chromagen entwickelt worden ist, umfasst (i) eine zylindrische 150 Watt-Hg/Xe-CW-Lampe, die zu einer Anregung von hoher Intensität über den Bereich von 290 nm ≤ λ ≤ 320 nm in der Lage ist, (ii) einen Photoelektronenvervielfacher von ultrahoher Empfindlichkeit, bei dem die Photodynode beschichtet ist, um eine Reaktion nur über den Emissionsbereich von 360 nm ≤ λ ≤-550 nm zuzulassen, (iii) eine zylindrische Küvette mit Quarz-Anregungsfenstern, aber Glaswänden, die als Emissionsfilter dienen können. Die Küvette ist so montiert, dass die gesamte Probe vor der Photoelektronenvervielfacher-Röhre gesammelt werden kann, und (iv) 5 computergesteuerte Photonen-zählende Taktgeber („clocks"), die in Reihe angeordnet sind und jeweils in der Lage sind, zwischen Photonen mit einer Frequenz von 10⁹ pro Sekunde zu unterscheiden.
Bei Experimenten mit dem monomeren Formycin A und der Volllängen-Xef-1α-Sonde, die 489 Formycinreste enthält, unter Bedingungen von Raumtemperatur und pH = 10 haben wir festgestellt, dass (i) die Lumineszenz von Reihenverdünnungen des Monomers und der Sonde in linearer Beziehung zu der Konzentration steht und (ii) die Lumineszenz der Sonde äquivalent zu der gleichen Anzahl von freien Monomeren ist. In einem typischen Assay unter Verwendung von permanenten Fluorophoren wie jenen, die in den 17 und 18 gezeigt sind, wird die Menge an Zielsequenz, die in einer Probe vorhanden ist, bestimmt, indem Hybride denaturiert werden, nachdem nicht-gebundene Sonde weggewaschen worden ist, und die Menge an Sonde, die gebunden worden war, gemessen wird. Die Fluoreszenzäquivalenz von Resten in einer analogen Sondensequenz zu der Emission der gleichen Anzahl von Monomeren unter alkalischen Bedingungen, die hier verwendet wurden, zeigt an, dass in dem Oligomer ein vernachlässigbares Selbst-Quenchen stattfindet, und demonstriert, dass die Lumineszenz der Sonde direkt verwendet werden kann, um die Menge an Sonde, die durch Ziel-RNA oder -DNA gebunden wird, zu quantifizieren, wodurch eine breite Basis für die Gestaltung von diagnostischen Detektoren für eine große Vielzahl von Nukleinsäureassays und Diagnostik bereitgestellt wird. Es ist eine wichtige Konsequenz der Erfindung, dass Empfindlich keit und Signal-Rauschverhältnisse eine Funktion der Anzahl der gezählten Photonen und der Anzahl von Zeitspannen, während welchen das Zählen erfolgt, sind.
Beispiel 10 – Anheftung von 5'- und 3'-Linkern für eine Immobilisierung der Oligonukleotide und Hybride oder für eine Anheftung von fluoreszierenden Oligomeren als „Markierungen"
Die Chemien und Vorgehensweisen der Erfindung können verwendet werden, um eine jegliche Sonde, die unter Verwendung von fluoreszierenden Nukleosidanaloga synthetisiert wird, unabhängig davon, ob die Synthese enzymatisch oder chemisch erfolgt, für sowohl Fluoreszenz als auch Hybridisierungsspezifität zu erzeugen und zu charakterisieren. Solche Sonden können nicht nur bei den in Lösung erfolgenden Hybridisierungsformaten, die hier beschrieben werden, eingesetzt werden, sondern auch in den häufiger verwendeten Laborprozeduren, wie „dot-blot"-Detektion, Elektrophorese in Agarose- oder Polyacrylamidgelen, Southern-Blotting und Hybridisierung auf Filtern und Membranen wie auch eine Trennung der Hybride durch HPLC oder Kapillarelektrophoresemethoden. Obwohl Linker für die in Lösung erfolgende Hybridisierung nicht essentiell sind, kann ein jeglicher geeigneter Affinitätslinker, wie Biotin/Avidin, oder homooder heterodifunktionaler Linker verwendet werden, um die Sonde oder das Hybrid für die Zwecke von Aufkonzentrierung, Isolierung oder Nachweis einzufangen, wie für die PCR-amplifizierten DNA-Fragmente von 13 veranschaulicht. Die Erfindung umfasst durch Linker derivatisierte fluoreszierende Nukleotide wie auch Oligonukleotide, durch Linker derivatisierte Primer für eine Verwendung bei einer Amplifizierung und einen nachfolgenden Nachweis mit fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden, Oligonukleotid-Sonden, Plasmide und Therapeutika, die ausgehend von diesen hergestellt oder in anderer Weise „markiert" („tagged") worden sind, und/oder deren Verwendungen und Anwendungen, so wie sie beispielsweise hier beschrieben werden. Solche Derivatisierungen umfassen, sind aber nicht be schränkt auf Transaminierungen an Purin- oder Pyrimidinnukleosiden und/oder deren fluoreszierenden Strukturanaloga, Aminothiol-, Azido-, Aldehyd-, Hydroxysuccinimid-, 5'-Aminoalkyl-3'-O-phosphoramidit-, 5'-Thioalkyl-3'-O-phosphoramidit-, 3'-Aminohexylamino-, Aminosilane- und Aminosilyl-Derivate und andere solche Linker und Gruppen, die mit Linkern oder in Kondensationsreaktionen, wie Schiff Base-Kondensationen von 3'oder 5'-oxidierten cis-Diolen, wie sie einem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig sind, reagieren können. Um dies zu veranschaulichen, wird ein spezieller Fall aufgeführt:

(i) Es wurde ein Satz von nicht-fluoreszierenden Amplifizierungsprimern für die MOMP-Gensequenz chemisch synthetisiert; am Ende der Synthese wurde ein zusätzlicher Zyklus verwendet, um 5'-Aminoüexyl-3'-O-phosphoramidit an den 5'-Terminus des fertiggestellten Primers anzufügen, wobei der Anhang chemisch unter Verwendung von Standard-Phosphotriesterchemie synthetisiert wurde.
(ii) Nach der Abspaltung von dem feste Phase-Träger in starker ethanolischer Base wurde die terminale Aminogruppe von jedem Strang mit NHS-Biotinester umgesetzt, um die 5'-biotinylierten Primer bereitzustellen.
(iii) Die Primer wurden für eine Standard-Amplifizierung verwendet, nach welcher die Amplimere auf avidinylierten Filterplatten mit 96 Vertiefungen eingefangen wurden und gewaschen wurden, um nicht-umgesetzte Materialien und Verunreinigungen zu entfernen.
(iv) Die eingefangenen Amplimere wurden mit mit fluoreszierendem Analog markierten Oligonukleotid-Sonden hybridisiert, wie oben beschrieben, und die Menge an Zielsequenz in den Amplimeren quantifiziert.

Solche Anheftungen von fluoreszierenden Oligonukleotiden an andere fluoreszierende oder nicht-fluoreszierende Oligonukleotide, an immobilisierende Körnchen, Filter oder aktivierte Kunststoffplatten und die durch enzymatische Anheftung, wie Ligation, oder chemische Anheftung durch solche Linker, wie sie hier beschrieben werden, vorgenommen werden, werden von der Erfindung umfasst.
Beispiel 11 – Verwendungen von Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET), um die Verwendungen von fluoreszierenden Nukleosidanaloga und Sonden zu erweitern oder zu verstärken
Oligonukleotide können synthetisiert oder derivatisiert werden, wie hier beschrieben, die zwei oder mehr spektral unterschiedliche, nachweisbare Markierungen aufweisen, entweder durch Verwendung von zwei oder mehr Nukleosidanaloga mit unterschiedlichen Fluoreszenzemissionseigenschaften oder durch Verwendung eines kovalent gebundenen FRET-Akzeptors, wie hier vorstehend beschrieben wird. FRET-Akzeptoren können auch verwendet werden, um die Nachweisempfindlichkeit für die fluoreszierenden Sonden zu verstärken oder zu erweitern, wenn sie einfach in Lösung vorliegen, so dass sie als Akzeptoren der Sondenemission wirken. Beispielsweise überlappen die Anregungsspektren von solchen Farbstoffen, wie den Cumarinen, z. B. 7-Amino-4-methylcumarin-3-acetat, 7-Methylumbelliferon, den Naphthalin- und Rnthracen-Farbstoffen u. s. w., das Emissionsspektrum von Oligomeren, die ausgehend von den fluoreszierenden Nukleosidanaloga, z. B. poly(FU), hergestellt worden sind, aber nicht das Anregungsspektrum der Oligomere. Solche Farbstoffe, wie 7-Amino-4-methylcumarin-3-acetat, können folglich verwendet werden entweder (i) als ein kovalent gebundener FRET-Akzeptor, z. B. indem der N-Hydroxysuccinimidester mit vorgeschriebenen Aminogruppen an dem Oligomer umgesetzt wird, oder (ii) durch einfaches Hinzufügen des Farbstoffs zu einer Lösung der Sonde, so dass er als ein FRET-Akzeptor der Sondenfluoreszenz wirkt. Zusätzlich zu den offensichtlichen Vorteilen einer Bereitstellung einer zweiten fluoreszierenden Markierung für die Hybridisierungssonde ermöglicht diese Methodik die Amplifizierung des Sondensignals durch einen effizienteren Einfang des emittierten Lichts, eine Verringerung von Hintergrundlicht aufgrund von Lichtstreuung ausgehend von Anregungsquellen und einen Nachweis bei längeren sichtbaren Wellenlängen.
Es sollte sich verstehen, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur Veranschaulichungszwecken dienen und dass Fachleuten auf diesem Gebiet verschiedene Modifizierungen oder Veränderungen im Lichte von diesen naheliegen werden und innerhalb des Geistes und Geltungsbereichs dieser Anmeldung und des Umfangs der beigefügten Ansprüche enthalten sein sollen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Ziel-Nukleotids in einer Probe, welches umfasst, die Probe unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Oligonukleotid-Sonde, die mit dem Ziel spezifisch hybridisiert, in Kontakt zu bringen und eine Hybridisierung nachzuweisen, indem eine Fluoreszenz oder eine Änderung der Fluoreszenz beobachtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde ein fluoreszierendes Nukleosid anstelle von einem beliebigen der sechs üblicherweise vorkommenden nichtfluoreszierenden Nukleoside umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das fluoreszierende Nukleosid sich am 3'- oder 5'-Ende der Sonde befindet. 3, Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde 5 bis 10000 Basen lang ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Sonde ferner eine 5'→ 3'-Linkergruppe umfasst, die eine Affinität für einen festen Träger, der aus Glas, Agarose, Acrylamid, Ny-lon und Nitrocellulose ausgewählt wird, aufweist oder chemisch an einen solchen bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei eine Hybridisierung durch das Quenchen von Fluoreszenz nachgewiesen wird. 6, Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das fluoreszierende Nukleosid eine der folgenden Strukturen aufweist
worin ---X₁ und ---X₆ jeweils =C, =Si oder -N sind; X₂ CR₉, SiR₉ oder N ist; X₃ CR₈, SiR₈ oder N ist; X₄ und X₅ jeweils CH, SiH oder N sind; mit der Maßgabe, dass wenigstens eines von X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ N ist; R₄ NH₂, SH oder OH ist; ---N-R₅ =N, -NH oder -N-CH=CH-, das an R₄ gebunden ist, ist; R₆ H, NH₂, SH, OH oder =O ist; R₈ und R9 unabhängig voneinander H, Br, F, I, Alkyl oder Aryl ist; ^R10 ^H, eine säureempfindliche, basenstabile Blockierungsgruppe oder ein Phosphorderivat ist; ^R12 H, OH, Amino, Azido, Thiol, eine ungesättigte Gruppe oder ein Phosphorderivat ist; und ^R14 H, OH oder OR₃ ist, wobei R3 eine Schutzgruppe oder ein Fluorophor ist; mit der insgesamten Maßgabe, dass wenigstens eines von R₁₂ und R₁₄ H ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei Rio aus H, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, β,γ-Methylen-2'-triphosphat, 5'-O-Phosphoramidit, Phosphodiester, Methylphosphonat, Phosphorthioat, Phosphoramidit und Phosphotriester ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei R₁₂ OP (OR₁₆) -N (R₁₆) z ist; R₁₄ H ist; R₁₅ Methyl, β-Cyanethyl, p-Nitrophenyl, o-Chlornitrophenyl oder p-Chlorphenyl ist; und R₁₆ Niederalkyl, vorzugsweise Methyl oder Isopropyl, oder heterocyclisch, wie Morpholino, Pyrrolidino oder 2,2,6,6-Trimethylpyrrolidino, ist.
Verfahren nach Anspruch 6, welches umfasst, (A) einzelsträngige Nukleinsäure aus der Probe zusammen zu bringen mit der fluoreszierenden Sonde von 5 bis ungefähr 10000 Basen Länge, und wobei (i) die Sequenz der fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonde analog zu der komplementären Sequenz des Abschnitts der Ziel-DNA oder -RNA, mit dem sie hybridisieren soll, ist; (ii) die fluoreszierende Oligonukleotid-Sonde zu einer Watson-Crick-Basenpaarung in der Lage ist, derart, dass jedes fluoreszierende Nukleosidanalog Basenpaare nur mit dem komplementären Molekül des üblicherweise vorkommenden Nukleotids, das durch dieses ausgetauscht worden ist, bildet; und (iii) die Ableitung von einzelsträngiger Nukleinsäure mit der fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonde unter Bedingungen ausgeführt wird, dass stabile Doppelstränge oder Hybride sich (a) nur zwischen den fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden und jenem Abschnitt oder jener Sequenz der in der Probe vorhandenen Ziel-DNA oder -RNA, an den oder die die zu der Ziel-DNA oder -RNA komplementäre Sequenz binden würde, bilden; aber sich (b) nicht signifikant zwischen fluoreszierender Oligonukleotid-Sonde und Nicht-Ziel-DNA oder -RNA in den Fragmenten davon bilden; und (B) zu bestimmen, ob in Schritt (A) ein stabiler Doppelstrang gebildet worden ist, durch: (i) (a) Trennen der nicht-hybridisierten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonde von hybridisierten fluoreszierende Sonde : Ziel-Nukleinsäure-Doppelsträngen, die in Schritt (A) gebildet worden sind; oder (b) Binden der in einen Doppelstrang eingebauten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonde, sofern erforderlich, an eine feste Phase, um ein Waschen und/oder eine Aufkonzentrierung zu vereinfachen; (ii) Denaturieren der isolierten Hybride; und (iii) Bestimmen, ob ein detektierbares Signal vorhanden ist, durch die Behandlung von '(A) (iii) (a) als einen Indikator für das Vorhandensein der biologischen Einheit oder einer genetischen Mutation in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Vorhandensein einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einer Probe getestet wird durch Amplifizierung unter Verwendung von Primern, die an ihren 5'-Enden modifiziert worden sind, um eine spezifische chemische oder Affinitäts-Verknüpfung, Adsorption oder Bindung an einen festen Träger zu ermöglichen, wobei der Träger Polystyrol-Körnchen (-Beads), Platten mit 96 Vertiefungen, Agarose, Polyacrylamid, Nylon oder Nitrocellulose umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, welches umfasst: (A) Einbauen eines Ribonukleotids oder Desoxyribonukleotids, das durch Einbauen oder Anheftung daran von fluoreszie renden Nukleotidanalogen modifiziert worden ist, in ein Polynukleotid, das komplementär oder zu dem zu dem Polynukleotid komplementären Strang analog ist; und (B) Hybridisieren des komplementären fluoreszierenden oder analogen komplementären fluoreszierenden Oligonukleotids an das Ziel-Polynukleotid; und Detektieren des Vorhandenseins der Nukleotide durch die Fluoreszenz der Sonde.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Hybridisierungsschritt oder Detektionsschritt an einer festen Phase ausgeführt wird.
Kit zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Ziel-Nukleotidsequenz in der Nukleinsäure einer biologischen Probe, welcher umfasst: (A) ein Primer-Polynukleotid, umfassend eine Primersequenz, die im wesentlichen komplementär zu einer Ziel-Nukleotidsequenz in einer biologischen Probe ist, wobei die Ziel-Nukleotidsequenz ein Oligdnukleotidsegment umfasst, welches zu dem 3'-terminalen Abschnitt des Primers komplementär ist, um eine Matrize für eine Primerabhängige Nukleinsäurepolymerase zu bilden; (B) eine Mehrzahl von Nukleotidtriphosphaten, wobei wenigstens eines der Triphosphate ein fluoreszierendes Nukleosidanalog ist; (C) eine Primer-abhängige DNA-Polymerase, die die Primer in einer 5'→ 3'-Richtung verlängert, wenn das 3'-Ende des Primers Basenpaarungen zu einer Matrizen-DNA-Sequenz ausbildet und an diese hybridisiert; und (D) eine fluoreszierende Oligonukleotid-Sonde, umfassend eine analoge komplementäre Sequenz zu dem Ziel-Oligonukleotid, welche stark und spezifisch mit der Zielsequenz für einen Nachweis, eine Identifizierung, Lokalisierung und Quantifizierung der Ziel-Nukleotidsequenz hybridisieren kann.