JP5146957B2 - 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対 - Google Patents
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Description
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸である、態様1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸である、態様1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして、
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドと、
以下の式2:
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドとが、塩基対を形成している核酸。
A1)7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A2)7−(2−チアゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A3)7−(1H−2−イミダゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A4)5−アミノ−7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A5)5−アミノ−7−(2−チアゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A6)5−アミノ−7−(1H−2−イミダゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A7)4−(2−チエニル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基;
A8)4−(2−チアゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基;
A−9)4−(1H−2−イミダゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基:
A−10)6−アミノ−4−(2−チエニル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基;
A−11)6−アミノ−4−(2−チアゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基;及び
A−12)6−アミノ−4−(1H−2−イミダゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基
からなるグループから選択される、態様13に記載の核酸。
B1)2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基
B2)2−ホルミル−4−ヨード−1H−ピロール−1−イル基;
B3)2−ホルミル−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;
B4)2−ホルミル−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B5)2−ホルミル−4−(2−置換アミノビニル)−1H−ピロール−1−イル基;
B6)2−ホルミル−4−(3−置換アミノ−1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B7)2−ニトロ−1H−ピロール−1−イル基;
B8)2−ニトロ−4−ヨード−1H−ピロール−1−イル基;
B9)2−ニトロ−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;
B10)2−ニトロ−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B11)2−ニトロ−4−(2−置換アミノビニル)−1H−ピロール−1−イル基;及び
B12)2−ニトロ−4−(3−置換アミノ−1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基
からなるグループから選択される、態様13に記載の核酸。
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式2:
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式2の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式1の塩基を有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法。
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式1:
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式1の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式2の塩基を有するヌクレオチドを取り込む
ことを含む、前記調製方法。
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するリボヌクレオシド 5’−三リン酸。
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するリボヌクレオシド 5’−三リン酸。
R5は、水素又は置換アミノ基であり、
R6は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
AはN又はCHである。]
で表される塩基を有する5’−O−(4、4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト)デオキシリボヌクレオシド。
R7は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R8は、ホルミル基又はニトロ基であり、
ただし、R7が水素又は1−プロピニル基で、R8がホルミル基の場合を除く。]
で表される塩基を有する5’−O−(4、4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト)デオキシリボヌクレオシド。
本発明者は、複製と転写の反応において、効率および選択性に優れた人工塩基対を得るために、自分たちが開発したいくつかの非天然型塩基対を組み合わせることによって構築される塩基対を研究した。
しかしながら、鋳型中のDsに対してdDsTP(Vmax/KM=2.0×105)が効率よく取り込まれてしまい、Dsに対するdPaTPの導入効率(Vmax/KM=6.2×104)よりも高い効率であった。このDs−Ds対は、問題とされる塩基の形の相補性に従わない疎水性塩基−疎水性塩基間の塩基対形成であるため、B型DNA構造を変形させてしまう。その結果、鋳型中のDsに対してdDsTPが導入されると、その後の複製の伸長が停止してしまう。例えば、Dsを含む鋳型DNAを用いて、dPaTPとdDsTPの両基質を含む溶液中でプライマー伸長反応を行うと、dDsTPの増加とともに(dPaTPの0.5または1モル等量)鋳型中のDsに対してdDsTPが取り込まれてしまうので、3’ →5’エキソヌクレアーゼ活性を有するクレノウフラグメント(KF exo+)によるプライマー伸長は阻害された(図2d、レーン3および4)。
2)複製反応において、エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いる;そして、
3)後述の式1の塩基を有するヌクレオチドと式2の塩基を有するヌクレオチドとの人工塩基対を利用する。
本発明は、一態様において核酸の新規な複製方法を提供する。本発明の方法は、複製反応においてアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸を基質として用いることを特徴とする。
2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)と2−オキソ−(1H)ピリジン−3−イル基(y)(特許文献1、非特許文献17)
2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン−9−イル基(v)と2−オキソ−(1H)ピリジン−3−イル基(y)(特許文献3、非特許文献18)
ピロール−2−カルバルデヒド(Pa)と7−メチル−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(Q)(非特許文献26、非特許文献34)
本発明者はさらに、新規な人工塩基対を考案し、2005年8月4日に特許出願を行った(特願2005−226492号)。上記出願は、ピロール−2−カルバルデヒド(Pa)と2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)との人工塩基対に関する。上記塩基対は、特にPaを鋳型としsを基質とする転写反応において優れた選択性を示す。
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸である。
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸である。
本発明はまた、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸を提供する。
本発明者は、複製、転写及び翻訳の全ての反応において、効率および選択性に優れた人工塩基対を得るために、自分たちが開発したいくつかの非天然型塩基対を組み合わせることによって構築される塩基対を研究した。その結果、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル(s)(非特許文献17、33)と2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル(Pa)(非特許文献26)の組み合わせが、転写において高度な選択性および効率を示すことを見出した(特許文献4:未公開)。
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして、
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドと、
以下の式2:
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドとが、塩基対を形成している核酸を提供する。
A1)7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Ds);
A2)7−(2−チアゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dv);
A3)7−(1H−2−イミダゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A4)5−アミノ−7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Ds);
A5)5−アミノ−7−(2−チアゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dv);
A6)5−アミノ−7−(1H−2−イミダゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A7)4−(2−チエニル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(DDs);
A8)4−(2−チアゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(DDv);
A−9)4−(1H−2−イミダゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基:
A−10)6−アミノ−4−(2−チエニル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(DDs);
A−11)6−アミノ−4−(2−チアゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(DDv);及び
A−12)6−アミノ−4−(1H−2−イミダゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基
からなるグループから選択される。
及び
からなる群より選択される。
B1)2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基(Pa)
B2)2−ホルミル−4−ヨード−1H−ピロール−1−イル基;
B3)2−ホルミル−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;
B4)2−ホルミル−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B5)2−ホルミル−4−(2−置換アミノビニル)−1H−ピロール−1−イル基;
B6)2−ホルミル−4−(3−置換アミノ−1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B7)2−ニトロ−1H−ピロール−1−イル基(Pn);
B8)2−ニトロ−4−ヨード−1H−ピロール−1−イル基;
B9)2−ニトロ−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;
B10)2−ニトロ−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B11)2−ニトロ−4−(2−置換アミノビニル)−1H−ピロール−1−イル基;及び
B12)2−ニトロ−4−(3−置換アミノ−1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基
からなるグループから選択される。
本発明はまた、以下の式1:
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式2:
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式2の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式1の塩基を有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法を提供する。
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式1:
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式1の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式2の塩基を有するヌクレオチドを取り込む
ことを含む、前記調製方法を提供する。
また、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸(DNA又はRNA)(例えば、mRNA、合成RNA)は、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。本発明の核酸は遺伝子断片やプローブなどとして使用されうる。天然の遺伝子の一部又は全部を本発明の核酸で置換した態様、天然の遺伝子に本発明のヌクレオチドを1個又はそれより多く付加したもの、又はこれらを組み合わせたものも本発明に包含される。
本発明は、さらに以下の式1:
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するリボヌクレオシド 5’−三リン酸を提供する。
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するリボヌクレオシド 5’−三リン酸を提供する。
R5は、水素又は置換アミノ基であり、
R6は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
AはN又はCHである。]
で表される塩基を有する5’−O−(4、4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト)デオキシリボヌクレオシド、を提供する。
R7は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R8は、ホルミル基又はニトロ基であり、
ただし、R7が水素又は1−プロピニル基で、R8がホルミル基の場合を除く。]
で表される塩基を有する5’−O−(4、4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト)デオキシリボヌクレオシドを提供する。
1.一般的な方法及び材料
試薬及び溶媒は、標準的な供給業者より購入し、さらなる精製なく使用した。2次元薄層クロマトグラフィー(2D TLC)は、254nm蛍光指示薬(Merck)を含む0.25mmシリカゲル60プレートを用いて、転写反応をモニターした。1H NMR、13C NMR及び31P NMRスペクトルは、JEOL EX270及びBRUKER核磁気共鳴スペクトロメーター(300MHz及び600MHz)上に記録した。分取用C18カラム(Waters Microbond Sphere、150×19mm)を備えたGilson HPLCシステム上で、ヌクレオシド精製を行った。DEAE−セファデックス A−25カラム(300×15mm)及び分析用C18カラム(Synchropak RPP、250×4.6mm、Eichrom Technologies)で、三リン酸誘導体を精製した。
7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジンの合成は、図22に記載の反応によって行った。具体的には、7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(化合物4)は、2−アミノ−3−ニトロ−4−クロロピリジン(化合物1)(非特許文献41)から3工程で合成した(72%)。7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジンのデオキシリボヌクレオシド(化合物6)は、1−クロロ−2−デオキシ−3,5−ジ−O−トルオイル−α−D−エリスロ−ペントフラノース(非特許文献42)と化合物4のナトリウム塩との反応、続く、メタノールアンモニウムを用いた化合物5からの、トルオイル基の脱保護によって、化合物4から単一産物として収率61%で得られた。
(1)2−アミノ−3−ニトロ−4−(2−チエニル)ピリジン(化合物2)
DMF(50ml)中の2−アミノ−3−ニトロ−4−クロロピリジン(化合物1)(非特許文献41)(1.74g、10mmol)及びジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(350mg、0.50mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で2−(トリブチルスタニルチオフェン(3.82ml、12mmol)を加えた。得られた混合物を100℃で4時間攪拌した。混合物を水(250ml)に注ぎ、そして、酢酸エチル(250ml×3)で抽出した。Na2SO4上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を、塩化メチレン:酢酸エチル(100:1から49:1)を溶出剤として用いるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーに装填した。2.07gの化合物2(塩化メチレン:酢酸エチル=19:1上でRf0.30)が93%の収率で得られた。
8.17(d,1H,J=5.1Hz),
7.4(dd,1H,J=5.0及び1.1Hz),
7.12(dd,1H,J=3.6及び1.1Hz),
7.07(dd,1H,J=5.0及び3.6Hz),
6.77(d,1H,J=5.1Hz),5.66(bs,2H)。
C9H8N3O2S (M+1): 計算値 222.0337; 観測値 222.0337。
130mlエタノールと65mlの酢酸エチル中の、化合物2(2.06g、9.3mmol)と466mg パラジウム炭素(10重量%)との混合物に、28mlの1M ホウ化水素ナトリウム水溶液を0℃で加えた。得られた混合物を0℃で1時間攪拌した。混合物に43mlの5% 塩化アンモニウム水溶液を加えた。混合物を、セライトで濾過した。濾過物に500mlの水を加えた。エタノール及び酢酸エチルを蒸発させた後、混合物を酢酸エチルで抽出した(250ml×3)。Na2SO4上で乾燥させた後、溶媒を留去した。残渣を、塩化メチレン:酢酸エチル(19:1から93:7)を溶出溶媒にしてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。1.46gの化合物3(塩化メチレン:酢酸エチル=9:1上でRf0.24)が82%の収率で得られた。
7.64(d,1H,J=5.1Hz),
7.40(dd,1H,J=5.1及び1.1Hz),
7.23(dd,1H,J=3.5及び1.1Hz),
7.14(dd,1H,J=5.1及び3.5Hz),
6.74(d,1H,J=5.1Hz),
4.26(bs,2H),3.72(bs,2H)。
C9H10N3S (M+1): 計算値 192.0595; 観測値 192.0588。
化合物3(956mg、5.0mmol)のギ酸溶液(15ml)を、12時間、環流した。反応混合物中に、氷冷浴上で、24mlの28%NH4OHを加えた。得られた沈殿物を濾過し、H2O及びエチルエーテルで洗浄し、そして60℃で12時間乾燥させて7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(970mg、96%)を得た。
13.20(s,1H), 8.48(s,1H), 8.30(m,2H),
7.78(dd,1H,J=1.0及び5.1Hz),
7.54(d,1H,J=5.1Hz),
7.25(dd,1H,J=3.8及び4.9Hz)。
113.12, 128.00, 128.71, 129.24,
130.00, 131.16, 137.60, 143.44,
144.09, 148.66。
C10H8N3S (M+1): 計算値 202.0439; 観測値 202.0444。
化合物4(403mg、2.0mmol)のCH3CN溶液(32ml)に、NaH(96mg、2.4mmol、鉱油中60%分散液)を加えた。得られた混合物を室温で
1時間攪拌した。混合物に、2−デオキシ−3,5−ジ−O−p−トルオイル−α−D−エリスロ−ペントフラノシル クロリド(933mg、2.4mmol)(非特許文献42)を加えた。室温下で2.5時間攪拌した後、反応混合物を酢酸エチルと水によって分離した。有機層を飽和食塩水で3回洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた後、減圧下で留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中、0.5%メタノール)によって産物を精製し、化合物5を得た(714mg、65%)。
8.32(d,1H,J=5.3Hz), 8.26(s,1H),
8.16(dd,1H,J=3.8及び1.2Hz),
7.93(m,4H),7.50(dd,1H,J=5.1及び1.2Hz),
7.47(d,1H,J=5.3Hz), 7.22(m,5H),
6.68(dd,1H,J=8.6及び5.8Hz),
5.82(m,1H), 4.69(m,3H),
3.18(ddd,1H,J=14.2,8.6及び6.4Hz),
2.86(ddd,1H,J=14.2,5.8及び2.0Hz),
2.43(s,3H), 2.37(s,3H)。
C31H28N3O5S (M+1): 計算値 554.1750; 観測値 554.1748。
1.33g(2.40mmol)の化合物5に、0℃でアンモニア飽和メタノール(120ml)を加えた。溶液を室温で2時間攪拌した。反応後、溶媒を留去し、残渣を、塩化メチレン:エタノール(97:3から93:7)を溶出溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。717mgの化合物6が94%の収率で得られた。
8.75(s,1H), 8.35(d,1H,J=5.1Hz),
8.30(d,1H,J=3.7Hz), 7.83(d,1H,J=5.1Hz),
7.65(d,1H,J=5.1Hz), 7.28(t,1H,J=4.2Hz),
6.54(t,1H,J=6.9Hz), 5.34(d,1H,J=4.1Hz),
5.11(t,1H,J=5.7Hz), 4.46(m,1H),
3.91(m,1H), 3.60(m,2H),
2.80(m,1H), 2.37(m,1H)。
147.10, 144.04, 143.62, 137.06,
132.00, 131.00, 129.78, 129.06,
128.07, 113.93, 87.88, 83.72,
70.80, 61.74, 39.40。
C15H16N3O3S (M+1): 計算値 318.0912; 観測値 318.0905。
ε= 2.04×104 25mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 6.8中。
化合物6の317mg(1.0mmol)部分を、乾燥ピリジンで3回共沸させた。これに、5.0mlの無水ピリジンを加え、さらに、ジメトキシトリチルクロリド(356mg、1.1mmol)を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した後、水(50ml)に注ぎ、塩化メチレン(50ml×3)で抽出した。Na2SO4上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を、塩化メチレン:酢酸エチル(9:1から13:7)を溶出溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。550mgの化合物7を89%の収率で得た。
8.29(d,1H,J=5.1Hz), 8.22(s,1H),
8.17(dd,1H,J=3.8及び1.1Hz),
7.49(dd,1H,J=5.1及び1.1Hz),
7.44(d,1H,J=5.1Hz), 7.37(m,2H),
7.27(m,5H), 7.20(m,3H), 6.78(m,4H),
6.57(dd,1H,J=6.5及び6.2Hz),
4.66(m,1H), 4.12(m,1H), 3.75(s,3H),
3.75(s,3H),
3.42(dd,1H,J=10.1及び4.6Hz),
3.38(dd,1H,J=10.1及び5.4Hz),
2.86(m,1H),
2.56(ddd,1H,J=13.8,6.5及び4.6Hz),
2.06(d,1H,J=3.5Hz)。
C36H34N3O5S (M+1): 計算値 620.2219; 観測値 620.2230。
化合物7(425mg、0.69mmol)を、無水ピリジンで3回、次いで、無水アセトニトリルで3回、共沸させた。これを無水アセトニトリル(4.6ml)中に溶かし、262μl(0.82mmol)の2−シアノエチル テトライソプロピルホスホロジアミダイト、及び0.45M テトラゾールのアセトニトリル溶液(1.68ml)を加えた。この混合物を1時間室温で攪拌した。混合物に90μlの無水メタノールを加えた後、混合物を水(50ml)に注ぎ、1%トリエチルアミン(v/v)を含む塩化メチレン(50ml×3)で抽出した。Na2SO4上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を、2%トリエチルアミン(v/v)を含む、ヘキサン:酢酸エチル(4:1から3:2)を溶出溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。490mgの化合物8を87%の収率で得た。
8.65(m,1H), 8.27(m,1H), 8.23(m,1H),
7.81(m,1H), 7.62(m,1H), 7.26(m,3H),
7.18(m,7H), 6.75(m,4H), 6.54(m,1H),
4.81(m,1H), 4.13(m,1H),
3.84−3.45(m,10H), 3.21(m,3H),
2.82−2.48(m,3H) 1.13(m,12H)。
148.76ppm 及び 148.14ppm。
C45H51N5O6SP (M+1): 計算値 820.3298; 観測値 820.3325。
化合物7(124mg、0.20mmol)を無水ピリジンで3回、共沸した。これを無水ピリジン(2.0ml)で溶かし、さらに38μl(0.40mmol)の無水酢酸を加えた。得られた混合物を、室温で2日間攪拌した。混合物を水(50ml)に注ぎ、塩化メチレン(50ml×3)で抽出した。Na2SO4上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を20mlの無水塩化メチレンに溶かし、これに0℃で200μlのジクロロ酢酸を加えた。混合物を2℃で15分間攪拌した後、8mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、これに42mlの水を加え、塩化メチレン(50ml×3)で抽出した。Na2SO4上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を、塩化メチレン:酢酸エチル(9:1から3:2)を溶出溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。65mgの化合物9を88%の収率で得た。
8.29(d,1H,J=5.4Hz),
8.18(dd,1H,J=3.8及び1.1Hz),
8.13(s,1H), 7.53(dd,1H,J=5.0及び1.1Hz),
7.50(d,1H,J=5.4Hz),
7.20(dd,1H,J=5.0及び3.8Hz),
6.69(m,1H), 6.37(dd,1H,J=10.1及び5.4Hz),
5.58(m,1H), 4.28(m,1H), 3.96(m,2H),
3.32(ddd,1H,J=15.9,10.1及び5.9Hz),
2.41(m,1H), 2.12(s,3H)。
C17H18N3O4S (M+1): 計算値 360.1018; 観測値 360.0993。
化合物4(80mg、0,4mmol)、テトラ−O−アセチル−β−D−リボフラノース(130mg、0.4mmol)及びクロロ酢酸(2mg)の混合液を200℃で5分間加熱した。得られた暗色のシロップにメタノールアンモニア(40ml)を加え、室温で18時間処理した。溶媒を減圧下で留去し、残渣に30%CH3CN水溶液を加え、そして、産物を逆相HPLCによって精製して化合物11を得た(39mg、29%、2工程)。
8.78(s,1H), 8.36(d,1H,J=5.2Hz),
8.31(dd,1H,J=1.0及び3.7Hz),
7.84(dd,1H,J=0.9及び5.1Hz),
7.66(d,1H,J=5.2Hz),
7.28(dd,1H,J=3.7及び5.0Hz),
6.08(d,1H,J=5.8Hz), 5.49(d,1H,J=6.0Hz),
5.26(t,1H,J=6.5Hz), 5.20(d,1H,J=4.9Hz),
4.67(q,1H,J=5.8Hz), 4.20(q,1H,J=4.9Hz),
4.00(m,1H), 3.71(m,1H), 3.59(m,1H)。
147.29, 144.07, 143.91, 137.00,
132.13, 131.08, 129.86, 129.14,
128.10, 114.02, 87.76, 85.57,
73.48, 70.43, 61.43。
C15H16N3O4S (M+1): 計算値 334.0862; 観測値 334.0871。
化合物11(99mg、0,29mmol)を無水ピリジンで3回、共沸し、そしてピリジン(3.0ml)中に溶解した。この溶液に、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(106mg、0.31mmol)を加え、混合物を室温で2時間攪拌した。反応混合物を5%NaHCO3水溶液に注ぎ、そして酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で3回洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして溶媒を減圧下で留去した。産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1%メタノール−CH2Cl2)で精製し、化合物12を得た
(131mg、71%)。
8.39(s,1H), 8.28(d,1H,J=5.2Hz),
8.25(d,1H,J=3.4Hz), 7.52(t,2H,H=5.7Hz),
7.22(m,2H), 7.14(m,7H), 6.69(m,5H),
6.04(d,1H,J=6.2Hz), 4.77(m,1H),
4.48(m,1H), 4.34(d,1H,J=4.6Hz),
3.70(s,6H), 3.46(dd,1H,J=3.4及び10.5Hz),
3.23(dd,1H,J=2.9及び10.5Hz)。
C36H34N3O6S (M+1): 計算値 636.2168; 観測値 636.2173。
化合物12(120mg、0.19mmol)を無水ピリジンで3回、共沸した。これを無水ピリジン(1.9ml)に溶かし、さらに72μl(0.76mmol)の無水酢酸を加えた。この混合物を、室温で7時間攪拌した。混合物を5%NaHCO3(50ml)及び酢酸エチル(50ml)に注いだ。有機層を飽和食塩水で1回洗浄した。Na2SO4で有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣をトルエンで2回共沸した後、CH2Cl2(19ml)に溶かし、190μlのジクロロ酢酸を0℃で加えた。この反応混合物を0℃で15分間攪拌した。混合物を5%NaHCO3に注ぎ、CH2Cl2で抽出した。有機層を飽和食塩水で1回洗浄し、そして、Na2SO4で有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。産物を、2%メタノール−塩化メチレン溶液を溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。77mgの化合物13を93%の収率で得た。
8.79(s,1H), 8.37(d,1H,J=5.2Hz),
8.29(dd,1H,J=1.2及び3.7Hz),
7.84(dd,1H,J=1.1及び5.1Hz),
7.68(d,1H,J=5.2Hz),
7.27(dd,1H,J=3.7及び5.1Hz),
6.38(d,1H,J=6.8Hz),
6.02(dd,1H,J=5.6及び6.6Hz),
5.54(m,2H), 4.26(m,1H), 3.71(m, 2H),
2.14(s,3H), 1.98(s,3H)。
169.55, 169.22, 146.98, 144.39,
143.85, 136.74, 132.50, 131.02,
130.11, 129.32, 128.14, 114.36,
85.20, 83.63, 72.34, 71.23, 61.05,
20.44, 20.13。
C19H20N3O6S (M+1): 計算値 418.1073; 観測値 418.1049。
ピロール−2−カルボアルデヒド(330mg、3.5mmol)のCH3CN溶液(18ml)に、NaH(60%油分散液、152mg、3.8mmol)を加え、室温で45分間攪拌した。次いで、これに2,3,5−トリ−O−ベンジル−D−リボフラノシル クロリド(3.1mmol)(非特許文献44)のCH3CN溶液(18ml)を加えた。反応混合物を室温で4時間攪拌した。産物を酢酸エチル及び水で分離し、そして、有機層を飽和食塩水で3回洗浄し、Na2SO4で乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去した。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン中の20%酢酸エチルによって溶出)で精製し、粗1−(2,3,5−トリ−O−ベンジル−D−リボフラノシル)ピロール−2−カルボキシアルデヒド(506mg)を得た。粗1−(2,3,5−トリ−O−ベンジル−D−リボフラノシル)ピロール−2−カルボキシアルデヒド(506mg、1.0mmol)をトルエンで共沸した後、残渣にCH2Cl2(17ml)を加えた。この溶液に、−78℃でBBr3(1M溶液、3.0ml)を加え、2.5時間攪拌し、次いで50%メタノール−CH2Cl2溶液(25ml)を加えた。溶液を−78℃で10分間攪拌した後、28%のNH4OH(0.5ml)を加えた。次いで、反応混合物を、室温に達するまで攪拌した。産物を、CH2Cl2及びH2Oによって分離し、そして水層をCH2Cl2で3回洗浄し、減圧下で溶媒を留去した。産物を逆相C18HPLCで精製し、1−(β−D−リボフラノシル)ピロール−2−カルボアルデヒドを得た(108mg、15%、2工程)。
9.54(s,1H), 7.74(s,1H),
7.06(dd,1H,J=1.6及び4.0Hz),
6.39(d,1H,J=4.3Hz),
6.30(dd,1H,J=3.0及び4.0Hz),
5.27(d,1H,J=5.6Hz),
5.05(d,1H,J=4.9Hz),
5.00(t,1H,J=5.3Hz), 4.02(m,2H),
3.85(m,1H), 3.52(m,2H)。
179.41, 131.68, 128.24, 124.94,
110.23, 89.34, 84.33, 75.64,
69.50, 60.82。
C10H14NO5 (M+1): 計算値 228.0872; 観測値 228.0863。
4−プロピニル−1−(β−D−リボフラノシル)ピロール−2−カルボアルデヒド(化合物18)は、化合物17の合成方法と同様に、4−プロピニル−2−ピロールカルボアルデヒド(化合物16)(非特許文献40)(266mg、2.0mmol)から合成された。RP−HPLCで精製して、化合物18が得られた(39mg、7%、2工程)。
9.50 (s,1H), 7.91(s,1H),
7.09(d,1H,J=1.8Hz), 6.32(d,1H,J=3.6Hz),
5.32(d,1H,J=5.5Hz), 5.07(t,1H,J=5.2Hz),
5.05(d,1H,J=4.2Hz), 4.01(m,1H),
3.86(m,1H),
3.66(ddd,1H,J=3.4、5.3及び11.9Hz),
3.55(ddd,1H,J=3.6、4.9及び12.1Hz),
1.97(s,3H)。
179.60, 131.15, 130.43, 126.13,
106.22, 89.62, 85.26, 84.49,
75.86, 73.17, 69.30, 60.53, 3.79。
C13H16NO5 (M+1): 計算値 266.1028; 観測値 266.1023。
保護されたヌクレオシド(0.1mmol、化合物9又は13)をピリジンで共沸して乾燥させた。残渣をピリジン(100μl)−ジオキサン(300μl)混合溶媒中に溶解した。これに、1M 2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オン−ジオキサン溶液(110μl、0.11mmol)を加えた。10分後、0.5M ビス(トリブチルアンモニウム)ピロリン酸−トリエチルアミン(10μl):DMF(300μl、0.15mmol)混合溶液を反応混合物に素早く加えた。この混合液を室温で10分間攪拌した。次いで、これに1%ヨウ素−ピリジン:水(98/2、v/v)(2.0ml)混合溶液を加えた。15分後、150μlの5%NaHSO3水性溶液を加え、次いで5.0mlの水をこれに加えた。溶液を室温で30分間攪拌した後、20mlの濃アンモニア水を加えて、室温で2時間、アンモノリシスを行った。溶媒を減圧下で留去し、産物をDEAEセファデックス(A−25)カラムクロマトグラフィー(50mMから1M TEABの直線勾配によって溶出)で精製し、次いでC18−HPLCカラム(0%から30%のCH3CN−100mM 酢酸トリエチルアンモニウム溶液の直線濃度勾配によって溶出)で精製し、ヌクレオシド 5’−三リン酸を得た。
1H NMR (270MHz,D2O) δ
8.51(s,1H), 8.09(d,1H,J=5.3Hz),
7.78(d,1H,J=3.6Hz), 7.56(d,1H,J=4.9Hz),
7.36(d,1H,J=5.3Hz), 7.12(t,1H,J=4.9Hz),
6.41(t,1H,J=7.3Hz), 4.16(m,1H),
4.04(m,2H), 3.01(q,18H,J=7.3Hz),
2.72(m,1H), 2.46(m,1H),
1.09(t,27H,J=7.3Hz)。
−9.94(d,1P,J=20.1Hz),
−10.72(d,1P,J=20.1Hz),
−22.58(t,1P,J=20.1Hz)。
C15H18N3O12P3S; 計算値 555.97 (M−H)−; 観測値 555.69 (M−H)−。
1H NMR (300MHz,D2O) δ
8.74(s,1H), 8.32(d,1H,J=5.4Hz),
8.01(d,1H,J=3.5Hz),
7.68(dd,1H,J=1.1及び5.1Hz),
7.64(d,1H,J=5.1Hz),
7.25(dd,1H,J=3.5及び5.1Hz),
6.25(d,1H,J=6.0Hz),
4.82(m,1H), 4.57(m,1H), 4.36(m,1H),
4.20(m,2H), 3.11(q,18H,J=7.3Hz),
1.19(t,27H,J=7.3Hz)。
−9.80(d,1P,J=20.1Hz),
−11.03(d,1P,J=18.9Hz),
−22.78(t,1P,J=20.1及び18.9Hz)。
C15H18N3O13P3S; 計算値 571.97 (M−H)−;測定値 571.74 (M−H)−。
保護されたヌクレオシド(0.1mmol、化合物21(非特許文献46)又は化合物9)をピリジンで共沸して乾燥させた。残渣をピリジン(100μl)−ジオキサン(300μl)混合溶液中に溶解した。これに1M 2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オンのジオキサン溶液(110μl、0.11mmol)を加えた。10分後、0.5M ビス(トリブチルアンモニウム)ピロリン酸(300μl、0.15mmol)−トリエチルアミン(10μl)のDMF溶液を、反応混合物に素早く加え、室温で10分間攪拌した。次いで、1%ヨウ素−ピリジン/水(98/2、v/v)混合溶液(2.0ml)を加えた。15分後、150μlの5%NaHSO3水性溶液を加えた。溶媒を減圧下で留去した後、残渣に20mlの28%アンモニア水を加えた。60℃で5時間(デオキシアデノシンの5’−γ−アミド三リン酸の場合)、又は室温で2時間(化合物6の5’−γ−アミド三リン酸の場合)、アンモノリシスを行った。溶媒を減圧下で留去した後、産物をDEAEセファデックス(A−25)カラムクロマトグラフィー(50mMから1M TEABの直線濃度勾配によって溶出)で精製し、次いでC18−HPLCカラム(0%から30%のCH3CN−100mM 酢酸トリエチルアンモニウム溶液の直線濃度勾配によって溶出)で精製し、ヌクレオシド 5’−γ−アミド三リン酸を得た。
1H NMR (270MHz,D2O) δ
8.35(s,1H), 8.11(s,1H),
6.37(t,1H,J=6.9Hz), 4.16(m,1H),
4.03(m,2H), 3.05(q,18H,J=7.3Hz),
2.70(m,1H), 2.48(m,1H),
1.13(t,27H,J=7.3Hz)。
−0.50(d,1P,J=19.5Hz),
−10.77(d,1P,J=19.5Hz),
−22.14(t,1P,20.1Hz)。
C10H17N6O11P3; 計算値 489.01(M−H)−; 観測値 488.98 (M−H)−。
1H NMR (270 MHz, D2O) δ
8.57(s,1H), 8.16(d,1H,J=5.3Hz),
7.85(d,1H,J=3.6Hz), 7.58(d,1H,J=4.9Hz),
7.45(d,1H,J=5.3Hz), 7.15(t,1H,J=4.6Hz),
6.48(t,1H,J=6.9Hz), 4.18(m,1H),
4.05(m,2H), 3.03(q,18H,J=7.3Hz),
2.75(m,1H), 2.50(m,1H),
1.11(t,27H,J=7.3Hz)。
−0.52(d,1P,J=20.1Hz),
−10.75(d,1P,J=19.5Hz),
−22.14(t,1P,J=20.8Hz)。
C15H19N4O11P3S; 計算値 554.99 (M−H)−; 観測値 555.01 (M−H)−。
1−(β−D−リボフラノシル)ピロール−2−カルボアルデヒド(0,1mmol)(化合物17)又は4−プロピニル−1−(β−D−リボフラノシル)ピロール−2−カルボアルデヒド(0,1mmol)(化合物18)とプロトンスポンジ(33mg、0.15mmol)を含むトリメチルリン酸溶液(500μl)に、0℃でPOCl3(12μl、0.13mmol)を加え、0℃で2時間攪拌した。反応混合物にトリ−n−ブチルアミン(120μl、0.5mmol)を加え、次いで、これに、0.5M ビス(トリブチルアンモニウム)ピロリン酸(1.0ml、0.5mmol)のDMF溶液を加えた。5分後、0.5M 炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液(TEAB、500μl)を加えて、反応を終了した。得られた粗産物を、DEAEセファデックス(A−25)カラムクロマトグラフィー(1.5cm×30cm、50mMから1M TEABの直線勾配によって溶出)で精製し、次いでC18−HPLCカラム(Synchropak RPP、Eichrom Technologies、0%から30%のCH3CN−100mM 酢酸トリエチルアンモニウム溶液の勾配によって溶出)で精製した。
1H NMR (270MHz,D2O) δ
9.28(s,1H), 7.64(s,1H),
7.08(d,1H,J=3.9Hz),
6.45(d,1H,J=4.1Hz), 6.32(m,1H),
4.32(m,2H), 4.10(m,3H),
3.03(q,18H,J=7.3Hz),
1.11(t,27H,J=7.3Hz)。
−10.51(d,1P,J=19.5Hz),
−11.3(d,1P,J=20.1Hz),
−22.91(t,1H,J=20.1Hz)。
C10H16NO14P3: 計算値 465.97 (M−H)−; 測定値 465.85 (M−H)−。
1H NMR (270MHz,D2O) δ
9.28(s,1H), 7.70(s,1H), 7.08(s, 1H),
6.40(d,1H,J=4.0Hz), 4.30(m,2H),
4.13(m,3H), 3.06(q,18H,J=7.3Hz),
1.86(s,3H), 1.14(t,27H,J=7.3Hz)。
−10.10(d,1P,J=19.5Hz),
−11.02(d,1P,J=19.5Hz),
−22.82(t,1P,J=20.1Hz)。
C13H18NO14P3: 計算値 503.99 (M−H)−; 観測値 503.94 (M−H)−。
1. 7−(2−チアゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(化合物4)(Dv)のヌクレオシド誘導体の合成(図33)
チアゾリル基の導入の反応(a)に2−(トリブチルスタニル)チアゾールを用いた以外は、図22に示した 7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(実施例Iの化合物4)(Ds)のヌクレオシド誘導体の合成と同様に行った。
(1)1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−ニトロピロール(化合物3)の合成
2−ニトロピロール(化合物1)(非特許文献49)(224mg,2.0mmol)をアセトニトリル(20ml)に溶解させ、NaH(80mg,60%油分散液,2.0mmol)を加えた。室温で30分間撹拌した後、2−デオキシ−3,5−ジ−O−p−トルオイル−α−D−エリスロ−ペントフラノシル クロリド(855mg,2.2mmol)を加えて室温で2時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で洗浄し、有機層を水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物2を722mg(78%)得た。化合物2(722mg)にメタノリックアンモニア(50ml)を加えてトルオイル基の脱保護を室温12時間で行い、シリカゲルカラムで精製後、最終精製をHPLCで行い化合物3を291mg(82%)得た。
7.76(bs,1H), 7.26(dd,1H,J=1.6及び3.6Hz),
6.59(t,1H,J=5.9Hz), 6.30(t,1H,J=3.6Hz),
5.27(d,1H,J=4.3Hz), 5.03(t,1H,J=5.3Hz)
4.23(m,1H), 3.85(m,1H), 3.59(m, 2H),
2.42(m,1H), 2.19(m,1H)。
C9H11O5N2; 計算値 227.07 (M−H)-; 測定値 227.03 (M−H)-,
C9H13O5N2; 計算値 229.08 (M+H)+; 測定値 229.06 (M+H)+。
化合物3(228mg,1.0mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(10ml)を加え、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(373mg,1.1mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5% NaHCO3水溶液で洗浄し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物4を493mg(93%)得た。
化合物4(159mg,0.3mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(3ml)を加え、無水酢酸(57μl,0.6mmol)を加えて反応溶液を室温で12時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5% NaHCO3で洗浄し、5% NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しトルエンで共沸した後、塩化メチレン30mlに溶解させた。この反応溶液にジクロロ酢酸(300μl)を0℃で加えて15分間、0℃で撹拌した。5% NaHCO3水溶液を反応溶液に加えて洗浄し、有機層を5% NaHCO3で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して化合物6を73mg(91%)得た。
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー(ESI−MS)
C9H14O14N2P3; 計算値, 466.97 (M−H)-; 測定値, 466.70 (M−H)-。
(1)4−ヨード−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン(化合物3)の合成
1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン(化合物1)(5.3g,45mmol)を酢酸エチル(45ml)に溶解し、酢酸エチル(30ml)に溶解したメタ−クロロ過安息香酸(14g,54mmol)溶液を0℃で撹拌しながら1時間かけて滴下して加えた。滴下後室温で3時間撹拌した後、0℃で静置した。結晶をろ過し、酢酸エチルで洗浄後、減圧下で乾燥した。これを水(30ml)に溶解後、30% K2CO3をpH10になるまで加え、室温で1時間、0℃で1時間静置した後、沈殿をろ過、エーテルで洗浄してN−オキシドを3.5g(58%)得た。N−オキシド(3.0g,22mmol)をDMF(16ml)に溶解し50℃で加熱した。メタンスルホニルクロリド(4.7ml,60mmol)のDMF(6.4ml)溶液を70℃で滴下し、この反応溶液を75℃で2時間撹拌した。反応溶液を氷に加えた後、0℃で10NのNaOHを用いて中和した。室温で1時間撹拌し、生成した沈殿をろ過して水で洗浄した後、60℃で減圧乾燥して目的とする化合物2を2.7g(80%)得た。
化合物3(950mg,3.9mmol)のアセトニトリル(39ml)溶液に、NaH(156mg,60%油分散液,3.9mmol)を加えた。室温で1時間撹拌した後、2−デオキシ−3,5−ジ−O−p−トルオイル−α−D−エリスロ−ペントフラノシル クロリド(1.8g,1.2当量)を加えて室温で1.5時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和アンモニウムクロリド水溶液で洗浄し、有機層を飽和アンモニウムクロリド水溶液と飽和食塩水で分液した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物4を1.8g(77%)得た。
化合物4(715mg,1.2mmol)とジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(42mg,0.06mmol)のDMF(12ml)溶液に2−(トリブチルスタニル)チオフェン(601μl,1.8mmol)を加えて100℃で1時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水、次いで、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物5を586mg(88%)得た。
8.27(d,1H,J=5.1Hz), 7.87(d,1H,J=3.8Hz),
7.83(d,1H,J=3.6Hz), 7.79(d,1H,J=5.1Hz),
7.41(d,1H,J=5.0Hz),
7.28(dd,1H,J=3.7及び5.0Hz),
6.93(d,1H,J=3.8Hz),
6.76(dd,1H,J=6.0及び8.2Hz),
5.28(d,1H,J=4.1Hz),
5.02(t,1H,J=5.6Hz), 4.39(m,1H),
3.85(m,1H), 3.56(m,2H), 2.57(m,1H),
2.26(m,1H)。
8.38(d,1H,J=5.1Hz), 8.13(d,1H,J=3.2Hz),
8.01(d,1H,J=3.2Hz), 7.96(d,1H,J=3.7Hz),
7.72(d,1H,J=5.1Hz), 7.15(d,1H,J=3.7Hz),
6.79(dd,1H,J=6.1及び8.0Hz),
5.29(d,1H,J=4.0Hz), 4.50(t,1H,J=5.5Hz),
4.40(m,1H), 3.86(m,1H), 3.57(m,2H),
2.58(m,1H), 2.26(m,1H)。
化合物7(300mg,0.9mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(9ml)を加え、4,4’−ジメトキシトリチル クロリド(386mg,1.1mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5% NaHCO3水溶液で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物9を570mg(97%)得た。
2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノ クロロ ホスホロアミダイト(115μl,0.52mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応溶液にメタノール(50μl)を加え酢酸エチル:水(20:1,v/v)で希釈し5% NaHCO3水溶液を加えて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して化合物11を345mg(90%)得た。
化合物9(247mg,0.4mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(4ml)を加え、無水酢酸(75μl,0.8mmol)を加えて反応溶液を室温で12時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5% NaHCO3水溶液で分液し、有機層を5% NaHCO3水溶液で洗浄した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しトルエンで共沸した後、残渣を塩化メチレン40mlに溶解させた。この反応溶液にジクロロ酢酸(400μl)を0℃で加えて15分間、0℃で撹拌した。5% NaHCO3水溶液を反応溶液に加えて分液し、有機層を5% NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して化合物13を125mg(87%)得た。
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー(ESI−MS)
C16H18O12N2P3S; 計算値, 554.98 (M−H)-; 測定値, 554.73 (M−H)-。
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー(ESI−MS)
C15H17O12N3P3S; 計算値, 555.97 (M−H)-; 測定値, 555.82 (M−H)-。
1.手法
本実施例では、別途特に明記しない限り以下の手法を用いた。
1ヌクレオチド挿入実験を、文献にしたがって行った(非特許文献30−32)。5’−末端を6−カルボキシルフルオロセインで標識したプライマー(20−mer)を鋳型DNA(35−mer)と、20mM MgCl2、2mM DTT、および0.1mg/mlウシ血清アルブミンを含有する100mM Tris−HCl(pH7.5)緩衝液中で、95℃の加温と緩やかな4℃への冷却によりアニールした。プライマー−鋳型二本鎖溶液(10μM、5μl)をエキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウフラグメント(KF exo-、Amersham USB)の酵素溶液(2μl)と混合した。混合物を2分間インキュベートし、次いで、各dNTP溶液(3μl)をこの溶液に加えて、37℃で反応を開始した。使用した酵素の量(5−50nM)、反応時間(1−35分)、およびdNTPの勾配濃度(0.3−1500μM)を調節し、25%以下の生成物を与える条件で測定を行った。反応を10μlのストップ溶液(95%ホルムアミドおよび20mM EDTA)で停止し、そして混合物を直ちに75℃で3分間加熱した。希釈産物をGeneScanソフトウエア(バージョン3.0)を装備した自動ABI377DNAシークエンサーで解析した(非特許文献32)。比速度(v0)を反応の範囲を反応時間で割ることにより計算し、そして使用した様々な酵素濃度に対して酵素濃度を標準化した(20nM)。動力学変数(KMおよびVmax)を[dNTP]に対する[dNTP]/v0のハーネス−ウルフプロットから得た。各変数を、3ないし8のデータセットから平均化した。
5’−32P−標識プライマー(23−mer)および鋳型DNA(35−mer)の二本鎖を、14mM MgCl2および0.2mM DTTを含有する20mM Tris−HCl(pH7.5)緩衝液中でアニールした。二本鎖溶液(400nM,5μl)を氷上で5xdNTP溶液(2μl)と混合し、次いで、これに、KF exo-(1ユニット)またはKF exo+(1ユニット)(TAKARA)を含有する酵素溶液(3μl)を加えることで反応を開始した。反応溶液を37℃で3または5分間インキュベートし、そして89mM Tris−ホウ酸塩、2mM EDTA、10M 尿素、および0.05%BPBを含む色素溶液(10μl)を添加することにより、反応を終結させた。この溶液を直ちに75℃で3分間加熱し、次いで15%ポリアクリルアミド−7M尿素ゲルで電気泳動した。ゲル上の産物を、バイオイメージングアナライザー(モデル BAS2500、Fuji)で解析した。
ジデオキシ−サイクルシーケンシング反応(20μl)を、1nmol dPa’TPの存在または非存在下で、0.3pmol鋳型および4pmolプライマー1またはプライマー2を含有する8μlのReady Reaction Mix(BigDye1.1、Applied Biosystems)で、PTC−100 Program Thermal Controller(MJ Reseach)上で行った。25サイクルのPCR(96℃、10秒;50℃、5秒;60℃、4分)の後で、残存する色素ターミネーターをCentri−SeqTMスピンカラム(Applied Biosystems)で反応溶液から取り除いた後、この溶液を55℃で減圧下で乾燥した。残存物をホルムアミド溶液(4μl)で再懸濁し、そして6%ポリアクリルアミド−6M尿素ゲルを装着したABI 377 DNAシークエンサーで解析した。配列データを、Applied Biosystems PRISMシークエンシング解析v3.2ソフトウエアで解析した。
PTC−100 Controllerを用いて、反応を、10mM KCl、 10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X−100、0.3mM 各dNTP(N=Pa,G,C,およびT)並びにdNTPN(N=DsおよびA)、1μM 各プライマー1およびプライマー2、2.3nM 二本鎖DNA断片、並びに0.04ユニット/μl Vent DNAポリメラーゼ(New England BioLabs)の20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.8)中で行った。PCRサイクルは、94℃、0.5分;45℃、0.5分;65℃、4分で行った。コントロールのPCRでは、0.2mM各天然型dNTPおよび0.01ユニット/μlのVent DNAポリメラーゼを使用し、そして伸長反応のステップを72℃1分間で行った。PCR産物を4%アガロースゲル上でエチジウムブロマイドにより染色し、染色されたバンドの強度をMolecular Imager FX Pro systemおよびQuantity Oneソフトウエア(Bio−Rad)を使用して定量化した。シーケンシング解析のために、PCR産物は、予め、ゲル電気泳動(7%ポリアクリルアミド−7M尿素ゲル)またはろ過(Microcon YM−30およびMicropure−EZ)により精製された。
転写(20μl)を、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% Triton X−100、1−3mM各天然型NTP、0−3mM Pa’TP、0−3mM DsTP、10mM GMP、2μM 鋳型DNA(17−mer転写物の合成のための)または0.5μM 鋳型DNA(tRNA転写物合成のための)、および2.5ユニット/μl T7 RNAポリメラーゼ(TAKARA)を含有する40mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)中で実行した。転写効率を調べるために、17−mer転写物の合成では、2μCi[γ−32P]GTP(PerkinElmer、GMPの代わり)、tRNA転写物の合成では、[α−32P]GTP(Amersham)をそれぞれ加えて転写を行った。37℃で、3時間(17−mer合成の場合)または6時間(tRNA合成の場合)インキュベーションの後に、尿素を含む色素溶液を加えて反応を停止した。この溶液を、75℃で3分間加熱し、そして15または20%(17−mer)または10%(tRNA)ポリアクリルアミド−7M尿素ゲル電気泳動により、産物を、バイオイメージングアナライザーで解析した。転写産物中のヌクレオチドの組成解析の際は(非特許文献17,33)、転写物を、2μCi[α−32P]UTPまたは[α−32P]ATP(Amersham)で内部標識した。転写後、産物を、10μlの15mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中で、37℃で2時間、0.75ユニットのRNase T2により消化した。17−merの解析では、0.05A260ユニットの大腸菌tRNA(Sigma)を消化反応溶液中に加えた。消化産物を2D−TLC(HPTLCプレート、100x100mm、Merck)により解析した。1次元目の展開溶媒は、イソ酪酸−アンモニア−水(66:1:33 v/v/v)、2次元目の展開溶媒は、イソプロピルアルコール−HCl−水(70:15:15 v/v/vまたはPa’転写物のための75:15:10 v/v/v)をそれぞれ用いた。TLCプレート上の標識ヌクレオチドのスポットをバイオイメージングアナライザーにより解析した。
それぞれのDNAのPCRは、PTC−100コントローラーを用いて、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X−100、0.3mMの各dNTP(N=Pa、G、C及びT)及びdNTPN(N=Ds及びA)、1μMの各プライマー1及びプライマー2、2.3Mの二本鎖DNA断片(DNA2−9)、及び0.04単位/μlのVent DNAポリメラーゼ(New England BioLabs)を含む、Tris−HCl緩衝液(pH8.8)中で行った。PCRのサイクルは、94℃、0.5分;45℃、0.5分;65℃、4分で行った。シーケンシングのために、PCR産物をゲル電気泳動(7% ポリアクリルアミド−7M尿素ゲル)又は濾過(Microcon YM−30及びMicropure−EZ)によって予め精製した。dPa’TP存在下、あるいは、非存在下でシーケンシングを行い、6% ポリアクリルアミド−6M尿素ゲルを装着したABI377DNAシークエンサーで、配列を決定した。
tRNA転写産物のアミノアシル化は、マイナーチェンジを加えた製造業者のプロトコルに従った迅速翻訳システム(RTS−100、ロシュ)中で調べた。[α−32P]で分子内標識されたtRNA転写産物(0.4μM)を、30℃で30分間、システム(25μl)中でインキュベートした。酢酸ナトリウム(pH4.5)で飽和させたフェノールで、tRNAを抽出し、そして、0.2M Tris−酢酸及び3mM EDTAを含む産生緩衝液(pH4.75)中、4℃で10%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分析した(図5d、図21)。
修飾Paである4−プロピニルピロール−2−カルバルデヒド(Pa’)ヌクレオシドの三リン酸誘導体(dPa’TP)(非特許文献34)を加えたジデオキシヌクレオチド鎖終結によるシーケンシング法(非特許文献33)により、DNA断片中のDs−Pa塩基対の位置を確認した。KF exo-による鋳型中のDsに対するdPa’TPの導入効率(Vmax/KM=2.2×105)は、鋳型中のDsに対するdPaTPの導入効率(Vmax/KM=5.7×104)に比べて3.9倍高くなる(表1及び2)。したがって、Ds含有鎖のシーケンシングは、dPa’TPを加えて、Taq DNAポリメラーゼのシーケンシングキットであるBigDye1.1(applied Biosystems)を用いて行われた。シーケンシングおよびその後の実験のために、Ds−Pa塩基対を含有する2本鎖DNA断片(150−merおよび174−mer、DNA1−14)は、化学的に合成されたDNA断片をプライマー伸長または連結することにより調製した(図6)。
Ds−Pa塩基対を含有するDNA1−14(図6)(150−merまたは174−mer、2.3nM)のPCR増幅を、3’ →5’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性DNAポリメラーゼ(0.04ユニット/μl、VENT DNAポリメラーゼ,New England BioLabs)およびdDsTPN、dPaTP、dATPN、dGTP、dCTP、およびdTTPの基質混合物(各0.3mM)を使用して行った。PCRサイクルは、94℃で30秒、45℃で30秒、および65℃で4分、で行った。
Ds−PaおよびDs−Pa’ 塩基対は、T7RNAポリメラーゼによるDsTP、PaTPおよびPa’TPのRNAへの部位特異的導入を相補的に仲介した。Ds、PaまたはPa’を含有する鋳型DNA(35−mer)を使用して、転写を検討した(図4aおよび4b)。非天然型塩基のリボヌクレオシド三リン酸を加えて3時間の転写を行った後、32Pで標識された転写物をゲル上で解析した(図4c)。各Pa、Pa’およびDsを含有する全長の転写物(17−mer)の収率は、天然型塩基からなる鋳型DNAを用いた天然型塩基のみの転写物のもの(図4cレーン9)と比べて28−91%であった(図4cレーン1,2,5,および7)。非天然型塩基を含む鋳型DNAの転写において、非天然型塩基の基質を加えなかった場合の転写物の収率は有意に減少した(図4cレーン3,6および8)。
b: Np=Pap、Pa’p、又はDsp
c: 値は以下の式を用いて決定した
ビオチン化されたPaTP(1−(β−D−リボフラノシル)−4−[(3−ビオチンアミド−1−プロピニル)]ピロール−2−カルバルデヒド 5’−トリフォスフェート:化合物28、Bio−PaTP)は、図36に示すスキームによって合成した。
2,3,5−トリ−O−ベンジル−D−リボフラノース(1.0g、2.3mmol)およびCCl4(344μl、3.6mmol)を含むTHF溶液(4.6ml)に、ヘキサメチルホスホラストリアミド(562μl、3.0mmol)を−78℃で加えた。当該溶液を、−78℃で2時間、そして室温で30分間、攪拌した(溶液A)。CH3CN(25mL)中、4−ヨード−ピロール−2−カルボキシアルデヒド(化合物23)(830mg、3.7mmol)に、NaH(60%オイルディスパージョン、150mg、3.7mmol)を加えた。反応混合物を室温で30分間攪拌した。次いで、THF中の2,3,5−トリ−O−ベンジル−D−リボフラノシルクロリド(溶液A)を加えた。反応混合物を室温で12時間攪拌した。生成物を酢酸エチルおよび水で分液した。有機層は飽和NH4Clで3回洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして減圧下で濃縮した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン中1%メタノールで溶出)で精製し、1−(2,3,5−トリ−O−ベンジル−D−リボフラノシル)−4−ヨードピロール−2−カルバルデヒドを得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ
9.54(d,1H,J=0.8Hz), 9.10(t,1H,J=5.2Hz),
8.01(s,1H), 7.18(d,1H,J=1.8Hz),
6.49(s,1H), 6.34(d,1H,J=3.5Hz),
5.35(d,1H,J=5.6Hz), 5.10(m,2H),
4.17(d,2H,J=5.4 Hz), 4.02(m,2H),
3.88(m,1H),
3.68(ddd,1H,J=3.4, 5.3, 12.1Hz),
3.57(ddd,1H,J=3.5, 5.0, 12.1Hz).
13C NMR(75MHz,DMSO−d6) δ
180.28, 163.78, 131.88, 131.49,
126.85, 105.23, 90.23, 85.26,
85.04, 76.83, 76.41, 69.75,
67.01, 60.96, 30.20.
HRMS(FAB,3−NBA マトリクス)
C15H17N2O6Cl2(M+1):計算値,391.0464;実測値,391.0462.
(2)1−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−4−[(3−ジクロロアセトアミド)−1−プロピニル]ピロール−2−カルバルデヒド(化合物26)の合成(図36のスキームにおける反応(d)−(e))。
1H NMR(500MHz,DMSO−d6) δ
9.56(s,1H), 9.05(t,1H,J=5.0Hz),
7.72(s,1H), 7.38−7.20(m,10H),
6.87(d,4H,J=7.1Hz), 6.47(s,1H),
6.34(d,1H,J=3.3Hz),
5.47(d,1H,J=5.3 Hz),
5.13(d,1H,J=5.7 Hz),
4.12−4.00(m,5H), 3.73(s,6H),
3.22(m,2H).
HRMS(FAB,3−NBA マトリクス)
C36H35N2O8Cl2(M+1): 計算値,693.1770; 実測値,693.1721.
化合物26:
1H NMR(500MHz,DMSO−d6) δ
9.50(s,1H), 9.10(bs,1H), 8.06(s,1H),
7.24(d,1H,J=1.3Hz), 6.64(d,1H,J=5.0Hz),
6.48(s,1H), 5.43(t, 1H,J=5.0Hz),
5.35(t,1H,J=5.2Hz), 5.32(t,1H,J=4.8Hz),
4.17(m,3H), 3.73(m,1H), 3.62(m,1H),
2.07(s,3H), 2.01(s,3H).
HRMS(FAB,3−NBA マトリクス)
C19H21N2O8Cl2(M+1): 計算値,475.0675; 実測値,475.0687.
(3)1−(β−D−リボフラノシル)−4−[(3−ビオチンアミド−1−プロピニル)]ピロール−2−カルバルデヒド 5’−トリフォスフェート(化合物28)の合成(図36のスキームにおける反応(f)−(g))。
エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロスコピー(ESI−MS)
C13H19O14N2P3: 計算値,519.00(M−H)-; 実測値,518.98(M−H)-.
化合物28:
1H NMR(300MHz,D2O) δ
9.36(d,1H,J=0.9Hz), 7.86(s,1H),
7.20(d,1H,J=1.7Hz), 6.44(d,1H,J=4.1Hz),
4.39−4.33(m,3H), 4.23−4.15(m,4H),
4.06(d,2H,J=3.7Hz), 3.18(m,1H),
3.12(q,24H,J=7.3Hz),
2.82(dd,1H,J=4.9および13.1Hz),
2.60(d,1H,J=13.0Hz),
2.23(t,2H,J=7.0Hz), 1.60(m,4H),
1.32(m,2H), 1.20(t,36H,J=7.3Hz).
31P NMR(107MHz,D2O) δ
−8.96(d,1P,J=16.5Hz),
−10.67(d,1H,J=20.1Hz),
−22.36(t,1P,J=20.1Hz).
エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロスコピー(ESI−MS)
C23H33O16N4P3S: 計算値,745.07(M−H)-; 実測値,745.07(M−H)-.
UV−可視光スペクトル(10mM リン酸ナトリウム緩衝液中,pH7.0),
λmax=258nm(ε=1.1×104),308nm(ε=9.5×103).
実施例V Ds−Pa人工塩基対を介したT7転写によるRNAの部位特異的ビオチン化
転写およびPCR増幅の双方におけるDs−Pa人工塩基対の選択性および可能性についてより詳細に試験するために、152−mer RNA分子の部位特異的ビオチン化を行った。
転写(20μl)は、3μCi[γ−32P]GTP、2mM 各天然型NTP、0−4mM Bio−PaTP(ビオチン化されたPaの基質:実施例IVに記載したように化学合成した)、および30nM 鋳型(DNA6およびDNAcont2(図6参照)、それぞれについて、ライゲーションにより得られた鋳型およびPCR増幅した鋳型を用いた)を用いて、6時間37℃で行った。
ビオチンが連結されたPa(Bio−Pa)は、ライゲーションにより得られた鋳型およびPCR増幅した鋳型を用いて、Ds−Pa塩基対を介したT7転写によってRNAへ導入された。RNA分子(152−mer)へのBio−Paの導入を解析するために、DNA6およびDNAcont2鋳型(図6参照)を用いて、天然型基質NTP(2mM)およびBio−PaTP(2または4mM)存在下でT7転写を行った。Ds−Pa塩基対を伴う転写効率は、天然型塩基のみを含むDNA断片であるDNAcont2を用いた場合(図44c、レーン3、7および11)と比較して、47−85%であった(図44c、レーン2、6および10)。ライゲーションにより得られたDNA6鋳型およびPCR増幅したDNA6鋳型を用いた転写では、Bio−PaTPの非存在下において、完全長産物の量が有意に低下した(図44c、レーン1、5および9)。これらの結果は、DNA6をPCR増幅した際に、Ds−Pa塩基対の天然型塩基対への置き換えがほとんど起こらなかったことを示す。
2−ニトロピロールの4位修飾ヌクレオシド誘導体は、図45に示すスキームによって合成した。
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−ニトロピロール(700mg、3.1mmol)をCH3CN(12ml)に溶解し、N−ヨードスクシンイミド(1.38g、6.1mmol)を加え、室温で12時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で2回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しシリカゲルカラム(CH2Cl2:MeOH=50:1、v/v)およびHPLC(25%−40% CH3CN、10分、40%−50% CH3CN、5分)で精製して化合物1を607mg(56%)得た。未反応回収原料219mg(31%)。
1H NMR (500MHz, DMSO−d6): δ
7.90(d,1H,J=2.1Hz), 7.40(d,1H,J=2.1Hz),
6.54(t,1H,J=5.6Hz), 5.27(d,1H,J=4.5Hz),
5.10(t,1H,J=5.2Hz), 4.23(m,1H),
3.83(m,1H), 3.65(m,1H), 3.56(m,1H),
2.40(m,1H), 2.23(m,1H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C9H12IN2O5 (M+1): 計算値 354.9791; 測定値 354.9784.
(2)1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−プロピニル−2−ニトロピロール(化合物2)の合成
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(化合物1)(280mg、0.79mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(56mg、0.08mmol)をDMF(7.9ml)に溶解し、トリブチル(1−プロピニル)スズ(481μl、1.6mmol)を加えた。反応溶液を100℃で1.5時間加熱し、溶液を濃縮後シリカゲルカラム(CH2Cl2:MeOH、50:1、v/v)およびHPLC (34%−35% CH3CN、13分)で精製して化合物2を125mg(60%)得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO−d6): δ
7.92(d,1H,J=2.2Hz), 7.27(d,1H,J=2.2Hz),
6.55(t,1H,J=5.7Hz), 5.28(d,1H,J=4.5Hz),
5.11(t,1H,J=5.2Hz), 4.24(m,1H),
3.85(m,1H),
3.67(ddd,1H,J=3.6,5.3,12.1Hz),
3.57(m,1H), 2.43(m,1H), 2.23(m,1H),
1.99(s,3H).
13C NMR (75 MHz, DMSO−d6): δ
136.21, 129.17, 117.08, 105.29,
88.74, 88.30, 86.75, 72.91, 69.21,
60.83, 42.58, 4.29.
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C12H15N2O5 (M+1): 計算値 267.0981; 測定値 267.0991.
(3)1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(ジクロロアセトアミド1−プロピニル)−2−ニトロピロール(化合物3)の合成
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(化合物1)(354mg、1.0mmol)、Pd(PPh3)4(58mg、0.05mmol)、CuI(30mg、0.16mmol)、トリエチルアミン(209μl、1.5mmol)をDMF(3.5ml)に溶解し、N−(2−プロピニル)−ジクロロアセトアミドの1M DMF溶液(1.5ml、1.5mmol)を加えて室温で12時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で3回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラム(CH2Cl2:MeOH、20:1、v/v)およびHPLC(34%−35% CH3CN、12分)で精製して化合物3を317mg(81%)得た。
9.01(t,1H,J=5.3Hz), 7.98(d,1H,J=2.1Hz),
7.33(d,1H,J=2.1Hz), 6.54(t,1H,J=5.8Hz),
6.47(s,1H), 5.27(d,1H,J=4.5Hz),
5.10(t,1H,J=5.2Hz), 4.23(m,1H),
4.17(d,2H,J=5.4Hz), 3.84(m,1H),
3.66(ddd,1H,J=3.5,5.2,12.1Hz),
3.56(dt,1H,J=4.6,12.2Hz), 2.43(m,1H),
2.23(m,1H).
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー(ESI−MS)
C14H15O6N3Cl2; 計算値 390.03 (M−H)-; 測定値 389.85 (M−H)-.
(4)1−[2−デオキシ−5−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−β−D−リボフラノシル]−4−プロピニル−2−ニトロピロール 2−シアノエチル−N,N−
ジイソプロピルホスホルアミダイト(化合物6)の合成
化合物2(200mg,0.75mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(7.5ml)を加え、4,4’−ジメトキシトリチル クロリド(280mg,0.83mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5% NaHCO3で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製(CH2Cl2:MeOH, 200:1,v/v)して化合物4を365mg(86%)得た。化合物4(190mg,0.33mmol)をピリジンで共沸した後、THF(1.7ml)とジイソプロピルエチルアミン(87μl,1.5当量)を加えた溶液に、2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノ クロロ ホスホルアミダイト(82μl,0.37mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応溶液にメタノール(50μl)を加え酢酸エチル:水(20:1,v/v)で希釈し5% NaHCO3を加えて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラム(CH2Cl2:ヘキサン,1:4,v/v, 2% トリエチルアミン)で精製して化合物6を223mg(87%)得た。
1H NMR (300MHz, DMSO−d6): δ
7.65(d,1H,J=2.2Hz), 7.41−7.23(m,10H),
6.89(d,4H,J=8.8Hz), 6.59(t,1H,J=5.3Hz),
5.37(d,1H,J=5.0Hz), 4.30(m,1H),
3.97(m,1H), 3.75(s,6H),
3.21(d,2H,J=4.1Hz), 2.48−2.32(m,2H),
1.92(s,3H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C33H33N2O7 (M+1): 計算値 569.2288; 測定値 569.2246.
化合物6:
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ
7.62及び7.55 (d及びd,1H,J=2.2Hz),
7.48−7.44(m,2H), 7.39−7.22(m,8H),
6.87(m,4H), 6.68(m,1H), 4.56(m,1H),
4.25(m,1H), 3.88−3.35(m,6H),
3.82(s及びs,6H), 2.85−2.72(m,1H),
2.63(t,1H,J=6.4Hz), 2.46(t,1H,J=6.4Hz),
2.36−2.25(m,1H), 1.95及び1.93(s及びs,3H),
1.20−1.08(m,12H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C42H50N4O8P (M+1): 計算値 769.3366; 測定値 769.3166.
(5)1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−プロピニル−2−ニトロピロール 5’−三リン酸(化合物9)の合成
化合物4(160mg,0.28mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(2.8ml)を加え、無水酢酸(53μl,0.56mmol)を加えて反応溶液を室温で12時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5% NaHCO3で分液し、5% NaHCO3で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しトルエンで共沸した後、塩化メチレン28mlに溶解させた。この反応溶液にジクロロ酢酸(280μl)を0℃で加えて15分、0℃で撹拌した。5% NaHCO3を反応溶液に加えて分液し、有機層を5% NaHCO3で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して化合物7を78mg(90%、2工程)得た。化合物7(31mg,0.1mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(100μl)とジオキサン(300μl)を加えた後、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスホリン−4−オン(110μl,ジオキサンの1M 溶液)を加えて10分間室温で撹拌した。トリ−n−ブチルアミン(100μl)とビス(トリブチルアンモニウム)ピロリン酸(300μl,DMF中の0.5M 溶液)を反応溶液に加えて10分間撹拌した。I2/ピリジン(2.0ml,ピリジン中の1% ヨード:H2O,98:2,v/v)を加えて15分間撹拌後、5% NaHSO3(150μl)を加えて反応溶液を濃縮した。H2O(5.0ml)を加えて室温で30分間撹拌後、28%アンモニア水を20ml加えて室温で2時間撹拌した。反応溶液を濃縮、凍結乾燥した後、DEAE Sephadex A−25で精製(50mM−1.0mM TEAB 直線勾配)し、目的とする化合物9を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO−d6): δ
7.90(d,1H,J=2.1Hz), 7.30(d,1H,J=2.1Hz),
6.60(t,1H,J=6.4Hz), 5.22(m,2H),
4.13(m,1H), 3.65(m,2H),
2.62(ddd,1H,J=3.0,6.0,14.3Hz),
2.43(m,1H), 2.08(s,3H), 2.00(s,3H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C14H17N2O6 (M+1): 計算値 309.1087; 測定値 309.1066.
化合物9:
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー(ESI−MS)
C12H17O14N2P3; 計算値 504.98 (M−H)-; 測定値 505.95 (M−H)-.
(6)1−(2−デオキシ−3−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−4−(ジクロロアセトアミド1−プロピニル)−2−ニトロピロール(化合物8)の合成
化合物3(305mg,0.78mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(7.8ml)を加え、4,4’−ジメトキシトリチル クロリド(291mg,0.86mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5% NaHCO3で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラム(CH2Cl2:EtOAc,9:1,v/v)で精製して化合物5を526mg(97%)得た。化合物5(515mg,0.74mmol)をピリジンで共沸した後、ピリジン(7.4ml)を加え、無水酢酸(280μl,3.0mmol)を加えて反応溶液を室温で12時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5% NaHCO3で分液し、5% NaHCO3で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しトルエンで共沸した後、塩化メチレン74mlに溶解させた。この反応溶液にジクロロ酢酸(740μl)を0℃で加えて15分間、0℃で撹拌した。5% NaHCO3を反応溶液に加えて分液し、有機層を5% NaHCO3で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラム(CH2Cl2:MeOH,50:1,v/v)で精製して化合物8を289mg(90%,2工程)得た。
9.07(t,1H,J=5.3Hz), 7.67(d,1H,J=2.2Hz),
7.41−7.21(m,10H),
6.89(dd,4H,J=1.7,8.9Hz),
6.59(t,1H,J=5.4Hz), 6.48(s,1H),
5.38(d,1H,J=4.9Hz), 4.29(m,1H),
4.12(d,2H,J=4.4Hz), 3.99(m,1H),
3.74(s,6H), 3.17(m,2H),
2.46−2.33(m,2H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C35H34N3O8Cl2 (M+1): 計算値, 694.1723; 測定値 694.1729.
化合物8: 1H NMR(300MHz,DMSO−d6): δ
9.12(t,1H,J=5.3Hz), 7.96(d,1H,J=2.2Hz),
7.36(d,1H,J=2.2Hz), 6.61(t,1H,J=6.3Hz),
6.49(s,1H), 5.23(m,2H),
4.18(d,2H,J=5.4Hz), 4.13(m,1H),
3.68(m,2H),
2.63(ddd,1H,J=3.0,6.0,14.3Hz),
2.44(m,1H), 2.07(s,3H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C16H18N3O7Cl2 (M+1): 計算値 434.0522; 測定値 434.0549.
実施例VII NH2−hx−dPnTP、ROX−hx−dPnTP、FAM−hx−dPnTPの合成
本実施例では、dPnTPに関する誘導体として、NH2−hx−dPnTP、ROX−hx−dPnTP、FAM−hx−dPnTPを、図46に示す合成スキームに従って合成した。これらの誘導体は、例えば複製(PCRやプライマー伸長)でDNA中に導入することが可能である。アミノ基の誘導体は、導入後のDNAの修飾に用いることが出来、それ以外の蛍光基を結合した各誘導体は、DNAの蛍光標識、ならびに、FRETなどに応用が可能である。
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(354mg、1mmol、αアノマーを含む)を50mLナス型フラスコ中、無水アセトニトリルで共沸を2回行った。ヨウ化銅(31mg、160μmol))、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(58mg、50μmol)を加え、これらを無水DMF(5mL)に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエチルアミン(210μL,1.5mmol)を加え、遮光下室温で攪拌した。これにN−(2−プロピニル)−6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド(396mg、1.5mmol)のDMF(4mL)溶液を滴下し、室温で一晩攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(5−10% CH3OH、CH2Cl2中)およびC18−HPLC(39−41% CH3CN、H2O中、15分)で精製し、目的物をアモルファス状物質(408mg,収率83%)として得た。
9.38(brs,1H),8.28(t,1H,J=5.3Hz),
7.95(d,1H,J=2.0Hz), 7.30(d,1H,J=2.0Hz),
6.54(t,1H,J=5.6Hz), 5.29(d,1H,J=4.0Hz),
5.20−5.05(m,1H), 4.30−4.20(m,1H),
4.05(d,2H,J=5.3Hz), 3.83(q,1H,J=4.0Hz),
3.70−3.50(m,2H), 3.14(t,2H,J=7.3Hz),
2.50−2.36(m,1H), 2.30−2.17(m,1H),
2.08(t,2H,J=7.3Hz), 1.58−1.40(m,4H),
1.28−1.16(m,2H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C20H26F3N4O7 (M + 1): 計算値 491.1754 ; 測定値 491.1761.
(2)1−(2−デオキシ−3−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール (工程(b)、(c))
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール(394mg、803μmol)を50mLナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(4mL)に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル(286mg、844μmol)を加え、室温で1時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチル/水中に加え、水層を除去した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(0−0.5% CH3OH、CH2Cl2中)で精製し、トリチル化体をアモルファス状物質(543mg)として得た。1−(2−デオキシ−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール(542mg、684μmol)を30mLナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(7mL)に溶解させ、酢酸無水物(169μL,1.79mmol)を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物を無水ジクロロメタン(68mL)に溶解させ、0℃で攪拌させながらジクロロ酢酸(680μL)を加え、15分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に加え、水層をジクロロメタンで抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(2% CH3OH、CH2Cl2中)で精製し、目的物をアモルファス状物質(328mg、77%,2段階収率)として得た。
9.39(brs,1H), 8.30(t,1H,J=5.4Hz),
7.94(d,1H,J=2.2Hz), 7.33(d,1H,J=2.2Hz),
6.61(t,1H,J=6.3Hz), 5.30−5.18(m,2H),
4.20−4.10(m,1H), 4.06(d,2H,J=5.4Hz),
3.75−3.55(m,2H), 3.16(t,2H,J=7.0Hz),
2.62(ddd,1H,J=3.0,6.0,14.2Hz),
2.50−2.35(m,1H), 2.15−2.05(m,2H),
2.07(s,3H), 1.60−1.40(m,4H),
1.30−1.20(m,2H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C22H28F3N4O8 (M + 1): 計算値 533.1859 ; 測定値 533.1907.
(3)1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール 5’−三リン酸 (NH2−hx−dPnTP) (工程(d))
1−(2−デオキシ−3−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール(53mg、100μmol)を10mL ナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(100μL)および無水ジオキサン(300μL)を加えて溶解させ、2−クロロ−4H−1,2,3−ジオキサホスホリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(110μL、110μmol)を加えて室温で10分間攪拌したのちに、トリ−n−ブチルアミン(100μL)およびビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロリン酸の0.5M DMF溶液(300μL)を加えて10分間攪拌した。1% ヨウ素/水/ピリジン溶液(2mL)を加え、室温で15分間攪拌し、5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150μL)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(5mL)を加え、室温で30分間攪拌した後に濃アンモニア水(20mL)を加えて8時間攪拌した。これをDEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)およびC18−HPLC(濃度勾配;x%―xx% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
7.79(s,1H), 7.31(s,1H),
6.68(t,1H,J=5.6Hz), 4.60−4.50(m,1H),
4.30−4.00(m,5H), 3.13(q,18H,J=7.3Hz),
2.90(t,2H,J=7.5Hz), 2.62−2.52(m,1H),
2.46−2.30(m,1H), 2.24(t,2H,J=7.0Hz),
1.63−1.55(m,4H), 1.38−1.16(m,29H).
31P NMR (121MHz, D2O) δ
−8.26, −10.51, −22.05.
MS (ESI)
C18H28N4O15P3, [M−H]−: 計算値 633.08 ; 測定値 633.00.
(4)1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−[3−[6−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−ニトロピロール 5’−三リン酸 (FAM−hx−dPnTP) (工程(e))
NH2−hx−dPnTP(6μmol)を0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.5,0.72mL)に溶解させ、5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシスクシンイミジル エステル(FAM−SE)(3.7mg,7.8μmol)のDMF溶液(500μL)を加えて、時々振とうさせながら遮光下室温で8時間反応させた。これに濃アンモニア水(0.5mL)を加え、時々振とうさせながら5分間反応させた。これを凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm,濃度直線勾配;TEABの50mM―1M 溶液)およびC18−HPLC(濃度勾配;0%―50% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
8.29(s,1H), 8.04(d,1H,J=7.5Hz),
7.58(brs,1H), 7.26(d,1H,7.5Hz),
7.00−6.60(m,7H), 6.39(brs,1H),
4.50−4.35(m,1H), 4.40−3.90(m,5H),
3.50−3.30(m,2H), 3.12(q,18H,J=7.3Hz),
2.41−2.10(m,4H), 1.75−1.50(m,4H),
1.45−1.10(m,29H).
31P NMR (121MHz, D2O) δ
−10.86, −10.86, −23.13.
MS (ESI)
C39H38N4O21P3 [M−H]−: 計算値 991.12; 測定値 990.56
(5)1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−[3−[6−(ローダミン−X−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−ニトロピロール 5’−三リン酸(ROX−hx−dPnTP) (工程(e))
NH2−hx−dPnTP(6μmol)を0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.5,0.85mL)に溶解させ、5−カルボキシ−X−ローダミン N−ヒドロキシスクシンイミジル エステル(ROX−SE)(5mg、7.92μmol)のDMF溶液(1mL)を加えて、時々振とうさせながら遮光下室温で18時間反応させた。これに濃アンモニア水(0.5mL)を加え、時々振とうさせながら5分間反応させた。これを凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm、濃度直線勾配;TEABの50mM―1M 溶液)およびC18−HPLC(濃度勾配;12.5%―50% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
8.28(s,1H), 8.03(d,1H,J=8.9Hz),
7.47(s,1H), 7.19(d,1H,J=7.7Hz),
6.68(brs,1H), 6.55(brs,1H),
6.43(brs,1H), 6.09(brs,1H),
4.40−4.25(m,1H), 4.15−3.70(m,5H),
3.60−3.27(m,10H), 3.12(q,18H,J=7.3Hz),
2.95−2.70(m,4H), 2.65−2.40(m,4H),
2.40−2.15(m,3H), 2.05−1.70(m,9H),
1.60−1.50(m,4H), 1.50−1.15(m, 29H).
31P NMR (121MHz, D2O) δ
−10.90, −11.59, −23.27.
MS(ESI)
C51H56N6O19P3 [M−H]−: 計算値 1149.28; 測定値 1148.77
実施例VIII NH2−hx−PaTP、FAM−hx−PaTP、TAMRA−hx−PaTPの合成
本実施例では、rPaTPに関する誘導体として、NH2−hx−PaTP、FAM−hx−PaTP、TAMRA−hx−PaTPを図47に示す合成スキームし従って合成した。これらの誘導体は、例えば転写でRNA中に導入することが可能である。アミノ基の誘導体は、導入後のRNAの修飾に用いることが出来、それ以外の蛍光基を結合した各誘導体は、RNAの蛍光標識、ならびにFRETなどに応用が可能である。
1−(β−D−リボフラノシル)−4−ヨードピロール−2−カルボアルデヒド(177mg、500μmol,αアノマーを含む)を10mLナス型フラスコ中、無水アセトニトリルで共沸を2回行った。ヨウ化銅(15mg、80μmol))、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(29mg,25μmol)を加え、これらを無水DMF(2.5mL)に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエチルアミン(105μL,750μmol)を加え、遮光下室温で攪拌した。これにN−(2−プロピニル)−6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド(198mg、750μmol)のDMF(2mL)溶液を滴下し、室温で一晩攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(10% CH3OH、CH2Cl2中)およびC18−HPLC(22−24% CH3CN、H2O中、15分)で精製し、目的物をアモルファス状物質(126mg、収率51%)として得た。
9.52(d,1H,J=0.66Hz), 9.38(brs,1H),
8.27(t,1H,J=5.3Hz), 7.96(s,1H),
7.13(d,1H,J=1.6Hz), 6.32(d,1H,J=3.6Hz),
5.42−5.32(brs,1H), 5.18−5.05(m,2H),
4.08−3.95(m,4H), 3.90−3.84(m,1H),
3.70−3.50(m,2H), 3.20−3.10(m,2H),
2.08(t,2H,J=7.3Hz), 1.55−1.40(m,4H),
1.30−1.15(m,2H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C21H27F3N3O7 (M + 1): 計算値 490.1801 ; 測定値 490.1815.
(2)1−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−4−[(3−(6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]ピロール−2−カルボアルデヒド (工程(b)、(c))
1−(β−D−リボフラノシル)−4−[(3−(6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]ピロール−2−カルボアルデヒド(122mg,250μmol)を10mLナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(4mL)に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル(89mg、263μmol)を加え、室温で2時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチル/水中に加え、水層を除去した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(0−0.5% CH3OH、CH2Cl2中)で精製し、トリチル化体をアモルファス状物質(150mg)として得た。1−(5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−4−[(3−(6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]ピロール−2−カルボアルデヒド(149mg、188μmol)を10mLナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(2mL)に溶解させ、酢酸無水物(53μL,565μmol)を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物を無水ジクロロメタン(19mL)に溶解させ、0℃で攪拌させながらジクロロ酢酸(280μL)を加え、15分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に加え、水層をジクロロメタンで抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1−2.5% CH3OH、CH2Cl2中)で精製し、目的物をアモルファス状物質(90mg、63%,2段階収率)として得た。
9.49(s,1H), 9.39(brs,1H),
8.28(t,1H,J=5.3Hz), 8.03(s,1H),
7.21(d,1H,J=1.6Hz), 6.63(d,1H,J=5.3Hz),
5.44(brs,1H), 5.40−5.28(m,3H),
4.20−4.15(m,1H), 4.05(d,2H,J=5.3Hz),
3.80−3.56(m,2H), 3.20−3.10(m,2H),
2.14−1.98(m,8H), 1.55−1.40(m,4H),
1.30−1.15(m,2H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix)
C25H31F3N3O9 (M + 1): 計算値 574.2012 ; 測定値 574.2061.
(3)1−(β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]ピロール−2−カルボアルデヒド 5’−三リン酸 (NH2−hx−PaTP) (工程(d))
1−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−4−[(3−(6−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]ピロール−2−カルボアルデヒド(57mg、100μmol)を10mL ナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(100μL)および無水ジオキサン(300μL)を加えて溶解させ、2−クロロ−4H−1,2,3−ジオキサホスホリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(110μL、110μmol)を加えて室温で10分間攪拌したのちに、トリ−n−ブチルアミン(100μL)およびビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロリン酸の0.5M DMF溶液(300μL)を加えて10分間攪拌した。1% ヨウ素/水/ピリジン溶液(2mL)を加え、室温で15分間攪拌し、5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150μL)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(5mL)を加え、室温で30分間攪拌した後に濃アンモニア水(20mL)を加えて8時間攪拌した。これをDEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm,濃度直線勾配;TEABの50mM―1M 溶液)およびC18−HPLC(濃度勾配;0%―50% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
C19H29N3O15P3 [M−H]−: 計算値 632.08 ; 測定値 632.00
(4)1−(β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]ピロール−2−カルボアルデヒド 5’−三リン酸 (FAM−hx−PaTP) (工程(e))
上記で合成したNH2−hx−PaTPの1/3量を0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.5、2.5mL)に溶解させ、5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシスクシンイミジル エステル(9mg、19μmol)のDMF溶液(200μL)を加えて、時々振とうさせながら遮光下室温で9時間反応させた。これに濃アンモニア水(1mL)を加え、時々振とうさせながら1時間反応させた。これを凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm,濃度直線勾配;TEABの50mM―1M 溶液)およびC18−HPLC(濃度勾配;0%―50% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
9.07(s,1H), 8.20(s,1H),
7.93(d,1H,J=7.9Hz), 7.62(brs,1H),
7.13(d,1H,J=7.9Hz), 7.00−6.60(m,7H),
6.10(d,1H,J=3.2Hz), 4.25−3.80(m,7H),
3.40−3.20(m,2H), 3.04(q,18H,J=7.3Hz),
2.16(t,2H,J=6.4Hz), 1.65−1.45(m,4H),
1.40−1.00(m,29H).
31P NMR (121MHz, D2O) δ
−10.90, −11.38, −23.25.
MS (ESI)
C40H39N3O21P3 [M−H]−: 計算値 990.13; 測定値 989.78.
(5)1−(β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−(テトラメチルローダミン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]ピロール−2−カルボアルデヒド 5’−三リン酸 (TAMRA−hx−PaTP) (工程(e))
上記で合成したNH2−hx−PaTPの1/3量を0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.5,2.5mL) に溶解させ、5−カルボキシテトラメチルローダミン N−ヒドロキシスクシンイミジル エステル(TAMRA−SE)(10mg、19μmol)のDMF溶液(1mL)を加えて、時々振とうさせながら遮光下室温で9時間反応させた。これに濃アンモニア水(1mL)を加え、時々振とうさせながら8時間反応させた。これを凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm,濃度直線勾配;TEABの50mM―1M 溶液)およびC18−HPLC(濃度勾配;12.5%―50% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
9.07(s,1H), 8.26(s,1H),
8.02(d,1H,J=7.9Hz), 7.69(s,1H),
7.35(d,1H,J=7.9Hz), 7.10(d,1H,J=9.4Hz),
7.01(d,1H,J=9.4Hz), 6.88−6.70(m,3H),
6.39(d,2H,J=9.2Hz), 6.06(d,1H,J=3.5Hz),
4.20(t,1H,J=4.9Hz), 4.10−3.80(m,6H),
3.55−3.30(m,2H), 3.25−3.00(m,30H),
2.25(t,2H,J=6.3Hz), 1.75−1.55(m,4H),
1.40−1.10(m,29H).
31P NMR (121MHz, D2O) δ −10.84, −11.56, −23.22.
MS (ESI)
C44H49N5O19P3 [M−H]−: 計算値 1044.22; 測定値 1044.09.
実施例IX クレノウフラグメントを用いた複製による、アミノ基や蛍光色素を結合した基質PnのDNA(55−mer)中への導入
本実施例では、リンカーを介してアミノ基や蛍光色素(FAM)を結合した基質Pn(NH2−hx−dPnTP、FAM−hx−dPnTP)(実施例VIIで作成)を用いて、複製によるこれらの基質のDNA中への取り込みを調べた。
本実施例では、蛍光色素(FAMあるいはTAMRA)をリンカーを介して結合した基質Pa(FAM−hx−PaTP,TAMRA−hx−PaTP)(実施例VIIIで作成)を用いて、転写によるこれらの基質のRNA中への取り込みを調べた。
Claims (29)
- 核酸の複製の方法であって、複製反応においてアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸を基質として用いることを特徴とする、方法。
- 前記置換基が、アミノ基である、請求項1に記載の方法。
- 複製反応において、エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いる、請求項1又は2に記載の方法。
- エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有する、クレノウフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ及び好熱菌由来のDNA ポリメラーゼからなる群から選択される、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 基質となるデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸が、非天然型の塩基を有する、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 基質となるデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸が、天然型の塩基を有する、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- アミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸。
- ジメチルアミノ基及びメルカプト基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、請求項9に記載のデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸。
- アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されており、かつ非天然型の塩基を有する、デオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸。
- アミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されており、かつ天然型の塩基を有するデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸。
- 天然型の塩基がアデニンである、請求項12に記載のデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸。
- アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド 5’−三リン酸の、請求項1ないし8のいずれか1項に記載の核酸の複製のための方法における、基質としての使用。
- 以下の式1:
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして、
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドと、
以下の式2:
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドとが、塩基対を形成している核酸。 - 式1の塩基が、以下の
A1)7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A2)7−(2−チアゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A3)7−(1H−2−イミダゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A4)5−アミノ−7−(2−チエニル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A5)5−アミノ−7−(2−チアゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A6)5−アミノ−7−(1H−2−イミダゾリル)−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基;
A7)4−(2−チエニル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基;
A8)4−(2−チアゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基;
A−9)4−(1H−2−イミダゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基:
A−10)6−アミノ−4−(2−チエニル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基;
A−11)6−アミノ−4−(2−チアゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基;及び
A−12)6−アミノ−4−(1H−2−イミダゾリル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基
からなるグループから選択される、請求項15に記載の核酸。 - 式2の塩基が、以下の
B1)2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基
B2)2−ホルミル−4−ヨード−1H−ピロール−1−イル基;
B3)2−ホルミル−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;
B4)2−ホルミル−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B5)2−ホルミル−4−(2−置換アミノビニル)−1H−ピロール−1−イル基;
B6)2−ホルミル−4−(3−置換アミノ−1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B7)2−ニトロ−1H−ピロール−1−イル基;
B8)2−ニトロ−4−ヨード−1H−ピロール−1−イル基;
B9)2−ニトロ−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;
B10)2−ニトロ−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
B11)2−ニトロ−4−(2−置換アミノビニル)−1H−ピロール−1−イル基;及び
B12)2−ニトロ−4−(3−置換アミノ−1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基
からなるグループから選択される、請求項15に記載の核酸。 - 転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で、塩基対を形成している、請求項15ないし17のいずれか1項に記載の核酸。
- 以下の式1:
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式2:
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式2の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式1の塩基を有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法。 - 以下の式2:
R3は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R4は、ホルミル基又はニトロ基である。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式1:
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された若しくは無置換の2−チエニル基、置換された若しくは無置換の2−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の1H−2−イミダゾリル基であり、そして
Aは、N又はCHである。]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式1の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式2の塩基を有するヌクレオチドを取り込む
ことを含む、前記調製方法。 - 請求項19または20に記載の方法によって調製された、式1及び/又は式2の塩基を有するヌクレオチドを含む核酸。
- tRNA、mRNA、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はsiRNAである、請求項21に記載の核酸。
- 以下の式4:
R7は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のC1−C3アルキル基、置換された若しくは無置換のC2−C3アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のC2−C3アルキニル基から選択される基であり、そして、
R8は、ホルミル基又はニトロ基であり、
ただし、R7が水素又は1−プロピニル基で、R8がホルミル基の場合を除く。]
で表される塩基を有する5’−O−(4、4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト)デオキシリボヌクレオシドの、請求項19に記載の核酸を調製する方法における、転写又は複製における鋳型の化学合成、及びDNA又はRNAの化学合成における原料としての使用。 - 請求項20に記載の方法によって調製された、式2で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸であって、式2の置換基R3が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたC1−C3アルキル基、C2−C3アルケニル基、又はC2−C3アルキニル基である、前記核酸。
- 式2の置換基R3が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたC1−C3アルキル基、C2−C3アルケニル基、又はC2−C3アルキニル基である、請求項24に記載の使用。
- 式4の置換基R7が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたC1−C3アルキル基、C2−C3アルケニル基、又はC2−C3アルキニル基である、請求項26に記載の使用。
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