JP5146957B2

JP5146957B2 - 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対

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Publication number: JP5146957B2
Application number: JP2007549184A
Authority: JP
Inventors: 一郎平尾; 茂之横山
Original assignee: Tagcyx Biotechnologies Inc; RIKEN
Current assignee: Tagcyx Biotechnologies Inc; RIKEN
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2026-12-07
Also published as: EP1970445B1; EP1970445A4; US20100036111A1; US8030478B2; AU2006323745A1; CA2642657A1; KR101404374B1; CN101365791A; CN101365791B; AU2006323745B2; HK1121491A1; WO2007066737A1; KR20080093986A; JPWO2007066737A1; EP1970445A1

Description

本出願は、２００５年１２月９日に提出された日本国出願特願２００５−３５６８８３および２００６年７月１０日に提出された日本国出願特願２００６−１８９８０６に基づく優先権を主張し、その全内容は本明細書中に取り込まれる。

本発明は、核酸の複製の方法及び新規人工塩基対に関する。

核酸は、Ａ−Ｔ（Ｕ）およびＧ−Ｃ塩基対の自己相補性により増幅し、並びに触媒およびリガンドとして機能する。しかしながら、天然型のタンパク質における２０の異なるアミノ酸と比べて、天然型の核酸においては僅か４つの異なる塩基からなるヌクレオチドで形成されているという数の制限が、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の機能を限定している。非天然型塩基対システムは、核酸の塩基の種類を増やして遺伝情報を拡張することができるので、この問題の解決法となる（非特許文献１−５）。非天然型塩基対としては、ポリメラーゼ触媒反応により、ＤＮＡおよびＲＮＡに特別なヌクレオチド類似体の部位特異的導入を可能にする高い特異的相補性が要求される。これが可能になれば、天然に存在する塩基の数により制限される現在の遺伝子工学が、非天然型塩基対システムを使用する新規技術により取り替えられ得る。

非天然型塩基対を作成する最初の試みは、Ｂｅｎｎｅｒらにより行われた（非特許文献６−７）。彼らは、天然型塩基対の水素結合パターンとは異なる水素結合パターンで、イソグアニン−イソシトシン（ｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ）およびキサントシン−ジアミノピリミジンのような、いくつかの非天然型塩基対を開発した。最近これらの非天然型塩基対が、該塩基対を含有するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅（非特許文献８−９）、および配列解析（非特許文献１０）に適用された。しかしながら、忠実度は比較的高くはなく、そして／または面倒な方法が必要とされる。これらの問題に加えて、ｉｓｏＣおよびジアミノピリミジンのような２−アミノピリミジン類似体は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより基質として認識されない。したがってこれらの塩基対の使用は制限されている。

次いで、Ｋｏｏｌらは、天然型塩基に類似の形を有するが、塩基対合において水素結合を形成する能力を欠く疎水性塩基を合成した（非特許文献１１−１２）。これらの疎水性塩基は、ＤＮＡポリメラーゼにより選択的に認識されたことから、複製においては、水素結合相互作用よりむしろ塩基対間の幾何学的な形の相補性が重要であることが示唆された。最近、一連の疎水性塩基対がＲｏｍｅｓｂｅｒｇらにより開発され、そして大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントにより、これらの塩基対がＤＮＡ中に相補的に導入された（非特許文献１３−１５）。しかしながら、疎水塩基は、複製において、形の相補性に従わずに、疎水性塩基間で非特異的導入が生じた（非特許文献１４）。さらに、転写において機能するこれらの塩基対の報告はない。

水素結合パターンおよび形の相補性の概念を組み合わせることにより、本発明者らは、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（ｓ）と２−オキソピリジン（ｙ）との間（非特許文献１６−１７）、並びに２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン（ｖ）とｙとの間（非特許文献１８）の、非天然型塩基対を開発した。ｓおよびｖの６位の大きな置換基は、天然型塩基との好ましくない塩基対（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅｐａｉｒｉｎｇ）を効率的に抑制し、そして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、鋳型中のｓまたはｖに相補して、ｙおよび修飾ｙ塩基の基質（ヌクレオシド５’−３リン酸）が部位特異的にＲＮＡ中に導入された。この特異的転写は、機能性のＲＮＡ分子を開発する手法として実用化が可能であるが（非特許文献１９−２１）、複製におけるｓ−ｙおよびｖ−ｙ塩基対の選択性は、転写における選択性と比べてそれほど高くはない（非特許文献１６、１８）。

上記問題解決のために、複製と転写（機能性核酸の創製）、あるいは、複製・転写・翻訳の全て（機能性タンパク質の創製）において、効率、選択性に優れた新規な人工塩基対が希求される。

以下の文献は、参考文献としてその全内容が本明細書中に援用される。
ＷＯ２００１／００５８０１ＷＯ２００４／００７７１３ＷＯ２００５／０２６１８７特願２００５−２２６４９２号 Benner, S. A., Burgstaller, P., Battersby, T. R. & Jurczyk, S. in The RNA World (eds Gesteland, R. F., Cech, T. R. & Atkins, J. F.) 163-181 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999). Henry, A. A. & Romesberg, F. E. Beyond A, C, G and T: augmenting nature's alphabet. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 727-733 (2003). Moser, M. J. & Prudent, J. R. Enzymatic repair of an expanded genetic information system. Nucleic Acids Res. 31, 5048-5053 (2003). Bergstrom, D. E. Orthogonal base pairs continue to evolve. Chem. Biol. 11, 18-20 (2004). Benner, S. A. & Sismour, A. M. Synthetic biology. Nat. Rev. 6, 533-543 (2005). Piccirilli, J. A., Krauch, T., Moroney, S. E. & Benner, S. A. Enzymatic incorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alphabet. Nature 343, 33-37 (1990). Switzer, C. Y., Moroney, S. E. & Benner, S. A. Enzymatic recognition of the base pair between isocytidine and isoguanosine. Biochemistry 32, 10489-10496 (1993). Sismour, A. M. et al. PCR amplification of DNA containing non-standard base pairs by variants of reverse transcriptase from Human Immunodeficiency Virus-1. Nucleic Acids Res. 32, 728-735 (2004). Johnson, S. C., Sherrill, C. B., Marshall, D. J., Moser, M. J. & Prudent, J. R. A third base pair for the polymerase chain reaction: inserting isoC and isoG. Nucleic Acids Res. 32, 1937-1941 (2004). Ahle, J. D., Barr, S., Chin, A. M. & Battersby, T. R. Sequence determination of nucleic acids containing 5-methylisocytosine and isoguanine: identification and insight into polymerase replication of the non-natural nucleobases. Nucleic Acids Res. 33, 3176-3184 (2005). Morales, J. C. & Kool, E. T. Efficient replication between non-hydrogen-bonded nucleoside shape analogs. Nat. Struct. Biol. 5, 950-954 (1998). Kool, E. T., Morales, J. C. & Guckian, K. M. Mimicking the structure and function of DNA: Insights into DNA stability and replication. Angew. Chem. Int. Ed. 39, 990-1009 (2000). McMinn, D. L. et al. Efforts toward expansion of the genetic alphabet: DNA polymerase recognition of a highly stable, self-pairing hydrophobic base. J. Am. Chem. Soc. 121, 11585-11586 (1999). Wu,Y. et al. Efforts toward expansion of the genetic alphabet: optimization of interbase hydrophobic interactions. J. Am. Chem. Soc. 122, 7621-7632 (2000). Ogawa, A. K. et al. Efforts toward the expansion of the genetic alphabet: Information storage and replication with unnatural hydrophobic base pairs. J. Am. Chem. Soc. 122, 3274-3287 (2000). Fujiwara, T., Kimoto, M., Sugiyama, H., Hirao, I. & Yokoyama, S. Synthesis of 6-(2-thienyl)purine nucleoside derivatives that form unnatural base pairs with pyridin-2-one nucleosides. Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 2221-2223 (2001). Hirao, I. et al. An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins. Nat. Biotechnol. 20, 177-182 (2002). Mitsui, T., Kimoto, M., Harada, Y., Yokoyama, S. & Hirao, I. An efficient unnatural base pair for a base-pair-expanded transcription system. J. Am. Chem. Soc. 24, 8652-8658 (2005). Kimoto M. et al. Site-specific incorporation of a photo-crosslinking component into RNA by T7 transcription mediated by unnatural base pairs. Chem. Biol. 11, 47-55 (2004). Moriyama, K., Kimoto, M., Mitsui, T., Yokoyama, S. & Hirao, I. Site-specific biotinylation of RNA molecules by transcription using unnatural base pairs. Nucleic Acids Res. 33, e129 (2005). Kawai, R. et al. Site-specific fluorescent labeling of RNA molecules by specific transcription using unnatural base pairs. J. Am. Chem. Soc. in press. Matray, T.J. & Kool, E.T. A specific partner for abasic damage in DNA. Nature 399, 704-708 (1999). Doublie, S., Tabor, S., Long, A. M., Richardson, C. C. & Elenberger, T. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution. Nature 391, 251-258 (1998). Kiefer, J. R., Mao, C., Braman, J. C. & Beese, L. S. Visualizing DNA replication in a catalytically active Bacillus DNA polymerase crystal. Nature 391, 304-307 (1998). Morales, J. C. & Kool, E. T. Functional hydrogen-bonding map of the minor groove binding tracks of six DNA polymerases. Biochemistry 39, 12979-12988 (2000). Mitsui, T. et al. An unnatural hydrophobic base pair with shape complementarity between pyrrole-2-carbaldehyde and 9-methylimidazo[(4,5)-b]pyridine. J. Am. Chem. Soc. 125, 5298-5307 (2003). Morales, J. C. & Kool. E. T. Minor groove interactions between polymerase and DNA: More essential to replication than Watson-Crick hydrogen bonds? J. Am. Chem. Soc. 121, 2323-2324 (1999). Hirao, I. et al. A two-unnatural-base-pair system toward the expansion of the genetic code. J. Am. Chem. Soc. 126, 13298-13305 (2004). Tae, E. L., Wu, Y., Xia, G., Schultz, P. G. & Romesberg, F. E. Efforts toward expansion of the genetic alphabet: Replication of DNA with three base pairs. J. Am. Chem. Soc. 123,7439-7440 (2001). Petruska, J. et al. Comparison between DNA melting thermodynamics and DNA polymerase fidelity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6252-6256 (1988). Goodman, M. F., Creighton, S., Bloom, L. B. & Petruska, J. Biochemical basis of DNA replication fidelity. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 83-126 (1993). Kimoto, M., Yokoyama, S. & Hirao, I. A quantitative, non-radioactive single-nucleotide insertion assay for analysis of DNA replication fidelity by using an automated DNA sequencer. Biotechnol. Lett. 26, 999-1005 (2004). Ohtsuki, T. et al. Unnatural base pair for specific transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 4922-4925 (2001). Mitsui, T., Kimoto, M., Sato, A., Yokoyama, S. & Hirao, I. An unnatural hydrophobic base, 4-propynylpyrrole-2-carbaldehyde, as an efficient pairing partner of 9-methylimidazo[(4,5)-b]pyridine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 4515-4518 (2003). Cha, R. S. & Thilly W, G. in PCR Primer (eds Dieffenbach, C. W. & Dveksler, G. S.) 37-51 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1995). Himeno, H., Hasegawa, T., Ueda, T., Watanabe, K. & Shimizu, M. Conversion of aminoacylation specificity from tRNATyr to tRNASer in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6815-6819 (1990). Bedouelle, H. Recognition of tRNATyr by tyrosyl-tRNA synthetase. Biochimie 72, 589-598 (1990). Mulder, B. A. et al. Nucleotide modification at the γ-phosphate leads to the improved fidelity of HIV-1 reverse transcriptase. Nucleic Acids Res. 33, 4865-4873 (2005). Mitsui, T., Kitamura, A., Kimoto, M., To, T., Sato, A., Hirao, I. & Yokoyama, S. An unnatural hydrophobic base pair with shape complementarity between pyrrole-2-carbaldehyde and 9-methylimidazo[(4,5)-b]pyridine. J. Am. Chem. Soc. 125, 5298-5307 (2003). Mitsui, T., Kimoto, M., Sato, A., Yokoyama, S. & Hirao, I. An unnatural hydrophobic base, 4-propynylpyrrole-2-carbaldehyde, as an efficient pairing partner of 9-methylimidazo[(4,5)-b]pyridine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 4515-4518 (2003). De Roos, K. B. & Salemink, C. A., Deazapurine derivatives. V, A new synthesis of 1- and 3-deaza-adenine and related compound. Recueil. 88, 1263-1274 (1963). Rolland, V., Kotera, M. & Lhomme, J. Convenient preparation of 2-deoxy 3,5-di-O-p-toluoyl-a-D-erythro-pentofuranosyl chloride. Synthetic commun. 27, 3505-3511 (1997). Ludwig, J. & Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of 5'-O-(1-thiotriphosphates), 5'-O-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989). Stevens, J. D., Ness, R. K. & Fletcher. Jr, H. G. Syntheses with partially benzylated sugars. XI. Studies on the synthesis of the anomeric 5,6-dimethyl-1-D-ribofuranosylbenzimidazole (Ribazoles). Comparison of the condensation of 2,3,5-tri-O-benzoyl-D-ribofuranosyl bromide and 2,3,5-tri-O-benzoyl-D-ribofuranosyl chloride with 5,6-dimethylbenzimidazole. J. Org. Chem. 33, 1806-1810 (1968). Kovacs, T. & Otvos, L. Simple synthesis of 5-vinyl- and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-5'-triphosphates. Tetrahedron Lett. 29, 4525-4528 (1988). Ti, G. S., Gaffney, B. L. & Jones, R. A., Transient protection: Efficient One-Flask Syntheses of Protected Deoxynucleosides. J. Am. Chem. Soc. 104, 1316-1319 (1982). Stumber, M., Herrmann, C., Wohlgemuth, S., Kalbitzer, H. R., Jahn, W. & Geyer, M. Synthesis, characterization and application of two nucleoside triphosphate analogues, GTPγNH2 and GTPγF. Eur. J. Biochem. 269, 3270-3278 (2002). Knorre, D. G., Kurbatov, V. A. & Samukov, V. V. General method for the synthesis of ATP gamma-derivatives. FEBS Lett. 70, 105-108 (1976). K. J. Morgan and D. P. Morrey. Nitropyrrole-I, The preparation and properties of 2- and 3-nitropyrrole, Tetrahedron, 22, 57-62, 1966.

本願発明は、以下の態様１−２７を提供することを目的とする。

態様１：核酸の複製の方法であって、複製反応においてアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を基質として、（好ましくはこれを通常の基質と組み合わせて）用いることを特徴とする、方法。

態様２：前記置換基が、アミノ基である、態様１の記載の方法。

態様３：複製反応において、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いる、態様１又は２に記載の方法。

態様４：エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、クレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及び好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼなど）からなる群から選択される、態様１ないし３のいずれか１項に記載の方法。

態様５：基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が、非天然型の塩基を有する、態様１ないし４のいずれか１項に記載の方法。

態様６：基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が、天然型の塩基を有する、態様１ないし４のいずれか１項に記載の方法。

態様７：基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が、以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ¹は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ²は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸である、態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法。

態様８：基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が、以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸である、態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法。

態様９：アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸。

態様１０：アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されており、かつ非天然型の塩基を有する、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸。

態様１１：アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されており、かつ天然型の塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸。

態様１２：アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の、態様１ないし８のいずれか１項に記載の核酸の複製のための方法における、基質としての使用。

態様１３：以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ¹は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ²は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして、
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するヌクレオチドと、
以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するヌクレオチドとが、塩基対を形成している核酸。

態様１４：式１の塩基が、以下の
Ａ１）７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ２）７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ３）７−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ４）５−アミノ−７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ５）５−アミノ−７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ６）５−アミノ−７−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ７）４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基；
Ａ８）４−（２−チアゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基；
Ａ−９）４−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基：
Ａ−１０）６−アミノ−４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基；
Ａ−１１）６−アミノ−４−（２−チアゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基；及び
Ａ−１２）６−アミノ−４−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基
からなるグループから選択される、態様１３に記載の核酸。

態様１５：式２の塩基が、以下の
Ｂ１）２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基
Ｂ２）２−ホルミル−４−ヨード−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ３）２−ホルミル−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ４）２−ホルミル−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ５）２−ホルミル−４−（２−置換アミノビニル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ６）２−ホルミル−４−（３−置換アミノ−１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ７）２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ８）２−ニトロ−４−ヨード−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ９）２−ニトロ−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ１０）２−ニトロ−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ１１）２−ニトロ−４−（２−置換アミノビニル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；及び
Ｂ１２）２−ニトロ−４−（３−置換アミノ−１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基
からなるグループから選択される、態様１３に記載の核酸。

態様１６：転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で、塩基対を形成している、態様１３ないし１５のいずれか１項に記載の核酸。

態様１７：以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ¹は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ²は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式２の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式１の塩基を有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法。

態様１８：以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ¹は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ²は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式１の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式２の塩基を有するヌクレオチドを取り込む
ことを含む、前記調製方法。

態様１９：態様１７または１８に記載の方法によって調製された、式１及び／又は式２の塩基を有するヌクレオチドを含む核酸。

態様２０：ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム、アプタマー又はｓｉＲＮＡである、態様１９に記載の核酸。

態様２１：以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ¹は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ²は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するリボヌクレオシド５’−三リン酸。

態様２２：以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するリボヌクレオシド５’−三リン酸。

態様２３：以下の式３：

［ここにおいて、
Ｒ⁵は、水素又は置換アミノ基であり、
Ｒ⁶は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
ＡはＮ又はＣＨである。］
で表される塩基を有する５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）デオキシリボヌクレオシド。

態様２４：以下の式４：

［ここにおいて、
Ｒ⁷は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁸は、ホルミル基又はニトロ基であり、
ただし、Ｒ⁷が水素又は１−プロピニル基で、Ｒ⁸がホルミル基の場合を除く。］
で表される塩基を有する５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）デオキシリボヌクレオシド。

態様２５：態様１８に記載の方法によって調製された、式２で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸であって、式２の置換基Ｒ³が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたＣ₁−Ｃ₃アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₃アルケニル基、又はＣ₂−Ｃ₃アルキニル基である、前記核酸。

態様２６：態様２２に記載のリボヌクレオシド５’−三リン酸であって、Ｒ³が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたＣ₁−Ｃ₃アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₃アルケニル基、又はＣ₂−Ｃ₃アルキニル基である、前記リボヌクレオシド５’−三リン酸。

態様２７：態様２４に記載の５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）デオキシリボヌクレオシドであって、Ｒ⁷が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたＣ₁−Ｃ₃アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₃アルケニル基、又はＣ₂−Ｃ₃アルキニル基である、前記５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）デオキシリボヌクレオシド。

本発明者らは、上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、本発明を想到した。

本発明の非天然型塩基対システムの開発の経緯
本発明者は、複製と転写の反応において、効率および選択性に優れた人工塩基対を得るために、自分たちが開発したいくつかの非天然型塩基対を組み合わせることによって構築される塩基対を研究した。

本発明者は、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル（ｓ）（非特許文献１７、３３）と２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐａ）（非特許文献２６）の組み合わせが、転写において高度な選択性および効率を示すことを見出した（特許文献４：未公開）。そして、本発明においてさらに、ｓのプリン環中の６員環の２つのＮ原子のうち１つをＣＨに置換し２位のアミノ基を水素に替えた、即ち、デアザ、デアミノ化した７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）を作成し、ＤｓとＰａの人工塩基対の適合を調べた。その結果、ＤｓとＰａの人工塩基対は、複製と転写において、どちらが鋳型、又は基質となっても高度な選択性および効率を示すことを見出し、本発明を想到した。

具体的には、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）およびピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）間、並びにＤｓおよび４−プロピニルピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ’）（図１ａ）間の疎水性塩基対がｉｎｖｉｔｒｏでの複製および転写において高い選択性を示すことが見出された（図１ｃ）。複製において、本発明者らは、通常の５’−三リン酸と修飾５’−三リン酸である５’−γ−アミド三リン酸（図１ｂ）の基質を組み合わせ、さらに、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を可能にする高い選択性を達成した。さらに、これらの非天然型塩基は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる通常の転写でＲＮＡ中に相補的に導入された。

より詳細には、本発明者らは、以下の２つの概念を考慮することによりＤｓ−Ｐａ塩基対を設計した；１）塩基対の選択性を高めるために、天然型塩基とは異なる形の疎水性塩基を採用し（非特許文献１２、２２）、２）ポリメラーゼとの相互作用に必要な（非特許文献２３−２５）、プロトン受容基、例えば、Ｄｓの４位の窒素（ＡおよびＧの３位に対応）およびＰａのアルデヒド基（ＣおよびＴの２位のケト基に対応）を追加した（図１ａ）。

疎水性塩基対の致命的な問題は、塩基の形の相補性に従わない疎水性塩基−疎水性塩基間の塩基対（例えば、Ｄｓ−Ｄｓ対合）が効率よく形成されてしまうことである（非特許文献１４、２９）。複製におけるＤｓ−Ｐａ塩基対の選択性を試験するために、本発明者らは、エキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウフラグメント（ＫＦｅｘｏ^-）を使用した１ヌクレオチド挿入実験により、基質と鋳型間の塩基対形成能を調べた（図２ａ）（非特許文献３０−３２）。

実験に用いる基質（ｄＤｓＴＰおよびｄＰａＴＰ）とＤｓまたはＰａを含む鋳型ＤＮＡは、化学的に合成された（実施例Ｉ及びＩＩ）。実験の結果は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対形成およびＡ−Ｔ塩基対形成のそれぞれの選択性がそれ以外の組み合わせの塩基間の対合の選択性よりも高いことを示した（図２ｂおよび表１及び２）。

表１クレノウフラグメントによる鋳型ＤＮＡへの１ヌクレオチド導入実験。

ａ．アッセイを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴおよび０．０５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有する溶液（１０μｌ）中で、５μＭ鋳型−プライマー二本鎖、５−５０ｎＭ酵素、および０．３−１５００μＭヌクレオシド５’−三リン酸を用いて、３７℃で１−３５分間行った。各変数は３ないし８のデータセットで平均化された。

ｂ．標準偏差を括弧中に示す。

ｃ．１５００μＭヌクレオシド５’−三リン酸および５０ｎＭ酵素で２０分間インキュベーションした後においても産物は、ほとんど検出されなかった（＜２％）。

ｄ．この用語の単位は、％ｍｉｎ^-1Ｍ^-1である。

表２クレノウフラグメントによる鋳型ＤＮＡへの１ヌクレオチド導入実験。

ａ．アッセイを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴおよび０．０５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有する溶液（１０μｌ）中で、５μＭ鋳型−プライマー二本鎖、５−５０ｎＭ酵素、および０．３−１５００μＭヌクレオシド５’−三リン酸を用いて、３７℃で１−３５分間行った。各データは３ないし８のデータセットで平均化された。

ｂ．標準偏差を括弧中に示す。

ｄ．単位は、％ｍｉｎ^-1Ｍ^-1である。

しかしながら、鋳型中のＤｓに対してｄＤｓＴＰ（Ｖ_max／Ｋ_M＝２．０×１０⁵）が効率よく取り込まれてしまい、Ｄｓに対するｄＰａＴＰの導入効率（Ｖ_max／Ｋ_M＝６．２×１０⁴）よりも高い効率であった。このＤｓ−Ｄｓ対は、問題とされる塩基の形の相補性に従わない疎水性塩基−疎水性塩基間の塩基対形成であるため、Ｂ型ＤＮＡ構造を変形させてしまう。その結果、鋳型中のＤｓに対してｄＤｓＴＰが導入されると、その後の複製の伸長が停止してしまう。例えば、Ｄｓを含む鋳型ＤＮＡを用いて、ｄＰａＴＰとｄＤｓＴＰの両基質を含む溶液中でプライマー伸長反応を行うと、ｄＤｓＴＰの増加とともに（ｄＰａＴＰの０．５または１モル等量）鋳型中のＤｓに対してｄＤｓＴＰが取り込まれてしまうので、３’ →５’エキソヌクレアーゼ活性を有するクレノウフラグメント（ＫＦｅｘｏ⁺）によるプライマー伸長は阻害された（図２ｄ、レーン３および４）。

そこで複製におけるこの疎水塩基対の本質的な問題を解決するために、本発明者らはさらに、基質としてＤｓの修飾５’−三リン酸である５’−γ−アミド三リン酸（図１ｂ）（ｄＤｓＴＰ_Nと表示する）を採用した。本発明者らは、鋳型中のＤｓに対してｄＤｓＴＰ_Nの導入効率（Ｖ_max／Ｋ_M＝９．９×１０³）が有意に減少することを発見した。しかし、更なる問題は、鋳型中のＰａに対するｄＤｓＴＰ_Nの導入効率（Ｖ_max／Ｋ_M＝６．７×１０⁴）が、鋳型中のＰａに対するＡの導入効率（Ｖ_max／Ｋ_M＝４．３×１０⁴）に近いレベルにまで低下してしまうことであった。この問題は、Ａの５’−γ−アミド三リン酸（ｄＡＴＰ_N）を使用することにより解決することができた。ｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰ_Nを用いることにより、鋳型Ｐａに対するｄＤｓＴＰ_Nの導入効率は、鋳型Ｐａに対するｄＡＴＰ_Nの導入効率（Ｖ_max／Ｋ_M＝１．８×１０³）よりも３７倍高くなり、Ｐａ−Ｄｓ塩基対の高い選択性を保つことができた。

したがって、本発明者らは、通常の５’−三リン酸であるｄＰａＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、と５’−γ−アミド三リン酸であるｄＤｓＴＰ_NおよびｄＡＴＰ_Nを組み合わせて使用することにより、複製において非天然型塩基対の高い相補的な選択性を達成した（図２ｃ）。

修飾基質ｄＤｓＴＰ_Nの存在下では、鋳型Ｄｓに対するＰａの導入の後のプライマー伸長反応は、阻害されること無く進行した（図２ｄ、レーン５および６）。さらに、鋳型Ｐａに対するｄＤｓＴＰ_Nの導入、または鋳型Ｔに対するｄＡＴＰ_Nの導入後のプライマー伸長も効率的に進行した（図２ｅ、レーン２および図２ｅ、レーン１４）。興味深いことに、鋳型Ｐａに対してｄＡＴＰが誤って導入された場合のその後の伸長反応よりも、鋳型Ｐａに対するｄＡＴＰ_Nの誤った導入後の伸長反応のほうが著しくその反応効率が低下した（図２ｅ、レーン４および５）。

非天然型塩基対の選択性をさらに改善するために、本発明者らは、本システムにおいて３’ →５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用した。ＫＦｅｘｏ＋を用いることにより、望ましくないＡ−ＰａおよびＤｓ−Ｔ塩基対が形成された後のプライマー伸長反応の効率は著しく低下し、プライマー伸長は非天然型塩基位置周辺で中断された（図２ｄレーン１、並びに図２ｅレーン９，１０，１７および１８）。

したがって、本発明者らは好ましくは、３’ →５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼに通常の５’−三リン酸基質と修飾５’−三リン酸基質を組み合わせて、複製において、Ａ−ＴおよびＧ−Ｃ塩基対と共に機能する特異的非天然型塩基対システムを作成した。

非天然型塩基対は、塩基間の特異的な形の相補性で形成されるが、両者間の水素結合の相互作用を欠く。複製において、好ましくは実用レベルで高い忠実度でＰＣＲ増幅を可能にする３’ →５’エキソヌクレアーゼ活性を有する（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼに対する基質として通常の５’−三リン酸と修飾５’−三リン酸である５’−γ−アミド三リン酸との組み合わせによって、この非天然型塩基対は特に高い選択性を示す。非天然型塩基を含有するＤＮＡ断片の配列は、非天然型塩基の基質を加えたジデオキシヌクレオチド鎖終結法によるシーケンシングにより確認可能である。さらに、非天然型塩基対の相補性は、通常のＴ７転写によるＲＮＡへのこれらの塩基の導入も仲介することができる。

本発明は、以下の１）−３）のうちいずれか、あるいはこれらの組み合わせを用いた、新規な核酸増幅システムを提供する。

１）複製反応においてアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を基質として用いる；
２）複製反応において、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いる；そして、
３）後述の式１の塩基を有するヌクレオチドと式２の塩基を有するヌクレオチドとの人工塩基対を利用する。

以上、本発明の理解のために本発明を想到するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。

核酸の複製方法
本発明は、一態様において核酸の新規な複製方法を提供する。本発明の方法は、複製反応においてアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を基質として用いることを特徴とする。

複製反応において基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸のγ位のリン酸の水酸基を上記の置換基で置換することによって、複製反応の選択性がさらに向上する。このような修飾５’−三リン酸の利用により、基質の取り込み効率が無置換のものと比較して低下する場合であっても、選択性の向上により、人工塩基対を組み込んだ複製反応が実質的に利用可能なように進行する。

好ましくは、前記置換基はアミノ基である。

デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸のγ位のリン酸の水酸基の修飾方法は特に限定されず、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、本明細書の実施例Ｉ−３−（１５）及び（１６）は、置換基がアミノ基の場合の対応するヌクレオシドからの合成例を開示する。あるいは、非特許文献４７も、γ−アミド化ヌクレオチドの合成方法を開示している。

置換基がメチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基、フルオロ基等、アミノ基以外の場合も同様に、当業者に公知の方法を用いて合成することが可能である。

複製反応は、上記基質の使用以外は特に限定されず、公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、複製反応において好ましくない非特異的な塩基対形成を防ぐために、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、クレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、及び好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ）からなる群から選択される。

本発明の方法の一態様として、非天然型の塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を基質として用いることができる。近年、天然型塩基対と異なる水素様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対の創出の研究が行われ、いくつかの人工塩基対が報告されている。人工塩基対は塩基間の水素結合を利用した組み合わせや塩基の疎水性を利用した組み合わせ等が知られている。本発明は、これらの非天然型塩基を有する核酸において、γ位のリン酸の水酸基を修飾することによって、転写、複製及び／又は翻訳反応における選択性、効率を上昇させることを可能にした。

本発明における非天然型塩基の種類は特に限定されず、例えば、下記の公知の任意の非天然型塩基を有するデオキシリボヌクレオチドの利用が包含される。

２−アミノ−６−ジメチルアミノプリン（ｘ）と２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）（非特許文献３３）
２−アミノ−６−(２−チエニル)−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）と２−オキソ−(１Ｈ)ピリジン−３−イル基（ｙ）（特許文献１、非特許文献１７）
２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基（ｖ）と２−オキソ−(１Ｈ)ピリジン−３−イル基（ｙ）（特許文献３、非特許文献１８）
ピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）と７−メチル−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｑ）（非特許文献２６、非特許文献３４）
本発明者はさらに、新規な人工塩基対を考案し、２００５年８月４日に特許出願を行った（特願２００５−２２６４９２号）。上記出願は、ピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）と２−アミノ−６−(２−チエニル)−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）との人工塩基対に関する。上記塩基対は、特にＰａを鋳型としｓを基質とする転写反応において優れた選択性を示す。

さたに、本発明者らは本発明において、さらなる新規人工塩基対を提供する。当該新規人工塩基対も本発明の複製反応に有効に使用しうる。よって、限定されるわけではないが、基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸は、以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ¹は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ²は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸である。

あるいは、基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸は、以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸である。

式１の塩基及び式２の塩基はいずれも、基質、鋳型のいずれとして使用された場合においても複製反応において優れた選択性、効率を示す。さらに、転写反応においても優れた選択性、効率を示す。

本発明において提供される式１の塩基と式２の塩基との新規人工塩基対については、「本発明の人工塩基対に基づく核酸」の項目において詳述する。

あるいは、基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸は、天然型の塩基を有するものであってもよい。デオキシリボヌクレオシドの天然型の塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）の４種類が知られている。これらの天然型の塩基の場合も非天然型の塩基の場合と同様に、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸も、基質として核酸の複製反応に有効に使用しうる。

デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸
本発明はまた、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を提供する。

本発明のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸は、非天然型の塩基を有するものであっても、天然型の塩基を有するものであってもよい。「非天然型の塩基」、及び「天然型の塩基」については、核酸の複製方法に関して上述した通りである。

本発明のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸は、上述した本発明の核酸の複製の方法における、基質としての使用することができる。

本発明の人工塩基対に基づく核酸
本発明者は、複製、転写及び翻訳の全ての反応において、効率および選択性に優れた人工塩基対を得るために、自分たちが開発したいくつかの非天然型塩基対を組み合わせることによって構築される塩基対を研究した。その結果、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル（ｓ）（非特許文献１７、３３）と２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐａ）（非特許文献２６）の組み合わせが、転写において高度な選択性および効率を示すことを見出した（特許文献４：未公開）。

そして、本発明においてさらに、ｓのプリン環中の６員環の２つのＮ原子のうち１つをＣＨに置換し２位のアミノ基を水素に替えた、即ち、デアザ、デアミノ化した７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）を作成し、ＤｓとＰａの人工塩基対の適合を調べた。その結果、ＤｓとＰａの人工塩基対は、複製と転写において、どちらが鋳型、又は基質となっても高度な選択性および効率を示すことを見出し、本発明を想到した。

よって、本発明はその一態様において、以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するヌクレオチドとが、塩基対を形成している核酸を提供する。

本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、上記式１で表される塩基、式２で表される塩基、などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、一、二、又は三リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、２’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を２’位に有する２’−置換リボフラノシルであってもよい。限定されるわけではないが、リン酸部分は、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されていることが望ましい。糖部分及びリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはＲＮＡの構成成分となり、デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはＤＮＡの構成成分となる。

式１の塩基において、Ｒ²のチエニル基、チアゾリル基又はイミダゾリル基は、無置換であるかあるいは、４位及び／又は５位が、メチル基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシ基からなるグループより独立して選択される一つまたはそれより多くの基で置換されていてもよい。

本発明の式１の塩基のうち、Ｒ²が置換された又は無置換の２−チエニル基のものを、本明細書において文脈により、「Ｄｓ」又は「Ｄｓ類似体」と呼称する。本発明の式１の塩基のうち、Ｒ²が置換された又は無置換の２−チアゾリル基のものを、本明細書において文脈により、「Ｄｖ」又は「Ｄｖ類似体」と呼称する。本発明の式１の塩基のうち、Ｒ²が置換された又は無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基のものを、本明細書において文脈により、「Ｄｍ」又は「Ｄｍ類似体」と呼称する。

式１のＲ¹は、本明細書においては、例えば、「Ｄｓ」という場合、Ｒ¹が水素あるいはアミノ基のいずれの場合も含む。これに対して、先行技術文献では、例えば、Ｒ¹がアミノ基の場合に「ｓ」、水素の場合には「ｓ’」と、Ｒ¹の態様に応じて区別して記載してある場合もある。

Ａは、ＮであってもＣＨでもよい。Ｎの場合デアザ体、例えば、「Ｄｓ」「Ｄｖ」「Ｄｍ」と表現する。ＣＨの場合、例えば、「ＤＤｓ」「ＤＤｖ」「ＤＤｍ」と表現する。本願明細書において例えば、「Ｄｓ類似体」は「ＤＤｓ」等を含む。さらに、文脈により、「ＤＤｓ」、「Ｄｓ類似体」を総称して「Ｄｓ」と表現する場合もある。

限定されるわけではないが、好ましくは、式１の塩基は以下の
Ａ１）７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）；
Ａ２）７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｖ）；
Ａ３）７−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ４）５−アミノ−７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）；
Ａ５）５−アミノ−７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｖ）；
Ａ６）５−アミノ−７−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ７）４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ＤＤｓ）；
Ａ８）４−（２−チアゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ＤＤｖ）；
Ａ−９）４−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基：
Ａ−１０）６−アミノ−４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ＤＤｓ）；
Ａ−１１）６−アミノ−４−（２−チアゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ＤＤｖ）；及び
Ａ−１２）６−アミノ−４−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基
からなるグループから選択される。

上記塩基のうち、Ａ１とＡ４はＤｓ、Ａ７とＡ１０はＤＤｓである。Ａ２とＡ５はＤｖ、Ａ８とＡ１１はＤＤｖである。Ａ３とＡ６は、「Ｄｍ」、Ａ９とＡ１２は、「ＤＤｍ」である。

より好ましくは、Ａ１）７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）、Ａ２）７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｖ）、Ａ４）５−アミノ−７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）、又はＡ５）５−アミノ−７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｖ）である。最も好ましくは７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）（実施例Ｉの化合物１０又は１４）である。

本発明の式１の塩基、及びこれを含むヌクレオシド、ヌクレオチドは、公知の方法を用いて合成することが可能である。具体的には例えば、本願明細書の実施例Ｉ−３には、２−アミノ−３−ニトロ−４−クロロピリジン（実施例Ｉの化合物１）（非特許文献４１）から、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）のヌクレオシド５’−三リン酸及び５’−γ−アミド三リン酸（実施例Ｉの化合物１０又は１４）を合成する方法を開示している。また、実施例ＩＩ−１は、７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５］ピリジン（実施例ＩＩの化合物４）（Ｄｖ）のヌクレオシド５’−三リン酸を合成する方法を開示している。

さらに、実施例ＩＩ−３は、４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ＤＤｓ）及び４−（２−チアゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ＤＤｖ）のヌクレオシド５’−三リン酸を合成する方法を開示している。

また、その他の本発明の式１の塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチド、５’−γ−アミド三リン酸も、本願明細書に具体的に開示と同様方法及び／又は当業者に既知の方法を用いて合成することができる。

本発明の式２の塩基において、Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基である。

上記アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基等は、さらに、低級アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、及び芳香族複素環からなるグループより独立して選択される一つまたはそれより多くの基で置換されていてもよい。

あるいは、上記アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基等は、さらに、ビオチン又は蛍光分子で置換されていてもよい。

ビオチンは補酵素Ｒとも呼ばれ、ビタミンＢ群の１種である。ビオチンは、卵白中に含まれる糖タンパク質であるアビジンと特異的に結合し、複合体を形成することが知られている。よって、置換基としてビオチンを有するヌクレオシド等は、アビジンタンパク質に特異的に結合する。このため、ビオチンが結合したヌクレオシド等を含む核酸は、アビジンを結合した担体と結合させることができるので、核酸を固定化、分離することができ、特定の分子に結合する核酸（アプタマーなど）を固定化すれば、例えば、特定物質の検出や単離に、また、診断試薬として利用できる。式２の塩基におけるＲ³のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基等にビオチンを導入するためには、アミノ基を介してビオチンを直接結合させてもよく、リンカーを介して結合させてもよい。

蛍光分子は、公知の蛍光分子を利用可能であるが、好ましくは、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）、およびそれらの誘導体からなる群より選択される。フルオレセイン及びローダミンは、一般的に開環型及びスピロ型の二通りで表記される。

例えば、ＦＡＭの吸収極大波長は４９３ｎｍ、蛍光極大波長は５２２ｎｍである。また、ＴＡＭＲＡの吸収極大波長は５５３ｎｍ、蛍光極大波長は５７８ｎｍである。ＤＡＮＳＹＬの吸収極大波長は３３５ｎｍ、蛍光極大波長は５１８ｎｍである。ＨＥＸの吸収極大波長は５３５ｎｍ、蛍光極大波長は５５６ｎｍである。ＴＥＴの吸収極大波長は５２１ｎｍ、蛍光極大波長は５３６ｎｍである。５−ＲＯＸの吸収極大波長は５６７ｎｍ、蛍光極大波長は５９１ｎｍである。６−ＲＯＸの吸収極大波長は５７０ｎｍ、蛍光極大波長は５９０ｎｍである。蛍光分子で置換されているＲ³を有する式２の塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドは、蛍光分子の種類に応じて核酸の検出を行うことが可能である。よって、式２の塩基におけるＲ³のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基等が蛍光分子で置換された塩基を有するヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。また、各蛍光分子によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。式２の塩基におけるＲ³のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基等に蛍光分子を導入するためには、アミノ基を介して蛍光分子を直接結合させてもよく、リンカーを介して結合させてもよい。

なお、式２の塩基におけるＲ³のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基等にリンカーを介してビオチンまたは蛍光分子を結合させる場合、リンカーの種類は特に限定されず、当業者は適宜採用可能である。リンカーは限定されるわけではないが、好ましくは、下記の化学式ＩおよびＩＩ：

［式Ｉ中、ｎは１ないし５の整数から選択される］
及び

［式ＩＩ中、ｍ及びｌは、１ないし５の整数から各々独立に選択される］
からなる群より選択される。

Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。式２の塩基において、Ｒ⁴がホルミル基の場合、本明細書において文脈により、「Ｐａ」又は「Ｐａ類似体」と呼称する。Ｒ⁴がニトロ基の場合、本明細書において文脈により、「Ｐｎ」又は「Ｐｎ類似体」と呼称する。「Ｐａ」、「Ｐａ類似体」、「Ｐｎ」、「Ｐｎ類似体」等を総称して、「Ｐａ］と呼称する場合もある。

限定されるわけではないが、好ましくは、式２の塩基は以下の
Ｂ１）２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基（Ｐａ）
Ｂ２）２−ホルミル−４−ヨード−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ３）２−ホルミル−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ４）２−ホルミル−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ５）２−ホルミル−４−（２−置換アミノビニル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ６）２−ホルミル−４−（３−置換アミノ−１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ７）２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル基（Ｐｎ）；
Ｂ８）２−ニトロ−４−ヨード−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ９）２−ニトロ−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ１０）２−ニトロ−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ１１）２−ニトロ−４−（２−置換アミノビニル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；及び
Ｂ１２）２−ニトロ−４−（３−置換アミノ−１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基
からなるグループから選択される。

上記塩基のうち、Ｂ１−Ｂ６は「Ｐａ］又は｛Ｐａ誘導体」であり、Ｂ７−Ｂ１２は「Ｐｎ］又は「Ｐｎ誘導体」である。

より好ましくは、Ｂ１）２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基（Ｐａ）（実施例Ｉの化合物１９）、又はＢ４）２−ホルミル−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基（実施例Ｉの化合物２０）である。

本発明の式２の塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチドは、公知の方法を用いて合成することが可能である。例えば、Ｐａは、その出発原料である例えば、ピロール−２−カルボアルデヒドは、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ社［１００３−２９−８］、Ｍｅｒｃｋ社［８０７５７４］から購入することができる。また、Ｐａ誘導体は、基本的にＰａから誘導することによって合成できる。例えば、Ｐａの４位にプロピンを導入した誘導体は、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３，ｐ．４５１５−４５１８（２００３）（非特許文献２８）に記載されている。

本明細書の実施例Ｉでは、実施例Ｉ−３−（１２）において、ピロール−２−カルボアルデヒドから１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド（化合物１７）を合成した。また、（１３）において、４−プロピニル−２−ピロールカルボアルデヒド（化合物１６）（非特許文献４０）から、４−プロピニル−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド（化合物１８）を合成した。さらにこれらのヌクレオシド５’−三リン酸及び５’−γ−アミド三リン酸が合成された（化合物１９及び２０）。

また、本明細書の実施例ＩＩ−２では、２−ニトロピロール（化合物１）（非特許文献４９）から、２−ニトロピロール（化合物１）（Ｐｎ）のヌクレオシド５’−三リン酸が合成された。

本発明は、式１の塩基を有するヌクレオチドと、式２の塩基を有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、核酸を提供する。本明細書において「核酸」とは、１より多くのヌクレオチドが、５’→３’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを含む。二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。また、ＤＮＡには、ＲＮＡを鋳型として逆転写してなるｃＤＮＡも含まれる。あるいは、核酸は３本鎖、４本鎖等も形成しうる。

本発明者らは、核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製へ取り組んだ。新たに開発された人工塩基対の態様として、式１の塩基を有するヌクレオチドと、式２の塩基を有するヌクレオチドとの塩基対が含まれる。式１の塩基を有するヌクレオチド及び式２の塩基を有するヌクレオチドは、いずれも、複製と転写いずれの機構においても、基質としても鋳型としても高効率及び／又は高選択性をもって機能する。

式１の塩基と式２の塩基の間、例えば、ＤｓおよびＰａ間では有意な水素結合相互作用が存在しないにもかかわらず（非水素結合Ｄｓ−Ｐａ塩基対）、Ｄｓ−Ｐａ塩基対形成の効率および選択性は、天然型の塩基対形成のそれと同程度に高いものである。このＤｓ−Ｐａ塩基対は、先に開発された親水性ｓ−ｚ塩基対よりも高い効率を示す。Ｄｓ及びＰａの相補的な形状は互いに適合するが、天然型のプリン類及びピリミジン類の形状とは相違する。この特異的な立体化学的適合が、天然型塩基との望ましくない塩基対合を排除し、その結果、複製と転写においてＤｓ−Ｐａの高い選択性が得られると考えられる。このように、形状−相補性は複製や転写における特異的な塩基対形成に重要な役割を果たす。

本発明の、式１の塩基を有するヌクレオチドと式２の塩基を有するヌクレオチドとは、異なる２本の核酸上に存在して塩基対により二本鎖を形成しうる。あるいは、両ヌクレオチドは同一の一本の核酸上に存在してもよい。この場合、塩基対により、一本鎖はループ構造を形成してもよい。

本発明の式１の塩基を有するヌクレオチド及び式２の塩基を有するヌクレオチドは、複製、転写又は逆転写反応により、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸に取り込むことが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によってＤＮＡ又はＲＮＡに取り込んでもよい。

複製、転写又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ等）、複製反応は、クレノウフラグメント（ＫＦ）、逆転写反応はＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＸＬ（ＡＭＶ−ＲＴ）（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社）を使用することが可能である。

限定されるわけではないが、本発明の核酸は一態様において、核酸の複製、転写、又は逆転写の工程で、塩基対を形成している。本発明の核酸が、転写工程で塩基対を形成している場合、式１の塩基を有するヌクレオチドがＤＮＡの１部であり、式２の塩基を有するヌクレオチドがＲＮＡの一部であってもよいし、あるいはその逆に式２の塩基を有するヌクレオチドがＤＮＡの１部であり、式２の塩基を有するヌクレオチドがＲＮＡの一部であってもよい。

本発明の非天然型塩基対システムの概要を図１ｃに示した。本発明のシステムの複製における効果は、例えば、図２ｂ−ｅ、図３ｂ−ｉ、図８−図２０に示されている。本発明のシステムの転写における効果は、例えば、図４ｃ−ｅ、図５ａ−ｃに示されている。

核酸の調製方法
本発明はまた、以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式２の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式１の塩基を有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法を提供する。

本発明はまた、以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ¹は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ²は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式１の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式２の塩基を有するヌクレオチドを取り込む
ことを含む、前記調製方法を提供する。

式１で表される塩基を有するヌクレオチド、及び式２で表される塩基を有するヌクレオチドの定義については、本明細書の「本発明の人工塩基対に基づく核酸」の項目において前述した通りである。

本発明はさらに、上記本発明の方法によって調製された、式１及び／又は式２の塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を提供することを目的とする。

本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとして使用されうる。アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡとは、ある特定の遺伝子の発現を抑えるＤＮＡ又はＲＮＡである。標的とする遺伝子配列（センス鎖）の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザイムは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称である。アプタマーは、ｉｎｖｉｔｒｏセレクション法によって得られた、タンパク質等の特定の分子に結合する機能を有する核酸である
また、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ）は、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。本発明の核酸は遺伝子断片やプローブなどとして使用されうる。天然の遺伝子の一部又は全部を本発明の核酸で置換した態様、天然の遺伝子に本発明のヌクレオチドを１個又はそれより多く付加したもの、又はこれらを組み合わせたものも本発明に包含される。

さらにまた、本発明の非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）においても利用可能である。ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によってその配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象である。ＲＮＡ干渉の典型的な例としては、ｄｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーに属するダイサー（Ｄｉｃｅｒ）により、３’末端の側に２塩基程度のオーバーハングを有する約２１塩基−２３塩基のｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）にプロセッシングされる。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣと呼ばれるｓｉＲＮＡ−蛋白質複合体に取り込まれ、配列特異的にｍＲＮＡを分解する。ＲＮＡ干渉は、哺乳動物（ヒト、マウス等）、線虫、植物、ショウジョウバエ、菌類などの広範な生物種間で保存されている現象であることが示されている。本発明の非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ＲＮＡ干渉におけるｓｉＲＮＡとして、または分解を受けるｍＲＮＡの一部として利用可能である。

リボヌクレオシド５’−三リン酸
本発明は、さらに以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ¹は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ²は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するリボヌクレオシド５’−三リン酸を提供する。

置換基などの式１の構造について、デオキシリボヌクレオチドについて上述した通りである。

本発明はさらにまた、以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ³は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁴は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するリボヌクレオシド５’−三リン酸を提供する。

置換基などの式２の構造について、デオキシリボヌクレオチドについて上述した通りである。

さらに、本発明は以下の式３：

［ここにおいて、
Ｒ⁵は、水素又は置換アミノ基であり、
Ｒ⁶は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
ＡはＮ又はＣＨである。］
で表される塩基を有する５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）デオキシリボヌクレオシド、を提供する。

Ｒ⁵の置換アミノ基は、メチル基、イソブチリル基、ベンゾイル基等で置換されたアミノ基を含む。

Ｒ⁶は、式1のＲ²と同様である。

式３に含まれる化合物の例として、実施例Ｉで化合物８を合成した。

式３の化合物は、例えば、複製及び転写におけるＤＮＡ鋳型の化学合成における原料として有用である。

さらにまた、以下の式４：

［ここにおいて、
Ｒ⁷は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ₁−Ｃ₃アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ₂−Ｃ₃アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ⁸は、ホルミル基又はニトロ基であり、
ただし、Ｒ⁷が水素又は１−プロピニル基で、Ｒ⁸がホルミル基の場合を除く。］
で表される塩基を有する５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）デオキシリボヌクレオシドを提供する。

Ｒ⁷は、式２のＲ³と同様である。

Ｒ⁸は、式２のＲ⁴と同様である。

式４の化合物は、例えば、複製及び転写におけるＤＮＡ鋳型の化学合成における原料として有用である。

図１ａ−ｃは、特異的複製および転写を可能とする非天然型塩基対システムについて示す。図１ａは、非天然型Ｄｓ−Ｐａ塩基対および天然型塩基対を示す。図１ａ−ｃは、特異的複製および転写を可能とする非天然型塩基対システムについて示す。図１ｂは、ＰＣＲおよびプライマー伸長のための基質としての非修飾５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）および修飾５’−γ−アミド三リン酸の構造を示す。図１ａ−ｃは、特異的複製および転写を可能とする非天然型塩基対システムについて示す。図１ｃは、ＰＣＲ増幅、プライマー伸長、ＤＮＡシーケンシング、およびＴ７転写において機能する非天然型塩基対システムを示す。図２ａ−ｅは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を使用した非天然型塩基対システムの１ヌクレオチド挿入およびプライマー伸長実験について示す。図２ａは、１ヌクレオチド挿入実験のための鋳型プライマー二本鎖の配列である。図２ａ−ｅは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を使用した非天然型塩基対システムの１ヌクレオチド挿入およびプライマー伸長実験について示す。図２ｂは、ＫＦｅｘｏ^-による各鋳型塩基に対する各非修飾基質（ｄＮ’ＴＰ）の導入効率を示す。図２ａ−ｅは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を使用した非天然型塩基対システムの１ヌクレオチド挿入およびプライマー伸長実験について示す。図２ｃは、ＫＦｅｘｏ^-による各鋳型塩基に対する各基質（非修飾基質ｄＮ’ＴＰ、Ｎ＝Ｐａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ、並びに修飾基質ｄＮ’ＴＰ_N、Ｎ＝ＤｓおよびＡ）の導入効率を示す。図２ａ−ｅは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を使用した非天然型塩基対システムの１ヌクレオチド挿入およびプライマー伸長実験について示す。図２ｄは、ｄＤｓＴＰまたはｄＤｓＴＰ_Nの存在または非存在において、ｄＰａＴＰおよび天然型基質とＤｓを含有する鋳型を用いて、ＫＦｅｘｏ⁺により５分間のプライマー伸長反応を行った結果を示す。図２ａ−ｅは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を使用した非天然型塩基対システムの１ヌクレオチド挿入およびプライマー伸長実験について示す。図２ｅは、ＫＦｅｘｏ^-またはｅｘｏ⁺による一連の基質（Ｄ_SN＝ｄＤｓＴＰ_NおよびＡ_N＝ｄＡＴＰ_N）を加えて、Ｐａを含む鋳型、あるいは、天然型の鋳型を用いた３分間のプライマー伸長。ｄＧＴＰが各反応に存在しないので、全長産物は主に３３−ｍｅｒになる。図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ａは、実験のスキームを示す。二本鎖ＤＮＡ断片（１５０−ｍｅｒ、ＤＮＡ１）を、ＤｓおよびＰａを含有する化学的に合成されたＤＮＡ断片（９１−ｍｅｒおよび８１−ｍｅｒ）を用いてプライマー伸長により調製した。図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ｂは、はじめのＤＮＡ断片（０サイクル）並びに５および１０サイクルの後のＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。ＤＮＡ１は、ＰＣＲをサイクル（９４℃、０．５分；４５℃、０．５分；６５℃、４分）で０．０４ユニット／μｌＶＥＮＴＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅された。天然型塩基のみを含有するＤＮＡｃｏｎｔ１は、ＰＣＲをサイクル（９４℃、０．５分；４５℃、０．５分；７２℃、１分）で０．０１ユニット／μｌＶＥＮＴＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅された。図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ｃ−ｉは、図３ａ及びｂに関して説明した要領に沿ってＰＣＲ及び配列決定を行った結果を示す。非天然型塩基対システムを用いた１０（ｄ、ｇ）、および１０＋１０（ｅ，ｈ）サイクルＰＣＲの後の、または天然型基質のみの１０サイクルＰＣＲ（ｆ）の後の、ＰＣＲ前のＤＮＡ１（ｃ、ｇ）およびＰＣＲ産物の、ｄＰａ’ＴＰの存在下（ｃ−ｆ）または非存在下（ｇ−ｉ）でのシーケンシング。

図３ｃは、ＰＣＲ前（０サイクル）のｄＰａ’ＴＰの存在下でのシーケンシングの結果である。４０番目の塩基は、鋳型のＤｓの相補的な位置に対応する塩基であり、シーケンシング反応ではこの位置にＰａ’が組み込まれる。よって、この部位のみＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれのピークも消失する。
図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ｃ−ｉは、図３ａ及びｂに関して説明した要領に沿ってＰＣＲ及び配列決定を行った結果を示す。図３ｄは、１０サイクルＰＣＲ後のｄＰａ’ＴＰの存在下でのシーケンシングの結果である。４０番目の塩基は、鋳型のＤｓの相補的な位置に対応する塩基であり、シーケンシング反応ではこの位置にＰａ’が組み込まれる。よって、この部位のみＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれのピークも消失する。図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ｃ−ｉは、図３ａ及びｂに関して説明した要領に沿ってＰＣＲ及び配列決定を行った結果を示す。図３ｅは、１０＋１０サイクルＰＣＲ後のｄＰａ’ＴＰの存在下でのシーケンシングの結果である。４０番目の塩基は、鋳型のＤｓの相補的な位置に対応する塩基であり、シーケンシング反応ではこの位置にＰａ’が組み込まれる。よって、この部位のみＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれのピークも消失する。図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ｃ−ｉは、図３ａ及びｂに関して説明した要領に沿ってＰＣＲ及び配列決定を行った結果を示す。図３ｆは、天然型基質のみでｓ及びＰａ基質が存在しない条件下でのＰＣＲ（１０サイクル）後のｄＰａ’ＴＰの存在下でのシーケンシングの結果である。４０番目の塩基に相当する、鋳型のＤＮＡ１中のＤｓ−Ｐａ塩基対は、完全にＡ−Ｔ塩基対に置き換わっている（４０番目の塩基Ｔ）。図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ｃ−ｉは、図３ａ及びｂに関して説明した要領に沿ってＰＣＲ及び配列決定を行った結果を示す。図３ｇは、ＰＣＲ前（０サイクル）のｄＰａ’ＴＰの非存在下でのシーケンシングの結果である。４０番目の塩基は、鋳型のＤｓの相補的な位置に対応する塩基であるが、Ｄｓと特異的な塩基対を形成する塩基が存在しないため、この位置以降のピークはほとんど消滅する。図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ｃ−ｉは、図３ａ及びｂに関して説明した要領に沿ってＰＣＲ及び配列決定を行った結果を示す。図３ｈは、１０サイクルＰＣＲ後のｄＰａ’ＴＰの非存在下でのシーケンシングの結果である。４０番目の塩基は、鋳型のＤｓの相補的な位置に対応する塩基であるが、Ｄｓと特異的な塩基対を形成する塩基が存在しないため、この位置以降のピークはほとんど消滅する。ただし、塩基の非特異的な取り込み（読み過し）も観察される。この読み過しのピークは、ＰＣＲ増幅要サイクル数の増加によりわずかに大きくなった。図３ａ−ｉは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅について示す。図３ｃ−ｉは、図３ａ及びｂに関して説明した要領に沿ってＰＣＲ及び配列決定を行った結果を示す。図３ｉは、１０＋１０サイクルＰＣＲ後のｄＰａ’ＴＰの非存在下でのシーケンシングの結果である。４０番目の塩基は、鋳型のＤｓの相補的な位置に対応する塩基であるが、Ｄｓと特異的な塩基対を形成する塩基が存在しないため、この位置以降のピークはほとんど消滅する。ただし、塩基の非特異的な取り込み（読み過し）も観察される。この読み過しのピークは、ＰＣＲ増幅要サイクル数の増加によりわずかに大きくなった。図４は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対により仲介されるＴ７転写について示す。図４ａ及び図４ｂは、実験のスキームである。図４は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対により仲介されるＴ７転写について示す。図４ａ及び図４ｂは、実験のスキームである。図４は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対により仲介されるＴ７転写について示す。図４ｃは、ＰａＴＰ、Ｐａ’ＴＰまたはＤｓＴＰの存在下（１ｍＭ）または非存在下における天然型ＮＴＰ（１ｍＭ）と鋳型（Ｎ＝Ｄｓ、Ｐａ、Ｐａ’、ＡまたはＣ）を用いた転写物のゲル電気泳動を示す。転写物を［γ−³²Ｐ］ＧＴＰで標識した。各転写物の収率を、天然型塩基からなる鋳型（Ｎ＝ＡまたはＣ）からの天然型転写物との比較により決定した。それぞれの転写効率（収率）は、３つのデータセットから平均化された。図４は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対により仲介されるＴ７転写について示す。図４ｄ及び図４ｅは、転写物（１７−ｍｅｒ）のヌクレアーゼ消化から得られた標識リボヌクレオチド３’− 一リン酸の２Ｄ−ＴＬＣ解析の結果を示す。図４は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対により仲介されるＴ７転写について示す。図４ｄ及び図４ｅは、転写物（１７−ｍｅｒ）のヌクレアーゼ消化から得られた標識リボヌクレオチド３’− 一リン酸の２Ｄ−ＴＬＣ解析の結果を示す。図５は、非天然型アンチコドンを含有するｔＲＮＡ分子の特異的Ｔ７転写について示す。図５ａは、Ｐａ’ＴＰ（３ｍＭ）またはＤｓＴＰ（２ｍＭ）の存在下における、天然型ＮＴＰ（２または３ｍＭ）の鋳型（ＤＮＡ１１−１４およびＤＮＡｃｏｎｔ４）を用いたｔＲＮＡ転写物のゲル電気泳動の結果を示す。転写物を、内部に［α−³²Ｐ］ＧＴＰで標識した。各転写物の収率は、ＤＮＡｃｏｎｔ４からのサプレッサーｔＲＮＡ_CUA転写物との比較により決定した。それぞれの転写効率（収率）は、３つのデータセットから平均化された。図５は、非天然型アンチコドンを含有するｔＲＮＡ分子の特異的Ｔ７転写について示す。図５ｂ及び図５ｃは、ｔＲＮＡ_CPa'AおよびｔＲＮＡ_CUDsの転写物のヌクレアーゼ消化から得られた標識リボヌクレオシド３’− 一リン酸の２Ｄ−ＴＬＣ解析の結果を示す。図５は、非天然型アンチコドンを含有するｔＲＮＡ分子の特異的Ｔ７転写について示す。図５ｂ及び図５ｃは、ｔＲＮＡ_CPa'AおよびｔＲＮＡ_CUDsの転写物のヌクレアーゼ消化から得られた標識リボヌクレオシド３’− 一リン酸の２Ｄ−ＴＬＣ解析の結果を示す。図５は、非天然型アンチコドンを含有するｔＲＮＡ分子の特異的Ｔ７転写について示す。図５ｄは、大腸菌無細胞システム（ＲＴＳ−１００、Ｒｏｃｈｅ）におけるｔＲＮＡ転写物のアミノアシル化について示す。［α−³²Ｐ］ＧＴＰで内部標識されたｔＲＮＡ転写物を、無細胞システム中で３０℃で３０分のインキュベーションし、アミノアシル化されたｔＲＮＡを０．２ＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ４．７５）および３ｍＭＥＤＴＡを含有する１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して解析した。図６は、ＰＣＲ、シーケンシングおよび転写の実験のためのＤＮＡ断片の配列を示す。図７は、化学合成されたＤＮＡ断片の配列を示す。図７は、化学合成されたＤＮＡ断片の配列を示す。図８は、０−１０％のＤＮＡｃｏｎｔ１を含有するＤＮＡ１の、ｄＰａ’ＴＰ非存在下での色素ターミネーターシーケンシングを示す。このピークパターンとＤｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片ＰＣＲのピークパターンを比較することによりＤｓ−Ｐａ塩基対のＰＣＲにおける忠誠度を調べることができる。図９は、３００ｍＭのｄＤＳＴＰ_N、ｄＰａＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰとＤＮＡ１からのＰＣＲ産物のダイターミネーターシーケンシングを示す。ＤＮＡ１の１０サイクル（ｂ、ｅ）または１０＋１０サイクル（ｃ，ｆ）の後の、はじめのＤＮＡ１（ａ、ｄ）およびＰＣＲ産物の、ｄＰａ’ＴＰの存在下（ａ−ｃ）または非存在下（ｄ−ｆ）におけるシーケンシング。ｄＡＴＰ_Nの代わりに、ｄＡＴＰを使用してＰＣＲを行うと、忠実度は有意に減少した（ｅ，ｆ）。図１０は、³²Ｐ−標識５’− 若しくは３’−プライマーを用いたＰＣＲ産物のオートラジオグラフを示す。 ³²Ｐ−標識５’−及び非標識３’−プライマー、又は³²Ｐ−標識３’−及び非標識５’−プライマーを用いてＤＮＡ１（ａ）又はＤＮＡｃｏｎｔ１（ｂ）を含むＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼのための緩衝溶液（１００μｌ）中でＰＣＲを行った。１、３、５、１０及び１５回のＰＣＲサイクルの後の各反応溶液から、その一部（１０μｌ）を１０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル上で分析した。バイオイメージングアナライザーを用いて、ゲル上の産物を分析し、定量した。各サイクルあたりの効率（Ｙ）を、以下の一般曲線フィットを用いたカレイダグラフによって計算した。Ｎ_f＝Ｎ₀×（１＋Ｙ）ⁿ［ここで、ｎは、ＰＣＲサイクルの数（ｎ＝１、３、５及び１０）であり、Ｎ₀は、最初のコピー数であり、そして、Ｎ_fは、ｎサイクル後の産物のコピー数である。］Ｎｆは、以下の式から決定した。Ｎ_f＝Ｎ₀＋Ｐ₀×（Ｉ_full／Ｉ_total）［ここで、Ｐ₀は、³²Ｐ−標識プライマーの数であり、Ｉ_fullは、全長産物に相当するバンドのカウントであり、そしてＩ_totalは、レーン中のバンドの総カウントである。］決定されたＹ値を以下の表に示す。

図１１は、Ｄｓ及びＰａを含有する化学的に合成された断片の異なる試料（ａ−ｄ）から調製されたＤＮＡ２及び４断片のＰＣＲ産物の、ｄＰａ’ＴＰ非存在下でのダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。この結果から、化学合成したＤｓ−Ｐａ塩基対を含むＤＮＡ断片の純度が、ＰＣＲ後のピークパターンに影響していることがわかる。すなわち、先に求めたＰＣＲにおけるＤｓ−Ｐａ塩基対の忠誠度（９９．８％）は、化学合成したＤＮＡ断片の純度に依存しているので、その忠誠度は９９．８％よりもさらに高いと考えられる。図１２は、ＤＮＡ１、ＤＮＡ３−１０及びＤＮＡｃｏｎｔ１からのＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動により決定された、増幅効率について示す。ＰＣＲ産物を、４％アガロースゲル上で検出し、エチジウムブロマイドによって染色した。そして、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸＰｒｏシステム及びＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて染色されたバンドの強度を定量した。以下の式を用いて増幅効率を決定した。（ＰＣＲ産物の強度）／（ＰＣＲのためのインプットＤＮＡの強度）効率は、３−４データシートから平均化した。標準偏差は括弧書きで示してある。図１３は、プライマー２を用いた場合のＤＮＡ２からのＰＣＲ産物の、ダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。図１４は、プライマー２を用いた場合のＤＮＡ３からのＰＣＲ産物の、ダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。図１５は、プライマー２を用いた場合のＤＮＡ４からのＰＣＲ産物の、ダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。図１６は、プライマー１を用いた場合のＤＮＡ５からのＰＣＲ産物の、ダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。図１７は、プライマー１を用いた場合のＤＮＡ６からのＰＣＲ産物の、ダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。図１８は、プライマー２を用いた場合のＤＮＡ７からのＰＣＲ産物の、ダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。図１９は、プライマー２を用いた場合のＤＮＡ８からのＰＣＲ産物の、ダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。図２０は、プライマー２を用いた場合のＤＮＡ９からのＰＣＲ産物の、ダイターミネーターシーケンシングの結果を示す。図２１は、大腸菌由来の無細胞翻訳システムにおける非天然型アンチコドンを含有するｔＲＮＡのアミノアシル化のスキームを示す図２２は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンのヌクレオシド誘導体のための合成スキームを示す。試薬及び略語（ａ）ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、２−（トリブチルスタニル）チオフェン、ＤＭＦ；（ｂ）パラジウム炭素、ホウ化水素ナトリウム、エタノール、酢酸エチル；（ｃ）ギ酸；（ｄ）ＮａＨ、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ₃ＣＮ；（ｅ）ＮＨ₃、メタノール；（ｆ）及び（ｌ）４，４’−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン；（ｇ）２−シアノエチルテトライソプロピルホスホルジアミダイト、テトラゾール、ＣＨ₃ＣＮ；（ｈ）及び（ｍ）無水酢酸、ピリジン、次いでジクロロ酢酸、ジクロロメタン；（ｉ）及び（ｎ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２，−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸、ＤＭＦ、次いでＩ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ（５’−三リン酸の場合）、Ｉ₂／ピリジン、ＮＨ₄ＯＨ（５’−γ−アミド三リン酸の場合）；（ｊ）テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース、クロロ酢酸；（ｋ）アンモニア飽和メタノール。Ｔｏｌ：トルオイル、ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル、Ａｃ：アセチル図２３は、ピロール−２−カルボアルデヒド、４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシド誘導体、及び６−アミノ−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン５’−γ−アミド三リン酸の合成スキームを示す。試薬及び略語（ａ）ＮａＨ、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ₃ＣＮ；（ｂ）アンモニア飽和メタノール；（ｃ）４，４’−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン；（ｄ）２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノクロロホスホルアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン、ＴＨＦ；（ｅ）プロトンスポンジ、ＰＯＣｌ₃、トリメチルリン酸、次いで、トリブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸、ＤＭＦ；（ｆ）ＮａＨ、ＣＨ₃ＣＮ、次いで、２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシルクロリド；（ｇ）ＢＢｒ₃、ジクロロメタン；（ｈ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸、ＤＭＦ、次いで、Ｉ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ（５’−γ−アミド三リン酸の場合）；Ｔｏｌ：トルオイル、ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル、Ａｃ：アセチル図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ａは、化合物６及び１１の¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＯＳＯ−ｄ₆）スペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｂは、化合物６及び１１の¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＯＳＯ−ｄ₆）スペクトル（７．０−９．０ｐｐｍ）である。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｃは、化合物６の１ＤＮＯＥスペクトル（ＤＭＯＳＯ−ｄ₆中）である。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｄは、化合物１１の１ＤＮＯＥスペクトル（ＤＭＯＳＯ−ｄ₆中）である。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｅは、化合物６の¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＯＳＯ−ｄ₆）スペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｆは、化合物６の２ＤＣＯＳＹスペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｇは、化合物６の２ＤＮＯＥＳＹスペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｈは、化合物６の２ＤＨＳＱＣスペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｉは、化合物６の２ＤＨＭＢＣスペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｊは、化合物６の２ＤＨＭＢＣスペクトル（拡大）である。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｋは、化合物１１の¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＯＳＯ−ｄ₆）スペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｌは、化合物１１の２ＤＣＯＳＹスペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｍは、化合物１１の２ＤＮＯＥＳＹスペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｎは、化合物１１の２ＤＨＳＱＣスペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｏは、化合物１１の２ＤＨＭＢＣスペクトルである。図２４は、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）のヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２４ｐは、化合物１１の２ＤＨＭＢＣスペクトル（拡大）である。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ａは、化合物１７の¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＯＳＯ−ｄ₆）スペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｂは、化合物１７の¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＯＳＯ−ｄ₆）スペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｃは、化合物１７の２ＤＣＯＳＹスペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｄは、化合物１７の２ＤＨＳＱＣスペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｅは、化合物１７の２ＤＨＭＢＣスペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｆは、化合物１７の２ＤＮＯＥＳＹスペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｇは、化合物１８の¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＯＳＯ−ｄ₆）スペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｈは、化合物１８の¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＯＳＯ−ｄ₆）スペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｉは、化合物１８の２ＤＣＯＳＹスペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｊは、化合物１８の２ＤＮＯＥＳＹスペクトルスペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｋは、化合物１８の２ＤＨＳＱＣスペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｌは、化合物１８の２ＤＨＭＢＣスペクトルである。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｍは、化合物１７の１ＤＮＯＥスペクトル（ＤＭＯＳＯ−ｄ₆中）である。図２５は、ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシドのＮＭＲスペクトルを示す。図２５ｎは、化合物１８の１ＤＮＯＥスペクトル（ＤＭＯＳＯ−ｄ₆中）である。図２６は、デオキシアデノシン５’−γ−アミド三リン酸のＤＥＡＥセファデックスイオン交換カラム溶出パターンを示す。白丸は２６０ｎｍの結果、黒丸は２８０ｎｍの結果である。図２７は、デオキシアデノシン５’−γ−アミド三リン酸のＥＳＩ−マススペクトルである。図２８ａは、デオキシアデノシン５’−γ−アミド三リン酸の¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルである。図２８ｂは、デオキシアデノシン５’−γ−アミド三リン酸の¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルである。図２９ａは、７−（２−チエニル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン５’−γ−アミド三リン酸（上段）と５’−三リン酸（下段）の¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルを示す。図２９ｂは、７−（２−チエニル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン５’−γ−アミド三リン酸（上段）と５’−三リン酸（下段）の¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルを示す。図３０ａは、７−（２−チエニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン５’−三リン酸（化合物１４）の¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルを示す。図３０ｂは、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（化合物１９）の¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルを示す。図３０ｃは、４−プロピニル−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（化合物２０）の¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルを示す。図３１ａは、７−（２−チエニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン５’−三リン酸（化合物１４）の³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルを示す。図３１ｂは、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（化合物１９）の³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルを示す。図３１ｃは、４−プロピニル−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（化合物２０）の³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルを示す。図３２は、Ｃ₃₅Ｈ₄₀Ｏ₁₇Ｐ₂Ｓのエレクトロスプレーイオン化マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）の結果を示す。Ｃ₃₅Ｈ₄₀Ｏ₁₇Ｐ₂Ｓ：計算値：９２４．１７（１−）；４６１．５８（２−）測定値：９２４．０２（１−）；４６１．７０（２−）図３３は、７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンのヌクレオシド誘導体のための合成スキームを示す。試薬及び略語（ａ）ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、２−（トリブチルスタニル）チアゾール、ＤＭＦ；（ｂ）パラジウム炭素、ホウ化水素ナトリウム、エタノール、酢酸エチル；（ｃ）ギ酸；（ｄ）ＮａＨ、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ₃ＣＮ；（ｅ）アンモニア飽和メタノール；（ｆ）４，４’−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン；（ｇ）２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン，ＴＨＦ；（ｈ）無水酢酸、ピリジン、次いでジクロロ酢酸、ジクロロメタン；（ｉ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２，−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸、Ｉ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ。Ｔｏｌ：トルオイル、ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル、Ａｃ：アセチル図３４は、２−ニトロピロール（化合物１）のヌクレオシド誘導体の合成スキームを示す。試薬及び略語（ａ）ＮａＨ、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ₃ＣＮ；（ｂ）アンモニア飽和メタノール；（ｃ）４，４’−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン；（ｄ）２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノクロロホスホルアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン、ＴＨＦ；（ｅ）無水酢酸、ピリジン、次いで、ジクロロ酢酸、ジクロロメタン；（ｆ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸、Ｉ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ。Ｔｏｌ：トルオイル、ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル、Ａｃ：アセチル図３５は、４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ＤＤｓ）及び４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ＤＤｖ）のヌクレオシド誘導体のための合成スキームを示す。試薬及び略語（ａ）ｍＣＰＢＡ、ＥｔＯＡｃ、次いで、メタンスルホニルクロリド、ＤＭＦ；（ｂ）ＮａＩ、ＣＨ₃ＣＯＣｌ、ＣＨ₃ＣＮ；（ｃ）ＮａＨ、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ₃ＣＮ；（ｄ）ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、２−（トリブチルスタニル）チオフェン又は２−（トリブチルスタニル）チアゾール、ＤＭＦ；（ｅ）アンモニア飽和メタノール；（ｆ）４，４’−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン；（ｇ）２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン，ＴＨＦ；（ｈ）無水酢酸、ピリジン、次いでジクロロ酢酸、ジクロロメタン；（ｉ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２，−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸、Ｉ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ。Ｔｏｌ：トルオイル、ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル、Ａｃ：アセチル図３６は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ビオチンアミド−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２８）のための合成スキームを示す。試薬および略語（ａ）ＮａＨ、ＣＨ₃ＣＮ、次いで２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシルクロリド；（ｂ）ＢＢｒ₃、ジクロロメタン；（ｃ）３−（ジクロロアセトアミド）−１−プロピン、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、ＣｕＩ、トリエチルアミン、ＤＭＦ；（ｄ）４，４’−ジメチルトリチルクロリド、ピリジン；（ｅ）無水酢酸、ピリジン、次いで、ジクロロ酢酸、ジクロロメタン；（ｆ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェート、ＤＭＦ、次いで、Ｉ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ；（ｇ）ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＤＭＦ、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）、次いでＮＨ₄ＯＨ。ＤＭＴｒ：４，４’−ジメトキシトリチル、Ａｃ：アセチル。図３７は、４−ヨードピロール−２−カルバルデヒドのリボヌクレオシドの¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）スペクトルを示す。図３８は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２４）のＮＭＲスペクトルを示す。図３８ａは、化合物２４の¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）スペクトルである。図３８は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２４）のＮＭＲスペクトルを示す。図３８ｂは、化合物２４の¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）スペクトルである。図３８は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２４）のＮＭＲスペクトルを示す。図３８ｃは、化合物２４の２ＤＣＯＳＹスペクトルである。図３８は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２４）のＮＭＲスペクトルを示す。図３８ｄは、化合物２４の２ＤＮＯＥＳＹスペクトルである。図３８は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２４）のＮＭＲスペクトルを示す。図３８ｅは、化合物２４の２ＤＨＭＱＣスペクトルである。図３８は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２４）のＮＭＲスペクトルを示す。図３８ｆは、化合物２４の２ＤＨＭＢＣスペクトルである。図３８は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２４）のＮＭＲスペクトルを示す。図３８ｇは、化合物２４の２ＤＨＭＢＣスペクトル（拡大）である。図３９は、１−［５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２５）の¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）スペクトルを示す。図４０は、１−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２６）の¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）スペクトルを示す。図４１は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−アミノ−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２７）および１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ビオチンアミド−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２８）のＤＥＡＥセファデックスイオン交換カラムによる溶出パターンを示す。図４２は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−アミノ−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２７：上のスペクトル）および１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ビオチンアミド−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２８：下のスペクトル）のＥＳＩマススペクトルを示す。図４３は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ビオチンアミド−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２８）のＮＭＲスペクトルを示す。図４３ａは、化合物２８の¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルである。図４３は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ビオチンアミド−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２８）のＮＭＲスペクトルを示す。図４３ｂは、化合物２８の２ＤＣＯＳＹスペクトルである。図４３は、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ビオチンアミド−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２８）のＮＭＲスペクトルを示す。図４３ｃは、化合物２８の³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）スペクトルである。図４４ａは、ビオチン化されたＰａＴＰ（Ｂｉｏ−ＰａＴＰ：化合物２８）の化学構造を示す。図４４ｂは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を用いたＴ７転写によるＲＮＡ分子の部位特異的ビオチン化についての、転写および転写物解析の実験スキームを示す。図４４ｃは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を用いたＴ７転写によるＲＮＡ分子の部位特異的ビオチン化実験で得られた転写物のゲル電気泳動の写真である。レーン１−４はライゲーションにより得られた鋳型、レーン５−１２はＰＣＲ増幅された鋳型を用いた場合の結果である。鋳型としては、ＤＮＡ６（レーン１、２、５、６、９、１０）および対照としてＤＮＡｃｏｎｔ２（レーン３、４、７、８、１１、１２）を用い、Ｂｉｏ−ＰａＴＰの存在下（２ｍＭ）または非存在下で、天然型ＮＴＰｓ（２ｍＭ）ととも転写反応を行った。転写物は［γ−³²Ｐ］ＧＴＰで標識した。図４４ｄは、ビオチン化転写物の分析のためのゲルシフトアッセイの結果を示す写真である。ライゲーションにより得られた鋳型であるＤＮＡ６およびＰＣＲ増幅（２０サイクル）された鋳型であるＤＮＡｃｏｎｔ２から、Ｂｉｏ−ＰａＴＰを用いて転写された１５２−ｍｅｒＲＮＡ、ならびに、ライゲーションにより得られた鋳型であるＤＮＡｃｏｎｔ５およびＤＮＡｃｏｎｔ６から、ビオチン化されたＵＴＰ（Ｂｉｏ−ＵＴＰ）を用いて転写された、１５２−ｍｅｒＲＮＡをストレプトアビジンと混合した。ビオチン化ＲＮＡ−ストレプトアビジン複合体とＲＮＡ単体は、７％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル上で分離され、そして複合体の割合（収率）をバンドの強度から決定した。図４４ｅは、Ｂｉｏ−ＰａまたはＡを５９位に含む１５２−ｍｅｒ転写物の配列解析の結果を示す写真である。５’末端を³²Ｐで標識された転写物を、ＲＮａｓｅＴ１（Ｔ１）またはアルカリ（ＡＬ）で部分消化した。アルカリ部分消化した転写物の一部をストレプトアビジン磁気ビーズで処理して、Ｂｉｏ−Ｐａを含むＲＮＡ断片（ＡＬ＋ＳＡ）を捕捉し、その残りを電気泳動した。それぞれの消化した断片は１０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル上で分析した。図４５は、２−ニトロピロールの４位修飾ヌクレオシド誘導体の合成スキームを示す。試薬及び略語（ａ）Ｎ−ヨードスクシンイミド、ＣＨ₃ＣＮ；（ｂ）プロピニル−１−トリブチルチン、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₂Ｃｌ₂、ＤＭＦ又はＮ−（２−プロピニル）−ジクロロアセトアミド、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄、ＣｕＩ、トリエチルアミン、ＤＭＦ；（ｃ）４，４’−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン；（ｄ）２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホルアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン、ＴＨＦ；（ｅ）無水酢酸、ピリジン、次いでジクロロ酢酸、ジクロロメタン；（ｆ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸、Ｉ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ。ＤＭＴｒ：４，４’−ジメトキシトリチル、Ａｃ：アセチル。図４６は、ＮＨ₂−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ、ＲＯＸ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ及びＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰの合成スキームを示す。試薬及び略語（ａ）ＣｕＩ，Ｐｄ［Ｐ（Ｃ₆Ｈ₅）₃］₄、ＤＭＦ、トリエチルアミン、室温、次いで、Ｎ−（２−プロピニル）−６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド；（ｂ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、室温；（ｃ）無水酢酸、ピリジン、室温、次いで、ジクロロ酢酸、ジクロロメタン、０℃；（ｄ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン／ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸、ＤＭＦ、次いで、Ｉ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ、室温；（ｅ）Ｒ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｒ＝ＦＡＭ又はＲＯＸ）／ＤＭＦ，０．１ＭＮａＨＣＯ₃−Ｎａ₂ＣＯ₃緩衝液（ｐＨ８．５）、室温、８時間、次いで、ＮＨ₄ＯＨ。図４７は、ＮＨ２−ｈｘ−ＰａＴＰ、ＦＡＭ−ｈｘ−ＰａＴＰ及びＴＡＭＲＡ−ｈｘ−ＰａＴＰの合成スキームを示す。試薬及び略語（ａ）ＣｕＩ，Ｐｄ［Ｐ（Ｃ₆Ｈ₅）₃］₄、ＤＭＦ、トリエチルアミン、室温、次いで、Ｎ−（２−プロピニル）−６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド；（ｂ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、室温；（ｃ）無水酢酸、ピリジン、室温、次いで、ジクロロ酢酸、ジクロロメタン、０℃；（ｄ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン／ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸、ＤＭＦ、次いで、Ｉ₂／ピリジン、水、ＮＨ₄ＯＨ、室温；（ｅ）Ｒ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｒ＝ＦＡＭ又はＴＡＭＲＡ）／ＤＭＦ，０．１ＭＮａＨＣＯ₃−Ｎａ₂ＣＯ₃緩衝液（ｐＨ８．５）、室温、８時間、次いで、ＮＨ₄ＯＨ。図４８は、クレノウフラグメントを用いた複製による、アミノ基や蛍光色素を結合した基質ＰｎのＤＮＡ（５５−ｍｅｒ）中への導入のスキーム及びその結果を示す。図４９は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写による、蛍光色素を結合した基質ＰａのＲＮＡ（１７−ｍｅｒ）中への導入のスキーム及びその結果を示す。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例Ｉ化学合成−１
１．一般的な方法及び材料
試薬及び溶媒は、標準的な供給業者より購入し、さらなる精製なく使用した。２次元薄層クロマトグラフィー（２ＤＴＬＣ）は、２５４ｎｍ蛍光指示薬（Ｍｅｒｃｋ）を含む０．２５ｍｍシリカゲル６０プレートを用いて、転写反応をモニターした。¹ＨＮＭＲ、¹³ＣＮＭＲ及び³¹ＰＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬＥＸ２７０及びＢＲＵＫＥＲ核磁気共鳴スペクトロメーター（300ＭＨｚ及び600ＭＨｚ）上に記録した。分取用Ｃ18カラム（ＷａｔｅｒｓＭｉｃｒｏｂｏｎｄＳｐｈｅｒｅ、１５０×１９ｍｍ）を備えたＧｉｌｓｏｎＨＰＬＣシステム上で、ヌクレオシド精製を行った。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５カラム（３００×１５ｍｍ）及び分析用Ｃ１８カラム（ＳｙｎｃｈｒｏｐａｋＲＰＰ、２５０×４．６ｍｍ、ＥｉｃｈｒｏｍＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、三リン酸誘導体を精製した。

高分解能マススペクトル（ＨＲＭＳ）及びエレクトロスプレーイオン化マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）を、各々Ｗａｔｅｒｓ２６９０ＬＣシステムを備えたＪＥＯＬＨＸ−１１０若しくはＪＭ７００マススペクトロメーター及びＷａｔｅｒｓマイクロマスＺＭＤ４０００上に記録した。蛍光測定は、ＦＰ−６５００スペクトル蛍光計（ＪＡＳＣＯ）で行った。

ピロール−２−カルボアルデヒド（非特許文献３９）及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒド（非特許文献４０）は、先行文献に記載されたように合成した。

２．化合物の合成の説明
７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成は、図２２に記載の反応によって行った。具体的には、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物４）は、２−アミノ−３−ニトロ−４−クロロピリジン（化合物１）（非特許文献４１）から３工程で合成した（７２％）。７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンのデオキシリボヌクレオシド（化合物６）は、１−クロロ−２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノース（非特許文献４２）と化合物４のナトリウム塩との反応、続く、メタノールアンモニウムを用いた化合物５からの、トルオイル基の脱保護によって、化合物４から単一産物として収率６１％で得られた。

７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンのリボヌクレオシド（化合物１１）は、２００℃で、触媒量のクロロ酢酸を用いて、テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノースと４の反応によって合成された。化合物１１は、アンモニア飽和メタノールによる脱保護及びＲＰ−ＨＰＬＣによる精製の後、収率２９％で得られた。

ＮＭＲ及び高分解能マススペクトロスコピーによって、ヌクレオシド６及び１１の構造を確認した（１．「一般的な方法及び材料」の項目における化合物６及び１１のＮＭＲスペクトル）。化合物６と化合物１１の芳香族プロトンピークは、同じ化学シフトを示した。また、化合物６と化合物１１のＨＭＢＣ及びＨＳＱＣは、糖Ｃ１’と、イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン塩基部分のＮ−３位との間でＮ−グリコシド結合が形成されていることを示した。さらに、本発明者らは、２ＤＮＯＥＳＹ及び２ＤＨＭＢＣスペクトルによって、化合物６及び１１のチエニル部分は、イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン環の７位において結合していることを確認した。化合物６及び１１のアノマー構造は、２ＤＮＯＥＳＹ及び１ＤＮＯＥによってβ体であることが確認された。１ＤＮＯＥ実験の主要な結果は、Ｈ１’プロトンの照射は、化合物６及び１１において各々、Ｈ４’シグナルの２％及び３％増強、そして、Ｈ２シグナルの８％及び９％増強を与える、ということである。差次的ＮＯＥ実験において、Ｈ２プロトンを照射した場合、Ｈ１’シグナルの９％及び１０％増強、Ｈ２’及びＨ３’シグナルの３−５％増強が得られた。よって、ＮＯＥ実験に基づいて、化合物６及び１１のアノマー構造は、β構造と定められた。化合物６は、定法によってアミダイトに変換され、そして、Ｔｐ（６）ｐＴの三量体は、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＥＳＩ−ＭＳ）でその生成を確認した。「ピロール−２−カルボアルデヒド、４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒドのヌクレオシド誘導体、及び６−アミノ−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン５’−γ−アミド三リン酸」における三量体のマススペクトルを参照）。化合物１０及び１４のヌクレオシド５’−三リン酸は、酵素反応の基質として、定法（非特許文献４３）で合成した。

ピロール−２−カルボアルデヒド（化合物１５）及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒド（化合物１６）のヌクレオシド誘導体の合成は、図２３に記載された反応によって達成された。化合物１５及び１６のデオキシヌクレオシド誘導体の合成は、報告されている（非特許文献３９及び４０）。化合物１５及び１６のリボヌクレオシドは、２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシルクロリド（非特許文献４４）と化合物１５又は１６のナトリウム塩との反応、続く、ＢＢｒ₃での処理によるベンジル基の脱保護によって合成された。これにより、２工程で各々化合物１７（収率１５％）及び化合物１８（収率７％）のリボヌクレオシドが得られた。

ＮＭＲ（図２５における化合物１７及び１８のＮＭＲスペクトルを参照）及び高分解能マススペクトロスコピーによって化合物１７及び１８の構造を確認した。化合物１７及び１８のＨＭＢＣ及びＨＳＱＣスペクトルは、Ｃ１’炭素において、糖とピロール塩基部分の間でＮ−グリコシド結合が形成されていることを示した。化合物１７及び１８のアノマー構造は、ＮＯＥ実験（差次的ＮＯＥ及びＮＯＥＳＹスペクトル）によって確認された。

差次的ＮＯＥＳＹスペクトル実験の主要な結果は以下の通りである。Ｈ１’プロトンの照射は、Ｈ４’シグナルの３−４％増強を与えた。Ｈ２’（及び／又はＨ３’）プロトンが照射された場合は、Ｈ５シグナルの９−１０％増強が得られた。化合物１７及び１８のＮＯＥＳＹスペクトルは、Ｈ１’とＨ４’の間、Ｈ１’とＣＨＯプロトンの間、並びにＨ５とＨ２’（及び／又はＨ３’）の間に、クロスピークを示した。従って、化合物１７及び１８のアノマー構造は、ＮＯＥＮＭＲに基づいて、β構造と定められた。化合物１７及び１８のリボヌクレオシドは、定法（非特許文献４５）によって、リボヌクレオシド５’−三リン酸に変換された。

ヌクレオシド５’−三リン酸は、先行技術文献（非特許文献４３及び４５）に開示の方法に従って合成した。５’−γ−アミド三リン酸の合成は、定法（非特許文献４３）を変更して行った。化合物９及び２１の保護されたヌクレオシドを。２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オンによって、亜リン酸化した。保護されたヌクレオシド亜リン酸誘導体を、ピロリン酸での処理によって、Ｐ²，Ｐ³−ジオキソ−Ｐ¹−５’−ヌクレオシジルシクロ三リン酸に変換させた。ヨウ素／水での処理の後、得られた５’−トリメタリン酸を濃アンモニア水で処理し、ヌクレオシド５’−γ−アミド三リン酸を与えた。

５’−γ−アミド三リン酸の精製は、陰イオン交換ＤＥＡＥセファデックスカラムクロマトグラフィー及びＲＰ−ＨＰＬＣによって行われた。デオキシアデノシン５’−γ−アミド三リン酸のＤＥＡＥカラム溶出パターン及びエレクトロスプレーイオン化マススペクトルは、（図２６及び２７）に示した。

５’−γ−アミド三リン酸の合成において、デオキシアデノシンの５’−三リン酸も形成され、そして、画分の吸光度の計算値から、５’−γ−アミド三リン酸と５’−三リン酸との割合は、４．８：１であった。化合物２２は、デオキシアデノシンの５’−リン酸（ｄＡＴＰ）と比較して速く溶出され、ＤＥＡＥカラム精製によって分離された。５’−γ−アミド三リン酸の分子量を、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルによって確認した。化合物２２とｄＡＴＰの差は、１ｍ／ｚであった。ＨＰＬＣによる最終精製後、ヌクレオシド５’−γ−アミド三リン酸をトリエチルアンモニウム塩として得た。そしてＮＭＲスペクトルスコピー（¹Ｈ及び³¹ＰＮＭＲ）によってその構造を確認した。デオキシアデノシン５’−γ−アミド三リン酸及び化合物６のγ−リン酸シグナルは、化合物６，１１、１７及び１８の５’−リン酸のそれと比較して、低磁場シフトした（−０．５０及び−０．５２ｐ．ｐ．ｍ）。この現象は、グアノシンの５’−γ−アミド三リン酸でも観察された。

３．合成の具体的な説明
（１）２−アミノ−３−ニトロ−４−（２−チエニル）ピリジン（化合物２）
ＤＭＦ（５０ｍｌ）中の２−アミノ−３−ニトロ−４−クロロピリジン（化合物１）（非特許文献４１）（１．７４ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（３５０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下で２−（トリブチルスタニルチオフェン（３．８２ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を１００℃で４時間攪拌した。混合物を水（２５０ｍｌ）に注ぎ、そして、酢酸エチル（２５０ｍｌ×３）で抽出した。Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を、塩化メチレン：酢酸エチル（１００：１から４９：１）を溶出剤として用いるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーに装填した。２．０７ｇの化合物２（塩化メチレン：酢酸エチル＝１９：１上でＲｆ０．３０）が９３％の収率で得られた。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ
８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），
７．４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０及び１．１Ｈｚ），
７．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６及び１．１Ｈｚ），
７．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０及び３．６Ｈｚ），
６．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），５．６６（ｂｓ，２Ｈ）。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ、マトリックス）
Ｃ₉Ｈ₈Ｎ₃Ｏ₂Ｓ（Ｍ＋１）：計算値２２２．０３３７；観測値２２２．０３３７。

（２）２，３−ジアミノ−４−（２−チエニル）ピリジン（化合物３）
１３０ｍｌエタノールと６５ｍｌの酢酸エチル中の、化合物２（２．０６ｇ、９．３ｍｍｏｌ）と４６６ｍｇパラジウム炭素（１０重量％）との混合物に、２８ｍｌの１Ｍホウ化水素ナトリウム水溶液を０℃で加えた。得られた混合物を０℃で１時間攪拌した。混合物に４３ｍｌの５％塩化アンモニウム水溶液を加えた。混合物を、セライトで濾過した。濾過物に５００ｍｌの水を加えた。エタノール及び酢酸エチルを蒸発させた後、混合物を酢酸エチルで抽出した（２５０ｍｌ×３）。Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた後、溶媒を留去した。残渣を、塩化メチレン：酢酸エチル（１９：１から９３：７）を溶出溶媒にしてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。１．４６ｇの化合物３（塩化メチレン：酢酸エチル＝９：１上でＲｆ０．２４）が８２％の収率で得られた。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ
７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），
７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１及び１．１Ｈｚ），
７．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５及び１．１Ｈｚ），
７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１及び３．５Ｈｚ），
６．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），
４．２６（ｂｓ，２Ｈ），３．７２（ｂｓ，２Ｈ）。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₉Ｈ₁₀Ｎ₃Ｓ（Ｍ＋１）：計算値１９２．０５９５；観測値１９２．０５８８。

（３）７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物４）
化合物３（９５６ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）のギ酸溶液（１５ｍｌ）を、１２時間、環流した。反応混合物中に、氷冷浴上で、２４ｍｌの２８％ＮＨ₄ＯＨを加えた。得られた沈殿物を濾過し、Ｈ₂Ｏ及びエチルエーテルで洗浄し、そして６０℃で１２時間乾燥させて７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（９７０ｍｇ、９６％）を得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
１３．２０（ｓ，１Ｈ），８．４８（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｍ，２Ｈ），
７．７８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０及び５．１Ｈｚ），
７．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），
７．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８及び４．９Ｈｚ）。

¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
１１３．１２，１２８．００，１２８．７１，１２９．２４，
１３０．００，１３１．１６，１３７．６０，１４３．４４，
１４４．０９，１４８．６６。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₁₀Ｈ₈Ｎ₃Ｓ（Ｍ＋１）：計算値２０２．０４３９；観測値２０２．０４４４。

（４）７−（２−チエニル）−３−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物５）
化合物４（４０３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のＣＨ₃ＣＮ溶液（３２ｍｌ）に、ＮａＨ（９６ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、鉱油中６０％分散液）を加えた。得られた混合物を室温で
１時間攪拌した。混合物に、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド（９３３ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）（非特許文献４２）を加えた。室温下で２．５時間攪拌した後、反応混合物を酢酸エチルと水によって分離した。有機層を飽和食塩水で３回洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた後、減圧下で留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂中、０．５％メタノール）によって産物を精製し、化合物５を得た（７１４ｍｇ、６５％）。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ
８．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），８．２６（ｓ，１Ｈ），
８．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８及び１．２Ｈｚ），
７．９３（ｍ，４Ｈ），７．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１及び１．２Ｈｚ），
７．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．２２（ｍ，５Ｈ），
６．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６及び５．８Ｈｚ），
５．８２（ｍ，１Ｈ），４．６９（ｍ，３Ｈ），
３．１８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．２，８．６及び６．４Ｈｚ），
２．８６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．２，５．８及び２．０Ｈｚ），
２．４３（ｓ，３Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ）。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₃₁Ｈ₂₈Ｎ₃Ｏ₅Ｓ（Ｍ＋１）：計算値５５４．１７５０；観測値５５４．１７４８。

（５）７−（２−チエニル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物６）
１．３３ｇ（２．４０ｍｍｏｌ）の化合物５に、０℃でアンモニア飽和メタノール（１２０ｍｌ）を加えた。溶液を室温で２時間攪拌した。反応後、溶媒を留去し、残渣を、塩化メチレン：エタノール（９７：３から９３：７）を溶出溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。７１７ｍｇの化合物６が９４％の収率で得られた。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
８．７５（ｓ，１Ｈ），８．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），
８．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），
７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），
６．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），５．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），
５．１１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），４．４６（ｍ，１Ｈ），
３．９１（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｍ，２Ｈ），
２．８０（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｍ，１Ｈ）。

¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
１４７．１０，１４４．０４，１４３．６２，１３７．０６，
１３２．００，１３１．００，１２９．７８，１２９．０６，
１２８．０７，１１３．９３，８７．８８，８３．７２，
７０．８０，６１．７４，３９．４０。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｎ₃Ｏ₃Ｓ（Ｍ＋１）：計算値３１８．０９１２；観測値３１８．０９０５。

ＵＶ： λｍａｘ，３１１ｎｍ；
ε＝２．０４×１０⁴ ２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８中。

（６）７−（２−チエニル）−３−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物７）
化合物６の３１７ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）部分を、乾燥ピリジンで３回共沸させた。これに、５．０ｍｌの無水ピリジンを加え、さらに、ジメトキシトリチルクロリド（３５６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した後、水（５０ｍｌ）に注ぎ、塩化メチレン（５０ｍｌ×３）で抽出した。Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を、塩化メチレン：酢酸エチル（９：１から１３：７）を溶出溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。５５０ｍｇの化合物７を８９％の収率で得た。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ
８．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），８．２２（ｓ，１Ｈ），
８．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８及び１．１Ｈｚ），
７．４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１及び１．１Ｈｚ），
７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．３７（ｍ，２Ｈ），
７．２７（ｍ，５Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），６．７８（ｍ，４Ｈ），
６．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５及び６．２Ｈｚ），
４．６６（ｍ，１Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），
３．７５（ｓ，３Ｈ），
３．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１及び４．６Ｈｚ），
３．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１及び５．４Ｈｚ），
２．８６（ｍ，１Ｈ），
２．５６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，６．５及び４．６Ｈｚ），
２．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ）。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₃₆Ｈ₃₄Ｎ₃Ｏ₅Ｓ（Ｍ＋１）：計算値６２０．２２１９；観測値６２０．２２３０。

（７）７−（２−チエニル）−３−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（化合物８）
化合物７（４２５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を、無水ピリジンで３回、次いで、無水アセトニトリルで３回、共沸させた。これを無水アセトニトリル（４．６ｍｌ）中に溶かし、２６２μｌ（０．８２ｍｍｏｌ）の２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト、及び０．４５Ｍテトラゾールのアセトニトリル溶液（１．６８ｍｌ）を加えた。この混合物を１時間室温で攪拌した。混合物に９０μｌの無水メタノールを加えた後、混合物を水（５０ｍｌ）に注ぎ、１％トリエチルアミン（ｖ／ｖ）を含む塩化メチレン（５０ｍｌ×３）で抽出した。Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を、２％トリエチルアミン（ｖ／ｖ）を含む、ヘキサン：酢酸エチル（４：１から３：２）を溶出溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。４９０ｍｇの化合物８を８７％の収率で得た。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
８．６５（ｍ，１Ｈ），８．２７（ｍ，１Ｈ），８．２３（ｍ，１Ｈ），
７．８１（ｍ，１Ｈ），７．６２（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，３Ｈ），
７．１８（ｍ，７Ｈ），６．７５（ｍ，４Ｈ），６．５４（ｍ，１Ｈ），
４．８１（ｍ，１Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ），
３．８４−３．４５（ｍ，１０Ｈ），３．２１（ｍ，３Ｈ），
２．８２−２．４８（ｍ，３Ｈ）１．１３（ｍ，１２Ｈ）。

³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
１４８．７６ｐｐｍ及び１４８．１４ｐｐｍ。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₄₅Ｈ₅₁Ｎ₅Ｏ₆ＳＰ（Ｍ＋１）：計算値８２０．３２９８；観測値８２０．３３２５。

（８）７−（２−チエニル）−３−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物９）
化合物７（１２４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回、共沸した。これを無水ピリジン（２．０ｍｌ）で溶かし、さらに３８μｌ（０．４０ｍｍｏｌ）の無水酢酸を加えた。得られた混合物を、室温で２日間攪拌した。混合物を水（５０ｍｌ）に注ぎ、塩化メチレン（５０ｍｌ×３）で抽出した。Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を２０ｍｌの無水塩化メチレンに溶かし、これに０℃で２００μｌのジクロロ酢酸を加えた。混合物を２℃で１５分間攪拌した後、８ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、これに４２ｍｌの水を加え、塩化メチレン（５０ｍｌ×３）で抽出した。Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を、塩化メチレン：酢酸エチル（９：１から３：２）を溶出溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。６５ｍｇの化合物９を８８％の収率で得た。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ
８．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），
８．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８及び１．１Ｈｚ），
８．１３（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０及び１．１Ｈｚ），
７．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），
７．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０及び３．８Ｈｚ），
６．６９（ｍ，１Ｈ），６．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１及び５．４Ｈｚ），
５．５８（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），３．９６（ｍ，２Ｈ），
３．３２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９，１０．１及び５．９Ｈｚ），
２．４１（ｍ，１Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ）。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₁₇Ｈ₁₈Ｎ₃Ｏ₄Ｓ（Ｍ＋１）：計算値３６０．１０１８；観測値３６０．０９９３。

（９）７−（２−チエニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物１１）
化合物４（８０ｍｇ、０，４ｍｍｏｌ）、テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース（１３０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）及びクロロ酢酸（２ｍｇ）の混合液を２００℃で５分間加熱した。得られた暗色のシロップにメタノールアンモニア（４０ｍｌ）を加え、室温で１８時間処理した。溶媒を減圧下で留去し、残渣に３０％ＣＨ₃ＣＮ水溶液を加え、そして、産物を逆相ＨＰＬＣによって精製して化合物１１を得た（３９ｍｇ、２９％、２工程）。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
８．７８（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），
８．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０及び３．７Ｈｚ），
７．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．９及び５．１Ｈｚ），
７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），
７．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７及び５．０Ｈｚ），
６．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），５．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），
５．２６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），
４．６７（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），４．２０（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），
４．００（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｍ，１Ｈ）。

¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
１４７．２９，１４４．０７，１４３．９１，１３７．００，
１３２．１３，１３１．０８，１２９．８６，１２９．１４，
１２８．１０，１１４．０２，８７．７６，８５．５７，
７３．４８，７０．４３，６１．４３。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｎ₃Ｏ₄Ｓ（Ｍ＋１）：計算値３３４．０８６２；観測値３３４．０８７１。

（１０）７−（２−チエニル）−３−［５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物１２）
化合物１１（９９ｍｇ、０，２９ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回、共沸し、そしてピリジン（３．０ｍｌ）中に溶解した。この溶液に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１０６ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。反応混合物を５％ＮａＨＣＯ₃水溶液に注ぎ、そして酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で３回洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、そして溶媒を減圧下で留去した。産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノール−ＣＨ₂Ｃｌ₂）で精製し、化合物１２を得た
（１３１ｍｇ、７１％）。

¹ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ
８．３９（ｓ，１Ｈ），８．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），
８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），７．５２（ｔ，２Ｈ，Ｈ＝５．７Ｈｚ），
７．２２（ｍ，２Ｈ），７．１４（ｍ，７Ｈ），６．６９（ｍ，５Ｈ），
６．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），４．７７（ｍ，１Ｈ），
４．４８（ｍ，１Ｈ），４．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），
３．７０（ｓ，６Ｈ），３．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４及び１０．５Ｈｚ），
３．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９及び１０．５Ｈｚ）。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₃₆Ｈ₃₄Ｎ₃Ｏ₆Ｓ（Ｍ＋１）：計算値６３６．２１６８；観測値６３６．２１７３。

（１１）７−（２−チエニル）−３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物１３）
化合物１２（１２０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回、共沸した。これを無水ピリジン（１．９ｍｌ）に溶かし、さらに７２μｌ（０．７６ｍｍｏｌ）の無水酢酸を加えた。この混合物を、室温で７時間攪拌した。混合物を５％ＮａＨＣＯ₃（５０ｍｌ）及び酢酸エチル（５０ｍｌ）に注いだ。有機層を飽和食塩水で１回洗浄した。Ｎａ₂ＳＯ₄で有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。残渣をトルエンで２回共沸した後、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１９ｍｌ）に溶かし、１９０μｌのジクロロ酢酸を０℃で加えた。この反応混合物を０℃で１５分間攪拌した。混合物を５％ＮａＨＣＯ₃に注ぎ、ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、そして、Ｎａ₂ＳＯ₄で有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧下で留去した。産物を、２％メタノール−塩化メチレン溶液を溶媒としてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。７７ｍｇの化合物１３を９３％の収率で得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
８．７９（ｓ，１Ｈ），８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），
８．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２及び３．７Ｈｚ），
７．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１及び５．１Ｈｚ），
７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），
７．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７及び５．１Ｈｚ），
６．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），
６．０２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６及び６．６Ｈｚ），
５．５４（ｍ，２Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｍ，２Ｈ），
２．１４（ｓ，３Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ）。

¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
１６９．５５，１６９．２２，１４６．９８，１４４．３９，
１４３．８５，１３６．７４，１３２．５０，１３１．０２，
１３０．１１，１２９．３２，１２８．１４，１１４．３６，
８５．２０，８３．６３，７２．３４，７１．２３，６１．０５，
２０．４４，２０．１３。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₁₉Ｈ₂₀Ｎ₃Ｏ₆Ｓ（Ｍ＋１）：計算値４１８．１０７３；観測値４１８．１０４９。

（１２）１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド（化合物１７）
ピロール−２−カルボアルデヒド（３３０ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）のＣＨ₃ＣＮ溶液（１８ｍｌ）に、ＮａＨ（６０％油分散液、１５２ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４５分間攪拌した。次いで、これに２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシルクロリド（３．１ｍｍｏｌ）（非特許文献４４）のＣＨ₃ＣＮ溶液（１８ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で４時間攪拌した。産物を酢酸エチル及び水で分離し、そして、有機層を飽和食塩水で３回洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去した。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％酢酸エチルによって溶出）で精製し、粗１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボキシアルデヒド（５０６ｍｇ）を得た。粗１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボキシアルデヒド（５０６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をトルエンで共沸した後、残渣にＣＨ₂Ｃｌ₂（１７ｍｌ）を加えた。この溶液に、−７８℃でＢＢｒ₃（１Ｍ溶液、３．０ｍｌ）を加え、２．５時間攪拌し、次いで５０％メタノール−ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液（２５ｍｌ）を加えた。溶液を−７８℃で１０分間攪拌した後、２８％のＮＨ₄ＯＨ（０．５ｍｌ）を加えた。次いで、反応混合物を、室温に達するまで攪拌した。産物を、ＣＨ₂Ｃｌ₂及びＨ₂Ｏによって分離し、そして水層をＣＨ₂Ｃｌ₂で３回洗浄し、減圧下で溶媒を留去した。産物を逆相Ｃ１８ＨＰＬＣで精製し、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒドを得た（１０８ｍｇ、１５％、２工程）。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
９．５４（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｓ，１Ｈ），
７．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６及び４．０Ｈｚ），
６．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），
６．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０及び４．０Ｈｚ），
５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），
５．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），
５．００（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），４．０２（ｍ，２Ｈ），
３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｍ，２Ｈ）。

¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
１７９．４１，１３１．６８，１２８．２４，１２４．９４，
１１０．２３，８９．３４，８４．３３，７５．６４，
６９．５０，６０．８２。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₁₀Ｈ₁₄ＮＯ₅ （Ｍ＋１）：計算値２２８．０８７２；観測値２２８．０８６３。

（１３）４−プロピニル−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド（化合物１８）
４−プロピニル−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド（化合物１８）は、化合物１７の合成方法と同様に、４−プロピニル−２−ピロールカルボアルデヒド（化合物１６）（非特許文献４０）（２６６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）から合成された。ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、化合物１８が得られた（３９ｍｇ、７％、２工程）。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
９．５０（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），
７．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），６．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），
５．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），５．０７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），
５．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），４．０１（ｍ，１Ｈ），
３．８６（ｍ，１Ｈ），
３．６６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４、５．３及び１１．９Ｈｚ），
３．５５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６、４．９及び１２．１Ｈｚ），
１．９７（ｓ，３Ｈ）。

¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ
１７９．６０，１３１．１５，１３０．４３，１２６．１３，
１０６．２２，８９．６２，８５．２６，８４．４９，
７５．８６，７３．１７，６９．３０，６０．５３，３．７９。

ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリックス）
Ｃ₁₃Ｈ₁₆ＮＯ₅ （Ｍ＋１）：計算値２６６．１０２８；観測値２６６．１０２３。

（１４）７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンのヌクレオシド５’−三リン酸の合成
保護されたヌクレオシド（０．１ｍｍｏｌ、化合物９又は１３）をピリジンで共沸して乾燥させた。残渣をピリジン（１００μｌ）−ジオキサン（３００μｌ）混合溶媒中に溶解した。これに、１Ｍ２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン−ジオキサン溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、０．５Ｍビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸−トリエチルアミン（１０μｌ）：ＤＭＦ（３００μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）混合溶液を反応混合物に素早く加えた。この混合液を室温で１０分間攪拌した。次いで、これに１％ヨウ素−ピリジン：水（９８／２、ｖ／ｖ）（２．０ｍｌ）混合溶液を加えた。１５分後、１５０μｌの５％ＮａＨＳＯ₃水性溶液を加え、次いで５．０ｍｌの水をこれに加えた。溶液を室温で３０分間攪拌した後、２０ｍｌの濃アンモニア水を加えて、室温で２時間、アンモノリシスを行った。溶媒を減圧下で留去し、産物をＤＥＡＥセファデックス（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１ＭＴＥＡＢの直線勾配によって溶出）で精製し、次いでＣ１８−ＨＰＬＣカラム（０％から３０％のＣＨ₃ＣＮ−１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液の直線濃度勾配によって溶出）で精製し、ヌクレオシド５’−三リン酸を得た。

７−（２−チエニル）−３−（２−デオキシ−β−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン５’−三リン酸（化合物１０）
¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
８．５１（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），
７．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），７．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），
７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），
６．４１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．１６（ｍ，１Ｈ），
４．０４（ｍ，２Ｈ），３．０１（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．７２（ｍ，１Ｈ），２．４６（ｍ，１Ｈ），
１．０９（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。

³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−９．９４（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ），
−１０．７２（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ），
−２２．５８（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ）。

エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₅Ｈ₁₈Ｎ₃Ｏ₁₂Ｐ₃Ｓ；計算値５５５．９７（Ｍ−Ｈ）−；観測値５５５．６９（Ｍ−Ｈ）−。

７−（２−チエニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン５’−三リン酸（化合物１４）
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
８．７４（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），
８．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），
７．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１及び５．１Ｈｚ），
７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），
７．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５及び５．１Ｈｚ），
６．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），
４．８２（ｍ，１Ｈ），４．５７（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｍ，１Ｈ），
４．２０（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
１．１９（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。

³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−９．８０（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ），
−１１．０３（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ），
−２２．７８（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１及び１８．９Ｈｚ）。

エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₅Ｈ₁₈Ｎ₃Ｏ₁₃Ｐ₃Ｓ；計算値５７１．９７（Ｍ−Ｈ）−；測定値５７１．７４（Ｍ−Ｈ）−。

（１５）アデニン又は７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（非特許文献４３、４７、４８）のヌクレオシド５’−γ−アミド三リン酸の合成
保護されたヌクレオシド（０．１ｍｍｏｌ、化合物２１（非特許文献４６）又は化合物９）をピリジンで共沸して乾燥させた。残渣をピリジン（１００μｌ）−ジオキサン（３００μｌ）混合溶液中に溶解した。これに１Ｍ２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オンのジオキサン溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、０．５Ｍビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（３００μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）−トリエチルアミン（１０μｌ）のＤＭＦ溶液を、反応混合物に素早く加え、室温で１０分間攪拌した。次いで、１％ヨウ素−ピリジン／水（９８／２、ｖ／ｖ）混合溶液（２．０ｍｌ）を加えた。１５分後、１５０μｌの５％ＮａＨＳＯ₃水性溶液を加えた。溶媒を減圧下で留去した後、残渣に２０ｍｌの２８％アンモニア水を加えた。６０℃で５時間（デオキシアデノシンの５’−γ−アミド三リン酸の場合）、又は室温で２時間（化合物６の５’−γ−アミド三リン酸の場合）、アンモノリシスを行った。溶媒を減圧下で留去した後、産物をＤＥＡＥセファデックス（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１ＭＴＥＡＢの直線濃度勾配によって溶出）で精製し、次いでＣ１８−ＨＰＬＣカラム（０％から３０％のＣＨ₃ＣＮ−１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液の直線濃度勾配によって溶出）で精製し、ヌクレオシド５’−γ−アミド三リン酸を得た。

６−アミノ−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン５’−γ−アミド三リン酸（化合物２２）
¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
８．３５（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），
６．３７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．１６（ｍ，１Ｈ），
４．０３（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．７０（ｍ，１Ｈ），２．４８（ｍ，１Ｈ），
１．１３（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。

³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−０．５０（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ），
−１０．７７（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ），
−２２．１４（ｔ，１Ｐ，２０．１Ｈｚ）。

エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₀Ｈ₁₇Ｎ₆Ｏ₁₁Ｐ₃；計算値４８９．０１（Ｍ−Ｈ）−；観測値４８８．９８（Ｍ−Ｈ）−。

７−（２−チエニル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン５’−γ−アミド三リン酸（化合物１０のγ−アミド三リン酸）
¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
８．５７（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），
７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），
７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．１５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），
６．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．１８（ｍ，１Ｈ），
４．０５（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．７５（ｍ，１Ｈ），２．５０（ｍ，１Ｈ），
１．１１（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。

³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−０．５２（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ），
−１０．７５（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ），
−２２．１４（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．８Ｈｚ）。

エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₅Ｈ₁₉Ｎ₄Ｏ₁₁Ｐ₃Ｓ；計算値５５４．９９（Ｍ−Ｈ）−；観測値５５５．０１（Ｍ−Ｈ）−。

（１６）ピロール−２−カルボアルデヒド及び４−プロピニルピロール−２−カルボアルデヒド（非特許文献４５）のヌクレオシド５’−三リン酸
１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド（０，１ｍｍｏｌ）（化合物１７）又は４−プロピニル−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド（０，１ｍｍｏｌ）（化合物１８）とプロトンスポンジ（３３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を含むトリメチルリン酸溶液（５００μｌ）に、０℃でＰＯＣｌ₃（１２μｌ、０．１３ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２時間攪拌した。反応混合物にトリ−ｎ−ブチルアミン（１２０μｌ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、次いで、これに、０．５Ｍビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（１．０ｍｌ、０．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を加えた。５分後、０．５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ、５００μｌ）を加えて、反応を終了した。得られた粗産物を、ＤＥＡＥセファデックス（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（１．５ｃｍ×３０ｃｍ、５０ｍＭから１ＭＴＥＡＢの直線勾配によって溶出）で精製し、次いでＣ１８−ＨＰＬＣカラム（ＳｙｎｃｈｒｏｐａｋＲＰＰ、ＥｉｃｈｒｏｍＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０％から３０％のＣＨ₃ＣＮ−１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液の勾配によって溶出）で精製した。

１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（化合物１９）
¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
９．２８（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｓ，１Ｈ），
７．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），
６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），６．３２（ｍ，１Ｈ），
４．３２（ｍ，２Ｈ），４．１０（ｍ，３Ｈ），
３．０３（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
１．１１（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。

³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−１０．５１（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ），
−１１．３（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ），
−２２．９１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ）。

エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₀Ｈ₁₆ＮＯ₁₄Ｐ₃：計算値４６５．９７（Ｍ−Ｈ）−；測定値４６５．８５（Ｍ−Ｈ）−。

４−プロピニル−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（化合物２０）
¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
９．２８（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），
６．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），４．３０（ｍ，２Ｈ），
４．１３（ｍ，３Ｈ），３．０６（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
１．８６（ｓ，３Ｈ），１．１４（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。

³¹ＰＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−１０．１０（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ），
−１１．０２（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ），
−２２．８２（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ）。

エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₃Ｈ₁₈ＮＯ₁₄Ｐ₃：計算値５０３．９９（Ｍ−Ｈ）−；観測値５０３．９４（Ｍ−Ｈ）−。

実施例ＩＩ化学合成−２
１．７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（化合物４）（Ｄｖ）のヌクレオシド誘導体の合成（図３３）
チアゾリル基の導入の反応（ａ）に２−（トリブチルスタニル）チアゾールを用いた以外は、図２２に示した７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（実施例Ｉの化合物４）（Ｄｓ）のヌクレオシド誘導体の合成と同様に行った。

ただし、アミダイト合成（ｇ）については、実施例Ｉ−３（７）の７−（２−チエニル）−３−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物８）の合成で、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト、及び０．４５Ｍテトラゾールのアセトニトリル溶液を用いたが、本実施例では、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン、ＴＨＦを用いた。試薬は異なるが、生成するアミダイトは同じである。

２．２−ニトロピロール（化合物１）（Ｐｎ）のヌクレオシド誘導体の合成（図３４）
（１）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ニトロピロール（化合物３）の合成
２−ニトロピロール（化合物１）（非特許文献４９）（２２４ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解させ、ＮａＨ（８０ｍｇ，６０％油分散液，２．０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分間撹拌した後、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド（８５５ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で洗浄し、有機層を水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物２を７２２ｍｇ（７８％）得た。化合物２（７２２ｍｇ）にメタノリックアンモニア（５０ｍｌ）を加えてトルオイル基の脱保護を室温１２時間で行い、シリカゲルカラムで精製後、最終精製をＨＰＬＣで行い化合物３を２９１ｍｇ（８２％）得た。

化合物３： ¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
７．７６（ｂｓ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６及び３．６Ｈｚ），
６．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），
５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），５．０３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）
４．２３（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），
２．４２（ｍ，１Ｈ），２．１９（ｍ，１Ｈ）。

エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₉Ｈ₁₁Ｏ₅Ｎ₂；計算値２２７．０７（Ｍ−Ｈ）^-；測定値２２７．０３（Ｍ−Ｈ）^-，
Ｃ₉Ｈ₁₃Ｏ₅Ｎ₂；計算値２２９．０８（Ｍ＋Ｈ）⁺；測定値２２９．０６（Ｍ＋Ｈ）⁺。

（２）１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−２−ニトロピロール２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物５）の合成
化合物３（２２８ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（１０ｍｌ）を加え、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（３７３ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物４を４９３ｍｇ（９３％）得た。

化合物４（２６５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ＴＨＦ（２．５ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（１３１μｌ，０．７５ｍｍｏｌ）を加えた溶液に、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホルアミダイト（１２３μｌ，０．５５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液にメタノール（５０μｌ）を加え酢酸エチル：水（２０：１，ｖ／ｖ）で希釈し、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液を加えて洗浄した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して、化合物５を３１５ｍｇ（８６％）得た。

（３）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ニトロピロール５’−三リン酸（化合物７）の合成
化合物４（１５９ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（３ｍｌ）を加え、無水酢酸（５７μｌ，０．６ｍｍｏｌ）を加えて反応溶液を室温で１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ₃で洗浄し、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しトルエンで共沸した後、塩化メチレン３０ｍｌに溶解させた。この反応溶液にジクロロ酢酸（３００μｌ）を０℃で加えて１５分間、０℃で撹拌した。５％ＮａＨＣＯ₃水溶液を反応溶液に加えて洗浄し、有機層を５％ＮａＨＣＯ₃で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して化合物６を７３ｍｇ（９１％）得た。

化合物６（４１ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（１５０μｌ）とジオキサン（４５０μｌ）加えた後、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン（１８０μｌ，１Ｍジオキサン溶液）を加えて１０分間室温で撹拌した。トリ−ｎ−ブチルアミン（１５０μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（４５０μｌ，０．５ＭＤＭＦ溶液）を反応溶液に加えて１０分間撹拌した。Ｉ₂／ピリジン（３．０ｍｌ，ピリジン中１％ヨウ素：Ｈ₂Ｏ，９８：２，ｖ／ｖ）を加えて１５分間撹拌後、５％ＮａＨＳＯ₃水溶液（２２５μｌ）を加えて反応溶液を濃縮した。Ｈ₂Ｏ（７．５ｍｌ）を加えて室温で３０分間撹拌後、２８％アンモニア水を３０ｍｌ加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を濃縮、凍結乾燥した後ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５で精製（５０ｍＭから１．０ｍＭＴＥＡＢ直線勾配）し、ＨＰＬＣで最終精製を行い目的とする化合物７を得た。

化合物７：
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₉Ｈ₁₄Ｏ₁₄Ｎ₂Ｐ₃；計算値，４６６．９７（Ｍ−Ｈ）^-；測定値，４６６．７０（Ｍ−Ｈ）^-。

３．４−（チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ＤＤｓ）及び４−（チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ＤＤｖ）のヌクレオシド誘導体の合成（図３５）
（１）４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物３）の合成
１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物１）（５．３ｇ，４５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（４５ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（３０ｍｌ）に溶解したメタ−クロロ過安息香酸（１４ｇ，５４ｍｍｏｌ）溶液を０℃で撹拌しながら１時間かけて滴下して加えた。滴下後室温で３時間撹拌した後、０℃で静置した。結晶をろ過し、酢酸エチルで洗浄後、減圧下で乾燥した。これを水（３０ｍｌ）に溶解後、３０％Ｋ₂ＣＯ₃をｐＨ１０になるまで加え、室温で１時間、０℃で１時間静置した後、沈殿をろ過、エーテルで洗浄してＮ−オキシドを３．５ｇ（５８％）得た。Ｎ−オキシド（３．０ｇ，２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１６ｍｌ）に溶解し５０℃で加熱した。メタンスルホニルクロリド（４．７ｍｌ，６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６．４ｍｌ）溶液を７０℃で滴下し、この反応溶液を７５℃で２時間撹拌した。反応溶液を氷に加えた後、０℃で１０ＮのＮａＯＨを用いて中和した。室温で１時間撹拌し、生成した沈殿をろ過して水で洗浄した後、６０℃で減圧乾燥して目的とする化合物２を２．７ｇ（８０％）得た。

化合物２（２．７ｇ，１８ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（１３ｇ，８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２８ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながらＣＨ₃ＣＯＣｌ（３．５ｍｌ，５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を８５℃で１２時間加熱した。反応溶液を室温に戻した後、１０％Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液（２８ｍｌ）と１０％ＮａＨＳＯ₃水溶液（２８ｍｌ）を順次加えて室温で１５分間撹拌した。酢酸エチルを加えて洗浄し、有機層を飽和食塩水でさらに洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製し、４−ヨード−１−Ｎ−アセチル−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．０ｇ）ならびに４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物３）（２．３ｇ）を得た。４−ヨード−１−Ｎ−アセチル−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．０ｇ，７．０ｍｍｏｌ）は、エタノール（７０ｍｌ）に溶解し、メタノール中の２８％ナトリウムメトキシド（１．４ｍｌ，７．０ｍｍｏｌ）を加えて１時間加熱還流した。反応溶液を濃縮後、酢酸エチルと飽和アンモニウムクロリド水溶液で分液し、有機層を飽和アンモニウムクロリド水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、先に得られた化合物３（２．３ｇ）とあわせてエタノールで再結晶して化合物３（４．０ｇ，９２％）を得た。

（２）１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物４）の合成
化合物３（９５０ｍｇ，３．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３９ｍｌ）溶液に、ＮａＨ（１５６ｍｇ，６０％油分散液，３．９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド（１．８ｇ，１．２当量）を加えて室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和アンモニウムクロリド水溶液で洗浄し、有機層を飽和アンモニウムクロリド水溶液と飽和食塩水で分液した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物４を１．８ｇ（７７％）得た。

（３）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７）および１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物８）の合成
化合物４（７１５ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）とジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（４２ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１２ｍｌ）溶液に２−（トリブチルスタニル）チオフェン（６０１μｌ，１．８ｍｍｏｌ）を加えて１００℃で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水、次いで、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物５を５８６ｍｇ（８８％）得た。

化合物５（５８０ｍｇ）にアンモニア飽和メタノール（５０ｍｌ）を加えてトルオイル基の脱保護を室温１２時間で行い、シリカゲルカラムで精製後、最終精製をＨＰＬＣで行い化合物７を３０４ｍｇ（９１％）得た。

化合物６および化合物８の合成は、２−（トリブチルスタニル）チアゾールを用いた以外は同様に行った。合成は、化合物４（６００ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）から合成し、化合物６（４４９ｍｇ，８１％）、化合物８（２４５ｍｇ，９７％）を得た。

化合物７： ¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
８．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），
７．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），７．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），
７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），
７．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７及び５．０Ｈｚ），
６．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），
６．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０及び８．２Ｈｚ），
５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），
５．０２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．３９（ｍ，１Ｈ），
３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｍ，１Ｈ），
２．２６（ｍ，１Ｈ）。

化合物８： ¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），８．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），
８．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），
７．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），
６．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１及び８．０Ｈｚ），
５．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），４．５０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），
４．４０（ｍ，１Ｈ），３．８６（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｍ，２Ｈ），
２．５８（ｍ，１Ｈ），２．２６（ｍ，１Ｈ）。

（４）１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物１１）及び１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物１２）の合成
化合物７（３００ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（９ｍｌ）を加え、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（３８６ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して化合物９を５７０ｍｇ（９７％）得た。

化合物９（２９０ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ＴＨＦ（２．４ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（１２３μｌ，０．７ｍｍｏｌ）を加えた溶液に、
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト（１１５μｌ，０．５２ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液にメタノール（５０μｌ）を加え酢酸エチル：水（２０：１，ｖ／ｖ）で希釈し５％ＮａＨＣＯ₃水溶液を加えて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して化合物１１を３４５ｍｇ（９０％）得た。

同様に化合物１０および化合物１２の合成は、化合物８（２２０ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）から合成し、化合物１０（４２４ｍｇ，９９％）、化合物１２（２２７ｍｇ，８６％）を得た。

（５）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン５’−三リン酸（化合物１５）および１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン５’−三リン酸（化合物１６）の合成
化合物９（２４７ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（４ｍｌ）を加え、無水酢酸（７５μｌ，０．８ｍｍｏｌ）を加えて反応溶液を室温で１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で分液し、有機層を５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しトルエンで共沸した後、残渣を塩化メチレン４０ｍｌに溶解させた。この反応溶液にジクロロ酢酸（４００μｌ）を０℃で加えて１５分間、０℃で撹拌した。５％ＮａＨＣＯ₃水溶液を反応溶液に加えて分液し、有機層を５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して化合物１３を１２５ｍｇ（８７％）得た。

化合物１３（３６ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（１００μｌ）とジオキサン（３００μｌ）加えた後、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフィン−４−オン（１１０μｌ，１Ｍジオキサン溶液）を加えて１０分間室温で撹拌した。トリ−ｎ−ブチルアミン（１００μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（３００μｌ，０．５ＭＤＭＦ溶液）を反応溶液に加えて１０分間撹拌した。Ｉ₂／ピリジン（２．０ｍｌ，ピリジン中１％ヨウ素：Ｈ₂Ｏ，９８：２，ｖ／ｖ）を加えて１５分間撹拌後、５％ＮａＨＳＯ₃水溶液（１５０μｌ）を加えて反応溶液を濃縮した。Ｈ₂Ｏ（５ｍｌ）を加えて室温で３０分撹拌後、２８％アンモニア水を２０ｍｌ加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を濃縮、凍結乾燥した後ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５で精製（５０ｍＭから１．０ｍＭＴＥＡＢ直線勾配し、ＨＰＬＣで最終精製を行い目的とする化合物１５を得た。

同様に化合物１４および化合物１６の合成は、化合物１０（２１０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）から合成し、化合物１４（１０８ｍｇ，８９％）、化合物１６（０．１ｍｍｏｌ合成スケール）を得た。

化合物１５：
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₆Ｈ₁₈Ｏ₁₂Ｎ₂Ｐ₃Ｓ；計算値，５５４．９８（Ｍ−Ｈ）^-；測定値，５５４．７３（Ｍ−Ｈ）^-。

化合物１６：
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₅Ｈ₁₇Ｏ₁₂Ｎ₃Ｐ₃Ｓ；計算値，５５５．９７（Ｍ−Ｈ）^-；測定値，５５５．８２（Ｍ−Ｈ）^-。

実施例ＩＩＩ生物学的実験
１．手法
本実施例では、別途特に明記しない限り以下の手法を用いた。

ＫＦｅｘｏ ^- を用いた１ヌクレオチド挿入実験
１ヌクレオチド挿入実験を、文献にしたがって行った（非特許文献３０−３２）。５’−末端を６−カルボキシルフルオロセインで標識したプライマー（２０−ｍｅｒ）を鋳型ＤＮＡ（３５−ｍｅｒ）と、２０ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭＤＴＴ、および０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有する１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中で、９５℃の加温と緩やかな４℃への冷却によりアニールした。プライマー−鋳型二本鎖溶液（１０μＭ、５μｌ）をエキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウフラグメント（ＫＦｅｘｏ^-、ＡｍｅｒｓｈａｍＵＳＢ）の酵素溶液（２μｌ）と混合した。混合物を２分間インキュベートし、次いで、各ｄＮＴＰ溶液（３μｌ）をこの溶液に加えて、３７℃で反応を開始した。使用した酵素の量（５−５０ｎＭ）、反応時間（１−３５分）、およびｄＮＴＰの勾配濃度（０．３−１５００μＭ）を調節し、２５％以下の生成物を与える条件で測定を行った。反応を１０μｌのストップ溶液（９５％ホルムアミドおよび２０ｍＭＥＤＴＡ）で停止し、そして混合物を直ちに７５℃で３分間加熱した。希釈産物をＧｅｎｅＳｃａｎソフトウエア（バージョン３．０）を装備した自動ＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーで解析した（非特許文献３２）。比速度（ｖ₀）を反応の範囲を反応時間で割ることにより計算し、そして使用した様々な酵素濃度に対して酵素濃度を標準化した（２０ｎＭ）。動力学変数（Ｋ_MおよびＶ_max）を［ｄＮＴＰ］に対する［ｄＮＴＰ］／ｖ₀のハーネス−ウルフプロットから得た。各変数を、３ないし８のデータセットから平均化した。

ＫＦを用いたプライマー伸長反応
５’−³²Ｐ−標識プライマー（２３−ｍｅｒ）および鋳型ＤＮＡ（３５−ｍｅｒ）の二本鎖を、１４ｍＭＭｇＣｌ₂および０．２ｍＭＤＴＴを含有する２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中でアニールした。二本鎖溶液（４００ｎＭ，５μｌ）を氷上で５ｘｄＮＴＰ溶液（２μｌ）と混合し、次いで、これに、ＫＦｅｘｏ^-（１ユニット）またはＫＦｅｘｏ⁺（１ユニット）（ＴＡＫＡＲＡ）を含有する酵素溶液（３μｌ）を加えることで反応を開始した。反応溶液を３７℃で３または５分間インキュベートし、そして８９ｍＭＴｒｉｓ−ホウ酸塩、２ｍＭＥＤＴＡ、１０Ｍ尿素、および０．０５％ＢＰＢを含む色素溶液（１０μｌ）を添加することにより、反応を終結させた。この溶液を直ちに７５℃で３分間加熱し、次いで１５％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。ゲル上の産物を、バイオイメージングアナライザー（モデルＢＡＳ２５００、Ｆｕｊｉ）で解析した。

ＤＮＡシーケンシング
ジデオキシ−サイクルシーケンシング反応（２０μｌ）を、１ｎｍｏｌｄＰａ’ＴＰの存在または非存在下で、０．３ｐｍｏｌ鋳型および４ｐｍｏｌプライマー１またはプライマー２を含有する８μｌのＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ（ＢｉｇＤｙｅ１．１、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＰＴＣ−１００ＰｒｏｇｒａｍＴｈｅｒｍａｌＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪＲｅｓｅａｃｈ）上で行った。２５サイクルのＰＣＲ（９６℃、１０秒；５０℃、５秒；６０℃、４分）の後で、残存する色素ターミネーターをＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｑ^TMスピンカラム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応溶液から取り除いた後、この溶液を５５℃で減圧下で乾燥した。残存物をホルムアミド溶液（４μｌ）で再懸濁し、そして６％ポリアクリルアミド−６Ｍ尿素ゲルを装着したＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーで解析した。配列データを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰＲＩＳＭシークエンシング解析ｖ３．２ソフトウエアで解析した。

ＰＣＲ増幅
ＰＴＣ−１００Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いて、反応を、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３ｍＭ各ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ｐａ，Ｇ，Ｃ，およびＴ）並びにｄＮＴＰ_N（Ｎ＝ＤｓおよびＡ）、１μＭ各プライマー１およびプライマー２、２．３ｎＭ二本鎖ＤＮＡ断片、並びに０．０４ユニット／μｌＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）の２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）中で行った。ＰＣＲサイクルは、９４℃、０．５分；４５℃、０．５分；６５℃、４分で行った。コントロールのＰＣＲでは、０．２ｍＭ各天然型ｄＮＴＰおよび０．０１ユニット／μｌのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを使用し、そして伸長反応のステップを７２℃１分間で行った。ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上でエチジウムブロマイドにより染色し、染色されたバンドの強度をＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸＰｒｏｓｙｓｔｅｍおよびＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量化した。シーケンシング解析のために、ＰＣＲ産物は、予め、ゲル電気泳動（７％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル）またはろ過（ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０およびＭｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ）により精製された。

Ｔ７転写
転写（２０μｌ）を、２４ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭスペルミジン、５ｍＭＤＴＴ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１−３ｍＭ各天然型ＮＴＰ、０−３ｍＭＰａ’ＴＰ、０−３ｍＭＤｓＴＰ、１０ｍＭＧＭＰ、２μＭ鋳型ＤＮＡ（１７−ｍｅｒ転写物の合成のための）または０．５μＭ鋳型ＤＮＡ（ｔＲＮＡ転写物合成のための）、および２．５ユニット／μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を含有する４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で実行した。転写効率を調べるために、１７−ｍｅｒ転写物の合成では、２μＣｉ［γ−³²Ｐ］ＧＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＧＭＰの代わり）、ｔＲＮＡ転写物の合成では、［α−³²Ｐ］ＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をそれぞれ加えて転写を行った。３７℃で、３時間（１７−ｍｅｒ合成の場合）または６時間（ｔＲＮＡ合成の場合）インキュベーションの後に、尿素を含む色素溶液を加えて反応を停止した。この溶液を、７５℃で３分間加熱し、そして１５または２０％（１７−ｍｅｒ）または１０％（ｔＲＮＡ）ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル電気泳動により、産物を、バイオイメージングアナライザーで解析した。転写産物中のヌクレオチドの組成解析の際は（非特許文献１７，３３）、転写物を、２μＣｉ［α−³²Ｐ］ＵＴＰまたは［α−³²Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で内部標識した。転写後、産物を、１０μｌの１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で、３７℃で２時間、０．７５ユニットのＲＮａｓｅＴ₂により消化した。１７−ｍｅｒの解析では、０．０５Ａ₂₆₀ユニットの大腸菌ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を消化反応溶液中に加えた。消化産物を２Ｄ−ＴＬＣ（ＨＰＴＬＣプレート、１００ｘ１００ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）により解析した。１次元目の展開溶媒は、イソ酪酸−アンモニア−水（６６：１：３３ｖ／ｖ／ｖ）、２次元目の展開溶媒は、イソプロピルアルコール−ＨＣｌ−水（７０：１５：１５ｖ／ｖ／ｖまたはＰａ’転写物のための７５：１５：１０ｖ／ｖ／ｖ）をそれぞれ用いた。ＴＬＣプレート上の標識ヌクレオチドのスポットをバイオイメージングアナライザーにより解析した。

ＤＮＡ２−９のＰＣＲ増幅産物のジデオキシ−サイクルシーケンシング
それぞれのＤＮＡのＰＣＲは、ＰＴＣ−１００コントローラーを用いて、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ｐａ、Ｇ、Ｃ及びＴ）及びｄＮＴＰ_N（Ｎ＝Ｄｓ及びＡ）、１μＭの各プライマー１及びプライマー２、２．３Ｍの二本鎖ＤＮＡ断片（ＤＮＡ２−９）、及び０．０４単位／μｌのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）を含む、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）中で行った。ＰＣＲのサイクルは、９４℃、０．５分；４５℃、０．５分；６５℃、４分で行った。シーケンシングのために、ＰＣＲ産物をゲル電気泳動（７％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル）又は濾過（ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０及びＭｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ）によって予め精製した。ｄＰａ’ＴＰ存在下、あるいは、非存在下でシーケンシングを行い、６％ポリアクリルアミド−６Ｍ尿素ゲルを装着したＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーで、配列を決定した。

ＤＮＡ断片中の非天然型塩基の位置は、ｄＰａ’ＴＰの存在下及び非存在下でのシーケンシングから得られた双方のピークパターンを比較することによって確認することができる。

大腸菌無細胞翻訳システムにおける非天然型アンチコドンを含有するｔＲＮＡのアミノアシル化
ｔＲＮＡ転写産物のアミノアシル化は、マイナーチェンジを加えた製造業者のプロトコルに従った迅速翻訳システム（ＲＴＳ−１００、ロシュ）中で調べた。［α−³²Ｐ］で分子内標識されたｔＲＮＡ転写産物（０．４μＭ）を、３０℃で３０分間、システム（２５μｌ）中でインキュベートした。酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で飽和させたフェノールで、ｔＲＮＡを抽出し、そして、０．２ＭＴｒｉｓ−酢酸及び３ｍＭＥＤＴＡを含む産生緩衝液（ｐＨ４．７５）中、４℃で１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分析した（図５ｄ、図２１）。

２．Ｄｓを含有するＤＮＡ断片のシーケンシング
修飾Ｐａである４−プロピニルピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ’）ヌクレオシドの三リン酸誘導体（ｄＰａ’ＴＰ）（非特許文献３４）を加えたジデオキシヌクレオチド鎖終結によるシーケンシング法（非特許文献３３）により、ＤＮＡ断片中のＤｓ−Ｐａ塩基対の位置を確認した。ＫＦｅｘｏ^-による鋳型中のＤｓに対するｄＰａ’ＴＰの導入効率（Ｖ_max／Ｋ_M＝２．２×１０⁵）は、鋳型中のＤｓに対するｄＰａＴＰの導入効率（Ｖ_max／Ｋ_M＝５．７×１０⁴）に比べて３．９倍高くなる（表１及び２）。したがって、Ｄｓ含有鎖のシーケンシングは、ｄＰａ’ＴＰを加えて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのシーケンシングキットであるＢｉｇＤｙｅ１．１（ａｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われた。シーケンシングおよびその後の実験のために、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有する２本鎖ＤＮＡ断片（１５０−ｍｅｒおよび１７４−ｍｅｒ、ＤＮＡ１−１４）は、化学的に合成されたＤＮＡ断片をプライマー伸長または連結することにより調製した（図６）。

５’−ＣＤｓＡ／３’−ＧＰａＴを含有するＤＮＡ１のシーケンシングでは、０．０５ｍＭｄＰａ’ＴＰを加えることにより鋳型中のＤｓに対して天然型塩基の色素ターミネーターが導入されなくなるので、鋳型中のＤｓに対応する部位のみＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔのいずれのピークも消失する（図３ｃ）。すなわち、このシーケンシングでピークが現れずにギャップが認められた位置が非天然型塩基の位置を示している。

ＤＮＡ１以外の非天然型塩基周辺が異なった配列を含むＤＮＡでは、ｄＰａ’ＴＰ存在下でのシーケンシングで、明らかなギャップパターンを示さなかったものもあった（図１３−２０）。しかし、ｄＰａ’ＴＰ非存在下でのシーケンシングでは、鋳型Ｄｓの位置以降のピークはほとんど消滅するので（図３ｇ）、ｄＰａ’ＴＰ存在下および非存在下でのそれぞれのシーケンシングのピークパターンを比較することにより、ＤＮＡ中の非天然型塩基の位置を確認することができる（例えば、図３ｃおよび３ｇ）。

３．Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅
Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含有するＤＮＡ１−１４（図６）（１５０−ｍｅｒまたは１７４−ｍｅｒ、２．３ｎＭ）のＰＣＲ増幅を、３’ →５’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性ＤＮＡポリメラーゼ（０．０４ユニット／μｌ、ＶＥＮＴＤＮＡポリメラーゼ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）およびｄＤｓＴＰ_N、ｄＰａＴＰ、ｄＡＴＰ_N、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰの基質混合物（各０．３ｍＭ）を使用して行った。ＰＣＲサイクルは、９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、および６５℃で４分、で行った。

本発明者らは、はじめにＤＮＡ１の増幅の選択性および効率性を試験した（図３ａ）。１０サイクルのＰＣＲの後（図３ｂ）、産物をｄＰａ’ＴＰ共存下、あるいは非共存下でのシーケンシングにより解析した（図３ｄおよび３ｈ）。加えて、さらなる１０サイクルのＰＣＲ（全体で１０＋１０サイクル）を１０サイクルＰＣＲ産物の一部を使用して行った（図３ｅおよび３ｉ）。１０サイクルおよび１０＋１０サイクルのＰＣＲ産物のｄＰａ’ＴＰ存在下でのシーケンシングは、はじめのＤＮＡ１のシーケンシングと類似のピークパターンを与えた。ｄＰａ’ＴＰ非共存下でのシーケンシングにおいて（図３ｇ−３ｉ）、ＤＮＡ１中の非天然型塩基の位置に続く読み過し（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）のピークは、ＰＣＲサイクル数の増加によりわずかに大きくなった。したがって、読み過しピークの高さは、ＰＣＲ増幅によりＤｓ−Ｐａ塩基対から天然型塩基対への変異率を決定するために使用することができる。変異率は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対の代わりに１−１０％のＡ−Ｔを含有するコントロールＤＮＡ断片のｄＰａ’ＴＰ非共存下でのシーケンシングにより得られた読み過しのピークの高さ（図８）とＰＣＲ産物の読み過しピークの高さ（図３ｇ−３ｉ）を、比較することにより決定された。１０サイクルおよび１０＋１０サイクルの後のＤＮＡ１中のＤｓ−Ｐａ塩基対の変異率は、それぞれ〜１％および３−４％であった。この手法を用いて、Ａのγ−アミド三リン酸の使用が、ＰＣＲにおけるＤｓ−Ｐａ塩基対の選択性を増加していることもわかった。ｄＡＴＰ_Nを使用しないで、ｄＤｓＴＰ_N、ｄＰａＴＰおよび天然型ｄＮＴＰを使用したＤＮＡ１のＰＣＲ増幅は、変異率が上昇した。１０および１０＋１０サイクルの後で、Ｄｓ−Ｐａ塩基対の変異率は、それぞれ〜５％および〜１０％であった（図９）。また、ｄＤｓＴＰ_NおよびｄＰａＴＰの非存在下での１０サイクルのＰＣＲにおいて、ＤＮＡ１中のＤｓ−Ｐａ塩基対は、完全にＡ−Ｔ塩基対に置き換わっていた（図３ｆ）。

ＤＮＡ１の増幅効率は、ゲル上のＰＣＲ産物を色素で染色する、あるいは、各標識プライマーを使用した産物のオートラジオグラフにより、それらのバンドの強度から評価した。その結果（図３ｂ）、ＤＮＡ１は１０サイクルのＰＣＲで１５倍に増幅され、天然型ＤＮＡ断片（ＤＮＡｃｏｎｔ１）は１０サイクルのＰＣＲで３７倍に増幅された。より正確な効率は、５’−または３’−³²P標識プライマーを使用してＰＣＲ産物のオートラジオグラフにより得られた（図１０）。式Ｎ_f＝Ｎ₀（１＋Ｙ）ⁿを用いてサイクルごとの伸長効率（Ｙ）を決定した。ここで、Ｎ_fは産物の最終コピー数であり、Ｎ₀ははじめのコピー数であり、そしてｎはＰＣＲサイクルの数である（非特許文献３５）。ＤＮＡ１を用いた１から１０サイクルのＰＣＲの効率（Ｙ）は、５’プライマーからの伸長に対しては０．３８であり、３’プライマーからの伸長に対しては０．２９であった。そしてＤＮＡｃｏｎｔ１を通常の条件下でＰＣＲ増幅した場合には、Ｙ値はそれぞれ０．４３および０．３５であった。したがって、非天然型塩基対システムにおけるＰＣＲのサイクルごとの効率は、従来の天然型塩基対システムにおけるものの７６−８８％である。以上で得られたＰＣＲ産物の増幅効率およびＤＮＡシーケンシングから決定されたＤｓ−Ｐａ塩基対の変異率から、ＤＮＡ１中のＤｓ−Ｐａ塩基対のＰＣＲにおける忠実度（ＤＮＡ１が二倍に増幅されるときの）は、９９．８％以上と計算される。しかしながら、この忠実度は、ＰＣＲ増幅におけるＤｓ−Ｐａ塩基対の選択性よりむしろ、化学的に合成されたはじめのＤＮＡ断片の純度に依存することがわかった（図１１）。したがって、非天然型塩基対システムの選択性は９９．８％よりもかなり高いものと考えられる。

本発明者らは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対周辺の異なった配列を含む他のＤＮＡ断片（ＤＮＡ２−１４）の増幅も検討した。１０サイクルのＰＣＲの後、各ＤＮＡ断片は１６から３０倍に増幅され（図１２）、各ＤＮＡのＤｓ−Ｐａ塩基対の変異率は１−３％であった（図１３−図２０）。例外は、５’−Ｘ（Ａ）_n−３’配列を含有するＤＮＡ１０−１４の増幅であった。ここでＸ＝ＤｓまたはＰａであり、そしてｎ＝２である。これらのＤＮＡ断片の１０サイクルのＰＣＲの後の増幅効率は５倍未満であった。この低い効率は、Ａのγ−アミド三リン酸の取り込みに続いて、ＤｓまたはＰａの基質が連続して取り込まれる場合に起こる。したがって、５’−ＤｓＡＡ−３’および５’ＰａＡＡ−３’配列を除いて、非天然型塩基を含有する全ての配列は、ＤＮＡ増幅に使用可能である。

４．Ｄｓ−Ｐａ塩基対に仲介されるＴ７転写
Ｄｓ−ＰａおよびＤｓ−Ｐａ’ 塩基対は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＤｓＴＰ、ＰａＴＰおよびＰａ’ＴＰのＲＮＡへの部位特異的導入を相補的に仲介した。Ｄｓ、ＰａまたはＰａ’を含有する鋳型ＤＮＡ（３５−ｍｅｒ）を使用して、転写を検討した（図４ａおよび４ｂ）。非天然型塩基のリボヌクレオシド三リン酸を加えて３時間の転写を行った後、³²Ｐで標識された転写物をゲル上で解析した（図４ｃ）。各Ｐａ、Ｐａ’およびＤｓを含有する全長の転写物（１７−ｍｅｒ）の収率は、天然型塩基からなる鋳型ＤＮＡを用いた天然型塩基のみの転写物のもの（図４ｃレーン９）と比べて２８−９１％であった（図４ｃレーン１，２，５，および７）。非天然型塩基を含む鋳型ＤＮＡの転写において、非天然型塩基の基質を加えなかった場合の転写物の収率は有意に減少した（図４ｃレーン３，６および８）。

Ｔ７転写においてＤｓ−ＰａおよびＤｓ−Ｐａ’ 塩基対の高い選択性を、内部³²Ｐ標識転写物のヌクレオチド組成を解析（非特許文献１７，３３）することにより確認した（図４ｄおよび４ｅ、並びに表３）。

表３．Ｔ７転写物のヌクレオチド組成解析

ａ：図４及び５に示されたような、Ａ（エントリー１−１３及び２４−３１）又はＵ（エントリー１４−２３及び３２−３９）の５’末端側に取り込まれたヌクレオチドの組成物
ｂ：Ｎｐ＝Ｐａｐ、Ｐａ’ｐ、又はＤｓｐ
ｃ：値は以下の式を用いて決定した

ｄ：各ヌクレオチドの理論値を角括弧内に記載してある。

ｅ：標準偏差は丸括弧内に示してある。

ｆ：検出されず。

内部³²Ｐ標識された転写物をＲＮａｓｅＴ₂により消化し、生じた標識ヌクレオシド３’−一リン酸を２Ｄ薄層クロマトグラフィー（２Ｄ−ＴＬＣ）により解析した。非天然型塩基を含有する鋳型を使用する転写物において、ＤｓおよびＰａに対応する各スポットが２Ｄ−ＴＬＣ上に現れ、そして非天然型塩基の形状に類似した天然型基質の誤った導入（例えば、ＰａＴＰに対するＣＴＰおよびＵＴＰ、並びにＤｓＴＰに対するＡＴＰおよびＧＴＰ）に対応するスポットはいずれも観察されなかった（図４ｄ、Ｎ＝Ｄｓおよび図４ｅ、Ｎ＝Ｐａ）。完全に天然型塩基からなる鋳型を使用する転写物において、ＰａまたはＤｓに対応するスポットは観察されなかった（図４ｄ、Ｎ＝ＡおよびＧ、並びに図４ｅ、Ｎ＝ＴおよびＣ）。２Ｄ−ＴＬＣ上の各ヌクレオチドのスポットの定量値は、産物配列から予測される理論値にきわめて近く（表３、エントリー１−２３）、その結果から転写におけるＤｓ−ＰａまたはＤｓ−Ｐａ’ 塩基対の選択性は９５％以上と見積もられた。

本発明者らは、応用例として、非天然型アンチコドンであるＣＵＰａ’、ＣＰａ’Ａ、ＣＵＤｓ、およびＣＤｓＡを含有するｔＲＮＡ分子（８５−ｍｅｒ）をＴ７転写により調製した。ここでは、大腸菌抑制ｔＲＮＡ^Tyrの配列を採用した。

ＰａＴＰまたはＰａ’ＴＰの１７−ｍｅｒ転写物への転写効率は比較的低かったが、Ｐａ’を含有するより長いｔＲＮＡ（８５−ｍｅｒ）の転写は高い効率を示した；８５−ｍｅｒの収率は、ＣＵＡアンチコドンを持つｔＲＮＡ転写物のものと比較して８８−９３％であった（図５ａ）。ヌクレオチド組成解析のために、転写物を［α−³²Ｐ］ＡＴＰまたは［α−³²Ｐ］ＵＴＰで内部標識した。非天然型ヌクレオチドがＡの５’末端側に位置しているので、各非天然型ヌクレオチドの３’−一リン酸は［α−³²Ｐ］ＡＴＰのみで標識される。したがって、転写物が［α−³²Ｐ］ＡＴＰで標識された場合のみ、非天然型ヌクレオチドに対応するスポットが２Ｄ−ＴＬＣにより検出される（図５ｂおよび５ｃ）。鋳型中のＤｓに対するＰａ’、および鋳型中のＰａに対するＤｓの導入の選択性は、９６％以上であった（表３、エントリー２４−３９）。

得られたｔＲＮＡ転写物を使用して、本発明者らは、大腸菌抽出液中でのアミノアシル化を検討した（ＲＴＳ１００Ｅ．ｃｏｌｉＨＹｋｉｔ、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。ＣＰａ’ＡおよびＣＤｓＡアンチコドンをもつｔＲＮＡは、全くアミノアシル化されず、大腸菌由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の認識を排除することがわかった（図５ｄレーン７−１０）。また、ＣＵＰａ’およびＣＵＤｓアンチコドンを持つｔＲＮＡはアミノアシル化された（図５ｄレーン１−４）。これらの非天然型アンチコドンを持つｔＲＮＡのアミノアシル化の選択性は、大腸菌ｔＲＮＡ^TyrおよびそのチロシルｔＲＮＡ合成酵素間の認識の選択性（非特許文献３６，３７）とよく一致する。以上の結果は、非天然型塩基のｔＲＮＡへの部位特異的導入を確認するものでもある。

実施例ＩＶビオチン化されたＰａＴＰの合成
ビオチン化されたＰａＴＰ（１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ビオチンアミド−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート：化合物２８、Ｂｉｏ−ＰａＴＰ）は、図３６に示すスキームによって合成した。

（１）１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２４）の合成（図３６のスキームにおける反応（ａ）−（ｃ））：
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノース（１．０ｇ、２．３ｍｍｏｌ）およびＣＣｌ₄（３４４μｌ、３．６ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ溶液（４．６ｍｌ）に、ヘキサメチルホスホラストリアミド（５６２μｌ、３．０ｍｍｏｌ）を−７８℃で加えた。当該溶液を、−７８℃で２時間、そして室温で３０分間、攪拌した（溶液Ａ）。ＣＨ₃ＣＮ（２５ｍＬ）中、４−ヨード−ピロール−２−カルボキシアルデヒド（化合物２３）（８３０ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）に、ＮａＨ（６０％オイルディスパージョン、１５０ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間攪拌した。次いで、ＴＨＦ中の２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシルクロリド（溶液Ａ）を加えた。反応混合物を室温で１２時間攪拌した。生成物を酢酸エチルおよび水で分液した。有機層は飽和ＮＨ₄Ｃｌで３回洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、そして減圧下で濃縮した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中１％メタノールで溶出）で精製し、１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピロール−２−カルバルデヒドを得た。

１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピロール−２−カルバルデヒドのジクロロメタン（１５ｍｌ）溶液に、ＢＢｒ₃（１Ｍ溶液、８．５ｍｌ）を−７８℃で加えた。反応混合物を２時間攪拌し、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂中の５０％メタノール（３０ｍｌ）を加えた。当該溶液を−７８℃で１０分間攪拌した後、２８％ＮＨ₄ＯＨ（４ｍｌ）を加え、そして反応混合物を室温になるまで攪拌した。溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂およびＨ₂Ｏに加えた。水層はＣＨ₂Ｃｌ₂で３回、分液および洗浄し、そして残渣を減圧下で濃縮した。生成物を逆相Ｃ１８ＨＰＬＣで精製して、１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピロール−２−カルバルデヒド（３３０ｍｇ）を得た。

１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピロール−２−カルバルデヒド（１７６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、αアノマーを含有する）をピリジン及びトルエンで共沸させた。１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピロール−２−カルバルデヒド（１７６ｍｇ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２９ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（１０５μｌ、０．７５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ(１．８ｍｌ）溶液に、３−（ジクロロアセトアミド）−１−プロピン（０．７５ｍｍｏｌ）の１ＭＤＭＦ溶液（７５０μｌ）を加えた。反応物を室温で１２時間攪拌した。生成物をＥｔＯＡｃ／Ｈ₂Ｏで分液し、有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中１０％メタノール）、およびＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、化合物２４をβ異性体として得た（１２３ｍｇ、２６％、３段階の全収率）。化合物２４の構造は、ＮＭＲ（図３８）および高分解能質量分析により確認した。化合物２４のＨＭＱＣスペクトル（図３８ｅ）およびＨＭＢＣスペクトル（図３８ｆおよび図３８ｇ）は、Ｎ−グリコシド結合が、Ｃ１’炭素において糖およびピロール塩基部位との間に形成されたことを示した。また、化合物２４のＮＯＥＳＹスペクトル（図３８ｄ）のクロスピークは、化合物１８（図２５ｊ）のそれと類似しており、そしてＨ１’およびＨ４’プロトンの間のクロスピークを示したため、化合物２４の芳香族の立体配置はβと同定された。

化合物２４：
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
９．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．８Ｈｚ），９．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），
８．０１（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），
６．４９（ｓ，１Ｈ），６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），
５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．１０（ｍ，２Ｈ），
４．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），４．０２（ｍ，２Ｈ），
３．８８（ｍ，１Ｈ），
３．６８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４，５．３，１２．１Ｈｚ），
３．５７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５，５．０，１２．１Ｈｚ）．
¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
１８０．２８，１６３．７８，１３１．８８，１３１．４９，
１２６．８５，１０５．２３，９０．２３，８５．２６，
８５．０４，７６．８３，７６．４１，６９．７５，
６７．０１，６０．９６，３０．２０．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリクス）
Ｃ₁₅Ｈ₁₇Ｎ₂Ｏ₆Ｃｌ₂（Ｍ＋１）：計算値，３９１．０４６４；実測値，３９１．０４６２．
（２）１−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ジクロロアセトアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルバルデヒド（化合物２６）の合成（図３６のスキームにおける反応（ｄ）−（ｅ））。

化合物２４（１１８ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した。ピリジン（３．０ｍｌ）中の残渣に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１１３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間攪拌し、そしてＥｔＯＡｃおよび５％ＮａＨＣＯ₃に加えた。有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮した。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中、１％メタノール）で精製して１９７ｍｇの化合物２５を収率９５％で得た。

化合物２５（１８８ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸させた。ピリジン（２．７ｍｌ）中の残渣に無水酢酸（１０３μｌ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１２時間攪拌し、そしてＥｔＯＡｃおよび５％ＮａＨＣＯ₃に加えた。有機層は飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮した。ジクロロメタン（２７ｍｌ）中の残渣にジクロロ酢酸（２７０μｌ）を０℃で加えた。混合物を０℃で１５分間攪拌し、５％水性炭酸水素ナトリウム水溶液へ注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた後、溶液を減圧下で濃縮した。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中、１％メタノール）で精製し、１１８ｍｇの化合物２６を収率９２％で得た。

化合物２５：
¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
９．５６（ｓ，１Ｈ），９．０５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），
７．７２（ｓ，１Ｈ），７．３８−７．２０（ｍ，１０Ｈ），
６．８７（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），６．４７（ｓ，１Ｈ），
６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），
５．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），
５．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），
４．１２−４．００（ｍ，５Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），
３．２２（ｍ，２Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリクス）
Ｃ₃₆Ｈ₃₅Ｎ₂Ｏ₈Ｃｌ₂（Ｍ＋１）：計算値，６９３．１７７０；実測値，６９３．１７２１．
化合物２６：
¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
９．５０（ｓ，１Ｈ），９．１０（ｂｓ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），
７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），６．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），
６．４８（ｓ，１Ｈ），５．４３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），
５．３５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），５．３２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），
４．１７（ｍ，３Ｈ），３．７３（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｍ，１Ｈ），
２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリクス）
Ｃ₁₉Ｈ₂₁Ｎ₂Ｏ₈Ｃｌ₂（Ｍ＋１）：計算値，４７５．０６７５；実測値，４７５．０６８７．
（３）１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−ビオチンアミド−１−プロピニル）］ピロール−２−カルバルデヒド５’−トリフォスフェート（化合物２８）の合成（図３６のスキームにおける反応（ｆ）−（ｇ））。

保護されたヌクレオシド２６（４７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、減圧下で濃縮した。残渣をピリジン（１００μｌ）およびジオキサン（３００μｌ）に溶解した。ジオキサン中の２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍ溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、トリ−ｎ−ブチルアミン（１００μｌ）およびＤＭＦ中０．５Ｍビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェート（３００μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を反応混合物に素早く加えた。混合物を室温で１０分間攪拌した。次いで、ピリジン／水（９８／２，ｖ／ｖ）中の１％ヨード溶液（２．０ｍｌ）を加えた。１５分後、ＮａＨＳＯ₃の５％水性溶液（１５０μｌ）を加えた。揮発性の成分をエバポレーションで除き、そして次いで水（５．０ｍｌ）を残渣に加えた。混合物を室温で３０分間攪拌し、そして次いで、濃アンモニア（２０ｍｌ）で室温、１２時間処理した。溶液を減圧下で濃縮し、そして生成物をＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１ＭＴＥＡＢのリニアグラジエントで溶出した）で精製し、そして次いで、Ｃ１８−ＨＰＬＣ（１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム中０％から３０％ＣＨ₃ＣＮのグラジエントにより溶出した）により精製して、ヌクレオシド５’−トリフォスフェート２７を得た。

凍結乾燥後、０．１ＭＮａＨＣＯ₃−Ｎａ₂ＣＯ₃緩衝液（５ｍｌ、ｐＨ８．６）中の化合物２７を、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９００μｌ、ＤＭＦ溶液中０．１４Ｍ）と室温で３時間反応させた。混合物を２８％ＮＨ₄ＯＨ（２ｍｌ）で１時間処理した。生成物をＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１ＭＴＥＡＢへのリニアグラジエントにより溶出した）、および次いでＣ１８−ＨＰＬＣ（１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム中、０％から３０％ＣＨ₃ＣＮのグラジエントにより溶出した）により精製し、ヌクレオシド５’−トリフォスフェート２８を、化合物２６から１４％の収率で得た。化合物２８の構造は、¹ＨＮＭＲ（図４３ａおよびｂ）、³¹ＰＮＭＲ（図４３ｃ）、および質量分析（図４２）により確認した。化合物２８のビオチン部分のプロトンシグナルは、以前に合成したビオチン化ｙＴＰのそれと同一であり、Ｄ₂Ｏ中の³¹ＰＮＭＲスペクトルは、ヌクレオチド５’−トリフォスフェートに対応する典型的なリンのシグナルを示した。

化合物２７：
エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₃Ｈ₁₉Ｏ₁₄Ｎ₂Ｐ₃：計算値，５１９．００（Ｍ−Ｈ）^-；実測値，５１８．９８（Ｍ−Ｈ）^-．
化合物２８：
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
９．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．８６（ｓ，１Ｈ），
７．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），６．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），
４．３９−４．３３（ｍ，３Ｈ），４．２３−４．１５（ｍ，４Ｈ），
４．０６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），３．１８（ｍ，１Ｈ），
３．１２（ｑ，２４Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９および１３．１Ｈｚ），
２．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ），
２．２３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．６０（ｍ，４Ｈ），
１．３２（ｍ，２Ｈ），１．２０（ｔ，３６Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
³¹ＰＮＭＲ（１０７ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−８．９６（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ），
−１０．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ），
−２２．３６（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ）．
エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₂₃Ｈ₃₃Ｏ₁₆Ｎ₄Ｐ₃Ｓ：計算値，７４５．０７（Ｍ−Ｈ）^-；実測値，７４５．０７（Ｍ−Ｈ）^-．
ＵＶ−可視光スペクトル（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中，ｐＨ７．０），
λｍａｘ＝２５８ｎｍ（ε＝１．１×１０⁴），３０８ｎｍ（ε＝９．５×１０³）．
実施例ＶＤｓ−Ｐａ人工塩基対を介したＴ７転写によるＲＮＡの部位特異的ビオチン化
転写およびＰＣＲ増幅の双方におけるＤｓ−Ｐａ人工塩基対の選択性および可能性についてより詳細に試験するために、１５２−ｍｅｒＲＮＡ分子の部位特異的ビオチン化を行った。

ＲＮＡの部位特異的ビオチン化（１５２−ｍｅｒ）
転写（２０μｌ）は、３μＣｉ［γ−³²Ｐ］ＧＴＰ、２ｍＭ各天然型ＮＴＰ、０−４ｍＭＢｉｏ−ＰａＴＰ（ビオチン化されたＰａの基質：実施例ＩＶに記載したように化学合成した）、および３０ｎＭ鋳型（ＤＮＡ６およびＤＮＡｃｏｎｔ２（図６参照）、それぞれについて、ライゲーションにより得られた鋳型およびＰＣＲ増幅した鋳型を用いた）を用いて、６時間３７℃で行った。

ライゲーションにより得られたＤＮＡｃｏｎｔ５およびＤＮＡｃｏｎｔ６（図６参照）を用いた対照反応については、転写は、２ｍＭＢｉｏ−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−トリフォスフェート、ロシュ・アプライド・サイエンス）の存在下または非存在下で、２ｍＭＡＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰのみとともに行った。生成物を、７〜１０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル上で分析及び精製した。

ビオチン化ＲＮＡ転写物は、ストレプトアビジンを用いたゲルシフトアッセイによって検出した。２ｐｍｏｌの³²Ｐ−標識した転写物および１００ｐｍｏｌのストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の混合物（１０μｌ）を、５０ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で、２０℃で１時間インキュベートした。ビオチン化ＲＮＡ−ストレプトアビジン複合体を、７％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル上の電気泳動により分析した。Ｂｉｏ−Ｐａ導入位置を決定するために、各ＲＮＡ（１５２−ｍｅｒ）を、仔ウシ腸由来アルカリフォスファターゼ（Ｔａｋａｒａ）で５’−末端を脱リン酸化した後、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（パーキン・エルマー）で標識した。標識されたＲＮＡを、ＲＮａｓｅＴ１で、４．７Ｍ尿素、０．７ｍＭＥＤＴＡ、および０．１７ｍｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡを含む１３．３ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、５５℃で１２分間、ならびに、アルカリで、０．６ｍＭＥＤＴＡを含む３２ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）中、９０℃で１５分間、部分消化した。アルカリ消化したＲＮＡ溶液（９μｌ）を、１５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）（１１μｌ）と混合し、そして混合物（１０μｌ）をストレプトアビジン磁気ビーズ（０．４ｍｇ）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）とともに５分間、室温でインキュベートし、ビオチン化されたＲＮＡを捕捉した。上清の一部（５μｌ）を、他の消化した試料と共に１０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル上で分析した。

結果
ビオチンが連結されたＰａ（Ｂｉｏ−Ｐａ）は、ライゲーションにより得られた鋳型およびＰＣＲ増幅した鋳型を用いて、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を介したＴ７転写によってＲＮＡへ導入された。ＲＮＡ分子（１５２−ｍｅｒ）へのＢｉｏ−Ｐａの導入を解析するために、ＤＮＡ６およびＤＮＡｃｏｎｔ２鋳型（図６参照）を用いて、天然型基質ＮＴＰ（２ｍＭ）およびＢｉｏ−ＰａＴＰ（２または４ｍＭ）存在下でＴ７転写を行った。Ｄｓ−Ｐａ塩基対を伴う転写効率は、天然型塩基のみを含むＤＮＡ断片であるＤＮＡｃｏｎｔ２を用いた場合（図４４ｃ、レーン３、７および１１）と比較して、４７−８５％であった（図４４ｃ、レーン２、６および１０）。ライゲーションにより得られたＤＮＡ６鋳型およびＰＣＲ増幅したＤＮＡ６鋳型を用いた転写では、Ｂｉｏ−ＰａＴＰの非存在下において、完全長産物の量が有意に低下した（図４４ｃ、レーン１、５および９）。これらの結果は、ＤＮＡ６をＰＣＲ増幅した際に、Ｄｓ−Ｐａ塩基対の天然型塩基対への置き換えがほとんど起こらなかったことを示す。

ＲＮＡへのＢｉｏ−Ｐａ導入選択性を、ストレプトアビジンを用いて、ビオチン化転写物のゲルシフトアッセイによって評価した。ストレプトアビジンとビオチンとの結合は非常に強く、特異的であることからゲルシフトした転写物の割合は、転写によるビオチン導入率（すなわち、ビオチン化転写物の収率）とほぼ同じと考えられる。天然型の基質と等量である２ｍＭＢｉｏ−ＰａＴＰ、およびライゲーションにより得られたＤＮＡ６鋳型を用いた転写において、９０％の転写物がビオチン化され（図４４ｄ、レーン２）、そしてＢｉｏ−ＰａＴＰ濃度を増加させると（４ｍＭ）導入率が９６％に向上した（図４４ｄ、レーン４）。天然型塩基に対するＢｉｏ−ＰａＴＰの誤った導入については、２または４ｍＭＢｉｏ−ＰａＴＰの存在下でＤＮＡｃｏｎｔ２を鋳型として用いた転写実験で評価したところ、ビオチン化転写物の収率はそれぞれ９および１６％であった（図４４ｄ、レーン６および７）。これらの誤った導入は、１５２−ｍｅｒ転写物の１つの塩基の位置あたりわずか０．０６％（全体で９％）、および０．１２％（全体で１６％）と概算された。ＰＣＲ増幅（２０サイクル）された鋳型を用いた転写において、Ｂｉｏ−Ｐａの導入率は、３−４％ほど減少した（図４４ｄ、レーン９および１１）。この値は、配列解析（図３ｉ）によって見積もったＤｓ−Ｐａ塩基対部位の変異率（３−４％）と一致した。興味深いことに、天然型塩基に対するＢｉｏ−Ｐａの誤った導入は、天然型および人工塩基の基質の存在下でＰＣＲ増幅（２０サイクル）されたＤＮＡｃｏｎｔ２鋳型を用いた転写において、増加しなかった（図４４ｄ、レーン１３および１４）。したがって、天然型塩基に対するＤｓおよびＰａの誤った導入は、ＰＣＲ増幅の間非常に低いと考えられた。

また、Ｄｓ−Ｐａ塩基対のＴ７転写における選択性と、天然型のＡ−Ｔ（Ｕ）塩基対の選択性を比較した。鋳型鎖中の塩基Ｇ、ＣおよびＴに対するＢｉｏ−ＵＴＰの誤った導入を評価するために、鋳型鎖のコード領域に、Ａを１つのみ含む対照ＤＮＡ（ＤＮＡｃｏｎｔ５）およびＡを含まない対照ＤＮＡ（ＤＮＡｃｏｎｔ６）を合成した（図６参照）。ＤＮＡｃｏｎｔ５およびＤＮＡｃｏｎｔ６を鋳型に用いる転写では、０または２ｍＭＢｉｏ−ＵＴＰおよび他の天然型基質（２ｍＭＡＴＰ，ＧＴＰおよびＣＴＰ）を用いる以外は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対の系と同じ条件で行った。ＤＮＡｃｏｎｔ５の転写においては、Ａに対するＢｉｏ−Ｕの導入により、転写物は完全にビオチン化された（図４４ｄ、レーン１６）。しかしながら、ＤＮＡｃｏｎｔ６の転写において、鋳型鎖中の塩基Ｇ、ＣおよびＴに対するＢｉｏ−Ｕの誤った導入によって２１％の転写物がビオチン化された（図４４ｄ、レーン１８）。したがって、天然型塩基に対してＢｉｏ−ＰａＴＰが誤って導入される割合（９％および１６％、それぞれ図４４ｄ、レーン６および７）は、天然型塩基に対してビオチンを連結したＵＴＰ（Ｂｉｏ−ＵＴＰ）が誤って導入される割合（２１％）よりも低いことが明らかになった。このＢｉｏ−Ｕが誤って導入された割合（２１％）が、天然型基質に対してＢｉｏ−ＰａＴＰが２ｍｏｌ等量存在する条件においてさえ、Ｂｉｏ−Ｐａが天然型塩基に対して誤って導入される割合（１６％）よりも高かったことは特筆すべきである。よって、Ｄｓに対するＢｉｏ−Ｐａの導入はＡに対するＢｉｏ−Ｕの導入よりもわずかに効率が悪いが、Ｔ７転写において、鋳型鎖中の天然型塩基部位に対するＢｉｏ−Ｐａの誤った導入を排除する選択性は、鋳型鎖中の塩基Ｇ、ＴおよびＣの部位に対するＢｉｏ−Ｕの誤った導入を排除する選択性よりも高い。

転写物におけるＢｉｏ−Ｐａの導入部位を決定するために、ビオチン化転写物の配列を解析した。Ｂｉｏ−Ｐａが鋳型中のＤｓに対して正確に転写物に導入されたのであれば、転写物の５９位がビオチン化されている。５’末端が³²Ｐで標識された転写物をアルカリまたはＲＮａｓｅＴ１で部分消化し、電気泳動でその産物を解析した。Ｂｉｏ−Ｐａを含む転写物の配列ラダーにおいて、５９−ｍｅｒよりも大きい断片に対応するバンドがシフトした（図４４ｅ、レーン２および８）。また、アルカリ消化した断片をストレプトアビジンで処理してビオチン化断片を捕捉し、その残りを電気泳動した場合、５９−ｍｅｒよりも大きい断片はほぼ消失した（図４４ｅ、レーン２および９）。これらの結果は、転写物の５９位における部位特的なＢｉｏ−Ｐａの導入を示すものである。さらに、ＰＣＲ増幅（２０サイクル）された鋳型を用いた転写物（図４４ｅ、レーン７−１２）は、ライゲーションにより得られた鋳型を用いて得られた転写物（図４４ｅ、レーン１−６）と同じパターンを生じた。

したがって、この方法によるＲＮＡの部位特異的ビオチン化は、ＲＮＡの活性を損失することなく、ＲＮＡ分子を固定するのに有用である。ビオチンのような大きな残基で修飾された人工塩基ＰａがＲＮＡに効率よく組み込まれたので、フルオロフォアを連結したＰａなど、一連の機能性４−修飾Ｐａ塩基もまた、ＲＮＡに組み込むことができる。

実施例ＶＩ２−ニトロピロールの４位修飾ヌクレオシド誘導体の合成
２−ニトロピロールの４位修飾ヌクレオシド誘導体は、図４５に示すスキームによって合成した。

（１）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（図４５の化合物１）の合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ニトロピロール（７００ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）をＣＨ₃ＣＮ（１２ｍｌ）に溶解し、Ｎ−ヨードスクシンイミド（１．３８ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で２回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しシリカゲルカラム（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ＝５０：１、ｖ／ｖ）およびＨＰＬＣ（２５％−４０％ＣＨ₃ＣＮ、１０分、４０％−５０％ＣＨ₃ＣＮ、５分）で精製して化合物１を６０７ｍｇ（５６％）得た。未反応回収原料２１９ｍｇ（３１％）。

化合物１
¹ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ
７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），７．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），
６．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），
５．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．２３（ｍ，１Ｈ），
３．８３（ｍ，１Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｍ，１Ｈ），
２．４０（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｍ，１Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₉Ｈ₁₂ＩＮ₂Ｏ₅ （Ｍ＋１）：計算値３５４．９７９１；測定値３５４．９７８４．
（２）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニル−２−ニトロピロール（化合物２）の合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（化合物１）（２８０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₂Ｃｌ₂（５６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７．９ｍｌ）に溶解し、トリブチル（１−プロピニル）スズ（４８１μｌ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を１００℃で１．５時間加熱し、溶液を濃縮後シリカゲルカラム（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ、５０：１、ｖ／ｖ）およびＨＰＬＣ（３４％−３５％ＣＨ₃ＣＮ、１３分）で精製して化合物２を１２５ｍｇ（６０％）得た。

化合物２：
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ
７．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），
６．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），
５．１１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．２４（ｍ，１Ｈ），
３．８５（ｍ，１Ｈ），
３．６７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．３，１２．１Ｈｚ），
３．５７（ｍ，１Ｈ），２．４３（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｍ，１Ｈ），
１．９９（ｓ，３Ｈ）．
¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ
１３６．２１，１２９．１７，１１７．０８，１０５．２９，
８８．７４，８８．３０，８６．７５，７２．９１，６９．２１，
６０．８３，４２．５８，４．２９．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₁₂Ｈ₁₅Ｎ₂Ｏ₅ （Ｍ＋１）：計算値２６７．０９８１；測定値２６７．０９９１．
（３）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（ジクロロアセトアミド１−プロピニル）−２−ニトロピロール（化合物３）の合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（化合物１）（３５４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（５８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（３０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２０９μｌ、１．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．５ｍｌ）に溶解し、Ｎ−（２−プロピニル）−ジクロロアセトアミドの１ＭＤＭＦ溶液（１．５ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラム（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ、２０：１、ｖ／ｖ）およびＨＰＬＣ（３４％−３５％ＣＨ₃ＣＮ、１２分）で精製して化合物３を３１７ｍｇ（８１％）得た。

化合物３： ¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ
９．０１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），
７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），６．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），
６．４７（ｓ，１Ｈ），５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），
５．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．２３（ｍ，１Ｈ），
４．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．８４（ｍ，１Ｈ），
３．６６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５，５．２，１２．１Ｈｚ），
３．５６（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．６，１２．２Ｈｚ），２．４３（ｍ，１Ｈ），
２．２３（ｍ，１Ｈ）．
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｏ₆Ｎ₃Ｃｌ₂；計算値３９０．０３（Ｍ−Ｈ）^-；測定値３８９．８５（Ｍ−Ｈ）^-．
（４）１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−プロピニル−２−ニトロピロール２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルホスホルアミダイト（化合物６）の合成
化合物２（２００ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（７．５ｍｌ）を加え、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（２８０ｍｇ，０．８３ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ₃で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ，２００：１，ｖ／ｖ）して化合物４を３６５ｍｇ（８６％）得た。化合物４（１９０ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ＴＨＦ（１．７ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（８７μｌ，１．５当量）を加えた溶液に、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホルアミダイト（８２μｌ，０．３７ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液にメタノール（５０μｌ）を加え酢酸エチル：水（２０：１，ｖ／ｖ）で希釈し５％ＮａＨＣＯ₃を加えて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラム（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ヘキサン，１：４，ｖ／ｖ，２％トリエチルアミン）で精製して化合物６を２２３ｍｇ（８７％）得た。

化合物４：
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ
７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），７．４１−７．２３（ｍ，１０Ｈ），
６．８９（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），
５．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．３０（ｍ，１Ｈ），
３．９７（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），
３．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），２．４８−２．３２（ｍ，２Ｈ），
１．９２（ｓ，３Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₃₃Ｈ₃₃Ｎ₂Ｏ₇ （Ｍ＋１）：計算値５６９．２２８８；測定値５６９．２２４６．
化合物６：
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）： δ
７．６２及び７．５５（ｄ及びｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），
７．４８−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．３９−７．２２（ｍ，８Ｈ），
６．８７（ｍ，４Ｈ），６．６８（ｍ，１Ｈ），４．５６（ｍ，１Ｈ），
４．２５（ｍ，１Ｈ），３．８８−３．３５（ｍ，６Ｈ），
３．８２（ｓ及びｓ，６Ｈ），２．８５−２．７２（ｍ，１Ｈ），
２．６３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），
２．３６−２．２５（ｍ，１Ｈ），１．９５及び１．９３（ｓ及びｓ，３Ｈ），
１．２０−１．０８（ｍ，１２Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₄₂Ｈ₅₀Ｎ₄Ｏ₈Ｐ（Ｍ＋１）：計算値７６９．３３６６；測定値７６９．３１６６．
（５）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニル−２−ニトロピロール５’−三リン酸（化合物９）の合成
化合物４（１６０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（２．８ｍｌ）を加え、無水酢酸（５３μｌ，０．５６ｍｍｏｌ）を加えて反応溶液を室温で１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ₃で分液し、５％ＮａＨＣＯ₃で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しトルエンで共沸した後、塩化メチレン２８ｍｌに溶解させた。この反応溶液にジクロロ酢酸（２８０μｌ）を０℃で加えて１５分、０℃で撹拌した。５％ＮａＨＣＯ₃を反応溶液に加えて分液し、有機層を５％ＮａＨＣＯ₃で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して化合物７を７８ｍｇ（９０％、２工程）得た。化合物７（３１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（１００μｌ）とジオキサン（３００μｌ）を加えた後、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン（１１０μｌ，ジオキサンの１Ｍ溶液）を加えて１０分間室温で撹拌した。トリ−ｎ−ブチルアミン（１００μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（３００μｌ，ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液）を反応溶液に加えて１０分間撹拌した。Ｉ₂／ピリジン（２．０ｍｌ，ピリジン中の１％ヨード：Ｈ₂Ｏ，９８：２，ｖ／ｖ）を加えて１５分間撹拌後、５％ＮａＨＳＯ₃（１５０μｌ）を加えて反応溶液を濃縮した。Ｈ₂Ｏ（５．０ｍｌ）を加えて室温で３０分間撹拌後、２８％アンモニア水を２０ｍｌ加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を濃縮、凍結乾燥した後、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５で精製（５０ｍＭ−１．０ｍＭＴＥＡＢ直線勾配）し、目的とする化合物９を得た。

化合物７：
¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ
７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），
６．６０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），５．２２（ｍ，２Ｈ），
４．１３（ｍ，１Ｈ），３．６５（ｍ，２Ｈ），
２．６２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０，６．０，１４．３Ｈｚ），
２．４３（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₁₄Ｈ₁₇Ｎ₂Ｏ₆ （Ｍ＋１）：計算値３０９．１０８７；測定値３０９．１０６６．
化合物９：
エレクトロスプレーイオン化マススペクトロスコピー（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｃ₁₂Ｈ₁₇Ｏ₁₄Ｎ₂Ｐ₃；計算値５０４．９８（Ｍ−Ｈ）^-；測定値５０５．９５（Ｍ−Ｈ）^-．
（６）１−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（ジクロロアセトアミド１−プロピニル）−２−ニトロピロール（化合物８）の合成
化合物３（３０５ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（７．８ｍｌ）を加え、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（２９１ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ₃で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラム（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＥｔＯＡｃ，９：１，ｖ／ｖ）で精製して化合物５を５２６ｍｇ（９７％）得た。化合物５（５１５ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸した後、ピリジン（７．４ｍｌ）を加え、無水酢酸（２８０μｌ，３．０ｍｍｏｌ）を加えて反応溶液を室温で１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ₃で分液し、５％ＮａＨＣＯ₃で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮しトルエンで共沸した後、塩化メチレン７４ｍｌに溶解させた。この反応溶液にジクロロ酢酸（７４０μｌ）を０℃で加えて１５分間、０℃で撹拌した。５％ＮａＨＣＯ₃を反応溶液に加えて分液し、有機層を５％ＮａＨＣＯ₃で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラム（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ，５０：１，ｖ／ｖ）で精製して化合物８を２８９ｍｇ（９０％，２工程）得た。

化合物５： ¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ
９．０７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），
７．４１−７．２１（ｍ，１０Ｈ），
６．８９（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝１．７，８．９Ｈｚ），
６．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），６．４８（ｓ，１Ｈ），
５．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），４．２９（ｍ，１Ｈ），
４．１２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），３．９９（ｍ，１Ｈ），
３．７４（ｓ，６Ｈ），３．１７（ｍ，２Ｈ），
２．４６−２．３３（ｍ，２Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₃₅Ｈ₃₄Ｎ₃Ｏ₈Ｃｌ₂ （Ｍ＋１）：計算値，６９４．１７２３；測定値６９４．１７２９．
化合物８： ¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ
９．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），
７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），６．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），
６．４９（ｓ，１Ｈ），５．２３（ｍ，２Ｈ），
４．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），４．１３（ｍ，１Ｈ），
３．６８（ｍ，２Ｈ），
２．６３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０，６．０，１４．３Ｈｚ），
２．４４（ｍ，１Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₁₆Ｈ₁₈Ｎ₃Ｏ₇Ｃｌ₂ （Ｍ＋１）：計算値４３４．０５２２；測定値４３４．０５４９．
実施例ＶＩＩＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ、ＲＯＸ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰの合成
本実施例では、ｄＰｎＴＰに関する誘導体として、ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ、ＲＯＸ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰを、図４６に示す合成スキームに従って合成した。これらの誘導体は、例えば複製（ＰＣＲやプライマー伸長）でＤＮＡ中に導入することが可能である。アミノ基の誘導体は、導入後のＤＮＡの修飾に用いることが出来、それ以外の蛍光基を結合した各誘導体は、ＤＮＡの蛍光標識、ならびに、ＦＲＥＴなどに応用が可能である。

（１）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール（図４６の工程（ａ））
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（３５４ｍｇ、１ｍｍｏｌ、αアノマーを含む）を５０ｍＬナス型フラスコ中、無水アセトニトリルで共沸を２回行った。ヨウ化銅（３１ｍｇ、１６０μｍｏｌ））、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（５８ｍｇ、５０μｍｏｌ）を加え、これらを無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエチルアミン（２１０μＬ，１．５ｍｍｏｌ）を加え、遮光下室温で攪拌した。これにＮ−（２−プロピニル）−６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド（３９６ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を滴下し、室温で一晩攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５−１０％ＣＨ₃ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（３９−４１％ＣＨ₃ＣＮ、Ｈ₂Ｏ中、１５分）で精製し、目的物をアモルファス状物質（４０８ｍｇ，収率８３％）として得た。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
９．３８（ｂｒｓ，１Ｈ），８．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），
７．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），
６．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），
５．２０−５．０５（ｍ，１Ｈ），４．３０−４．２０（ｍ，１Ｈ），
４．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），３．８３（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），
３．７０−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．５０−２．３６（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．１７（ｍ，１Ｈ），
２．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．５８−１．４０（ｍ，４Ｈ），
１．２８−１．１６（ｍ，２Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₂₀Ｈ₂₆Ｆ₃Ｎ₄Ｏ₇ （Ｍ＋１）：計算値４９１．１７５４；測定値４９１．１７６１．
（２）１−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール（工程（ｂ）、（ｃ））
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール（３９４ｍｇ、８０３μｍｏｌ）を５０ｍＬナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行った。これを無水ピリジン（４ｍＬ）に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル（２８６ｍｇ、８４４μｍｏｌ）を加え、室温で１時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチル／水中に加え、水層を除去した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−０．５％ＣＨ₃ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中）で精製し、トリチル化体をアモルファス状物質（５４３ｍｇ）として得た。１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール（５４２ｍｇ、６８４μｍｏｌ）を３０ｍＬナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行った。これを無水ピリジン（７ｍＬ）に溶解させ、酢酸無水物（１６９μＬ，１．７９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物を無水ジクロロメタン（６８ｍＬ）に溶解させ、０℃で攪拌させながらジクロロ酢酸（６８０μＬ）を加え、１５分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に加え、水層をジクロロメタンで抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％ＣＨ₃ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中）で精製し、目的物をアモルファス状物質（３２８ｍｇ、７７％，２段階収率）として得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
９．３９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），
７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），
６．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），５．３０−５．１８（ｍ，２Ｈ），
４．２０−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），
３．７５−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），
２．６２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０，６．０，１４．２Ｈｚ），
２．５０−２．３５（ｍ，１Ｈ），２．１５−２．０５（ｍ，２Ｈ），
２．０７（ｓ，３Ｈ），１．６０−１．４０（ｍ，４Ｈ），
１．３０−１．２０（ｍ，２Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₂₂Ｈ₂₈Ｆ₃Ｎ₄Ｏ₈ （Ｍ＋１）：計算値５３３．１８５９；測定値５３３．１９０７．
（３）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール５’−三リン酸（ＮＨ₂−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ）（工程（ｄ））
１−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール（５３ｍｇ、１００μｍｏｌ）を１０ｍＬナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン（１００μＬ）および無水ジオキサン（３００μＬ）を加えて溶解させ、２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍジオキサン溶液（１１０μＬ、１１０μｍｏｌ）を加えて室温で１０分間攪拌したのちに、トリ−ｎ−ブチルアミン（１００μＬ）およびビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸の０．５ＭＤＭＦ溶液（３００μＬ）を加えて１０分間攪拌した。１％ヨウ素／水／ピリジン溶液（２ｍＬ）を加え、室温で１５分間攪拌し、５％亜硫酸水素ナトリウム水溶液（１５０μＬ）を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水（５ｍＬ）を加え、室温で３０分間攪拌した後に濃アンモニア水（２０ｍＬ）を加えて８時間攪拌した。これをＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；ｘ％―ｘｘ％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物を得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
７．７９（ｓ，１Ｈ），７．３１（ｓ，１Ｈ），
６．６８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．６０−４．５０（ｍ，１Ｈ），
４．３０−４．００（ｍ，５Ｈ），３．１３（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．９０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．６２−２．５２（ｍ，１Ｈ），
２．４６−２．３０（ｍ，１Ｈ），２．２４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），
１．６３−１．５５（ｍ，４Ｈ），１．３８−１．１６（ｍ，２９Ｈ）．
³¹ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−８．２６， −１０．５１， −２２．０５．
ＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ₁₈Ｈ₂₈Ｎ₄Ｏ₁₅Ｐ_3, ［Ｍ−Ｈ］⁻：計算値６３３．０８；測定値６３３．００．
（４）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−［６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］−２−ニトロピロール５’−三リン酸（ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ）（工程（ｅ））
ＮＨ₂−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（６μｍｏｌ）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５，０．７２ｍＬ）に溶解させ、５−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＦＡＭ−ＳＥ）（３．７ｍｇ，７．８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５００μＬ）を加えて、時々振とうさせながら遮光下室温で８時間反応させた。これに濃アンモニア水（０．５ｍＬ）を加え、時々振とうさせながら５分間反応させた。これを凍結乾燥させた後、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；０％―５０％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物を得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
８．２９（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），
７．５８（ｂｒｓ，１Ｈ），７．２６（ｄ，１Ｈ，７．５Ｈｚ），
７．００−６．６０（ｍ，７Ｈ），６．３９（ｂｒｓ，１Ｈ），
４．５０−４．３５（ｍ，１Ｈ），４．４０−３．９０（ｍ，５Ｈ），
３．５０−３．３０（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．４１−２．１０（ｍ，４Ｈ），１．７５−１．５０（ｍ，４Ｈ），
１．４５−１．１０（ｍ，２９Ｈ）．
³¹ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−１０．８６， −１０．８６， −２３．１３．
ＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ₃₉Ｈ₃₈Ｎ₄Ｏ₂₁Ｐ₃ ［Ｍ−Ｈ］⁻：計算値９９１．１２；測定値９９０．５６
（５）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−［６−（ローダミン−Ｘ−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］−２−ニトロピロール５’−三リン酸（ＲＯＸ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ）（工程（ｅ））
ＮＨ₂−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（６μｍｏｌ）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５，０．８５ｍＬ）に溶解させ、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＲＯＸ−ＳＥ）（５ｍｇ、７．９２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を加えて、時々振とうさせながら遮光下室温で１８時間反応させた。これに濃アンモニア水（０．５ｍＬ）を加え、時々振とうさせながら５分間反応させた。これを凍結乾燥させた後、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ、濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；１２．５％―５０％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物を得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
８．２８（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），
７．４７（ｓ，１Ｈ），７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），
６．６８（ｂｒｓ，１Ｈ），６．５５（ｂｒｓ，１Ｈ），
６．４３（ｂｒｓ，１Ｈ），６．０９（ｂｒｓ，１Ｈ），
４．４０−４．２５（ｍ，１Ｈ），４．１５−３．７０（ｍ，５Ｈ），
３．６０−３．２７（ｍ，１０Ｈ），３．１２（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．９５−２．７０（ｍ，４Ｈ），２．６５−２．４０（ｍ，４Ｈ），
２．４０−２．１５（ｍ，３Ｈ），２．０５−１．７０（ｍ，９Ｈ），
１．６０−１．５０（ｍ，４Ｈ），１．５０−１．１５（ｍ，２９Ｈ）．
³¹ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−１０．９０， −１１．５９， −２３．２７．
ＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ₅₁Ｈ₅₆Ｎ₆Ｏ₁₉Ｐ₃ ［Ｍ−Ｈ］⁻：計算値１１４９．２８；測定値１１４８．７７
実施例ＶＩＩＩＮＨ２−ｈｘ−ＰａＴＰ、ＦＡＭ−ｈｘ−ＰａＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｈｘ−ＰａＴＰの合成
本実施例では、ｒＰａＴＰに関する誘導体として、ＮＨ２−ｈｘ−ＰａＴＰ、ＦＡＭ−ｈｘ−ＰａＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｈｘ−ＰａＴＰを図４７に示す合成スキームし従って合成した。これらの誘導体は、例えば転写でＲＮＡ中に導入することが可能である。アミノ基の誘導体は、導入後のＲＮＡの修飾に用いることが出来、それ以外の蛍光基を結合した各誘導体は、ＲＮＡの蛍光標識、ならびにＦＲＥＴなどに応用が可能である。

（１）１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルボアルデヒド（図４７の工程（ａ））
１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピロール−２−カルボアルデヒド（１７７ｍｇ、５００μｍｏｌ，αアノマーを含む）を１０ｍＬナス型フラスコ中、無水アセトニトリルで共沸を２回行った。ヨウ化銅（１５ｍｇ、８０μｍｏｌ））、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（２９ｍｇ，２５μｍｏｌ）を加え、これらを無水ＤＭＦ（２．５ｍＬ）に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエチルアミン（１０５μＬ，７５０μｍｏｌ）を加え、遮光下室温で攪拌した。これにＮ−（２−プロピニル）−６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド（１９８ｍｇ、７５０μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を滴下し、室温で一晩攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％ＣＨ₃ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（２２−２４％ＣＨ₃ＣＮ、Ｈ₂Ｏ中、１５分）で精製し、目的物をアモルファス状物質（１２６ｍｇ、収率５１％）として得た。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
９．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．６６Ｈｚ），９．３８（ｂｒｓ，１Ｈ），
８．２７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．９６（ｓ，１Ｈ），
７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），６．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），
５．４２−５．３２（ｂｒｓ，１Ｈ），５．１８−５．０５（ｍ，２Ｈ），
４．０８−３．９５（ｍ，４Ｈ），３．９０−３．８４（ｍ，１Ｈ），
３．７０−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．２０−３．１０（ｍ，２Ｈ），
２．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．５５−１．４０（ｍ，４Ｈ），
１．３０−１．１５（ｍ，２Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₂₁Ｈ₂₇Ｆ₃Ｎ₃Ｏ₇ （Ｍ＋１）：計算値４９０．１８０１；測定値４９０．１８１５．
（２）１−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルボアルデヒド（工程（ｂ）、（ｃ））

１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルボアルデヒド（１２２ｍｇ，２５０μｍｏｌ）を１０ｍＬナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行った。これを無水ピリジン（４ｍＬ）に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル（８９ｍｇ、２６３μｍｏｌ）を加え、室温で２時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチル／水中に加え、水層を除去した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−０．５％ＣＨ₃ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中）で精製し、トリチル化体をアモルファス状物質（１５０ｍｇ）として得た。１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルボアルデヒド（１４９ｍｇ、１８８μｍｏｌ）を１０ｍＬナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行った。これを無水ピリジン（２ｍＬ）に溶解させ、酢酸無水物（５３μＬ，５６５μｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物を無水ジクロロメタン（１９ｍＬ）に溶解させ、０℃で攪拌させながらジクロロ酢酸（２８０μＬ）を加え、１５分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に加え、水層をジクロロメタンで抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１−２．５％ＣＨ₃ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中）で精製し、目的物をアモルファス状物質（９０ｍｇ、６３％，２段階収率）として得た。

¹ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
９．４９（ｓ，１Ｈ），９．３９（ｂｒｓ，１Ｈ），
８．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），８．０３（ｓ，１Ｈ），
７．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），６．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），
５．４４（ｂｒｓ，１Ｈ），５．４０−５．２８（ｍ，３Ｈ），
４．２０−４．１５（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），
３．８０−３．５６（ｍ，２Ｈ），３．２０−３．１０（ｍ，２Ｈ），
２．１４−１．９８（ｍ，８Ｈ），１．５５−１．４０（ｍ，４Ｈ），
１．３０−１．１５（ｍ，２Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡｍａｔｒｉｘ）
Ｃ₂₅Ｈ₃₁Ｆ₃Ｎ₃Ｏ₉ （Ｍ＋１）：計算値５７４．２０１２；測定値５７４．２０６１．
（３）１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（ＮＨ₂−ｈｘ−ＰａＴＰ）（工程（ｄ））
１−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［（３−（６−トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］ピロール−２−カルボアルデヒド（５７ｍｇ、１００μｍｏｌ）を１０ｍＬナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン（１００μＬ）および無水ジオキサン（３００μＬ）を加えて溶解させ、２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍジオキサン溶液（１１０μＬ、１１０μｍｏｌ）を加えて室温で１０分間攪拌したのちに、トリ−ｎ−ブチルアミン（１００μＬ）およびビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸の０．５ＭＤＭＦ溶液（３００μＬ）を加えて１０分間攪拌した。１％ヨウ素／水／ピリジン溶液（２ｍＬ）を加え、室温で１５分間攪拌し、５％亜硫酸水素ナトリウム水溶液（１５０μＬ）を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水（５ｍＬ）を加え、室温で３０分間攪拌した後に濃アンモニア水（２０ｍＬ）を加えて８時間攪拌した。これをＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；０％―５０％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物を得た。

ＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ₁₉Ｈ₂₉Ｎ₃Ｏ₁₅Ｐ₃ ［Ｍ−Ｈ］⁻：計算値６３２．０８；測定値６３２．００
（４）１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（ＦＡＭ−ｈｘ−ＰａＴＰ）（工程（ｅ））
上記で合成したＮＨ₂−ｈｘ−ＰａＴＰの１／３量を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５、２．５ｍＬ）に溶解させ、５−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（９ｍｇ、１９μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２００μＬ）を加えて、時々振とうさせながら遮光下室温で９時間反応させた。これに濃アンモニア水（１ｍＬ）を加え、時々振とうさせながら１時間反応させた。これを凍結乾燥させた後、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；０％―５０％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物を得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
９．０７（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），
７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．６２（ｂｒｓ，１Ｈ），
７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．００−６．６０（ｍ，７Ｈ），
６．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），４．２５−３．８０（ｍ，７Ｈ），
３．４０−３．２０（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．６５−１．４５（ｍ，４Ｈ），
１．４０−１．００（ｍ，２９Ｈ）．
³¹ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
−１０．９０， −１１．３８， −２３．２５．
ＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ₄₀Ｈ₃₉Ｎ₃Ｏ₂₁Ｐ₃ ［Ｍ−Ｈ］⁻：計算値９９０．１３；測定値９８９．７８．
（５）１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−（テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］ピロール−２−カルボアルデヒド５’−三リン酸（ＴＡＭＲＡ−ｈｘ−ＰａＴＰ）（工程（ｅ））
上記で合成したＮＨ₂−ｈｘ−ＰａＴＰの１／３量を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５，２．５ｍＬ）に溶解させ、５−カルボキシテトラメチルローダミンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）（１０ｍｇ、１９μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を加えて、時々振とうさせながら遮光下室温で９時間反応させた。これに濃アンモニア水（１ｍＬ）を加え、時々振とうさせながら８時間反応させた。これを凍結乾燥させた後、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；１２．５％―５０％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物を得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ
９．０７（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ），
８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．６９（ｓ，１Ｈ），
７．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），
７．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），６．８８−６．７０（ｍ，３Ｈ），
６．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），
４．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），４．１０−３．８０（ｍ，６Ｈ），
３．５５−３．３０（ｍ，２Ｈ），３．２５−３．００（ｍ，３０Ｈ），
２．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．７５−１．５５（ｍ，４Ｈ），
１．４０−１．１０（ｍ，２９Ｈ）．
³¹ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ） δ −１０．８４， −１１．５６， −２３．２２．
ＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ₄₄Ｈ₄₉Ｎ₅Ｏ₁₉Ｐ₃ ［Ｍ−Ｈ］⁻：計算値１０４４．２２；測定値１０４４．０９．
実施例ＩＸクレノウフラグメントを用いた複製による、アミノ基や蛍光色素を結合した基質ＰｎのＤＮＡ（５５−ｍｅｒ）中への導入
本実施例では、リンカーを介してアミノ基や蛍光色素（ＦＡＭ）を結合した基質Ｐｎ（ＮＨ₂−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ）（実施例ＶＩＩで作成）を用いて、複製によるこれらの基質のＤＮＡ中への取り込みを調べた。

具体的には、以下のような実験手法を採用した。種々の位置にＤｓを含む鋳型鎖ＤＮＡ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ，５５−ｍｅｒ；１Ｄｓ，２Ｄｓ，３Ｄｓ，４Ｄｓ，５Ｄｓ（配列番号３３−３７）または対照（配列番号３８））とフルオレセインで蛍光標識されたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ，２０−ｍｅｒ）からなる二本鎖をふくむ溶液（１０μｌ）に、滅菌水で希釈されたデオキシヌクレオシド三リン酸溶液（５μｌ）と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したクレノウフラグメント（２Ｕ、５μｌ）を混合し、プライマー伸長反応を行った（２０μｌスケール）。反応は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、０．０５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中で、２００ｎＭＴｅｍｐｌａｔｅ−Ｐｒｉｍｅｒ、１００μＭまたは２００μＭｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）、１０μＭＮＨ₂−ｈｘ−ｄＰｎＴＰもしくはＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ、０．１μＵ／μｌクレノウフラグメント（ＧＥヘルスケア）を用いて行われた。３７℃で５分間反応を行った後、この溶液に１０Ｍ尿素（２０μｌ）を加えて反応を停止させた。その溶液を７５℃で３分間加熱した後、反応産物を１０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルによる電気泳動で解析した。反応産物のバンドを蛍光イメージアナライザ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒ、バイオラッド、ＦＡＭ検出モード）により検出した。

結果を図４８Ｂ及びＣに示す。Ｐｎの修飾基質の非存在下と比較して、ＮＨ₂−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（図４８Ｂ及びＣ）またはＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（図４８Ｃ）の存在下で全長の産物量が増加したことから、鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓに相補して、ＤＮＡ中にこれらの修飾ｄＰｎＴＰが取り込まれることがわかった。

実施例ＸＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写による、蛍光色素を結合した基質ＰａのＲＮＡ（１７−ｍｅｒ）中への導入
本実施例では、蛍光色素（ＦＡＭあるいはＴＡＭＲＡ）をリンカーを介して結合した基質Ｐａ（ＦＡＭ−ｈｘ−ＰａＴＰ，ＴＡＭＲＡ−ｈｘ−ＰａＴＰ）（実施例ＶＩＩＩで作成）を用いて、転写によるこれらの基質のＲＮＡ中への取り込みを調べた。

具体的には、以下のような実験手法を採用した。１０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で、鋳型ＤＮＡ（３５−ｍｅｒ，１０μＭ）とそのプロモーター部分の相補鎖ＤＮＡ（２１−ｍｅｒ、１０μＭ）のアニーリングを行った。転写反応は、４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２４ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭスペルミジン、５ｍＭＤＴＴ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で、２μＣｉ［γ−³²Ｐ］ＧＴＰ、１ｍＭＮＴＰｓ、１ｍＭＦＡＭ−，又はＴＡＭＲＡ−ｈｘ−ＰａＴＰ、２μＭ鋳型ＤＮＡ、および５０単位Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行われた。３７℃で３時間反応を行った後、この溶液に１０Ｍ尿素（２０μＬ）を加えて反応を停止させた。その溶液を７５℃で３分間加熱した後、転写物を２０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルによる電気泳動で解析した。

結果を図４９に示す。Ｄｓを含む鋳型ＤＮＡを用いた場合のみ、電気泳動上で転写物（１７−ｍｅｒ）のバンドの移動度が遅くなることから、鋳型中のＤｓに相補して、ＲＮＡ中にこれらの修飾ＰａＴＰが導入されたことがわかった。転写効率は、天然型のみのコントロール実験（図４９中右側のＮｏｎｅのレーン）と比較して、ＦＡＭ−ｈｘ−ＰａＴＰは１４％、ＴＡＭＲＡ−ｈｘ−ＰａＴＰは１０％であった。

産業上利用の可能性

本発明者らは、複製および転写で実用レベルの高い選択性を有する非天然型塩基対システムを開発し、これにより遺伝アルファベットを拡張した新たなバイオテクノロジーの創出が可能になる。疎水性Ｄｓ−Ｐａ塩基対は、これを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅することができる。さらに、Ｄｓ−Ｐａ塩基対により、通常のＴ７転写でＤｓおよびＰａを部位特異的にＲＮＡ中に導入することもできる。したがって、該システムは、新たな機能性の人工ＤＮＡおよびＲＮＡを作成するための新規技術を提供する。加えて、修飾基質および疎水性塩基対は、複製および転写の機構のさらなる解明においても科学的に重要である。

複製において、本発明者らは、Ｄｓ−Ｄｓ、天然型−非天然型塩基対のような望ましくない塩基対合を防ぐために、５’−γ−アミド三リン酸および通常の５’−三リン酸を組み合わせることにより非天然型塩基対合の高い選択性を達成した。５’−γ−アミド三リン酸は、対合塩基間の正しい相補性を認識するためのＤＮＡポリメラーゼ基質として有用である。最近、別の５’−γ−修飾三リン酸である、５’−γ−Ｐ−アミノナフタレン−５−スルフォネート三リン酸が、逆転写の忠実度を改善することが報告された（非特許文献３８）。これらの発見は、ＤＮＡポリメラーゼのγ−修飾三リン酸の認識は、通常の三リン酸基質の幾何学的適合よりも対合塩基間の正確な幾何学的適合を必要とすることを示唆する。５’−γ−アミド三リン酸および３’ →５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの組み合わせは、他の非天然型塩基対にも適用が可能である。

Ｄｓ−Ｐａ塩基対は、疎水性塩基対が転写において機能する最初の例を提供し、これは既に複製で示されたように、疎水性の塩基対が転写においても対合塩基間の形の相補性が重要性であることを示唆する。

Ｄｓ−Ｐａ塩基対システムは、新規機能性ＲＮＡ分子を作り出すために非常に有用である。４−プロピニルピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ’）も、鋳型中のＤｓに対して相補的にＲＮＡに部位特異的に導入されるので、４位を修飾した一連のＰａ塩基誘導体もＲＮＡ中に導入することも可能である。その際に鋳型ＤＮＡは、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を含むＤＮＡ断片のＰＣＲにより増幅することができる。したがって、Ｄｓ−Ｐａ塩基対システムは、任意の位置に機能性の人工コンポーネントを導入した核酸を作成するための強力な道具となる。

Claims

核酸の複製の方法であって、複製反応においてアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を基質として用いることを特徴とする、方法。
前記置換基が、アミノ基である、請求項１に記載の方法。
複製反応において、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項１又は２に記載の方法。
エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、クレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及び好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が、非天然型の塩基を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が、天然型の塩基を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が、以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
基質となるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が、以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ^３は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ_１−Ｃ_３アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ^４は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
アミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸。
ジメチルアミノ基及びメルカプト基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、請求項９に記載のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸。
アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されており、かつ非天然型の塩基を有する、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸。
アミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されており、かつ天然型の塩基を有するデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸。
天然型の塩基がアデニンである、請求項１２に記載のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸。
アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸の複製のための方法における、基質としての使用。
以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして、
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するヌクレオチドと、
以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ^３は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ_１−Ｃ_３アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ^４は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するヌクレオチドとが、塩基対を形成している核酸。
式１の塩基が、以下の
Ａ１）７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ２）７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ３）７−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ４）５−アミノ−７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ５）５−アミノ−７−（２−チアゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ６）５−アミノ−７−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基；
Ａ７）４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基；
Ａ８）４−（２−チアゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基；
Ａ−９）４−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基：
Ａ−１０）６−アミノ−４−（２−チエニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基；
Ａ−１１）６−アミノ−４−（２−チアゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基；及び
Ａ−１２）６−アミノ−４−（１Ｈ−２−イミダゾリル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基
からなるグループから選択される、請求項１５に記載の核酸。
式２の塩基が、以下の
Ｂ１）２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基
Ｂ２）２−ホルミル−４−ヨード−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ３）２−ホルミル−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ４）２−ホルミル−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ５）２−ホルミル−４−（２−置換アミノビニル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ６）２−ホルミル−４−（３−置換アミノ−１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ７）２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ８）２−ニトロ−４−ヨード−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ９）２−ニトロ−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ１０）２−ニトロ−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ｂ１１）２−ニトロ−４−（２−置換アミノビニル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；及び
Ｂ１２）２−ニトロ−４−（３−置換アミノ−１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基
からなるグループから選択される、請求項１５に記載の核酸。
転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で、塩基対を形成している、請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の核酸。
以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ^３は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ_１−Ｃ_３アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ^４は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式２の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式１の塩基を有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法。
以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ^３は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ_１−Ｃ_３アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ^４は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記式１の塩基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記式２の塩基を有するヌクレオチドを取り込む
ことを含む、前記調製方法。
請求項１９または２０に記載の方法によって調製された、式１及び／又は式２の塩基を有するヌクレオチドを含む核酸。
ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム、アプタマー又はｓｉＲＮＡである、請求項２１に記載の核酸。
以下の式１：

［ここにおいて、
Ｒ^１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ^２は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
Ａは、Ｎ又はＣＨである。］
で表される塩基を有するリボヌクレオシド５’−三リン酸。
以下の式２：

［ここにおいて、
Ｒ^３は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ_１−Ｃ_３アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ^４は、ホルミル基又はニトロ基である。］
で表される塩基を有するリボヌクレオシド５’−三リン酸の、請求項２０に記載の核酸を調製する方法における、転写の基質としての使用。
以下の式３：

［ここにおいて、
Ｒ^５は、水素又は置換アミノ基であり、
Ｒ^６は、置換された若しくは無置換の２−チエニル基、置換された若しくは無置換の２−チアゾリル基、又は置換された若しくは無置換の１Ｈ−２−イミダゾリル基であり、そして
ＡはＮ又はＣＨである。］
で表される塩基を有する５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）デオキシリボヌクレオシド。
以下の式４：

［ここにおいて、
Ｒ^７は、水素、ヨード基、置換された若しくは無置換のＣ_１−Ｃ_３アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ_２−Ｃ_３アルキニル基から選択される基であり、そして、
Ｒ^８は、ホルミル基又はニトロ基であり、
ただし、Ｒ^７が水素又は１−プロピニル基で、Ｒ^８がホルミル基の場合を除く。］
で表される塩基を有する５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）デオキシリボヌクレオシドの、請求項１９に記載の核酸を調製する方法における、転写又は複製における鋳型の化学合成、及びＤＮＡ又はＲＮＡの化学合成における原料としての使用。
請求項２０に記載の方法によって調製された、式２で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸であって、式２の置換基Ｒ^３が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたＣ_１−Ｃ_３アルキル基、Ｃ_２−Ｃ_３アルケニル基、又はＣ_２−Ｃ_３アルキニル基である、前記核酸。
式２の置換基Ｒ^３が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたＣ_１−Ｃ_３アルキル基、Ｃ_２−Ｃ_３アルケニル基、又はＣ_２−Ｃ_３アルキニル基である、請求項２４に記載の使用。
式４の置換基Ｒ^７が、ビオチン又は蛍光分子で置換されたＣ_１−Ｃ_３アルキル基、Ｃ_２−Ｃ_３アルケニル基、又はＣ_２−Ｃ_３アルキニル基である、請求項２６に記載の使用。