JP5679147B2 - 非天然塩基を含む改変ｔＲＮＡ及びその用途 - Google Patents

Description

［関連出願の記載］
本発明は、日本国特許出願：特願２００８−０２７５６７号（２００８年 ２月 ７日出願）の優先権主張に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
本発明は、非天然塩基を含む改変ｔＲＮＡ及びその用途に関し、より詳細には、特定の位置に非天然塩基を組み込んだ改変ｔＲＮＡと、これを活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との組み合わせ、及びそのような組み合わせを用いて非標準型アミノ酸をタンパク質の所望の位置へ効率的に導入する方法に関する。

天然の二本鎖ＤＮＡ中のＡとＴ及びＧとＣは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的な」塩基対を形成している。しかし、天然の核酸には４種類の塩基（２種類の塩基対）しかないという事実は、核酸の化学的・物理的多様性に限界を与えている。非天然塩基対（人工塩基対）により遺伝暗号を拡張することができれば、核酸やタンパク質の所望の位置に様々な機能的構成要素を導入するうえで有用である。これまで、非天然塩基対の研究は、塩基間の水素結合を利用した組み合わせや塩基の疎水性を利用した組み合わせに基づき、複製、転写、及び翻訳のそれぞれの工程において天然塩基対に拮抗しうるものが探索されてきた。

本発明者らは、天然塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然塩基との対合を排除できるような種々の非天然塩基対を開発してきた。例えば、プリンの６位にかさ高い置換基を導入した２−アミノ−６−ジメチルアミノプリン（ｘ）と２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）、及びそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもったピリジン−２−オン（ｙ）をデザインした。このｘ−ｙ及びｓ−ｙ塩基対形成について、クレノウフラグメントによるＤＮＡ中への取り込み及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ中への取り込みを調べたところ、立体障害を利用した非天然塩基対ｓ−ｙは、転写反応において非常に高い選択性を示し、鋳型ＤＮＡ中のｓと相補的な位置にｙを部位特異的に取り込んだＲＮＡを合成することができた（例えば、特許文献１参照）。そして、このｓ−ｙ塩基対を用いて遺伝暗号を拡張し、非標準型アミノ酸に対応する新たなコドン−アンチコドンをつくり、試験管内で非標準型アミノ酸を部位特異的に組み込んだタンパク質の合成に成功している（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、複製反応におけるこれら非天然塩基対どうしの選択性は転写反応における選択性ほど高いものではなかった。

近年、本発明者らは疎水性相互作用による塩基対の形成に基づき、複製及び転写反応において高い選択性と取り込み効率を有する非天然塩基対、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）及びピロール−２−カルボアルデヒド（Ｐａ）を開発している（例えば、非特許文献２参照）。複製反応においては、Ｄｓのγ−アミド三リン酸を用いることにより、Ｄｓ塩基の自己対合を抑制し、Ｄｓ−Ｐａ間の選択的な塩基対を形成することができる。一方、転写反応においては、標準的なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ反応によってＤｓ−Ｐａ塩基対の相補性に基づくＲＮＡの合成が可能である。

しかしながら、これらの非天然塩基に関する従来技術は、ＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼによる非天然塩基の認識と、非天然塩基間の特異的な相補性、安定性について検討されてきたものの、翻訳段階において作用する様々な因子、例えば、ｔＲＮＡとアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との相互作用に与える影響については未だ検討されていない。

一方、遺伝暗号は、非標準型アミノ酸をナンセンスコドンであるＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）又はＵＡＧ（アンバー）へ割り当てることによっても拡張することができる。これらのナンセンスコドンに対応するするサプレッサーｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^オーカー、ｔＲＮＡ^オパール、及びｔＲＮＡ^アンバー）は、それぞれＵＵＡ、ＵＣＡ及びＣＵＡのナンセンスアンチコドンを有し、これらに非標準型アミノ酸を付加しうる変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と共に、遺伝暗号の拡張に用いられている。

例えば、タンパク質中のセリンの側鎖へのリン酸化は、シグナル伝達等の重要な多くの生物学的現象に関与している翻訳後の修飾機構である。遺伝暗号を拡張することにより、タンパク質の所望の位置へホスホセリンを導入することができれば、タンパク質のセリン残基のリン酸化の役割を研究するうえで極めて重要である。ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）は、いくつかの古細菌においてホスホセリンを認識し、これをｔＲＮＡ^ＣｙｓのアンチコドンＧＣＡへ連結させる非標準型ａａＲＳである。本発明者らは、すでにアルカエグロブス・フルギダス由来のＳｅｐＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｃｙｓ／ホスホセリン複合体の立体構造を解析している。そして、この複合体の立体構造に基づいて、アンチコドンにＵＣＡ及びＣＵＡを有する変異体ｔＲＮＡ^Ｃｙｓを認識するようにＳｅｐＲＳを改変し、このような変異体ＳｅｐＲＳ／ｔＲＮＡペアを用いてナンセンスコドンへホスホセリンを導入しうることを示した（例えば、非特許文献３参照）。

特許第３８９３０５７号公報 Hirao, I. et al., An unnatural pair for incorporating amino acid analogs into proteins, Nature Biotechnology, Vol. 20, pp.177-182 (2002) Hirao, I. et al., An unnatural hydrophobic base pair system: site-specific incorporation of nucleotide analogs into DNA and RNA, Nature Methods, Vol. 3, pp.729-735 (2006) Fukunaga, R. & Yokoyama, S., Structural insights into the first step of RNA-dependent cysteine biosynthesis in archaea, Nature Structural & Molecular Biology, Vol. 14, pp.272-279, (2007)

以上の特許文献１及び非特許文献１〜３の全開示内容は、本書に引用をもって繰り込み記載されているものとする。以下に本発明による関連技術の分析を与える。
ナンセンスコドンを用いて非標準型アミノ酸を導入する方法においては、翻訳終結因子がタンパク質コード領域内のナンセンスコドンを認識した場合には翻訳反応がその部位で停止し、切断型のタンパク質が産生される。さらに、非標準型アミノ酸が標的遺伝子内部の目的とするナンセンスコドンだけでなく、非標的遺伝子の通常の終止コドンへも所定の割合で導入され、これらのタンパク質の読み過ごしが起こる。その結果、目的とする非標準型アミノ酸組み込みタンパク質の合成効率が低下するという問題がある。

また、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、活性化するアミノ酸と共に、対応するｔＲＮＡの特定のヌクレオシドを認識して他のｔＲＮＡから識別している。従って、アンチコドンを認識するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、ナンセンスコドンに対応するアンチコドンを認識できないために、目的とするアミノアシルｔＲＮＡの合成効率が低下することもありうる。このような場合に、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の構造を改変するだけでなく、これと相互作用する位置のｔＲＮＡの構造を改変して、当該酵素との親和性や特異性を改善することができれば有用である。

本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであって、ｔＲＮＡの特定位置に部位特異的に非天然塩基を導入し、非標準型アミノ酸によって効率的にアミノアシル化されうる改変ｔＲＮＡを合成する方法、及びこのような改変ｔＲＮＡとアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との組み合わせを用いて、特異的かつ効率的に非標準型アミノ酸組み込みタンパク質を合成する方法を提供するものである。

すなわち、第一の視点において本発明の改変ｔＲＮＡは、タンパク質の所望の位置に非標準型アミノ酸を導入するための改変されたｔＲＮＡであって、当該ｔＲＮＡの何れかの位置に非天然塩基を含み、それによって非標準型アミノ酸とのアミノアシル化反応の効率が改善されることを特徴とする。前記アミノアシル化反応は、変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって触媒されることが好ましい。また、前記非天然塩基が、ｔＲＮＡの保存残基以外の何れかの位置に含まれることが好ましい。さらに好ましい実施形態において、前記非天然塩基は、前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と相互作用する位置であって、アクセプター・ステムの最初の３つの塩基対、アンチコドン、識別塩基、クラスＩＩｔＲＮＡについてはエキストラ・アーム全体、２０位、３２位、３７位、及び３８位から選択される少なくとも１つの位置に含まれることを特徴とする。

他の視点において、本発明は非標準型アミノ酸によるｔＲＮＡのアミノアシル化反応を改善するための改変ｔＲＮＡのスクリーニング方法を提供する。この方法は、
（ａ）非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって認識されるサプレッサーｔＲＮＡを用意し、
（ｂ）前記ｔＲＮＡの任意の位置に非天然塩基を導入した改変ｔＲＮＡを合成し、
（ｃ）標準型及び非標準型アミノ酸並びにこれらのアミノ酸に対するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において、前記改変ｔＲＮＡのアミノアシル化活性を測定し、そして
（ｄ）非標準型アミノ酸の取り込み量が増加するか、又は標準型アミノ酸に比べて非標準型アミノ酸の取り込み率が改善した改変ｔＲＮＡを選択することを含む。前記工程（ｂ）における改変ｔＲＮＡの合成は、非天然塩基対を含むｔＲＮＡ遺伝子を調製し、当該ｔＲＮＡ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして転写反応を行うことが好ましい。前記ｔＲＮＡ遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅可能であることがさらに好ましい。

さらに異なる視点において、本発明は非標準型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法であって、
（ａ）非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｂ）前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって認識される本発明の改変ｔＲＮＡと、
（ｃ）所望の位置にナンセンスコドン又は非天然塩基を含むコドンを有する所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡと、
を、前記非天然塩基及び非標準型アミノ酸の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする。好ましい実施形態において、前記非標準型アミノ酸は、ホスホセリン、ピロリジン、リジン誘導体又はチロシン誘導体等が挙げられる。

本発明の方法によれば、ｔＲＮＡの特定位置に非天然塩基を導入した改変ｔＲＮＡと、当該改変ｔＲＮＡを特異的に認識し、かつ非標準型アミノ酸を活性化しうる変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との新たな組み合わせを作製することができる。かかる組み合わせは、非標準型アミノ酸によるアミノアシルｔＲＮＡの合成量を増大させるだけでなく、両者の構造変化に伴って非標準型アミノ酸に対する特異性の高い組み合わせを提供することが可能となる。すなわち、標準型アミノ酸の取り込みによるバックグラウンドを抑制して特異性の高い非標準型アミノ酸組み込みタンパク質の合成に有用である。

さらに、本発明の方法によって、異なる種類の非標準型アミノ酸のそれぞれに特異的な新たな組み合わせを作製することが可能となる。これにより、複数種類の非標準型アミノ酸を様々な部位へ導入したタンパク質の作製も容易となり、従来法では作り出すことができなかった新たな機能を有するタンパク質を創出し、これらを簡便に調製することができる。

標準型ｔＲＮＡの２次構造を示す模式図である。 遺伝暗号拡張のための非天然塩基対システムを示す。（Ａ）天然のＡ−Ｔ（Ｕ）及びＧ−Ｃ塩基対、並びに非天然Ｄｓ−Ｐａ対の構造である。（Ｂ）実施例において用いたｔＲＮＡのコドン−アンチコドンの塩基対を表す。 ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ及びｔＲＮＡ_ＣＰａＡ合成のためのＤｓ−Ｐａ塩基対の形成を介した特異的Ｔ７転写反応を示す。（Ａ）実施例において用いたｔＲＮＡの構造である。（Ｂ）ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ及びｔＲＮＡ_ＣＰａＡ合成、並びにヌクレオチド組成分析のスキームである。（Ｃ）転写産物のＲＮａｓｅＴ２処理後の標識されたヌクレオチドを２次元ＴＬＣで分析した結果である。 ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ及びｔＲＮＡ_ＣＰａＡに対する種々のＳｅｐＲＳ酵素によるホスホセリンアミノアシル化活性を示す。

本発明において、用語「非天然」とは、核酸塩基を説明する文脈において用いられ、天然のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）及び天然のｔＲＮＡに存在する修飾塩基以外の任意の塩基をいう。「非標準型」とは、アミノ酸を説明する文脈において用いられ、「非標準型アミノ酸」とは、遺伝暗号表によって指定されている２０種類の標準型アミノ酸以外のアミノ酸をいう。「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルを形成している化合物であり、好ましくは、一、二、又は三リン酸エステルである。

［非天然塩基を含むｔＲＮＡ及びその調製方法］
ｔＲＮＡは、すべての生物において広範に存在し、その構造と機能が最も明らかな非翻訳ＲＮＡ(non-coding RNA)のひとつである。ｔＲＮＡは７６〜９０ヌクレオシドからなり、２次構造上は、３つのステムループ（Ｄステムループ、アンチコドンステムループ、ＴΨＣステムループ）と１本のステム（アクセプターステム）からなる、クローバー葉状構造をしている。これらのうち、アクセプターステムとＤステムループ（Ｄアーム）は、ひとつづきの二重らせんを形成し、一方、アンチコドンループ（アンチコドンアーム）とＴΨＣステムループ（ＴΨＣアーム）も同様に１本のひとつづきの二重らせんを形成して、この２本のへリックスが直交してＬ字型の３次構造をつくっている。このＬ字型構造の一方の端にアンチコドンと呼ばれる３塩基からなる領域をもち、これがｍＲＮＡ上のコドンと塩基特異的に水素結合する。一方、Ｌ字型構造のもう一方の端には、ＣＣＡ３‘末端と呼ばれる領域があって、この３’末端のアデノシン残基のリボースのヒドロキシル基にアミノ酸が結合する。

図１は、標準型ｔＲＮＡの２次構造を示したものである。塩基の種類が特定されている位置は、すべてのｔＲＮＡで保存されている「保存残基」である。これらの保存残基の番号を固定するために、ｔＲＮＡの中のヌクレオチド残基は図１に示したように番号付けされている。「アンチコドン」は３４位〜３６位、「識別塩基（ディスクリミネーター）」は７４位に相当する。ヒスチジンｔＲＮＡのみ、−１位にヌクレオチドが存在し、このヌクレオチドは識別塩基と塩基対を形成している。本明細書において、ｔＲＮＡの構造を示す用語は、当該技術分野の一般的な技術用語の意味として理解される。「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミン、「Ｕ」はウラシル、「Ｙ」はピリミジン、及び「Ｒ」はプリン残基を表す。実線で表される部分に含まれる残基の数は、ｔＲＮＡの分子種によって異なる。クラスＩＩｔＲＮＡでは、Ｅで表した実線部分に十数残基のヌクレオチドが含まれており、それらはステム構造を形成している（エクストラ・アームと称する場合がある）。

コドンとアンチコドンとの対合の特異性は、塩基特異的な水素結合によって担われているのに対し、ｔＲＮＡとアミノ酸との間には特異性を決めるような物理的化学的な相互作用は存在しない。後述するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）がアミノ酸ごとに用意されていて、この酵素がアミノ酸とｔＲＮＡの正しい組み合わせを認識していると考えられる。ａａＲＳとｔＲＮＡとの複合体の結晶構造の解析から、多くのｔＲＮＡでは、アンチコドンと識別塩基がａａＲＳによって認識されていることが示唆されている。さらにそれぞれのｔＲＮＡは、アンチコドンやディスクリミネーター以外に、独特な位置が認識され、これらが他のｔＲＮＡとの識別に働いているものと考えられる。

従って、本発明においては、ｔＲＮＡの任意の位置、好ましくは保存残基以外の何れかの位置に非天然塩基を導入し、もとのｔＲＮＡよりもアミノアシル化反応の効率が改善された改変ｔＲＮＡを作製することができる。ここで、用語「アミノアシル化反応の効率の改善」とは、目的とする非標準型アミノ酸との反応効率が上昇すること、及び２０種類の標準型アミノ酸との反応効率が低下することの何れでもよい。

さらに好ましくは、目的とするａａＲＳとｔＲＮＡとのペアについて相互作用部位を決定し、ｔＲＮＡのこれらの部位の１又は２以上の塩基を非天然塩基に置換することができる。ｔＲＮＡのアミノ酸特異性に関わる残基は、アクセプター・ステムの最初の３つの塩基対（１位と７３位、２位と７２位、３位と７０位）−１位のヌクレオチドが存在する場合はこの残基と７４位との塩基対、アンチコドン、識別塩基、クラスＩＩｔＲＮＡについてはエキストラ・アーム全体、２０位、３２位、３７位、及び３８位から選択される少なくとも１つの位置である。

これらのｔＲＮＡの所望の位置に導入する非天然塩基としては特に限定されないが、当該非天然塩基を組み込んだｔＲＮＡをコードする遺伝子から転写反応によって合成するためには、ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応において高い選択性を示し、鋳型ＤＮＡ中の特定の塩基と相補的な位置に部位特異的に取り込まれることが必要である。また、これらの非天然塩基がｔＲＮＡのアンチコドンに導入される場合には、ｍＲＮＡのコドンと特異的に結合しうることが重要である。さらに、本発明に係るｔＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅しうることが好ましく、そのためＤＮＡポリメラーゼによる複製反応において高い選択性を有することが望まれる。

従って、本発明の好ましい実施形態において、以下の非天然塩基対から選択される何れかの非天然塩基が挙げられる。このような非天然塩基対としては、５位に置換基を有してもよい２−オキソ−１Ｈ−ピリジン−３−イル（ｙ）基、２−オキソ−１Ｈ−イミダゾール−３−イル（ｚ）基、４位に置換基を有してもよい２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐａ）基、及び４位に置換基を有してもよい２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐｎ）基から選択される何れか１つと、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル（ｓ）基、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル（Ｄｓ）基、及び６位、若しくは２位及び６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基の何れか１つとの塩基対である。

これらの非天然塩基のいくつかをさらに詳細に説明すると、４位に置換基を有してもよい２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基は、以下の一般式（Ｉ）で表される構造を有する。

式（Ｉ）において、ピロール環の４位のＲは、水素原子であるか、あるいは置換された若しくは無置換のＣ１−Ｃ３アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ２−Ｃ３アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ２−Ｃ３アルキニル基から選択される置換基によって置換されていてもよい。上記アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基等は、さらに、低級アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、及び芳香族複素環からなるグループより独立して選択される一つまたはそれより多くの基で置換されていてもよい。本発明の４位に置換基を有してもよい２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を、本明細書において文脈により、「Ｐａ」又は「Ｐａ誘導体」と称する。

具体的には、前記４位に置換基を有してもよい２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基は、
１）２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐａ）基；
２）２−ホルミル−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
３）２−ホルミル−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；及び
４）２−ホルミル−４−エチニル−１Ｈ−ピロール−１−イル基
からなる群から選択されてもよい。より好ましくは、２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基である。

本発明の「４位に置換基を有してもよい２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基」を有するヌクレオシド、ヌクレオチドは、公知の方法を用いて合成することが可能である。その出発原料であるピロール−２−カルボアルデヒドは、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ社 ［１００３−２９−８］、Ｍｅｒｃｋ社 ［８０７５７４］から購入することができる。また、Ｐａ誘導体は、基本的にＰａから誘導することによって合成できる。例えば、Ｐａの４位にプロピンを導入した誘導体は、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３，ｐ．４５１５−４５１８（２００３）に記載されている。

一方、上記Ｐａ又はＰａ誘導体と特異的な水素結合に基づく塩基対を形成しうる非天然塩基としては、６位、若しくは２位及び６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基が挙げられ、以下の式（ＩＩ）で表される。

式（ＩＩ）において、Ｒ^１は、水素原子又はアミノ基であり、Ｒ^２は、置換された又は無置換の２−チエニル基又は２−チアゾリル基である。Ｒ^２のチエニル基又はチアゾリル基は、無置換であるかあるいは、４位及び／又は５位が、メチル基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシ基からなるグループより独立して選択される一つまたはそれより多くの基で置換されていてもよい。本発明の６位、若しくは２位及び６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基のうちＲ^２が置換された又は無置換の２−チエニル基のものを、本明細書において文脈により、「ｓ」又は「ｓ類似体」と呼称する。本発明の６位、若しくは２位及び６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基のうち、Ｒ^２が置換された又は無置換の２−チアゾリル基のものを、本明細書において文脈により、「ｖ」又は「ｖ類似体」と称する。

具体的には、前記６位、若しくは２位及び６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基は、
１）２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）；
２）６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ’）；
３）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
４）６−（４−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
５）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
６）６−（５−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
７）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｖ）；
８）６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
９）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
１０）６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
１１）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；及び
１２）６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基
からなる群から選択されてもよい。より好ましくは、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基である。

本発明の「６位、若しくは２位及び６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基」、及びこれを含むヌクレオシド、ヌクレオチドは、公知の方法を用いて合成することが可能である。例えば、特開２００７−６１０８７号公報〈参考文献１〉の実施例１には、２−Ｎ−フェノキシアセチル−６−（２−チエニル）−９−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−１−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンから、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９−（１−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン ５’−三リン酸（ｓＴＰ）を合成する方法が開示されている。なお、参考文献１の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。

またｓの合成は、例えば、Bioorg.Med.Chem.Lett.,11,p.2221-2223(2001) 〈参考文献２〉の第２頁の第二段落に記載されている。また、ｖの合成は、例えば国際公開公報ＷＯ２００５／０２６１８７号パンフレット〈参考文献３〉の段落００２６、００２７、図５−６等に開示されている。あるいは、J.Am.Chem.Soc.,127,p.8652-8658(2005) 〈参考文献４〉の第２頁の右側の段落に開示されている。なお、参考文献２〜４の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。

さらに好ましい実施形態において、上記Ｐａ又はＰａ誘導体と疎水性相互作用に基づく塩基対を形成しうる非天然塩基として、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル（Ｄｓ）基がある。それらの相互作用は以下のように表すことができる。

上記Ｄｓ−Ｐａ対は、インビトロ又はインビボにおける転写及び複製反応において特異的な相補性を有しているが、通常のＤｓ三リン酸を基質として用いると、Ｄｓ自身が対を形成してＤｓ−Ｄｓ対が形成されるという問題がある。そこで、複製反応においてはＤｓの基質として修飾ヌクレオチドであるγ−アミド三リン酸を用いることが好ましい。Ｄｓのγ−アミド三リン酸は、複製反応においてＤｓに向かい合った位置への取り込み効率が低下するが、Ｐａの相補鎖への取り込み効率は低下しない。さらに好ましくはＰａの相補鎖へのアデニンの誤取り込み効率を下げるために、アデニンのγ−アミド三リン酸を用いてもよい。このように、Ｐａ、Ｇ、Ｃ及びＴの通常のヌクレオチド三リン酸と、Ｄｓ及びＡのγ−アミド三リン酸とを組み合わせて用いることにより、ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応が特異的に進行し、Ｄｓ−Ｐａ対を有するＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅が可能となる。

さらになお好ましい実施形態において、上記Ｐａよりもさらに特異的に複製反応での塩基対を形成する非天然塩基として２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐｎ）基が挙げられる。その疎水的相互作用は以下のように表すことができる。

Ｐｎの２位のニトロ基は、複製反応において天然塩基であるアデニン（Ａ）とのミスマッチを効率的に抑止することができる。従って、ＰＣＲ増幅反応において、Ｄｓのγ−アミド三リン酸と、Ｐｎの通常の三リン酸と、その他の天然塩基とを用いることで、Ｄｓ−Ｐｎ対を効率的かつ特異的に合成することができる。

本発明の改変ｔＲＮＡの調製方法としては、化学合成法、酵素合成法及びこれらの両方を用いる方法等特に限定されないが、好ましくは、上述した非天然塩基対を含む鋳型ＤＮＡから転写、逆転写、又は複製を行い、１つの非天然塩基を含む鋳型ヌクレオチドの相補的な位置に他の特定の非天然塩基を含むヌクレオチドを組み込むことにより合成する。改変ｔＲＮＡ分子中には１又は複数の非天然塩基を含むことができる。

相補的な非天然塩基対としては、上述したＤｓ−Ｐａ、Ｄｓ−Ｐｎ、ｓ−ｙ、ｓ−ｚ、ｘ−ｙ、ｖ−ｙ等の非天然塩基対が挙げられるがこれらに限定されない。これらの中でも特に好ましい塩基対はＤｓ−Ｐａ対及びＤｓ−Ｐｎ対であり、これらの塩基対を含む鋳型ＤＮＡはＤＮＡ複製反応により増幅し、増幅した鋳型ＤＮＡを用いた転写反応によりｔＲＮＡを合成することができる。

［アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）］
ａａＲＳは、天然に存在する２０種類のアミノ酸ごとに２０種類が存在し、ただ一つのアミノ酸と１セットのｔＲＮＡ（複数存在する場合がある）を認識する。ａａＲＳによるアミノ酸とｔＲＮＡの認識はきわめて厳密であり、タンパク質合成が誤る確率は、一つのアミノ酸あたり１／１００００程度であるといわれている。ＡＴＰ結合モチーフの相違により、２０種類のａａＲＳは１０種類ずつ２つのクラス（クラスＩとクラスＩＩ）に分類されている。この２つのクラスでは、触媒ドメインの高次構造や触媒機構が異なる。クラスＩのａａＲＳは対応するｔＲＮＡの３’末端のアデノシン残基のリボースの２’ＯＨにアミノ酸を転移させるのに対し、クラスＩＩの酵素は３’ＯＨにアミノ酸を結合させる。ｔＲＮＡの認識機構についても、クラスＩＩのａａＲＳはｔＲＮＡのアクセプターステムを強く認識するのに対し、クラスＩのａａＲＳはＤアームを含むｔＲＮＡ上のより広い部位を認識しているといわれている。

本発明の方法に使用するａａＲＳは、天然に存在するどのようなａａＲＳでもよいが、好ましくは非標準型アミノ酸を活性化しうる変異体酵素である。非標準型アミノ酸を含んだタンパク質（アロタンパク質）は、タンパク質の機能・構造解析のための有効であり、さらに新規な生理活性物質や高性能ナノデバイスを作り出す上で重要な技術基盤となる。このようなアロタンパク質を生産するためには、非標準型アミノ酸を認識し、かつ、他のａａＲＳでは認識されないようなｔＲＮＡ（例えば、終止コドンに対応するようなサプレッサーｔＲＮＡ）を認識するようなａａＲＳをつくりだす必要がある。これまで、大腸菌のチロシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）を野生型酵素には認識されない種々のチロシン誘導体及びアンバーサプレッサーｔＲＮＡを特異的に認識するように改変した種々の変異体ＴｙｒＲＳが報告されている（例えば、Kiga, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 23, 9715-9720 (2002) 〈参考文献５〉参照）。その他、古細菌由来のピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）及びその変異体酵素は、ピロリジン又はその誘導体をタンパク質に導入することができる（例えば、特開２００７−０３７４４５号公報〈参考文献６〉参照）。なお、参考文献５及び６の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。

古細菌、特に、メタン生成古細菌から取得したホスホセリル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）及びその変異体酵素は、大腸菌や真核細胞内においてホスホセリンを導入するために使用することができる。野生型ＳｅｐＲＳとしては、例えば、メタン生成古細菌であるメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、メタノコッカス・マリパルディス(Methanococcus maripaludis)、及びメタノカルドコッカス・ジャナシイ(Methanocaldococcus jannaschii)や、硫黄還元古細菌アルカエグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)等から取得することできるがこれらに限定されない。これらの古細菌を含む多くの細菌ゲノム塩基配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースから塩基配列の相同性検索を行って、他の相同な遺伝子を取得することも可能である。典型的な例として、メタノサルシナ・マゼイ由来のＳｅｐＲＳは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００３９０１として、メタノコッカス・マリパルディス由来のＳｅｐＲＳは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００５７９１として、メタノカルドコッカス・ジャナシイ由来のＳｅｐＲＳは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００９０９として、及びアルカエグロブス・フルギダス由来のＳｅｐＲＳは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００９１７（ＧｅｎｅＩＤ：１４８３３２２）として登録されている。上記アルカエグロブス・フルギダス由来ＳｅｐＲＳの遺伝子の塩基配列を配列番号１に、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。これらのＳｅｐＲＳの配列はよく保存されており、例えば、アミノ酸配列の相同性は、凡そ７０％以上である。

野生型ａａＲＳの立体構造に基づいて、所望の位置のアミノ酸残基を置換、欠失又は付加することにより種々の変異体酵素を作成することができる。例えば、ＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡ^Ｃｙｓ−ホスホセリンの三元複合体の立体構造が知られている。ＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡ^Ｃｙｓ−Ｓｅｐ三元複合体及びＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡ^Ｃｙｓ二成分複合体のそれぞれ２．６Å及び２．８Åの分解能で得られた原子座標は、プロテインデータバンク（PDB, Protein Data Bank, The Research Collaboratory for Structual Bioinformatics (RCSB)が運営、http://www.rcsb.org/pdb/〈参考文献７〉参照）に、それぞれ２ＤＵ３及び２ＤＵ４というコード番号にて登録されている。なお、参考文献７の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。

本発明者らはすでに上記立体構造に基づいてｔＲＮＡ^Ｃｙｓのアンバーサプレッサー及びオパールサプレッサーｔＲＮＡに対する結合親和性が高められた変異体ＳｅｐＲＳを取得した（例えば上述した非特許文献４参照）。これらの内容は参照により本願明細書に組み込まれる。

本発明の好ましい実施形態において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の４１８位及び４２０位のグルタミン酸がアスパラギンに置換され、さらに４２３位のスレオニンがバリンに置換された三重変異体ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）は、上述した非天然塩基を含むｔＲＮＡと組み合わせてアロタンパク質の合成に用いることができる。このような変異体を作製する方法としては、当業者に公知の種々の方法を用いることができ、例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて全長の変異体ＰｙｌＲＳをコードするＤＮＡを取得し、これを大腸菌等の宿主細胞を用いて発現させることができる。あるいは、Ｋｕｎｋｅｌ法又はギャップ二重鎖(Gapped duplex)法等の公知の部位特異的突然変異導入方法によって行うことができ、これらの手法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−ＫやＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ）等）を利用することができる。

［改変ｔＲＮＡのスクリーニング方法］
本発明はさらに、非標準型アミノ酸によるｔＲＮＡのアミノアシル化反応を改善するための改変ｔＲＮＡのスクリーニング方法を提供する。この方法は：
（ａ）非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって認識されるサプレッサーｔＲＮＡを用意し、
（ｂ）前記ｔＲＮＡの任意の位置に非天然塩基を導入した改変ｔＲＮＡを合成し、
（ｃ）標準型及び非標準型アミノ酸並びにこれらのアミノ酸に対するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において、前記改変ｔＲＮＡのアミノアシル化活性を測定し、そして
（ｄ）非標準型アミノ酸の取り込み量が増加するか、又は標準型アミノ酸に比べて非標準型アミノ酸の取り込み率が改善した改変ｔＲＮＡを選択することを含む。

ここで、非天然塩基をｔＲＮＡのどの位置に導入するかをデザインする場合には、上述したように、目的とするａａＲＳとｔＲＮＡとのペアについて相互作用部位を決定し、ｔＲＮＡのこれらの部位の１又は２以上の塩基を非天然塩基に置換することができる。ｔＲＮＡのアミノ酸特異性に関わる残基は、アクセプター・ステムの最初の３つの塩基対（１位と７３位、２位と７２位、３位と７０位）−１位のヌクレオチドが存在する場合はこの残基と７４位との塩基対、アンチコドン、識別塩基、クラスＩＩｔＲＮＡについてはエキストラ・アーム全体、２０位、３２位、３７位、及び３８位から選択される少なくとも１つの位置である。

前記工程（ｂ）における改変ｔＲＮＡの合成は、非天然塩基対を含むｔＲＮＡ遺伝子を調製し、当該ｔＲＮＡ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして複製及び転写反応を行うことが好ましい。このような改変ｔＲＮＡの合成に使用しうる非天然塩基対としては、５位に置換基を有してもよい２−オキソ−１Ｈ−ピリジン−３−イル（ｙ）基、２−オキソ−１Ｈ−イミダゾール−３−イル（ｚ）基、４位に置換基を有してもよい２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐａ）基、及び４位に置換基を有してもよい２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐｎ）基から選択される何れか１つと、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル（Ｄｓ）基、及び６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基の何れか１つとの塩基対が好ましい。これらの中でも特に好ましいのは、Ｄｓ−Ｐａ対、又はＤｓ−Ｐｎ対である。

あるいは、上記ａａＲＳとの相互作用に関与する部位以外の任意の位置にランダムに非天然塩基を導入したｔＲＮＡの遺伝子ライブラリーを作製し、この改変ｔＲＮＡのライブラリーを用いて上記スクリーニングを行ってもよい。ｔＲＮＡは立体的に折りたたまれた構造をしており、３次元的に塩基が相互作用しているため、ａａＲＳと直接相互作用していなくても塩基置換の効果が離れた位置に及ぶことがあるからである。

［非標準型アミノ酸組み込みタンパク質の合成］
本発明の非標準型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法は、
（ａ）非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｂ）前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって認識される上記本発明の改変ｔＲＮＡと、
（ｃ）所望の位置にナンセンスコドン又は非天然塩基を含むコドンを有する所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡと、
を、前記非天然塩基及び非標準型アミノ酸の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする。

ここで、本発明にかかるａａＲＳや改変ｔＲＮＡの合成系としては特に制限されることはなく、任意の発現系を用いることができる。例えば、無細胞タンパク質合成系や真正細菌細胞内におけるタンパク質合成系、或いは、真核細胞、好ましくは動物細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞である。

無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。様々な生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母等から公知の技術を利用して調製することができる。中でも大腸菌の抽出液を用いることが好ましく、例えば、ズベイら(Zubay et al., Ann. Rev. Genet. Vol.7, pp.267-287 (1973)〈参考文献８〉)又はプラットら(Pratt, J.M. et al., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford〈参考文献９〉)に記載された方法により調製されたＳ３０抽出液を用いることができる。なお、参考文献８及び９の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。

非標準型アミノ酸組み込みタンパク質の合成反応を行う際には、上記細胞抽出液に転写／翻訳鋳型となる所望の位置にナンセンスコドン又は非天然塩基を含むコドンを有する所望のタンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡを添加する。また、非標準型アミノ酸、非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、本発明の改変ｔＲＮＡ、及び改変ｔＲＮＡに含まれる非天然塩基を含むヌクレオチド三リン酸を加える。さらに、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類、抗菌剤、また鋳型としてＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡ合成の基質、及びＲＮＡポリメラーゼ等を含むことができる。これらは目的タンパク質や、用いるタンパク質合成系の種類によって適宜選択して調製される。例えば、大腸菌のＳ３０抽出液の場合は、Ｔｒｉｓ−酢酸、ＤＴＴ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、アミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸に加えてホスホセリンを添加する。）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、及び至適濃度の酢酸マグネシウム等の一部あるいは全部を添加する。

次に、本発明をさらに詳細に説明するために、図２に示したような非天然塩基対Ｄｓ−Ｐａ対を用い、アンチコドンの位置にＰａ基を含む改変ｔＲＮＡへホスホセリンを結合させた実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

［ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ及びｔＲＮＡ_ＣＰａＡの合成］
（１）非天然塩基を含むｔＲＮＡ分子の調製
鋳型となるＤＮＡ断片はアプライドバイオシステムズ３９２ＤＮＡ合成機により、Ｄｓ及び天然塩基のホスホアミダイト（アプライドバイオシステムズ社）、並びに２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドアミダイト（グレンリサーチ社）を用いて化学合成した。ＤＮＡ断片の塩基配列は、次のとおりである。
５’−非鋳型ＤＮＡ断片(７１塩基)：5'-GATAATACGACTCACTATAGCCAGGGTGGCAGAGGGGCTATGCGGCGGACTCTAGATCCGCTTTACCCCGG-3'（配列番号３）
５’−鋳型ＤＮＡ断片（ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ、６０塩基）：TmGmGAGCCAGGGCCCGGATTCGAACCGGGGTAAAGCGGATCTADsAGTCCGCCGCATAGCCC-3' （配列番号４）
５’−鋳型ＤＮＡ断片（ｔＲＮＡ_ＣＰａＡ、６０塩基）：TmGmGAGCCAGGGCCCGGATTCGAACCGGGGTAAAGCGGATCTDsGAGTCCGCCGCATAGCCC-3' （配列番号５）

ここで、Ｔｍは２’−Ｏ−メチルチミジンを表し、Ｇｍは２’−Ｏ−メチルグアノシンを表す。二本鎖ＤＮＡ鋳型（９４塩基対）は、５’−非鋳型ＤＮＡ断片（配列番号３）と５’−鋳型ＤＮＡ断片（配列番号４又は５）とをアニールし、続いてクレノウフラグメント（タカラバイオ）によるプライマー伸長反応によって調製した。Ｐａを含むｔＲＮＡ転写物は、４０ｍＭトリス塩酸、２４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ、２ｍＭスペルミジン、５ｍＭジチオスレイトール、３ｍＭのＰａＴＰ、１ｍＭの天然ＮＴＰｓ及び１０ｍＭのＧＭＰを含む溶液中に０．５μＭ鋳型を用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（２．５ユニット／μｌ）により３７℃で６時間合成した。転写物はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。

（２）Ｔ７転写物のヌクレオチド組成分析
分析用に、［α−^３２Ｐ］ＡＴＰ（２μＣｉ）又は［α−^３２Ｐ］ＵＴＰ（２μＣｉ）の存在下に転写反応を行った。転写産物は、１５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）を含む溶液（１０μｌ）中で、ＲＮａｓｅＴ_２（０．７５−１．５ユニット／μｌ）により３７℃で１〜２時間消化した。消化物はメルクＨＰＴＬＣプレート（１００×１００ｍｍ）（メルク社）を用いて、一次元の展開溶媒としてはイソブチル酸：塩酸：水（容量比６６：１：３３）により、２次元の展開溶媒としてはイソプロピルアルコール：塩酸：水（容量比７０：１５：１５）により２次元ＴＬＣで分析した。ＴＬＳプレート上の産物はイメージアナライザーＢＡＳ２５００（富士フィルム）で分析した。各スポットの定量は、３〜９個のデータセットの平均をとった。

（３）結果
アンチコドン認識部位内に１〜３個の点突然変異を有する一連の変異体ＳｅｐＲＳによるアミノアシル化を調べるために、上記のように非天然のＤｓ−Ｐａ塩基対を介する転写反応によりアンチコドンにＰａＵＡ又はＣＰａＡ配列を含む２つのｔＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ及びｔＲＮＡ_ＣＰａＡを合成した（図２Ｂ及び図３Ａ参照）。この２つのｔＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ^{Ａｍｂｅｒ}と比較してアンチコドントリプレットの最初の又は第二のヌクレオチドがＰａに置換されている。

ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ及びｔＲＮＡ_ＣＰａＡ（それぞれ７５塩基）は、Ｐａ基質（ＰａＴＰ）と、Ｄｓを含む鋳型ＤＮＡとを用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより調製した。ｍＲＮＡの鋳型ＤＮＡ（９４塩基対）は、図３Ｂに示したように、５’−非鋳型ＤＮＡ断片(７１塩基)と、５’−鋳型ＤＮＡ断片（６０塩基）とを含む部分的に二本鎖ＤＮＡのプライマー伸長反応により構築した。鋳型ストランド５’末端の２つのヌクレオチド（Ｇ及びＴ）は、それらの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（Ｇｍ及びＴｍ）で置換した。これは、新生転写産物の３’末端に１以上の非鋳型ヌクレオチドの付加を減少させることができる。転写反応は、３ｍＭのＰａＴＰ、１ｍＭの天然ＮＴＰｓ及び１０ｍＭのＧＭＰと、０．５μＭの鋳型を用いて行った。天然のＮＴＰｓに比べてＰａＴＰの取り込みは多少効率が悪いため、ＰａＴＰの濃度を３ｍＭに増加させた。

鋳型ＤＮＡのＤｓと向かい合った位置のｔＲＮＡ転写物へＰａが高い選択性で取り込まれることを、内部標識された転写産物のヌクレオチド組成分析によって確認した。その結果を図３Ｃ及び表１に示した。ｔＲＮＡ_ＰａＵＡの分析では、Ｐａに相当する放射性標識されたリボヌクレオシド３’−リン酸に対応するスポットが、［α−^３２Ｐ］ＵＴＰで標識した転写物から得られた２次元ＴＬＣ上には現れたが、［α−^３２Ｐ］ＡＴＰを用いた場合には現れなかった。この結果は、Ｄｓと向かい合った位置への正確なＰａの取り込みを示す。なぜなら、ｔＲＮＡ配列においてＰａの３’側の隣接塩基がＵの場合には、転写反応で［α−^３２Ｐ］ＵＴＰを用いた場合のみＰａの３’−リン酸が放射性標識されるからである。反対に、［α−^３２Ｐ］ＡＴＰで標識されたｔＲＮＡ_ＰａＵＡの転写産物のＴＬＣ上にはＰａスポットが検出されないことから、３ｍＭのＰａＴＰと１ｍＭの天然ＮＴＰｓを用いた転写反応において、天然塩基の相補的な位置へのＰａの誤取り込みはほとんど起こらないことを示す。同様に、ｔＲＮＡ_ＣＰａＡの解析において、リン酸化Ｐａのスポットは［α−^３２Ｐ］ＡＴＰで標識した転写産物から得られたＴＬＣ上には認められるが、［α−^３２Ｐ］ＵＴＰで標識した場合には認められなかった。これはｔＲＮＡ_ＣＰａＡにおけるＰａの３’側隣接塩基がＡであり、［α−^３２Ｐ］ＡＴＰでよってのみ放射性標識されるからである。

注）^ａ：図３に示したように、Ａ（項目番号１及び３）又はＵ（項目番号２及び４）の５‘隣接塩基に取り込まれたヌクレオチドの組成を示す。
^ｂ：値は、次の計算式を用いて決定した：（各ヌクレオチドの放射活性）／［全てのヌクレオチド（３’一リン酸）の全放射活性］×（［α−^３２Ｐ］ＮＴＰの５‘隣接塩基の全数）。
^ｃ：各ヌクレオチドの理論値を［］内に示す。
^ｄ：標準偏差を（）内に示す。

ＴＬＣ上のこれらのスポットの定量結果より、Ｄｓに向かい合った位置へのＰａの取り込みの選択性は、ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ及びｔＲＮＡ_ＣＰａＡの両方において約９８％であった(表１、項目番号２及び３参照)。一方、天然塩基に向かい合ったＰａＴＰの誤取り込みの値は、１．１〜１．２％であった（表１、項目番号１及び４参照)。これらの値は、以下の計算式によるｔＲＮＡ転写物におけるＰａの誤取り込みが、転写物の各位置につき０．０８〜０．１１％であることを示す：
［Ｐａ組成］／［ｔＲＮＡ_ＰａＵＡについてＡの５’側の隣接塩基の総数、又はｔＲＮＡ_ＣＰａＡについてＵの５’側の隣接塩基の総数］×１００（％）
従って、天然のＮＴＰｓの濃度（１ｍＭ）に比べてＰａＴＰの濃度（３ｍＭ）を増加させることによって、転写産物の他の位置へのＰａの誤取り込みなしに、鋳型Ｄｓに向かい合った位置におけるｔＲＮＡのアチコドンへＰａを高選択的かつ効率的に導入することができた。

［ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ及びｔＲＮＡ_ＣＰａＡへホスホセリンを導入するための酵素のスクリーニング］
Ａ．フルギダスのＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡ^Ｃｙｓ−ホスホセリンの三元複合体の立体構造に基づいて、第一及び第二のアンチコドン塩基との相互作用に関与するアミノ酸残基に１又はそれ以上の変異を導入した種々の変異体ＳｅｐＲＳを設計した。種々の変異体ＳｅｐＲＳによるホスホセリン結合反応は、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭのＡＴＰ、６０μＭの［^１４Ｃ］ホスホセリン、１μＭのＳｅｐＲＳ酵素及び２０μＭのｔＲＮＡ_ＰａＵＡ又はｔＲＮＡ_ＣＰａＡを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．６）１０μＬ中、５０℃にて行なった。１０分間反応させた後、７μＬの反応混合液を取り出し、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で平衡化したろ紙（ワットマン、３ｍｍ）上で反応を停止した。ろ紙を５％氷冷ＴＣＡ溶液で３回洗浄し、次に１００％エタノールで１回洗浄した。ろ紙上に沈殿した［^１４Ｃ］Ｓｅｐ−ｔＲＮＡの放射活性をシンチレーションカウンターで計測した。各実験は３回繰り返し、その平均値で示した。その結果を図４に示す。

図４に示したように、野生型及び１又は２個の点突然変異を有する変異体ＳｅｐＲＳのほとんどは、ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ又はｔＲＮＡ_ＣＰａＡの何れにも測定可能な活性を示さなかった。これとは反対に、三重変異体であるＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）は、ｔＲＮＡ_ＰａＵＡに対して実質的な活性を示した。この変異体酵素はｔＲＮＡ_ＣＰａＡに対しても検出可能な活性を示した。この変異体酵素は、ｔＲＮＡ^オパール及びｔＲＮＡ^アンバーをホスホセリンでアミノアシル化することが分かっている。同一の反応条件で合成されたそれぞれのホスホセリル−ｔＲＮＡ量を比較すると、野生型ＳｅｐＲＳによって産生されるＳｅｐ−ｔＲＮＡ^Ｃｙｓは約６０ｐｍｏｌに対し、ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）によって産生されるＳｅｐ−ｔＲＮＡ^Ｃｙｓは約１５ｐｍｏｌ、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡ^オパールは約３０ｐｍｏｌ、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡ^アンバーは約２５ｐｍｏｌ、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡ_ＰａＵＡは約６０ｐｍｏｌ、及びＳｅｐ−ｔＲＮＡ_ＣＰａＡは約７ｐｍｏｌであった。したがって、ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）の活性は、ｔＲＮＡ^オパール及びｔＲＮＡ^アンバーに比べてｔＲＮＡ_ＰａＵＡではより高く、ｔＲＮＡ_ＣＰａＡではより低かった。

変異体ａａＲＳを用いて非標準型アミノ酸をタンパク質へ部位特異的に導入するためには、当該ａａＲＳが外来性ｔＲＮＡのみを特異的に認識し、内在性ｔＲＮＡを認識しないことが要求される。これに関し、ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）は、大腸菌、小麦胚芽、及び酵母の内在性ｔＲＮＡ混合物に対して検出可能な活性を示さなかったため、ｔＲＮＡ_ＰａＵＡを高度に特異的にアミノアシル化すると考えられる。

［酵素活性の測定と動力学的解析］
ホスホセリン結合反応の動力学的解析は、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭのＡＴＰ、１００μＭの［^１４Ｃ］ホスホセリン、１、２、５、１０、２０、４０、８０又は１００μＭのｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｃｙｓ、ｔＲＮＡ^Ｏｐａｌ、ｔＲＮＡ^{Ａｍｂｅｒ}、ｔＲＮＡ_ＰａＵＡ又はｔＲＮＡ_ＣＰａＡ）及びＳｅｐＲＳ酵素を含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．６）１５μＬ中、５０℃にて行なった。ｔＲＮＡ^Ｃｙｓの動力学的パラメーターを決定するためには、１μＭの野生型ＳｅｐＲＳ又は２μＭのＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）を用い、ｔＲＮＡ^Ｏｐａｌ、ｔＲＮＡ^{Ａｍｂｅｒ}、及びｔＲＮＡ_ＰａＵＡのためには、２μＭのＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）を用い、ｔＲＮＡ_ＣＰａＡのためには、５μＭのＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）を用いた。反応開始後３０秒及び６０秒経過したときに一定量（６μＬ）の反応混合液を取り出し、生成した［^１４Ｃ］Ｓｅｐ−ｔＲＮＡを上記と同様の方法にて定量した。動力学的パラメーターは、Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロットを用いて計算した。

その結果を下記の表２に示す。ｔＲＮＡ^Ｃｙｓに対する野生型ＳｅｐＲＳのｋｃａｔ／Ｋｍと比較して、ｔＲＮＡ_ＰａＵＡに対するＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）のｋｃａｔ／Ｋｍ値は約半分に減少しているのみであり、ｔＲＮＡ^ＯｐａｌやｔＲＮＡ^{Ａｍｂｅｒ}に対するＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）のそれらよりも約２倍程度大きかった。また、もとのｔＲＮＡ^Ｃｙｓと比較すると改変後のｔＲＮＡ_ＰａＵＡに対するＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｎ、Ｔ４２３Ｖ）のｋｃａｔ／Ｋｍ値は約９倍も上昇していることが分かる。

非標準型アミノ酸を組み込んだタンパク質を産生することは基礎研究のみならず、医学や農学、そして新規材料としての工学分野等において広範囲な応用及び実用化が可能である。本発明は、このための改変ｔＲＮＡ及びアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の新たな組み合わせを提供する。
なお、前述の特許文献等の各開示を、本書に引用をもって繰り込むものとする。本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素の多様な組み合わせないし選択が可能である。すなわち、本発明は、請求の範囲を含む全開示、技術的思想にしたがって当業者であればなし得るであろう各種変形、修正を含むことは勿論である。

Claims (8)

1. ｔＲＮＡ ^アンバー のアンチコドンの１番目の位置に、４位に置換基を有してもよい２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐａ）基を含み、それによってホスホセリンとのアミノアシル化反応の効率が改善されることを特徴とする改変ｔＲＮＡ。
2. 前記アミノアシル化反応が、変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって触媒されるものであり、当該変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、
   （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列における４１８番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換したアミノ酸配列、
   （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における４２０番目のＥをＤ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、又はＲに置換したアミノ酸配列、
   （Ｃ）配列番号２に示す４１８番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換し、かつ４２０番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換したアミノ酸配列、又は
   （Ｄ）配列番号２に示す４１８番目のＥをＮに置換し、４２０番目のＥをＮに置換し、かつ４２３番目のＴをＶに置換したアミノ酸配列で表される請求項１に記載の改変ｔＲＮＡ。
3. 非天然塩基対を含むｔＲＮＡ遺伝子から転写反応により合成される請求項１又は２に記載の改変ｔＲＮＡ。
4. 前記ｔＲＮＡ遺伝子が、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅可能である請求項３に記載の改変ｔＲＮＡ。
5. （ａ）ホスホセリンを活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、
   （ｂ）前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって認識される請求項１〜４の何れか一項に記載の改変ｔＲＮＡと、
   （ｃ）７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル（Ｄｓ）基を２番目又は３番目の位置に含むコドンを所望の位置に有する所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡと、
   を、４位に置換基を有してもよい２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐａ）基を含むヌクレオチド三リン酸、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル（Ｄｓ）基を含むヌクレオチド三リン酸及びホスホセリンの存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させるものであり、
   前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、
   （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列における４１８番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換したアミノ酸配列、
   （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における４２０番目のＥをＤ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、又はＲに置換したアミノ酸配列、
   （Ｃ）配列番号２に示す４１８番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換し、かつ４２０番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換したアミノ酸配列、又は
   （Ｄ）配列番号２に示す４１８番目のＥをＮに置換し、４２０番目のＥをＮに置換し、かつ４２３番目のＴをＶに置換したアミノ酸配列で表されることを特徴とするホスホセリン組み込みタンパク質の製造方法。
6. 前記７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル（Ｄｓ）基を含むｍＲＮＡのコドンがＵＡＤｓである請求項５に記載の方法。
7. 請求項１〜４の何れか一項に記載の改変ｔＲＮＡと、
   前記改変ｔＲＮＡをホスホセリンによってアミノアシル化しうる変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素であって、
   （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列における４１８番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換したアミノ酸配列、
   （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における４２０番目のＥをＤ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、又はＲに置換したアミノ酸配列、
   （Ｃ）配列番号２に示す４１８番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換し、かつ４２０番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換したアミノ酸配列、又は
   （Ｄ）配列番号２に示す４１８番目のＥをＮに置換し、４２０番目のＥをＮに置換し、かつ４２３番目のＴをＶに置換したアミノ酸配列で表される変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との組み合わせ。
8. 請求項１〜４の何れか一項に記載の改変ｔＲＮＡをコードする遺伝子と、
   前記改変ｔＲＮＡをホスホセリンによってアミノアシル化しうる変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子であって、当該変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、
   （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列における４１８番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換したアミノ酸配列、
   （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における４２０番目のＥをＤ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、又はＲに置換したアミノ酸配列、
   （Ｃ）配列番号２に示す４１８番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換し、かつ４２０番目のＥをＤ、Ｎ、又はＱに置換したアミノ酸配列、又は
   （Ｄ）配列番号２に示す４１８番目のＥをＮに置換し、４２０番目のＥをＮに置換し、かつ４２３番目のＴをＶに置換したアミノ酸配列で表される、変異体アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子との組み合わせ。

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