JP5679147B2 - 非天然塩基を含む改変tRNA及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、日本国特許出願:特願2008−027567号(2008年 2月 7日出願)の優先権主張に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
本発明は、非天然塩基を含む改変tRNA及びその用途に関し、より詳細には、特定の位置に非天然塩基を組み込んだ改変tRNAと、これを活性化しうるアミノアシル−tRNA合成酵素との組み合わせ、及びそのような組み合わせを用いて非標準型アミノ酸をタンパク質の所望の位置へ効率的に導入する方法に関する。
ナンセンスコドンを用いて非標準型アミノ酸を導入する方法においては、翻訳終結因子がタンパク質コード領域内のナンセンスコドンを認識した場合には翻訳反応がその部位で停止し、切断型のタンパク質が産生される。さらに、非標準型アミノ酸が標的遺伝子内部の目的とするナンセンスコドンだけでなく、非標的遺伝子の通常の終止コドンへも所定の割合で導入され、これらのタンパク質の読み過ごしが起こる。その結果、目的とする非標準型アミノ酸組み込みタンパク質の合成効率が低下するという問題がある。
(a)非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−tRNA合成酵素によって認識されるサプレッサーtRNAを用意し、
(b)前記tRNAの任意の位置に非天然塩基を導入した改変tRNAを合成し、
(c)標準型及び非標準型アミノ酸並びにこれらのアミノ酸に対するアミノアシル−tRNA合成酵素の存在下において、前記改変tRNAのアミノアシル化活性を測定し、そして
(d)非標準型アミノ酸の取り込み量が増加するか、又は標準型アミノ酸に比べて非標準型アミノ酸の取り込み率が改善した改変tRNAを選択することを含む。前記工程(b)における改変tRNAの合成は、非天然塩基対を含むtRNA遺伝子を調製し、当該tRNA遺伝子を鋳型DNAとして転写反応を行うことが好ましい。前記tRNA遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅可能であることがさらに好ましい。
(a)非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−tRNA合成酵素と、
(b)前記アミノアシル−tRNA合成酵素によって認識される本発明の改変tRNAと、
(c)所望の位置にナンセンスコドン又は非天然塩基を含むコドンを有する所望のタンパク質をコードするmRNAと、
を、前記非天然塩基及び非標準型アミノ酸の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする。好ましい実施形態において、前記非標準型アミノ酸は、ホスホセリン、ピロリジン、リジン誘導体又はチロシン誘導体等が挙げられる。
tRNAは、すべての生物において広範に存在し、その構造と機能が最も明らかな非翻訳RNA(non-coding RNA)のひとつである。tRNAは76〜90ヌクレオシドからなり、2次構造上は、3つのステムループ(Dステムループ、アンチコドンステムループ、TΨCステムループ)と1本のステム(アクセプターステム)からなる、クローバー葉状構造をしている。これらのうち、アクセプターステムとDステムループ(Dアーム)は、ひとつづきの二重らせんを形成し、一方、アンチコドンループ(アンチコドンアーム)とTΨCステムループ(TΨCアーム)も同様に1本のひとつづきの二重らせんを形成して、この2本のへリックスが直交してL字型の3次構造をつくっている。このL字型構造の一方の端にアンチコドンと呼ばれる3塩基からなる領域をもち、これがmRNA上のコドンと塩基特異的に水素結合する。一方、L字型構造のもう一方の端には、CCA3‘末端と呼ばれる領域があって、この3’末端のアデノシン残基のリボースのヒドロキシル基にアミノ酸が結合する。
1)2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル(Pa)基;
2)2−ホルミル−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
3)2−ホルミル−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;及び
4)2−ホルミル−4−エチニル−1H−ピロール−1−イル基
からなる群から選択されてもよい。より好ましくは、2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基である。
1)2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s);
2)6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s’);
3)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
4)6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
5)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
6)6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
7)2−アミノ−6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基(v);
8)6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
9)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
10)6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
11)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;及び
12)6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基
からなる群から選択されてもよい。より好ましくは、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基である。
aaRSは、天然に存在する20種類のアミノ酸ごとに20種類が存在し、ただ一つのアミノ酸と1セットのtRNA(複数存在する場合がある)を認識する。aaRSによるアミノ酸とtRNAの認識はきわめて厳密であり、タンパク質合成が誤る確率は、一つのアミノ酸あたり1/10000程度であるといわれている。ATP結合モチーフの相違により、20種類のaaRSは10種類ずつ2つのクラス(クラスIとクラスII)に分類されている。この2つのクラスでは、触媒ドメインの高次構造や触媒機構が異なる。クラスIのaaRSは対応するtRNAの3’末端のアデノシン残基のリボースの2’OHにアミノ酸を転移させるのに対し、クラスIIの酵素は3’OHにアミノ酸を結合させる。tRNAの認識機構についても、クラスIIのaaRSはtRNAのアクセプターステムを強く認識するのに対し、クラスIのaaRSはDアームを含むtRNA上のより広い部位を認識しているといわれている。
本発明はさらに、非標準型アミノ酸によるtRNAのアミノアシル化反応を改善するための改変tRNAのスクリーニング方法を提供する。この方法は:
(a)非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−tRNA合成酵素によって認識されるサプレッサーtRNAを用意し、
(b)前記tRNAの任意の位置に非天然塩基を導入した改変tRNAを合成し、
(c)標準型及び非標準型アミノ酸並びにこれらのアミノ酸に対するアミノアシル−tRNA合成酵素の存在下において、前記改変tRNAのアミノアシル化活性を測定し、そして
(d)非標準型アミノ酸の取り込み量が増加するか、又は標準型アミノ酸に比べて非標準型アミノ酸の取り込み率が改善した改変tRNAを選択することを含む。
本発明の非標準型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法は、
(a)非標準型アミノ酸を活性化しうるアミノアシル−tRNA合成酵素と、
(b)前記アミノアシル−tRNA合成酵素によって認識される上記本発明の改変tRNAと、
(c)所望の位置にナンセンスコドン又は非天然塩基を含むコドンを有する所望のタンパク質をコードするmRNAと、
を、前記非天然塩基及び非標準型アミノ酸の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする。
(1)非天然塩基を含むtRNA分子の調製
鋳型となるDNA断片はアプライドバイオシステムズ392DNA合成機により、Ds及び天然塩基のホスホアミダイト(アプライドバイオシステムズ社)、並びに2’−O−メチルリボヌクレオシドアミダイト(グレンリサーチ社)を用いて化学合成した。DNA断片の塩基配列は、次のとおりである。
5’−非鋳型DNA断片(71塩基):5'-GATAATACGACTCACTATAGCCAGGGTGGCAGAGGGGCTATGCGGCGGACTCTAGATCCGCTTTACCCCGG-3'(配列番号3)
5’−鋳型DNA断片(tRNAPaUA、60塩基):TmGmGAGCCAGGGCCCGGATTCGAACCGGGGTAAAGCGGATCTADsAGTCCGCCGCATAGCCC-3' (配列番号4)
5’−鋳型DNA断片(tRNACPaA、60塩基):TmGmGAGCCAGGGCCCGGATTCGAACCGGGGTAAAGCGGATCTDsGAGTCCGCCGCATAGCCC-3' (配列番号5)
分析用に、[α−32P]ATP(2μCi)又は[α−32P]UTP(2μCi)の存在下に転写反応を行った。転写産物は、15mM酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)を含む溶液(10μl)中で、RNaseT2(0.75−1.5ユニット/μl)により37℃で1〜2時間消化した。消化物はメルクHPTLCプレート(100×100mm)(メルク社)を用いて、一次元の展開溶媒としてはイソブチル酸:塩酸:水(容量比66:1:33)により、2次元の展開溶媒としてはイソプロピルアルコール:塩酸:水(容量比70:15:15)により2次元TLCで分析した。TLSプレート上の産物はイメージアナライザーBAS2500(富士フィルム)で分析した。各スポットの定量は、3〜9個のデータセットの平均をとった。
アンチコドン認識部位内に1〜3個の点突然変異を有する一連の変異体SepRSによるアミノアシル化を調べるために、上記のように非天然のDs−Pa塩基対を介する転写反応によりアンチコドンにPaUA又はCPaA配列を含む2つのtRNA分子、tRNAPaUA及びtRNACPaAを合成した(図2B及び図3A参照)。この2つのtRNA分子は、tRNAAmberと比較してアンチコドントリプレットの最初の又は第二のヌクレオチドがPaに置換されている。
b:値は、次の計算式を用いて決定した:(各ヌクレオチドの放射活性)/[全てのヌクレオチド(3’一リン酸)の全放射活性]×([α−32P]NTPの5‘隣接塩基の全数)。
c:各ヌクレオチドの理論値を[]内に示す。
d:標準偏差を()内に示す。
[Pa組成]/[tRNAPaUAについてAの5’側の隣接塩基の総数、又はtRNACPaAについてUの5’側の隣接塩基の総数]×100(%)
従って、天然のNTPsの濃度(1mM)に比べてPaTPの濃度(3mM)を増加させることによって、転写産物の他の位置へのPaの誤取り込みなしに、鋳型Dsに向かい合った位置におけるtRNAのアチコドンへPaを高選択的かつ効率的に導入することができた。
A.フルギダスのSepRS−tRNACys−ホスホセリンの三元複合体の立体構造に基づいて、第一及び第二のアンチコドン塩基との相互作用に関与するアミノ酸残基に1又はそれ以上の変異を導入した種々の変異体SepRSを設計した。種々の変異体SepRSによるホスホセリン結合反応は、20mM塩化マグネシウム、150mM塩化ナトリウム、5mMのATP、60μMの[14C]ホスホセリン、1μMのSepRS酵素及び20μMのtRNAPaUA又はtRNACPaAを含む100mMのHEPES−NaOH緩衝液(pH7.6)10μL中、50℃にて行なった。10分間反応させた後、7μLの反応混合液を取り出し、10%トリクロロ酢酸(TCA)で平衡化したろ紙(ワットマン、3mm)上で反応を停止した。ろ紙を5%氷冷TCA溶液で3回洗浄し、次に100%エタノールで1回洗浄した。ろ紙上に沈殿した[14C]Sep−tRNAの放射活性をシンチレーションカウンターで計測した。各実験は3回繰り返し、その平均値で示した。その結果を図4に示す。
ホスホセリン結合反応の動力学的解析は、20mM塩化マグネシウム、150mM塩化ナトリウム、5mMのATP、100μMの[14C]ホスホセリン、1、2、5、10、20、40、80又は100μMのtRNA(tRNACys、tRNAOpal、tRNAAmber、tRNAPaUA又はtRNACPaA)及びSepRS酵素を含む100mMのHEPES−NaOH緩衝液(pH7.6)15μL中、50℃にて行なった。tRNACysの動力学的パラメーターを決定するためには、1μMの野生型SepRS又は2μMのSepRS(E418N、E420N、T423V)を用い、tRNAOpal、tRNAAmber、及びtRNAPaUAのためには、2μMのSepRS(E418N、E420N、T423V)を用い、tRNACPaAのためには、5μMのSepRS(E418N、E420N、T423V)を用いた。反応開始後30秒及び60秒経過したときに一定量(6μL)の反応混合液を取り出し、生成した[14C]Sep−tRNAを上記と同様の方法にて定量した。動力学的パラメーターは、Eadie−Hofsteeプロットを用いて計算した。
なお、前述の特許文献等の各開示を、本書に引用をもって繰り込むものとする。本発明の全開示(請求の範囲を含む)の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素の多様な組み合わせないし選択が可能である。すなわち、本発明は、請求の範囲を含む全開示、技術的思想にしたがって当業者であればなし得るであろう各種変形、修正を含むことは勿論である。
Claims (8)
- tRNA アンバー のアンチコドンの1番目の位置に、4位に置換基を有してもよい2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル(Pa)基を含み、それによってホスホセリンとのアミノアシル化反応の効率が改善されることを特徴とする改変tRNA。
- 前記アミノアシル化反応が、変異体アミノアシル−tRNA合成酵素によって触媒されるものであり、当該変異体アミノアシル−tRNA合成酵素は、
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列における418番目のEをD、N、又はQに置換したアミノ酸配列、
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列における420番目のEをD、N、Q、K、又はRに置換したアミノ酸配列、
(C)配列番号2に示す418番目のEをD、N、又はQに置換し、かつ420番目のEをD、N、又はQに置換したアミノ酸配列、又は
(D)配列番号2に示す418番目のEをNに置換し、420番目のEをNに置換し、かつ423番目のTをVに置換したアミノ酸配列で表される請求項1に記載の改変tRNA。 - 非天然塩基対を含むtRNA遺伝子から転写反応により合成される請求項1又は2に記載の改変tRNA。
- 前記tRNA遺伝子が、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅可能である請求項3に記載の改変tRNA。
- (a)ホスホセリンを活性化しうるアミノアシル−tRNA合成酵素と、
(b)前記アミノアシル−tRNA合成酵素によって認識される請求項1〜4の何れか一項に記載の改変tRNAと、
(c)7−(2−チエニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル(Ds)基を2番目又は3番目の位置に含むコドンを所望の位置に有する所望のタンパク質をコードするmRNAと、
を、4位に置換基を有してもよい2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル(Pa)基を含むヌクレオチド三リン酸、7−(2−チエニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル(Ds)基を含むヌクレオチド三リン酸及びホスホセリンの存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させるものであり、
前記アミノアシル−tRNA合成酵素は、
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列における418番目のEをD、N、又はQに置換したアミノ酸配列、
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列における420番目のEをD、N、Q、K、又はRに置換したアミノ酸配列、
(C)配列番号2に示す418番目のEをD、N、又はQに置換し、かつ420番目のEをD、N、又はQに置換したアミノ酸配列、又は
(D)配列番号2に示す418番目のEをNに置換し、420番目のEをNに置換し、かつ423番目のTをVに置換したアミノ酸配列で表されることを特徴とするホスホセリン組み込みタンパク質の製造方法。 - 前記7−(2−チエニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル(Ds)基を含むmRNAのコドンがUADsである請求項5に記載の方法。
- 請求項1〜4の何れか一項に記載の改変tRNAと、
前記改変tRNAをホスホセリンによってアミノアシル化しうる変異体アミノアシル−tRNA合成酵素であって、
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列における418番目のEをD、N、又はQに置換したアミノ酸配列、
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列における420番目のEをD、N、Q、K、又はRに置換したアミノ酸配列、
(C)配列番号2に示す418番目のEをD、N、又はQに置換し、かつ420番目のEをD、N、又はQに置換したアミノ酸配列、又は
(D)配列番号2に示す418番目のEをNに置換し、420番目のEをNに置換し、かつ423番目のTをVに置換したアミノ酸配列で表される変異体アミノアシル−tRNA合成酵素との組み合わせ。 - 請求項1〜4の何れか一項に記載の改変tRNAをコードする遺伝子と、
前記改変tRNAをホスホセリンによってアミノアシル化しうる変異体アミノアシル−tRNA合成酵素遺伝子であって、当該変異体アミノアシル−tRNA合成酵素は、
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列における418番目のEをD、N、又はQに置換したアミノ酸配列、
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列における420番目のEをD、N、Q、K、又はRに置換したアミノ酸配列、
(C)配列番号2に示す418番目のEをD、N、又はQに置換し、かつ420番目のEをD、N、又はQに置換したアミノ酸配列、又は
(D)配列番号2に示す418番目のEをNに置換し、420番目のEをNに置換し、かつ423番目のTをVに置換したアミノ酸配列で表される、変異体アミノアシル−tRNA合成酵素遺伝子との組み合わせ。
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