JP2007061087A - 新規人工塩基対及びその利用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規人工塩基対に基づく核酸、ならびに当該核酸の調製方法、利用を提供する。
【解決手段】
本発明の核酸は、置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している。本発明の核酸の調製方法は、置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、6位置換された9H−プリン−9−イル基を有するヌクレオチドを組み込む、ことを含む。
【選択図】 なし
Description
天然の二本鎖DNA中のAとT及びGとCは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的」な塩基対を形成している。非天然型塩基対の研究は塩基間の水素結合を利用した組み合わせや塩基の疎水性を利用した組み合わせ等が知られているが、複製、転写、翻訳の工程全てにおいて天然型塩基対に拮抗し得るものは見出されていない。このような状況において複製、転写、翻訳の少なくとも一工程において天然型塩基対に拮抗し得る非天然型塩基対は特異的な有用性を持つものである。
最近、RNA医療の関心が高まる中で、RNA中への蛍光プローブの導入は、RNAの蛍光標識化法、そして、RNAの複雑な高次構造を解析するための重要なテクノロジーの1つになっている。後者の構造解析用の蛍光プローブとしては、蛍光性の塩基(2−アミノプリンなど)をもつヌクレオチドを利用する方法が従来から用いられている。この点、上述した2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)は蛍光塩基であり、これを塩基として含むヌクレオチドは強い蛍光特性を有する。従って、sを塩基として含むヌクレオチドをRNA中の任意の部位に導入することができれば、有用な蛍光プローブの調製が可能となる。
A1)2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基;
A2)2−ホルミル−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
A3)2−ホルミル−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;及び
A4)2−ホルミル−4−エチニル−1H−ピロール−1−イル基
からなるグループから選択され、そして
前記6位置換された9H−プリン−9−イル基が、
B1)2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B2)6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B3)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B4)6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B5)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B6)6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B7)2−アミノ−6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B8)6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B9)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B10)6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B11)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;及び
B12)6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基
からなるグループから選択される。
本発明はまた、6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法を提供する。本発明の調製方法は、置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、6位置換された9H−プリン−9−イル基を有するヌクレオチドを組み込む、ことを含む。
I) i)本発明の核酸の調製方法によって調製された、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、と、
ii)5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している前記ヌクレオチド、を含む核酸、とをハイブリダイズさせ、そして、
II) 蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
i) 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ii) 5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸を調製する方法を提供することを目的とする。本発明の調製方法は、
iii) 置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに
iv) 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド
を含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記iii)のヌクレオチドの相補的な位置に、前記i)のヌクレオチドを組み込み、そして、前記iv)のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ii)のヌクレオチドを組み込む
ことを含む。
本発明はまた、6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドと5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドとを、同一の鎖上に含む、本発明の核酸のステム−ループ(ヘアピン)構造形成の検出方法を提供することを含む。本発明の検出方法は、
1) 本発明の核酸において、i)のヌクレオチドと、ii)のヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、そして、
2) 蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
よって、本発明はその一態様において、置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、核酸を提供する。
A1)2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基(Pa);
A2)2−ホルミル−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
A3)2−ホルミル−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;及び
A4)2−ホルミル−4−エチニル−1H−ピロール−1−イル基
からなるグループから選択されてもよい。より好ましくは、2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基である。
R1は、水素又はアミノ基であり、
R2は、置換された又は無置換の2−チエニル基又は2−チアゾリル基である。]
R2のチエニル基又はチアゾリル基は、無置換であるかあるいは、4位及び/又は5位が、メチル基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシ基からなるグループより独立して選択される一つまたはそれより多くの基で置換されていてもよい。本発明の6位置換された9H−プリン−9−イル基のうち、R2が置換された又は無置換の2−チエニル基のものを、本明細書において文脈により、「s」又は「s類似体」と呼称する。本発明の6位置換された9H−プリン−9−イル基のうち、R2が置換された又は無置換の2−チアゾリル基のものを、本明細書において文脈により、「v」又は「v類似体」と呼称する。
B1)2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s);
B2)6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s’);
B3)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B4)6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B5)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B6)6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B7)2−アミノ−6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基(v);
B8)6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B9)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B10)6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B11)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;及び
B12)6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基
からなるグループから選択されてもよい。より好ましくは、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基である。
さらにより好ましくは、前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基が、2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基であり、そして、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基が、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基である。
本発明はまた、6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法を提供する。本発明の調製方法は、置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、6位置換された9H−プリン−9−イル基を有するヌクレオチドを組み込む、ことを含む。
また、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸(DNA又はRNA)(例えば、mRNA、合成RNA)は、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。本発明の核酸は遺伝子断片やプローブなどとして使用されうる。天然の遺伝子の一部又は全部を本発明の核酸で置換した態様、天然の遺伝子に本発明のヌクレオチドを1個又はそれより多く付加したもの、又はこれらを組み合わせたものも本発明に包含される。
6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド(例えば、s)は蛍光塩基であり、これを塩基として含むヌクレオチドは強い蛍光特性を有する。
例えば、tRNA 36sの蛍光プロフィールから得られるTm値は、UVプロフィールから得られるTm値よりも高かった。このことは、全tRNA構造の安定性に比べてアンチコドン ステム−ループがより高い安定性を有することを示唆している。対照的に、tRNA16s及び17sの低い安定性(蛍光プロフィールから得られる低いTm値)は、Dループを含む部分構造は、tRNA構造全体の脆弱な部分の可能性があることを示唆している。よって、各s標識体の蛍光プロフィールから得られるTm値を、UV融解プロフィールから得られるTm値と比較することにより、s標識された局部構造の安定性の高さを判別することができる。
よって、本発明は、本発明の核酸における、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む局部領域の立体構造の解析方法を提供することを目的とする。本発明の解析方法は、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド中の、塩基に由来する蛍光強度をいろいろな環境下(温度変化、イオン濃度(例えば、マグネシウム)の変化など)で測定することを含む。
本発明はさらに、本発明の核酸の調製方法によって調製された、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸の別の利用態様の1つである、核酸の二本鎖形成の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、
I) i)本発明の核酸の調製方法によって調製された、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、と、
ii)5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している前記ヌクレオチド、を含む核酸、とをハイブリダイズさせ、そして、
II) 蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドにおいて、5位に蛍光色素は、直接又はリンカーを介して結合している。これらの標識ヌクレオシド又はヌクレオチドについては、本発明者の先行する特許出願(特願2004−324271、2004年11月8日出願、未公開)に詳述されている。
5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドの合成法は、特に限定されることはない。3−(β−D−リボフラノシル)−ピリジン−2(1H)−オンに、先ず5位に置換基を導入し、次いで、三リン酸を導入してもよい。あるいは、3−(β−D−リボフラノシル)−ピリジン−2(1H)−オンに、先ず三リン酸を導入し、次いで、置換基を導入してもよい。特に、大きな基を導入する場合、先ず、5位にアミノプロピニル基等を導入し、これに活性化した置換基を結合させてもよい。
同一の鎖上に2種類の人工塩基を含む核酸を調製する方法
本発明はさらに、
i) 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ii) 5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸を調製する方法を提供することを目的とする。本発明の調製方法は、
iii) 置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに
iv) 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド
を含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記iii)のヌクレオチドの相補的な位置に、前記i)のヌクレオチドを組み込み、そして、前記iv)のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ii)のヌクレオチドを組み込む
ことを含む。
i) 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ii) 5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸も提供する。
核酸のステム−ループ(ヘアピン)構造形成の検出方法
本発明はまた、6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドと5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドとを同一の鎖上に含む、本発明の核酸のステム−ループ(ヘアピン)構造形成の検出方法を提供することを含む。本発明の検出方法は、
1) 本発明の核酸において、i)のヌクレオチドと、ii)のヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、そして、
2) 蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを2個以上隣接して含む核酸もまた、本発明の範囲内である。
本実施例では、s−Pa塩基対合を利用してT7転写を行った。
1)試薬、溶媒等
試薬及び溶媒は、標準的な供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。エレクトロスプレイ−イオン化マススペクトル(ESI−MS)は、Waters ZMD 4000 LC/MSシステム上に記録した。DNA鋳型は、Pa(非特許文献9)及び天然塩基のホスホルアミド類を用いて、自動DNA合成機(model392,PerkinElmer Applied Biosystems,Foster City,CA)によって化学合成した。ゲル電気泳動によってオリゴヌクレオチドを精製した。
2−N−フェノキシアセチル−6−(2−チエニル)−9−(2,3−ジ−O−アセチル−1−β−D−リボフラノシル)プリン(57mg、0.1mmol)(非特許文献29)をピリジン中に溶解し、そして真空下で溶媒を留去し、試料中の水分を共沸除去した。残渣をピリジン(100μl)及びジオキサン(300μl)中に溶解した。次いで、2−クロロ−4H−1,2,3−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オン(0.11mmol)の1Mジオキサン溶液(100μl)を添加した(非特許文献25)。10分後、この溶液に0.5M ビス(トリブチルアンモニウム)ピロリン酸(0.15mmol)のDMF溶液(300μl)とトリ−n−ブチルアミン(100μl)をすばやく加えた。その反応混合物を室温で10分間かき混ぜた。次いで、1%ヨウ素溶液(ピリジン/水(98:2、v/v)溶液、2ml)を加えた。15分後、5%NaHSO3水溶液(150μl)、次いで、5mlの水を反応溶液に加えた。
化学合成されたDNA鋳型(17−mer RNA合成のための、10μMの35−merのコード鎖及び21−merの非コード鎖)を、10mM NaClを含む10mM Tris−HCl(pH7.6)緩衝溶液中で、95℃で加熱し、その後、4℃まで徐冷して、アニーリングした。
24mM MgCl2、2 mM スペルミジン、5 mM DTT、0.01% Triton X−100を含む40mM Tris−HCl(pH 8.0)緩衝溶液(20μl)中、1mM天然NTPs、若しくは1mM sTP、2μCi[γ−32P]GTP、2μM鋳型及び50単位のT7 RNAポリメラーゼ(Takara、Kyoto)の存在下で転写を行った。[γ−32P]GTPの使用により、転写産物は5’末端のみ標識され、これにより収率を求めた。37℃での3時間のインキュベーションの後、10M尿素及び0.05%BPBを含む色素溶液(20μl)を加えることにより反応を止めた。混合物を75℃で3時間加熱し、20%ポリアクリルアミド−7M尿素ゲル上で産物を分析した。
本実施例では、基質としてs(sTP)、および、非天然塩基が転写産物中の13−15番目に相当する相補的な部位に位置する、1つ若しくは2つのPa塩基を含むDNA鋳型を用いて、転写を行った。図2Aに実験スキームを示す。図2Aにおいて、17−mer RNA合成のための10μMの35−merのコード鎖及び21−merの非コード鎖の配列、並びに17−mer RNA転写産物の塩基配列は下記の通りである。
5’−ataatacgactcactataggg−3’
鋳型鎖 (配列番号2)
3’−tattatgctgagtgatatccctcgaagggannntc−5’
17−merRNA転写産物 (配列番号3)
5’−gggagcuucccunnnag−3’
本発明者らはまた、対照として、イミダゾリン−2−オン(z)(図1B)を含む別のDNA鋳型も調べた(図1B);zは、T7転写によるRNAへのsの部位特異的挿入のためのよい鋳型塩基であるが、転写効率は、天然の転写と比較して効率が低い。s−z対は塩基間に2つの水素結合が形成される可能性があるが、その形はs−Pa対に類似する。
本実施例では、転写におけるs−Pa塩基対の選択性を調べるために、Pa、z及び天然の鋳型からの転写で得られる全長(17−mer)の転写物中のヌクレオチドの組成分析を行った。転写物を[α−32P]UTP、[α−32P]ATP又は[α−32P]GTPのどれかで内部標識し、この転写産物をRNase T2でヌクレオシド3’リン酸体にまで完全に分解した。得られた標識ヌクレオチドを2D−TLCで分析し(図3)、そして各ヌクレオシド3’−一リン酸のスポットを定量した(表1)。
表1 T7転写産物のヌクレオチド組成分析
b: 値は、下記の式を用いて決定された:
(各ヌクレオチドの放射活性)/[全てのヌクレオチド3’−一リン酸]×([α−32P]NTPの5’側のヌクレオチドの総数]
c: 各ヌクレオチドの理論的な数は、角型括弧書きで示す。
e: 検出されず
図3及び表1に示した結果より、1つのPa塩基を含む鋳型を用いた場合では、高い選択性でRNA中へのsの取り込みが確認された。図3では、Paを含む鋳型を用いて[γ−32P]UTPで標識した場合にのみ、標識されたs−ヌクレオシド3’−一リン酸が2D−TLC上で観察された。さらに、表1に示されたように、鋳型DNA中のPaに相補してRNA中に取り込まれたsの選択性(97%)(表1、エントリー1)は、s−z塩基対での場合の選択性(表1、エントリー2)、又は天然型塩基対のみでの転写の選択性と同じくらい高く(表1、エントリー3及び5)、そして、鋳型中の天然型の塩基に相補した間違ったsTPの取り込みは観察されなかった(表1、エントリー4及び6)。2つのPa塩基を含む鋳型を用いた転写の場合、1番目の位置におけるsの取り込みの選択性は十分に高かったが(95%)、2番目の位置におけるsの取り込みの選択性は84−87%程度であった。しかし、sTPの濃度を上げる(3mM)ことによって、この選択性はある程度(89−93%)改善された。従って、RNA中へのsの部位特異的取り込みに用いる鋳型塩基として、Paはzよりも優れており、そして、この結果は、非水素結合性の塩基対も転写において機能しうることを示唆している。
1)16s、17s、36s、47s、57s及び59s tRNAの調製
蛍光プローブとしてのs塩基の有用性を示すために、本発明者らは、sを酵母由来のtRNAPheの特定の部位に取り込ませ、そしてtRNAの各部位におけるsの蛍光特性をいろいろな条件下で分析することにより、tRNAの高次構造を調べた。s塩基の蛍光は、近隣の塩基による塩基積み重ね(stacking)によって消光されるため、RNA分子中のsの周囲の局部構造についての情報が得られる。
この配列では、C2−G71塩基対はG2−C71(非特許文献26)で置換されている。鋳型鎖DNAの5’末端の2つのヌクレオシド(G及びT)は、2'−O−メチルリボヌクレオシドで置換することにより、目的とする産物よりも長くなってしまう鋳型非依存の転写産物の生成を抑えている(非特許文献27)。
図4−6に、酵母由来のtRNAPhe中のsの導入部位及びtRNAの構造(非特許文献20)を示す。図4は、オリジナルなtRNAの2次構造である。sで置換された塩基は○で囲んである。波線は塩基−塩基相互作用を示す。ボックスで囲んだG−C塩基対はオリジナルのtRNA中ではC−G塩基対であるが、この置換ではtRNAの高次構造(非特許文献26)は有意に変わっていない。
sを特定の部位に含む各tRNAの蛍光スペクトル及びUV溶解曲線を、20から90℃までの範囲で、0.5℃/分の加熱速度で、各々、FP−6500分光蛍光計(JASCO)、及びUV−2450分光光度計(SHIMADZU)を用いて記録した。
16s、17s、36s、47s、57s及び59s tRNAの、434nmでの蛍光強度の温度依存変化によって得られる融解曲線(実線)及び260nmにおけるUV吸収の変化によって得られる融解曲線(波線)を図9に示す。
s−Pa塩基対を転写に用いることにより、蛍光性の人工塩基sをRNA中に効率よく導入することが出来るようになった。このs−Pa塩基対を、本発明者らが既に開発しているv−y塩基対と組み合わせることにより、1本のRNA中にsとy、あるいは、sと5位を修飾したyを、それぞれ任意の位置に導入することができる。特に、FAMを導入したyを利用することにより、sとFAM−yの間でFRETを観察することができる。
(sとyを部位特異的に含むRNA 39−merの解析).
二本鎖の鋳型DNA(5μM)のアニーリング操作は、10mM NaClを含む10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.6)中で行われた(温度条件:95℃で3分間加熱後、−0.1℃/秒の勾配で4℃まで徐冷)。T7転写反応は、40mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、8mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、2μCi[γ−32P]GTP、1mM NTPs、0−1mM sTP、0−1mM yTP、0.5μM 鋳型DNA、および50unitsのT7 RNA polymerase(Takara)を含む反応溶液(全量 20μl)で行った。37℃、3時間反応を行った後、10M 尿素を含む電気泳動用色素溶液を等量(20μl)加えて反応を停止させた。この溶液を75℃で3分間加熱後、15% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲルで電気泳動を行い、転写物をバイオイメージアナライザーで解析した(図10)。
T7 RNAポリメラーゼによる転写反応を、40mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、8mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、2μCi[α−32P]ATPまたは2μCi[α−32P]GTPまたは2μCi[α−32P]CTPまたは2μCi[α−32P]UTP、1mM NTPs、0−1mM sTP、0−1mM yTP、0.5μM 鋳型DNA、および50unitsのT7 RNA polymerase(Takara)を含む反応溶液で行った。転写物を、15% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲルによる電気泳動により精製し、ゲルからの溶出を行った後、tRNA(0.05 OD)を加えてエタノール沈殿を行い回収した。このサンプルを滅菌水10μlに溶解し、溶液(8.5μl)を用いてRNaseT2による完全分解反応を行った。溶液(8.5μl)にRNase T2(1.5μl,0.5U/μl)を加えて、37℃で2時間反応を行った。この溶液の一部をTLC(Merck,10cmx10cm)にスポットし、二次元展開を行った。展開液として、一次元目はイソ酪酸:濃アンモニア水:水=66:1:33(v/v/v)、二次元目は2−プロパノール:塩酸:水=65:10:25(v/v/v)を用いた。展開後のスポットをバイオイメージアナライザーで検出し、解析を行った(図11、表4)。
(sとy、もしくはsとFAM−yを部位特異的に含むRNA 39−merの調製).
T7転写反応は、40mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、8mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、1mM NTPs、1mM sTP、1mM yTPまたは1mM FAM−yTP、0.5μM 鋳型DNA、および125unitsのT7 RNA polymerase(Takara)を含む反応溶液(全量50μl)で行った。37℃、6時間反応を行った後、DNase I溶液を加えて、37℃で15分間保温することで鋳型DNAを分解した。10M 尿素を含む電気泳動用色素溶液を等量(50μl)加えて反応を停止させた後、反応溶液を75℃で3分間加熱してから、15% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲルで電気泳動を行い、目的の転写物39−merを精製した。ゲルから滅菌水で溶出した後、エタノール沈澱を行い、転写物を回収し、UV吸収から目的の転写物RNA 39−merの濃度を決定した。
sとy、もしくはsとFAM−yを部位特異的に含むRNA 39−mer(0.2μM)を用いて、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、100mM NaCl、0.1mM EDTA中での蛍光スペクトルを20℃で測定した。測定前のRNAサンプルのアニーリング操作では、RNA 39−mer(0.2μM)を含む溶液、およびRNA 39−merとその39−merに相補的な配列を持つ相補性RNA 42−mer(0.4μM)を含む溶液を75℃で3分間加熱した後、−0.1℃/3秒の勾配で4℃まで徐冷を行った。アニーリング操作を行ったサンプルは、4℃で保管され、測定時は、サンプルを測定セルに移してから20℃に2分以上放置した後にスペクトル走査(360−650nm)を開始した。蛍光測定(励起波長350nm)には、3x3mmセルを用い、レスポンス 0.5s、走査速度 2000nm/分、感度はマニュアル設定でPMT 500Vに固定、スリットバンド幅は5nmに固定してスペクトル測定を行った(図12)。
図10は、v−y塩基対とs−Pa塩基対を用いた転写によるRNAへのyとsの部位特異的導入の戦略と転写産物のポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す。
b: 値は、下記の式を用いて決定された:
(各ヌクレオチドの放射活性)/[全てのヌクレオチド(3’−一リン酸)]×([α−32P]NTPの5’隣りのヌクレオチドの総数]
c: 各ヌクレオチドの理論的な数は、角型括弧書きで示す。
e: 検出されず
転写では、yTPの量を0.5mMと1mMで行った結果を示してある。エントリー1−8の結果は、全て、理論値(カッコ内の数値)と良く一致している。エントリー9−14では、天然型塩基のみの鋳型DNAを用いた場合についての結果であるが、エントリー10において、1mMのyTPを用いた場合にわずかにypが天然型の鋳型塩基に相補して取り込まれていることがわかった。したがって、転写におけるyTPの量は、0.5mMのほうが良い。以上の結果から、s−Pa塩基対とv−y塩基対を組み合わせて転写を行うことにより、1本のRNA中にsとyをそれぞれ選択的に導入できることがわかった。
DNA/RNA二本鎖において、蛍光性の人工塩基である2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基または2−アミノ−6−(チアゾリル)プリン−9−イル基(以下、本実施例においてそれぞれsまたはvと称する)、およびフルオロフォアを連結した2−オキソ−(1H)ピリジン−3−イル基(以下、本実施例においてyと称する)の間でFRET実験を行った。sまたはvの発光スペクトルは、FAMが連結した5−(3−アミノ−1−プロピニル)−y(FAM−yTP)またはFAMが連結した5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−y(FAM−hx−yTP)であるヌクレオチド誘導体の吸収スペクトルと重なった(図13a)。よって、DNAフラグメント中のsまたはvは蛍光ドナーとして作用し、そして相補的なRNAフラグメント中のFAM−yまたはFAM−hx−yは蛍光アクセプターとして作用する。
人工塩基sまたはvを含むDNAは、例えば、国際公開WO 01/05801号または国際公開WO 2005/026187号に記載の方法に従って、人工塩基sまたはvを含むヌクレオチドのシアノエチルホスホロアミダイト誘導体を用いて、当該技術分野に周知のDNA化学合成法により合成した。化学的に合成された35merのDNAの配列は、5’−CAN1N2N3CTCGGGATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT−3’(配列番号20;ここで、N1N2N3が;CTsまたはCTvのDNAをそれぞれDNA35s1またはDNA35v1;CssまたはCvvのDNAをそれぞれDNA35s2aまたはDNA35v2a;sTsまたはvTvのDNAをそれぞれDNA35s2bまたはDNA35v2b;と称する)とした。得られたDNAはゲル電気泳動によって精製した。
FAM−yまたはFAM−hx−yをN’の位置で含有する17merのRNA(5’−GGGAAUCCCGAGN’AGUG−3’:配列番号21)を、T7 RNAポリメラーゼおよびFAM−yまたはFAM−hx−yの基質(FAM−yTPまたはFAM−hx−yTP)を用いてT7転写により調製した。鋳型(コード鎖としてDNA35v1、非コード鎖として5’−ATAATACGACTCACTATAGGG−3’(配列番号22)をそれぞれ10μM)を、10mM Tris−HCl(pH7.6)および10mM NaClを含む緩衝溶液中で、95℃で加熱し、その後、4℃まで徐冷して、アニーリングした。転写反応は、40mM Tris−HCl(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、および0.01% Triton X−100を含む緩衝溶液中、1mM 天然NTPs、1mM FAM−yTPまたはFAM−hx−yTP、2μM 鋳型、および2.5ユニット/μL T7 RNAポリメラーゼ(Takara)の存在下で行った。37℃で3時間インキュベーションした後、10M 尿素および0.05% BPBを含有する色素溶液を等量加えることにより反応を止めた。反応混合物は75℃で3分間加熱し、そして17−merの転写物をゲル電気泳動により精製した。
蛍光スペクトルは10mM リン酸ナトリウム(pH7.0)、100mM NaCl、および0.1mM EDTAを含む緩衝液中で測定した。発光スペクトルはsについて350nm、vについて360nmの励起波長で記録した。発光のスペクトルバンドパスは5nmであった。
共鳴エネルギー転移は、sまたはvの低蛍光状態からFAM−yまたはFAM−hx−yの高蛍光状態の間で観察された。DNA35s1またはDNA35v1が、FAM−yまたはFAM−hx−yを部位特異的に含む17−mer RNAと20℃で二本鎖を形成したときにFRETが生じ、そして70℃で二本鎖が変性したときにFRETは有意に減少した(図14aおよびb)。加えて、DNA35s2aおよびDNA35v2aと、FAM−yまたはFAM−hx−yを部位特異的に含むRNAとの二本鎖においても、FRETが効率よく生じた(図14cおよびd)。
Claims (26)
- 置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、核酸。
- 前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基が、
A1)2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基;
A2)2−ホルミル−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
A3)2−ホルミル−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;及び
A4)2−ホルミル−4−エチニル−1H−ピロール−1−イル基
からなるグループから選択され、そして
前記6位置換された9H−プリン−9−イル基が、
B1)2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B2)6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B3)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B4)6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B5)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B6)6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B7)2−アミノ−6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B8)6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B9)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B10)6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B11)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;及び
B12)6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基
からなるグループから選択される、
請求項1に記載の核酸。 - 前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基が、2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基であり、そして、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基が、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基である、請求項1又は2に記載の核酸。
- 転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で、塩基対を形成している、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドがDNAの一部であり、そして、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドがRNAの一部である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の核酸。
- 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、6位置換された9H−プリン−9−イル基を有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法。 - 前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基が、
A1)2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基;
A2)2−ホルミル−4−(1−プロピン−1−イル)−1H−ピロール−1−イル基;
A3)2−ホルミル−4−メチル−1H−ピロール−1−イル基;及び
A4)2−ホルミル−4−エチニル−1H−ピロール−1−イル基
からなるグループから選択され、そして
前記6位置換された9H−プリン−9−イル基が、
B1)2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B2)6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B3)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B4)6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B5)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B6)6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B7)2−アミノ−6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B8)6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B9)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B10)6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B11)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;及び
B12)6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基
からなるグループから選択される、
請求項6に記載の調製方法。 - 鋳型において、前記置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチドが2個以上存在する、請求項6又は7に記載の調製方法。
- 請求項6ないし8に記載の方法によって調製された、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸。
- tRNA、mRNA、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はsiRNAである、請求項9に記載の核酸。
- 前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド中の、塩基に由来する蛍光強度の温度変化および/またはイオン濃度変化を測定する、ことを含む、請求項9又は10に記載の核酸における、前記ヌクレオチドを含む局部領域の立体構造の解析方法。
- 前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド中の、塩基に由来する蛍光強度が、温度の上昇に伴い実質的に上昇する場合には、生体内温度下で、前記ヌクレオチドは立体配座において周囲に存在するヌクレオチドと積み重なっていると判断し、そして、蛍光強度が温度の上昇に伴い実質的に低下又は上昇しない場合には、生体内温度下で、前記ヌクレオチドは外部に暴露していると判断する、請求項11に記載の解析方法。
- I) i)請求項6ないし8に記載の方法によって調製された、前記6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、と、
ii)5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している前記ヌクレオチド、を含む核酸、とをハイブリダイズさせ、そして、
II) 蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。 - I)i)の6位置換された9H−プリン−9−イル基が、
B1)2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B2)6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B3)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B4)6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B5)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B6)6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B7)2−アミノ−6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B8)6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B9)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B10)6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B11)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;及び
B12)6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基
からなるグループから選択される、請求項13に記載の検出方法。 - I)ii)の核酸が、塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)又は6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)が直接又はリンカーを介して-結合している、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸である、請求項13又は14に記載の検出方法。
- i) 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ii) 5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸を調製する方法であって、
iii) 置換された若しくは無置換の2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに
iv) 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド
を含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記iii)のヌクレオチドの相補的な位置に、前記i)のヌクレオチドを組み込み、そして、前記iv)のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ii)のヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法。 - 請求項16に記載の方法によって調製された、
i) 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ii) 5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸。 - tRNA、mRNA、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はsiRNAである、請求項17に記載の核酸。
- 核酸のステム−ループ又はヘアピン構造形成の検出方法であって、
1) 請求項17又は18に記載の核酸において、i)のヌクレオチドと、ii)のヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、そして、
2) 蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸のステム−ループ又はヘアピン構造形成の検出方法。 - 核酸のステム−ループ又はヘアピン構造が、請求項17又は18に記載の核酸が、標的分子と結合することによって形成される、請求項19の検出方法。
- 6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを、2個以上隣接して含む核酸。
- tRNA、mRNA、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はsiRNAである、請求項21に記載の核酸。
- I) i)6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを、2個以上隣接して含む核酸、と、
ii)5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している前記ヌクレオチド、を含む核酸、とをハイブリダイズさせ、そして、
II) 蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。 - I)i)の6位置換された9H−プリン−9−イル基が、
B1)2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B2)6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B3)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B4)6−(4−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B5)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B6)6−(5−メチル−2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基;
B7)2−アミノ−6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B8)6−(2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B9)2−アミノ−6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B10)6−(4−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;
B11)2−アミノ−6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基;及び
B12)6−(5−メチル−2−チアゾリル)−9H−プリン−9−イル基
からなるグループから選択される、請求項23に記載の検出方法。 - I)ii)の核酸が、塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)又は6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)が直接又はリンカーを介して結合している、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸である、請求項23又は24に記載の検出方法。
- 核酸のステム−ループ又はヘアピン構造形成の検出方法であって、
1) i)6位置換された9H−プリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチド、並びに、
ii)5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している前記ヌクレオチド、を同一鎖上に含む核酸であって、i)のヌクレオチドを隣接して2個以上含む前記核酸、において、i)のヌクレオチドと、ii)のヌクレオチドをハイブリダイズさせ、そして
2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、前記方法。
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