CN101268188A

CN101268188A - 新型人工碱基对及其应用

Info

Publication number: CN101268188A
Application number: CNA2006800290296A
Authority: CN
Inventors: 平尾一郎; 平尾路子; 横山茂之
Original assignee: Independent Administrative Institution Physical Chemistry Institute
Current assignee: Independent Administrative Institution Physical Chemistry Institute; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2005-08-04
Filing date: 2006-08-04
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2026-08-04
Also published as: KR20080034019A; DE602006019611D1; EP1921141A1; WO2007015557A1; US8212014B2; JP5649018B2; JP2007061087A; HK1120292A1; CN101268188B; US20100285598A1; AU2006276413A1; EP1921141B1; EP1921141A4

Abstract

本发明提供基于新型人工碱基对的核酸，以及相应核酸的制备方法、应用。本发明的核酸中，具有取代的或者无取代的2－甲酰－1H－吡咯－1－基为碱基的核苷酸与具有6位取代的9H－嘌呤－9－基为碱基的核苷酸形成碱基对。本发明的核酸的制备方法包括：以含有具有取代的或者无取代的2－甲酰－1H－吡咯－1－基为碱基的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在前述具有取代或无取代的2－甲酰－1H－吡咯－1－基为碱基的核苷酸的互补位置插入具有6位取代的9H－嘌呤－9－基为碱基的核苷酸。

Description

新型人工碱基对及其应用

技术领域

本申请主张以日本专利申请、特愿2005-226492(2005年8月4日请)和特愿2006-182062(2006年6月30日)为基础的优先权。基础申请的内容全部被本申请所沿用。

本发明涉及基于新型人工碱基对的核酸+++及其应用。

背景技术

生物高分子核酸(DNA、RNA)仅用4种碱基的组合形成的序列记录生命活动所必需的大量遗传信息。此外，核酸通过以自身为模板利用DNA聚合酶自我复制、利用RNA聚合酶转录，经由核糖体翻译的过程，从DNA向DNA、DNA向RNA、RNA向蛋白质传递遗传信息。使这样的遗传信息的复制和传递成为可能的正是排他的碱基对形成(A·T/U、G·C)规则。此外，核酸形成多样的高级结构，发挥各种各样的功能。其中一个例子是：到目前为止，通过in vitro筛选法，发现了大量具有适体、核酶功能的新型核酸。

但是，与20种氨基酸组成的蛋白质相比，天然核酸只有四种碱基(2种碱基对)的事实限制了核酸的化学、物理多样性。例如，生物体中的tRNA、rRNA、mRNA等功能性RNA为了稳定自身的结构、稳定RNA·RNA之间、RNA·蛋白质之间的相互作用，利用了各种各样的碱基修饰。所以认为，在新型功能性核酸的开发中，扩展新碱基(对)的目录是非常有价值的。

以核酸的进一步功能扩展为目标，科学家们展开了创造具有非天然型碱基的核苷或核苷酸的竞赛。作为向核酸导入修饰碱基(或者非天然型碱基)的方法可以考虑：1)通过化学合成直接导入的方法，2)通过核酸合成酶导入的方法。1)的情况要解决amidite的稳定性和存在碱基部分的适当保护基等化学合成上的问题。此外，这些问题得到解决虽然能够位置选择性的导入各种各样的非天然型碱基，但该核酸的扩增困难，也很难合成长链的核酸。2)的情况，如果底物被酶所识别，能够在人工碱基对之间互补地复制、转录的话，就可以制备、扩增该核酸，但是这样的底物、碱基对(非天然型核苷酸)也尚在开发中。

非天然型人工碱基对的研究背景

天然双链DNA中的A、T和G、C分别通过特异的氢键互相形成“排他的”碱基对。关于非天然型碱基对的研究，已知的有利用碱基间的氢键的组合和利用碱基的疏水性的组合，但并没有发现在复制、转录、翻译的全部步骤中能够与天然型碱基对拮抗的产品。在这种情况下，在复制、转录、翻译的至少一个步骤中能够与天然型碱基对拮抗的非天然型碱基对即具有特殊的价值。

最近的非天然型非氢键碱基对的研究证明，对于在复制中有效地引入适合的核苷酸，配对碱基之间的氢键并非绝对必要，取而代之，碱基间形状的互补性在复制中发挥重要作用(非专利文献5-6)。由此可见，非氢键碱基对是创造新型生物技术、扩展基因表格和密码的潜在候补(非专利文献7-9)。

至于转录方面，能够被RNA聚合酶高选择性、高效率地识别的非氢键碱基对还未见报道。具体地说，本发明人此前开发了一种(s-y)碱基对，其基于2-氨基-6-(2-噻吩)-9H-嘌呤-9-基(s)与2-氧代-(1H)吡啶-3-基(y)的组合的氢键相互作用，并在试管内成功地合成了位点特异性地含有非天然型氨基酸的蛋白质(专利文献1、非专利文献14)。

而专利文献3开发了2-氨基-6-(2-噻唑)嘌呤-9-基(v)和2-氧代-(1H)吡啶-3-基(y)相组合的(v-y)碱基对(专利文献3)。

并且，作为s的核酸碱基对，除天然型4碱基、(s-y)外，在本发明之前还报道了(s-z)(z指2-氧杂-1，3-二氢咪唑-1-基)和(s-5位取代y)。这些(s-y)、(s-z)、(s-5位取代y)的非天然型碱基对全部包括氢键相互作用(专利文献2、非专利文献13-15)。

但是，这些非天然型碱基对中，(s-y)和(s-5位取代y)对于以y为DNA模板将s插入到RNA的转录步骤选择性不高，而(s-z)选择性虽高，却未必收率高。

[化1]

另一方面，有报道称：2-甲酰-1H-吡咯-1-基(Pa)除天然型4碱基之外，还可以与的9-甲基咪唑[(4，5)-b]吡啶(Q)形成非氢键碱基对(Pa-Q)(非专利文献9)。

[化2]

但是，对于上述非氢键碱基对，只报道了通过DNA聚合酶的翻译或通过逆转录酶的DNA合成，其能否为RNA聚合酶所识别还是未知的。T7样RNA聚合酶的单一亚基在结构和机制方面与DNA聚合酶类似(非专利文献16-17)，但根据最近的T7RNA聚合酶复合体的结构解析，RNA聚合酶和DNA聚合酶之间的差异已经明确(非专利文献17-18)。在转录中，插入的底物与模板中的碱基以“开放”的构象形成碱基对，而且在从“开放的”构象到“闭合”的构象迁移期间维持形成的碱基对(非专利文献18)。但是，在复制中，是向“闭合”构象迁移之后，碱基对才开始形成。由此可以认为，在转录中配对碱基之间的氢键比复制中更为重要，而且，还产生了非氢键碱基对在转录中是否能发挥功能的问题。

如果非天然型碱基能够介导特异性转录，那么就能够创造出具有改进功能的新型RNA分子，并扩展基因密码(非专利文献1-4)。

向RNA导入荧光探针

最近RNA治疗越来越热门，向RNA中导入荧光探针已经成为RNA荧光标记法和解析RNA复杂高级结构的重要技术之一。对于后者的结构解析用荧光探针，一直以来使用具有荧光性碱基(2-氨基嘌呤)的核苷酸。这方面，上述2-氨基-6-(噻吩)-9H-嘌呤-9-基(s)是荧光碱基，含有此碱基的核苷酸具有强烈的荧光特性。所以，如果能将含有s碱基的核苷酸导入到RNA中的任意位点，就能够制备有用的荧光探针。

但是，将具有这些荧光性碱基的核苷酸通过转录导入到RNA的已知的方法在收率方面并不尽如人意。所以，将具有s等荧光性碱基的核苷酸通过转录导入到RNA中的一定位点实际上是不能做到的，因此长链RNA的高级结构的解析很困难。

如果开发出通过转录将荧光探针导入RNA中的方法，就能够测定溶液中的RNA结构的运动学。而且，这些方法对于利用RNA的医药品的开发也会发挥作用。所以，建立使一般认为不可能的向长链RNA中导入荧光探针得以实现的方法很重要。由此，可以开发新的方法，用于生物体内的功能性RNA结构解析和其与其它分子的复合体的结构解析。

希望开发新型的人工碱基对，以在复制、转录、翻译的全部步骤中，向核酸中导入具有能够拮抗天然型碱基对的非天然型的、且赋予了荧光特性的碱基的核苷酸。

专利文献1：WO2001/005801

专利文献2：WO2004/007713

专利文献3：WO2005/026187

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非专利文献29：Fujiwara，T.，Kimoto，M.，Sugiyama，H.，Hirao，I.& Yokoyama，S.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，11，2221-2223(2001).

非专利文献30：Mitsui，T.，Kimoto，M.，Harada，Y.，Yokoyama，S.& Hirao，I.，J.Am.Chem.Soc.，127，86528658(2005)

发明内容

发明拟解决的问题

本发明的目的是提供基于新型人工碱基对的核酸。具体地说，本发明的核酸中，具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸与具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸形成碱基对。

本发明虽不限于此，但本发明的核酸优选前述取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基选自下组：

A1)2-甲酰-1H-吡咯-1-基，

A2)2-甲酰-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基，

A3)2-甲酰-4-甲基-1H-吡咯-1-基，和

A4)2-甲酰-4-乙炔基-1H-吡咯-1-基；

并且，所述6位取代的9H-嘌呤-9-基选自下组：

B1)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B2)6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B3)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B4)6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B5)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B6)6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B8)6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B9)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B10)6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B11)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和

B12)6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基。

本发明的核酸优选在转录、逆转录、复制或者翻译步骤中形成碱基对。

本发明还提供一种核酸制备方法，所述核酸含有具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。本发明的制备方法包括以含有具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在前述具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸的互补位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。

本发明的进一步目的是提供一种核酸，所述核酸含有前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，其通过上述本发明的方法制备。

本发明的另一个目的是提供本发明的核酸中包含前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的局部区域的立体结构的解析方法。本发明的解析方法包括通过改变环境，如温度变化、离子(例如镁)浓度等的变化等来测定前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸中碱基来源的荧光强度。

在一种实施方式下，本发明的解析方法是：前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸中的、碱基来源的荧光强度随温度的上升而实质上上升时，判断为在生物体内温度下，所述核苷酸在立体构象上与存在于周围的核苷酸相堆积；而荧光强度随温度上升而实质上降低或未上升时，判断为在生物体内温度下，所述核苷酸暴露于外部。

本发明的另一目的是提供核酸的双链形成的检测方法。本发明的检测方法包括：

I)使i)的核酸与ii)的核酸杂交，

其中i)的核酸是包含所述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸，其根据权利要求6至8所述的方法制备；ii)的核酸包含具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，该碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)；并且，

II)测定荧光光谱的变化。

本发明的另一目的是提供一种核酸制备方法，所述核酸在同一链上含有下述i)的核苷酸和ii)的核苷酸，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸；ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，上述碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)。

本发明的制备方法包括以含有iii)的核苷酸和iv)的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在所述iii)的核苷酸的互补位置插入所述i)的核苷酸，并且在所述iv)的核苷酸的互补位置插入所述ii)核苷酸，其中，iii)的核苷酸是具有取代或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸，iv)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。

本发明还提供通过上述方法制备的核酸。

本发明还包括提供本发明的核酸的茎环(发夹)结构形成的检测方法，所述核酸在同一链上含有具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸和具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸。本发明的检测方法包括：

1)在本发明的核酸中，使i)的核苷酸与ii)的核苷酸杂交；并且，

2)测定荧光光谱的变化。

解决问题的方法

本发明人等为了解决上述问题，研究了通过组合以前自行开发的数个非天然型碱基构建的碱基对。结果发现：2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基(s)(非专利文献13、14)和2-甲酰-1H-吡咯-1-基(Pa)(非专利文献9)(图1A)的组合在转录中表现高度的选择性和效率。也就是说，将Pa核苷酸插入到DNA模板中进行向RNA的转录反应时，能够在生成的RNA中的与DNA模板Pa互补的位置选择性且高效地导入s，从而想到了本发明。

底物s能够通过RNA聚合酶，在从DNA模板生成的RNA中，位点特异性地插入与模板中的Pa互补的位置。嘌呤碱基s具有能形成氢键的取代基(1位的氢受体基团和2位的氢供体氨基)。但是，Pa的配对表面没有这样的亲水性基团。本发明者发现：Pa碱基的甲酰基中的氧面向双链DNA的小沟(minor groove)，与聚合酶相互作用，不作为碱基对形成中的氢受体基团发挥作用(非专利文献9)。本发明中，可以认为s-Pa对没有显著的氢键相互作用，但5元环碱基Pa与s有形状互补性。

基于本发明的人工碱基对的核酸

因而，在其一种实施方式中，本发明提供一种核酸，这种核酸具有具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸和具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸形成的碱基对。

本发明中的“核苷”是指核酸碱基与糖的还原基通过糖苷键结合形成的糖苷化合物。“核酸碱基”是包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及这些碱基的衍生物的概念。“衍生物”的种类并不特别限定，具体地有例如相当于取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基的碱基、相当于6位取代的9H-嘌呤-9-基的碱基等。“核苷酸”是指前述核苷的糖部分与磷酸形成酯的化合物。优选为一、二、或三磷酸酯。核苷或者核苷酸的糖部分可以是呋喃核糖基、2’-脱氧呋喃核糖基、或者2’位具有卤素等取代基的2’-取代呋喃核糖基，而磷酸部分也可以是硫代磷酸。总之，糖部分和磷酸部分可以采用周知的核苷、核苷酸或者它们的衍生物中可见的结构。糖部分为呋喃核糖基的核糖核苷酸是RNA的构成成分，糖部分为脱氧呋喃核糖基的脱氧核糖核苷酸是DNA的构成成分。

本发明的“取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基”具有用以下通式表示的结构。

[化3]

其中吡咯环的4位R是氢，或者可以用以下任意一种取代基取代：取代或无取代的C₁-C₃烷基、取代或无取代的C₂-C₃烯基、或者取代或无取代的C₂-C₃炔基。上述烷基、烯基或炔基等可以进一步被一个或多个基团取代，所述取代基团独立地选自：低级烷基、卤素、羟基、氨基、烷基氨基和芳香族杂环。本说明书中根据上下文，称本发明的取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为“Pa”或“Pa类似物”。

并非限定，但前述取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基可以选自下组：

A1)2-甲酰-1H-吡咯-1-基(Pa)，

A2)2-甲酰-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基，

A3)2-甲酰-4-甲基-1H-吡咯-1-基，和

A4)2-甲酰-4-乙炔基-1H-吡咯-1-基。

优选2-甲酰-1H-吡咯-1-基。

本发明的具有“取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基”(“Pa”或“Pa类似物”)的核苷、核苷酸可以用周知的方法合成。其起始原料例如吡咯-2-甲醛，可以从例如Aldrich公司[1003-29-8]、Merck公司[807574]购买。而Pa衍生物基本上是从Pa衍生合成。例如Pa的4位导入了丙炔的衍生物在Bioorg.Med.Chem.Lett.，13，p.4515-4518(2003)(非专利文献28)中有所描述。

本发明的“6位取代的9H-嘌呤-9-基”具有可以用以下通式表示的结构。

[化4]

[其中，

R¹是氢或者氨基，

R²是取代或无取代的2-噻吩基或2-噻唑基。]

R²的噻吩基或噻唑基可以是无取代的，或者其4位和/或5位可被独立地选自下组的一个或多个基团取代：甲基、氨基、硝基和羟基。对于本发明的6位取代的9H-嘌呤-9-基，根据本说明书的上下文，将具有R²被取代的2-噻吩基或无取代的2-噻吩基的该化合物称为“s”或“s类似物”。对于本发明的6位取代的9H-嘌呤-9-基，根据本说明书的上下文，将具有R²被取代的2-噻唑基或无取代的2-噻唑基的该化合物称为“v”或“v类似物”。

并非限制，但前述6位取代的9H-嘌呤-9-基可以选自下组：

B1)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s)，

B2)6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s’)，

B3)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B4)6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B5)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B6)6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基(v)，

B8)6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B9)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B10)6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B11)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和

B12)6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基。

优选为2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基。

上述碱基中，B 1)是“s”、B2)到B6)是“s类似物”。B7)是“v”，B8)到B12)是“v类似物”。

更加优选前述取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基是2-甲酰-1H-吡咯-1-基，并且前述6位取代的9H-嘌呤-9-基是2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基。

本发明的“6位取代的9H-嘌呤-9-基”以及包含它的核苷、核苷酸可以用周知的方法合成。具体地，例如本说明书的实施例1中公开了从2-N-苯氧乙酰-6-(2-噻吩基)-9-(2，3-二-O-乙酰-1-β-D-呋喃核糖)嘌呤，合成2-氨基-6-(2-噻吩基)-9-(1-β-D-呋喃核糖)嘌呤5’-三磷酸(sTP)的方法。

s的合成例如Bioorg.Med.Chem.Lett.，11，p.2221-2223(2001)(非专利文献29)的第2页的第二段所述。v的合成例如专利文献3的段落0026、0027、图5-6等所述。或者，如J.Am.Chem.Soc.，127，p.8652-8658(2005)(非专利文献30)的第2页的右侧段落所述。

除了s、v以外，具有本发明的“6位取代的9H-嘌呤-9-基”的核苷、核苷酸也可以用与s或v的任何一种的合成方法同样的方法合成。例如，结合了呋喃的o可以用与s同样的合成方法合成(非专利文献29)。

本发明提供一种核酸，该核酸中具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸和具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸形成碱基对。本说明书中，“核酸”是指多于1个核苷酸沿5’→3’方向连接而成的核酸链的分子。本发明的核酸包含单链或者双链的RNA或DNA。双链可以是DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA。此外，DNA中包括以RNA为模板逆转录形成的cDNA。或者核酸也可以形成三链、四链等。

本发明人等以核酸的进一步功能扩展为目标，着手具有非天然型碱基的核苷或核苷酸的创造。作为新开发的人工碱基对的实施方式，包括具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基(例：Pa)为碱基的核苷酸和具有6位取代的9H-嘌呤-9-基(例：s)为碱基的核苷酸形成碱基对(图1)。由此，特别在使用包含Pa的DNA模板的T7RNA聚合酶转录中，可向RNA中特异地插入s。

尽管s和Pa之间不存在显著的氢键相互作用(非氢键s-Pa对)，但在转录中，s-Pa对的效率和选择性高，与天然碱基对相当。该s-Pa对比之前开发的亲水性s-z对显示更高的效率。s和Pa的互补形状互相匹配，但与天然的嘌呤类和嘧啶类的形状不同。可以认为：这种特异的立体化学匹配排除了与天然碱基的非规范的配对，其结果是，转录时能够获得s-Pa的高选择性。由此可见，形状-互补性对于转录和复制中的特异碱基配对发挥重要的作用。

本发明的具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸和具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸可以存在于不同的两条核酸上，通过碱基对形成双链。或者，两种核苷酸也可以存在于同一条核酸上。这时，通过碱基对，单链可以形成茎环结构。

本发明的具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸，或者具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，可以通过转录、复制或逆转录反应插入DNA或RNA等核酸中。或者，也可以与具有天然型碱基的核苷或核苷酸一样，通过化学合成插入DNA或RNA。

转录、复制或逆转录可以按照周知的方法进行。并非限定，但例如转录反应可以使用T7RNA聚合酶(Takara等)、复制反应可以使用Klenow大片段(KF)、逆转录反应可以使用AMV Reverse Transcriptase XL(AMV-RT)(LifeScience公司)。对于复制反应，为了防止反应中失去本发明的核苷酸，例如可以使用不具有3’→5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶(Takara Taq^TM)，也可以使用含有具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸的引物进行模板DNA的PCR扩增。

并非限定，但在一种实施方式中，本发明的核酸在核酸的转录、逆转录、复制或翻译的步骤中形成碱基对。本发明的核酸在转录步骤中形成碱基对时，前述具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸可以是DNA的一部分，并且前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸可以是RNA的一部分。

核酸的制备方法

本发明提供制备一种核酸的方法，所述核酸包含具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。本发明的制备方法包括以含有具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在上述具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸的互补位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。

关于本发明的含有2-甲酰-1H-吡咯-1-基的核苷酸和含有6位取代的9H-嘌呤-9-基的核苷酸的定义，如本说明书前面的“依赖本发明的人工碱基对的核酸”项中所述。

正如本说明书的实施例1-2中所阐明的那样，即使是模板中存在连续两个或两个以上的具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸时，转录反应也能够进行，在互补位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。所以，通过本发明的方法，使以往不可能的、存在两个或者多个连续非天然碱基s的DNA和RNA的制备得以实现。所以，一种实施方式中，本发明的制备方法的模板中存在2个以上的具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸。

本发明的另一目的是提供一种核酸，所述核酸含有前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，其通过上述本发明的方法制备。

含有本发明的核苷酸的核酸可以用作tRNA、mRNA、反义DNA或RNA、核酶或者适体。反义DNA或RNA是指抑制指定的基因表达的DNA或RNA。其因与目标基因序列(正义链)的全长或部分序列互补而得名。其可以用作人工调节基因表达的方法。含有本发明的核苷酸的反义DNA或RNA因为含有非天然型碱基，所以能够创造出对于目标的互补性与只使用天然型碱基的时候不同的产品。核酶是以RNA为构成成分的催化剂的总称。适体是通过体外筛选法获得的、具有与蛋白质等一定分子结合功能的核酸。

插入了本发明的核苷酸的核酸(DNA或RNA)(例如mRNA、合成RNA)也可以编码蛋白质、肽的全体或其一部分。本发明的核酸可以用作基因片段和探针等。本发明中还包含天然基因的一部分或全部用本发明的核酸取代的形式、向天然基因中加入1个或者多个本发明的核苷酸的产物，或者这些情况的组合。

此外，插入了本发明的含有非天然碱基的核苷酸的核酸还可以用于RNA干涉(RNA interference、RNAi)。RNA干涉是指如下现象：通过双链RNA(dsRNA)序列特异性地使mRNA分解，其结果抑制基因表达。RNA干涉的典型实例是：属于RNA酶III家族的切丁酶将dsRNA加工成3’末端具有2个碱基左右的突出端的约21碱基-23碱基的siRNA(short interferingRNA)。siRNA插入称为RISC的siRNA-蛋白质复合体，序列特异性地分解mRNA。RNA干涉是在哺乳动物(人、小鼠等)、线虫、植物、果蝇、真菌等广泛的物种之间保守的现象。插入了本发明的含有非天然碱基的核苷酸的核酸可以用作RNA干涉中的siRNA，或者将被分解的mRNA的一部分。

此外，可以设计含有本发明的核苷酸的新型密码子。如前所述，即使是模板中存在连续两个或两个以上的具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基(例如Pa)的核苷酸时，转录反应也能够进行，在互补位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸(例如s)。所以，通过本发明的方法，使以往不可能的、存在两个或者多个连续非天然碱基s的DNA和RNA的制备得以实现。因此，可以设计含有3个s的密码子(sss)、含有2个s的密码子(例如ssA、Gss、sGs)、含有1个s的密码子(例如sAG、CsT、AGs)。新型的密码子可以编码天然氨基酸，也可以编码非天然氨基酸。这样，本发明不仅仅提供新型的非天然人工碱基，通过含有本发明的核苷酸的新型密码子的设计，能够设计全新的遗传密码，提供新的遗传密码世界。

而且，通过根据本发明的新型密码子设计的tRNA体系，可以设计能够利用非常多的氨基酸的新型蛋白质合成系统。能够利用的氨基酸只要是核糖体中蛋白质合成酶系统能够利用的即可。所以，本发明提供利用前述本发明的密码子的新型蛋白质合成系统。通过本发明的蛋白质合成系统，能够用本发明的核酸高效置换所希望位置的密码子的核酸，或者通过向密码子的所希望位置导入本发明的核酸，能够制造含有所希望的非天然氨基酸的蛋白质。

立体结构的解析方法

具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸(例如s)是荧光碱基，以此为碱基的核苷酸具有强荧光特性。

具体地说，使6位结合芳香族杂环等从而扩展了电子共轭体系的嘌呤衍生物容易出现荧光特性。并非限定，但以前就知道2-氨基嘌呤具有荧光特性。所以，并非限定，但尤其是6位结合芳香族杂环且2位具有氨基的嘌呤显示强荧光特性。特别是，s、s’、和v是优选的荧光碱基。相对于以往的技术，如果能够以人工碱基对通过转录向核酸中的一定位点导入结合了荧光染料的第5碱基，那么核酸的标记以及依赖标记的核酸解析、检测就变得非常简便。本发明中使用称做Pa-s的人工碱基对，使这些得以实现。

本发明人等以荧光性人工碱基s为探针，位点特异性地荧光标记酵母tRNA^Phe，得到了相应于标记位点、温度和Mg²⁺浓度的特征性荧光光谱(实施例3)。进而，将荧光光谱与对应于同样的s标记的酵母tRNA^Phe的UV光谱相比较。其结果，得到以下结论。

第一，从含有s的各tRNA转录产物的UV吸收光谱的变化求得的熔解温度(Tm值)与从天然tRNA转录产物的UV吸收光谱的变化求得的熔解温度(Tm值)基本相同。这说明这些位置上的s取代并没有显著造成tRNA结构整体的不稳定化。

第二，一定位置含有s的各tRNA显示反映局部结构特征的荧光强度的特征性变化。也就是在tRNA的高级结构中，s与邻近的碱基堆积时，荧光强度弱，随着堆积(stacking)程度减少，荧光强度增加。该发现说明：在RNA的一定位置导入s，通过测定例如随温度变化的荧光强度变化，能够掌握高级结构中的该s的堆积状态。所以，作为含有s的RNA的用途，提供该RNA的高级结构的新解析方法。

更具体地，Mg²⁺(2和5mM)存在下的酵母tRNA^Phe的s荧光光谱明确地分为两个组。低温度下，由组1(tRNA 16s、17s和47s)发射的s荧光强度比由组2(RNA 36s、57s和59s)发射的强度大1.7-3.4倍。温度上升，则由组1发出的高强度减少，相反由组2发出的强度上升。这些结果说明：组1的s碱基在生理学温度下暴露在溶液中，并且随着温度上升发生折叠结构的变性，s碱基与其它碱基的非特异性相互作用增强。与之形成对照，对于组2的碱基，在低温下的折叠结构中，邻近的碱基堆积，并且随温度上升碱基堆积缓缓变性。该推论与tRNA的晶体结构中各位点上的原有碱基的构象(图4)(非专利文献20)极为一致。而且，组1的荧光强度在生理学温度下随Mg²⁺的添加而剧烈上升。这说明，在Mg²⁺存在下，tRNA形成活性型的L型结构，这些位置上的碱基配置在外侧。

第三，从荧光光谱得到的Tm值与从UV熔解光谱得到的Tm值相比较，反映了tRNA结构中各局部结构的稳定性。

例如，从tRNA 36s的荧光光谱得到的Tm值比从UV光谱得到的Tm值高。这说明：与全tRNA结构的稳定性相比，反密码子茎环具有更高的稳定性。相反，tRNA16s和17s的低稳定性(从荧光光谱得到的低Tm值)说明：含有D环的部分结构可能是tRNA结构整体的脆弱部分。所以通过将从各s标记物的荧光光谱得到的Tm值与从UV熔解光谱得到的Tm值相比较，能够判定经s标记的局部结构的稳定性高低。

由此可见，利用s标记的位点特异性荧光探针化，可以成为研究三维RNA分子的局部结构特征的有力工具。

因而，本发明的另一个目的是提供本发明的核酸中包含前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的局部区域的立体结构的解析方法。本发明的解析方法包括在各种环境下(如温度变化、离子(例如镁)浓度的变化等)测定前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸中碱基来源的荧光强度。

在一种实施方式下，本发明的解析方法是：前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸中的、碱基来源的荧光强度随温度的上升而实质上上升时，判断为在生物体内温度下，所述核苷酸在立体构象上与存在于周围的核苷酸相堆积；而荧光强度随温度上升实质上降低或未上升时，判断为在生物体内温度下，所述核苷酸暴露于外部。

“生物体内温度”是指各生物体在自然条件下生息时的体内的温度，其根据生物种类而变化，例如人是约35.0℃到约39.0℃，牛是约36.7℃到约39.3℃，小鼠是约35.0℃到约39.0℃，狗是约37.9℃到约39.9℃，猪是约38.7℃到约39.8℃。

“核苷酸在立体构象上与存在于周围的核苷酸相堆积”更具体地是指2个以上的碱基在优选约以内堆积的状态(stacking)。

“核苷酸暴露于外部”更具体地是指碱基部分与其它碱基不堆积(优选相距约

以上)的状态，或者碱基部分与消光性碱基充分远离的状态。

荧光强度优选根据上述6位取代的9H-嘌呤-9-基的种类，在其显示最大荧光特性的一定波长测定。例如，在最大激发波长352nm激发B1)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s)，其显示以434nm为中心的荧光波长。同样，在325nm激发B2)6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s’)，其显示以381nm为中心的荧光波长；在363nm激发B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基(v)，其显示以461nm为中心的荧光波长。

“荧光强度随温度的上升而实质上上升”是指例如在温度从20℃上升到90℃时，能够确认荧光强度上升(例如1.1倍以上)。荧光强度上升的比例越大，就表示在生物体内温度下，该荧光性碱基在立体构象上与周围存在的更多的核苷酸相堆积，和/或与周围存在的核苷酸更近距离地相堆积。

“荧光强度随温度上升实质上降低或未上升”是指例如温度从20℃上升到90℃时，能够确定荧光强度降低(例如减少10％以上)或者未变化。荧光强度降低的比例越大，说明在生物体内温度下该荧光性碱基孤立存在，其所处部分核酸的结构没有形成一定的结构。

核酸的双链形成的检测方法

本发明还提供核酸的双链形成的检测方法，这是根据本发明的核酸制备方法制备的含有前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸的其它的实施方式之一。本发明的检测方法包括：

I)使i)的核酸与ii)的核酸杂交，

其中i)的核酸是包含所述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸，其根据本发明的核酸制备方法制备；ii)的核酸包含具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，上述碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)；并且，

II)测定荧光光谱的变化。

本发明的核酸双链形成的检测方法利用了两种核酸的杂交造成的荧光光谱的变化，一种核酸包含具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，另一种核酸包含具有5位被荧光染料取代的、5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸。正如专利文献1、2和非专利文献30等所述，6位取代的9H-嘌呤-9-基(例如s、v)可与2-氧代(1H)吡啶-3-基(y)形成碱基对。而关于具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷或核苷酸的合成方法，本说明书中另外详述。

6位取代的9H-嘌呤-9-基的荧光和与其具有不同性质的荧光染料取代的5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基的荧光存在于各核酸分子中时，一旦核酸双链形成而荧光之间物理靠近，就会发生荧光共振能量转移(FRET：Fluorescence Resonance Energy Transfer)，荧光光谱发生变化。本发明的检测方法是通过测定由FRET引起的荧光光谱的变化来检测核酸的双链的形成。

“荧光共振能量转移(FRET)”是指由于共振，激发能量从某个荧光分子向其它分子转移的现象。给与能量的分子称为donor(供体)，接受的分子称为aceptor(受体)。一旦发生FRET，失去能量的供体返回基态，同时接受能量的受体变成激发态。所以，供体的荧光减弱，而如果受体是荧光分子就能够观察到其荧光。如果受体是消光分子，那么仅有供体时观察到的荧光，由于FRET将不能观察到。利用FRET的蛋白质检测、核酸检测的一般方法是周知的，例如向RNA适体中导入2种引起FRET的染料以检测目标蛋白的方法(Jhaveri et al.，2000)、利用了发夹型核酸的互补链核酸的检测方法(Tyagi et al.，1996)。其它的，关于FRET在Walter et al.，2001和Klostermeieret al.，2001上有所概述。

发生FRET需要满足以下3个条件：i)供体的荧光光谱和受体的吸收光谱有重叠。光谱的重叠范围越大越好，但没有必要完全重合。优选供体的荧光光谱和受体的吸收光谱30％以上重叠，更优选50％重叠。ii)供体和受体物理上邻近。一般认为以50％的概率发生FRET的距离为3nm至6nm，FRET的效率相对于该距离的变化而敏感地变化。例如，核酸形成双链时，相对于以具有荧光特性的6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，以与之具有不同特性的荧光染料取代的5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸与之相接近，两者的距离优选为10nm以内，更优选6nm以内，最优选3nm以内时，能够检测出荧光光谱的变化。iii)供体与受体的相对取向合适。

在本发明的检测方法的一种实施方式中，含有具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸的核酸，是在其碱基的5位上通过连接物结合有5-羧基荧光素(5-FAM)或6-羧基荧光素(6-FAM)的含有具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸的核酸。

如前所述，例如s的最大激发波长为353nm，且用352nm的最大激发波长激发，则显示以434nm为中心的波长。另一方面，对于FAM，FAM的最大吸收波长为493nm，最大荧光波长为522nm。用353nm的波长激发时，具有s的核苷酸显示以434nm为中心的波长。与此相对，具有FAM取代的5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸(例如FAM-y)一接近s，就吸收s放出的荧光，而显示最大荧光波长为522nm的荧光光谱。也就是说，用353nm的波长激发时，434nm的荧光光谱越减少，522nm的荧光光谱越增加，FAM-y就越接近s即含有s的核酸与含有FAM的核酸的杂交，这样能够检测核酸的双链的形成。

具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷或核苷酸

在具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷或核苷酸中，荧光染料直接或通过连接物与5位相连。关于这些标记核苷或核苷酸，在本发明人早期提出的专利申请(特愿2004-324271，2004年11月8日申请，未公开)中有详细描述。

荧光染料可以使用周知的荧光染料，优选选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)。荧光素和罗丹明一般用开环型和螺环型两种方式表示。关于这些荧光染料，在例如Tuschl et al.，1994；Misra et al.，2004；Gibson et al.，1996和Chehab et al.，1989中详细描述。

例如，FAM的最大吸收波长为493nm，最大荧光波长为522nm。此外，TAMRA的最大吸收波长为553nm，最大荧光波长为578nm。DANSYL的最大吸收波长为335nm，最大荧光波长为518nm。HEX的最大吸收波长为535nm，最大荧光波长为556nm。TET的最大吸收波长为521nm，最大荧光波长为536nm。5-ROX的最大吸收波长为567nm，最大荧光波长为591nm。6-ROX的最大吸收波长为570nm，最大荧光波长为590nm。

具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷或核苷酸包含其5位取代基团作为荧光分子，因而可以根据荧光分子的种类进行核酸的检测。因此，作为标记核酸，可以用作检验与该核酸相互作用的物质的探针。另外，由于各荧光染料不同，荧光的颜色也不同，因此还可以用于多重染色。

荧光染料可以与2-氧代(1H)吡啶-3-基的5位直接结合，或者通过连接物与之结合。连接物的种类并不特别限定，本领域技术人员可以适当采用。并非限定，但连接物优选从下述化学式I-III中选择：

[化5]

[式I中n从1至5的整数中选择]

[化6]

[式II中m和1从1至5的整数中分别独立地选择]

和

[化7]

具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷或核苷酸的合成方法并不特别限制。可以向3-(β-D-呋喃核糖)-吡啶-2(1H)-酮中首先向5位导入取代基，接着导入三磷酸。或者，可以首先向3-(β-D-呋喃核糖)-吡啶-2(1H)-酮中导入三磷酸，接着导入取代基。特别是，导入大的基团时，可以首先向5位导入氨基丙炔基(アミノプロピニル)等，在其上连接活化的取代基。

或者，根据荧光染料不同，具有2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸的修饰可以不是在单个的核苷酸合成时进行，而是在通过转录等合成含有该核苷酸的核酸之后进行。

5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基与6位取代的9H-嘌呤-9-基在两处形成氢键。5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基在立体结构上不能与天然型嘌呤碱基A(腺嘌呤)和G(鸟嘌呤)形成碱基对。而且，6位取代的9H-嘌呤-9-基由于空间位阻不能与天然型T(胸腺嘧啶)、U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)形成碱基对。所具有6位取代的9H-嘌呤-9-基(例如s、v)与5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基可以特异性地形成碱基对。

具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸可以通过转录、复制或逆转录反应插入DNA或RNA等核酸中。具体地，使用含有具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸，例如含有s或v的模板DNA，通过T7RNA聚合酶进行转录反应，则含2-氧代(1H)吡啶-3-基的底物(例如yTP)位点特异性地、以与s或v互补的形式插入到RNA中。对于y，可以化学修饰其5位，所以能够将具有各种功能的y衍生物插入RNA中的一定位点。

或者，可以与具有天然碱基的核苷或核苷酸一样，通过化学合成插入DNA或RNA中。

制备同一链上含有2种人工碱基的核酸的方法

本发明的制备方法包括以含有iii)的核苷酸和iv)的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在所述iii)的核苷酸的互补位置组合入所述i)的核苷酸，并且在所述iv)的核苷酸的互补位置组合入所述ii)核苷酸，其中，iii)的核苷酸是具有取代或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸，iv)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。

本发明的上述制备方法将具有取代或无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸位模板插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，和具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸位模板5位插入具有取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸相组合，并加以利用。

本发明还提供通过上述方法制备的、在同一链上含有i)的核苷酸和ii)的核苷酸的核酸，其中，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸；ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，上述碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)。

本发明的上述核酸可以用作tRNA、mRNA、反义DNA或RNA、核酶或者适体。还可以用于RNA干涉(RNA interference，RNAi)。

在本说明书的实施例4中，以含有Pa和v的DNA为模板进行转录，制备了在同一链上含有s和y或s和FAM-y的RNA。

核酸的茎环(发夹)结构形成的检测方法

2)测定荧光光谱的变化。

本发明的核酸的茎环(发夹)结构形成的检测方法利用在前面“核酸的双链形成的检测方法”项中所述的FRET，也就是说，当6位取代的9H-嘌呤-9-基的荧光和与之具有不同性质的荧光染料取代的5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基的荧光位于“同一分子内”时，如果形成茎环(发夹)结构而荧光基团之间物理上接近，那么就会发生FRET，荧光光谱出现变化。本发明的检测方法是通过测定由FRET引起的荧光光谱的变化来检测检测核酸的茎环(发夹)结构的形成。

可以以与观察单独的两条核酸之间形成双链时的荧光光谱变化相同的方式，观察由核酸的茎环(发夹)结构的形成造成的FRET所引起的荧光光谱变化。

本发明优选的一种实施方式中，核酸的茎环(发夹)结构是由于下述本发明的核酸的分子内的含有s和FAM-y的自身互补序列形成茎部而形成的，所述本发明的核酸在同一链上含有具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸和具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸。这样，以核酸分子内的s和FAM-y为探针，测定两者间的FRET效率，可以得知茎环结构等核酸的高级结构。

如果设计仅在其它目标分子结合时形成茎环(发夹)结构的核酸分子，则可以制成利用荧光光谱的变化检测该目标分子的系统。所以，本发明可以用于实时分子间相互作用检测系统、实时分子内结构变化检测系统、分子灯标、利用FRET效率的分子间距离推测等。目标分子包括DNA、RNA、蛋白质等。

本说明书的实施例4中，对于在同一链上含有s和FAM-y的RNA分子，研究了s和FAM-y之间的FRET。在本说明书的实施例4中，当在350nm激发s，无论是形成茎环结构而在s与FAM-y之间形成碱基对时，还是加入互补链RNA形成分子间双链结构而s与FAM-y分离时，两种情况均能观测到FRET，出现FAM-y来源的521nm附近的荧光。但是，比较导入了s和FAM-y的片段的s的荧光强度(图12b和c的实线谱的440nm附近的强度)与作为其对照的导入了s和y的片段的s的荧光强度(图12b和c的虚线谱的440nm附近的强度)，发现形成茎环结构时s的荧光强度显著减少。茎环结构中的s与FAM-y的距离为

双链结构中s与FAM-y的距离扩大到因而，s和FAM-y的距离接近时，两者间的FRET效率提高。

含有连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸

也在本发明的范围内。

前述核酸中，由于含有连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，相邻的人工碱基之间产生自身消光，所以，与不出现连续的以9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的情况相比，此时9H-嘌呤-9-基的荧光强度显著减少(参照图13c和d)。另一方面，即使在9H-嘌呤-9-基之间产生自身消光，通过与5位被荧光染料取代的5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基的杂交，也能够观察到9H-嘌呤-9-基与荧光染料之间的FRET(参照图14c和d)。而且，在含有连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸中，由于9H-嘌呤-9-基的荧光强度减少即背景荧光低，能够高效地观察到与荧光染料之间的FRET(参照图15)。也就是说，本发明的FRET系统使用含有连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的自身消光探针，能够将荧光供体的背景抑制在低水平，所以即使在大量荧光供体探针存在下，也能够检测出含有荧光受体的互补链，从这方面来讲，其是特别有价值的。

含有连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸可以用于上述核酸的双链形成的检测方法和核酸的茎环或发夹结构形成的检测方法。

在含有连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸中，连续的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸数只要是两个以上即可，没有特别限制，优选为2至10个、2至5个、2至3个，最优选2个。

含有连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸，可以通过本发明的核酸制备方法或周知的化学合成来制备，但并不限于此。

发明的效果

本发明提示：从发现了非天然碱基的新型碱基对Pa-s来看，即使在转录中，配对的碱基之间的形状互补性也很重要(非专利文献5-6)。由此，即使是在以往认为困难的转录中，也可以插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。

与以下以往周知的获得在希望位置上具有s的RNA的方法相比，本发明的方法明显收率更高：(1)化学RNA合成法；(2)含有y核苷酸的模板DNA的转录反应；(3)含有具有2-氧杂-1，3-二氢咪唑-1-基的核苷酸(z)的模板DNA的转录反应。

以往的诸如2-氨基嘌呤核苷酸类(非专利文献21-23)的常用荧光探针，由于不能够通过转录位点特异性地插入RNA中，所以特别是很难在长链RNA分子中应用。也就是说，在以往的方法中，虽然通过化学合成将2-氨基嘌呤的核苷酸衍生物导入RNA中，但在RNA的化学合成法中，合成长链的RNA(50个核苷酸以上)困难，其操作也复杂其花费时间。其结果是，以往的方法的应用受到限制。

与此相对，本发明中可以将具有荧光特性的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸位点特异性地插入RNA中。本发明中，虽然需要化学合成用作模板的DNA，但与RNA相比，DNA的化学合成可以合成更长的链长(150个核苷酸左右)，且化学合成的DNA还能够用酶连接。这样，使以往的荧光探针法做不到的长链RNA分析得以实现。这可以成为大RNA分子内一定位置的局部构象变化动态研究的最强有力工具。在本发明的实施例3中，实际上进行了tRNA内局部高级结构的解析。

此外，现在发现了RNA干涉等RNA在生物体内的许多新功能，利用这些现象的医药品的开发也正在进行。但是，研究这些RNA分子的生物体内行为的方法并不多。所以，本荧光探针法成为生物体内的RNA解析以及研究RNA医药品在生物体内的作用的良好方法。

而且，本发明中最新阐明的s-Pa碱基对能够通过翻译将氨基酸类似物位点特异性地插入蛋白质中，所以可以实际应用于基因密码的扩展。

附图说明

(图1)图1显示非天然型s-Pa(A)碱基对和s-z(B)碱基对。

(图2)图2显示s-Pa碱基对介导的T7转录的实验方案，和转录产物的凝胶电泳结果。

图2A：实验方案

图2B：使用含有1个或2个Pa或z碱基的模板DNA、加入天然NTPs(1mM)和sTP(1mM)时的转录产物的凝胶电泳。转录产物用[γ-³²P]GTP标记其5’末端。各转录产物的相对收率通过与全部由天然碱基组成的模板的转录产物的收率进行比较来决定，各收率从3～4个数据组求平均值得到。

(图3)图3显示由转录产物(17-mer)的核酸酶消化获得的标记核糖核苷3’-一磷酸的2D-TLC分析。其为转录产物用[α-³²P]NTP内部标记、由在1mM sTP存在下转录的17-mer片段得到的二维TLC。中图中模板DNA中的N₁N₂N₃为PaAC，右图中的N₁N₂N₃为CAC。

(图4)图4显示向酵母来源的tRNA^Phe中导入s的位点和tRNA的结构(非专利文献20)。图4是原始tRNA转录产物的二维结构。s取代的位置用○圈出。虚线显示三维结构上的碱基-碱基相互作用。划框的G-C对从原始的C-G-对变化而来，该变化未显著改变原始tRNA的结构(非专利文献26)。

(图5)图5显示向酵母来源的tRNA^Phe中导入s的位点和tRNA的结构(非专利文献20)。图5是原型tRNA转录产物的三维结构。

(图6)图6A～C是包括向酵母来源的tRNA^Phe中导入s的位点的区域的扩大图。深色的碱基(群)是取代为s的位点，这些碱基与浅色碱基(群)堆积，且球(黄色)表示Mg²⁺。图中的碱基表示被修饰的碱基，括号内记载的碱基相当于原始转录产物中的碱基。

(图7)图7A显示s的核糖核苷(1μM)的激发和荧光光谱。黑圆实线表示用352nm激发的荧光光谱。白圆虚线表示用434nm激发的荧光光谱。

图7B和C显示用352nm激发的(B)tRNA 47s(1μM)的荧光光谱；和(C)tRNA 57s(1μM)的荧光光谱。荧光光谱在50mM二甲胂酸钠(pH 7.2)、50mM KCl和0.1mM EDTA中，20℃下测定。(B)中黑圆实线、白圆实线和×实线分别表示tRNA 47s在0mM Mg²⁺、2mM Mg²⁺和5mM Mg²⁺存在下的荧光光谱。(C)中黑圆实线、白圆实线和×实线分别表示tRNA 57s在0mMMg²⁺、2mM Mg²⁺和5mM Mg²⁺存在下的荧光光谱。

(图8)图8显示(A)s核糖核苷的荧光强度的温度依赖性，(B)用s的核糖核苷修正tRNA 36s的荧光强度的实例。tRNA转录产物的荧光强度通过等式Yct＝Yt/(Rt/R20)来修正。其中，Yct是t℃的各tRNA的修正后强度，Yt是t℃的各tRNA的测定荧光强度，Rt是t℃的s的核糖核苷的观察到的荧光强度，R20是20℃的s的核糖核苷的观测到的荧光强度。

(图9)显示在各种位置包含s的tRNA的、通过434nm的荧光强度变化求得的熔解曲线(实线)和通过260nm的UV吸收变化求得的熔解曲线(虚线)。粗(黑)实线、中(蓝)实线、细实线(红)分别表示通过0mM Mg²⁺、2mM Mg²⁺和5mM Mg²⁺存在下的434nm的荧光强度变化求得的熔解曲线。粗(黑)虚线、中(蓝)虚线、细虚线(红)分别表示通过0mM Mg²⁺、2mM Mg²⁺和5mM Mg²⁺存在下的260nm的荧光强度变化求得的熔解曲线。

(图10)显示通过利用v-y碱基对和s-Pa碱基对的转录，将y和s位点特异性地导入RNA中的方法，和转录产物的聚丙烯酰胺电泳结果。在图10a中，序列中的P表示人工碱基Pa。

(图11)图11显示通过利用v-y碱基对和s-Pa碱基对的转录制备的转录产物(Bhp2-1)的核苷酸组成的分析结果。在图11b中，各点的定量归纳于表4中。

(图12)图12显示导入了人工碱基s和y或FAM-y的RNA(Bbp2-1)的荧光测定结果。图12b显示Bhp2-1与互补性RNA形成双链时的荧光光谱。图12c显示Bhp2-1单链形成发夹结构时的结果。图12b和图12c两者中，实线为13位有FAM-y、36位有s的Bhp2-1的结果，虚线为13位有y、36位有s的Bhp2-1的结果。

(图13)图13a为磷酸缓冲液(pH 7.0)中s脱氧核糖核苷(细线)和FAM-yTP(粗线)的荧光(flu，黑线)和吸收(abs，虚线)光谱。图13b是FRET实验的方案。对于非天然碱基，当对s或v进行激发(λ_ex)时，用黑圆表示低荧光状态，用白圆表示高荧光状态。图13c和d是包含s碱基(c：DNA35s1、DNA35s2a和DNA35s2b)和包含v碱基(c：DNA35v1、DNA35v2a和DNA35v2b)的单链DNA的稳态荧光发射光谱。

(图14)图14显示DNA/RNA双链的稳态荧光发射光谱。使各35-mer DNA(a，DNA35s1；b，DNA35v1；c，DNA35s2a；d，DNA35v2a；e，DNA35s2b；f，DNA35v2b)与含有FAM-y(白圆和黑圆)或FAM-hx-y(白三角或黑三角)的17-mer RNA杂交。白圆和白三角是20℃的光谱，黑圆和黑三角是70℃的光谱。

(图15)图15显示过量使用含有人工碱基的DNA探针时的DNA/RNA双链的稳态荧光发光光谱。使各35-mer DNA(1μM)(a，DNA35s1；b，DNA35v1；c，DNA35s2a；d，DNA35v2a)与含有FAM-y(白圆和黑圆)或FAM-hx-y(白三角和黑三角)的17-mer RNA(100nM)杂交。白圆和白三角是20℃的光谱，黑圆和黑三角是70℃的光谱。

实施例

以下通过实施例具体说明本发明，但这些并不限定本发明的技术范围。本领域技术人员根据本说明书的描述可以很容易地对本发明加以修饰、变更，这些全部包括在本发明的技术范围内。

实施例1：利用s-Pa碱基配对的T7转录

在本实施例中，利用s-Pa碱基对进行T7转录。

1)试剂、溶剂等

试剂和溶剂从标准的供应商购入，不需进一步纯化即可使用。电喷雾电离质谱(ESI-MS)在Waters ZMD 4000LC/MS系统上进行记录(記録)。DNA模板是使用Pa(非专利文献9)和天然碱基的磷酰胺类，通过自动DNA合成仪(model392，PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City，CA)化学合成的。用凝胶电泳纯化了寡核苷酸。

2)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9-(1-β-D-呋喃核糖)嘌呤5’-三磷酸(sTP)的合成

将2-N-苯氧乙酰-6-(2-噻吩基)-9-(2，3-二-O-乙酰-1-β-D-呋喃核糖)嘌呤(57mg，0.1mmol)(非专利文献29)溶解到吡啶中，在真空下蒸馏除去溶剂，共沸除去样品中的水分。将残渣溶解到吡啶(100μl)和二氧杂环己烷(300μl)中。接着，添加2-氯-4H-1，2，3-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱(ベンゾジオキサホスフオリン)-4-酮(0.11mmol)的1M二氧杂环己烷溶液(100μl)(非专利文献25)。10分钟后，向该溶液中快速添加0.5M双(三丁基铵)焦磷酸(0.15mmol)的DMF溶液(300μl)和三-正丁基胺(100μl)。将该反应混合物在室温搅拌10分钟。接着加入1％碘溶液(吡啶/水(98∶2，v/v)溶液，2ml)。15分钟后，向反应溶液中加入5％NaHSO₃水溶液(150μl)，接着，向反应液中加入5ml的水。

将溶液在室温搅拌30分钟，然后加入浓氨水(20ml)。在55℃氨解12小时。在真空下浓缩溶液，并依次通过DEAE Sephadex(A-25)柱层析(50mM至1M TEAB的线性梯度洗脱)、C18-HPLC(100mM醋酸三乙基胺中的0％至30％的CH₃CN梯度洗脱)(带有Eichorom Technologies公司的SynchropakRPP的Gilson HPLC纯化系统)来纯化产物，得到了sTP。

[化8]

¹H NMR(270MHz，D₂O)δ1.13(t，27H，J＝7.3Hz)，3.05(q，18H，J＝7.3 and 14.8Hz)，4.19(m，2H)，4.32(m，1H)，4.56(m，1H)，4.83(m，1H)，5.94(d，1H，J＝5.9Hz)，7.19(dd，1H，J＝4.0 and 4.9Hz)，7.66(d，1H，J＝4.9Hz)，8.16(d，1H，J＝4.0Hz)，8.33(s，1H).

³¹P NMR(109MHz，D₂O)δ-22.38(t，1H，J＝19.5and 20.1Hz)，-10.68(d，1H，J＝19.5Hz)，-9.24(d，1H，J＝20.1Hz).

ESI-MS for C₁₄H₁₇N₅O₁₃P₃S(M-H)：calcd，587.98；found，587.70.

3)用于T7转录的模板的制备

将化学合成的DNA模板(用于17-mer RNA合成的、10μM的35-mer的编码链和21-mer的非编码链)，在含有10mM NaCl的10mM Tris-HCl(pH7.6)缓冲液中95℃加热，然后渐渐冷却到4℃，进行了退火。

4)T7转录(17-mer RNA)

在含有24mM MgCl₂、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％Triton X-100的40mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液(20μl)中，在1mM天然NTPs或1mM sTP、2μCi[γ-³²P]GTP、2μM模板和50单位T7RNA聚合酶(Takara，Kyoto)的存在下进行了转录。通过使用[γ-³²P]GTP，转录产物仅5’末端被标记，由此求出了收率。在37℃温育3小时后，通过加入含有10M尿素和0.05％BPB的染料溶液(20μl)终止反应。将混合物在75℃加热3小时，在20％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上对产物进行了分析。

5)结果

在本实施例中，使用s(sTP)底物和下述DNA模板进行了转录，所述DNA模板含有1个或2个Pa碱基，非天然碱基位于相当于转录产物中的13-15位的互补位置上。图2A表示实验方案。图2A中，用于合成17-mer RNA的10μM的35-mer的编码链和21-mer的非编码链的序列，和17-mer RNA转录产物的碱基序列如下。

模板互补链(序列编号1)

5’-ataatacgactcactataggg-3’

模板链(序列编号2)

3’-tattatgctgagtgatatccctcgaagggannntc-5’

17-mer RNA转录产物(序列编号3)

5’-gggagcuucccunnnag-3’

作为对照，本发明人等还研究了另一DNA模板(图1B)，其含有咪唑啉-2-酮(z)；z是通过T7转录向RNA中位点特异性地插入s的良好模板碱基，但转录效率比天然转录低。s-z对可以在碱基之间形成2个氢键，其形式与s-Pa类似。

用这些模板进行3小时转录，将用[γ-³²P]GTP标记了5’末端的转录产物在凝胶电泳上进行了分析，结果如图2B所示。具体地说，图2B是用含有1个或者2个Pa或z碱基的模板，加入天然型NTP(1mM，N＝A，G，C，U)和sTP(1mM)进行转录的产物的凝胶电泳的结果。转录产物用[γ-³²P]GTP标记了其5’末端。以仅由天然型碱基组成的模板的转录产物为100％，各转录产物的相对收率与之相比较来确定。各收率取3-4个数据组的平均值。

如图2B所示，来自含有1个Pa的模板DNA的全长(17-mer)转录产物(含有1个s碱基)的相对收率为92％(图2B，泳道1，N₁＝Pa)，这比来自含有1个z的模板DNA的转录收率(35％)(图2B，泳道4)要高，且与使用仅有天然型的模板(N₁＝C)和NTP的转录的收率(图2B，泳道8)基本上同样高。在使用含有2个Pa碱基的模板的转录中，其相对收率比天然型的转录(图2B，泳道8)低，但能够得到全长的产物(图2B，泳道2和3)。作为对照，在使用含有2个z的模板的转录中，不能得到全长的转录物(图2B，泳道5和6)。

实施例2：T7转录产物(17-mer RNA)中的核苷酸组成分析

在本实施例中，为了研究转录中s-Pa碱基对的选择性，进行了Pa、z、和天然模板的转录中得到的全长(17-mer)转录物中的核苷酸的组成分析。用[α-³²P]UTP、[α-³²P]ATP或[α-³²P]GTP中的一种内部标记转录物，用RNA酶T2将该转录物完全分解成核苷3’磷酸体。用2D-TLC分析得到的标记核苷酸(图3)，并对各核苷3’一磷酸的点进行了定量(表1)。

具体地，在含有24mM MgCl₂、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％TritonX-100的40mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液(20μl)中，在10mM GMP、1mM天然型NTP(1mM，N＝A，G，C，U)、0或1或3mM sTP、2μCi[γ-³²P]UTP或[γ-³²P]ATP或[γ-³²P]GTP(Amersham)、2μM模板DNA和50单位T7RNA聚合酶(Takara)(非专利文献14、15)的存在下进行转录。在37℃温育3小时后，加入染料溶液终止了反应。

将混合物在75℃加热3小时，然后用15％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶进行了电泳。从凝胶中洗脱出全长产物，并向其中加入0.05A₂₆₀单位的大肠杆菌来源的tRNA，乙醇沉淀产物。将转录产物在15mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中用0.075U/μl的RNA酶T2在37℃消化2小时。通过该处理，转录产物被RNA酶T2完全分解成核苷3’-一磷酸。对于消化产物，通过使用MerckHPTLC板(100×100mm)(Merck，Darmstadt，Germany)的2D-TLC进行了分析。使用的展开溶剂第一维为异丁酸/NH₄OH/H₂O(66∶1∶33 v/v/v)，第二维为异丙醇/HCl/H₂O(70∶15∶15 v/v/v)。用BioImage Analyzer分析了TLC板上的产物。各点的定量是从3-9个数据组求平均值。

结果如图3所示。将定量各核苷3’-一磷酸的结果归纳在表1中。

表1T7转录产物的核苷酸组成分析

a：图2所示转录产物的插入在U(编号1-8)、A(编号9-12)或G(编号13-16)的5’侧的核苷酸的组成。

b：该值用下式确定：

(各核苷酸的放射活性)/(全部的核苷酸3’-一磷酸)×([α-³²P]NTP的5’侧的核苷酸总数)

c：各核苷酸的理论数用中括号表示。

d：标准偏差用括号表示

e：没有检测到

根据图3和表1所示的结果，可以确认使用含有1个Pa碱基的模板时，以高选择性地向RNA中插入s。在图3中，仅在使用含有Pa的模板、用[γ-³²P]UTP进行标记时，能够在2D-TLC上观察到标记的s-核苷3’-一磷酸。根据表1所示，与模板DNA中的Pa互补地向RNA中插入s的选择性(97％)(表1，编号1)与使用s-z碱基对时的选择性(表1，编号2)或仅使用天然碱基对转录时的选择性基本上同样高(表1，编号3和5)，且未观察到与模板中的天然碱基互补的、错误的sTP的插入(表1，编号4和6)。使用含有2个Pa碱基的模板进行转录时，在第1个位置上插入s的选择性非常高(95％)，但在第2个位置上插入s的选择性为84-87％左右。但是，通过提高sTP的浓度(3mM)，该选择性得到一定程度(89-93％)改善。所以，作为用于向RNA中位点特异性地插入s的模板碱基，Pa比z更好，而且，该结果提示：非氢键性碱基对也能够在转录中发挥机能。

实施例3：16s、17s、36s、47s、57s和59s tRNA的制备及其荧光光谱和UV 熔解曲线

1)16s、17s、36s、47s、57s和59s tRNA的制备

为了显示s碱基作为荧光探针的有用性，本发明人等将s插入酵母来源的tRNA的一定位点，且通过在各种条件下分析tRNA的各位点的s的荧光特性，研究了tRNA的高级结构。由于s碱基的荧光会因邻近碱基的碱基堆积(stacking)而消光，所以可以得到RNA分子中s周围的局部结构的信息。

发明人等向tRNA中的6处分别导入了s：具体地是D-环中的第16位或者第17位(tRNA 16s或17s)、反密码子中的第36位(tRNA 36s)、额外环(エキストラル一プ)中的第47位(tRNA 47s)和TψC环中的第57位或第59位(tRNA 57s或59s)。各位点的s被导入不与tRNA中的其它碱基形成碱基对的位点(图4)。

制备含有s的酵母tRNA^Phe分子的各模板序列(用于RNA合成的5μM的94-mer模板DNA及其互补链DNA)如以下表2所示(序列编号4-11)。

[表2]

1.含有s的tRNA转录产物的DNA模板序列

全tRNA转录产物的非模板链(94-mer)

ATAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGCTCAGTTGGGAGAGCGCCAGACTGAAG

ATCTGGAGGTCCTGTGTTCGATCCACAGAATTCCCACCA(序列编号：4)

原始tRNA转录产物的模板链(94-mer)(Tm＝2′-OMe-T，Gm＝2′-OMe-G)

TmGmGTGGGAATTCTGTGGATCGAACACAGGACCTCCAGATCTTCAGTCTGGCG

CTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列编号：5)

tRNA 36s的模板链(94-mer)(Tm＝2′-OMe-T，Gm＝2′-OMe-G)

TmGmGTGGGAATTCTGTGGATCGAACACAGGACCTCCAGATCPaTCAGTCTGGC

GCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列编号：8)

tRNA 47s的模板链(94-mer)(Tm＝2′-OMe-T，Gm＝2′-OMe-G)

TmGmGTGGGAATTCTGTGGATCGAACACAGGPaCCTCCAGATCTTCAGTCTGGC

GCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列编号：9)

tRNA 57s的模板链(94-mer)(Tm＝2′-OMe-T，Gm＝2′-OMe-G)

TmGmGTGGGAATTCTGTGGATPaGAACACAGGACCTCCAGATCTTCAGTCTGGC

GCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列编号：10)

tRNA 59s的模板链(94-mer)(Tm＝2′-OMe-T，Gm＝2′-OMe-G)

TmGmGTGGGAATTCTGTGGPaTCGAACACAGGACCTCCAGATCTTCAGTCTGGC

GCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列编号：11)

用于RNA合成的5μM的94-mer模板DNA及其互补链DNA序列

该序列中，C2-G71碱基对用G2-C71(非专利文献26)取代。通过用2’-O-甲基核糖核苷取代模板链DNA的5’末端的2个核苷(G和T)，来抑制比目的产物更长的非模板依赖性的转录产物的生成(非专利文献27)。

用于RNA合成的94-mer模板DNA及其互补链DNA的制备按与实施例1中的“3)用于T7转录的模板的制备”项所述相同的方式进行。

图4-6中显示了酵母来源的tRNA^Phe中的s导入位点和tRNA的结构(非专利文献20)。图4是原始的tRNA的二级结构。s取代的碱基以○圈出。虚线表示碱基-碱基相互作用。划框的G-C碱基对在原始的tRNA中是C-G碱基对，但该取代中tRNA的高级结构(非专利文献26)没有明显变化。

图5是天然tRNA的三维结构，图6A-C表示插入了s的各位点的扩大图。深色碱基(群)被取代成s，其与浅色碱基(群)堆积。而且，球(黄色)表示tRNA中的Mg²⁺。图中的碱基表示在天然tRNA中被修饰的碱基，括号内所述的碱基表示转录产物中的碱基。

各位点导入了s的tRNA转录产物是用含有Pa的模板DNA，在1mM sTP和天然NTPs存在下通过T7RNA聚合酶来制备的。具体地，首先在含有24mM MgCl₂、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％Triton X-100的40mMTris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，在10mM GMP、1mM天然NTPs、1mM sTP、0.5μM模板DNA和2.5U/μl T7RNA聚合酶的存在下进行转录。在37℃温育6小时后，加入1.75倍的染料溶液终止转录。将该溶液在75℃加热3小时，用10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶进行了电泳。从胶中洗脱出全长产物，乙醇沉淀。将产物溶解在450μl的10mM EDTA(pH8)中，75℃温育5分钟。

接着，用Microcon YM-10过滤器(Amicon)，将缓冲液交换成测定Tm用的缓冲液(含有50mM二甲胂酸钠(pH7.2)和50mM KCl)。通过260nm的吸光度确定tRNA的量。而且，为了荧光和UV熔解测定，配制了溶液，使得在含0.1mM EDTA、2mM或5mM MgCl₂的Tm缓冲液中含有1μM tRNA。

2)荧光光谱和UV熔解曲线

在20到90℃的范围，以0.5℃/分钟的加热速度，用FP-6500荧光光谱仪(JASCO)和UV-2450分光光度计(SHIMADZU)记录了一定位点含有s的各tRNA的荧光光谱和UV熔解曲线。

s碱基具有2个最大激发波长(299和352nm)，图7A表示核糖核苷(1μM)的激发和荧光光谱。由图7A可见，s显示以434nm为中心的荧光光谱，其荧光量子产率在pH7.0下为0.41。图7B和C表示在352nm激发的(B)tRNA47s(1μM)的荧光光谱和(C)tRNA 57s(1μM)的荧光光谱。荧光光谱是在50mM二甲胂酸钠(pH7.2)、50mM KCl和0.1mM EDTA中、在20℃测定的。

本实施例是在含50mM二甲胂酸钠(pH7.2)、50mM KCl和0.1mMEDTA，或者不含EDTA而加入2mM或5mM MgCl₂的溶液中，测定(以352nm为中心、以3nm的光谱带宽激发的)s在434nm的荧光强度和260nm的UV吸收，研究了各tRNA转录产物(1μM)的热力学熔解曲线。

因与溶剂分子撞击而产生的s的消光，温度越高就越容易发生(图8A)。所以，通过s的核苷单体归一化了各tRNA转录产物的荧光强度随温度的变化。利用IGOR Pro软件(WaveMetrics.Inc.)计算了通过荧光强度随温度的变化求得的tRNA熔解温度。具体地，图8中，(A)表示s的核糖核苷的荧光强度随温度的变化，(B)表示对s的核糖核苷的荧光强度随温度的变化进行了修正后的tRNA 36s荧光强度的温度依赖性。tRNA转录产物的荧光强度通过等式Yct＝Yt/(Rt/R20)来修正。其中，Yct是t℃的各tRNA的修正后强度，Yt是t℃的各tRNA实际测得的荧光强度，Rt是t℃的s的核糖核苷的荧光强度，R20是20℃的s的核糖核苷的荧光强度。

3)结果

对于16s、17s、36s、47s、57s和59s tRNA，通过434nm的荧光强度随温度的变化求得的熔解曲线(实线)和通过260nm的UV吸收变化求得的熔解曲线(虚线)如图9所示。

首先，第一，含有s的各tRNA转录产物的UV熔解温度(2mM MgCl₂中，64.6-66.4℃)与天然tRNA转录产物的熔解温度(2mM MgCl₂中，65.5℃)基本上同样高。这说明：这些位置即使用s取代，也不会显著造成tRNA结构的不稳定化。

第二，在一定位置含有s的各tRNA显示反映局部结构特征的荧光强度的特征变化。Mg²⁺(2和5mM)存在下的荧光特性明确地分为两组：一组包括tRNA 16s、17s和47s(组1)，另一组包括tRNA 36s、57s和59s(组2)。在2mM或5mM Mg²⁺存在下，低温度下的组1的s的荧光强度比组2的s的荧光强度大1.7-3.4倍。组1的高s荧光强度随温度上升而减少，组2的s荧光强度随温度上升而增大。

这些结果说明，第16、17或47位的s碱基在生理学温度下暴露在溶液中，并且伴随着温度上升引起的tRNA变性，s碱基与其它碱基的非特异性相互作用增强。与之形成对照，对于第36、57或59位的s碱基，在低温下，其在形成L型结构的tRNA中与邻近的碱基堆积，并且由于温度上升，tRNA缓慢变性，s与邻近碱基的堆积结构被破坏。该推论与由X射线晶体结构解析得到tRNA的L型结构中各位点上原有碱基的构象(图4)(非专利文献20)极为一致。tRNA 16s、17s和47s的荧光强度在生理学温度下由于Mg²⁺的添加而剧烈上升。这说明，通过Mg²⁺与tRNA的结合，tRNA形成L型结构，其结果是处于这些位置的碱基被配置在暴露于溶液中的位置。

第三，从荧光光谱得到的Tm值与从UV熔解光谱得到的Tm值相比较，反映了tRNA结构中各局部结构的稳定性。表3中显示了从一定位点含有s的酵母来源的tRNA^Phe的荧光和UV光谱得到的熔解温度(Tm)。

表3从一定位点含有s的酵母来源的tRNA^Phe的荧光和UV光谱得到的熔解温度(Tm)

表3

荧光和UV光谱是在50mM二甲胂酸钠(pH7.2)和50mM KCl中，在Mg²⁺共存下或者非共存下，使用各tRNA转录产物(1μM)得到的。各个熔解温度用IgorPro软件(WaveMetrics.Inc.)计算得到。未计算n.c.。

例如，从tRNA 36s的荧光光谱得到的Tm值(2mM MgCl₂中，69.5℃)比从其UV光谱得到的Tm值(2mM MgCl₂中，65.2℃)高。这说明：与tRNA整体结构的稳定性相比，反密码子茎环具有更高的稳定性。与之形成对照，tRNA16s(2mM MgCl₂中，58.0℃)和17s(2mM MgCl₂中，59.6℃)的低稳定性说明含有D环的局部结构是tRNA整体结构的脆弱部分。

实施例4：含有人工碱基s和FAM-y的RNA链的FRET实验

通过将s-Pa碱基对用于转录，能够向RNA中高效导入荧光性人工碱基s。通过将该s-Pa碱基对与本发明人等已经开发的v-y碱基对组合，能够将s和y或者s和5位修饰的y分别导入一条RNA中的任意位置。特别是通过利用导入了FAM的y，能够观察s与FAM-y之间的FRET。

在本实施例中，化学合成了各位点导入了Pa和v的转录用模板DNA，使用这些模板和s与y或FAM-y的各种底物(sTP、yTP、FAM-yTP)进行了转录。

通过T7RNA聚合酶的转录反应

(一定位点上含有s和y的RNA 39-mer的解析)

双链模板DNA(5μM)的退火操作在含有10mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)中进行(温度条件：95℃加热3分钟后，以-0.1℃/秒的梯度渐渐冷却到4℃)。T7转录反应在含有40mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、8mMMgCl₂、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％Triton X-100、2μCi[γ-³²P]GTP、1mM NTPs、0-1mM sTP、0-1mM yTP、0.5μM模板DNA和50单位T7RNA聚合酶(Takara)的反应溶液(总量20μl)中进行。在37℃反应3小时后，加入等量(20μl)的含有10M尿素的电泳用染料溶液终止反应。该溶液在75℃加热3分钟后，用15％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶进行电泳，用BioImageAnalyzer(生物影像分析仪)解析了转录物。

通过T7RNA聚合酶的转录反应生成物的碱基组成分析

通过T7RNA聚合酶的转录反应在含有40mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、8mM MgCl₂、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％Triton X-100、2μCi[α-³²P]ATP或2μCi[α-³²P]GTP或2μCi[α-³²P]CTP或2μCi[α-³²P]UTP、1mM NTPs、0-1mMsTP、0-1mM yTP、0.5μM模板DNA和50单位T7RNA聚合酶(Takara)的反应溶液中进行。转录物用15％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶进行电泳来纯化，并从凝胶中洗脱，然后加入tRNA(0.05 OD)，进行乙醇沉淀回收。将该样品溶解到10μl灭菌水中，取溶液(8.5μl)用RNA酶T2进行完全分解反应。向溶液(8.5μl)中加入RNA酶T₂(1.5μl、0.5U/μl)，37℃反应2小时。将该溶液的一部分点样到TLC(Merck，10cm×10cm)，进行二维展开。展开液第一维使用异丁酸∶浓氨水∶水＝66∶1∶33(v/v/v)，第二维使用2-丙醇∶盐酸∶水＝65∶10∶25(v/v/v)。展开后的点用BioImage Analyzer检测，进行了解析(图11，表4)。

通过T7RNA聚合酶的转录反应

(一定位点上含有s和y，或者s和FAM-y的RNA 39-mer的解析)

T7转录反应在含有40mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、8mM MgCl₂、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％Triton X-100、1mM NTPs、1mM sTP、1mM yTP或1mM FAM-yTP、0.5μM模板DNA和125单位T7RNA聚合酶(Takara)的反应溶液(总量50μl)中进行。在37℃进行反应6小时后，加入DNase I溶液，在37℃保温15分钟以分解模板DNA。加入等量(50μl)的含有10M尿素的电泳用染料溶液终止反应后，将反应溶液在75℃加热3分钟，然后用15％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶进行电泳，纯化了目的转录物39-mer。用灭菌水从凝胶洗脱后，进行乙醇沉淀，回收转录物，从UV吸收确定目的转录物RNA 39-mer的浓度。

荧光光谱测定

使用一定位点含有s和y或者s和FAM-y的RNA 39-mer(0.2μM)，在20℃测定了其在10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、100mM NaCl、0.1mM EDTA中荧光光谱。在测定前的RNA样品的退火操作中，将含有RNA39-mer(0.2μM)的溶液，和含有RNA-39mer和具有与该39-mer互补的序列的互补RNA 42-mer(0.4μM)的溶液在75℃加热3分钟后，以-0.1℃/3秒的梯度渐渐冷却到4℃。进行了退火操作之后的样品在4℃保存，测定时将样品移至测定池，在20℃放置2分钟以上后，再开始光谱扫描(360-650nm)。荧光测定(激发波长350nm)使用3×3mm比色池，响应0.5s、扫描速度2000nm/分、灵敏度按照手册设定固定在PMT 500V、狭缝宽度固定在5nm，进行了光谱测定(图12)。

结果

图10显示了通过利用v-y碱基对和s-Pa碱基对的转录向RNA中位点特异性地导入y和s的策略和转录产物的聚丙烯酰胺电泳的结果。

详细地说，图10a显示了模板DNA的序列和转录反应的条件(序列中Pa用P表示)。用聚丙烯酰胺电泳研究转录物(Bhp2-1、Bhp2-2、Bhp2-3)(图10b)，在同时添加sTP和yTP的转录中，转录物的量都增多。所以，为了研究s和y是否选择性地插入到RNA中，分别添加各种底物即向α位导入了放射性磷的[α-³²P]ATP、[α-³²P]GTP、[α-³²P]CTP、[α-³²P]UTP，进行转录，用RNA酶T2将放射性标记的转录物水解成核苷3’-一磷酸，用二维TLC分析磷酸经放射性标记的核苷3’-一磷酸，研究了转录产物的核苷酸组成(图11)。

在该方法中，如果插入了放射性底物，就能够在TLC上检测出其5’端的核苷酸。例如图11b中显示了Bhp2-1的二维TLC结果。在Bhp2-1中，y位于A的5’侧，s位于G的5’侧，所以如果y以与模板上的v互补的形式、s以与Pa互补的形式分别选择性地插入RNA中，那么[α-³²P]ATP标记的转录物的二维TLC上会出现yp(y的核苷3’-一磷酸)的点，此外，[α-³²P]GTP标记的转录物会出现sp(s的核苷3’-一磷酸)的点。实际上，在图11b中，各个TLC上出现了期待的点。[α-³²P]CTP或[α-³²P]UTP标记的转录物中，没有发现yp和sp任何一种的点，所以可知：各种人工碱基没有以与模板上的天然碱基互补的形式错误地插入。定量二维TLC上的各个点，其结果如表4所示。

[表4]

含有s和y的RNA(Bhp2-1)的核苷酸的组成分析

a：插入图11所示的A(编号1，2和9-11)、G(编号3，4和12-14)、C(编号5和6)或U(编号7和8)的5’侧的核苷酸的组成。

b：该值用下式确定：

c：各核苷酸的理论数用中括号表示。

d：标准偏差用括号表示

e：没有检测到

显示转录中yTP的量在0.5mM和1mM进行的结果。编号1-8的结果全部与理论值(括号内的数值)良好吻合。编号9-14是使用只有天然型碱基的模板DNA时的结果，但在编号10中可见：使用1mM的yTP时有少量的yp与天然型碱基互补性地插入。所以，转录中yTP的量以0.5mM为宜。根据以上结果，可知通过组合s-Pa碱基对和v-y碱基对进行转录，能够向一条RNA中分别选择性地导入s和y。

所以，代替y的底物，使用y的5位结合了FAM的底物(FAM-yTP)和sTP进行Bhp2-1的转录，转录产物用凝胶电泳纯化，研究了其荧光特性。因为Bhp2-1单独形成发夹结构，s和FAM-y被配置在形成碱基对的位置，所以使用两者可以观测到FRET。而且，如果加入该RNA的互补链RNA，则形成双链结构，s与FAM-y分离，FRET的效率降低。该双链结构的RNA的荧光图谱如图12b所示，发夹型RNA的荧光图谱如图12c所示(实线)。各自的荧光图谱与导入了s和y的RNA的图谱相比较(虚线：该RNA中不发生FRET，显示s的荧光图谱，作为对照)。任何一组都在350nm对s进行激发，观测到FRET，出现FAM-y的521nm附近的荧光。但是，发夹型的RNA FAM-y的荧光强度更强，此外，与对照(虚线)相比的s的消光也更显著。

由该结果可见，能够观测到与s和FAM-y两者之间的距离相关的FRET。所以，通过将s和FAM-y导入RNA中的不同位点，测定两者的FRET的效率，能够推算两者之间的距离，在RNA的结构解析中发挥作用。在以往的X射线晶体结构解析和通过NMR的结构解析中，只能够获得关于静态RNA结构的信息，但利用本方法，能够了解溶液中RNA结构变化的运动学。

实施例5：核酸双链中的s或v与FAM-y的人工碱基对的FRET实验

在DNA/RNA双链中，在荧光性人工碱基2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基或2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基(以下在本实施例中分别称为s或v)和连接了荧光团的2-氧代-(1H)吡啶-3-基(以下在本实施例中称为y)之间进行了FRET实验。s或v的发光光谱与核苷酸衍生物即连接了FAM的5-(3-氨基-1-丙炔基)-y(FAM-yTP)或连接了FAM的5-(3-(6-氨基己酰胺基)-1-丙炔基)-y(FAM-hx-yTP)的吸收光谱重叠(图13a)。所以，DNA片段中的s或v作为荧光供体发挥作用，且互补RNA片段中的FAM-y或FAM-hx-y作为荧光受体发挥作用。

含有人工碱基s或v的DNA的合成

含有人工碱基s或v的DNA是例如按照国际公开WO 01/05801号或国际公开WO 2005/026187号所述的方法，使用含有人工碱基s或v的核苷酸的氰乙基亚磷酰胺(シアノエチルホスホロアミダイト)衍生物，通过本领域技术人员周知的DNA化学合成法合成的。化学合成的35mer DNA的序列为

5’-CAN₁N₂N₃CTCGGGATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT-3’(序列编号20；其中，N₁N₂N₃是CTs或CTv的DNA分别称为DNA35s1或DNA35v1，是Css或Cvv的DNA分别称为DNA35s2a或DNA35v2a，是sTs或者vTv的DNA分别称为DNA35s2b或者DNA35v2b)。得到的DNA通过凝胶电泳进行了纯化。

含有FAM-y或FAM-hx-y的RNA的制备

在N’的位置上含有FAM-y或FAM-hx-y的17merRNA(5’-GGGAAUCCCGAGN’AGUG-3’：序列编号21)，是使用T7RNA聚合酶和FAM-y或FAM-hx-y底物(FAM-yTP或者FAM-hx-yTP)通过T7转录制备的。将模板(编码链DNA35v1，非编码链

5’-ATAATACGACTCACTATAGGG-3’(序列编号22)各10μM)在含有10mMTris-HCl(pH7.6)和10mM NaCl的缓冲液中，在95℃加热，然后缓慢冷却到4℃，退火。转录反应在含有40mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、24mM MgCl₂、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％Triton X-100的缓冲液中，在1mM天然NTPs、1mM FAM-yTP或FAM-hx-y、2μM模板和2.5单位/μL T7RNA聚合酶(Takara)存在下进行。在37℃温育3小时后，加入等量的含有10M尿素和0.05％BPB的染料溶液终止反应。将反应混合物在75℃加热3分钟，通过凝胶电泳纯化了17-mer转录物。

荧光光谱测定

荧光光谱在含有10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、100mM NaCl和0.1mMEDTA的缓冲液中测定。对于s在350nm、对于v在360nm的激发波长下记录发射光谱。发光的光谱狭缝(バンドパス)为5nm。

使一定位点上含有FAM-y或FAM-hx-y的17-mer RNA与一定位点上含有1个或2个s或v碱基的35-mer DNA(DNA35s1、35s2a、35s2b、35v1、35v2a和35v2b)杂交，在不同温度(20和70℃)测定DNA/RNA双链的发光光谱。

结果

在从s或v的低荧光状态到FAM-y或FAM-hx-y的高荧光状态之间，观察到了共振能量转移。在20℃，DNA35s1或DNA35v1与一定位点含有FAM-y或FAM-hx-y的17-mer RNA形成双链时，发生FRET；且在70℃双链变性时，FRET显著减少(图14a和b)。而且，DNA35s2a和DNA35v2a与一定位点含有FAM-y或FAM-hx-y的RNA形成的双链中，也能有效地发生FRET(图14c和d)。

令人感兴趣的是，含有两个连续人工碱基的DNA35s2a或DNA35v2a单链的荧光强度显著减少，而含有用1个T隔开的两个人工碱基的DNA35s2b或DNA35v2b单链的荧光强度则未见显著减少(图13c和d)。DNA35s2a或DNA35v2a单链的荧光强度减少是由于两个相邻的人工碱基之间的自身消光引起的。

即使与连续的两个碱基间发生自身消光的DNA35s2a或DNA35v2a形成双链，仍可观察到17-mer RNA的强FAM荧光，因此，使用自身消光探针的该FRET体系可以使对于目标链使用过量的探针变得容易。当对于17-mer RNA使用10摩尔当量的含有一个人工碱基的DNA35s1和DNA35v1时，共振能量转移分别被DNA35s1和DNA35v1的背景荧光完全掩盖(图15a和b)。作为对照，当对于17-mer RNA使用10摩尔当量的含有连续2个人工碱基的DNA35s2a和DNA35v2a时，分别可以清楚地观察到含有ss-和vv-的DNA与含有FAM的RNA之间的FRET(图15c和d)。所以，对于使用含有相邻的两个人工碱基的自身消光探针的FRET体系而言，既能减少荧光供体的背景，又可以观察到FRET现象，所以即使在大量供体探针存在下也能够检测出含有荧光受体的互补链。而且，大量的自身消光DNA探针使得与互补的荧光受体链形成双链变得容易，所以能够增加FRET效率。

序列表

<110>独立行政法人理化学研究所

<120>新型人工碱基对及其应用

<130>YCT1186

<150>JP 2005-226492

<151>2005-08-04

<150>JP 2006-182062

<151>2006-06-30

<160>22

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>1

ataatacgac tcactatagg g 21

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>3..5

<223>nnn表示下述中的任何一个：

胞嘧啶-腺嘌呤-2-甲酰-1H-吡咯-1-基

胞嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-2-甲酰-1H-吡咯-1-基

2-甲酰-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤-2-甲酰-1H-吡咯-1-基

胞嘧啶-腺嘌呤-2-氧代-1，3-二氢咪唑-1-基

胞嘧啶-2-氧代-1，3-二氢咪唑-1-基-2-氧代-1，3-二氢咪唑-1-基

2-氧代-1，3-二氢咪唑-1-基-腺嘌呤-2-氧代-1，3-二氢咪唑-1-基

胞嘧啶-腺嘌呤-胞嘧啶

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>2

ctnnnaggga agctccctat agtgagtcgt attat 35

<210>3

<211>17

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>13..15

<223>nnn表示下述中的任何一个：

2-氨基-6-(2-噻吩基)-嘌呤-9-基-胸腺嘧啶-鸟嘌呤

2-氨基-6-(2-噻吩基)-嘌呤-9-基-2-氨基-6-(2-噻吩基)-嘌呤-9-基-鸟嘌呤

2-氨基-6-(2-噻吩基)-嘌呤-9-基-胸腺嘧啶-2-氨基-6-(2-噻吩基)-嘌呤-9-基

鸟嘌呤-胸腺嘧啶-鸟嘌呤

<220>

<223>转录产物

<400>3

gggagcu ucc cunnnag 17

<210>4

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的用于转录的非模板链

<400>4

ataatacgac tcactatagg ggatttagct cagttgggag agcgccagac tgaagatctg

gaggtcctgt gttcgatcca cagaattccc acca 94

<210>5

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1

<223>tm

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2

<223>gm

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>5

nngtgggaat tctgtggatc gaacacagga cctccagatc ttcagtctgg cgctctccca

actgagctaa atcccctata gtgagtcgta ttat 94

<210>6

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1

<223>tm

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2

<223>gm

<220>

<221>misc_feature

<222>61

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>6

nngtgggaat tctgtggatc gaacacagga cctccagatc ttcagtctgg cgctctccca

nctgagctaa atcccctata gtgagtcgta ttat 94

<210>7

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1

<223>tm

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2

<223>gm

<220>

<221>misc_feature

<222>60

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>7

nngtgggaat tctgtggatc gaacacagga cctccagatc ttcagtctgg cgctctcccn

actgagctaa atcccctata gtgagtcgta ttat 94

<210>8

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1

<223>tm

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2

<223>gm

<220>

<221>misc_feature

<222>

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>41

<223>合成的用于转录的模板链

<400>8

nngtgggaat tctgtggatc gaacacagga cctccagatc ntcagtctgg cgctctccca

actgagctaa atcccctata gtgagtcgta ttat 94

<210>9

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1

<223>tm

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2

<223>gm

<220>

<221>misc_feature

<222>30

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>9

nngtgggaat tctgtggatc gaacacaggn cctccagatc ttcagtctgg cgctctccca

actgagctaa atcccctata gtgagtcgta ttat 94

<210>10

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1

<223>tm

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2

<223>gm

<220>

<221>misc_feature

<222>20

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>10

nngtgggaat tctgtggatn gaacacagga cctccagatc ttcagtctgg cgctctccca

actgagctaa atcccctata gtgagtcgta ttat 94

<210>11

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1

<223>tm

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2

<223>gm

<220>

<221>misc_feature

<222>18

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>11

nngtgggaat tctgtggntc gaacacagga cctccagatc ttcagtctgg cgctctccca

actgagctaa atcccctata gtgagtcgta ttat 94

<210>12

<211>76

<212>RNA

<213>酵母

<220>

<223>酵母tRNA Phe

<400>12

ggggauuuag cucaguuggg agagcgccag acugaagauc uggagguccu guguucgauc

cacagaauuc ccacca 76

<210>13

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的用于转录的非模板链

<400>13

agaatttaat acgactcact atagggaatc ccgagtagtg ctactaataa aatgcactag

tg 62

<210>14

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>4

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>

<221>misc_feature

<222>27

<223>n表示2-氨基-6-(2-噻唑基)-嘌呤-9-基

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>14

cacnagtgca ttttattagt agcactnctc gggattccct atagtgagtc gtattaaatt

ct 62

<210>15

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>7

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>

<221>misc_feature

<222>24

<223>n表示2-氨基-6-(2-噻唑基)-嘌呤-9-基

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>14

cactagngca ttttattagt agcnctactc gggattccct atagtgagtc gtattaaatt

ct 62

<210>16

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>11

<223>n表示2-甲酰-1H-吡咯-1-基

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n表示2-氨基-6-(2-噻唑基)-嘌呤-9-基

<220>

<223>合成的用于转录的模板链

<400>16

cactagtgca ntttattagt ngcactactc gggattccct atagtgagtc gtattaaatt

ct 62

<210>17

<211>39

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>13，16，19

<223>n表示2-氧代-(1H)吡啶-3-基或胸腺嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>29，33，36

<223>n表示2-氨基-6-(2-噻吩基)-嘌呤-9-基或腺嘌呤

<220>

<223>转录产物

<400>17

gggaaucccg agnagngcna cuaauaaanu gcncungug 39

<210>18

<211>39

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>13

<223>n表示2-氧代-(1H)吡啶-3-基

<220>

<221>misc_feature

<222>36

<223>n表示2-氨基-6-(2-噻吩基)-嘌呤-9-基

<220>

<223>转录产物

<400>18

gggaaucccg agnagugcua cuaauaaaau gcacungug 39

<210>19

<211>42

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的互补链

<400>19

gggcacuagu gcauuuuauu aguagcacua cucgggauuc cc 42

<210>20

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>3..5

<223>nnn表示下述中的任何一个：

胞嘧啶-胸苷-[2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基]；

胞嘧啶-胸苷-[2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基]；

胞嘧啶-[2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基]-[2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基]；

胞嘧啶-[2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基]-[2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基]；

[2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基]-胸苷-[2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基]；

[2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基]-胸苷-[2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基]；

<400>20

cannnctcgg gattccctat agtgagtcgt attat 35

<210>21

<211>17

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>rnisc_feature

<222>13

<223>n表示2-氧代-(1H)吡啶-3-基

<400>21

gggaaucccg agnagug 17

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ataatacgac tcactatagg g 21

Claims

1. 一种核酸，其中，具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸与具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸形成碱基对。

2. 权利要求1所述的核酸，其中，所述取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基选自下组：

A1)2-甲酰-1H-吡咯-1-基，

A2)2-甲酰-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基，

A3)2-甲酰-4-甲基-1H-吡咯-1-基，和

A4)2-甲酰-4-乙炔基-1H-吡咯-1-基；

并且，所述6位取代的9H-嘌呤-9-基选自下组：

B1)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B2)6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B3)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B4)6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B5)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B6)6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B8)6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B9)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B10)6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B11)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和

B12)6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基。

3. 权利要求1或2所述的核酸，其中，所述取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基是2-甲酰-1H-吡咯-1-基，且所述6位取代的9H-嘌呤-9-基是2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基。

4. 权利要求1至3任意一项所述的核酸，所述核酸在转录、逆转录、复制或翻译步骤中形成碱基对。

5. 权利要求1至4任意一项所述的核酸，其中所述具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸是DNA的一部分，且所述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸是RNA的一部分。

6. 一种制备核酸的方法，所述核酸含有具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，

所述制备方法包括以含有具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在上述具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸的互补位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。

7. 权利要求6所述的制备方法，其中，所述取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基选自下组：

A1)2-甲酰-1H-吡咯-1-基，

A2)2-甲酰-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基，

A3)2-甲酰-4-甲基-1H-吡咯-1-基，和

A4)2-甲酰-4-乙炔基-1H-吡咯-1-基；

并且，所述6位取代的9H-嘌呤-9-基选自下组：

B1)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B2)6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B3)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B4)6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B5)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B6)6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B8)6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B9)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B10)6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B11)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和

B12)6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基。

8. 权利要求6或7所述的制备方法，其中，模板中存在2个以上的所述具有取代的或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸。

9. 通过权利要求6至8所述的方法制备的、含有前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸。

10. 权利要求9所述的核酸，该核酸是tRNA、mRNA、反义DNA或RNA、核酶、适体或者siRNA。

11. 权利要求9或10所述的核酸中包含下述核苷酸的局部区域的立体结构的解析方法，所述核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，该方法包括测定上述核苷酸中碱基来源的荧光强度的温度变化和/或离子浓度变化。

12. 权利要求11所述的解析方法，其中，所述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸中碱基来源的荧光强度随温度的上升而实质上上升时，判断为：在生物体内温度下，所述核苷酸在立体构象上与存在于周围的核苷酸相堆积；而荧光强度随温度上升而实质上降低或未上升时，判断为：在生物体内温度下，所述核苷酸暴露于外部。

13. 检测核酸双链形成的方法，其包括：

I)使i)的核酸与ii)的核酸杂交，

其中i)的核酸是包含所述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸的核酸，其根据权利要求6至8所述的方法制备；ii)的核酸包含具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，该碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)；

II)测定荧光光谱的变化。

14. 权利要求13所述的检测方法，其中，

I)i)的6位取代的9H-嘌呤-9-基选自下组：

B1)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B2)6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B3)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B4)6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B5)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B6)6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B8)6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B9)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B10)6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B11)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和

B12)6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基。

15. 权利要求13或14所述的检测方法，其中，I)ii)的核酸为包含下述核苷酸的核酸，所述核苷酸具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基，该碱基的第5位上直接或通过连接物结合有5-羧基荧光素(5-FAM)或6-羧基荧光素(6-FAM)。

16. 一种制备核酸的方法，所述核酸在同一链上含有下述i)的核苷酸和ii)的核苷酸，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸；ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，该碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)；

所述制备方法包括以含有iii)的核苷酸和iv)的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在所述iii)的核苷酸的互补位置插入所述i)的核苷酸，并且在所述iv)的核苷酸的互补位置插入所述ii)核苷酸，其中，iii)的核苷酸是具有取代或者无取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基为碱基的核苷酸，iv)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。

17. 通过权利要求16所述的方法制备的、在同一链上含有i)的核苷酸和ii)的核苷酸的核酸，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸；所述ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，该碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)。

18. 权利要求17所述的核酸，其为tRNA、mRNA、反义DNA或RNA、核酶、适体或者siRNA。

19. 检测核酸茎环或发夹结构形成的方法，包括：

1)在权利要求17或18所述的核酸中，使i)的核苷酸和ii)的核苷酸杂交，并且

2)测定荧光光谱的变化。

20. 权利要求19的检测方法，其中核酸的茎环或发夹结构是通过权利要求17或18所述的核酸与目标分子结合而形成的。

21. 一种核酸，其中含有连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸。

22. 权利要求21所述的核酸，其为tRNA、mRNA、反义DNA或RNA、核酶、适体或者siRNA。

23. 检测核酸双链形成的方法，其包括：

I)使i)的核酸与ii)的核酸杂交，

其中i)的核酸包含连续2个以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，ii)的核酸包含具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，该碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)；并且，

II)测定荧光光谱的变化。

24. 权利要求23所述的检测方法，其中I)i)的6位取代的9H-嘌呤-9-基选自下组：

B1)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B2)6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B3)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B4)6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B5)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B6)6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，

B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B8)6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B9)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B10)6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，

B11)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和

B12)6-(5-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基。

25. 权利要求23或24所述的检测方法，其中，I)ii)的核酸为包含下述核苷酸的核酸，所述核苷酸具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基，该碱基的第5位上直接或通过连接物结合有5-羧基荧光素(5-FAM)或6-羧基荧光素(6-FAM)。

26. 检测核酸茎环或发夹结构形成的方法，所述检测方法包括：

1)在下述核酸中，使i)的核苷酸与ii)的核苷酸杂交，所述核酸在同一链上含有i)的核苷酸和ii)的核苷酸，且包含连续2个以上的i)的核苷酸；

并且，

2)测定荧光光谱的变化；

其中，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基为碱基的核苷酸，所述ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(1H)吡啶-3-基为碱基的核苷酸，该碱基的5位上直接或通过连接物结合有荧光染料，所述荧光染料选自下组：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)和6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)。