JP2023552936A - 核酸配列決定のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本開示の実施形態は、青色及び紫色光励起（例えば、それぞれ４５０～４６０ｎｍ及び４００～４０５ｎｍのレーザー）を使用した２チャネル核酸配列決定のための方法、キット、及び組成物に関する。特に、ヌクレオチドは、青色色素、紫色色素、又は青色色素及び紫色色素の両方で直接的に標識され得る。代替的に、組み込みのための１つ以上のヌクレオチドは、非標識であり得、青色色素、紫色色素、又は青色色素及び紫色色素の両方を含有する親和性試薬を使用して、組み込まれた各タイプのヌクレオチドに特異的に結合し得る。

Description

本開示は、一般に、核酸配列決定用途のための方法、システム、キット、及び組成物に関する。

ＤＮＡ配列決定について、複数の空間的に重複する分析物の独立した検出を達成するために、複数のスペクトル的に区別可能な蛍光標識を用いることが望ましい。かかる多重方法では、反応容器の数を低減して、実験プロトコルを簡素化し、適用特異的試薬キットの生成を容易にすることができる。例えば、多色の自動化されたＤＮＡ配列決定システムでは、多重蛍光検出は、単一の電気泳動レーンにおける複数のヌクレオチド塩基の分析を可能にし、それによって、単色の方法と比較してスループットを増加させ、レーン間電気泳動移動度の変動に関連する不確実性を低減する。

しかしながら、多重蛍光検出は、問題となり得、適切な蛍光標識の選択を制約するいくつかの重要な要因がある。第１に、所与の用途において、実質的に分解された吸収及び発光スペクトルで色素化合物を見つけることは困難であり得る。加えて、いくつかの蛍光色素が一緒に使用される場合、色素の吸収バンドが通常広く分離されているため、同時励起によって区別可能なスペクトル領域で蛍光シグナルを生成することは複雑であり得、そのため２つの色素に対してでも同等の蛍光励起効率を達成することは、困難である。多くの励起方法は、レーザーのような高電力光源を使用し、したがって、色素は、かかる励起に耐えるのに十分な光安定性を有しなければならない。分子生物学方法にとって特に重要な最終的な考慮事項は、蛍光色素が、例えば、ＤＮＡ合成溶媒及び試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、並びにリガーゼ酵素などの試薬化学物質と適合性でなければならない程度である。

蛍光バンドの好適な蛍光強度、形状、及び波長最大値のような蛍光特性を改善した蛍光色素分子は、核酸配列決定の速度及び精度を改善することができる。蛍光シグナルが強いことは、測定が、水性の生物学的緩衝液中かつ高温下で行われる場合には、大部分の有機色素の蛍光強度がそのような条件下で著しく低いため、特に重要である。更に、色素が付着している塩基の性質はまた、蛍光最大値、蛍光強度、及び色素の他のスペクトル特性に影響を及ぼす。核酸塩基と蛍光色素との間の、配列特異的相互作用は、蛍光色素の具体的な設計によって調整することができる。蛍光色素の構造を最適化することにより、ヌクレオチドの組み込み効率を改善し、シークエンシング（配列決定）エラーのレベルを低減させ、核酸シークエンシングにおける試薬の使用量を減少させ、その結果、核酸シークエンシングのコストを低減させることができる。

いくつかの光学的及び技術的開発は、既に、画質を大幅に向上させてきたが、最終的には、不十分な光学解像度によって制限された。光学解像度は、アッベの法則によって規定される。一般に、光学顕微鏡の光学解像度は、使用される光の波長のおよそ半分の距離で離間した物体どうしを見分けるレベルに限定される。実際的に、互いに非常に遠く離れた（少なくとも２００～３５０ｎｍ）物体どうしのみが、光学顕微鏡法によって見分けることができる。画像解像度を改善し、単位表面積当たりで見分けることができるオブジェクトの数を増加させる１つの方法は、より短い波長の励起光を使用することである。例えば、同じ光学系を用いて、波長がΔλ約１００ｎｍだけ短縮されると、解像度がより良好になり（約Δ５０ｎｍ／（約１５％））、歪みの少ない画像が記録され、認識可能な領域上の物体の密度が約３５％増加する。

しかしながら、広範囲のレーザー照射は、特に青色及び紫色におけるより短い領域で、波長溶液中／フローセルの表面上で蛍光色素の漂白及びヌクレオチド試料を損傷させるか、又は蛍光色素がコンジュゲート化されているものをそのようにする場合がある。そのような光への曝露はまた、ＤＮＡ試料の損傷を引き起こし得る。光漂白及び光損傷の種類及び程度は、例えば、化合物化学構造、並びにレドックス電位、特定の生体標識の励起スペクトル、特定の光源照射の強度、及び特定の測定における曝露時間のようないくつかの物理化学的特性に応じて異なり得る。より低い波長光源は、より高いエネルギー光子を送達しているため、より短い波長を有する紫色ＬＥＤ／レーザーは、色素の光漂白及びＤＮＡ損傷を引き起こす可能性が高い。蛍光検出における照射中に核酸損傷が生じ得るいくつかの化学経路が存在する。例えば、紫外線（ultraviolet、ＵＶ）放射線への曝露は、チミン又はシトシンの直接光化学物質［２＋２］光シクロ付加反応によるＤＮＡ損傷を引き起こして、ＴＴ、ＴＣ、及びＣＣなどのシクロブタン含有縮合ピリミジン二量体を提供することができることが示されている。そのような直接光シクロ付加反応は、約１００ｎｍ～約３１５ｎｍに延在するＵＶ Ｂ及びＵＶ Ｃ領域で起こり得る。約３１５ｎｍ～約５００ｎｍにわたる可視領域の一部分を通るＵＶ Ａ領域では、間接的な機構の複雑な混合によっても、他の成分の光感作によるＤＮＡ損傷が引き起こされ得る。そのような間接的な機構は、異なる光誘発反応種、例えば、一重項酸素、スーパーオキシドアニオン、及びヒドロキシルラジカルなどの反応性酸素種（Reactive Oxygen Species、ＲＯＳ）との相互作用を介して酸化ＤＮＡ修飾をもたらし得る。

シーケンシング効率を高め、ゲノム当たりのコストを減少させるために、良好な光学解像度を維持しながら、より多くのクラスターを同じ必要な表面積に詰めることができるように、ピッチ密度を増加させることが不可欠であり、より短い波長を有する光の使用を必要とする（紫色及び青色レーザーなど）。核酸配列決定用途のための波長（青色から紫色領域）の非常に密集した領域における色素の好適なセットを選択し、より短い波長励起によって引き起こされるＤＮＡ損傷を軽減する課題が依然として存在する。

本開示は、青色及び紫色光励起（例えば、４５０～４６０ｎｍ及び４００～４０５ｎｍのレーザー）を使用した２チャネル核酸配列決定用途のための方法、キット、及び組成物に関する。

本開示のいくつかの態様は、標的ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法に関するものであり、方法は、
（ａ）プライマーポリヌクレオチドを、第１のタイプのヌクレオチド、第２のタイプのヌクレオチド、第３のタイプのヌクレオチド、及び第４のタイプのヌクレオチドのうちの１つ以上を含む混合物と接触させることであって、プライマーポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、接触させることと、
（ｂ）混合物からプライマーポリヌクレオチドに１つのタイプのヌクレオチドを組み込んで、伸長したプライマーポリヌクレオチドを生成することと、
（ｃ）第１の励起光源を使用して第１の撮像イベントを行い、第１の発光フィルタで伸長したプライマーポリヌクレオチドから第１の発光シグナルを収集することと、
（ｄ）第２の励起光源を使用して第２の撮像イベントを行い、第２の発光フィルタで伸長したプライマーポリヌクレオチドから第２の発光シグナルを収集することと、を含み、
第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの一方は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの他方は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの一方は、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの他方は、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。いくつかの実施形態において、第１のタイプ、第２のタイプ、及び第３のタイプのヌクレオチドの各々は、検出可能な標識で標識されている。他の実施形態において、第１のタイプ、第２のタイプ、及び第３のタイプのヌクレオチドのうちの１つ以上は、非標識であり、方法は、プライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体に組み込まれた非標識ヌクレオチドに特異的に結合する１つ以上の親和性試薬の使用を含む第２の標識ステップを利用する。更なる実施形態において、第４のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、第１の撮像イベント及び第２の撮像イベント中にいかなるシグナルも放出しない。

本開示のいくつかの態様は、配列決定用途のためのキットに関するものであり、キットは、
第１の検出可能な標識で標識された第１のタイプのヌクレオチドと、
第２の検出可能な標識で標識された第２のタイプのヌクレオチドと、
第１の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、
第２の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、を含み、
第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識は、互いにスペクトル的に区別可能であり、第１の検出可能な標識は、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、第２の検出可能な標識は、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能であり、
第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの一方は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの他方は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの一方は、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの他方は、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。

本開示のいくつかの態様は、配列決定用途のためのキットに関するものであり、キットは、
第１の検出可能な標識で標識された第１のタイプのヌクレオチドと、
第２の検出可能な標識で標識された第２のタイプのヌクレオチドと、
第３の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、
第４の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、を含み、
第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識は、互いにスペクトル的に区別可能であり、第１の検出可能な標識は、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、第２の検出可能な標識は、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能であり、
第３の検出可能な標識及び第４の検出可能な標識は、互いにスペクトル的に区別可能であり、第３の検出可能な標識は、第１の光源によって励起可能かつ第１の放出フィルタによって検出可能であり、第４の検出可能な標識は、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能であり、
第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの一方は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの他方は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの一方は、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの他方は、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。

本開示のいくつかの他の態様は、配列決定用途のためのキットに関するものであり、キットは、
第１のタイプの非標識ヌクレオチドと、
第２のタイプの非標識ヌクレオチドと、
第３のタイプの非標識ヌクレオチドと、
親和性試薬のセットであって、
第１のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬、及び
第２のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬を含み、
第１の親和性試薬は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、第２の親和性試薬は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識は、第２の検出可能な標識とスペクトル的に区別可能である、親和性試薬のセットと、を含み、
第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの一方は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの他方は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの一方は、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの他方は、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。いくつかの実施形態において、第１の親和性試薬及び第２の親和性試薬の両方は、第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する。他の実施形態において、親和性試薬のセットは、第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第３の親和性試薬を更に含み、第３の親和性試薬は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第３の検出可能な標識と、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第４の検出可能な標識と、を含む。

本開示のいくつかの他の態様は、配列決定用途のためのキットに関するものであり、キットは、
非標識又は第１の検出可能な標識で標識されているのいずれかの第１のタイプのヌクレオチドと、
非標識又は第２の検出可能な標識で標識されているのいずれかの第２のタイプのヌクレオチドとであって、第１のタイプのヌクレオチド及び第２のタイプのヌクレオチドのうちの１つが非標識である、第１のタイプのヌクレオチドと、第２のタイプのヌクレオチドと、
第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び第１又は第２のタイプのヌクレオチドのいずれかと同じ検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドであって、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識が、互いにスペクトル的に区別可能であり、第１の検出可能な標識が、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、第２の検出可能な標識が、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、第３のタイプのヌクレオチドと、
第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び第１のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に第１のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬、又は第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び第２のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に第２のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬のいずれかを含む親和性試薬であって、第１の親和性試薬が、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、第２の親和性試薬が、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む、親和性試薬と、を含み、
第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの一方は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの他方は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの一方は、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの他方は、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。

紫色光曝露によって引き起こされるＤＮＡ光損傷を、時間の関数としての示す線グラフである。 実施例２に記載の合成方法による二次標識配列決定で得られた散布図である。

本開示は、核酸配列決定用途のための方法、システム、キット、及び組成物、具体的には、青色及び紫色光励起（例えば、４５０～４６０ｎｍ及び４００～４０５ｎｍのレーザー）並びに約４１５～４５０ｎｍ及び約４８０～５２５ｎｍのフィルタバンドを使用した２チャネル検出を使用する合成による配列決定に関する。本明細書に記載の方法、キット、及び組成物は、青色及び紫色色素を含む色素セット（すなわち、青色光及び紫色光領域で最大吸収を有する色素）を利用する。この方法は、親和性試薬を更に利用して、青色及び紫色の励起によって引き起こされるＤＮＡ損傷及び光漂白を低減する。より短い波長光源を有する本明細書に記載の配列決定法は、赤色／緑色光源励起又は緑色／青色光源励起を使用するＩｌｌｕｍｉｎａのＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、及びＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）システムで使用される現在の２チャネル配列決定と比較して、パターン化されたアレイ又はフローセルにおけるピッチ若しくはクラスター密度を増加させることができる。本明細書で使用される「ピッチ」という用語は、パターン化された固体支持体の２つのナノパターンの間の距離（例えば、パターン化されたフローセルにおける２つのナノウェル間の距離）を指す。赤色／緑色光源励起を使用するＩｌｌｕｍｉｎａ２チャネル配列決定に関する詳細な説明は、米国特許公開第２０１３／００７９２３２号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、緑色／赤色又は青色／緑色の励起を使用するシステムでは、光学解像度は、それぞれ赤色蛍光色素又は緑色蛍光色素発光（例えば、緑色／赤色系では約７１５ｎｍ、青色／緑色系では約５９０ｎｍ）によって制限される。紫色／青色光励起を使用することによって、光学解像度は、青色色素発光（すなわち、４８０～５２５ｎｍ）によって制限される。したがって、本開示の方法及びシステムは、ピッチ密度の最大５０％の増加を提供し得る。

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。用語「含む（including）」、並びに他の形態、例えば、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含まれる（included）」の使用は、限定的ではない。更に、用語「有する（having）」、並びに他の形態、例えば、「有する（have）」、「有する（has）」、及び「有した（had）」の使用は、限定的ではない。本明細書で使用されるとき、移行句又は請求項の本文において、用語「含む（comprise）」及び「含む（comprising）」は、オープンエンドの意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、語句「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」と同義であると解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈において使用される場合、用語「含む（comprising）」は、プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、又はデバイスの文脈で使用される場合、用語「含む（comprising）」は、化合物、組成物、又はデバイスが少なくとも列挙された特徴又は構成要素を含むが、追加の特徴又は構成要素も含み得ることを意味する。

本明細書で使用される場合、一般的な有機略語は、以下のように定義される。
℃ 摂氏温度
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸
ｄＣＴＰ デオキシシチジン三リン酸
ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸
ｄＴＴＰ デオキシチミジン三リン酸
ｄｄＮＴＰ ジデオキシヌクレオチド三リン酸
ｆｆＡ 完全官能化Ａヌクレオチド
ｆｆＣ 完全官能化Ｃヌクレオチド
ｆｆＧ 完全官能化Ｇヌクレオチド
ｆｆＮ 完全官能化ヌクレオチド
ｆｆＴ 完全官能化Ｔヌクレオチド
ＬＥＤ 発光ダイオード
ＳＢＳ 合成による配列決定

本明細書で使用される場合、「アレイ」という用語は、異なるプローブ分子を相対的な位置に従って互いに区別することができるように、１つ以上の基材に結合されている異なるプローブ分子の集団を指す。アレイは、基材上の異なるアドレス可能な位置に各々配置されるプローブ分子を含むことができる。代替的に、又は追加的に、アレイは、各々が異なるプローブ分子を担持する別個の基材を含むことができ、異なるプローブ分子は、基材が結合される表面上の基材の位置に従って、又は液体中の基材の位置に従って特定することができる。別個の基材が表面上に位置する例示的なアレイには、例えば、米国特許第６，３５５，４３１Ｂ１号、ＵＳ２００２／０１０２５７８、及びＰＣＴ公開第ＷＯ００／６３４３７号に記載されているように、ウェル中のビーズを含むものが挙げられるが、これらに限定されない。液体アレイ中のビーズを区別するために本発明に使用することができる例示的な形式は、例えば、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）などのマイクロ流体デバイスを使用し、例えば、米国特許第６，５２４，７９３号に記載されている。本発明に使用することができるアレイの更なる例には、米国特許第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５８３，２１１号、同第５，６５８，７３４号、同第５，８３７，８５８号、同第５，８７４，２１９号、同第５，９１９，５２３号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２８７，７６８号、同第６，２８７，７７６号、同第６，２８８，２２０号、同第６，２９７，００６号、同第６，２９１，１９３号、同第６，３４６，４１３号、同第６，４１６，９４９号、同第６，４８２，５９１号、同第６，５１４，７５１号、及び同第６，６１０，４８２号、並びにＷＯ９３／１７１２６、ＷＯ９５／１１９９５、ＷＯ９５／３５５０５、ＥＰ０ ７４２ ２８７、及びＥＰ０ ７９９ ８９７が含まれる。

本明細書で使用するとき、用語「共有結合した（「covalently attached」又は「covalently bonded」）」は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる化学結合の形成を指す。例えば、共有結合したポリマーコーティングとは、他の手段、例えば、接着又は静電相互作用による表面への付着と比較して、基材の官能化表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合したポリマーは、共有結合に加えて、手段によって結合され得ることが理解されるであろう。

本明細書に記載される化合物の単一のメソメリー形態が示されている各事例においては、代替のメソメリー形態も同様に企図される。

本明細書に使用されるとき、「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環式塩基、糖、及び１つ以上のリン酸基を含む。それらは、核酸配列のモノマー単位である。ＲＮＡ中では、糖は、リボースであり、ＤＮＡ中では、デオキシリボース、すなわち、リボース中に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。窒素含有複素環式塩基は、プリン、デアザプリン、又はピリミジン塩基であることができる。プリン塩基には、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びに７－デアザアデニン若しくは７－デアザグアニンなどの、それらの修飾された誘導体又は類似体が含まれる。ピリミジン塩基としては、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１又はプリンのＮ－９に結合される。いくつかの例では、「ヌクレオチド」という用語はまた、本明細書に記載されるように、任意選択的に、裂リンカーを介して、蛍光部分で標識されたヌクレオチドであるヌクレオチドコンジュゲートを包含し得る。

本明細書で使用される場合、「非標識ヌクレオチド」は、蛍光部分を含まないヌクレオチドを指す。いくつかの例では、非標識ヌクレオチドは、それが本明細書に記載の親和性試薬に結合することを可能にする開裂可能なリンカー及び／又は官能性部分（例えば、ハプテン）を含み得る。他の例では、非標識ヌクレオチドは、それを本明細書に記載の親和性試薬に結合することを可能にする開裂可能なリンカー又は官能性部分を有しない。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造的に類似しているが、リン酸部分を欠いている。ヌクレオシド類似体の例は、標識が塩基に連結され、糖分子に結合したリン酸基が存在しないものである。用語「ヌクレオシド」は、当業者によって理解される通常の意味で、本明細書で使用される。例としては、リボース部分を含むリボヌクレオシド、及びデオキシリボース部分を含むデオキシリボヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾されたペントース部分は、酸素原子が炭素で置き換えられている、かつ／又は炭素が硫黄又は酸素原子で置き換えられている、ペントース部分である。「ヌクレオシド」は、置換塩基及び／又は糖部分を有し得るモノマーである。更に、ヌクレオシドは、より大きなＤＮＡ及び／又はＲＮＡポリマー及びオリゴマーに組み込まれ得る。

用語「プリン塩基」は、当業者によって理解される通常の意味で、本明細書で使用され、その互変異性体を含む。同様に、用語「ピリミジン塩基」は、当業者によって理解される通常の意味で、本明細書で使用され、その互変異性体を含む。任意選択的に置換されたプリン塩基の非限定的なリストとしては、プリン、アデニン、グアニン、デアザプリン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、アロキサンチン、７－アルキルグアニン（例えば、７－メチルグアニン）、テオブロミン、カフェイン、尿酸、及びイソグアニンが挙げられる。ピリミジン塩基の例としては、シトシン、チミン、ウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、及び５－アルキルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、本明細書に記載のヌクレオシド又はヌクレオチドを「含む」として記載される場合、それは、本明細書に記載のヌクレオシド又はヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと共有結合を形成することを意味する。同様に、ヌクレオシド又はヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに「組み込まれた」など、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの一部として記載される場合、それは、本明細書に記載のヌクレオシド又はヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと共有結合を形成することを意味する。いくつかのそのような実施形態では、共有結合は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの３’ヒドロキシ基と、本明細書に記載のヌクレオチドの５’リン酸基との間で、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの３’炭素原子とヌクレオチドの５’炭素原子との間のホスホジエステル結合として形成される。

本明細書で使用される場合、「開裂可能なリンカー」という用語は、リンカー全体を除去する必要があることを意味するものではない。開裂部位は、リンカーの一部が、開裂後に検出可能な標識及び／又はヌクレオシド若しくはヌクレオチド部分に結合したままであることを確実にするリンカー上の位置に配置することができる。

本明細書で使用される場合、「誘導体」又は「類似体」は、修飾された塩基部分及び／又は修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチド又はヌクレオシド誘導体を意味する。そのような誘導体及び類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，１９８０）及びＵｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３－５８４，１９９０に考察されている。ヌクレオチド類似体はまた、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキル－ホスホネート、ホスホラニリデート（phosphoranilidate）、及びホスホラミデート連結を含む修飾されたホスホジエステルリンケージを含むことができる。本明細書で使用される「誘導体」、「類似体」、及び「修飾された」は、互換的に使用され得、本明細書で定義される用語「ヌクレオチド」及び「ヌクレオシド」に包含される。

本明細書で使用される場合、用語「リン酸塩」は、当業者によって理解される通常の意味で使用され、そのプロトン化形態（例えば、

を含む。本明細書で使用される場合、用語「一リン酸」、「二リン酸」、及び「三リン酸」は、当業者によって理解される通常の意味で使用され、プロトン化形態を含む。

当業者には理解されるように、本明細書に記載のヌクレオチドなどの化合物は、例えば、－ＣＯ_２ ^－、－ＳＯ_３ ^－、又は－Ｏ^－を含む、イオン化形態で存在し得る。化合物が、正又は負に帯電した置換基、例えば、Ｓを含有する場合、化合物が全体として中性であるように、負又は正に帯電した対イオンを含有してもよい。他の態様では、化合物は塩形態で存在してもよく、対イオンは、共役酸又は塩基によって提供される。

本明細書で使用される場合、用語「フェージング」は、３’ターミネーター及びフルオロフォアの不完全な除去、及び／又は所与の配列決定サイクルにおけるポリメラーゼによるクラスター内のＤＮＡ鎖の一部の組み込みを完了不良によって引き起こされる、ＳＢＳにおける現象を指す。プリフェージングは、効果的な３’ターミネーターなしでヌクレオチドを組み込むことによって引き起こされ、取り込みイベントは、終了不良により１サイクル前に進む。フェージング及びプリフェージングは、特定のサイクルで測定されたシグナル強度が、現在のサイクルからのシグナル、並びに前及び次のサイクルからのノイズからなるようにさせる。サイクル数が増加するにつれて、フェージング及びプリフェージングによって影響を受けた１つのクラスター当たりの配列の割合は増加し、正しい塩基の識別を妨げる。プリフェージングは、合成による配列決定（ＳＢＳ）中の微量の保護又はブロックされていない３’－ＯＨヌクレオチドの存在によって引き起こされ得る。保護されていない３’－ＯＨヌクレオチドは、製造プロセス中、又は場合によっては、保存及び試薬処理プロセス中に生成され得る。

本明細書で使用される場合、「スペクトル的に区別可能な蛍光色素」という用語は、２つ以上のかかる色素が１つの試料中に存在するとき、蛍光検出装置によって区別することができる波長で、蛍光エネルギーを放射する蛍光色素を指す。

青色／紫色２チャネル配列決定法
本開示のいくつかの態様は、標的ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖標的ポリヌクレオチド）の配列を決定するための方法に関するものであり、方法は、
（ａ）プライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体を、第１のタイプのヌクレオチド、第２のタイプのヌクレオチド、第３のタイプのヌクレオチド、及び第４のタイプのヌクレオチドのうちの１つ以上を含む混合物と接触させることであって、プライマーポリヌクレオチドが、一本鎖標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、接触させることと、
（ｂ）混合物からプライマーポリヌクレオチドに１つのタイプのヌクレオチドを組み込んで、伸長したプライマーポリヌクレオチド（すなわち、伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体）を生成することと、
（ｃ）第１の励起光源を使用して第１の撮像イベントを行い、第１の発光フィルタで伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体から第１の発光シグナルを収集することと、
（ｄ）第２の励起光源を使用して第２の撮像イベントを行い、第２の発光フィルタで伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体から第２の発光シグナルを収集することと、を含み、
第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの一方は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの他方は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの一方は、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの他方は、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、第１の励起光源は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍ（例えば、約４０５ｎｍ）の波長を有し、第１の発光フィルタは、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有する。第２の励起光源は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍ（例えば、約４６０ｎｍ）の波長を有し、第２の発光フィルタは、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。いくつかの他の実施形態において、第１の励起光源は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍ（例えば、約４６０ｎｍ）の波長を有し、第１の発光フィルタは、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。第２の励起光源は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍ（例えば、約４０５ｎｍ）の波長を有し、第２の発光フィルタは、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有する。

組み込み混合物中の標識ヌクレオチド
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、組み込み混合物中の各タイプのヌクレオチドは、標識されている。いくつかのかかる実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドは、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である、第１の検出可能な標識で標識されている。いくつかの更なる実施形態において、第２のタイプのヌクレオチドは、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、第２の検出可能な標識で標識されており、第２のタイプの検出可能な標識は、第１のタイプの検出可能な標識とスペクトル的に区別可能である。いくつかの更なる実施形態において、第３のタイプのヌクレオチドは、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方で標識されており、第３のタイプのヌクレオチドは、第１の励起光源及び第２の励起光源の両方によって励起可能である。いくつかの他の実施形態において、第３のタイプのヌクレオチドは、第３の標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、第４の標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドとの混合物を含み、第３の標識は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、第４の標識は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である。更なる実施形態において、第４のタイプのヌクレオチドは、非標識でないか、又は第１若しくは第２の撮像イベントのいずれの発光も有さない蛍光部分で標識されている。いくつかの例では、第４のタイプのヌクレオチドは、Ｇ塩基（例えば、ｄＧＴＰ）を含む。

ヌクレオチドのタイプが、２つの異なる標識で標識されているように記載される場合、それは、以下の２つのシナリオを含む。第１のシナリオでは、ヌクレオチドは、第１の標識で標識されたヌクレオチドと、第２の標識で標識された同じタイプのヌクレオチドとの混合物である。第２のシナリオでは、ヌクレオチドは、第１の標識及びそれに共有結合した第２の標識の両方を有する（すなわち、同じ分子に２つの標識）。加えて、第１及び第２の標識で標識されているとして記載されるヌクレオチドのタイプはまた、第１の標識及び第２の標識とは異なる１つ以上の追加の検出可能な標識を含み得る。

第１の例として、第１のタイプのヌクレオチドは、青色光源によって約４５０～４６０ｎｍで励起可能であり（すなわち、第１の色素は青色色素である）、かつ発光波長を４８０～５２５ｎｍの範囲に有する、第１の色素で標識され得る。第２のタイプのヌクレオチドは、約４００～４０５ｎｍの紫色光源によって励起可能であり（すなわち、第２の色素は紫色色素である）、かつ発光波長を４１５～４５０ｎｍの範囲に有する、第２の色素で標識され得る。第３のタイプのヌクレオチドは、第１の色素で標識された第３のヌクレオチドと第２の色素で標識された第３のヌクレオチドとの混合物であり得る。第４のタイプのヌクレオチドは、非標識である。第１の撮像イベントは、約４５０～４６０ｎｍの波長を有する青色光源を使用し、第１のタイプ及び第３のタイプのヌクレオチドの両方は、４８０～５２５ｎｍを包含するフィルタバンドを有する発光フィルタによって検出又は収集することができるシグナルを放出する。第２の撮像イベントは、約４００～４０５ｎｍの波長を有する紫色光源を使用し、第２のタイプ及び第３のタイプのヌクレオチドの両方は、４１５～４５０ｎｍを包含するフィルタバンドを有する発光フィルタによって検出又は収集することができるシグナルを放出する。第４のタイプのヌクレオチドは、標識されていないため、第１又は第２の撮像イベントのいずれでもシグナルは検出されない。本明細書に記載のシグナル検出パターンに基づいて、伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体に組み込まれたヌクレオチドの同一性が決定され得る。更なる実施形態において、組み込み混合物は、以下：青色色素Ａで標識されたｄＡＴＰ、紫色色素Ｂで標識されたｄＴＴＰ、青色色素Ａで標識されたｄＣＴＰ、紫色色素Ｂで標識されたｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含む。一実施形態において、青色色素で標識されたｄＡＴＰは、以下の構造：

を有し得る。かかるヌクレオチド色素コンジュゲートは、完全官能化Ａヌクレオチド（ｆｆＡ）とも呼ばれる。

第２の例として、第１のタイプの標識ヌクレオチド、第２のタイプの標識ヌクレオチド、及び第４のタイプの非標識ヌクレオチドは、第１の例に記載されたものと同じである。第３のタイプのヌクレオチドは、第３の色素及び第４の色素の両方で標識され得る（例えば、第３の色素で標識された第３のタイプのヌクレオチドと第４の色素で標識された第３のタイプのヌクレオチドとの混合物）。第３の色素は、第１の色素と同様の蛍光プロファイル（すなわち、吸収及び発光スペクトル）を有するが、発光強度の点で異なり得る。第４の色素は、第２の色素と同様の蛍光プロファイル（すなわち、吸収及び発光スペクトル）を有するが、発光強度の点で異なり得る。更なる実施形態において、組み込み混合物は、以下：青色色素Ａで標識されたｄＡＴＰ、紫色色素Ｂで標識されたｄＴＴＰ、青色色素Ｃで標識されたｄＣＴＰ、紫色色素Ｄで標識されたｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含む。

紫色色素
約３５０～４０５ｎｍの波長を有する紫色光源によって励起可能である蛍光色素は、本明細書に記載の第１又は第２の検出可能な標識として使用され得る。更なる実施形態において、特に有用な紫色色素は、発光スペクトルを４１０～４６０ｎｍ又は４１５～４５０ｎｍの範囲に有し得る。紫色色素の非限定的な例には、

ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０、及びＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ５００が含まれる。

青色色素
約４５０～４６０ｎｍの波長を有する青色光源によって励起可能である蛍光色素は、本明細書に記載の第１又は第２の検出可能な標識として使用され得る。更なる実施形態において、特に有用な青色色素は、発光スペクトルを４７５～５３０ｎｍ又は４８０～５２５ｎｍの範囲に有し得る。青色色素の非限定的な例には、参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１８／００９４１４０Ａ１号、同第２０１８／０２０１９８１Ａ１号、同第２０２０／０２７７５２９Ａ１号、及び同第２０２０／０２７７６７０Ａ１号に開示されているクマリン色素が含まれる。

いくつかの実施形態において、非限定的な例示的な青色色素には、以下：

が含まれる。一例では、配列決定法で使用される青色色素は、

である。追加の例示的な色素化合物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国出願第１７／３８５２３２号に開示されている。

抗酸化剤／ラジカルスカベンジャー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、１つ以上の抗酸化剤／ラジカルスカベンジャーを含むスキャン混合物を利用して、青色及び紫色の励起によって引き起こされる光損傷化を低減させる。特に、伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体は、第１の撮像イベント及び第２の撮像イベント中に１つ以上の抗酸化剤を含む緩衝液中にある。有用な抗酸化剤には、限定されないが、シクロオクタテトラエン（cyclooctatetraene、ＣＯＴ）、タキシフォリン、ケルセチン、アリルチオ尿素、ジメチルチオ尿素、シリビニン、アスコルビン酸若しくはその塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）、ポリフェノール化合物（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（トロロック）、没食子酸及びその低級アルキルエステル、そのモノメチルエーテル、及びその低級アルキルエステルとモノメチルエステルとの組み合わせ、ピロガロール、及びｔ－ブチルヒドロキノン（t-butyl hydroquinone、ＴＢＨＱ）、２，４，５－トリヒドロキシブチロフェノン（trihydroxybutyrophenone、ＴＨＢＰ）などのヒドロキノン、並びにそれらの任意選択的に置換された誘導体及び組み合わせが含まれる。いくつかの更なる実施形態では、組成物は、シクロオクタテトラエン及びケルセチン、並びにそれらの任意に置換された誘導体及び組み合わせを含む。

代替的に、本明細書に記載の青色／紫色色素はまた、シクロオクタテトラエン光保護部分に共有結合され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の青色又は紫色色素に共有結合され得るＣＯＴ部分は、構造：

を含み、式中、Ｒ^１Ａ及びＲ^２Ａの各々が、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、アジド、チオール、ニトロ、シアノ、任意選択的に置換されたアミノ、カルボキシル、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５Ａ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６ＡＲ^７Ａ、任意選択的に置換されたＣ_１～６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１～６アルコキシ、任意選択的に置換されたＣ_１～６ハロアルキル、任意選択的に置換されたＣ_２～６ハロアルコキシ、任意選択的に置換されたＣ_２～６アルケニル、任意選択的に置換されたＣ_２～６アルキニル、任意選択的に置換されたＣ_６～１０アリール、任意選択的に置換されたＣ_７～１４アラルキル、任意選択的に置換されたＣ_３～７カルボシクリル、任意選択的に置換された５～１０員ヘテロアリール、又は任意選択的に置換された３～１０員ヘテロシクリルであり、
Ｘ^１及びＹ^１が、各々独立して、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ^３Ａ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ^４Ａ－、－（Ｏ）_２－、－ＮＲ^３Ａ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ^４Ａ、－ＮＲ^３Ａ－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＲ^４Ａ－、任意選択的に置換されたＣ_１～６アルキレン、又は少なくとも１個の炭素原子がＯ、Ｓ、又はＮで置換されている任意選択的に置換されたヘテロアルキレンであり、
Ｚが、存在しないか、任意に置換されたＣ_２～６アルケニレン、又は任意に置換されたＣ_２～６アルキニレンであり、
Ｒ^３Ａ及びＲ^４Ａの各々が、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ_１～６アルキル、又は任意に置換されたＣ_６～１０アリールであり、
Ｒ^５Ａが、任意選択的に置換されたＣ_１～６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_６～１０アリール、任意選択的に置換されたＣ_７～１４アラルキル、任意選択的に置換されたＣ_３～７カルボシクリル、任意選択的に置換された５～１０員ヘテロアリール、又は任意選択的に置換された３～１０員ヘテロシクリルであり、
Ｒ^６Ａ及びＲ^７Ａの各々が、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ_１～６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_６～１０アリール、任意選択的に置換されたＣ_７～１４アラルキル、任意選択的に置換されたＣ_３～７カルボシクリル、任意選択的に置換された５～１０員ヘテロアリール、又は任意選択的に置換された３～１０員ヘテロシクリルであり、

において、Ｒ^１Ａ及びＲ^２Ａが結合している炭素原子が、Ｏ、Ｓ、又はＮで任意選択的に置換されているが、但し、炭素原子が、Ｏ又はＳで置換されている場合、Ｒ^１Ａ及びＲ^２Ａは、両方とも存在せず、該炭素原子がＮで置換されている場合、Ｒ^２Ａは、存在しないことを条件とし、ｍは、０～１０の整数である。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＹは、両方とも結合ではない。

いくつかの実施形態において、シクロオクタテトラエン部分は、構造

を含む。いくつかのかかる実施形態において、Ｒ^１Ａ及びＲ^２Ａのうちの少なくとも１つは、水素である。いくつかの更なる実施形態において、Ｒ^１Ａ及びＲ^２Ａの両方が、水素である。いくつかの他の実施形態において、Ｒ^１Ａは、Ｈであり、Ｒ^２Ａは、任意選択的に置換されたアミノ、カルボキシル、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６ＡＲ^７Ａである。いくつかの実施形態において、ｍは、１、２、３、４、５、又は６であり、Ｒ^１Ａ及びＲ^２Ａの各々は、独立して、水素、任意選択的に置換されたアミノ、カルボキシル、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６ＡＲ^７Ａ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの更なる実施形態において、ｍは、２、３、４、５、又は６である場合、１つのＲ^１Ａは、アミノ、カルボキシル、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６ＡＲ^７Ａであり、残りのＲ^１Ａ及びＲ^２Ａは、水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１Ａ及びＲ^２Ａが

で結合している少なくとも１つの炭素原子は、Ｏ、Ｓ、又はＮで置換されている。いくつかのかかる実施形態において、

における少なくとも１つの炭素原子は、酸素原子によって置換されており、当該置換された炭素原子に結合しているＲ^１Ａ及びＲ^２Ａの両方が、存在しない。いくつかの他の実施形態において、

における１つの
炭素原子が窒素原子で置換されている場合、当該置換された炭素原子に結合しているＲ^２Ａは、存在せず、当該置換された炭素原子に結合しているＲ^１Ａは、水素又はＣ_１～６アルキルである。Ｒ^１Ａ及びＲ^２Ａの任意の実施形態において、Ｒ^１Ａ又はＲ^２Ａが、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６ＡＲ^７Ａである場合、Ｒ^６Ａ及びＲ^７Ａは、独立して、Ｈ、Ｃ_１～６アルキル、又は置換Ｃ_１～６アルキル（例えば、－ＣＯ_２Ｈ、－ＮＨ_２、－ＳＯ_３Ｈ、又は－ＳＯ_３ ^－で置換されたＣ_１～６アルキル）であり得る。

いくつかの更なる実施形態において、本明細書に記載の蛍光色素は、以下の構造：

のシクロオクタテトラエン部分を含む。本明細書に記載のＣＯＴ部分は、本明細書に記載の蛍光色素の官能基（例えば、カルボキシル基）とＣＯＴ誘導体のアミノ基との間の反応に起因して、アミド結合を形成し得る（アミド結合のカルボニル基は示されていない）。ＳＢＳ化学において使用されるＣＯＴ関連抗酸化剤における追加の開示は、米国公開第２０２１／０１５５９８３Ａ１号に認められ得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

親和性試薬と組み合わせた組み込み混合物中の非標識ヌクレオチド
上記の実施形態に対する代替として、本明細書に記載の配列方法の第２の態様は、青色／紫色励起によって引き起こされるＤＮＡ損傷及び色素の光漂白を低減するために使用され得る二次標識ステップを含む。いくつかの実施形態において、二次標識は、標準的な配列決定法に対する修飾を指し、最初に非標識ヌクレオチドがプライマーポリヌクレオチドに組み込まれ、次いで組み込まれた非標識ヌクレオチドが、組み込まれたタイプのヌクレオチドに特異的な親和性試薬に結合し、親和性試薬は、青色光又は紫色光によって励起することができ、発光検出チャネルによって検出することができるシグナルを放出する１つ以上の検出可能な標識を含有する。特定の理論に拘束されるものではないが、親和性試薬のサイズは、ＲＯＳからＤＮＡを遮蔽することができ、したがって、青色／紫色光によって引き起こされる光損傷を低減又は軽減することができる。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、第１のタイプ、第２のタイプ、及び第３のタイプのヌクレオチドのうちの１つ以上は、非標識であり得る。一実施形態において、組み込み混合物中の第１のタイプ、第２のタイプ、及び第３のタイプのヌクレオチドの各々は、非標識であり、方法は、第１の撮像イベントの前に、伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体を親和性試薬のセットと接触させることを更に含み、セット中の少なくとも１つの親和性試薬は、組み込まれた第１のタイプ、第２のタイプ、又は第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する。いくつかのかかる実施形態において、親和性試薬のセットは、第１のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬、第２のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬を含む。いくつかの更なる実施形態において、第１の親和性試薬は、第１の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、第２の親和性試薬は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識は、第２の検出可能な標識とスペクトル的に区別可能である。いくつかのかかる実施形態において、第１の親和性試薬及び第２の親和性試薬の両方は、第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する。他の実施形態において、親和性試薬のセットは、第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第３の親和性試薬を更に含み、第３の親和性試薬は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第３の検出可能な標識と、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第４の検出可能な標識と、を含む。第３の色素は、第１の色素と同様の蛍光プロファイル（すなわち、吸収及び発光スペクトル）を有するが、発光強度の点で異なり得る。第４の色素は、第２の色素と同様の蛍光プロファイル（すなわち、吸収及び発光スペクトル）を有するが、発光強度の点で異なり得る。

検出可能な標識を含有する親和性試薬が組み込まれたヌクレオチドに結合する場合、伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体は、第１及び／又は第２の撮像イベントで検出することができる標識された伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体になる。本明細書に記載の紫色色素及び青色色素は、本明細書に記載の修飾方法の任意の実施形態において使用され得る。加えて、標識された伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体は、本明細書に記載の抗酸化剤及びＲＯＳスカベンジャーのうちの１つ以上を含むスキャン混合物中に存在し得る。親和性試薬中の検出可能な標識はまた、本明細書に記載の共有結合した光保護部分を含み得る。

親和性試薬
本明細書で使用される場合、「親和性試薬」という用語は、伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体における組み込まれたヌクレオチドに特異的に結合する、タンパク質又は抗体などの巨大分子を指す。いくつかの実施形態において、親和性試薬は、タンパク質タグ、抗体（限定されないが、抗体の結合断片、単鎖抗体、二重特異性抗体などを含む）、アプタマー、ノッチン、アフィマー、又は組み込まれたヌクレオチドに好適な特異性及び親和性で結合する任意の他の既知の薬剤を含む。本明細書に記載の各親和性試薬は、特定のタイプのヌクレオチドに対して、他のタイプのヌクレオチドに対するよりも実質的に高い親和性を有し得る。また、親和性試薬は、成長するＤＮＡ鎖（すなわち、伸長したプライマーポリヌクレオチド）の３’末端で組み込まれたヌクレオチドに結合するが、ＤＮＡ鎖上の他の位置のヌクレオチドには結合するべきではない。本明細書に記載の親和性試薬は、本明細書に記載の青色色素及び紫色色素などの１つ以上の検出可能な標識で直接的又は間接的に標識され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の検出可能な標識は、開裂可能なリンカーを介して親和性試薬に共有結合されている。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドは、第１のハプテンを含み、第１の親和性試薬は、第１のハプテンに特異的に結合する第１のハプテン結合パートナーを含む。いくつかのかかる実施形態において、第２のタイプのヌクレオチドは、第２のハプテンを含み、第２の親和性試薬は、第２のハプテンに特異的に結合する第２のハプテン結合パートナーを含む。第１のハプテン及び第２のハプテンの各々は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、若しくはクロロアルキル基を含むか、又はそれらから選択され得る。親和性試薬の各々は、１つ以上の蛍光部分とコンジュゲート化された抗ハプテン抗体であり得る特異的ハプテン結合パートナーを含む。いくつかの更なる実施形態において、第１のハプテンは、ビオチン部分を含み、第１のハプテン結合パートナーは、ストレプトアビジンを含み、ストレプトアビジンは、１つ以上の第１の検出可能な標識を含む。いくつかの更なる実施形態において、第２のハプテンは、クロロアルキル基を含み、第２のハプテン結合パートナーは、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含み、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）は、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む。第１又は第２の検出可能な標識は、本明細書に記載の１つ以上の開裂可能なリンカーを介して親和性試薬（例えば、ハプテン結合パートナー）にコンジュゲート化され得る。いくつかのかかる実施形態において、第３のタイプのヌクレオチドは、第１のハプテン及び第２のハプテンの両方を含み（例えば、第１のハプテンを含む第３のタイプのヌクレオチドと、第２のハプテンを含む第３のタイプのヌクレオチドとの混合物）、その結果、第１の親和性試薬及び第２の親和性試薬の両方が、第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合し得る。

他の実施形態において、セット親和性試薬が、第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第３の親和性試薬を更に含む場合、第３のタイプのヌクレオチドは、第３のハプテンを含み得、第３の親和性試薬は、第３のハプテン結合パートナーを含む。第３の親和性試薬は、第３のハプテン結合パートナー及び１つ以上の第３の検出可能な標識を含む第３の親和性試薬と、第３のハプテン結合パートナー及び１つ以上の第４の検出可能な標識を含む第３の親和性試薬との混合物であり得る。

例えば、第１のタイプの非標識ヌクレオチドは、ビオチン部分を含む第１のハプテンを含み得るが、第１の親和性試薬は、１つ以上の第１の検出可能な標識とコンジュゲート化されたストレプトアビジンを含み得、標識は、約４５０～４６０ｎｍの青色光源によって励起可能である青色色素であり（すなわち、第１の色素は、青色色素である）、４８０～５２５ｎｍの範囲の発光波長を有する。第２のタイプの非標識ヌクレオチドは、クロロアルキル基（例えば、ＣＨ_２）_６Ｃｌ）を含む第２のハプテンを含み得、一方、第２の親和性試薬は、１つ以上の第２の検出可能な標識とコンジュゲート化されたＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含み得、色素は、約４００～４０５ｎｍの紫色光源によって励起可能であり、４１５～４５０ｎｍの範囲の発光波長を有する紫色色素である。第３のタイプの非標識ヌクレオチドは、第１の親和性試薬及び第２の親和性試薬の両方に結合する第１のハプテン及び第２のハプテンの両方を含み得る。いくつかの実施形態において、第４のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、いずれの親和性試薬にも結合しない。伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ヌクレオチド複合体を親和性試薬のセットと接触させた後、未結合の親和性試薬を洗い流す。第１の撮像イベントは、約４５０～４６０ｎｍの波長を有する青色光源を使用し、第１のタイプ及び第３のタイプのヌクレオチドの両方は、４８０～５２５ｎｍを包含するフィルタバンドを有する発光フィルタによって検出又は収集することができるシグナルを放出する。第２の撮像イベントは、約４００～４０５ｎｍの波長を有する紫色光源を使用し、第２のタイプ及び第３のタイプのヌクレオチドの両方は（親和性試薬とコンジュゲート化された検出可能な標識を通して）、４１５～４５０ｎｍを包含するフィルタバンドを有する発光フィルタによって検出又は収集することができるシグナルを放出する。第４のタイプのヌクレオチドについて、第１又は第２の撮像イベントのいずれでもシグナルは検出されない。本明細書に記載のシグナル検出パターンに基づいて、伸長したプライマーポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドの同一性が決定され得る。更なる実施形態において、組み込み混合物は、以下：クロロアルキル基を含むｄＡＴＰ、ビオチン部分を含むｄＴＴＰ、ビオチン部分を含むｄＣＴＰ、クロロアルキル基を含むｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）、を含む。例示的なビオチン部分を含むｆｆＣ及びクロロアルキル基を含むｆｆＡは、

を含み、式中、ｎは、１、２、又は３である。

本明細書に記載の配列決定法の第３の態様はまた、親和性試薬を用いた二次標識の使用を含むが、第１のタイプ、第２のタイプ、又は第３のタイプのヌクレオチドのうちの１つのみが非標識である。いくつかの実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドは、第１の検出可能な標識で標識されており、第２のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、第３のタイプのヌクレオチドは、非標識及び第１の検出可能な標識で標識されているの両方であり、第１の検出可能な標識は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である。方法は、第１の撮像イベントの前に、伸長したプライマーポリヌクレオチドを親和性試薬と接触させることを更に含み、親和性試薬は、第２のタイプの非標識ヌクレオチド及び／又は第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する。いくつかのかかる実施形態において、親和性試薬は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む。いくつかの更なる実施形態において、親和性試薬は、１つ以上の第２の検出可能な標識にコンジュゲート化されたストレプトアビジンを含み、第２のタイプのヌクレオチド及び第３のタイプの非標識ヌクレオチドの両方は、ビオチン部分を含む。いくつかの他の実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、第２のタイプのヌクレオチドは、第２の検出可能な標識で標識されており、第３のタイプのヌクレオチドは、非標識及び第２の検出可能な標識で標識されているの両方であり、第２の検出可能な標識は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である。方法は、第１の撮像イベントの前に、伸長したプライマーポリヌクレオチドを親和性試薬と接触させることを更に含み、親和性試薬は、第１のタイプの非標識ヌクレオチド及び／又は第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する。いくつかのかかる実施形態において、親和性試薬は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第１の検出可能な標識を含む。いくつかの更なる実施形態において、親和性試薬は、１つ以上の第１の検出可能な標識にコンジュゲート化されたストレプトアビジンを含み、第１のタイプのヌクレオチド及び第３のタイプの非標識ヌクレオチドの両方は、ビオチン部分を含む。任意のかかる実施形態において、第４のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、親和性試薬と結合しないか、又は第１の撮像イベント及び第２の撮像イベント中にいずれのシグナルも放出しない。

別の例として、第１のタイプのヌクレオチドは、青色光源によって約４５０～４６０ｎｍで励起可能であり、発光波長を４８０～５２５ｎｍの範囲に有する、青色色素で標識されている。第２のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、ビオチン部分を含む。親和性試薬は、紫色光源によって約４００～４０５ｎｍで励起可能であり、発光波長を４１５～４５０ｎｍの範囲に有する、１つ以上の紫色色素とコンジュゲート化されたストレプトアビジンを含む。第３のタイプのヌクレオチドは、ビオチン部分を含む非標識の第３のタイプのヌクレオチドと、第１のタイプのヌクレオチドと同じ青色色素で標識された第３のタイプのヌクレオチドとの両方の混合物である。第４のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、いずれの親和性試薬とも結合しないか、又は第１／第２の撮像イベントでいずれのシグナルも放出しない。伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ヌクレオチド複合体を親和性試薬と接触させた後、未結合の親和性試薬を洗い流す。第１の撮像イベントは、約４５０～４６０ｎｍの波長を有する青色光源を使用し、第１のタイプ及び第３のタイプのヌクレオチドの両方は、４８０～５２５ｎｍを包含するフィルタバンドを有する発光フィルタによって検出又は収集することができるシグナルを放出する。第２の撮像イベントは、約４００～４０５ｎｍの波長を有する紫色光源を使用し、第２のタイプ及び第３のタイプのヌクレオチドの両方は（ストレプトアビジンに結合された紫色色素を介して）、４１５～４５０ｎｍを包含するフィルタバンドを有する発光フィルタによって検出又は収集することができるシグナルを放出する。第４のタイプのヌクレオチドについて、第１又は第２の撮像イベントのいずれでもシグナルは検出されない。本明細書に記載のシグナル検出パターンに基づいて、伸長したプライマーポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドの同一性が決定され得る。更なる実施形態において、組み込み混合物は、以下：青色色素で標識されたｄＡＴＰ、ビオチン部分を含むｄＴＴＰ、ビオチン部分を含むｄＣＴＰ、青色色素で標識されたｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含む。

本明細書に記載の配列決定法の第３の態様の代替的な実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドは、第１の検出可能な標識で標識されており、第２のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、第３のタイプのヌクレオチドは、非標識及び第３の検出可能な標識で標識されているの両方であり、第１及び第３の検出可能な標識の両方は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である（例えば、第３の標識は、第１の標識と同様の蛍光プロファイルを有するが、発光強度で異なり得る）。方法は、第１の撮像イベントの前に、伸長したプライマーポリヌクレオチドを親和性試薬のセットと接触させることを更に含み、少なくとも１つの親和性試薬は、第２のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合し、少なくとも１つの親和性試薬は、第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する。いくつかのかかる実施形態において、第２のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する親和性試薬は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む。第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する親和性試薬は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第４の検出可能な標識を含む（例えば、第４の標識は、第２の標識と同様の蛍光プロファイルを有するが、発光強度で異なり得る）。いくつかの更なる実施形態において、セット親和性試薬は、１つ以上の第２の検出可能な標識にコンジュゲート化されたストレプトアビジン、及び１つ以上の第４の検出可能な標識にコンジュゲート化された第２の抗体／タンパク質を含み得る。第２のタイプの非標識ヌクレオチドは、ビオチン部分を含み、第３のタイプの非標識ヌクレオチドは、第４の標識にコンジュゲート化された第２の抗体／タンパク質に特異的であるハプテンを含む。

本明細書に記載の配列決定法の第３の態様に対する別の代替的な実施形態は、組み込み混合物を使用することを含み、第１のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、第２のタイプのヌクレオチドは、第２の検出可能な標識で標識されており、第３のタイプのヌクレオチドは、非標識及び第４の検出可能な標識で標識されているの両方であり、第２及び第４の検出可能な標識の両方は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である（例えば、第３の標識は、第１の標識と同様の蛍光プロファイルを有するが、発光強度で異なり得る）。方法は、第１の撮像イベントの前に、伸長したプライマーポリヌクレオチドを親和性試薬のセットと接触させることを更に含み、少なくとも１つの親和性試薬は、第１のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合し、少なくとも１つの親和性試薬は、第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する。いくつかのかかる実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する親和性試薬は、１つ以上の第１の検出可能な標識を含む。第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する親和性試薬は、１つ以上の第３の検出可能な標識を含む。第１及び第３の検出可能な標識の両方は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である（例えば、第３の標識は、第１の標識と同様の蛍光プロファイルを有するが、発光強度で異なり得る）。

本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、ステップ（ａ）における混合物中のヌクレオチドは、４つの異なるタイプのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ又はＵ）、又はそれらの非天然ヌクレオチド類似体を含む。更なる実施形態において、４つの異なるタイプのヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、又はそれらの非天然ヌクレオチド類似体である。いくつかの更なる実施形態において、４つのタイプのヌクレオチドのうちの３つは、検出可能な標識で各々標識されており、ヌクレオチドのうちの１つは、フルオロフォアで標識されていないか、又はフルオロフォアで標識されているが、第１の撮像イベント若しくは第２の撮像イベントのいずれかで励起されてシグナルを放出することはできない。他の実施形態において、４つのタイプのヌクレオチドのうちの１つ、２つ、又は３つにおける検出可能な標識は、本明細書に記載の二次標識ステップを使用して添加され、非標識ヌクレオチドが最初にプライマーポリヌクレオチドに組み込まれ、次いで組み込まれたタイプのヌクレオチドに特異的な親和性試薬がプライマーヌクレオチドに導入され、親和性試薬は、第１及び／又は第２の撮像イベント中に、シグナルを放出することができる１つ以上の検出可能な標識を含む。更なる実施形態において、組み込み混合物中の４つのタイプのヌクレオチドの各々は、３’ヒドロキシル遮断（ブロッキング）基を含有する。かかる３’ヒドロキシル遮断基は、単一塩基のみがプライマーポリヌクレオチドの３’末端にポリメラーゼによって付加され得ることを確実にする。ステップ（ｂ）におけるヌクレオチドの組み込み後、残存する組み込まれていないヌクレオチドが洗い流される。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）：第２の撮像イベントの後、及び次の配列決定サイクルの前に、組み込まれたヌクレオチドから３’ヒドロキシル遮断基を除去することを更に含む。更なる実施形態において、組み込まれたヌクレオチドに結合した任意の検出可能な標識（開裂可能なリンカーを介して組み込まれたヌクレオチドに直接的に、又は親和性試薬を介して間接的に、のいずれか）も、次の配列決定サイクルの前に除去される。いくつかのかかる実施形態において、検出可能な標識及び３’ヒドロキシ遮断基は、単一のステップで（例えば、同じ化学反応条件下で）除去される。他の実施形態において、標識及び３’ヒドロキシ遮断基は、２つの別個のステップで除去される（例えば、標識及び３’遮断基は、２つの別個の化学反応条件下で除去される）。いくつかの更なる実施形態において、切断後洗浄ステップが、標識及び３’遮断基が除去された後に使用される。更なる実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は、繰り返しサイクル（例えば、少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、又は５００回）で行われ、方法は、各々連続的に組み込まれたヌクレオチドの同一性に基づいて、一本鎖標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部の配列を順次決定することを更に含む。いくつかのかかる実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は、少なくとも５０サイクル繰り返される。いくつかの更なる実施形態において、組み込み混合物からのヌクレオチドの組み込みは、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって行われる。例示的なポリメラーゼには、Ｐｏｌ８１２、Ｐｏｌ１９０１、Ｐｏｌ１５５８、又はＰｏｌ９６３が含まれるが、これらに限定されない。Ｐｏｌ８１２、Ｐｏｌ１９０１、Ｐｏｌ１５５８、又はＰｏｌ９６３ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、例えば、米国特許公開第２０２０／０１３１４８４Ａ１号及び同第２０２０／０１８１５８７Ａ１号に記載されており、それらの両方が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、第１の撮像イベントで使用される第１の励起光源及び第２の撮像イベントで使用される第２の励起光源の各々は、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、又はそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、第１の撮像イベント及び第２の撮像イベントからの発光検出の組み合わせは、画像分析ソフトウェアによって処理されて、固定された各プライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体位置で組み込まれた塩基の同一性を決定する。いくつかのかかる実施形態において、画像分析は、取り込みの繰り返しサイクル（少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００回の実行後）の後に処理される。

本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、一本鎖標的ポリヌクレオチドは、固体支持体に固定され得る。いくつかのかかる実施形態において、固体支持体は、複数の固定化一本鎖標的ポリヌクレオチドを含む。プライマーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である。いくつかのかかる実施形態において、プライマーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズして、プライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体を形成する。固体支持体は、クラスター化プライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体を含み得る。いくつかの実施形態において、固体支持体は、フローセル、例えば、複数のナノウェルを含み、各々が離れているパターン化フローセルを含む。いくつかの更なる実施形態において、各ナノウェルは、そこに１つの固定されたクラスターを含む。いくつかの実施形態において、パターン化フローセル上のナノウェルの密度は、約１００Ｋ／ｍｍ^２～約５００Ｋ／ｍｍ^２、約２００Ｋ／ｍｍ^２～約４００Ｋ／ｍｍ^２、又は約２５０Ｋ／ｍｍ^２～約３５０Ｋ／ｍｍ^２である。いくつかの実施形態において、固体支持体上の固定化一本鎖標的ポリヌクレオチド（又はプライマーポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションから形成されたクラスター）の密度は、約８０Ｋ／ｍｍ^２～約４００Ｋ／ｍｍ^２、約１００Ｋ／ｍｍ^２～約３００Ｋ／ｍｍ^２、又は約１５０Ｋ／ｍｍ^２～約２５０Ｋ／ｍｍ^２である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の配列決定法は、同様又は同等な光学解像度を有する赤色／緑色又は緑色／青色の励起を使用する２チャネル配列決定法と比較して、クラスター密度に最大１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％の増加を可能にする。

方法の追加の例示的な実施形態を以下に記載する。

特定の実施形態において、合成工程が実行され、かつ任意選択的に、鋳型又は標的ポリヌクレオチド鎖を本開示の蛍光標識ヌクレオチドを含む反応混合物とインキュベートする工程を含み得る。ポリメラーゼはまた、鋳型又は標的ポリヌクレオチド鎖にアニーリングされたポリヌクレオチド鎖上の遊離３’ＯＨ基と標識ヌクレオチド上の５’リン酸基との間のリン酸ジエステル結合の形成を可能にする条件下で提供されることもできる。したがって、合成工程は、ヌクレオチドの鋳型／標的鎖への相補的塩基対形成によって実現されるポリヌクレオチド鎖の形成を含むことができる。

本方法の全ての実施形態において、検出工程は、標識ヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチド鎖が標的鎖にアニーリングされている間、又は２つの鎖が分離される変性工程の後に実行され得る。合成工程と検出工程との間に、例えば化学的又は酵素的反応工程又は精製工程といった更なる工程が含まれてもよい。具体的には、標識ヌクレオチドを組み込むポリヌクレオチド鎖は、単離されても精製されてもよく、その後、更に処理されるか、又はその後の解析に使用されてもよい。例として、合成工程において本明細書に記載される標識ヌクレオチドを組み込んでいる標的ポリヌクレオチドは、その後、標識化プローブ又はプライマーとして使用され得る。他の実施形態において、本明細書に記載される合成工程の生成物は、更なる反応工程に供され得、所望であれば、これらの後続工程の生成物は精製又は単離され得る。

合成工程に好適な条件は、標準的な分子生物学的技術に精通しているものにはよく知られている。一実施形態において、合成工程は、本明細書に記載される標識ヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使用する標準的なプライマー伸長反応と類似し、好適なポリメラーゼ酵素の存在下で標的鎖に相補的な伸長したポリヌクレオチド鎖（プライマーヌクレオチド鎖）を形成し得る。他の実施形態において、合成工程は、それ自体が、プライマー標的ポリヌクレオチド鎖をコピーすることに由来するアニーリングされた相補鎖からなる、標識二本鎖増幅産物を生成する、増幅反応の一部をなし得る。他の提示的な合成工程としては、ニックトランスレーション、鎖置換重合、ランダムプライミングＤＮＡ標識化などが挙げられる。合成工程に特に有用なポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載される標識ヌクレオチドの組み込みを触媒することができるものである。様々な天然由来の又は変異体／改変されたポリメラーゼを使用することができる。例として、熱安定性ポリメラーゼは、熱サイクリング条件を使用して実施される合成反応に使用することができるが、熱安定性ポリメラーゼは、等温プライマー伸長反応には望ましくない場合がある。本開示による標識ヌクレオチドを組み込むことができる好適な熱安定性ポリメラーゼには、ＷＯ２００５／０２４０１０又はＷＯ０６／１２０４３３に記載されるものが含まれ、それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。３７℃などの低温で実施される合成反応では、ポリメラーゼ酵素は、必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はなく、したがって、ポリメラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ、鎖置換活性などのいくつかの要因に依存する。

特定の非限定的な実施形態において、本開示は、核酸シークエンシング、再シークエンシング、全ゲノムシークエンシング、単一ヌクレオチド多型性スコアリングの方法に加えて、ポリヌクレオチドに組み込まれたときに本明細書に記載される色素で標識化された修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの検出を伴う任意の他の用途の方法を含む。

特定の実施形態において、本開示は、本開示による色素部分を含む標識ヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの合成によるシークエンシング反応に使用することを提供する。合成による配列決定は、一般に、配列決定される鋳型／標的核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチド鎖を形成するために、ポリメラーゼ又はリガーゼを使用して、成長しつつあるポリヌクレオチド鎖に対し、５’から３’方向に１つ以上のヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを逐次的に付加することを含む。付加されたヌクレオチドのうちの１つ以上に存在する塩基が何であるかは、検出又は「撮像」工程で決定することができる。添加された塩基が何であるかは、各ヌクレオチド組み込み工程後に決定され得る。次いで、鋳型の配列は、従来式のワトソン・クリック塩基対合ルールを使用して推測され得る。単一の塩基が何であるかを決定するために本明細書に記載される色素で標識化されたヌクレオチドを使用することは、例えば、単一ヌクレオチド多型性のスコアリングにおいて有用であり得るが、そのような単一塩基伸長反応は、本開示の範囲内である。

本開示の実施形態において、標的ポリヌクレオチドの配列は、組み込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出を通して配列決定される標的ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への、１つ以上のヌクレオチドの組み込みを検出することによって決定される。標的ポリヌクレオチドの配列決定は、好適なプライマー（又は、ヘアピンの一部としてプライマーを含有するヘアピン構造体として調製されたプライマー）でプライミングすることができ、新生鎖は、ポリマー触媒反応において、プライマーの３’末端にヌクレオチドを付加することにより、段階的に伸長される。

特定の実施形態において、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）の各々は、固有のフルオロフォアで標識されてもよく、また、制御不可能な重合を防止するために、３’位置に遮断基を含む。代替的に、４つのヌクレオチドのうちの１つは、標識されていなくてもよい（暗色）。ポリメラーゼ酵素は、鋳型／標的ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌクレオチドを組み込むが、遮断基は、ヌクレオチドの更なる組み込みを防止する。任意の組み込まれていないヌクレオチドを洗い流すことができ、各組み込まれたヌクレオチドからの蛍光シグナルパターンは、光励起及び好適な発光フィルタを使用する電荷結合素子などの好適な手段によって、光学的に「読み取る」ことができる。次いで、３’－遮断基及び蛍光色素化合物を除去（開裂）して（同時に又は逐次的に）、更なるヌクレオチドの組み込みのために新生鎖をさらすことができる。典型的には、組み込まれたヌクレオチドが何であるかは、各組み込み工程後に決定されるが、これは厳密に必須というわけではない。同様に、米国特許第５，３０２，５０９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドを配列決定する方法を開示している。

上記に例示したようなその方法は、３’ブロックされたヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、及びＴを、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、固定化されたポリヌクレオチドに相補的な成長鎖に組み込む。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を組み込むが、３’－ヒドロキシル遮断基による更なる付加から防止される。次いで、組み込まれたヌクレオチドの標識を判定し、その後、更なる重合を可能にするために、化学的開裂によってブロッキング基が除去され得る。合成による配列決定反応において配列決定される核酸鋳型は、配列決定が所望される任意のポリヌクレオチドであってもよい。配列決定反応用の核酸鋳型は、典型的には、配列決定反応における更なるヌクレオチドの付加のためのプライマー又は開始点として機能する遊離３’ＯＨ基を有する二本鎖領域を含む。配列決定される鋳型の領域は、この遊離３’ＯＨ基を相補鎖上にオーバーハングする。配列決定される鋳型のオーバーハング領域は、一本鎖であってもよいが、配列決定される標的鎖に相補的な鎖上に「切れ目が存在」して、配列決定反応を開始するための遊離３’ＯＨ基を提供する限りにおいて、二本鎖であることも可能である。かかる実施形態において、配列決定は、鎖置換によって進行し得る。特定の実施形態において、遊離３’ＯＨ基を有するプライマーが、配列決定される鋳型の一本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として付加されてもよい。代替的に、配列決定されるプライマー及び鋳型鎖はそれぞれ、例えばヘアピンループ構造などの分子内二重鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部を形成してもよい。ヘアピンポリヌクレオチド及びそれらが固体支持体に結合され得る方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／５７２４８及び同ＷＯ２００５／０４７３０１に開示され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレオチドは、成長するプライマーに連続的に付加され、５’から３’方向にポリヌクレオチド鎖を合成することができる。添加された塩基の性質は、特に各ヌクレオチド添加後に判定されてよいが、必ずしもそうでなくてもよい。その判定によって、核酸鋳型についての配列情報が提供される。したがって、ヌクレオチドは、ヌクレオチドの５’リン酸基とのリン酸ジエステル結合の形成を介して、核酸鎖の遊離３’ＯＨ基にヌクレオチドを結合することにより、核酸鎖（又はポリヌクレオチド）に組み込まれる。

配列決定される核酸鋳型は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は更にはデオキシヌクレオチド及びリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子であってもよい。核酸鋳型は、配列決定反応における鋳型のコピーを防止しない限り、天然由来のヌクレオチド及び／又は非天然由来のヌクレオチドと、天然由来又は非天然由来の骨格連結を含んでよい。

ある特定の実施形態において、配列決定される標的ポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の任意の好適な連結方法、例えば、共有結合を介して、固体支持体に結合され得る。ある特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、固体支持体（例えば、シリカベースの支持体）に直接結合されてもよい。しかしながら、本開示の他の実施形態において、固体支持体の表面は、標的ポリヌクレオチドの直接的共有結合、又は標的ポリヌクレオチドのヒドロゲル若しくは多電解質層（それ自体は固体支持体に共有結合以外の方法で付着される）を通しての固定化のいずれかを可能にするように、何らかの方法で修飾されてもよい。

ポリヌクレオチドが支持体（例えば、ＷＯ００／００６７７０（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどのシリカベース支持体）に直接結合しているアレイは、ガラス上のペンダントエポキシド基と、ポリヌクレオチドの内部アミノ基との間の反応によって、ガラス支持体に固定化される。加えて、ポリヌクレオチドは、例えば、ＷＯ２００５／０４７３０１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、硫黄系求核試薬と固体担体との反応によって固体支持体に結合することができる。固体支持型鋳型ポリヌクレオチドのまた更なる例は、鋳型ポリヌクレオチドが、シリカ系又は他の固体担体上に支持されたヒドロゲルに取り付けられるものであり、例えば、ＷＯ００／３１１４８、ＷＯ０１／０１１４３、ＷＯ０２／１２５６６号、ＷＯ０３／０１４３９２、米国特許第６，４６５，１７８号、及びＷＯ００／５３８１２に記載されており、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる。

鋳型ポリヌクレオチドが固定化され得る具体的な表面としては、ポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられる。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、上記に引用した参考文献及び参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００５／０６５８１４に記載されている。使用され得る特定のヒドロゲルには、ＷＯ２００５／０６５８１４及び米国公開第２０１４／００７９９２３号に記載されるものが含まれる。一実施形態では、ヒドロゲルは、ＰＡＺＡＭ（ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド））である。

ＤＮＡ鋳型分子は、例えば、米国特許第６，１７２，２１８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ビーズ又は微小粒子に付着させることができる。ビーズ又は微小粒子への付着は、シークエンシング用途に有用であり得る。各ビーズが異なるＤＮＡ配列を含むビーズライブラリを調製することができる。それらの作成のための例示的なライブラリ及び方法は、Ｎａｔｕｒｅ，４３７，３７６－３８０（２００５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，５７４１，１７２８－１７３２（２００５），に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるヌクレオチドを使用したかかるビーズのアレイのシークエンシングは、本開示の範囲内である。

配列決定される鋳型は、固体支持体上に「アレイ」の一部を形成してもよく、この場合、アレイは任意の便利な形態をとることができる。したがって、本開示の方法は、単一分子アレイ、クラスター化アレイ、及びビーズアレイを含む全ての種類の高密度アレイに適用可能である。本開示の色素化合物で標識化されたヌクレオチドは、基本的に任意の種類のアレイ上で鋳型を配列決定するために使用されてもよく、そのようなアレイには、固体支持体上の核酸分子の固定化によって形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

しかしながら、本開示の色素化合物で標識化されたヌクレオチドは、クラスター化アレイの配列決定の文脈において特に有利である。クラスター化アレイでは、アレイ上の別個の領域（多くの場合、部位又は特徴部と呼ばれる）は、複数のポリヌクレオチド鋳型分子を含む。一般に、複数のポリヌクレオチド分子は、光学的手段によって個別に分解可能ではなく、代わりに、アンサンブル（集合体）として検出される。アレイがどのように形成されるかに応じて、アレイ上の各部位は、１つの個々のポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、部位は、特定の一本鎖若しくは二本鎖核酸種に対して均質である）、又は更には少数の異なるポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、２つの異なる核酸種の複数のコピー）を含んでもよい。核酸分子のクラスター化アレイは、当該技術分野において一般的に知られている技術を使用して生成され得る。例として、ＷＯ９８／４４１５１及びＷＯ００／１８９５７は、各々が参照により本明細書に組み込まれ、核酸の増幅方法を記載しており、鋳型及び増幅産物の両方は、固定化された核酸分子のクラスター又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、固体支持体上に固定化されたままである。これらの方法に従って調製されたクラスター化アレイ上に存在する核酸分子は、本開示の色素化合物で標識されたヌクレオチドを使用する配列決定に好適な鋳型である。

本出願の色素化合物で標識されたヌクレオチドは、単一分子アレイ上の鋳型の配列決定にも有用である。本明細書で使用するとき、用語「単一分子アレイ」又は「ＳＭＡ」は、固体支持体の上に分布（又は配列）されたポリヌクレオチド分子の集団を指し、いかなる個々のポリヌクレオチドの、集団の全ての他のポリヌクレオチドからの離間距離は、個々のポリヌクレオチド分子を個々に見分けることが可能であるようになっている。したがって、固体支持体の表面上に固定化された標的核酸分子は、いくつかの実施形態において、光学的手段によって見分けることができる。これは、１つのポリヌクレオチドをそれぞれ表す１つ以上の別個のシグナルが、使用される特定の撮像装置が、見分けることができるエリア内で発生することを意味する。

アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が、少なくとも１００ｎｍ、より具体的には少なくとも２５０ｎｍ、更により具体的には少なくとも３００ｎｍ、更により具体的には少なくとも３５０ｎｍである、単一分子検出が達成され得る。したがって、各分子は個別に分解可能（見分けることが可能）であり、単一分子蛍光点として検出可能であり、この単一分子蛍光点からの蛍光はまた、単一工程でのフォトブリーチを呈する。

用語「個々に分解された」及び「個々の解像度」は、本明細書では、可視化されたときに、アレイ上の１つの分子をその隣接する分子と区別することが可能であることを指定するために使用される。アレイ上の個々の分子間の分離は、個々の分子を分解するために使用される特定の技術によって、部分的に決定される。単一分子アレイの一般的な特徴は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ００／０６７７０及びＷＯ０１／５７２４８を参照することによって理解されるであろう。本開示の標識ヌクレオチドの１つの用途は合成による配列決定反応であるが、各ヌクレオチドの有用性は、かかる方法に限定されない。実際に、本明細書に記載の標識ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出を必要とする任意の配列決定法において有利に使用され得る。

キット
本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載の青色／紫色２チャネル配列決定法のためのキットに関する。いくつかの実施形態において、配列決定用途のためのキットは、
第１の検出可能な標識で標識された第１のタイプのヌクレオチドと、
第２の検出可能な標識で標識された第２のタイプのヌクレオチドと、
第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、を含み、
第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識は、互いにスペクトル的に区別可能であり、第１の検出可能な標識は、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、第２の検出可能な標識は、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能であり、
第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの一方は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの他方は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの一方は、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの他方は、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。いくつかの実施形態において、第３のタイプのヌクレオチドは、第１の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチド、及び第２の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドの混合物である。特定の例として、キットは、青色色素で標識されたｄＡＴＰ、ビオチン部分を含むｄＴＴＰ、ビオチン部分を含むｄＣＴＰ、青色色素で標識されたｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含み得る。

配列決定用途のためのキットの第２の態様において、キットは、
第１の検出可能な標識で標識された第１のタイプのヌクレオチドと、
第２の検出可能な標識で標識された第２のタイプのヌクレオチドと、
第３の検出可能な標識及び第４の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、を含み、
第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識は、互いにスペクトル的に区別可能であり、第１の検出可能な標識は、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、第２の検出可能な標識は、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能であり、
第３の検出可能な標識及び第４の検出可能な標識は、互いにスペクトル的に区別可能であり、第３の検出可能な標識は、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、第４の検出可能な標識は、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能であり、
第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの一方は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、第１の励起光源及び第２の励起光源のうちの他方は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの一方は、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、第１の発光フィルタ及び第２の発光フィルタのうちの他方は、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。いくつかの実施形態において、第３のタイプのヌクレオチドは、第３の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、第４の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドとの混合物である。

本明細書に記載のキットの第３の態様において、１つ以上のタイプのヌクレオチドは、非標識であり得る。いくつかの例では、配列決定用途のためのキットは、
第１のタイプの非標識ヌクレオチドと、
第２のタイプの非標識ヌクレオチドと、
第３のタイプの非標識ヌクレオチドと、
第１のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬、及び第２のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬を含む、親和性試薬のセットと、を含み、第１の親和性試薬は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、第２の親和性試薬は、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識は、第２の検出可能な標識とスペクトル的に区別可能である。いくつかのかかる実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドは、第１のハプテンを含み、第１の親和性試薬は、第１のハプテンに特異的に結合する第１のハプテン結合パートナーを含む。更なる実施形態において、第１のハプテンは、ビオチン部分を含むか、又はそれからなり、第１のハプテン結合パートナーは、ストレプトアビジンを含むか、又はそれからなり、ストレプトアビジンは、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の第１の検出可能な標識とコンジュゲート化される。いくつかの更なる実施形態において、第２のタイプのヌクレオチドは、第２のハプテンを含み、第２の親和性試薬は、第２のハプテンに特異的に結合する第２のハプテン結合パートナーを含む。更なる実施形態において、第２のハプテンは、クロロアルキル基（例えば、－（ＣＨ_２）_６Ｃｌ）を含み、第２のハプテン結合パートナーは、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含むか、又はそれからなり、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）は、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の第２の検出可能な標識とコンジュゲート化される。いくつかの更なる実施形態において、第３のタイプのヌクレオチドは、第１のハプテン及び第２のハプテンの混合物を含む。追加のハプテンはまた、本明細書に記載の非標識ヌクレオチドに使用され得、例えば、ジオキシゲニン及びジニトロフェノールを含むが、これらに限定されない。対応する親和性試薬は、抗ジゴキシゲニン結合パートナー又は抗ジニトロフェノール結合パートナーを含有する。いくつかの実施形態において、第１の親和性試薬及び第２の親和性試薬の両方は、第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する。他の実施形態において、親和性試薬のセットは、第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第３の親和性試薬を更に含み、第３の親和性試薬は、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第３の検出可能な標識と、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第４の検出可能な標識と、を含む。いくつかのかかる実施形態において、第３のタイプのヌクレオチドは、第１のハプテンを含み、第３の親和性試薬は、第３のハプテン結合パートナーを含む。更なる実施形態において、第３の親和性試薬は、第３のハプテン結合パートナー及び１つ以上の第３の検出可能標識を含む第３の親和性試薬と、第３のハプテン結合パートナー及び１つ以上の第４の検出可能な標識を含む第３の親和性試薬と、の混合物を含む。

配列決定用途のためのキットの第４の態様において、キットは、
非標識又は第１の検出可能な標識で標識されているのいずれかの第１のタイプのヌクレオチドと、
非標識又は第２の検出可能な標識で標識されているのいずれかの第２のタイプのヌクレオチドであって、第１のタイプのヌクレオチド及び第２のタイプのヌクレオチドのうちの１つが、非標識である、第２のタイプのヌクレオチドと、
第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び第１又は第２のタイプのヌクレオチドのいずれかと同じ検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドであって、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識が、互いにスペクトル的に区別可能であり、第１の検出可能な標識が、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、第２の検出可能な標識が、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、第３のタイプのヌクレオチドと、
親和性試薬であって、第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び第１のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に第１のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬、又は第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び第２のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に第２のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬のいずれかを含み、第１の親和性試薬が、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、第２の親和性試薬が、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む、親和性試薬と、を含む。いくつかの実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、第２のタイプのヌクレオチドは、第２の検出可能な標識で標識されており、第３のタイプのヌクレオチドは、非標識及び第２の検出可能な標識で標識されているの両方であり、親和性試薬は、第１のタイプのヌクレオチド及び第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬であり、第１の親和性試薬は、１つ以上の第１の検出可能な標識を含む。他の実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドは、第１の検出可能な標識で標識されており、第２のタイプのヌクレオチドは、非標識であり、第３のタイプのヌクレオチドは、非標識及び第２の検出可能な標識で標識されているの両方であり、親和性試薬は、第２のタイプのヌクレオチド及び第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬であり、第２の親和性試薬は、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む。更なる実施形態において、第１のタイプ又は第２のタイプのヌクレオチドのいずれかが非標識である場合、かかる非標識ヌクレオチドは、独立してハプテンを含む。更なる実施形態において、親和性試薬は、非標識ヌクレオチドにおけるハプテンに特異的に結合するハプテン結合パートナーを含む。一例において、ハプテンは、ビオチン部分を含み、ハプテン結合パートナーは、ストレプトアビジンを含む。かかるストレプトアビジンは、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の第１の検出可能な標識とコンジュゲート化される。別の例では、ハプテンは、クロロアルキル基を含み、ハプテン結合パートナーは、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含む。ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）は、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の第２の検出可能な標識とコンジュゲート化される。

本明細書に記載のキットの第４の態様の代替として、キットは、
非標識又は第１の検出可能な標識で標識されているのいずれかの第１のタイプのヌクレオチドと、
非標識又は第２の検出可能な標識で標識されているのいずれかの第２のタイプのヌクレオチドとであって、第１のタイプのヌクレオチド及び第２のタイプのヌクレオチドのうちの１つが、非標識である、第１のタイプのヌクレオチドと、第２のタイプのヌクレオチドと、
（ｉ）非標識の第３のタイプのヌクレオチド、及び第２のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に第３の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドの混合物、又は（ｉｉ）非標識の第３のタイプのヌクレオチド、及び第１のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に第４の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドの混合物を含み得る、第３のタイプのヌクレオチドであって、
第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識が、互いにスペクトル的に区別可能であり、第１及び第３の検出可能な標識の両方が、第１の光源によって励起可能かつ第１の放出フィルタによって検出可能であり、第２及び第４の検出可能な標識の両方が、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、第３のタイプのヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）第１のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に、第１のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬、及び第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第３の親和性試薬の混合物、又は（ｉｖ）第２のタイプのヌクレオチドが非標識である場合、第２のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬、及び第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第３の親和性試薬の混合物を含み得る、親和性試薬のセットであって、
（ｉｉｉ）に記載の混合物中で、第１の親和性試薬が、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、第３の親和性試薬が、１つ以上の第３の検出可能な標識を含み、
（ｉｖ）に記載の混合物中で、第２の親和性試薬が、１つ以上の第２の検出可能な標識を含み、第３の親和性試薬が、１つ以上の第４の検出可能な標識を含む、親和性試薬のセットと、を含む。

本明細書に記載のキットの任意の実施形態において、キットは、第４のタイプのヌクレオチドを更に含み得、第４のタイプのヌクレオチドは、非標識である（暗色）。加えて、本明細書に開示の青色及び紫色色素のうちのいずれかは、このセクションに記載されているヌクレオチド又は親和性試薬の第１若しくは第２の標識として使用され得る。

１つの特定の例として、キットは、以下のヌクレオチドセット：青色色素Ａで標識されたｄＡＴＰ、紫色色素Ｂで標識されたｄＴＴＰ、青色色素Ａで標識されたｄＣＴＰ、紫色色素Ｂで標識されたｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含み得る。

別の特定の例として、キットは、以下のヌクレオチドセット：青色色素Ａで標識されたｄＡＴＰ、紫色色素Ｂで標識されたｄＴＴＰ、青色色素Ｃで標識されたｄＣＴＰ、紫色色素Ｄで標識されたｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含み得る。

別の特定の例として、キットは、以下のヌクレオチドセット：青色色素Ａで標識されたｄＡＴＰ、ビオチン部分を含むｄＴＴＰ、ビオチン部分を含むｄＣＴＰ、青色色素Ａで標識されたｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含み得る。追加的に、キットは、任意選択的に、開裂可能なリンカーを介して、１つ以上の紫色色素Ｂで標識されたストレプトアビジンを含む、親和性試薬を更に含み得る。

別の特定の例として、キットは、以下のヌクレオチドセット：青色色素Ａで標識されたｄＡＴＰ、ビオチン部分である第１のハプテンを含むｄＴＴＰ、第二のハプテン部分を含むｄＣＴＰ、青色色素Ｂで標識されたｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含み得る。追加的に、キットは、１つ以上の紫色色素Ｃとコンジュゲート化されたストレプトアビジンと、各々任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の紫色色素Ｄとコンジュゲート化された第２のハプテン結合パートナーと、を含む親和性試薬のセットを更に含み得る。

更に別の例では、キットは、以下のヌクレオチドセット：クロロアルキル基（例えば、－（ＣＨ_２）_６Ｃｌ）を含むｄＡＴＰ、ビオチン部分を含むｄＴＴＰ、ビオチン部分を含むｄＣＴＰ、クロロアルキル基を含むｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含み得る。キットは、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の紫色色素で標識されたストレプトアビジンを含む、第１の親和性試薬を更に含み得る。キットは、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の青色色素で標識されたＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含む、第２の親和性試薬を更に含み得る。

更に別の例では、キットは、以下のヌクレオチドセット：クロロアルキル基（例えば、－（ＣＨ_２）_６Ｃｌ）を含む第１のハプテンを含むｄＡＴＰ、ビオチン部分を含む第２のハプテンを含むｄＴＴＰ、第３のハプテンを含むｄＣＴＰ、及び非標識ｄＧＴＰ（暗色Ｇ）を含み得る。キットは、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の紫色色素Ｂで標識されたストレプトアビジンを含む、第１の親和性試薬を更に含み得る。キットは、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、１つ以上の青色色素Ａで標識されたＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含む、第２の親和性試薬を更に含み得る。キットは、第３のハプテン結合パートナー及び１つ以上の青色色素Ｃを含む、第３の親和性試薬を更に含み得る。キットは、第３のハプテン結合パートナー及び１つ以上の紫色色素Ｄを含む、第３の親和性試薬を更に含み得る。

本明細書に記載のキットのいくつかの実施形態において、第１の励起光源は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍ（例えば、約４０５ｎｍ）の波長を有し、第１の発光フィルタは、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有する。第２の励起光源は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍ（例えば、約４６０ｎｍ）の波長を有し、第２の発光フィルタは、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。いくつかの他の実施形態において、第１の励起光源は、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍ（例えば、約４６０ｎｍ）の波長を有し、第１の発光フィルタは、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する。第２の励起光源は、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍ（例えば、約４０５ｎｍ）の波長を有し、第２の発光フィルタは、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有する。

上記の例に加えて、キットは、少なくとも１つの追加の構成要素を一緒に含み得る。更なる成分は、本明細書に記載される方法又は以下の実施例のセクションで特定される成分のうちの１つ以上であってもよい。本開示のキットに組み合わせることができる成分のいくつかの非限定的な例を以下に記載する。いくつかの実施形態において、キットは、ＤＮＡポリメラーゼ（変異体ＤＮＡポリメラーゼなど）及び１つ以上の緩衝組成物を更に含む。キットはまた、本明細書に記載の１つ以上の抗酸化剤及び／又はＲＯＳスカベンジャーを含み得る。抗酸化剤及び／又はＲＯＳスカベンジャーは、検出中にＤＮＡ（標的ポリヌクレオチド及び／又はプライマーポリヌクレオチド）及び色素を光損傷から保護するために使用することができる緩衝液又は組成物中にあり得る。追加の緩衝組成物は、３’ヒドロキシル遮断基及び／又は開裂可能なリンカーを切断するために使用することができる試薬を含み得る。例えば、パラジウム錯体などの、遷移金属及び少なくとも部分的に水溶性の配位子から形成された水溶性ホスフィン又は水溶性遷移金属触媒。キットの様々な構成要素は、使用前に希釈される濃縮形態で提供され得る。そのような実施形態では、好適な希釈緩衝液も含まれ得る。更なる実施形態において、キットは、１つ以上の固体支持体を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、固体支持体は、そこに固定された複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、固体支持体は、フローセル、例えば、複数のナノウェルを含むパターン化フローセルを含む。

本明細書に記載のキットのいくつかの実施形態において、検出可能な標識（例えば、青色及び紫色色素）は、ヌクレオチド塩基を介してヌクレオチドに共有結合され得る。いくつかのかかる実施形態において、標識ヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置に結合された標識、又は７デアザプリン塩基のＣ７位置に、任意選択的にリンカー部分を通して結合された標識を有し得る。例えば、核酸塩基は、７－デアザアデニンであり得、色素は、任意選択的にリンカーを通して、Ｃ７位置で７－デアザアデニンに結合している。核酸塩基は、７－デアザグアニンであり得、色素は、任意選択的にリンカーを通して、Ｃ７位置で７－デアザグアニンに結合されている。核酸塩基は、シトシンであり得、色素は、任意選択的にリンカーを通して、Ｃ５位置でシトシンに結合されている。別の例として、核酸塩基は、チミン又はウラシルであり得、色素は、任意選択的にリンカーを通して、Ｃ５位置でチミン又はウラシルに結合されている。本明細書に記載のヌクレオチド又はヌクレオチドコンジュゲートの任意の実施形態において、ヌクレオチド又はヌクレオチドコンジュゲートは、３’ヒドロキシル遮断基を含み得る。他の実施形態において、ヌクレオチドが非標識であり、二次標識方法が使用される場合、１つ以上の青色色素又は紫色色素は、任意選択的に、開裂可能なリンカーを通して、本明細書に記載の親和性試薬にコンジュゲート化され得る。例えば、１つのストレプトアビジンは、検出されるべき組み込まれたヌクレオチドの蛍光強度を増加させるために、同じ紫色色素の２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの分子で標識され得る。

本明細書に記載の方法及びキットの任意の実施形態において、標識が光源によって励起可能かつ発光フィルタによって検出可能である場合、それは、かかる光源によって励起可能かつかかる発光フィルタによって検出可能である、かかる標識とコンジュゲート化された（直接的な標識化又は親和性試薬を通した二次標識化のいずれか）ヌクレオチドも指す。

３’ヒドロキシル遮断基
本明細書に記載の方法及びキットの任意の実施形態において、組み込み混合物で使用されるヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース又はデオキシリボース糖に共有結合された遮断基を有し得る。特定の実施形態において、遮断基は、ヌクレオチドのデオキシリボース糖の３’ＯＨ位置にある。様々な３’ＯＨ遮断基が、ＷＯ２００４／０１８４９７及びＷＯ２０１４／１３９５９６に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、遮断基は、アジドメチル（－ＣＨ_２Ｎ_３）若しくは置換アジドメチル（例えば、－ＣＨ（ＣＨＦ_２）Ｎ_３又はＣＨ（ＣＨ_２Ｆ）Ｎ_３）、又はリボース若しくはデオキシリボース糖の３’酸素原子に接続しているアリルであり得る。いくつかの実施形態において、３’遮断基は、アジドメチルであり、リボース又はデオキシリボースの３’炭素を用いて３’－ＯＣＨ_２Ｎ_３を形成する。

いくつかの他の実施形態において、３’遮断基及び３’酸素原子は、リボース又はデオキシリボースの３’炭素に

共有結合した上記構造のアセタール基を形成し、
式中、各Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルコキシ、シアノ、ハロゲン、任意に置換されたフェニル、又は任意に置換されたアラルキルであり、
各Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、シアノ、又はハロゲンであり、
代替として、Ｒ^１ａ及びＲ^２ａは、それらが結合している原子と一緒に、任意に置換された５～８員ヘテロシクリル基を形成し、
Ｒ^Ｆは、Ｈ、任意に置換されたＣ_２～Ｃ_６アルケニル、任意に置換されたＣ_３～Ｃ_７シクロアルケニル、任意に置換されたＣ_２～Ｃ_６アルキニル、又は任意に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ^３ａ）_３であり、
各Ｒ^３ａは、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又は任意に置換されたＣ_６～Ｃ_１０アリールである。

追加の３’ＯＨ遮断基は、米国公開第２０２０／０２１６８９１Ａ１号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。アセタールブロッキング基

の非限定的な例であり、各々、リボース又はデオキシリボースの３’炭素に共有結合している。

３’ヒドロキシル遮断基の脱保護
いくつかの実施形態において、アジドメチル３’ヒドロキシル保護基は、水溶性ホスフィン試薬を使用することによって除去又は脱保護され得る。非限定的な例としては、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＭＰ）、トリス（ヒドロキシエチル）ホスフィン（ＴＨＥＰ）、又はトリス（ヒドロキシルプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ又はＴＨＰＰ）が挙げられる。本明細書に記載の３’－アセタールブロッキング基は、様々な化学条件下で除去又は切断され得る。ビニル又はアルケニル部分を含むアセタール遮断基

では、非限定的な切断条件には、ホスフィン配位子、例えばトリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＭＰ）、又はトリス（ヒドロキシルプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ又はＴＨＰＰ）の存在下での、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２又はアリルＰｄ（ＩＩ）クロリド二量体などのＰｄ（ＩＩ）錯体が含まれる。アルキニル基（例えば、エチニル）を含有するこれらのブロッキング基の場合、それらはまた、ホスフィン配位子（例えば、ＴＨＰ又はＴＨＭＰ）の存在下でのＰｄ（ＩＩ）錯体（例えば、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２又はアリルＰｄ（ＩＩ）クロリド二量体）によって除去され得る。

パラジウム切断試薬
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の３’ヒドロキシル遮断基は、パラジウム触媒によって切断され得る。いくつかのそのような実施形態では、Ｐｄ触媒は、水溶性である。いくつかのかかる実施形態において、Ｐｄ（０）錯体（例えば、トリス（３，３’，３”ホスフィニジントリス（ベンゼンスルホナト）パラジウム（０）九ナトリウム塩九水和物）である。場合によっては、Ｐｄ（０）は、アルケン、アルコール、アミン、ホスフィン、又は金属水素化物などの試薬によるＰｄ（ＩＩ）錯体の還元からその場で生成され得る。好適なパラジウム源としては、Ｎａ_２ＰｄＣｌ_４、Ｐｄ（ＣＨ_３ＣＮ）_２Ｃｌ_２、（ＰｄＣｌ（Ｃ_３Ｈ_５））_２、［Ｐｄ（Ｃ_３Ｈ_５）（ＴＨＰ）］Ｃｌ、［Ｐｄ（Ｃ_３Ｈ_５）（ＴＨＰ）_２］Ｃｌ、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２、Ｐｄ（Ｐｈ_３）_４、Ｐｄ（ｄｂａ）_２、Ｐｄ（Ａｃａｃ）_２、ＰｄＣｌ_２（ＣＯＤ）、及びＰｄ（ＴＦＡ）_２が挙げられる。そのような一実施形態では、Ｐｄ（０）錯体は、Ｎａ_２ＰｄＣｌ_４からその場で生成される。別の実施形態では、パラジウム源は、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体［（ＰｄＣｌ（Ｃ_３Ｈ_５））_２］である。いくつかの実施形態では、Ｐｄ（０）錯体は、Ｐｄ（ＩＩ）錯体をホスフィンと混合することによって水溶液中で生成される。好適なホスフィンとしては、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＭＰ）、１，３，５－トリアザ－７－ホスファアダマンタン（ＰＴＡ）、ビス（ｐ－スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物カリウム塩、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、及びトリフェニルホスフィン－３，３’，３”－トリスルホン酸三ナトリウム塩などの水溶性ホスフィンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、Ｐｄ（０）は、Ｐｄ（ＩＩ）錯体［（ＰｄＣｌ（Ｃ_３Ｈ_５））_２］をＴＨＰとその場で混合することによって調製される。Ｐｄ（ＩＩ）錯体とＴＨＰとのモル比は、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、又は１：１０であり得る。いくつかの更なる実施形態では、アスコルビン酸又はその塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）などの１つ以上の還元剤を添加してもよい。いくつかの実施形態では、切断混合物は、一級アミン、二級アミン、三級アミン、炭酸塩、リン酸塩、若しくはホウ酸塩、又はそれらの組み合わせなどの追加の緩衝試薬を含有し得る。いくつかの更なる実施形態では、緩衝剤試薬は、エタノールアミン（ethanolamine、ＥＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、グリシン、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、２－ジメチルエタノールアミン（dimethylethanolamine、ＤＭＥＡ）、２－ジエチルエタノールアミン（diethylethanolamine、ＤＥＥＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（tetramethylethylenediamine、ＴＥＭＥＤ）、若しくはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラエチルエチレンジアミン（tetraethylethylenediamine、ＴＥＥＤＡ）、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、緩衝剤試薬は、ＤＥＥＡである。別の実施形態では、緩衝剤試薬は、炭酸塩、リン酸塩、若しくはホウ酸塩、又はそれらの組み合わせなどの１つ以上の無機塩を含有する。一実施形態では、無機塩は、ナトリウム塩である。

リンカー
蛍光標識は、開裂可能なリンカーを介してヌクレオチドに共有結合され得る。用語「開裂可能なリンカー」の使用は、リンカー全体を除去する必要があることを意味するものではない。開裂部位は、リンカーの一部が、開裂後に色素及び／又は基材部分に付着したままであることを確実にするリンカー上の位置に配置され得る。開裂可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に開裂可能なリンカー、求核的に開裂可能なリンカー、光開裂可能リンカー、還元条件下で開裂可能なリンカー（例えば、ジスルフィド又はアジド含有リンカー）、酸化的条件で開裂可能なリンカー、安全装置リンカーの使用によって開裂可能なリンカー、除去機構によって開裂可能であるリンカーであり得る。色素化合物を基材部分に付着させるために開裂可能なリンカーを使用することにより、必要に応じて、検出後に標識を除去することができ、下流の工程においていかなる干渉シグナルも回避することができる。

有用なリンカー基は、ＰＴＣ公開第ＷＯ２００４／０１８４９３号（参照により本明細書において組み込まれる）に記載されており、その例としては、遷移金属及び少なくとも部分的に水溶性リガンドから形成された水溶性ホスフィン又は水溶性遷移金属触媒を使用して開裂され得るリンカーが挙げられる。水溶液中で、後者は、少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体を形成する。このような開裂可能なリンカーは、ヌクレオチドの塩基を、本明細書に記載される色素などの標識に接続するために使用することができる。

特定のリンカーには、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが含まれ、式：

（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、及びＮＱを含む基から選択され、Ｑは、Ｃ１～１０の置換又は非置換アルキル基であり、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、及びＮ（アリル）を含む基から選択され、Ｔは、水素又はＣ_１～Ｃ_１０置換又は非置換アルキル基であり、^＊は、その部分がヌクレオチドの残りの部分に接続される位置を示す）の部分を含むものなどが挙げられる。いくつかの態様において、リンカーは、ヌクレオチドの塩基を標識に接続する。

リンカーの追加の例としては、以下の式の部分を含むものなど、米国特許出願公開第２０１６／００４０２２５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが挙げられる

（式中、^＊は、その部分がヌクレオチドの残りの部分に接続される位置を示す）。本明細書に示されるリンカー部分は、ヌクレオチドと標識との間の全体又は部分的なリンカー構造を含み得る。本明細書に示されるリンカー部分は、ヌクレオチドと標識との間の全体又は部分的なリンカー構造を含み得る。

リンカーの追加の例には、以下の式：

の部分が含まれ、式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｚは、－Ｎ_３（アジド）、－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、－Ｏ－Ｃ_２－Ｃ_６アルケニル、又は－Ｏ－Ｃ_２－Ｃ_６アルキニルであり、Ｆｌは、追加のリンカー構造を含有し得る色素部分を含む。当業者は、本明細書に記載の色素化合物が、色素化合物の官能基（例えば、カルボキシル）をリンカーの官能基（例えば、アミノ）と反応させることによってリンカーに共有結合していることを理解する。一実施形態では、切断可能なリンカーは、

（「ＡＯＬ」リンカー部分）を含み、式中、Ｚは、－Ｏ－アリルである。

色素は、例えばリンカーを介してヌクレオチド塩基上の任意の位置に取り付けられてもよい。特定の実施形態において、ワトソン・クリック塩基対合が、得られた類似体に対して依然として実行され得る。特定の核塩基標識部位としては、ピリミジン塩基のＣ５位置、又は７－デアザプリン塩基のＣ７位置が挙げられる。

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドが組み込み時に非標識であり、親和性試薬に依存して、検出可能な標識を伸長したプライマーポリヌクレオチドに付加する場合、非標識ヌクレオチドは、ハプテンを結合するための開裂可能なリンカーを依然として含み得る。本明細書に記載の開裂可能なリンカーはまた、二次標識方法が親和性試薬を使用して伸長したプライマーポリヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体に標識を付加するために使用される場合、色素を親和性試薬に結合させるために使用され得る。

標識ヌクレオチド
本明細書に記載の色素で標識されたヌクレオチドは、式：

を有し、式中、Ｄｙｅは、本明細書に記載の色素化合物（標識）部分であり（色素の官能基とリンカー「Ｌ」の官能基との間の共有結合後）、Ｂは、例えばウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７－デアザアデニン、グアニン、７－デアザグアニンなどの核酸塩基であり、Ｌは、存在し得るか又は存在し得ない、任意選択的なリンカー基であり、Ｒ’は、Ｈであることができ、－ＯＲ’は、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、又は遮断基によって保護された－Ｏ－であり、Ｒ”は、Ｈ又はＯＨであり、Ｒ’’’は、Ｈ、本明細書に記載の３’ＯＨ遮断基であるか、又は－ＯＲ’’’は、ホスホラミダイトを形成する。式中、－ＯＲ’’’は、ホスホラミダイトであり、Ｒ’は、自動合成条件下でその後のモノマーカップリングを可能にする酸開裂可能なヒドロキシル保護基である。いくつかの更なる実施形態において、Ｂは、

又はそれらの任意選択的に置換された誘導体及び類似体を含む。いくつかの更なる実施形態では、標識核酸塩基は、構造

を含む。

特定の実施形態において、遮断基は、色素化合物とは別個かつ独立しており、すなわち、色素化合物には結合していない。代替的に、色素は、３’－ＯＨ遮断基の全て又は一部を含んでもよい。したがって、Ｒ’’’は、色素化合物を含んでも含まなくてもよい３’－ＯＨ遮断基であり得る。

更に別の代替的な実施形態において、ペントース糖の３’炭素上に遮断基は存在せず、例えば、塩基に結合した色素（又は色素及びリンカー構造物）が、更なるヌクレオチドの組み込みに対するブロックとして作用するのに十分なサイズ又は構造であり得る。したがって、色素が糖の３’位置に結合されているかどうかに関わらず、ブロックは立体的妨害物に起因し得るか、又は、サイズ、電荷、及び構造の組み合わせに起因し得る。

更に別の代替的な実施形態において、遮断基はペントース糖の２’又は４’炭素上に存在し、更なるヌクレオチドの組み込みに対してブロックとして作用するのに十分なサイズ又は構造であることができる。

いくつかの実施形態において、リンカー（色素とヌクレオチドとの間）及び遮断基が両方とも存在し、互いに別個の部分である。特定の実施形態において、リンカー及び遮断基は、同じ又は実質的に同様の条件下で両方とも開裂可能である。したがって、脱保護及び脱ブロッキングプロセスは、色素化合物及びブロッキング基の両方を除去するために単一の処理のみが必要となるため、より効率的であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、リンカー及び遮断基は、別個の条件下で個別に開裂可能である代わりに、同様の条件下で開裂可能である必要はない。

本開示はまた、色素化合物を組み込むポリヌクレオチドも包含する。このようなポリヌクレオチドは、ホスホジエステル連結で接合されたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからそれぞれなるＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、自然由来のヌクレオチド、本明細書に記載される標識化されたヌクレオチド以外の非自然由来（又は修飾）ヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせを、本明細書に記載されるような少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば、色素化合物で標識化されたもの）と組み合わせて含むことができる。本開示によるポリヌクレオチドは、非自然由来の骨格結合及び／又は非ヌクレオチド化学修飾も含み得る。少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含むリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの混合物からなるキメラ構造も想到される。

本明細書に記載される非限定的な標識ヌクレオチドコンジュゲートには：

が含まれ、式中、Ｌは、リンカーを表し、Ｒは、上記のリボース若しくはデオキシリボース部分、又は５’位置が一リン酸、二リン酸、若しくは三リン酸で置換されたリボース若しくはデオキシリボース部分を表す。

いくつかの実施形態において、開裂可能なリンカー及び蛍光部分を含む非限定的な例示的な完全官能化ヌクレオチドコンジュゲートは、以下：

に示され、式中、ＰＧは、本明細書に記載の３’ＯＨ遮断基を表し、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の整数であり、ｋは、０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態では、－Ｏ－ＰＧは、ＡＯＭである。別の実施形態では、－Ｏ－ＰＧは、－Ｏ－アジドメチルである。一実施形態において、ｋは、５である。いくつかの更なる実施形態において、ｐは、１、２、又は３であり、ｋは、５である。

は、リンカー部分のアミノ基とＤｙｅ（すなわち、本明細書に記載の青色色素又は紫色色素）のカルボキシル基との間の反応の結果として、開裂可能なリンカーを有するＤｙｅの接続点を指す。本明細書に記載の標識ヌクレオチドの任意の実施形態では、ヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸である。代替的に、ｆｆＮが標識されていない場合、Ｄｙｅ部分は、非標識ヌクレオチドと本明細書に記載の親和性試薬との結合を可能にすることができる官能部分（例えば、ハプテン）で置き換えられ得る。
実施例

追加的実施形態が、以下の実施例において更に詳細に開示されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。

実施例１．紫色照射を４０５ｎｍで使用したＤＮＡ光損傷の評価
この実施例では、４０５ｎｍの紫色光によって引き起こされた、損傷したＤＮＡを評価した。トリス緩衝液（ｐＨ＝８、１００ｍＭ）中の一本鎖ＤＮＡを、紫色色素ＤＹ４０５に共有結合したか、又は緩衝液中のＤＹ４０５の存在下で、紫色ＬＥＤ下で２時間照射した。ＤＹ４０５がＤＮＡの５’末端に共有結合されていた場合、照射によって引き起こされたＤＮＡに対する光損傷は、ＤＹ４０５を添加した緩衝液中にＤＮＡを混合した場合と比較して、実質的に増加されたことが観察された。結果を、図１に示した。

実施例２．青色／紫色２チャネルＭｉＳｅｑ（登録商標）システムを使用した合成による配列決定
この実施例では、合成による配列決定は、２チャネル青色／紫色として構成されたＭｉＳｅｑ（登録商標）装置で行われた。標準配列決定試薬を使用した。標準ＳＢＳにおける組み込み混合物を表１に要約する。これらのデータに示される配列決定したライブラリは、ＰｈｉＸである。

標準ＳＢＳ取り込み混合物では、使用した紫色色素は、ＤＹ４０５である。ｆｆＴ及びｆｆＣの両方とも、ＤＹ４０５で標識した。ｆｆＡ及びｆｆＣを標識するために、青色ＤｙｅＡを使用した。緑色ｆｆＮもまた、紫色及び青色チャネルにおけるシグナル強度を低下させるために導入し、正方形の散布プロットを分析後に好ましい形状で得た。ｆｆＧは、非標識だった（「暗色Ｇ」）。組み込み混合物中のヌクレオチドの構造を、以下に示す。ｆｆＣ－ｓＰＡ－ＤＹ４０５及びｆｆＴ－ＬＮ３－ＤＹ４０５の両方とも、ｐｐｐＣ－ｓＰＡ－ＮＨ_２又はｐｐｐＴ－ＬＮ３－ＮＨ_２をＤｙ４０５－ＮＨＳ（５ｍｇ）と反応させることによる標準ｆｆＮカップリング反応を使用することによって調製した。

ＤＹ４０５標識ストレプトアビジンの調製。第１に、無水ＤＭＡ中でヒューニッヒ塩基及びＴＳＴＵの存在下、ＤＹ４０５をＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩）（１．５当量）と３０分間反応させることによって、ＤＹ４０５をＤＹ４０５－ＮＨＳに変換した。第２に、ストレプトアビジン粉末を水及びＮａＨＣＯ_３緩衝液に溶解した。第１のステップから調製されたＤＹ４０５－ＮＨＳをストレプトアビジン溶液に移し、時折混合しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を反応混合物に添加した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｙｅ除去カラムを使用して過剰な色素を除去することによって、反応生成物を精製した。反応生成物の定量化は、最終色素／タンパク質比が約３．１～３．４だったことを示した。

二次標識ＳＢＳでは、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰについて二次標識を使用した。二次標識ＳＢＳ取り込み混合物において、ｆｆＴは、非標識であり、ビオチン部分を含んだ。ｆｆＣは、非標識及び青色色素Ａで標識されているの両方であり、ｆｆＡは、青色色素Ａで標識されていた。組み込み混合物を、表２に要約する。二次標識ＳＢＳにおいて、追加のステップが、標準的な組み込み後に配列決定法で必要とされた。１つのヌクレオチドの組み込み後、ＤＹ４０５標識ストレプトアビジンの溶液を、フローセルでフラッシュして６０℃で２５秒間インキュベートし、続いて、第１及び第２の撮像イベントを行う前に緩衝液洗浄を行った。ストレプトアビジン－ＤＹ４０５溶液は、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中に５ｕｇ／ｍｌのストレプトアビジン－ＤＹ４０５、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）を含有した。市販のＭｉＳｅｑ（登録商標）フローセルをこの実験に使用した。図２は、二次標識ＳＢＳを用いて得られた散布図を示し、この配列決定法の有用性を実証する。

表３は、二次標識ＳＢＳ及び標準ＳＢＳの両方における一次配列決定メトリクスを示す（Ｒ１＝二次標識ＳＢＳ及びＲ２＝標準ＳＢＳ）。結果は、青色／紫色２チャネル配列決定が、紫色色素の二次標識を伴う修飾方法に匹敵することを示す。

しかしながら、青色／紫色（Ｂ／Ｖ）チャネルを使用する５０サイクル実行について観察されたフェージング％及びシグナル減衰％は、標準的な青色／緑色（Ｂ／Ｇ）配列決定におけるよりもはるかに高い（表４）。

更なる実験を行って、ヌクレオチド取り込み時間及び紫色照光時間に関連するシグナル減衰の原因を理解した。紫色光の照射量の増加及び紫色光曝露時間の増加の両方が、シグナル減衰を悪化させることが発見された。しかしながら、ヌクレオチド取り込み時間を増加させることによって、フェージング％が実質的に減少し、結果として、シグナル減衰も改善された。更に、シグナル減衰もまた、紫色光の減少した損失及びより短い曝露時間（例えば、紫色曝露時間を２５０ｍｓから１７０ｍｓに短縮させる）を用いた、より明るいフローセルを使用することによって改善した。

Claims (59)

1. 標的ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
   （ａ）プライマーポリヌクレオチドを、第１のタイプのヌクレオチド、第２のタイプのヌクレオチド、第３のタイプのヌクレオチド、及び第４のタイプのヌクレオチドのうちの１つ以上を含む混合物と接触させることであって、前記プライマーポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、接触させることと、
   （ｂ）前記混合物から前記プライマーポリヌクレオチドに１つのタイプのヌクレオチドを組み込んで、伸長したプライマーポリヌクレオチドを生成することと、
   （ｃ）第１の励起光源を使用して第１の撮像イベントを行い、第１の発光フィルタで前記伸長したプライマーポリヌクレオチドから第１の発光シグナルを収集することと、
   （ｄ）第２の励起光源を使用して第２の撮像イベントを行い、第２の発光フィルタで前記伸長したプライマーポリヌクレオチドから第２の発光シグナルを収集することと、を含み、
   前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの一方が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの他方が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
   前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの一方が、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの他方が、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する、方法。
2. 前記第１のタイプのヌクレオチドが、前記第１の励起光源によって励起可能かつ前記第１の発光フィルタによって検出可能である、第１の検出可能な標識で標識されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２のタイプのヌクレオチドが、前記第２の励起光源によって励起可能かつ前記第２の発光フィルタによって検出可能である、第２の検出可能な標識で標識されており、前記第２のタイプの検出可能な標識が、前記第１のタイプの検出可能な標識とスペクトル的に区別可能である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記第３のタイプのヌクレオチドが、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方で標識されており、前記第３のタイプのヌクレオチドが、前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源の両方によって励起可能である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第３のタイプのヌクレオチドが、第３の標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、第４の標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドとの混合物を含み、前記第３の標識が、前記第１の励起光源によって励起可能かつ前記第１の発光フィルタによって検出可能であり、前記第４の標識が、前記第２の励起光源によって励起可能かつ前記第２の発光フィルタによって検出可能である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１のタイプ、前記第２のタイプ、及び前記第３のタイプのヌクレオチドの各々が、非標識であり、前記方法が、前記第１の撮像イベントの前に、前記伸長したプライマーポリヌクレオチドを親和性試薬のセットと接触させることを含み、前記セット中の少なくとも１つの親和性試薬が、前記組み込まれた第１のタイプ、第２のタイプ、又は第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
7. 前記親和性試薬のセットが、前記第１のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬と、前記第２のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬と、を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１の親和性試薬が、前記第１の励起光源によって励起可能かつ前記第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、前記第２の親和性試薬が、前記第２の励起光源によって励起可能かつ前記第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識が、前記第２の検出可能な標識とスペクトル的に区別可能である、請求項７に記載の方法。
9. 前記第１の親和性試薬及び前記第２の親和性試薬の両方が、前記第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する、請求項７又は８に記載の方法。
10. 前記親和性試薬のセットが、前記第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第３の親和性試薬を更に含み、前記第３の親和性試薬が、前記第１の励起光源によって励起可能かつ前記第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第３の検出可能な標識と、前記第２の励起光源によって励起可能かつ前記第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第４の検出可能な標識と、を含む、請求項７又は８に記載の方法。
11. 前記第１のタイプのヌクレオチドが、第１のハプテンを含み、前記第１の親和性試薬が、前記第１のハプテンに特異的に結合する第１のハプテン結合パートナーを含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１のハプテンが、ビオチン部分を含み、前記第１のハプテン結合パートナーが、ストレプトアビジンを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第２のタイプのヌクレオチドが、第２のハプテンを含み、前記第２の親和性試薬が、前記第２のハプテンに特異的に結合する第２のハプテン結合パートナーを含む、請求項７～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第２のハプテンが、クロロアルキル基を含み、前記第２のハプテン結合パートナーが、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１のタイプのヌクレオチドが、第１の検出可能な標識で標識されており、前記第２のタイプのヌクレオチドが、非標識であり、前記第３のタイプのヌクレオチドが、非標識及び前記第１の検出可能な標識で標識されているの両方であり、前記第１の標識が、前記第１の励起光源によって励起可能かつ前記第１の発光フィルタによって検出可能であり、前記方法が、前記第１の撮像イベントの前に、前記伸長したプライマーヌクレオチドを親和性試薬と接触させることを含み、前記親和性試薬が、前記第２のタイプの非標識ヌクレオチド又は前記第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
16. 前記親和性試薬が、前記第２の励起光源によって励起可能かつ前記第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記親和性試薬が、ストレプトアビジンを含み、前記第２のタイプのヌクレオチド及び前記第３のタイプの非標識ヌクレオチドの両方が、ビオチン部分を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第１のタイプのヌクレオチドが、非標識であり、前記第２のタイプのヌクレオチドが、前記第２の検出可能な標識で標識されており、前記第３のタイプのヌクレオチドが、非標識及び前記第２の検出可能な標識で標識されているの両方であり、前記第２の検出可能な標識が、前記第２の励起抗原によって励起可能かつ前記第２の発光フィルタによって検出可能であり、前記方法が、前記第１の撮像イベント前に、前記伸長したプライマーポリヌクレオチドを親和性試薬と接触させることを含み、前記親和性試薬が、前記第１のタイプの非標識ヌクレオチド又は前記第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
19. 前記親和性試薬が、前記第１の励起光源によって励起可能かつ前記第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第１の検出可能な標識を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記親和性試薬が、ストレプトアビジンを含み、前記第１のタイプのヌクレオチド及び前記第３のタイプの非標識ヌクレオチドの両方が、ビオチン部分を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第４のタイプのヌクレオチドが、非標識（暗色）であるか、又は前記第１の撮像イベント若しくは前記第２の撮像イベントのいずれからも発光を有しない蛍光部分で標識されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記４つのタイプのヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、又はそれらの非天然ヌクレオチド類似体を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記混合物中の前記４つのタイプのヌクレオチドの各々が、３’ヒドロキシル遮断基を有する、請求項２２に記載の方法。
24. （ｅ）前記第２の撮像イベントの後、及び次の配列決定サイクルの前に、前記組み込まれたヌクレオチドから前記３’ヒドロキシル遮断基を除去することを更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 複数のサイクルについてステップ（ａ）～（ｅ）を繰り返すことと、
    連続的に組み込まれたヌクレオチドに基づいて、前記標的ポリヌクレオチドの配列を決定することと、を更に含む、請求項２４に記載の方法。
26. ステップ（ａ）～（ｅ）が、少なくとも５０サイクル繰り返される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源の各々が、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記第１の励起光源が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第１の発光フィルタが、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記第２の励起光源が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、前記第２の発光フィルタが、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する、請求項２８に記載の方法。
30. 前記第１の励起光源が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、前記第１の発光フィルタが、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記第２の励起光源が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第２の発光フィルタが、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有する、請求項３０に記載の方法。
32. 前記伸長したプライマーポリヌクレオチドが、前記第１の撮像イベント及び前記第２の撮像イベント中に１つ以上の抗酸化剤を含む緩衝溶液中にある、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記標的ポリヌクレオチドが、固体支持体に固定されている、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記固体支持体が、複数の固定された標的ポリヌクレオチドを含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記固体支持体が、フローセルを含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
36. 前記フローセルが、複数のナノウェルを含むパターン化されたフローセルであり、各ナノウェルが、１つの固定された標的ポリヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。
37. 前記固体支持体上の前記固定された標的ポリヌクレオチドの密度が、約１００ｋ／ｍｍ^２～約３００ｋ／ｍｍ^２である、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 配列決定用途のためのキットであって、
    第１の検出可能な標識で標識された第１のタイプのヌクレオチドと、
    第２の検出可能な標識で標識された第２のタイプのヌクレオチドと、
    前記第１の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、
    前記第２の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、を含み、
    前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識が、互いにスペクトル的に区別可能であり、前記第１の検出可能な標識が、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、前記第２の検出可能な標識が、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能であり、
    前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの一方が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの他方が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
    前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの一方が、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの他方が、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する、キット。
39. 配列決定用途のためのキットであって、
    第１の検出可能な標識で標識された第１のタイプのヌクレオチドと、
    第２の検出可能な標識で標識された第２のタイプのヌクレオチドと、
    第３の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、
    第４の検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドと、を含み、
    前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識が、互いにスペクトル的に区別可能であり、前記第１の検出可能な標識が、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、前記第２の検出可能な標識が、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能であり、
    前記第３の検出可能な標識及び前記第４の検出可能な標識が、互いにスペクトル的に区別可能であり、前記第３の検出可能な標識が、前記第１の光源によって励起可能かつ前記第１の発光フィルタによって検出可能であり、前記第４の検出可能な標識が、前記第２の光源によって励起可能かつ前記第２の発光フィルタによって検出可能であり、
    前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの一方が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの他方が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
    前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの一方が、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの他方が、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する、キット。
40. 配列決定用途のためのキットであって、
    第１のタイプの非標識ヌクレオチドと、
    第２のタイプの非標識ヌクレオチドと、
    第３のタイプの非標識ヌクレオチドと、
    親和性試薬のセットであって、
    前記第１のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬、及び
    前記第２のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬を含み、
    前記第１の親和性試薬が、第１の励起光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、前記第２の親和性試薬が、第２の励起光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識が、前記第２の検出可能な標識とスペクトル的に区別可能である、親和性試薬のセットと、を含み、
    前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの一方が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの他方が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
    前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの一方が、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの他方が、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する、キット。
41. 前記第１のタイプのヌクレオチドが、第１のハプテンを含み、前記第１の親和性試薬が、前記第１のハプテンに特異的に結合する第１のハプテン結合パートナーを含む、請求項４０に記載のキット。
42. 前記第１のハプテンが、ビオチン部分を含み、前記第１のハプテン結合パートナーが、ストレプトアビジンを含む、請求項４１に記載のキット。
43. 前記第２のタイプのヌクレオチドが、第２のハプテンを含み、前記第２の親和性試薬が、前記第２のハプテンに特異的に結合する第２のハプテン結合パートナーを含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載のキット。
44. 前記第２のハプテンが、クロロアルキル基を含み、前記第２のハプテン結合パートナーが、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含む、請求項４３に記載のキット。
45. 前記第３のタイプのヌクレオチドが、第１のハプテン及び第２のハプテンの両方を含み、前記第１の親和性試薬及び前記第２の親和性試薬の両方が、前記第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する、請求項３９～４４のいずれか一項に記載のキット。
46. 前記親和性試薬のセットが、前記第３のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第３の親和性試薬を更に含み、前記第３の親和性試薬が、前記第１の励起光源によって励起可能かつ前記第１の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第３の検出可能な標識と、前記第２の励起光源によって励起可能かつ前記第２の発光フィルタによって検出可能である、１つ以上の第４の検出可能な標識と、を含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載のキット。
47. 配列決定用途のためのキットであって、
    非標識又は第１の検出可能な標識で標識されているのいずれかの第１のタイプのヌクレオチドと、
    非標識又は第２の検出可能な標識で標識されているのいずれかの第２のタイプのヌクレオチドとであって、前記第１のタイプのヌクレオチド及び前記第２のタイプのヌクレオチドのうちの一方が、非標識である、第１のタイプのヌクレオチドと、第２のタイプのヌクレオチドと、
    第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び前記第１又は前記第２のタイプのヌクレオチドのいずれかと同じ検出可能な標識で標識された第３のタイプのヌクレオチドであって、前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識が、互いにスペクトル的に区別可能であり、前記第１の検出可能な標識が、第１の光源によって励起可能かつ第１の発光フィルタによって検出可能であり、前記第２の検出可能な標識が、第２の光源によって励起可能かつ第２の発光フィルタによって検出可能である、第３のタイプのヌクレオチドと、
    親和性試薬であって、前記第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び前記第１のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に前記第１のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬、又は前記第３のタイプの非標識ヌクレオチド、及び前記第２のタイプのヌクレオチドが非標識である場合に前記第２のタイプのヌクレオチドに特異的に結合する第２の親和性試薬のいずれかを含み、前記第１の親和性試薬が、１つ以上の第１の検出可能な標識を含み、前記第２の親和性試薬が、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む、親和性試薬と、を含み、
    前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの一方が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第１の励起光源及び前記第２の励起光源のうちの他方が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、
    前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの一方が、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、前記第１の発光フィルタ及び前記第２の発光フィルタのうちの他方が、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する、キット。
48. 前記第１のタイプのヌクレオチドが、非標識であり、前記第２のタイプのヌクレオチドが、第２の検出可能な標識で標識されており、前記第３のタイプのヌクレオチドが、非標識及び第２の検出可能な標識で標識されているの両方であり、前記親和性試薬が、前記第１のタイプのヌクレオチド及び前記第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬であり、前記第１の親和性試薬が、１つ以上の第１の検出可能な標識を含む、請求項４７に記載のキット。
49. 前記第１のタイプのヌクレオチドが、第１の検出可能な標識で標識されており、前記第２のタイプのヌクレオチドが、非標識であり、前記第３のタイプのヌクレオチドが、非標識及び第２の検出可能な標識で標識されているの両方であり、前記親和性試薬が、前記第２のタイプのヌクレオチド及び前記第３のタイプの非標識ヌクレオチドに特異的に結合する前記第２の親和性試薬であり、前記第２の親和性試薬が、１つ以上の第２の検出可能な標識を含む、請求項４７に記載のキット。
50. 前記第１のタイプ又は前記第２のタイプのヌクレオチドのいずれかが非標識である場合、前記非標識ヌクレオチドが、独立してハプテンを含む、請求項４７～４９のいずれか一項に記載のキット。
51. 前記親和性試薬が、前記非標識ヌクレオチドにおける前記ハプテンに特異的に結合するハプテン結合パートナーを含む、請求項５０に記載のキット。
52. 前記ハプテンが、ビオチン部分又はクロロアルキル基を含む、請求項５０又は５１に記載のキット。
53. 前記ハプテン結合パートナーが、ストレプトアビジン又はＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を含む、請求項５１又は５２に記載のキット。
54. 前記第１の励起光源が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第１の発光フィルタが、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有し、前記第２の励起光源が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、前記第２の発光フィルタが、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有する、請求項３８～５３のいずれか一項に記載のキット。
55. 前記第１の励起光源が、約４５０ｎｍ～約４６０ｎｍの波長を有し、前記第１の発光フィルタが、約４８０ｎｍ～約５２５ｎｍの検出波長を有し、前記第２の励起光源が、約３５０ｎｍ～約４１０ｎｍの波長を有し、前記第２の発光フィルタが、約４１５ｎｍ～約４５０ｎｍの検出波長を有する、請求項３８～５３のいずれか一項に記載のキット。
56. 第４のタイプのヌクレオチドを更に含み、前記第４のタイプのヌクレオチドが、非標識（暗色）である、請求項３８～５５のいずれか一項に記載のキット。
57. ＤＮＡポリメラーゼ及び１つ以上の緩衝組成物を更に含む、請求項３８～５６のいずれか一項に記載のキット。
58. 少なくとも１つの緩衝組成物が、前記第１の励起光源及び／又は前記第２の励起光源によって引き起こされるＤＮＡ光損傷を低減するための１つ以上の抗酸化剤を含む、請求項５７に記載のキット。
59. 複数の固定されたオリゴヌクレオチドを含む１つ以上の固体支持体を更に含み、前記固体支持体上の前記固定されたオリゴヌクレオチドの密度が、約１００ｋ／ｍｍ^２～約３００ｋ／ｍｍ^２である、請求項３８～５８のいずれか一項に記載のキット。