KR102053108B1 - 폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도 - Google Patents

폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은 신규한 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도에 관한 것이다. 이러한 화합물은 핵산 서열화 적용에서 뉴클레오티드에 대한 형광 표지로서 사용될 수 있다.

Description

폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도
본 개시 내용은 신규한 폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 이러한 화합물은 핵산 서열화 적용에서 뉴클레오티드를 위한 형광 표지로서 사용될 수 있다.
본 개시 내용이 관련된 최신 기술을 보다 충분히 기술하기 위해 여러 간행물 및 특허 문헌이 본 출원에 참조된다. 이러한 간행물 및 문헌 각각의 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
형광 표지를 이용하는 핵산의 비-방사성 검출은 분자 생물학에서 중요한 기술이다. 이전에 재조합 DNA 기술에서 사용된 다수의 절차들은, 예를 들어, 32P로 방사성 표지된 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 사용에 크게 의존하였다. 방사성 화합물은 관심을 받고 있는 핵산 및 다른 분자들의 민감한 검출을 가능하게 한다. 그러나, 방사성 동위원소의 사용에는 이들의 비용, 제한된 사용 수명 및 보다 중요하게는 안전 고려사항과 같이 심각한 제한이 있다. 방사성 표지에 대한 필요성을 없애는 것은, 예를 들어, 시약 폐기와 관련된 환경적 영향 및 비용을 감소시키면서 안전성을 향상시킨다. 비-방사성 형광 검출에 따를 수 있는 방법은, 비제한적인 예로서, 자동 DNA 서열화, 혼성화 방법, 폴리메라아제-연쇄-반응 생성물의 실시간 검출 및 면역검정을 포함한다.
다수의 적용들의 경우, 복수의 공간적으로 중첩되는 분석물의 독립적인 검출을 달성하기 위해서는 다중의 스펙트럼으로 구별가능한 형광 표지를 사용하는 것이 요망된다. 그러한 복합적인 방법에서, 반응 용기의 수는 감소될 수 있어서, 실험 프로토콜을 단순화시키고, 적용-특이적 시약 키트의 생산을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 다색 자동 DNA 서열화에서, 복합적인 형광 검출은 단일 전기영동 차선에서 다중 뉴클레오티드 염기의 분석을 가능하게 하고, 이에 의해서 단색 방법에 비해 처리량을 증가시키고, 차선간 전기영동 이동성 변화와 관련된 불확실성을 감소시킨다.
그러나, 복합적인 형광 검출은 문제가 될 수 있고, 형광 표지의 선택을 제한하는 다수의 중요한 인자들이 있다. 첫 번째로, 방출 스펙트럼이 주어진 적용에서 적절하게 스펙트럼 분해되는 염료 화합물을 찾는 것은 어려울 수 있다. 또한, 여러 형광 염료를 함께 사용하는 경우, 동시 여기에 의해 구별가능한 스펙트럼 영역에서 형광 신호를 발생시키는 것이 어려울 수 있는데, 그 이유는 이에 대하여 사용가능할 수 있는 염료의 흡수 밴드가 일반적으로 넓게 분리되고, 그에 따라서 두 개의 염료들에 대해서도 거의 동등한 형광 여기 효율을 달성하는 것이 어렵기 때문이다. 다수의 여기 방법에는 레이저와 같은 고출력 광원이 사용되고, 그에 따라서 염료는 그러한 여기에 저항하기에 충분한 광-안정성을 가져야 한다. 분자 생물학 방법에서 특히 중요한 마지막 고려 사항은, 예를 들어, DNA 합성 용매 및 시약, 완충액, 폴리메라아제 효소 및 리가아제 효소와 같이 사용되는 시약 화학물질과 형광 염료가 상용성이어야 하는 정도이다.
서열화 기술이 진보됨에 따라서, 상기 제약사항 모두를 만족시키고 특히 고체 상 서열화 등과 같은 고출력 분자 방법에 맞춰질 수 있는 추가의 형광 염료 화합물, 이의 핵산 컨쥬게이트, 및 염료 세트에 대한 필요성이 증가되었다.
개선된 형광 특성, 예컨대, 형광 세기, 형광 밴드의 모양 및 파장 최대치를 지니는 형광 염료 분자는 핵산 서열화의 속도 및 정확도를 향상시킬 수 있다. 강한 형광 신호는 수성 생물학적 완충액에서 그리고 더 높은 온도에서 측정되는 경우에 특히 중요한데, 그 이유는 대부분의 염료의 형광 세기가 그러한 조건에서 상당히 더 낮기 때문이다. 더욱이, 염료가 부착되는 염기의 성질은 또한 형광 최대치, 형광 세기 및 다른 스펙트럼 염료 특성에 영향을 준다. 핵염기와 형광 염료 간의 서열 특이적 상호작용은 형광 염료의 특이적 구성에 의해 조정될 수 있다. 형광 염료 구조에 대한 최적화는 뉴클레오티드 혼입의 효율을 개선시키고, 서열화 오류 수준을 저하시키고, 핵산 서열화에서의 시약의 사용량을 감소시키고, 그에 따라서 이의 비용을 감소시킬 수 있다.
개선된 폴리메틴 구성물, 및 생체분자 표지로서, 특히 핵산 서열화에 사용되는 뉴클레오티드를 위한 표지로서의 이의 용도가 본원에 기재된다. 표지된 뉴클레오티드 혼입의 효율 및 신규한 형광 구성물을 사용하여 얻어질 수 있는 서열화 판독의 길이 및 정확도에서 특정 개선이 보여질 수 있다. 이하에서 기재되는 분자들은 고출력 여기원이 사용되는 상황에서 특히 유리하다. 고출력 여기는 어느 정도의 출력 포화를 야기할 수 있는데, 여기서 표지에 의해 방출되는 광자의 수는 여기력의 증가에 따라 선형적이지 않게 된다. 출력 포화는 표지의 구조와 관련된 분자 켄칭 효과(molecular quenching effect)에 의해 야기될 수 있거나, 요망되는 형광 수명보다 긴 수명을 지니는 표지에 의해 야기될 수 있고, 이에 의해서 표지는 광자를 방출하기 전에 여기된 상태로 요망되는 기간보다 긴 기간을 소비하게 된다. 다중의 상이한 표지가 병행하여 사용되는 경우, 출력 포화에 이르는 표지들 중 하나를 지니는 것은 다른 표지들이 계속 더 밝아지는 때에 표지의 구별을 더 어렵게 만든다. 본원에 기재된 표지는 상응하는 종래 기술의 표지 화합물보다 높은 수준으로 출력 포화에 이르는데 있어서 특히 유리하다.
요약
첫 번째 양태에 따르면, 본 개시 내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 메조머 형태(mesomeric form)를 제공한다:
Figure 112018040691069-pct00001
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온(counterion)이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
P는 1일 수 있고; 이러한 경우에 화합물은 하기 화학식 (Ia) 또는 이의 메조머 형태이다:
Figure 112018040691069-pct00002
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
P는 2일 수 있고; 이러한 경우에 화합물은 하기 화학식 (Ib) 또는 이의 메조머 형태이다:
Figure 112018040691069-pct00003
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
Ra1 또는 Ra2가 H인 특정 예에서, Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기일 수 있다. 화합물은, Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나가 SO3 -이거나, Ra1 또는 Ra2가 인접한 탄소 원자에 융합되는 추가의 고리(추가의 고리는 SO3 -를 지님)이거나, Rc1 또는 Rc2가 알킬 설폰산 기가 되도록, 하나 이상의 설폰산 치환체를 필요로 한다.
p가 2인 특정 예에서, Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이다.
특정 예에서, r은 3이다.
특정 예에서, n은 1이다. OH 기는 고리 상에서 4-위치에 있을 수 있다. 특정 예에서, n은 O이고, 페닐 고리는 비치환된다. n이 O인 특정 예에서, Y는 S 또는 O이다(CH2가 아님).
또 다른 구체예에서, 본 개시 내용의 화합물은 다양한 기질 모이어티, 예컨대, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 카보하이드레이트, 리간드, 입자, 세포, 반고체 표면 (예를 들어, 겔) 및 고체 표면과 컨쥬게이션(conjugation)될 수 있다. 컨쥬게이션은 아미드 또는 에스테르로 변화될 수 있는 카복실 기 C(=O)-X를 통해 수행될 수 있다.
따라서, 본 개시 내용의 추가의 양태에 따르면, 예를 들어, 그러한 기질 모이어티에 공유 부착을 가능하게 하기 위해 링커 기를 포함하는 염료 화합물이 제공된다.
추가의 양태에 따르면, 본 개시 내용은 화학식: N-L-염료에 의해 정의되는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 화합물을 제공하고, 여기서 N은 뉴클레오티드이고, L은 임의의 링커 모이어티이고, 염료는 본 개시 내용에 따른 형광 화합물이다.
추가의 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 염료 화합물을 사용하는 서열화 방법을 제공한다.
추가의 양태에 따르면, 본 개시 내용은 또한 다양한 면역학적 검정, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 표지에서 그리고 합성에 의한 DNA 서열화를 위해 사용될 수 있는 염료 화합물 (자유 또는 컨쥬게이트 형태로)을 포함하는 키트를 제공한다. 추가의 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 자동 기기 플랫폼 상에서 합성에 의해 서열화 사이클에 특히 적절한 염료 "세트"를 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시 내용의 추가의 양태는 본 개시 내용의 화합물의 화학적 제조이다.
상세한 설명
본 개시 내용은 형광 검출 및 합성에 의한 서열화의 방법에 특히 적합한 신규한 화합물을 제공한다. 인돌 N-페닐 모이어티를 지니는 화합물은 N-알킬 유사체에 비해 형광 세기 및 광안정성에 있어서 유리하고, 그에 따라서 특정 핵산 서열화 적용을 개선시킨다.
첫 번째 양태에 따르면, 본 개시 내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 메조머 형태를 제공한다:
Figure 112018040691069-pct00004
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
본 개시 내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 메조머 형태를 제공한다:
Figure 112018040691069-pct00005
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, Ra1 또는 Ra2는 인접한 탄소 원자에 융합되는 추가의 고리(추가의 고리는 SO3 -를 지님)이거나, Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이다.
본 개시 내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 메조머 형태를 제공한다:
Figure 112018040691069-pct00006
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고, 여기서 n이 0인 경우, Y는 S 또는 O이다.
본 개시 내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 메조머 형태를 제공한다:
Figure 112018040691069-pct00007
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, Ra1 또는 Ra2는 인접한 탄소 원자에 융합되는 추가의 고리(추가의 고리는 SO3 -를 지님)이거나, Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이고, 여기서 n이 O인 경우, Y는 S 또는 O이다.
분자는 위치 Ra에서 하나 이상의 설폰아미드 또는 SO3 - 모이어티를 함유할 수 있다. Ra1 및/또는 Ra2는 SO3 - 또는 설폰아미드일 수 있다. 다른 Ra (Ra1 또는 Ra2)는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리일 수 있다. Ra1 또는 Ra2는 H일 수 있다. Ra1 또는 Ra2는 SO3 -일 수 있다. Ra1은 Ra2와 상이할 수 있고, 예를 들어, 구조는 Ra1에서 단일 설폰아미드 기 및 Ra2로서 H를 지닐 수 있다. Ra1과 Ra2 둘 모두는 설폰아미드일 수 있다. 설폰아미드는 SO2NH2 또는 SO2NHR일 수 있고, 여기서 R은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴 기이다. Ra1도 Ra2도 SO3 - 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리가 아닌 경우, Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기여야 한다.
Ra1 또는 Ra2는 인돌 고리의 인접한 탄소에 융합된 추가의 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 고리일 수 있다. 예를 들어, 그러한 경우에, 방향족 고리가 융합되는 경우, 염료 말단 기는 하기 유형의 구조식으로 표현될 수 있다:
Figure 112018040691069-pct00008
상기 식에서, Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아미드, 또는 설폰산일 수 있다.
따라서, 본 개시 내용의 염료는 하기 화학식 (1C) 또는 (ID) 또는 이의 메조머 형태로 기재될 수 있다:
Figure 112018040691069-pct00009
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아미드, 또는 설폰산이다.
따라서, 본 개시 내용의 염료는 하기 화학식 (1C) 또는 (ID) 또는 이의 메조머 형태로 기재될 수 있다:
Figure 112018040691069-pct00010
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아미드, 또는 설폰산이고, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, Rd는 SO3 -이거나, Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이다.
따라서, 본 개시 내용의 염료는 하기 화학식 (1C) 또는 (ID) 또는 이의 메조머 형태로 기재될 수 있다:
Figure 112018040691069-pct00011
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아미드, 또는 설폰산이고, 여기서 n이 0인 경우, Y는 S 또는 O이다.
따라서, 본 개시 내용의 염료는 하기 화학식 (1C) 또는 (ID) 또는 이의 메조머 형태로 기재될 수 있다:
Figure 112018040691069-pct00012
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아미드, 또는 설폰산이고, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, Rd는 SO3 -이거나, RC1 또는 RC2는 알킬 설폰산 기이고, 여기서 n이 O인 경우, Y는 S 또는 O이다.
화학식 (IC) 또는 (ID)에서, 인돌 고리의 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리는, 예를 들어, 설폰산 또는 설폰아미드로 치환되거나 비치환될 수 있다.
C(=O)-X 카복시 기 또는 이의 유도체는 길이 q의 알킬 사슬에 의해 인돌 질소 원자에 부착되고, 여기서 q는 1-5개의 탄소 또는 헤테로-원자이다. 사슬은 (CH2)q일 수 있고, 여기서 q는 1-5이다. 이러한 기는 (CH2)5COOH일 수 있다.
분자는 위치 Rc에서 하나 이상의 알킬-설포네이트 모이어티를 함유할 수 있다. Rc1 및/또는 Rc2는 알킬-SO3 -일 수 있다. 다른 Rc (Rc1 또는 Rc2)는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 (CH2)tSO3H일 수 있고, 여기서 t는 1-6이다. t는 1-4일 수 있다. t는 4일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 치환된 알킬 기일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 COOH 또는 -SO3H 모이어티 또는 이들의 에스테르 또는 아미드 유도체를 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, Ra1 또는 Ra2 중 하나가 SO3 -이고, Ra1 또는 Ra2 중 다른 하나가 H 또는 SO3 -인 경우, Rc1 또는 Rc2는 또한 알킬 설폰산 기일 수 있다.
C(=O)-X로 나타나 있는 COOH 기는 추가의 부착을 위한 링킹 모이어티로서 작용할 수 있거나, 추가의 분자에 링킹된다. 컨쥬게이션이 발생하면, COOH 또는 COO-는 아미드 또는 에스테르로 변환된다.
화합물의 예는 하기 화학식(II) 또는 (IIa) 또는 이의 메조머 형태에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00013
Figure 112018040691069-pct00014
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
화합물의 예는 하기 화학식(II) 또는 (IIa) 또는 이의 메조머 형태에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00015
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고, 여기서 n이 O인 경우, Y는 S 또는 O이다.
화합물의 추가의 예는 하기 화학식 (IIIa) 또는 (IIIb)에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00016
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
t는 1 내지 6의 정수이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
화합물의 추가의 예는 하기 화학식 (IIIa) 또는 (IIIb)에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00017
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
t는 1 내지 6의 정수이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고, 여기서 n이 O인 경우, Y는 S 또는 O이다.
화합물의 추가의 예는 하기 화학식 (IVa) 내지 (IVd)에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00018
Figure 112018040691069-pct00019
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
Ra1은 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
Rc1는 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아미드, 또는 설폰산이다.
화합물의 추가의 예는 하기 화학식 (Va) 내지 (Vd)에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00020
Figure 112018040691069-pct00021
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이다.
화합물의 추가의 예는 하기 화학식 (VIa) 내지 (VId)에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00022
Figure 112018040691069-pct00023
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
t는 1 내지 6의 정수이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이다.
alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 알킬, 알케닐 또는 알키닐 사슬이다. Alk는 기 (CH2)r일 수 있고, 여기서 r은 1-5이다. Alk는 (CH2)3일 수 있다. 대안적으로, 탄소 사슬은 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 함유할 수 있다. 사슬은, 임의로 추가의 CH2 기를 지니는 연결 -CH2-CH=CH-CH2-를 함유할 수 있다. 사슬은, 임의로 추가의 CH2 기를 지니는 연결 -CH2-C≡C-CH2-를 함유할 수 있다.
화학식 VII 내지 VIII에 주어진 임의의 예에서, r은 3일 수 있다.
화학식 I 내지 VIII에 주어진 임의의 예에서, q는 5일 수 있다.
화학식 III, 화학식 VI 또는 화학식 VII에 주어진 임의의 예에서, t는 4일 수 있다.
화학식 I 내지 VI에 주어진 임의의 예에서, n은 1 내지 3일 수 있다. 화학식 I 내지 VI에 주어진 임의의 예에서, n은 1일 수 있다. 화학식 I 내지 VI에 주어진 임의의 예에서, n은 0 내지 1의 정수일 수 있다. n이 1인 경우, OH 기는 고리 상의 임의의 위치에 있을 수 있다. OH 기는 4 위치에 있을 수 있다. n이 2 또는 3인 경우, OH 기는 페닐 고리 상의 임의의 위치에 있을 수 있다.
화학식 I 내지 VI에 주어진 임의의 예에서, n이 0(제로)인 경우, Y는 O 또는 S이고 CH2가 아닐 수 있다.
화학식 I 내지 VI에 주어진 임의의 예에서, Y는 0일 수 있다.
화학식 I 내지 VI에 주어진 임의의 예에서, Y는 0일 수 있다. Y가 0인 경우, n은 0 내지 3일 수 있다. Y가 CH2인 경우, n은 1 내지 3일 수 있다.
화합물의 추가의 예는 하기 화학식 (VIIa) 내지 (VIId)에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00024
Figure 112018040691069-pct00025
Figure 112018040691069-pct00026
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
r은 1 내지 5의 정수이고;
t는 1 내지 6의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이다.
화합물의 추가의 예는 하기 화학식 (VIIIa) 내지 (VIIId)에 따른 구조식을 포함한다:
Figure 112018040691069-pct00027
Figure 112018040691069-pct00028
Figure 112018040691069-pct00029
상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
r은 1 내지 5의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이다.
특히 유용한 화합물은 본원에 기재된 염료로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다.
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 알킬-카복시 기를 통해 인돌의 질소 원자에 부착되어 아미드를 형성시키는 표지를 지닐 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 링커 모이어티를 통해 피리딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착된 표지를 지닐 수 있다.
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보오스 또는 데옥시리보오스 당에 공유 부착된 차단 기를 지닐 수 있다. 차단 기는 리보오스 또는 데옥시리보오스 당 상의 임의의 위치에서 부착될 수 있다. 특정 구체예에서, 차단 기는 뉴클레오티드의 리보오스 또는 데옥시리보오스 당의 3' OH 위치에 있다.
둘 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 키트로서, 적어도 하나의 뉴클레오티드가 본 개시 내용의 화합물로 표지된 뉴클레오티드인 키트가 본원에 제공된다. 키트는 둘 이상의 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 둘 이상의 형광 표지로 표지될 수 있다. 표지들 중 둘 이상은 레이저일 수 있는 단일 여기원을 사용하여 여기될 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 표지에 대한 여기 밴드는 스펙트럼의 중첩된 영역에서의 여기가 둘 모두의 표지로 하여금 형광을 방출하게 하도록 적어도 부분적으로 중첩될 수 있다. 특정 구체예에서, 둘 이상의 표지로부터의 방출은, 표지들 중 적어도 하나의 존재가 방출을 광학적으로 구별함으로써 결정될 수 있도록 스펙트럼의 상이한 영역에서 발생할 것이다.
키트는 4개의 표지된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 여기서 4개의 뉴클레오티드의 첫 번째는 본원에 개시된 바와 같은 화합물로 표지된다. 그러한 키트에서, 두 번째, 세 번째, 및 네 번째 뉴클레오티드는 각각, 임의로 첫 번째 뉴클레오티드 상의 표지와 상이하고, 임의로 서로의 표지와 상이한 화합물로 표지될 수 있다. 따라서, 화합물들 중 하나 이상은 화합물(들)이 다른 화합물과 구별가능하도록 뚜렷한 흡광도 최대치 및/또는 방출 최대치를 지닐 수 있다. 예를 들어, 각각의 화합물은 화합물들 각각이 다른 3개의 화합물들과 구별가능하도록 뚜렷한 흡광도 최대치 및/또는 방출 최대치를 지닐 수 있다. 최대치가 아닌 흡광도 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼의 일부는 상이할 수 있고, 이러한 차이는 화합물들을 구별하는데 이용될 수 있음이 이해된다. 키트는 화합물들 중 둘 이상이 600 nm 초과의 뚜렷한 흡광도 최대치를 지니게 할 수 있다. 본 발명의 화합물은 전형적으로 640 nm 초과의 영역에서 광을 흡수한다.
본원에 기재된 화합물, 뉴클레오티드 또는 키트는 생물학적 시스템(예를 들어, 이의 과정 또는 성분 포함)을 검출하거나, 측정하거나, 확인하는데 사용될 수 있다. 화합물, 뉴클레오티드 또는 키트를 사용할 수 있는 예시적인 기술은 서열화, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전 분석, RNA 분석, 세포 검정 (예를 들어, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 검정 (예를 들어, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)을 포함한다. 사용은 자동 서열화 기기와 같은 특정 기술을 수행하기 위한 자동 기기에서 이루어질 수 있다. 서열화 기기는 상이한 파장에서 작동하는 두 개의 레이저를 함유할 수 있다.
본원에는 본 개시 내용의 화합물을 합성하는 방법이 개시된다. 하기 화학식 (X) 및/또는 (X1), (X2), (X3) 또는 (X4)의 화합물 또는 이들의 염은 대칭 또는 비대칭 폴리메틴 염료의 합성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다:
Figure 112018040691069-pct00030
또는 이들의 염.
상기 식에서, Ra1은 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고; Rc1은 알킬 또는 치환된 알킬이고; Ar은 방향족 기이고, R은 알킬 기이다. 4-하이드록시페닐의 특정 예가 나타나 있는 경우, 추가의 하이드록실 기는 또한 n이 1보다 큰 경우에 고리 상에서 치환될 수 있다. r은 3일 수 있다.
본원에는 본 개시 내용의 화합물을 합성하는 방법이 개시된다. 하기 화학식 (X5)의 화합물 또는 이의 염은 대칭 또는 비대칭 폴리메틴 염료의 합성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다:
Figure 112018040691069-pct00031
본원에 사용되는 용어 "알킬"은 C1-C20 탄화수소를 지칭하고, C3-C10 비-방향족 카보사이클릭 고리를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 알킬 기는, 1 내지 6개의 탄소 원자를 각각 함유하는 포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭하는 C1-C6 알킬이다. 특정 경우에, 알킬 기는 하나 이상의 불포화 기를 포함할 수 있고, 이에 따라서 알케닐 및 알키닐을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "할로겐"은 플루오로-(이하에서 F로 명명됨), 클로로-(이하에서 C1으로 명명됨), 브로모-(이하에서 Br로 명명됨) 또는 아이오도-(이하에서 I로 명명됨)를 지칭하고, 일반적으로 유기 화합물에서 수소 원자에 대한 치환과 관련되며, 이러한 치환은 임의로 수소에 대한 완전 치환이다.
용어 "치환된 알킬"은 상기 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기를 지칭하고, 여기서 이들은, 이로 제한되지는 않지만, 할로, 시아노, SO3 -, SRa, ORa, NRbRc, 옥소, CONRbRc, COOH 및 COORb로 추가로 치환되거나 비치환될 수 있다. Ra, Rb 및 Rc는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택될 수 있다. 추가로, 상기 치환된 알킬, 치환된 알케닐 및 치환된 알키닐은 임의로 적어도 하나의 헤테로 원자 또는 O, NRb, 및 S(O)t 등으로부터 선택된 기로 중단될 수 있고, 여기서 t는 0 내지 2이다. 치환된 알킬은 또한 벤질과 같은 기를 포함하고, 여기서 알킬 기는 추가의 아릴 또는 치환된 아릴 모이어티이거나 이를 포함한다.
본 개시 내용에 따른 염료는 N-프로필-4-하이드록시페닐에테르 치환된 인돌을 포함하여 여러 상이한 출발 물질로부터 합성될 수 있다. 염료는 동일한 인돌이 폴리메틴 사슬의 양 말단에 있도록 대칭으로, 또는 상이한 인돌이 발색단의 어느 한 말단에 있도록 비대칭으로 제조될 수 있다. 폴리메틴 염료를 제조하기 위한 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 개시 내용의 양태에 따르면, 기질 모이어티에 대한 부착에 적합한, 특히 기질 모이어티에 대한 부착을 가능하게 하는 링커 기를 포함하는 염료 화합물이 제공된다. 기질 모이어티는 사실상 본 개시 내용의 염료가 컨쥬게이션될 수 있는 어떠한 분자 또는 물질일 수 있고, 비-제한적 예로서, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 카보하이드레이트, 리간드, 입자, 고체 표면, 유기 및 무기 폴리머, 염색체, 핵, 생 세포 및 이들의 조합물 또는 집합체를 포함할 수 있다. 염료는 소수성 인력, 이온성 인력 및 공유 부착을 포함하는 다양한 수단에 의해 임의의 링커로 컨쥬게이션될 수 있다. 특히, 염료는 공유 부착에 의해 기질에 컨쥬게이션된다. 더욱 특히, 공유 부착은 링커 기에 의해서 이루어진다.
기질에 대한 염료 화합물의 컨쥬게이션은, 아미드 또는 에스테르로 변화될 수 있는 카복실 기 COX를 통해 수행될 수 있다.
본 개시 내용에 따른 염료는 또 다른 분자에 대한 염료의 공유 부착을 위해 치환체 위치들 중 하나에서 반응성 링커 기를 포함할 수 있다. 반응성 링커 기는 결합 (예를 들어, 공유 또는 비-공유 결합)을 형성시킬 수 있는 모이어티이다. 특정 구체예에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 용어 "절단가능한 링커"의 사용은 모든 링커가 제거될 필요가 있음을 암시하는 것으로 의미되지 않는다. 절단 위치는 절단 후에 염료 및/또는 기질 모이어티에 부착된 남아 있는 링커의 일부에서 생성되는 링커 상의 한 위치에 위치될 수 있다. 절단가능한 링커는, 비-제한적 예로서, 친전자적으로 절단가능한 링커, 효소적으로 절단가능한 링커, 친핵성으로 절단가능한 링커, 광절단가능한 링커, 환원 조건하에 (예를 들어, 디설파이드 또는 아자이드 함유 링커), 산화 조건하에 절단가능한, 안전성-포착 링커의 사용을 통해 절단 가능한, 및 제거 메카니즘에 의해 절단가능한 링커일 수 있다. 기질 모이어티에 염료 화합물을 부착시키기 위해 절단가능한 링커를 사용하는 것은, 예를 들어, 검출 후에 표지를 제거하는 선택을 제공하고, 이에 의해서 후속 단계에서 어떠한 간섭 신호를 방지한다.
유용한 링커 기는 PCT 공보 번호 WO2004/018493호에서 찾아볼 수 있고(본원에 참조로 포함됨), 이의 예는 수용성 포스핀 또는 전이 금속으로부터 형성된 수용성 전이 금속 촉매 및 적어도 부분적으로 수용성인 리간드를 사용하여 절단될 수 있는 링커를 포함한다. 수용액에서, 후자는 적어도 부분적으로 수용성인 전이 금속 착물을 형성시킨다. 그러한 절단가능한 링커는 본원에 기재된 염료와 같은 표지에 뉴클레오티드의 염기를 연결하는데 사용될 수 있다.
특정 링커는 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들과 같은 PCT 공보 번호 WO2004/018493호에서 찾아볼 수 있다(본원에 참조로 포함됨):
Figure 112018040691069-pct00032
Figure 112018040691069-pct00033
(상기 식에서, X는 O, S, NH 및 NQ를 포함하는 군으로부터 선택되고, Q는 C1-10 치환되거나 비치환된 알킬 기이고, Y는 O, S, NH 및 N(알릴)을 포함하는 군으로부터 선택되고, T는 수소 또는 C1-C10 치환되거나 비치환된 알킬 기이고, *는 모이어티가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 나머지에 연결되는 곳을 나타낸다).
특정 구체예에서, 형광 염료 (형광단)와 구아닌 염기 사이의 링커의 길이는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 스페이서 기를 도입함으로써 변경될 수 있고, 이에 의해서 당해 기술 분야에 공지된 다른 연결을 통해 구아닌 염기에 부착된 동일한 형광단에 비해 형광 세기를 증가시킬 수 있다. 예시적인 링커 및 이의 특성은 WO07020457호로 공개된 GB 특허 출원 제0517097.2호에 기재되어 있다(본원에 참조로 포함됨). 링커의 구성, 및 특히 이의 증가된 길이는 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드에 도입되는 경우에 구아노신 뉴클레오티드의 구아닌 염기에 부착된 형광단의 밝기의 향상을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 염료를 구아닌-함유 뉴클레오티드에 부착된 형광 염료 표지의 검출을 이용하는 어떠한 분석 방법에 사용하려는 경우, 예를 들어, WO07020457호에 기재된 바와 같은 화학식 -((CH2)2O)n-의 스페이서 기를 지니는 링커를 사용하는 것이 유리할 수 있고, 여기서 n은 2 내지 50의 정수이다.
본 개시 내용은 추가로 본원에 기재된 염료들 중 하나 이상으로 표지된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 컨쥬게이트를 제공한다(변형된 뉴클레오티드). 표지된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는, 비-제한적 예로서, PCR 증폭, 등온 증폭, 고체 상 증폭, 폴리뉴클레오티드 서열화 (예를 들어, 고체 상 서열화), 및 틈 번역 반응 (nick translation reaction) 등에서와 같이 효소 합성에 의해 형성되는 폴리뉴클레오티드를 표지하는데 유용하다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 당 또는 핵염기에 대한 부위에서 표지될 수 있다. 당해 분야에 알려진 바와 같은 "뉴클레오티드"는 질소성 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기로 이루어진다. RNA에서, 당은 리보오스이고, DNA에서는 데옥시리보오스이다. 즉, 리보오스에 존재하는 하이드록실 기가 부족한 당이다. 질소성 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이다. 퓨린은 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)일 수 있고, 피리미딘은 시토신 (C), 티민 (T), 또는 RNA의 맥락에서는 우라실 (U)일 수 있다. 데옥시리보오스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르이고, 에스테르화는 당의 C-3 또는 C-5에 부착된 하이드록실 기 상에서 일어난다. 뉴클레오티드는 일반적으로 모노, 디- 또는 트리포스페이트이다.
"뉴클레오시드"는 구조적으로 뉴클레오티드와 유사하지만, 포스페이트 모이어티가 빠져 있다. 뉴클레오시드 유사체의 예는 표지가 염기에 링킹되고 당 분자에 포스페이트 기가 부착되지 않은 것일 것이다.
염기는 일반적으로 퓨린 또는 피리미딘으로 지칭되지만, 당업자는 왓슨-크릭 염기 짝짓기 (Watson-Crick base pairing)를 거치는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 능력을 변경시키지 않는 유도체와 유사체가 이용가능하다는 것을 알 것이다. "유도체" 또는 "유사체"는 코어 구조가 모 화합물의 구조와 동일하거나 거의 유사하지만, 예를 들어, 상이하거나 추가의 측 기와 같은 화학적 또는 물리적 변형이 있어서 또 다른 분자에 유도체 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 링킹될 수 있게 하는 화합물 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 염기는 데아자퓨린일 수 있다. 특정 구체예에서, 유도체는 왓슨-크릭 염기 짝짓기를 거칠 수 있다. "유도체" 및 "유사체"는 또한, 예를 들어, 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 지니는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 포함한다. 그러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어, 문헌[Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) and Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에 논의되어 있다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포라닐리데이트, 및 포스포라미데이트 연결 등을 포함하는 변형된 포스포디에스테르 연결을 지닐 수 있다.
염료는, 예를 들어, 링커를 통해 뉴클레오티드 염기 상의 어떠한 위치에 부착될 수 있다. 특정 구체예에서, 왓슨-크릭 염기 짝짓기는 계속해서 생성된 유사체에 대하여 수행될 수 있다. 특정 핵염기 표지 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치를 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 링커 기는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 대해 염료를 공유적으로 부착시키는데 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 효소로 도입가능하고 효소로 연장가능할 수 있다. 이에 따라서, 링커 모이어티는 화합물이 핵산 복제 효소에 의해 뉴클레오티드의 전체 결합 및 인식을 유의하게 방해하지 않도록 화합물에 뉴클레오티드를 연결하기에 충분한 길이일 수 있다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 단위를 포함할 수 있다. 스페이서는, 예를 들어, 뉴클레오티드 염기가 절단 부위 또는 표지에 관여하지 않게 한다.
본 개시 내용의 염료로 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 하기 화학식을 지닐 수 있다:
Figure 112018040691069-pct00034
상기 식에서, 염료는 본 개시 내용에 따른 염료 화합물이고, B는 핵염기, 예컨대, 우라실, 티민, 시토신, 아데닌, 및 구아닌 등이고, L은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 임의의 링커 기이다. R'는 H, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 티오포스페이트, 포스페이트 에스테르 유사체, 반응성 인 함유 기에 부착된 -O- 또는 차단 기에 의해 보호된 -O-일 수 있다. R''는 H, OH, 포스포라미다이트 또는 3'OH 차단 기일 수 있고, R'''는 H 또는 OH이다.
R''가 포스포라미다이트인 경우, R'는 산-절단가능한 하이드록실 보호 기이고, 이는 자동 합성 조건하에 후속적인 모노머 커플링을 가능하게 한다.
특정 구체예에서, 차단 기는 염료 화합물과 별개이고 이와 상관이 없다. 즉, 이에 직접적으로 부착되지 않는다. 대안적인 구체예에서, 염료는 3'OH 차단 기 모두 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 따라서, R''는, 본원에 개시된 염료 화합물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 3' OH 차단 기일 수 있다.
여전히 추가의 또 다른 대안적인 구체예에서, 펜토오스 당의 3' 탄소 상에는 차단 기가 존재하지 않으며, 염기에 부착된 염료 (또는 염료 또는 링커 구성물)는, 예를 들어, 추가의 뉴클레오티드의 도입에 대한 차단으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조로 되어 있을 수 있다. 따라서, 차단은, 염료가 당의 3' 위치에 부착되는지의 여부에 상관없이, 입체 장애에서 기인할 수 있거나, 크기, 전하 및 구조의 조합에서 기인할 수 있다.
여전히 추가의 또 다른 대안적인 구체예에서, 펜토오스 당의 2' 또는 4' 탄소 상에는 차단 기가 존재하며, 추가의 뉴클레오티드의 도입에 대한 차단으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조일 수 있다. 차단 기의 사용은 변형된 뉴클레오티드가 도입되는 경우에 연장을 중지시키는 것과 같이 중합이 제어될 수 있게 한다. 예를 들어, 비-제한적 예로서, 화학적 조건을 변화시킴으로써 또는 화학적 차단의 제거에 의해서 차단 효과가 가역적인 경우, 연장은 특정 위치에서 중지되고, 이후에 계속될 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 3'OH 차단 기는 WO2004/018497호(본원에 참조로 포함됨)에 개시된 모이어티를 포함할 것이다. 예를 들어, 차단 기는 아자이도메틸 (CH2N3) 또는 알릴일 수 있다.
특정 구체예에서, 링커 (염료과 뉴클레오티드 사이의)와 차단 기는 둘 모두 존재하거나, 별개의 모이어티이다. 특정 구체예에서, 링커와 차간 기는 둘 모두 실질적으로 유사한 조건하에서 절단가능하다. 따라서, 탈보호 및 비차단 과정이 더 효율적일 수 있는데, 그 이유는 단일 처리만이 염료 화합물과 차단 둘 모두를 제거하는데 필요할 것이기 때문이다. 그러나, 일부 구체예에서, 링커와 차단 기는 유사한 조건하에서 절단가능하지 않아도 되고, 그 대신에 별개의 조건하에서 개별적으로 절단가능하다.
본 개시 내용은 또한 염료 화합물을 도입하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결에 접합된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드에 각각 포함된 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 개시 내용에 따른 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적 뉴클레오티드, 본 개시 내용의 변형된 뉴클레오티드 이외의 또는 비-자연 발생적 (또는 변형된) 뉴클레오티드, 또는 본원에 기재된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 염료 화합물로 표지된)와 조합된 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시 내용에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한 비-자연적인 골격 연결 및/또는 비-뉴클레오티드 화학적 변형을 포함할 수 있다. 본 개시 내용에 따른 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 키메라 구조가 또한 고려된다.
본 개시 내용에 따른 염료 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오시드)는, 이들 자체 또는 더 큰 분자 구조 또는 컨쥬게이트로의 도입 또는 이와의 회합에 상관없이, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 부착된 형광 표지의 검출을 포함하는 방법과 같은 어떠한 분석 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "폴리뉴클레오티드로의 도입"은, 5'포스페이트가 포스포디에스테르 연결에서부터, 자체로 더 긴 폴리뉴클레오티드 사슬의 일부를 형성시킬 수 있는 두 번째 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오티드의 3'하이드록실 기에 접합된다는 것을 의미할 수 있다. 본원에 기재된 변형된 뉴클레오티드의 3' 말단은 추가의 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오티드의 5' 포스페이트에 대한 포스포디에스테르 연결에 접합될 수 있거나 접합되지 않을 수 있다. 따라서, 한 가지 비-제한적 구체예에서, 본 개시 내용은 폴리뉴클레오티드로 도입된 변형된 뉴클레오티드를 검출하는 방법으로서, (a) 폴리뉴클레오티드로 본 개시 내용의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 도입시키고, (b) 상기 변형된 뉴클레오티드(들)에 부착된 염료 화합물로부터 형광 신호를 검출함으로써 폴리뉴클레오티드로 도입된 변형된 뉴클레오티드(들)을 검출함을 포함하는 방법을 제공한다.
이러한 방법은 본 개시 내용에 따른 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 도입하는 합성 단계 (a), 및 폴리뉴클레오티드로 도입된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드(들)를 이들의 형광을 검출하거나 정량적으로 측정함으로써 검출하는 검출 단계 (b)를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 한 가지 구체예에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 폴리메라아제 효소의 작용에 의해 합성 단계에서 폴리뉴클레오티드로 도입된다. 그러나, 예를 들어, 화학적 올리고뉴클레오티드 합성 또는 표지된 올리고뉴클레오티드의 비표지된 올리고뉴클레오티드로의 결찰과 같은, 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드로 접합시키는 다른 방법이 이용될 수 있다. 따라서, 용어 "~을 도입하다"는, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우, 화학적 방법 뿐만 아니라 효소 방법에 의한 폴리뉴클레오티드 합성을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 합성 단계가 수행되고, 임의로 본 개시 내용의 형광 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 템플레이트 폴리뉴클레오티드 가닥을 인큐베이션(incubation)함을 포함할 수 있다. 템플레이트 폴리뉴클레오티드 가닥에 어닐링(annealing)된 폴리뉴클레오티드 가닥 상의 자유 3'하이드록실 기와 변형된 뉴클레오티드 상의 5' 포스페이트 기 간의 포스포디에스테르 연결의 형성을 가능하게 하는 조건하에 폴리메라아제가 또한 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 템플레이트 가닥에 뉴클레오티드의 상보적 염기-짝짓기에 의해 유도되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드 가닥의 형성을 포함할 수 있다.
방법의 모든 구체예에서, 검출 단계는 변형된 뉴클레오티드가 도입되는 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트 가닥에 어닐링시키면서, 또는 두 개의 가닥이 분리되는 변성 단계 후에 수행될 수 있다. 추가의 단계, 예를 들어, 화학적 또는 효소적 반응 단계 또는 정제 단계가 합성 단계와 보호 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 변형된 뉴클레오티드(들)를 도입하는 타겟 가닥은 분리되거나 정제된 후에 추가 처리될 수 있거나, 후속적인 분석에서 사용될 수 있다. 예로서, 합성 단계에서 변형된 뉴클레오티드(들)로 표지된 타겟 폴리뉴클레오티드는 후속적으로 표지된 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 합성 단계의 생성물은 추가 반응 단계에 주어질 수 있고, 요망되는 경우, 이러한 후속 단계들의 생성물은 정제되거나 분리될 수 있다.
합성 단계에 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기술에 익숙한 당업자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 한 가지 구체예에서, 합성 단계는 적합한 폴리메라아제 효소의 존재에서 템플레이트 가닥에 상보적인 연장된 타겟 가닥을 형성시키기 위해 본원에 기재된 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 전구체를 사용하는 표준 프라이머 연장 반응과 유사할 수 있다. 다른 구체예에서, 합성 단계는 자체로, 타겟 및 템플레이트 폴리뉴클레오티드 가닥을 복사하는 것으로부터 얻어지는 어닐링된 상보적 가닥을 포함하는 표지된 이중 가닥 증폭 생성물을 생성시키는 증폭 반응의 일부를 형성시킬 수 있다. 다른 예시적인 합성 단계는 틈 번역, 가닥 치환 중합, 랜덤 프라이밍 DNA 표지 등을 포함한다. 합성 단계에 특히 유용한 폴리메라아제 효소는 본원에 기재된 변형된 뉴클레오티드들 중 하나 이상의 도입을 촉매작용할 수 있는 효소이다. 다양한 자연 발생적 또는 변형된 폴리메라아제가 사용될 수 있다. 예로서, 열안정성 폴리메라아제는 열순환 조건을 이용하여 수행되는 합성 반응을 위해 사용될 수 있는 반면, 열안정성 폴리메라아제는 등온성 프라이머 연장 반응에는 요망되지 않을 수 있다. 본 개시 내용에 따른 변형된 뉴클레오티드를 도입할 수 있는 적합한 열안정성 폴리메라아제는 각각 본원에 참조로 포함되는 WO 2005/024010호 또는 WO06120433호에 기재된 것들을 포함한다. 37℃와 같은 더 낮은 온도에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리메라아제 효소는 열안정성 폴리메라아제를 반드시 필요로 하지 않고, 그에 따라서, 폴리메라아제의 선택은 반응 온도, pH, 및 가닥-치환 활성 등과 같은 다수의 인자들에 좌우될 것이다.
특정의 비-제한적 구체예에서, 본 개시 내용은 핵산 서열화, 재서열화, 전 게놈 서열화, 단일 뉴클레오티드 다형성 스코어링 (single nucleotide polymorphism scoring)의 방법, 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 경우에 본원에 기재된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출을 포함하는 어떠한 다른 적용을 포함한다. 형광 염료를 포함하는 변형된 뉴클레오티드로 표지된 폴리뉴클레오티드의 사용으로부터 유리한 어떠한 다양한 다른 적용에는 본원에 기재된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 개시 내용은 합성 반응에 의한 폴리뉴클레오티드 서열화 (polynucleotide sequencing-by-synthesis reaction)에서 본 개시 내용에 따른 염료 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 합성에 의한 서열화는 일반적으로 서열화될 템플레이트 핵산에 상보적인 연장된 폴리뉴클레오티드 사슬을 형성시키기 위해서 폴리메라아제 또는 리가아제를 사용하여 5' 내지 3' 방향에서 성장하는 폴리뉴클레오티드 사슬에 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다. 첨가된 뉴클레오티드(들) 중 하나 이상에서 존재하는 염기의 확인은 검출 또는 "영상화" 단계에서 결정될 수 있다. 첨가된 염기의 동질성은 각각의 뉴클레오티드 도입 단계 후에 결정될 수 있다. 템플레이트의 서열은 이후 통상적인 왓슨-크릭 염기-짝짓기 법칙을 이용하여 추론될 수 있다. 단일 염기의 동질성의 결정을 위한 본원에 기재된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드의 용도는, 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형성의 스코어링에서 유용할 수 있고, 그러한 단일 염기 연장 반응은 본 개시 내용의 범위 내에 있다.
본 개시 내용의 구체예에서, 템플레이트 폴리뉴클레오티드의 서열은 도입된 뉴클레오티드(들)에 부착된 형광 표지(들)의 검출을 통해 서열화될 템플레이트 폴리뉴클레오티드에 상보적인 미완성 가닥으로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입을 검출함으로써 결정된다. 템플레이트 폴리뉴클레오티드의 서열화는 적합한 프라이머로 프라이밍될 수 있고(또는 헤어핀 (hairpin)의 일부로서 프라이머를 함유할 헤어핀 구성물로서 제조됨), 미완성 사슬은 폴리메라아제-촉매작용 반응에서 프라이머의 3' 말단에 뉴클레오티드를 첨가함으로써 단계식으로 연장된다.
특정 구체예에서, 각각의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트 (A, T, G 및 C)는 독특한 형광단으로 표지될 수 있고, 또한 비제어된 중합을 방지하기 위해 3' 위치에서 차단 기를 포함한다. 대안적으로, 4개의 뉴클레오티드 중 하나는 비표지될 수 있다(어두운 색). 폴리메라아제 효소는 뉴클레오티드를 템플레이트 폴리뉴클레오티드에 상보적인 미완성 사슬로 도입하고, 차단 기는 추가로 뉴클레오티드의 도입을 방지한다. 임의의 비도입된 뉴클레오티드는 세척될 수 있고, 각각의 도입된 뉴클레오티드로부터의 형광 신호는 적합한 수단, 예컨대, 레이저 여기를 사용하는 전하-커플링 장치 및 적합한 방출 필터에 의해 광학적으로 "판독"될 수 있다. 3'-차단 기 및 형광 염료 화합물은 이후에 추가의 뉴클레오티드 도입을 위하여 미완성 사슬을 노출시키기 위해 (동시에 또는 순차적으로) 제거 (탈보호)될 수 있다. 전형적으로, 도입된 뉴클레오티드의 동질성은 각각의 도입 단계 후에 결정되지만, 이는 엄밀히 필수적인 것은 아니다. 마찬가지로, 미국 특허 제5,302,509호(본원에 참조로 포함됨)에는 고체 지지체 상에 고정된 폴리뉴클레오티드를 서열화하는 방법이 개시되어 있다.
상기 예시된 바와 같은 방법에는 DNA 폴리메라아제의 존재에서 고정된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 성장하는 가닥으로 형광 표지된 3'-차단된 뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 도입하는 것이 이용된다. 폴리메라아제는 타겟 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기를 도입하지만, 3'-차단 기에 의한 추가 첨가가 방지된다. 그 후에, 도입된 뉴클레오티드의 표지가 결정될 수 있고, 차단 기는 추가의 중합이 일어날 수 있도록 화학적 절단에 의해 제거된다. 합성 반응에 의한 서열화에서 서열화될 핵산 템플레이트는 서열화에 요망되는 어떠한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 서열화 반응을 위한 핵산 템플레이트는 전형적으로, 서열화 반응에서 추가의 뉴클레오티드의 첨가를 위한 프라이머 또는 개시점으로서 작용하는 자유 3' 하이드록실 기를 지니는 이중 가닥 영역을 포함할 것이다. 서열화될 템플레이트의 영역은 상보적 가닥 상에서 자유 3' 하이드록실 기를 돌출시킬 것이다. 서열화될 템플레이트의 돌출 영역은 단일 가닥화될 수 있지만, 서열화 반응의 개시를 위한 자유 3'OH 기를 제공하기 위해 서열화될 템플레이트 가닥에 상보적인 가닥 상에서 "틈이 존재하는" 경우, 이중-가닥화될 수 있다. 그러한 구체예에서, 서열화는 가닥 치환에 의해 진행될 수 있다. 특정 구체예에서, 자유 3' 하이드록실 기를 지니는 프라이머는, 서열화될 템플레이트의 단일-가닥화된 영역으로 혼성화되는 별개의 성분 (예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오티드)으로서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및 서열화될 템플레이트 가닥은 각각 분자내 이중복합체 (intra-molecular duplex), 예컨대, 헤어핀 루프 구조를 형성할 수 있는 부분적으로 자가-상보적 핵산 가닥의 일부를 형성시킬 수 있다. 헤어핀 폴리뉴클레오티드 및 이들을 고체 지지체에 부착시킬 수 있는 방법은 각각 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 공보 WO0157248호 및 WO2005/047301호에 개시되어 있다. 뉴클레오티드는 성장하는 프라이머에 연속적으로 첨가되어 5' 내지 3' 방향에서 폴리뉴클레오티드 사슬의 합성을 야기할 수 있다. 반드시는 아니지만 특히 각각의 뉴클레오티드 첨가 후에 첨가된 염기의 성질은 확인될 수 있고, 그에 따라서 핵산 템플레이트에 대한 서열 정보가 제공된다. 따라서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기와 포스포디에스테르 연결의 형성을 통해 핵산 가닥의 자유 3' 하이드록실 기에 뉴클레오티드를 접합시킴으로써 핵산 가닥 (또는 폴리뉴클레오티드)로 도입된다.
서열화될 핵산 템플레이트는 DNA 또는 RNA, 또는 심지어 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 혼성 분자일 수 있다. 핵산 템플레이트는, 이들이 서열화 반응에서 템플레이트의 복사를 방지하지 않는 한, 자연 발생적 및/또는 비-자연 발생적 뉴클레오티드 및 천연 또는 비-천연 골격 연결을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 서열화될 핵산 템플레이트는 당해 기술 분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 연결 방법을 통해, 예를 들어, 공유 부착을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 특정 구체예에서, 템플레이트 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체 (예를 들어, 실리카-기반 지지체)에 직접 부착될 수 있다. 그러나, 본 개시 내용의 다른 구체예에서, 고체 지지체의 표면은 템플레이트 뉴클레오티드의 직접적인 공유 부착을 가능하게 하기 위해, 또는 자체로 고체 지지체에 비-공유 부착될수 있는 하이드로겔 또는 다가전해질 다층을 통해 템플레이트 폴리뉴클레오티드를 고정시키기 위해 일부 방식으로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 실리카-기반 지지체에 직접 부착된 어레이(array)는, 예를 들어, WO00006770호 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 상의 내부 아미노 기와 유리 상의 펜던트 에폭사이드 기 간의 반응에 의해 유리 지지체 상에서 고정된다. 또한, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, W02005/047301호 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 고체 지지체와 황-기반 친핵체의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체-지지된 템플레이트 폴리뉴클레오티드의 또 다른 추가의 예는, 예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 W000/31148호, W001/01143호, W002/12566호, W003/014392호, 미국 특허 제6,465,178호 및 W000/53812호에 기재된 바와 같이, 실리카 기반 또는 다른 고체 지지체 상에 지지된 하이드로겔에 부착된다.
템플레이트 폴리뉴클레오티드가 고정될 수 있는 특정 표면은 폴리아크릴아미드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 상기 인용된 참조문헌 및 본원에 참조로 포함되는 WO2005/065814호에 기재되어 있다.
DNA 템플레이트 분자는, 예를 들어, 미국 특허 제6,172,218호 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 비드 (bead) 또는 미세입자 (microparticle)에 부착될 수 있다. 비드 또는 미세입자에 대한 부착은 서열화 적용에 유용할 수 있다. 각각의 비드가 상이한 DNA 서열을 함유하는 비드 라이브러리가 제조될 수 있다. 예시적인 라이브러리 및 이들의 형성을 위한 방법은 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌[Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005)]에 기재되어 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드를 사용하는 그러한 비드의 어레이에 대한 서열화는 본 개시 내용의 범위 내에 있다.
서열화될 템플레이트(들)는 고체 지지체 상에서 "어레이"의 일부를 형성시킬 수 있고, 이러한 경우에 어레이는 어떠한 편리한 형태를 지닐 수 있다. 따라서, 본 개시 내용의 방법은 단분자 어레이, 클러스터형 어레이(clustered array) 및 비드 어레이를 포함한 모든 유형의 고밀도 어레이에 적용가능하다. 본 개시 내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 고체 지지체 상에 핵산 분자를 고정시킴으로써 형성되는 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본질적으로 어떠한 유형의 어레이 상에서 템플레이트를 서열화하는데 사용될 수 있다.
그러나, 본 개시 내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 클러스터형 어레이의 서열화의 맥락에서 특히 유리하다. 클러스터형 어레이에서, 어레이 상에 별개의 영역 (흔히 부위, 또는 특징으로 지칭됨)은 다중 폴리뉴클레오티드 템플레이트 분자들을 포함한다. 일반적으로, 다중 폴리뉴클레오티드 분자들은 광학적 수단에 의해 개별적으로 분해가능하지 않고, 그 대신에 집합체로 검출된다. 어레이가 형성되는 방법에 좌우하여, 어레이 상의 각각의 부위는 하나의 개별적인 폴리뉴클레오티드 분자의 다중 복사 (예를 들어, 부위는 특정 단일- 또는 이중-가닥화된 핵산 종에 대하여 동일하다) 또는 심지어 소수의 상이한 폴리뉴클레오티드 분자들의 다중 복사 (예를 들어, 두 개의 상이한 핵산 종들의 다중 복사)를 포함할 수 있다. 핵산 분자의 클러스터형 어레이는 일반적으로 당해 기술 분야에 알려져 있는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 예로서, 각각 본원에 참조로 포함되는 WO 98/44151호 및 WO00/18957호에는 핵산의 증폭 방법으로서, 템플레이트와 증폭 생성물 둘 모두가 고정된 핵산 분자들의 클러스터 또는 "콜로니(colony)"를 포함하는 어레이를 형성시키기 위해 고체 지지체 상에 고정된 채로 유지되는 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법에 따라 제조된 클러스터형 어레이 상에 존재하는 핵산 분자들은 본 개시 내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 사용하는 서열화에 적합한 템플레이트이다.
본 개시 내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 또한 단분자 어레이 상에 템플레이트를 서열화하는데 있어서 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "단분자 어레이" 또는 "SMA"는 고체 지지체 위에 분배된 (또는 배열된) 폴리뉴클레오티드 분자들의 집단을 지칭하고, 여기서 모든 다른 집단으로부터의 어떠한 개별적인 폴리뉴클레오티드의 스페이싱은 개별적인 폴리뉴클레오티드 분자들을 개별적으로 분해하는 것이 가능하도록 이루어진다. 고체 지지체의 표면 상에 고정된 타겟 핵산 분자는 이에 따라 일부 구체예에서 광학적 수단에 의해 분해가 가능할 수 있다. 이는 각각 하나의 폴리뉴클레오티드를 나타내는 하나 이상의 별개의 신호들이 사용되는 특정 영상화 장치의 분해가능한 영역 내에서 발생될 것이라는 것을 의미한다.
어레이 상에서 인접한 폴리뉴클레오티드 분자들 사이의 스페이싱이 적어도 100 nm, 더욱 특히 적어도 250 nm, 더욱 더 특히 적어도 300 nm, 더욱 더 특히 적어도 350 nm인 단분자 검출이 달성될 수 있다. 따라서, 각각의 분자는 단분자 형광점으로서 개별적으로 분해가능하고 검출가능하고, 상기 단분자 형광점으로부터의 형광이 또한 단일 단계 광퇴색(photobleaching)을 나타낸다.
용어 "개별적으로 분해되는" 및 "개별적인 분해"는, 가시화되는 경우, 어레이 상의 하나의 분자를 이의 이웃하는 분자와 구별하는 것이 가능하다는 것을 명시하기 위해 본원에서 사용된다. 어레이 상의 개별 분자들의 분리는 개별 분자들을 분해하기 위해 사용되는 특정 기술에 의해 어느 정도 확인될 것이다. 단분자 어레이의 일반적인 특징은 각각 본원에 참조로 포함되는 공개된 출원 WO00/06770호 및 WO 01/57248호를 참조로 이해될 것이다. 본 개시 내용의 변형된 뉴클레오티드의 한 용도는 합성 반응에 의해 서열화이지만, 변형된 뉴클레오티드의 사용은 그러한 방법으로 제한되지 않는다. 실제로, 뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드로 도입되는 뉴클레오티드에 부착된 형광 표지의 검출을 필요로 하는 어떠한 서열화 방법에서 유리하게 사용될 수 있다.
특히, 본 개시 내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 자동 형광 서열화 프로토콜, 특히 Sanger와 동료들의 사슬 종결 서열화 방법을 기초로 한 형광 염료-종결자 주기 서열화에 사용될 수 있다. 그러한 방법에는 일반적으로 프라이머 연장 서열화 반응에서 형광 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 도입하기 위해 효소 및 주기 서열화가 이용된다. 소위 Sanger 서열화 방법, 및 관련 프로토콜 (Sanger형)에는 디데옥시뉴클레오티드가 표지된 무작위화 연쇄 종결이 이용된다.
따라서, 본 개시 내용은 또한 3'과 2' 위치 둘 모두에서 하이드록실 기가 결핍된 디데옥시뉴클레오티드인 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 그러한 변형된 디데옥시뉴클레오티드는 Sanger형 서열화 방법 등에서 사용하기에 적합하다.
3' 차단 기를 도입하는 본 개시 내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 또한 Sanger 방법 및 관련 프로토콜에서 사용될 수 있는 것으로 인식될 텐데, 그 이유는 변형된 디데옥시 뉴클레오티드를 사용함으로써 달성되는 동일한 효과가 다음과 같이 3'-OH 차단 기를 지니는 변형된 뉴클레오티드를 사용함으로써 달성될 수 있기 때문이고, 이 둘 모두 후속적인 뉴클레오티드의 도입을 방지한다. 본 개시 내용에 따르고 3' 차단 기를 지니는 뉴클레오티드가 Sanger형 서열화 방법에서 사용되는 경우, 뉴클레오티드에 부착된 염료 화합물 또는 검출가능한 표지는 절단가능한 링커를 통해 연결될 필요가 없는 것으로 인지될 것인데, 그 이유는 본 개시 내용의 표지된 뉴클레오티드가 도입되는 각각의 예에서 뉴클레오티드는 후속적으로 도입될 필요가 없고, 그에 따라서 표지가 뉴클레오티드로부터 제거될 필요가 없기 때문이다.
본 개시 내용은 또한 염료로 표지된 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 그러한 키트는 일반적으로 적어도 하나의 추가의 성분과 함께 본원에 기재된 염료로 표지된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 것이다. 추가의 성분(들)은 상기 기재된 방법에서 또는 하기 실시예 섹션에서 확인되는 성분들 중 하나 이상일 수 있다. 본 개시 내용의 키트에 조합될 수 있는 성분들의 일부 비-제한적 예는 이하에서 기재된다.
특정 구체예에서, 키트는 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 함께 본원에 기재된 염료로 표지된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 비표지된 또는 원래의 뉴클레오티드와, 및/또는 형광 표지된 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합과 함께 공급될 수 있다. 이에 따라서, 키트는 본 개시 내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 및 다른, 예를 들어, 종래 기술의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드들의 조합은 별개의 개별적인 성분들로서 (예를 들어, 용기 또는 튜브 당 하나의 뉴클레오티드 유형) 또는 뉴클레오티드 혼합물로서 (예를 들어, 동일한 용기 또는 튜브에서 혼합되는 둘 이상의 뉴클레오티드) 제공될 수 있다.
키트가 염료 화합물로 표지된 복수의 특히 두 개의, 더욱 특히 4개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상이한 뉴클레오티드가 상이한 염료 화합물로 표지될 수 있거나, 하나는 염료 화합물이 없는 어두운 색일 수 있다. 상이한 뉴클레오티드가 상이한 염료 화합물로 표지되는 경우, 상기 염료 화합물이 스펙트럼으로 구별가능한 형광 염료인 것이 키트의 특징이다. 본원에서 사용되는 용어 "스펙트럼으로 구별가능한 형광 염료"는 하나의 샘플에 둘 이상의 그러한 염료들이 존재하는 경우에 형광 검출 장비 (예를 들어, 상업적인 모세혈관 기반 DNA 서열화 플랫폼)에 의해 구별될 수 있는 파장에서 형광 에너지를 방출하는 형광 염료를 지칭한다. 형광 염료 화합물로 표지된 2개의 변형된 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급되는 경우, 스펙트럼으로 구별가능한 형광 염료가, 예를 들어, 동일한 레이저에 의해서와 같이 동일한 파장에서 여기될 수 있는 것이 일부 구체예의 특징이다. 형광 염료 화합물로 표지된 4개의 변형된 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급되는 경우, 2개의 스펙트럼으로 구별가능한 형광 염료가 둘 모두 하나의 파장에서 여기될 수 있고 다른 두 개의 스펙트럼으로 구별가능한 염료가 둘 모두 또 다른 파장에서 여기될 수 있는 것이 일부 구체예의 특징이다. 특정 여기 파장은 532 nm, 630 nm 내지 700 nm, 특히 660 nm이다.
한 가지 구체예에서, 키트는 본 개시 내용의 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드 및 두 번째 염료로 표지된 두 번째 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 염료들은 적어도 10 nm, 특히 20 nm 내지 50 nm의 흡광도 최대치의 차이를 지닌다. 더욱 특히, 두 개의 염료 화합물들은 15-40 nm의 스토크스 이동 (Stokes shift)을 지니고, 여기서 "스토크스 이동"은 최대 흡광도와 최대 방출 파장 사이의 거리이다.
추가의 구체예에서, 키트는 추가로 형광 염료로 표지된 두 개의 다른 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 염료는 488 nm 내지 550 nm, 특히 532 nm에서 동일한 레이저에 의해 여기된다. 염료는 적어도 10 nm, 특히 20 nm 내지 50 nm의 흡광도 최대치의 차이를 지닐 수 있다. 더욱 특히, 두 개의 염료 화합물들은 20-40 nm의 스토크스 이동을 지닐 수 있다. 더욱 더 특히, 두 개의 염료 화합물은 640 nm 미만, 특히 600 nm 미만의 상이한 흡광도 최대치를 지닐 수 있다. 본 개시 내용의 폴리메틴 염료와 스펙트럼으로 구별가능하고 상기 기준을 충족시키는 특정 염료는 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,268,486호 (예를 들어, Cy3) 또는 WO 0226891호 (Alexa 532; Molecular Probes A20106)에 기재된 바와 같은 폴리메틴 유사체 또는 미국 특허 제6,924,372호에 개시된 바와 같은 비대칭 폴리메틴이다. 대안적인 염료는 로다민 유사체, 예를 들어, 테트라메틸 로다민 및 이의 유사체를 포함한다.
대안적인 구체예에서, 본 개시 내용의 키트는 동일한 염기가 두 개의 상이한 화합물로 표지되는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 첫 번째 뉴클레오티드는 본 개시 내용의 화합물로 표지될 수 있다. 두 번째 뉴클레오티드는 스펙트럼에서 별개인 화합물로, 예를 들어, 600 nm 미만에서 흡수하는 '녹색(green)' 염료로 표지될 수 있다. 세 번째 뉴클레오티드는 본 개시 내용의 화합물과 스펙트럼에서 별개인 화합물의 혼합물로 표지될 수 있고, 네 번째뉴클레오티드는 '어두운 색(dark)'이고, 표지를 함유하지 않을 수 있다. 이에 따라서, 간단히 말해서, 뉴클레오티드 1-4는 '녹색', '적색(red)', '적색/녹색', 및 어두운 색으로 표지될 수 있다. 계측을 더 단순화시키기 위해서, 4개의 뉴클레오티드가 단일 레이저로 여기된 두 개의 염료로 표지될 수 있고, 그에 따라서, 뉴클레오티드 1-4의 표지는 '적색 1', '적색 2', '적색 1/적색 2', 및 어두운 색 또는 '녹색 1', '녹색 2', '녹색 1/녹색 2', 및 어두운 색일 수 있다.
뉴클레오티드는 본 개시 내용의 염료를 두 개 함유할 수 있다. Ra1 또는 Ra2가 인돌 고리의 인접한 탄소에 융합된 추가의 방향족 고리인 염료는 염료가 추가의 방향족 컨쥬게이션을 지니지 않는 염료보다 긴 파장에서 흡수한다. 키트는 본 개시 내용의 염료로 표지된 둘 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 각각의 Ra1 및 Ra2가 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드 또는 할로겐인 본 개시 내용의 화합물로 표지된 하나의 뉴클레오티드, 및 Ra1과 Ra2 중 하나 또는 이 둘 모두가 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리인 본 개시 내용의 화합물로 표지된 하나의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 뉴클레오티드가 520 nm 내지 560 nm의 영역에서 흡수하는 염료로 표지되는 추가의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 추가로 비표지된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
뉴클레오티드는 본 개시 내용의 염료를 두 개 함유할 수 있다. p가 1인 염료는 p가 2인 염료보다 짧은 파장에서 흡수한다. 키트는 본 개시 내용의 염료로 표지된 둘 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 p가 1인 본 개시 내용의 화합물로 표지된 하나의 뉴클레오티드, 및 p가 2인 본 개시 내용의 화합물로 표지된 하나의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 뉴클레오티드가 세 번째 표지로 표지된 추가의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 추가로 비표지된 뉴클레오티드 또는 네 번째 표지로 표지된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
키트가 상이한 염료 화합물로 표지된 상이한 뉴클레오티드를 지니는 형태와 관련하여 상기에서 예시되었지만, 키트는 동일한 염료 화합물을 지니는 2, 3, 4개 이상의 상이한 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
특정 구체예에서, 키트는 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드로 도입하는 것을 촉매작용할 수 있는 폴리메라아제 효소를 포함할 수 있다. 그러한 키트에 포함될 다른 성분들은 완충제 등을 포함할 수 있다. 본 개시 내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드, 및 상이한 뉴클레오티드들의 혼합물을 포함하는 다른 어떠한 뉴클레오티드 성분들이 사용 전에 희석될 농축 형태로 키트에 제공될 수 있다. 그러한 구체예에서, 적합한 희석 완충제가 또한 포함될 수 있다. 다시, 본원에 기재된 방법에서 확인되는 성분들 중 하나 이상은 본 개시 내용의 키트에 포함될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형은 하나의 대상으로 분명하고 명확히 분명하게 제한되지 않는 한 복수의 대상들을 포함한다는 것이 주지된다. 다양한 변형 및 변화가 본 교시의 사상 또는 범위로부터 벗어남 없이 본원에 기재된 다양한 구체예에 대하여 이루어질 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 다양한 구체예는 첨부된 청구항의 범위 내에서 다른 변형 및 변화 및 이의 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
실험 세부정보
4-(3- 브로모프로폭시 )페놀의 제조
Figure 112018040691069-pct00035
메탄올 (30 mL) 중의 하이드로퀴논 (3 g, 27.2 mmol)의 용액에 N2 하에서 포타슘 하이드록사이드 (2g, 35.4 mmol) 및 1,3-디브로모프로판 (8.3 mL, 81.7 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 65℃에서 밤새 교반하였다. 그 후에, 휘발물을 진공하에 제거하고, 디에틸 에테르 (30 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 암모늄 클로라이드 포화 수용액 및 물 (각각 30 mL)로 세척하였다. 유기 층을 마그네슘 설페이트로 건조시키고, 여과하고, 휘발물을 진공하에 제거하였다. 생성된 베이지색 슬러리를 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용리액: 페트롤륨 에테르 / 에틸 아세테이트 70/30)에 의해 정제하여 2.6g의 백색 슬러리를 제공하였다. 수율: 41%. 양성자 NMR (CDCl3): 6.87-6.73 (4H, m, H-Ar); 5.36 (1H, s, OH); 4.04 (2H, t, J = 6.2 Hz); 3.60 (2H, J = 6.2 Hz); 2.28 (2H, q, J = 6.2 Hz, H-2). 13C NMR (CDCl3): 152.8, 149.6, 116.1; 116.0; 66.7; 34.4; 30.2.
4-(2,3-디메틸-3H-인돌-3-일)부탄-1- 설폰산의 제조
Figure 112018040691069-pct00036
빙초산 (19 ml) 중의 페닐하이드라진 (8.6 mmol, 850 μL) 및 5-메틸-6-옥소헵탄설폰산 (7.2 mmol, 1.5 g)을 130℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 진공하에 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용리액: 디클로로메탄/메탄올 80/20) 1.23g의 연한 황색 포움을 제공하였다. 수율: 61 %. MS (DUIS): E-: 280 (M-1); 양성자 NMR (D2O): 7.42 (1H, d, J = 7.8Hz, H-4); 7.27 (1H, t, J = 7.8Hz, H-5); 7.24 (1H, d, J = 7.8Hz, H-7); 7.17 (1H, t, J = 7.8Hz, H-6); 2.59 (2H, dd, J = 7.6, 8.9Hz, H-11); 2.21-2.13 (1H, m); 1.88-1.73 (2H,m, H-8); 1.52-1.43 (2H, m, H-10); 1.13 (3H, s, C-3 상의 CH3); 0.70-0.63 (1H, m, H-9a); 0.51-0.44 (1H, m, H-9b). 13C NMR (D2O): 190.8; 152.3; 143.7; 127.8; 125.7; 122.2; 118.6; 57.9; 50.5; 48.9; 35.6; 24.0; 22.5; 21.8; 14.8.
1-(3-(4- 하이드록시페녹시 )프로필)-2,3-디메틸-3-(4- 설포부틸 )-3H-인돌-1-윰의 제조
Figure 112018040691069-pct00037
설폴란 (2 ml) 중의 4-(3-브로모프로폭시)페놀 (1.90 mmol, 438 mg) 및 4-(2,3-디메틸-3H-인돌-3-일)부탄-1-설폰산 (1.58 mmol, 504 mg)을 120℃에서 4.5 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 직접적으로 정제하여 (용리액: 디클로로메탄/메탄올 65/35) 329 mg의 연한 회색 오일을 제공하였다. 수율: 40 %. MS (DUIS): E-: 430 (M-1), E+: 432 (M+1); 양성자 NMR (TFA): 7.75-7.65 (4H, m, H-4/5/6/7); 6.98 (2H, d, J = 8.9 Hz, 페닐 상의 Har); 6.85 (2H, d, J = 8.9 Hz, 페닐 상의 Har); 4.82 (2H, bt, J = 6.6 Hz, H-12); 4.24-4.13 (2H, m, H-14); 3.69 (1H, s); 3.20-3.06 (2H, m, H-11); 2.91 (3H, s, C-2 상의 CH3); 2.63-2.52 (2H, m, H-13); 2.41-2.75 (2H,m, H-8); 1.90-1.83 (2H, m, H-10); 1.66 (3H, s, C-3 상의 CH3); 1.13-0.93 (2H, m, H-9).
1-(3-(4- 하이드록시페녹시 )프로필)-2,3,3- 트리메틸 -3H-인돌-1- 윰의 제조
Figure 112018040691069-pct00038
설폴란 (1 ml) 중의 4-(3-브로모프로폭시)페놀 (1.40 mmol, 324 mg) 및 트리메틸인돌닌 (0.80 mmol, 129 μl)을 120℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 직접적으로 정제하여 (용리액: 디클로로메탄/메탄올 90/10) 260 mg의 연한 회색 오일을 제공하였다. 수율: 84 %. 양성자 NMR (MeOD): 7.06 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-4); 7.00 (1H, bt, J = 7.8Hz, H-5); 6.77-6.64 (5 H, m, H-6 & 페닐 오르토 & 메타 상의 H); 6.58 (1H, d, J = 7.8Hz, H-7); 3.90 (2H, t, J = 5.8Hz, H-8), 3.71 (2H, J = 6.5Hz, H-10); 2.04 (2H, bq, J = 6.1Hz, H-9); 1.30 (6H, s, C-3 상의 2xCH3). 13C NMR (MeOD): 162.7; 153.6; 152.3; 147.2; 138.6; 128.6; 122.7; 119.5; 116.8; 116.6; 116.5; 103.3; 66.8; 45.1; 39.7; 30.6; 27.5.
AF670POPO의 제조
생성물 합성식:
Figure 112018040691069-pct00039
염료 합성 과정:
4-(2,3-디메틸-3H-인돌-3-일)부탄-1-설폰산 (204 mg, 400 μmol) 및 말론알데하이드 비스(페닐이민) 모노하이드로클로라이드 (114 mg, 440 μmol)를 아세트산 무수물/아세트산 (2/0.6 ml)의 혼합물 중에서 100℃에서 1.5 h 동안 교반하였다. 포타슘 아세테이트 (118 mg, 1.20 mmol) 및 설폰화 벤즈인돌륨 염 X (193 mg, 400 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 3 h 동안 교반하였다. 그 후에, 이를 실온으로 냉각시키고, 디에틸 에테르 (40 mL)를 첨가하였다. 진한 청색 고형물을 쏟아져 나왔다. 이를 여과하고, 추가의 디에틸 에테르 (40 mL)로 세척하고, ~30 %의 아세톤니트릴을 함유하는 물 (25 mL)에 용해시켰다. 생성된 진한 청색 용액을 여과하고, 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 주된 청색 (흡수 최대치 ~ 665 nm) 분획을 수거하고, 용매를 진공에서 제거하였다. MS (DUIS): E-: 869 (M-1), 434.1 (M-2/2).
염료 DX-DX를 적절한 출발 물질을 사용하여 유사하게 제조하였다.
표 1에는 공지된 구조적 유사체 염료 Std (특허: P6240WO)에 대한 유사한 파라미터와 비교한 이러한 방식으로 제조된 일부 염료 (물 중의 용액, OD ~0.2)의 스펙트럼 특성이 나타나 있다.
Figure 112018040691069-pct00040
Figure 112018040691069-pct00041
AF550POPOS0의 제조
생성물 합성식:
Figure 112018040691069-pct00042
염료 합성 과정:
1-(3-(4-하이드록시페녹시)프로필)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌-1-윰 (150 mg, 385 μmol) 및 N,N'-디페닐포름아미딘 (74 mg, 385 μmol)을 80℃에서 2 h 동안 아세트산 무수물 (2 mL)에서 교반하였다. 아세트산 (0.5 mL), 포타슘 아세테이트 (567 mg, 5.78 mmol) 및 설폰화 인돌륨 염 X (166 mg, 385 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 2.5 h 동안 교반하였다. 그 후에, 휘발물을 감압하에 제거하고, 디에틸 에테르 (20 mL)를 첨가하였다. 진한 적색 고형물이 쏟아져 나왔다. 이를 여과하고, 추가의 디에틸 에테르 (20 mL)로 세척하고, ~5 %의 아세톤니트릴을 함유하는 물 (15 mL)에 용해시켰다. 생성된 진한 적색 용액을 여과하고, 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 주된 적색 (흡수 최대치 ~ 550 nm) 분획을 수거하고, 용매를 진공에서 제거하였다. MS (DUIS): 비-아세틸화된 E-: 671.0 (M-1); E+: 673.3 (M+1), 774.4 (Et3N+ 염).
표 2에는 공지된 구조적 유사체 염료 (특허: P6240WO)에 대한 유사한 파라미터와 비교한 이러한 방식으로 제조된 일부 염료 (물 중의 용액, OD ~ 0.2)의 스펙트럼 특성이 나타나 있다.
Figure 112018040691069-pct00043
Figure 112018040691069-pct00044
염료 AF670POPO 뉴클레오티드 컨쥬게이트 ( FFA - AF670POPO )
Figure 112018040691069-pct00045
무수 DMA (3 mL), TSTU (18 mg, 58.8 μmol) 및 Hunig의 염기 (0.05 mL)를 건조된 염료 AF670POPO 샘플 (60 mg, 53.5 μmol)에 첨가하였다. 활성화된 에스테르의 청색이 발달되었다. 반응 혼합물을 실온에서 30 min 동안 교반하였다. TLC (CH3CN 중의 20% H2O)에 따르면, 활성화가 완료되었다. 활성화가 완료된 후, DMA/물 (0.5/0.3 mL) 중의 트리에틸암모늄 염 (53 mg, 56.1 μmol)으로서 5 pppA-LN3의 용액을 반응물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 18 h 동안 교반하였다. 커플링 진행을 TLC (아세토니트릴 중의 20% H2O)에 의해 체크하였다. 반응 혼합물을 아이스-배쓰로 ~4℃로 냉각시킨 후, 물 중의 0.1 M TEAB (5 mL)의 10 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10 min 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 중의 0.05 M TEAB 용액에서 ~ 25 g의 DEAE Sephadex 수지 현탁액으로 컬럼에 적용하고, TEAB (0.1 M 내지 1 M 이하의 농도 구배)로 세척하였다. 착색된 분획을 수거한 후, 증발시킨 후, 물과 다시 공증발시켜 TEAB를 더 제거하고, 건조 상태로 건조시켰다. 잔여물을 이후 TEAB 0.1 M에서 재용해시켰다. 이 용액을 0.2 nm 공극 크기의 시린지 필터를 통해 코닝 20 플라스크로 여과하였다. 생성물을 아세토니트릴 -0.1 M TEAB로 C18 역상 컬럼을 사용하여 HPLC에 의해 정제하였다. 수율 74 % (추정 소광 계수를 이용한 용액의 광학 밀도를 기초로 함).
염료 AF550POPOS0 뉴클레오티드 컨쥬게이트 ( FFT - AF550POPOS0 )
Figure 112018040691069-pct00046
무수 DMA (3 mL), TSTU (19 mg, 63.5 μmol) 및 Hunig의 염기 (0.05 mL)를 건조된 염료 AF550POPOS0 샘플 (39 mg, 57.7 μmol)에 첨가하였다. 활성화된 에스테르의 적색이 나타났다. 반응 혼합물을 실온에서 30 min 동안 교반하였다. DMA/물 (0.5/0.3 mL) 중의 트리에틸암모늄 염 (59 mg, 63.5 μmol)으로서 pppT-LN3의 용액을 반응물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 18 h 동안 교반하였다. 커플링 진행을 TLC (아세토니트릴 중의 20% H2O)에 의해 체크하였다. 반응 혼합물을 아이스-배쓰로 ~4℃로 냉각시킨 후, 물 중의 0.1 M TEAB (5 mL)의 10 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10 min 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 중의 0.05 M TEAB 용액에서 ~ 25 g의 DEAE Sephadex 수지 현탁액으로 컬럼에 적용하고, TEAB (0.1 M 내지 1 M 이하의 농도 구배)로 세척하였다. 착색된 분획을 수거한 후, 증발시킨 후, 물과 다시 공증발시켜 TEAB를 더 제거하고, 건조 상태로 건조시켰다. 잔여물을 이후 TEAB 0.1 M에서 재용해시켰다. 이 용액을 0.2 nm 공극 크기의 시린지 필터를 통해 코닝 20 플라스크로 여과하였다. 생성물을 아세토니트릴 -0.1 M TEAB로 C18 역상 컬럼을 사용하여 HPLC에 의해 정제하였다. 수율 48 % (추정 소광 계수를 이용한 용액의 광학 밀도를 기초로 함).
도면에 대한 설명
도 1: ffA-NR650C5와 함께 AF670POPO 및 이의 유사체로 표지된 FFA를 변형된 Illumina HiseqX 서열화 시스템에서 시험하였고, 여기서 둘 모두의 레이저(적색 및 녹색)에 대한 여기력의 약 33%까지의 증가가 각각 판독 1 & 2에 대한 사이클 101 & 251에서 나타났다(도 1에 대한 신호 참조).
도 2: 예기치 않게도, ffA-NR650C5의 경우에(도 2), 적색 신호는 적색 레이저의 출력 변화에 비례하여 반응하지 않은 것으로 관찰되었다. 결과적으로, 염기 분리 산포도의 모양은 사이클 101에서 변경되었다. 우측 상단 원은 좌측 상단 원에 더 가까운데, 이는 각각의 표지들을 구별하기가 더 어렵다는 것을 의미한다. 발생한 현상은 NR650C5가 아마도 HiSeqX에 대하여 사용된 최대 출력 밀도에서 광-포화되거나 거의-포화되었다는 것을 나타냈다. 이러한 산포도 변화는 서열화 품질에 불리하게 영향을 미친다. 흥미롭게도, AF670POPO 및 이의 유사체로, 현저한 개선이 관찰되었다. 이들의 신호는 레이저 출력 밀도 변화에 비례하여 증가되었다. 산포도는 최대 출력이 나타났을 때 사이클 100 내지 사이클 101에서 이의 분리 및 모양을 유지하였다(도 2). 도 2에서의 우측 상단 원은 도 1에서의 우측 상단 원보다 좌측 상단 원과 더 멀리 있다. 따라서, 표지는 도 2에서 더 우수하게 분리된다.
도 3: 550nm에서의 유사체들에서 흥미롭게도 페닐 고리 상의 하이드록실의 존재는 형광 세기에 대하여 유해한 영향을 갖는다는 것이 관찰되었다(도 3). 페놀의 OH가 없는 AF550POPS0의 형광은 OH를 갖는 AF550POPOS0보다 3배 더 강했다.
도 4: 이러한 신규한 유사체들은 서열화 적용에 대하여 산포도의 분포를 조정하고 최적화시키는 기회를 제공하였다. 예를 들어, T가 AF550POPOS0로 표지되고, A가 AF670POPO와 NR550S0의 혼합물로 표지되는 경우, 우수한 정사각형 산포도가 달성되었다(도 4a). 더 나아가, 녹색 A에 대하여 NR550S0를 AF550POPS0로 교체하는 것은 우수한 정사각형 산포도를 나타냈다(도 4b).
도 5: 이러한 새로운 특성들을 기초로 하여, 변형된 HiSeqX에 대하여 인간 템플레이트를 서열화하기 위해 ffT-LN3-AF550POPOS0 및 ffA-LN3-AF670POPO를 사용하였다. 고품질의 2x150bp 서열화가 판독 1에 대하여 < 1% 오차율로 달성되었고, 판독 2에 대하여 < 1.5% 오차율로 달성되었다(도 5에 나타나 있는 주요 서열화 메트릭스(main sequencing metrics)). 종래 기술의 표지를 사용하여 얻어진 산포도는 2x150bp 판독이 완료될 수 없음을 의미하였다.

Claims (32)

  1. 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 메조머 형태(mesomeric form):
    Figure 112019071666404-pct00047

    상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온(counterion)이고;
    m은 0 내지 3의 정수이고;
    p는 1 내지 2의 정수이고;
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    alk는 임의로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
    Y는 O이고;
    Z는 OH이고;
    n은 0 내지 3의 정수이고;
    X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이고;
    각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
    각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, Ra1 또는 Ra2는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고, 여기서 추가의 고리는 SO3 -를 가지거나, Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이다.
  2. 제1항에 있어서, n이 O인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, (alk)가 (CH2)3인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, p가 1인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, p가 2인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, Ra1이 H 또는 SO3 -인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, Ra2가 H 또는 SO3 -인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, Ra1이 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, Ra2가 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리인 화합물.
  10. 제1항에 있어서, Rc1 또는 Rc2가 메틸, 에틸, 프로필 또는 -(CH2)tSO3 -이고, t가 1 내지 6인 화합물.
  11. 제10항에 있어서, Rc1 또는 Rc2가 (CH2)4-SO3 -인 화합물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, n이 1인 화합물.
  15. 제14항에 있어서, OH 기가 4-위치에 있는 화합물.
  16. 제1항에 있어서, 어느 한 인돌이 하기 구조식의 일부인 화합물:
    Figure 112019071666404-pct00048

    상기 식에서, Rd은 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아미드, 또는 설폰산일 수 있고,
    Rc1은 알킬 또는 치환된 알킬이다.
  17. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (VIIIa)로 표현되는 화합물:
    Figure 112018040691069-pct00049

    상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
    m은 0 내지 3의 정수이고;
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    r은 1 내지 5의 정수이고;
    X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이다.
  18. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (VIId)로 표현되는 화합물:
    Figure 112018040691069-pct00050

    상기 식에서, mCat+ 또는 mAn-은 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고;
    m은 0 내지 3의 정수이고;
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    r은 1 내지 5의 정수이고;
    t는 1 내지 6의 정수이고;
    X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 컨쥬게이트이다.
  19. 제1항 내지 제11항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착되는 화합물.
  20. 제1항에 따른 화합물로 표지된 뉴클레오티드.
  21. 제18항에 따른 화합물로 표지된 뉴클레오티드로서, 표지가 C(=O)-X 모이어티로부터 형성된 아미드 연결을 통해 부착되는, 표지된 뉴클레오티드.
  22. 제20항에 있어서, 표지가 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착되는, 표지된 뉴클레오티드.
  23. 제20항에 있어서, 뉴클레오티드의 리보오스 또는 데옥시리보오스 당에 공유 부착되는 3' OH 차단 기를 추가로 포함하는, 표지된 뉴클레오티드.
  24. 둘 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 키트로서, 적어도 하나의 뉴클레오티드가 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드인 키트.
  25. 제24항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드 중 두 개가 단일 레이저를 사용하여 여기되는 키트.
  26. 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 키트로서, 4개의 뉴클레오티드의 첫 번째가 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 두 번째, 세 번째, 및 네 번째 뉴클레오티드가 각각 상이한 화합물로 표지되고, 각각의 화합물이 별개의 흡광도 최대치를 지니고, 각각의 화합물이 다른 세 개의 화합물과 구별가능한 키트.
  27. 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 키트로서, 4개의 뉴클레오티드의 첫 번째가 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 4개의 뉴클레오티드의 두 번째가 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 세 번째 뉴클레오티드가 세 번째 표지를 지니고, 네 번째 뉴클레오티드가 비표지되는(어두운 색) 키트.
  28. 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 키트로서, 4개의 뉴클레오티드의 첫 번째가 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 4개의 뉴클레오티드의 두 번째가 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 세 번째 뉴클레오티드가 두 개의 표지들의 혼합을 지니고, 네 번째 뉴클레오티드가 비표지되는(어두운 색) 키트.
  29. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드로서, 서열화, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전 분석, RNA 분석 또는 단백질 결합 검정에서 사용되는 표지된 뉴클레오티드.
  30. 제29항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 자동 서열화 기기에서 사용되고, 상기 자동 서열화 기기가 상이한 파장에서 작동하는 두 개의 레이저를 포함하는 표지된 뉴클레오티드.
  31. 하기 출발 물질 또는 이의 염 중 하나를 사용하여 제1항 내지 제11항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 합성하는 방법:
    Figure 112019071666404-pct00051

    Figure 112019071666404-pct00052

    상기 식에서, Ra1은 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고; Rc1은 알킬 또는 치환된 알킬이고; Ar은 방향족 기이고, R은 알킬 기이다.
  32. 하기 출발 물질을 사용하여 제1항 내지 제11항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 합성하는 방법:
    Figure 112019071666404-pct00053
    .
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