TWI701236B - 聚次甲基化合物及其做為螢光標記之用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容係關於新穎化合物及其做為螢光標記之用途。該等化合物可在核酸定序應用中用做核苷酸之螢光標記。

Description

聚次甲基化合物及其做為螢光標記之用途
本揭示內容係關於新穎聚次甲基化合物及其做為螢光標記物之用途。具體而言，該等化合物可在核酸定序應用中用做核苷酸之螢光標記。
本申請案中引用若干出版物及專利文件以更全面地闡述本揭示內容所屬之技術領域之狀態。該等出版物及文件之每一者之揭示係以引用的方式併入本文中。 利用螢光標記非放射性檢測核酸在分子生物學中係重要技術。先前在重組DNA技術中所採用之許多程序嚴重依賴於使用以(例如)32 P放射性標記之核苷酸或多核苷酸。放射性化合物容許靈敏地檢測所關注之核酸及其他分子。然而，在放射性同位素之使用中存在嚴重限制，例如其費用、有限之保存期及更重要的安全考慮。消除對於放射性標記之需要增強安全性，同時減少與(例如)試劑處置相關聯之環境影響及成本。可用於非放射性螢光檢測之方法包括做為非限制性實例之自動化DNA定序、雜交方法、聚合酶鏈反應產物之實時檢測及免疫分析。 對於許多應用而言，期望採用多個光譜上可區分之螢光標記以達成複數個空間上重疊分析物之獨立檢測。在此等多工方法中，可減少反應容器之數量，簡化實驗方案並促進專用試劑套組之生產。舉例而言，在多色自動化DNA定序中，多工螢光檢測容許在單一電泳道中分析多個核苷酸鹼基，藉此較單色方法增加通量並降低與泳道間電泳遷移率變化相關聯之不確定性。 然而，多工螢光檢測可有問題且存在數個限制螢光標記之選擇之重要因素。首先，可難以找到其發射光譜在給定應用中適當地光譜解析之染料化合物。另外，當若干種螢光染料一起使用時，藉由同時激發產生在可區分光譜區域中之螢光信號可較困難，此乃因可用於此之染料之吸收帶通常廣泛分離，因此即使對於兩種染料而言仍難以達成或多或少相等之螢光激發效率。許多激發方法使用高功率光源(例如雷射)且因此染料必須具有充足之光穩定性以經受此激發。在分子生物學方法中尤其重要之最後考慮係螢光染料必須與所使用之試劑化學(例如DNA合成溶劑及試劑、緩衝劑、聚合酶及連接酶)相容之程度。 隨著定序技術發展，已出現對於滿足所有上述約束且尤其適用於高通量分子方法(例如固相定序及諸如此類)之其他螢光染料化合物、其核酸偶聯物及染料組之需要。 具有改良之螢光性質(例如螢光強度、螢光帶之形狀及波長最大值)之螢光染料分子可改良核酸定序之速度及準確度。當在基於水之生物緩衝劑中及在較高溫度下量測時，強螢光信號尤其重要，此乃因大多數染料之螢光強度在此等條件下顯著較低。此外，染料所附接之基質之性質亦會影響螢光最大值、螢光強度及其他光譜染料性質。核鹼基與螢光染料之間之序列特異性相互作用可藉由螢光染料之特異性設計來定製。最佳化螢光染料之結構在核酸定序中可改良核苷酸併入之效率，降低定序錯誤之程度並減少試劑之使用且因此降低核酸定序之成本。
本文中闡述改良之聚次甲基構築體及其做為生物分子標記、尤其做為用於核酸定序中之核苷酸之標記之用途。尤其可改良經標記之核苷酸併入之效率及使用新穎螢光構築體可獲得之定序讀取之長度及準確度。下文所闡述之分子在其中使用高功率激發源之情形中尤其有利。高功率激發可造成一定程度之功率飽和，其中標記所發射之光子數不再與激發功率之增加呈線性。功率飽和可由與標記之結構相關之分子淬滅效應引起，或可由具有長於期望之螢光壽命之標記引起，藉此標記在發射光子之前於激發態中花費長於期望之時間。在同時使用多種不同之標記之情形下，使標記之一者達到功率飽和而其他標記繼續變亮使得標記之區分更加困難。本文中所闡述之標記尤其有利於達到較相應先前技術標記化合物更高程度之功率飽和。
根據第一態樣，本揭示內容提供式(I)化合物或其共振(mesomeric)形式：
Figure 105131115-A0305-02-0005-1
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；p係1至2之整數； q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係S、O或CH2；Z係OH；n係0至3之整數；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基。
P可係1；在此情形下，化合物係式(Ia)或其共振形式：
Figure 105131115-A0305-02-0006-2
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係S、O或CH2；Z係OH；n係0至3之整數； X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基。
P可係2；在此情形下，化合物係式(Ib)或其共振形式：
Figure 105131115-A0305-02-0007-3
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係S、O或CH2；Z係OH；n係0至3之整數；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基。
在其中Ra1或Ra2係H之某些實例中，Rc1或Rc2可係烷基磺酸基。化合物需要一或多個磺酸取代基，使得Ra1 或Ra2 之至少一者係SO3 - ，或Ra1 或Ra2 係稠合至毗鄰碳原子之另一環，該另一環具有SO3 - ，或Rc1 或Rc2 係烷基磺酸基。 在其中p係2之某些實例中，Rc1 或Rc2 係烷基磺酸基。 在某些實例中，r等於3。 在某些實例中，n係1。OH基可位於環上之位置4。在某些實例中n係0，且苯基環未經取代。在其中n係0之某些實例中，Y係S或O (且非CH2 )。 在另一實施例中，本揭示內容之化合物可與各種受質部分偶聯，例如核苷、核苷酸、多核苷酸、多肽、碳水化合物、配體、粒子、細胞、半固體表面(例如凝膠)及固體表面。偶聯可經由可變為醯胺或酯之羧基C(=O)-X實施。 因此，根據本揭示內容之另一態樣，提供染料化合物，其包含使得能夠(例如)共價附接至此等受質部分之連接體基團。 根據另一態樣，本揭示內容提供藉由式N-L-染料定義之核苷或核苷酸化合物，其中N係核苷酸，L係可選連接體部分且染料係根據本揭示內容之螢光化合物。 在另一態樣中，本揭示內容提供使用本揭示內容之染料化合物進行定序之方法。 根據另一態樣，本揭示內容亦提供包含染料化合物(游離或呈偶聯物形式)之套組，該等套組可用於各種免疫學分析、寡核苷酸及核酸標記中且用於DNA合成定序。在另一態樣中，本揭示內容提供包含染料「組」之套組，其尤其適於在自動化儀器平臺上合成定序之循環。 本揭示內容之另一態樣係本揭示內容之化合物之化學製備。
本揭示內容提供尤其適於螢光檢測及合成定序之方法之新穎化合物。具有吲哚N-苯基部分之化合物在螢光強度、光穩定性方面與N-烷基類似物相比係有利的，且因此改良某些核酸定序應用。
根據第一態樣，本揭示內容提供式(I)化合物或其共振形式：
Figure 105131115-A0305-02-0010-4
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；p係1至2之整數；q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係S、O或CH2；Z係OH；n係0至3之整數；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環； Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基。
本揭示內容提供式(I)化合物或其共振形式：
Figure 105131115-A0305-02-0011-5
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；p係1至2之整數；q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係S、O或CH2；Z係OH；n係0至3之整數；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；且Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基，其中Ra1或Ra2之至少一者係SO3 -，或Ra1或Ra2係稠合至毗鄰碳原子之另一環，該另一環具有SO3 -，或Rc1或Rc2係烷基磺酸基。
本揭示內容提供式(I)化合物或其共振形式：
Figure 105131115-A0305-02-0012-6
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；p係1至2之整數；q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係S、O或CH2；Z係OH；n係0至3之整數；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；且Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基，其中當n為0時，Y係S或O。
本揭示內容提供式(I)化合物或其共振形式：
Figure 02_image015
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； p係1至2之整數； q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數； X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物； Ra1 及Ra2 各自獨立地係H、SO3 - 、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；且 Rc1 及Rc2 各自獨立地係烷基或經取代之烷基，其中Ra1 或Ra2 之至少一者係SO3 - ，或Ra1 或Ra2 係稠合至毗鄰碳原子之另一環，該另一環具有SO3 - ，或Rc1 或Rc2 係烷基磺酸基且其中當n為0時，Y係S或O。 分子在位置Ra可含有一或多個磺醯胺或SO3 - 部分。Ra1 及/或Ra2 可係SO3 - 或磺醯胺。其他Ra (Ra1 或Ra2 )可獨立地係H、SO3 - 、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環。Ra1 或Ra2 可係H。Ra1 或Ra2 可係SO3 - 。Ra1 可不同於Ra2，例如結構在Ra1可具有單一磺醯胺基，且在Ra2可具有H。Ra1及Ra2二者可均為磺醯胺。磺醯胺可係SO2NH2或SO2NHR，其中R係烷基、經取代之烷基、芳基或經取代之芳基。倘若Ra1或Ra2均非SO3 -或稠合至毗鄰碳原子之另一環，則Rc1或Rc2必須係烷基磺酸基。
Ra1或Ra2可係稠合至吲哚環之毗鄰碳之另一脂肪族、芳香族或雜環環。舉例而言，在此等情形下當芳香環稠合時，染料末端基團可表示以下類型之結構
Figure 105131115-A0305-02-0014-7
其中Rd可係H、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、鹵素、羧基、磺醯胺或磺酸。
因此，本揭示內容之染料可藉由式(IC)或(ID)或其共振形式描述：
Figure 02_image019
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； p係1至2之整數； q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基；且Rd係H、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、鹵素、羧基、磺醯胺或磺酸。
因此，本揭示內容之染料可藉由式(IC)或(ID)或其共振形式描述：
Figure 105131115-A0305-02-0016-8
Figure 105131115-A0305-02-0016-9
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數； p係1至2之整數；q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係S、O或CH2；Z係OH；n係0至3之整數；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基；且Rd係H、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、鹵素、羧基、磺醯胺或磺酸，其中Ra1或Ra2之至少一者係SO3 -，或Rd係SO3 -，或Rc1或Rc2係烷基磺酸基。
因此，本揭示內容之染料可藉由式(IC)或(ID)或其共振形式描述：
Figure 02_image021
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； p係1至2之整數； q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數； X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基；且Rd係H、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、鹵素、羧基、磺醯胺或磺酸，其中當n為0時，Y係S或O。
因此，本揭示內容之染料可藉由式(IC)或(ID)或其共振形式描述：
Figure 105131115-A0305-02-0019-10
Figure 105131115-A0305-02-0019-11
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；p係1至2之整數；q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數； X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物； Ra1 及Ra2 各自獨立地係H、SO3 - 、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環； Rc1 及Rc2 各自獨立地係烷基或經取代之烷基；且 Rd係H、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、鹵素、羧基、磺醯胺或磺酸，其中Ra1 或Ra2 之至少一者係SO3 - ，或Rd係SO3 - ，或Rc1 或Rc2 係烷基磺酸基，且其中當n為0時，Y係S或O。 在式(IC)或(ID)中，稠合至吲哚環之毗鄰碳原子之額外環可視情況經(例如)磺酸或磺醯胺取代。 C(=O)-X羧基或其衍生物藉由長度q之烷基鏈附接至吲哚氮原子，其中q為1至5個碳或雜原子。鏈可係(CH2 )q，其中q係1至5。基團可係(CH2 )5 COOH。 分子在位置Rc可含有一或多個烷基-磺酸鹽部分。Rc1 及/或Rc2 可係烷基-SO3 - 。另一Rc (Rc1 或Rc2 )可獨立地係烷基或經取代之烷基。Rc1 及Rc2 可獨立地係甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或(CH2 )t SO3 H，其中t為1至6。t可係1至4。t可係4。Rc1 及Rc2 可係經取代之烷基。Rc1 及Rc2 可含有COOH或-SO3 H部分或其酯或醯胺衍生物。 在某些實施例中，當Ra1 或Ra2 之一者係SO3 - 且Ra1 或Ra2 之另一者係H或SO3 -時，Rc1或Rc2亦可係烷基磺酸基。
顯示為C(=O)-X之COOH基團可用做進一步附接之連接部分或連接至另一分子。一旦發生偶聯，COOH或COO-則轉化成醯胺或酯。
化合物之實例包括根據式(II)或(IIa)之結構或其共振形式：
Figure 105131115-A0305-02-0021-12
Figure 105131115-A0305-02-0021-13
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；p係1至2之整數；q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係S、O或CH2； Z係OH；n係0至3之整數；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；且Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基。
化合物之實例包括根據式(II)或(IIa)之結構或其共振形式：
Figure 105131115-A0305-02-0022-14
Figure 105131115-A0305-02-0022-15
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；p係1至2之整數；q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數； X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物； Ra1 及Ra2 各自獨立地係H、SO3 - 、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；且 Rc1 及Rc2 各自獨立地係烷基或經取代之烷基，其中當n為0時，Y係S或O。 化合物之其他實例包括根據式(IIIa)或(IIIb)之結構：
Figure 02_image033
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； p係1至2之整數； q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； t係1至6之整數； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數； X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物； Ra1 及Ra2 各自獨立地係H、SO3 - 、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；且 Rc1 及Rc2 各自獨立地係烷基或經取代之烷基。 化合物之其他實例包括根據式(IIIa)或(IIIb)之結構：
Figure 02_image035
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； p係1至2之整數； q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； t係1至6之整數； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數； X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物； Ra1 及Ra2 各自獨立地係H、SO3 - 、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；且 Rc1 及Rc2 各自獨立地係烷基或經取代之烷基，其中當n為0時，Y係S或O。 化合物之其他實例包括根據式(IVa)至(IVd)之結構：
Figure 02_image037
Figure 02_image039
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數； X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物； Ra1 係H、SO3 - 、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環； Rc1 係烷基或經取代之烷基；且 Rd係H、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、鹵素、羧基、磺醯胺或磺酸。 化合物之其他實例包括根據式(Va)至(Vd)之結構：
Figure 02_image041
Figure 02_image043
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數；且 X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物。 化合物之其他實例包括根據式(VIa)至(VId)之結構：
Figure 02_image045
Figure 02_image047
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； q係1至5之整數； alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈； t係1至6之整數； Y係S、O或CH2 ； Z係OH； n係0至3之整數；且 X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物。 alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之烷基、烯基或炔基鏈； Alk可係基團(CH2 )r，其中r為1至5。Alk可係(CH2 )3 。或者，碳鏈可含有一或多個雙鍵或三鍵。鏈可含有鍵聯-CH2 -CH=CH-CH2 -，視情況具有其他CH2 基團。鏈可含有鍵聯-CH2 -CºC-CH2 -，視情況具有其他CH2 基團。 在以式VII至VIII給出之任何實例中，r可等於3。 在以式I至VIII給出之任何實例中，q可等於5。 在以式III、式VI或式VII給出之任何實例中，t可等於4。 在以式I至VI給出之任何實例中，n可等於1至3。在以式I至VI給出之任何實例中，n可等於1。在以式I至VI給出之任何實例中，n可係0至1之整數。倘若n為1，則OH基可在環上之任何位置。OH基可在4-位。倘若n為2或3，則OH基可在苯基環上之任何位置。 在以式I至VI給出之任何實例中，當n為0時，Y可等於O或S且非CH2 。 在以式I至VI給出之任何實例中，Y可等於O。 在以式I至VI給出之任何實例中，Y可等於O。倘若Y為O，則n可係0至3。倘若Y為CH2 ，則n可係1至3。 化合物之其他實例包括根據式(VIIa)至(VIId)之結構：
Figure 02_image049
Figure 02_image051
Figure 02_image053
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； q係1至5之整數； r係1至5之整數； t係1至6之整數；且 X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物。 化合物之其他實例包括根據式(VIIIa)至(VIIId)之結構：
Figure 02_image055
Figure 02_image057
Figure 02_image059
其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數； q係1至5之整數； r係1至5之整數；且 X係OH或O- 或其醯胺或酯偶聯物。 尤其可用之化合物係以如本文中所述之染料標記之核苷酸或寡核苷酸。 經標記之核苷酸或寡核苷酸可使標記經由烷基-羧基附接至吲哚之氮原子以形成醯胺。經標記之核苷酸或寡核苷酸可藉助連接體部分使標記附接至嘧啶鹼基之C5位置或7-去氮嘌呤鹼基之C7位置。 經標記之核苷酸或寡核苷酸亦可具有共價附接至核苷酸之核糖或去氧核糖之封閉基團。封閉基團可附接在核糖或去氧核糖上之任何位置。在具體實施例中，封閉基團係在核苷酸之核糖或去氧核糖之3’ OH位置。 本文提供包括兩種或更多種核苷酸之套組，其中至少一種核苷酸係以本揭示內容之化合物標記之核苷酸。套組可包括兩種或更多種經標記之核苷酸。核苷酸可經兩個或更多個螢光標記標記。可使用單一激發源激發兩個或更多個標記，該激發源可係雷射。舉例而言，兩個或更多個標記之激發帶可至少部分重疊，使得在光譜之重疊區域中之激發造成兩個標記均發射螢光。在具體實施例中，來自兩個或更多個標記之發射將發生在光譜之不同區域中，使得可藉由光學區分發射來確定至少一個標記之存在。 套組可含有四種經標記之核苷酸，其中四種核苷酸之第一種係經本文中所揭示之化合物標記。在此一套組中，第二種、第三種及第四種核苷酸可各自以視情況不同於第一種核苷酸上之標記且視情況不同於彼此上之標記之化合物標記。因此，化合物之一或多者可具有不同之最大吸收及/或最大發射，使得化合物可區分於其他化合物。舉例而言，每一化合物可具有不同之最大吸收及/或最大發射，使得化合物之每一者可區分於其他三種化合物。將理解，除了最大值之外之吸收光譜及/或發射光譜之部分可不同，且該等差異可用以區分化合物。套組可使得兩種或更多種化合物具有高於600 nm之最大吸收。本發明之化合物通常吸收640 nm以上區域中之光。 本文中所述之化合物、核苷酸或套組可用來檢測、量測或鑑別生物系統(包括(例如)其過程或組份)。可採用該等化合物、核苷酸或套組之例示性技術包括定序、表現分析、雜交分析、遺傳分析、RNA分析、細胞分析(例如細胞結合或細胞功能分析)或蛋白質分析(例如蛋白質結合分析或蛋白質活性分析)。可在用於實施特定技術之自動化儀器上使用，例如自動化定序儀器。定序儀器可含有兩個在不同波長下操作之雷射器。 本文揭示合成本揭示內容之化合物之方法。式(X)及/或(X1)、(X2)、(X3)或(X4)之化合物或其鹽可用做合成對稱或不對稱聚次甲基染料或其鹽之起始材料：
Figure 02_image061
其中，Ra1 係H、SO3 - 、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；Rc1 係烷基或經取代之烷基；Ar係芳香族基團且R係烷基。在顯示4-羥基苯基之特定實例之情形下，在其中n大於1之情形下，其他羥基亦可在環上經取代。r可等於3。 本文揭示合成本揭示內容之化合物之方法。式(X5)化合物或其鹽可用做合成對稱或不對稱聚次甲基染料之起始材料：
Figure 02_image063
如本文中所用，術語「烷基」係指C1 -C20 烴且可包括C3 -C10 非芳香族碳環。在具體實施例中，烷基係C1 -C6 烷基，其係指分別含有介於1與6個碳原子之間之飽和、直鏈或具支鏈烴基。在特定情形下，烷基可包括一或多個不飽和基團，且因此包括烯基及炔基。 如本文中所用之術語「鹵素」係指氟-(下文中命名為F)、氯-(下文中命名為Cl)、溴-(下文中命名為Br)或碘-(下文中命名為I)，且通常涉及取代有機化合物中之氫原子，此取代視情況係完全取代氫。 術語「經取代之烷基」係指如上文所定義之烷基、烯基或炔基，其中其可視情況經以下(但不限於)各項進一步取代：鹵基、氰基、SO3 - 、SRa、ORa、NRbRc、側氧基、CONRbRc、COOH及COORb。Ra、Rb及Rc可各自獨立地選自H、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、芳基及經取代之芳基。另外，該經取代之烷基、經取代之烯基及經取代之炔基可視情況藉由至少一個選自以下之雜原子或基團間斷：O、NRb、S(O)t (其中t為0至2)及諸如此類。經取代之烷基亦涵蓋諸如苄基等基團，其中烷基包含另一芳基或經取代之芳基部分。 根據本揭示內容之染料可自各種不同起始材料合成，包括經N-丙基-4-羥基苯基醚取代之吲哚。可對稱地製造染料，使得在聚次甲基鏈之兩端具有相同吲哚，或不對稱地製造染料，使得在發色團之任一端具有不同吲哚。製備聚次甲基染料之方法為業內所熟知。 根據本揭示內容之態樣，提供適於附接至受質部分之染料化合物，其尤其包含連接體基團以使得能附接至受質部分。受質部分實際上可係本揭示內容之染料可偶聯之任何分子或物質，且藉助非限制性實例可包括核苷、核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配體、粒子、固體表面、有機及無機聚合物、染色體、細胞核、活細胞及其組合或集合。染料可藉由可選連接體藉由各種方式偶聯，包括疏水吸引、離子吸引及共價附接。特定而言，染料藉由共價附接偶聯至受質。更特定而言，借助連接體基團共價附接。 染料化合物偶聯至受質可經由羧基COX來進行，該羧基COX可轉化成醯胺或酯。 根據本揭示內容之染料可在一個取代基位置包括反應性連接體基團，用於將染料共價附接至另一分子。反應性連接基團係能夠形成鍵(例如共價或非共價鍵)之部分。在具體實施例中，連接體可係可裂解連接體。使用術語「可裂解連接體」並非意欲暗示需要去除整個連接體。裂解位點可位於連接體上之位置，使得裂解後連接體之一部分保持附接至染料及/或受質部分。藉助非限制性實例，可裂解連接體可係親電子可裂解連接體、酶促可裂解連接體、親核可裂解連接體、光可裂解連接體，可在還原條件下裂解(例如含二硫化物或疊氮化物之連接體)、可在氧化條件下裂解，可經由使用安全掣子(safety-catch)連接體裂解及可藉由消除機制裂解。使用可裂解連接體將染料化合物附接至受質部分提供例如在檢測後去除標記之選擇，藉此避免下游步驟中之任何干擾信號。 可用連接體基團可參見PCT公開案第WO2004/018493號(以引用的方式併入本文)，其實例包括可使用水溶性膦或自過渡金屬及至少部分水溶性配體形成之水溶性過渡金屬觸媒裂解之連接體。在水溶液中，該等水溶性過渡金屬觸媒形成至少部分水溶性之過渡金屬錯合物。此等可裂解連接體可用來將核苷酸之鹼基連接至標記(例如本文中所述之染料)。 具體連接體可參見PCT公開案第WO2004/018493號(以引用的方式併入本文)，例如包括下式之部分之彼等：
Figure 02_image065
Figure 02_image067
(其中X係選自包含O、S、NH及NQ之群，其中Q係C1-10經取代或未經取代之烷基，Y係選自包含O、S、NH及N(烯丙基)之群，T係氫或C1 -C10 經取代或未經取代之烷基，且*指示部分與核苷酸或核苷之其餘部分連接之位置)。 在具體實施例中，螢光染料(螢光團)與鳥嘌呤鹼基之間之連接體之長度可(例如)藉由引入聚乙二醇間隔體基團而改變，藉此與此項技術中已知之藉助其他鍵聯附接至鳥嘌呤鹼基之相同螢光團相比增加螢光強度。例示性連接體及其性質闡述於公開為WO07020457之GB專利申請案第0517097.2號(以引用的方式併入本文中)中。連接體之設計且尤其其增加之長度可容許當併入至多核苷酸(例如DNA)中時改良附接至鳥苷核苷酸之鳥嘌呤鹼基之螢光團之亮度。因此，當染料用於任何採用檢測附接至含鳥嘌呤核苷酸之螢光染料標記之分析方法中時，使用(例如)如WO07020457中所闡述之具有式-((CH2 )2 O)n -之間隔體基團(其中n係介於2與50之間之整數)之連接體可係有利的。 本揭示內容進一步提供以本文中所述之一或多種染料標記之核苷及核苷酸之偶聯物(經修飾核苷酸)。經標記之核苷及核苷酸可用於標記藉由酶法合成形成之多核苷酸，例如，做為非限制性實例，在PCR擴增、等溫擴增、固相擴增、多核苷酸定序(例如固相定序)、缺口移位(nick translation)反應及諸如此類中形成。 核苷及核苷酸可在糖或核鹼基上之位點經標記。如此項技術中已知，「核苷酸」係由以下組成：含氮鹼基、糖及一或多個磷酸基團。糖在RNA中係核糖且在DNA中係去氧核糖，即缺少核糖中存在之羥基之糖。含氮鹼基係嘌呤或嘧啶之衍生物。嘌呤可係腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，且嘧啶可係胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或在RNA之情形下為尿嘧啶(U)。去氧核糖之C-1原子鍵結至嘧啶之N-1或嘌呤之N-9。核苷酸亦係核苷之磷酸酯，其中酯化發生在附接至糖之C-3或C-5之羥基上。核苷酸通常係單、二或三磷酸酯。 「核苷」在結構上與核苷酸類似，但缺少磷酸酯部分。核苷類似物之實例將係其中標記連接至鹼基且不存在附接至糖分子之磷酸基者。 儘管鹼基通常稱為嘌呤或嘧啶，但熟習此項技術者將理解，可獲得不改變核苷酸或核苷經歷沃森-克裡克(Watson-Crick)鹼基配對之能力之衍生物及類似物。「衍生物」或「類似物」意指其核心結構與母體化合物相同或非常類似但具有化學或物理修飾(例如，容許衍生核苷酸或核苷連接至另一分子之不同或額外側基)之化合物或分子。舉例而言，鹼基可係去氮嘌呤。在具體實施例中，衍生物能夠經歷沃森-克裡克配對。「衍生物」及「類似物」亦包括(例如)具有經修飾之鹼基部分及/或經修飾之糖部分之合成核苷酸或核苷衍生物。此等衍生物及類似物論述於(例如) Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980)及Uhlman等人，Chemical Reviews 90:543-584, 1990中。核苷酸類似物亦可具有經修飾之磷酸二酯鍵聯，包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、苯胺基磷酸酯、胺基磷酸酯鍵聯及諸如此類。 染料可(例如)藉助連接體附接至核苷酸鹼基上之任何位置。在具體實施例中，所得類似物仍可進行沃森-克裡克鹼基配對。特定核鹼基標記位點包括嘧啶鹼基之C5位置或7-去氮嘌呤鹼基之C7位置。如上文所述，連接體基團可用來將染料共價附接至核苷或核苷酸。 在具體實施例中，經標記之核苷或核苷酸可酶促併入且可酶促延伸。因此，連接體部分可具有足夠長度以將核苷酸連接至化合物，使得化合物不顯著干擾核酸複製酶對核苷酸之整體結合及識別。因此，連接體亦可包含間隔體單元。間隔體使得(例如)核苷酸鹼基遠離裂解位點或標記。 以本揭示內容之染料標記之核苷或核苷酸可具有下式：
Figure 02_image069
其中染料係根據本揭示內容之染料化合物，B係核鹼基，例如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤及諸如此類，且L係可存在或可不存在之可選連接體基團。R’可係H、單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯類似物、附接至含有反應性磷之基團之-O-或藉由封閉基團保護之-O-。R’’可係H、OH、亞磷醯胺或3’OH封閉基團，且R’’’係H或OH。 倘若R’’係亞磷醯胺，則R’係酸可裂解之羥基保護基團，其容許在自動化合成條件下進行後續單體偶合。 在具體實施例中，封閉基團與染料化合物分開且獨立，即不直接附接至該染料化合物。在替代實施例中，染料可包含3’OH封閉基團之全部或部分。因此，R’’可係可包含或可不包含本文中所揭示之染料化合物之3’OH封閉基團。 在另一替代實施例中，在戊醣之3’碳上無封閉基團，且舉例而言附接至鹼基之染料(或染料與連接體之構築體)可具有足夠大小或結構以用做併入另一核苷酸之封閉。因此，封閉可由空間位阻所致或可由大小、電荷與結構之組合所致，無論染料是否附接至糖之3’位置。 在另一替代實施例中，封閉基團存在於戊醣之2’或4’碳上，且可具有足夠大小或結構以用做併入另一核苷酸之封閉。使用封閉基團容許在併入經修飾核苷酸時藉由例如停止延伸來控制聚合。若封閉效應可逆，例如做為非限制性實例藉由改變化學條件或藉由去除化學封閉物而可逆，則可在某些點停止延伸且然後容許繼續延伸。 在另一具體實施例中，3’OH封閉基團將包含WO2004/018497 (以引用的方式併入本文)中所揭示之部分。舉例而言，封閉基團可係疊氮基甲基(CH2 N3 )或烯丙基。 在具體實施例中，連接體(染料與核苷酸之間)及封閉基團二者均存在且係分開的部分。在具體實施例中，連接體及封閉基團二者均可在實質上類似之條件下裂解。因此，由於去除染料化合物及封閉二者僅需要單一處理，故去保護及去封閉過程可更有效。然而，在一些實施例中，連接體及封閉基團不需要在類似條件下裂解，而是個別地可在不同條件下裂解。 本揭示內容亦涵蓋併入染料化合物之多核苷酸。此等多核苷酸可係DNA或RNA，其分別包括以磷酸二酯鍵聯接合之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。根據本揭示內容之多核苷酸可包含天然核苷酸、除本揭示內容之經修飾核苷酸之外之非天然(或經修飾)核苷酸或其任何組合，以及至少一種本文中所述之經修飾核苷酸(例如經染料化合物標記)。根據本揭示內容之多核苷酸亦可包括非天然主鏈鍵聯及/或非核苷酸化學修飾。亦涵蓋包括包含至少一種根據本揭示內容之經修飾核苷酸之核糖核苷酸與去氧核糖核苷酸之混合物之嵌合結構。 包含根據本揭示內容之染料化合物之經修飾核苷酸(或核苷)可用於任何分析方法中，例如包括檢測附接至核苷酸或核苷之螢光標記之方法，無論靠其自身抑或併入至較大分子結構或偶聯物中或與較大分子結構或偶聯物結合。在本文中，術語「併入至多核苷酸中」可意指5’磷酸係以磷酸二酯鍵接合至第二(經修飾或未經修飾)核苷酸之3’羥基，其本身可形成較長多核苷酸鏈之一部分。本文中所述之經修飾核苷酸之3’端可以磷酸二酯鍵接合至另一(經修飾或未經修飾)核苷酸之5’磷酸或不接合。因此，在一個非限制性實施例中，本揭示內容提供檢測併入至多核苷酸中之經修飾核苷酸之方法，其包含：(a) 將本揭示內容之至少一種經修飾核苷酸併入至多核苷酸中及(b) 藉由檢測來自附接至該(等)經修飾核苷酸之染料化合物之螢光信號來檢測併入至多核苷酸中之經修飾核苷酸。 此方法可包括：合成步驟(a)，其中將一或多種根據本揭示內容之經修飾核苷酸併入至多核苷酸中，及檢測步驟(b)，其中藉由檢測或定量量測一或多種經修飾核苷酸之螢光來檢測併入至多核苷酸中之經修飾核苷酸。 在本揭示內容之一個實施例中，至少一種經修飾核苷酸在合成步驟中藉由聚合酶之作用併入至多核苷酸中。然而，可使用將經修飾核苷酸接合至多核苷酸之其他方法，例如化學寡核苷酸合成或將經標記之寡核苷酸連接至未經標記之寡核苷酸。因此，當參照核苷酸及多核苷酸使用時，術語「併入」可涵蓋藉由化學方法以及酶促方法進行之多核苷酸合成。 在特定實施例中，合成步驟進行且可視情況包含將模板多核苷酸鏈與包含本揭示內容之經螢光標記之經修飾核苷酸之反應混合物一起培育。亦可在允許在退火至模板多核苷酸鏈之多核苷酸鏈上之游離3’羥基與經修飾核苷酸上之5’磷酸基之間形成磷酸二酯鍵之條件下提供聚合酶。因此，合成步驟可包括如藉由核苷酸與模板鏈之互補鹼基配對引導之多核苷酸鏈之形成。 在方法之所有實施例中，檢測步驟可在經修飾核苷酸併入其中之多核苷酸鏈退火至模板鏈的同時或在其中兩條鏈分離之變性步驟之後進行。其他步驟(例如化學或酶促反應步驟或純化步驟)可包括於合成步驟與檢測步驟之間。具體而言，併入經修飾核苷酸之目標鏈可經分離或純化且然後進一步處理或用於後續分析中。舉例而言，在合成步驟中以經修飾核苷酸標記之目標多核苷酸隨後可用做經標記之探針或引子。在其他實施例中，本文中所述之合成步驟之產物可經受其他反應步驟且若期望，可純化或分離該等後續步驟之產物。 對於合成步驟之適宜條件將為熟習標準分子生物學技術者所熟知。在一個實施例中，合成步驟可係類似於標準引子延伸反應，在適宜聚合酶存在下，使用核苷酸前體(包括本文中所述之經修飾核苷酸)形成與模板鏈互補之延伸目標鏈。在其他實施例中，合成步驟本身可形成產生經標記之雙鏈擴增產物之擴增反應之一部分，該經標記之雙鏈擴增產物包括來源於目標及模板多核苷酸鏈之複製之退火互補鏈。其他例示性合成步驟包括缺口移位、鏈置換聚合、隨機引導的DNA標記等。對於合成步驟尤其可用之聚合酶係能夠催化併入本文中所述之一或多種經修飾核苷酸者。可使用各種天然或經修飾之聚合酶。舉例而言，可使用熱穩定性聚合酶進行使用熱循環條件實施之合成反應，而對於等溫引子延伸反應可不需要熱穩定性聚合酶。能夠併入根據本揭示內容之經修飾核苷酸之適宜熱穩定性聚合酶包括WO 2005/024010或WO06120433中所闡述之彼等，其各自係以引用的方式併入本文中。在較低溫度(例如37℃)下進行之合成反應中，聚合酶不一定必須為熱穩定性聚合酶，因此聚合酶之選擇將取決於多種因素，例如反應溫度、pH、鏈置換活性及諸如此類。 在特定非限制性實施例中，本揭示內容涵蓋以下之方法：核酸定序、重新定序、全基因體定序、單一核苷酸多態性評分或任何其他涉及當併入至多核苷酸中時檢測以本文中所述之染料標記之經修飾核苷酸或核苷之應用。任何受益於使用以包含螢光染料之經修飾核苷酸標記之多核苷酸之各種其他應用可使用以本文中所述之染料標記之經修飾核苷酸或核苷。 在具體實施例中，本揭示內容提供包含根據本揭示內容之染料化合物之經修飾核苷酸在多核苷酸合成定序反應中之用途。合成定序通常涉及使用聚合酶或連接酶在5’至3’方向上將一或多個核苷酸或寡核苷酸依序添加至生長多核苷酸鏈以形成與欲定序之模板核酸互補之延伸多核苷酸鏈。存在於一或多個所添加核苷酸中之鹼基之身份可在檢測或「成像」步驟中確定。所添加之鹼基之身份可在每一核苷酸併入步驟之後確定。然後可使用習用沃森-克裡克鹼基配對規則來推斷模板之序列。使用以本文中所述之染料標記之經修飾核苷酸確定單一鹼基之身份可用於(例如)單一核苷酸多態性之評分中，且此等單一鹼基延伸反應係在本揭示內容之範圍之內。 在本揭示內容之實施例中，模板多核苷酸之序列係藉由檢測併入與欲定序之模板多核苷酸互補之新生鏈中之一或多種核苷酸來確定，該檢測係藉助檢測附接至所併入核苷酸中之螢光標記來實施。模板多核苷酸之定序可以適宜引子(或製備為髮夾構築體，其將含有引子做為髮夾之一部分)引導，且新生鏈在聚合酶催化反應中藉由將核苷酸添加至引子之3’端以逐步方式延伸。 在具體實施例中，不同核苷酸三磷酸(A、T、G及C)各自可經獨特螢光團標記且亦在3’位置包含封閉基團以防止不受控制之聚合。或者四種核苷酸之一種可未經標記(黑暗)。聚合酶將核苷酸併入至與模板多核苷酸互補之新生鏈中，且封閉基團防止核苷酸之進一步併入。可洗掉任何未併入之核苷酸，且來自每一併入核苷酸之螢光信號可藉由適宜方式(例如使用雷射激發及適宜發射濾波器之電荷耦合裝置)以光學方式「讀取」。然後可將3’-封閉基團及螢光染料化合物去除(去保護)，以(同時或依序)暴露新生鏈用於進一步核苷酸併入。通常，所併入之核苷酸之身份將在每一併入步驟之後確定，但此並非嚴格必需的。類似地，美國專利第5,302,509號(其係以引用的方式併入本文中)揭示對固定化於固體載體上之多核苷酸進行定序之方法。 如上文所例示，該方法利用在DNA聚合酶存在下將經螢光標記之3’封閉之核苷酸A、G、C及T併入至與固定化多核苷酸互補之生長鏈中。聚合酶併入與目標多核苷酸互補之鹼基，但藉由3’-封閉基團防止其進一步添加。然後可確定所併入之核苷酸之標記，並藉由化學裂解去除封閉基團以容許發生進一步聚合。欲在合成定序反應中定序之核酸模板可係期望定序之任何多核苷酸。用於定序反應之核酸模板通常將包含具有游離3’羥基之雙鏈區域，其在定序反應中用做添加其他核苷酸之引子或起始點。欲定序之模板區域將在互補鏈上使此游離3’羥基突出。欲定序之模板之突出區可係單鏈，但亦可係雙鏈，條件係在與欲定序之模板鏈互補之鏈上「存在缺口」以提供用於起始定序反應之游離3’ OH基。在此等實施例中，定序可藉由鏈置換進行。在某些實施例中，帶有游離3’羥基之引子可做為與欲定序之模板之單鏈區雜交之單獨組份(例如短的寡核苷酸)添加。或者，引子及欲定序之模板鏈可各自形成能夠形成分子內雙鏈體(例如髮夾環結構)之部分自身互補之核酸鏈的一部分。髮夾多核苷酸及可將其附接至固體載體之方法揭示於國際申請公開案第WO0157248號及第WO2005/047301號中，其各自係以引用的方式併入本文中。核苷酸可連續地添加至生長引子，使得在5’至3’方向上合成多核苷酸鏈。具體而言但不一定在每一核苷酸添加後可確定已添加鹼基之性質，由此提供核酸模板之序列資訊。因此，藉由經由與核苷酸之5’磷酸基形成磷酸二酯鍵將核苷酸接合至核酸鏈之游離3’羥基來將核苷酸併入至核酸鏈(或多核苷酸)中。 欲定序之核酸模板可係DNA或RNA，或甚至包括去氧核苷酸與核糖核苷酸之雜交分子。核酸模板可包含天然及/或非天然核苷酸及天然或非天然主鏈鍵聯，條件係該等在定序反應中不阻止模板之複製。 在某些實施例中，欲定序之核酸模板可經由此項技術中已知之任何適宜連接方法(例如經由共價附接)附接至固體載體。在某些實施例中，模板多核苷酸可直接附接至固體載體(例如基於二氧化矽之載體)。然而，在本揭示內容之其他實施例中，固體載體之表面可以某種方式修飾，以容許模板多核苷酸之直接共價附接，或藉助本身可非共價附接至固體載體之水凝膠或聚電解質多層固定模板多核苷酸。 其中多核苷酸已直接附接至基於二氧化矽之載體之陣列係(例如) WO00006770 (以引用的方式併入本文中)中所揭示之彼等，其中多核苷酸係藉由玻璃上之環氧側基與多核苷酸上之內部胺基之間之反應固定化於玻璃載體上。另外，多核苷酸可藉由基於硫之親核劑與固體載體之反應附接至固體載體，例如如W02005/047301 (以引用的方式併入本文中)中所闡述。固體負載模板多核苷酸之另一實例係其中模板多核苷酸附接至負載於基於二氧化矽之載體或其他固體載體上之水凝膠者，例如如W000/31148、W001/01143、W002/12566、W003/014392、美國專利第6,465,178號及W000/53812中所闡述，其各自係以引用的方式併入本文中。 模板多核苷酸可固定至其之特定表面係聚丙烯醯胺水凝膠。聚丙烯醯胺水凝膠闡述於上文所引用之參考文獻及WO2005/065814 (其係以引用的方式併入本文中)中。 DNA模板分子可附接至珠粒或微粒，例如如美國專利第6,172,218號(其係以引用的方式併入本文中)中所闡述。附接至珠粒或微粒可用於定序應用。可製備珠粒文庫，其中每一珠粒含有不同DNA序列。例示性文庫及其產生方法闡述於Nature. 437, 376-380 (2005)；Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005)中，其各自係以引用的方式併入本文中。使用本文中所述之核苷酸對此等珠粒之陣列進行定序係在本揭示內容之範圍內。 欲定序模板可形成固體載體上之「陣列」之一部分，在此情形下該陣列可採取任何方便形式。因此，本揭示內容之方法適用於所有類型之高密度陣列，包括單一分子陣列、聚簇陣列及珠粒陣列。以本揭示內容之染料化合物標記之經修飾核苷酸可用於對基本上任何類型之陣列上之模板進行定序，包括(但不限於)藉由將核酸分子固定於固體載體上所形成之彼等。 然而，在對聚簇陣列進行定序之情形下，以本揭示內容之染料化合物標記之經修飾核苷酸尤其有利。在聚簇陣列中，陣列上之不同區域(通常稱為位點或特徵)包含多個多核苷酸模板分子。一般而言，多個多核苷酸分子不能藉由光學方式個別地解析，而是做為整體被檢測。端視陣列如何形成，陣列上之每一位點可包含一個個別多核苷酸分子之多個拷貝(例如該位點對於特定單鏈或雙鏈核酸物質同源)或甚至少量不同多核苷酸分子之多個拷貝(例如兩種不同核酸物質之多個拷貝)。可使用此項技術中通常已知之技術產生核酸分子之聚簇陣列。舉例而言，WO 98/44151及WO00/18957 (其各自併入本文中)闡述擴增核酸之方法，其中模板及擴增產物兩者均保持固定化於固體載體上以形成包括固定化核酸分子之聚簇或「集落」之陣列。存在於根據該等方法製備之聚簇陣列上之核酸分子下使用以本揭示內容之染料化合物標記之經修飾核苷酸進行定序之適宜模板。 以本揭示內容之染料化合物標記之經修飾核苷酸亦可用於對單一分子陣列上之模板進行定序。如本文所用之術語「單一分子陣列」或「SMA」係指分佈(或陣列)於固體載體上之多核苷酸分子群體，其中任何個別多核苷酸與群體中所有其他多核苷酸之間隔使得可個別地解析個別多核苷酸分子。因此，在一些實施例中，固定化至固體載體之表面上之目標核酸分子可能夠藉由光學方式解析。此意味著一或多個不同信號(每一者代表一個多核苷酸)將出現在所使用之特定成像裝置之可解析區域內。 可達成單一分子檢測，其中陣列上之毗鄰多核苷酸分子間之間隔為至少100 nm、更特定而言至少250 nm、更特定而言至少300 nm、甚至更特定而言至少350 nm。因此，每一分子可做為單一分子螢光點個別地解析並檢測，且來自該單一分子螢光點之螢光亦展現單步光漂白。 術語「個別經解析」及「個別解析」在本文中用於指定，當可視化時，可能區分陣列上之一個分子與其相鄰分子。陣列上個別分子之間之分離將部分藉由用來解析個別分子之特定技術來測定。單一分子陣列之一般特徵將藉由參考公開之申請案WO00/06770及WO 01/57248來理解，該等申請案各自係以引用的方式併入本文中。儘管本揭示內容之經修飾核苷酸之一種用途係用於合成定序反應中，但經修飾核苷酸之效用並非限於此等方法。實際上，核苷酸可有利地用於需要檢測附接至併入至多核苷酸中之核苷酸之螢光標記之任何定序方法中。 具體而言，以本揭示內容之染料化合物標記之經修飾核苷酸可用於自動化螢光定序方案中，尤其可用於桑格(Sanger)及同事之基於鏈終止定序方法之螢光染料-終止子循環定序中。此等方法通常使用酶及循環定序以在引子延伸定序反應中併入經螢光標記之二去氧核苷酸。所謂桑格定序方法及相關方案(桑格類型)利用具有經標記之二去氧核苷酸之隨機化鏈終止。 因此，本揭示內容亦涵蓋以染料化合物標記之經修飾核苷酸，其係在3’及2’位置二者均缺少羥基之二去氧核苷酸，此等經修飾之二去氧核苷酸適用於桑格類型定序方法及諸如此類中。 將認識到，併入3’封閉基團之以本揭示內容之染料化合物標記之經修飾核苷酸亦可用於桑格方法及相關方案中，此乃因藉由使用具有3’-OH封閉基團之經修飾核苷酸可達成藉由使用經修飾之二去氧核苷酸達成之相同效應：二者均阻止後續核苷酸之併入。倘若根據本揭示內容且具有3’封閉基團之核苷酸欲用於桑格類型定序方法中，則應理解，附接至該等核苷酸之染料化合物或可檢測之標記不需要經由可裂解連接體連接，此乃因在本揭示內容之經標記之核苷酸併入之每一情形下，不需要隨後併入核苷酸且因此不需要自核苷酸去除標記。 本揭示內容亦提供包括以染料標記之經修飾之核苷及/或核苷酸之套組。此等套組通常將包括至少一種以本文中所述之染料標記之經修飾核苷酸或核苷以及至少一種其他組份。該(等)其他組份可係一或多種上文所述方法中或下文實例部分中所鑑別之組份。可合併入本揭示內容之套組中之組份之一些非限制性之實例闡述於下文中。 在具體實施例中，套組可包括至少一種以本文中所述之染料標記之經修飾核苷酸或核苷以及經修飾或未經修飾核苷酸或核苷。舉例而言，以根據本揭示內容之染料標記之經修飾核苷酸可與未經標記或天然核苷酸及/或與經螢光標記之核苷酸或其任何組合組合提供。因此，套組可包含以根據本揭示內容之染料標記之經修飾核苷酸及以其他(例如先前技術)染料化合物標記之經修飾核苷酸。核苷酸之組合可做為單獨個別組份(例如每個容器或管中一種核苷酸類型)或做為核苷酸混合物(例如兩種或更多種核苷酸混合於同一容器或管中)提供。 倘若套組包含複數種、尤其兩種、更尤其四種以染料化合物標記之經修飾核苷酸，則不同核苷酸可以不同染料化合物標記，或一種可為黑暗的，無染料化合物。倘若不同核苷酸以不同染料化合物標記，則套組之特徵係該等染料化合物係光譜上可區分之螢光染料。如本文中所用，術語「光譜上可區分之螢光染料」係指當一個樣品中存在兩種或更多種此等染料時，可發射可藉由螢光檢測設備(例如，市售的基於毛細管之DNA定序平臺)區分之波長之螢光能量之螢光染料。當以套組形式供應兩種以螢光染料化合物標記之經修飾核苷酸時，一些實施例之特徵係光譜上可區分之螢光染料可(例如)藉由相同雷射在相同波長下激發。當以套組形式供應四種以螢光染料化合物標記之經修飾核苷酸時，一些實施例之特徵係兩種光譜上可區分之螢光染料二者可在一個波長下激發且另兩種光譜上可區分之染料二者可在另一波長下激發。特定激發波長為532 nm、630 nm至700 nm，尤其660 nm。 在一個實施例中，套組包括以本揭示內容之化合物標記之經修飾核苷酸及以第二染料標記之第二經修飾核苷酸，其中染料具有至少10 nm、尤其20 nm至50 nm之最大吸收差。更具體而言，兩種染料化合物具有介於15-40 nm之間之斯托克斯(Stokes)位移，其中「斯托克斯位移」係峰吸收與峰發射波長之間之距離。 在另一實施例中，套組可進一步包括兩種其他以螢光染料標記之經修飾核苷酸，其中染料藉由488 nm至550 nm、尤其532 nm之相同雷射激發。染料可具有至少10 nm、尤其20 nm至50 nm之最大吸收差。更具體而言，兩種染料化合物可具有介於20-40 nm之間之斯托克斯位移。更具體而言，兩種染料化合物可具有低於640 nm、尤其低於600 nm之不同最大吸收。光譜上可與本揭示內容之聚次甲基染料區分且滿足上述準則之特定染料係如美國專利第5,268,486號(例如Cy3)或WO 0226891 (Alexa 532；Molecular Probes A20106)中所闡述之聚次甲基類似物或如美國專利第6,924,372號中所揭示之不對稱聚次甲基染料，其各自係以引用的方式併入本文中。替代染料包括羅丹明(rhodamine)類似物，例如四甲基羅丹明及其類似物。 在替代實施例中，本揭示內容之套組可含有其中相同鹼基以兩種不同化合物標記之核苷酸。第一核苷酸可以本揭示內容之化合物標記。第二核苷酸可以光譜上不同之化合物、例如在小於600 nm吸收之「綠色」染料標記。第三核苷酸可標記為本揭示內容之化合物與光譜上不同之化合物之混合物，且第四核苷酸可係「黑暗」的且不含標記。因此，簡言之，核苷酸1-4可標記為「綠色」、「紅色」、「紅色/綠色」及黑暗。為進一步簡化儀器，四種核苷酸可經以單一雷射激發之兩種染料標記，且因此核苷酸1-4之標記可係「紅色1」、「紅色2」、「紅色1/紅色2」及黑暗或「綠色1」、「綠色2」、「綠色1/綠色2」及黑暗。 核苷酸可含有兩種本揭示內容之染料。其中Ra1 或Ra2 係稠合至吲哚環之毗鄰碳之另一芳香環之染料吸收較不具有另一芳香族共軛之染料更長之波長。套組可含有兩種或更多種以本揭示內容之染料標記之核苷酸。套組可含有以其中Ra1 及Ra2 各自獨立地係H、SO3 - 、磺醯胺或鹵素之本揭示內容之化合物標記之核苷酸，及一種以其中Ra1 及Ra2 之一者或二者均係稠合至毗鄰碳原子之另一環之本揭示內容之化合物標記之核苷酸。套組可含有另一核苷酸，其中該核苷酸以吸收區域為520 nm至560 nm之染料標記。套組可進一步含有未經標記之核苷酸。 核苷酸可含有兩種本揭示內容之染料。其中p為1之染料吸收波長短於其中p為2者。套組可含有兩種或更多種以本揭示內容之染料標記之核苷酸。套組可含有以其中p為1之本揭示內容之化合物標記之核苷酸，及一種以其中p為2之本揭示內容之化合物標記之核苷酸。套組可含有另一核苷酸，其中該核苷酸係以第三標記標記。套組可進一步含有未經標記之核苷酸或以第四標記標記之核苷酸。 儘管上文關於具有以不同染料化合物標記之不同核苷酸之組態例示套組，但將理解，套組可包括2種、3種、4種或更多種具有相同染料化合物之不同核苷酸。 在具體實施例中，套組可包括能夠催化經修飾核苷酸併入至多核苷酸中之聚合酶。此等套組中包括之其他組份可包括緩衝劑及諸如此類。以根據本揭示內容之染料標記之經修飾核苷酸及包括不同核苷酸之混合物之其他任何核苷酸組份可以在使用前稀釋之濃縮形式提供於套組中。在此等實施例中，亦可包括適宜稀釋緩衝劑。同樣，在本文中所述之方法中鑑別之組份之一或多者可包括在本揭示內容之套組中。 注意，如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，除非清楚明確地限於一個指示物，否則單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。熟習此項技術者將明瞭，在不脫離本教示之精神或範圍之情形下可對本文中所述之各個實施例做出各種修改及變化。因此，本文中所述之各個實施例意欲涵蓋隨附申請專利範圍及其等效形式之範圍內之其他修改及變化形式。實驗細節 4-(3- 溴丙氧基 ) 苯酚之製備
Figure 02_image071
在N2 下向氫醌(3 g, 27.2 mmol)於甲醇(30 mL)中之溶液添加氫氧化鉀(2g, 35.4 mmol)及1,3-二溴丙烷(8.3 mL, 81.7 mmol)。將反應物在65℃下攪拌過夜。然後在真空下去除揮發物並添加二乙醚(30 mL)。將有機層用氯化銨飽和水溶液及水(各30 mL)洗滌。用硫酸鎂乾燥有機層，過濾並在真空下去除揮發物。藉由在矽膠上之急驟層析(溶析劑：石油醚/乙酸乙酯70/30)來純化所得米黃色漿體，得到2.6 g白色漿體。產率：41%。質子NMR (CDCl3 ): 6.87-6.73 (4H, m, H-Ar); 5.36 (1H, s, OH); 4.04 (2H, t, J = 6.2 Hz); 3.60 (2H, J = 6.2 Hz); 2.28 (2H, q, J = 6.2 Hz, H-2)。13 C NMR (CDCl3 ): 152.8, 149.6, 116.1; 116.0; 66.7; 34.4; 30.2。4-(2,3- 二甲基 -3H- 吲哚 -3- 基 ) 丁烷 -1- 磺酸之製備
Figure 02_image073
將於冰乙酸(19 ml)中之苯基肼(8.6 mmol, 850 µL)及5-甲基-6-側氧基庚烷磺酸(7.2 mmol, 1.5 g)在130℃下攪拌3小時。使反應混合物冷卻至室溫並在真空下去除溶劑。藉由在矽膠上之急驟層析(溶析劑：二氯甲烷/甲醇80/20)來純化殘餘物，得到1.23 g之淺黃色泡沫狀物。產率：61%。MS (DUIS): E- : 280 (M-1); 質子NMR (D2 O): 7.42 (1H, d, J = 7.8Hz, H-4); 7.27 (1H, t, J = 7.8Hz, H-5); 7.24 (1H, d, J = 7.8Hz, H-7); 7.17 (1H, t, J = 7.8Hz, H-6); 2.59 (2H, dd, J = 7.6, 8.9Hz, H-11); 2.21-2.13 (1H, m); 1.88-1.73 (2H,m, H-8); 1.52-1.43 (2H, m, H-10); 1.13 (3H, s, C-3上之CH3); 0.70-0.63 (1H, m, H-9a); 0.51-0.44 (1H, m, H-9b)。13 C NMR (D2 O): 190.8; 152.3; 143.7; 127.8; 125.7; 122.2; 118.6; 57.9; 50.5; 48.9; 35.6; 24.0; 22.5; 21.8; 14.8。1-(3-(4- 羥基苯氧基 ) 丙基 )-2,3- 二甲基 -3-(4- 磺丁基 )-3H- 吲哚 -1- 鎓之製備
Figure 02_image075
將於環丁碸(2 ml)中之4-(3-溴丙氧基)苯酚(1.90 mmol, 438 mg)及4-(2,3-二甲基-3H-吲哚-3-基)丁烷-1-磺酸(1.58 mmol, 504 mg)於120℃下攪拌4.5 h。使反應混合物冷卻至室溫並藉由在矽膠上之急驟層析(溶析劑：二氯甲烷/甲醇65/35)來直接純化，得到329 mg之淺灰色油狀物。產率：40%。MS (DUIS): E- : 430 (M-1), E+ : 432 (M+1); 質子NMR (TFA): 7.75-7.65 (4H, m, H-4/5/6/7); 6.98 (2H, d, J = 8.9 Hz, 苯基上之Har); 6.85 (2H, d, J = 8.9 Hz, 苯基上之Har); 4.82 (2H, bt, J = 6.6 Hz, H-12); 4.24-4.13 (2H, m, H-14); 3.69 (1H, s); 3.20-3.06 (2H, m, H-11); 2.91 (3H, s, C-2上之CH3 ); 2.63-2.52 (2H, m, H-13); 2.41-2.75 (2H,m, H-8); 1.90-1.83 (2H, m, H-10); 1.66 (3H, s, C-3上之CH3); 1.13-0.93 (2H, m, H-9)。1-(3-(4- 羥基苯氧基 ) 丙基 )-2,3,3- 三甲基 -3H- 吲哚 -1- 鎓之製備
Figure 02_image077
將於環丁碸(1 ml)中之4-(3-溴丙氧基)苯酚(1.40 mmol, 324 mg)及三甲基假吲哚(0.80 mmol, 129 µl)於120℃下攪拌3小時。使反應混合物冷卻至室溫並藉由在矽膠上之急驟層析(溶析劑：二氯甲烷/甲醇90/10)直接純化，得到260 mg之淺灰色油狀物。產率：84%。質子NMR (MeOD): 7.06 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-4); 7.00 (1H, bt, J = 7.8Hz, H-5); 6.77-6.64 (5 H, m, 鄰苯基及間苯基上之H-6及H-); 6.58 (1H, d, J = 7.8Hz, H-7); 3.90 (2H, t, J = 5.8Hz, H-8), 3.71 (2H, J = 6.5Hz, H-10); 2.04 (2H, bq, J = 6.1Hz, H-9); 1.30 (6H, s, C-3上之2xCH3)。13 C NMR (MeOD): 162.7; 153.6; 152.3; 147.2; 138.6; 128.6; 122.7; 119.5; 116.8; 116.6; 116.5; 103.3; 66.8; 45.1; 39.7; 30.6; 27.5。AF670POPO 之製備 產物合成方案：
Figure 02_image079
染料合成程序： 將4-(2,3-二甲基-3H-吲哚-3-基)丁烷-1-磺酸(204 mg, 400 µmol)及丙二醛雙(苯基亞胺)單鹽酸鹽(114 mg, 440 µmol)在100℃下於乙酸酐/乙酸(2/0.6 ml)之混合物中攪拌1.5 h。添加乙酸鉀(118 mg, 1.20 mmol)及磺化苯并吲哚鎓鹽X (193 mg, 400 µmol)。將反應混合物在100℃下攪拌3 h。然後使其冷卻至室溫並添加二乙醚(40 mL)。深藍色固體析出。將其過濾，用額外二乙醚(40 mL)洗滌並溶於含有約30%乙腈之水(25 mL)中。過濾所得深藍色溶液並藉由製備型HPLC純化。收集主要藍色(最大吸收約665 nm)部分且在真空中去除溶劑。MS (DUIS): E- : 869 (M-1), 434.1 (M-2/2)。 染料DX-DX係使用適當的起始材料以類似方式製備 表1 與已知結構之類似物染料標準(專利：P6240WO)之類似參數相比，以此方式製備之一些染料(水溶液，OD約0.2)之光譜性質
Figure 02_image081
Figure 105131115-A0304-0001
 表1AF550POPOS0 之製備 產物合成方案：
Figure 02_image083
染料合成程序： 將1-(3-(4-羥基苯氧基)丙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓(150 mg, 385 µmol)及N ,N’ -二苯基甲脒(74 mg, 385 µmol)在80℃下於乙酸酐(2 mL)中攪拌2 h。添加乙酸(0.5 mL)、乙酸鉀(567 mg, 5.78 mmol)及磺化吲哚鎓鹽X (166 mg, 385 µmol)。將反應混合物在80℃下攪拌2.5 h。然後在減壓下去除揮發物並添加二乙醚(20 mL)。深紅色固體析出。將其過濾，用額外二乙醚(20 mL)洗滌並溶於含有約5%乙腈之水(15 mL)中。過濾所得深紅色溶液並藉由製備型HPLC純化。收集主要紅色(最大吸收約550 nm)部分並在真空中去除溶劑。MS (DUIS):未乙醯化 E- : 671.0 (M-1); E+ : 673.3 (M+1), 774.4 (Et3 N+ 鹽)。 表2 與已知結構之類似物染料(專利：P6240WO)之類似參數相比，以此方式製備之一些染料(水溶液，OD約0.2)之光譜性質
Figure 02_image085
Figure 105131115-A0304-0002
 表2染料 AF670POPO 核苷酸偶聯物 (FFA-AF670POPO)
Figure 02_image087
將無水DMA (3 mL)、TSTU (18 mg, 58.8 µmol)及Hunig鹼(0.05 mL)添加至染料AF670POPO之乾燥樣品(60 mg, 53.5 µmol)。活化酯之藍色顯色。將反應混合物在室溫下攪拌30 min。根據TLC (CH3CN中20% H2O)，完成活化。在活化完成之後，將呈三乙基銨鹽之5 pppA-LN3 (53 mg, 56.1 µmol)於DMA/水(0.5/0.3 mL)中之溶液添加至反應。將反應混合物在氮氣氛下於室溫下攪拌18 h。藉由TLC (20% H2O於乙腈中)檢查偶合進程。利用冰浴使反應混合物冷卻至約4℃，然後添加0.1 M TEAB (5 mL)於水中之溶液並將混合物在室溫下攪拌10 min。將反應混合物施加至具有於0.05 M TEAB水溶液中之約25 g DEAE Sephadex樹脂懸浮液之管柱並用TEAB (0.1 M直至1 M之濃度梯度)洗滌。收集有色部分並蒸發然後再與水共蒸發以去除更多的TEAB並真空下降至乾燥。然後將殘餘物再溶解於0.1 M TEAB中。經由0.2 nm孔徑注射器式過濾器將此溶液過濾至corning 20燒瓶中。使用C18反相管柱與乙腈-0.1 M TEAB藉由HPLC純化產物。產率74% (基於使用估計之消光係數之溶液之光密度)。染料 AF550POPOS0 核苷酸偶聯物 (FFT-AF550POPOS0)
Figure 02_image089
將無水DMA (3 mL)、TSTU (19 mg, 63.5 µmol)及Hunig鹼(0.05 mL)添加至染料AF550POPOS0之乾燥樣品(39 mg, 57.7 µmol)。活化酯之紅色顯色。將反應混合物在室溫下攪拌30 min。將呈三乙基銨鹽之pppT-LN3 (59 mg, 63.5 µmol)於DMA/水(0.5/0.3 mL)中之溶液添加至反應。將反應混合物在氮氣氛下於室溫下攪拌18 h。藉由TLC (20% H2O於乙腈中)檢查偶合進程。利用冰浴使反應混合物冷卻至約4℃，然後添加0.1 M TEAB (5 mL)於水中之溶液並將混合物在室溫下攪拌10 min。將反應混合物施加至具有於0.05 M TEAB水溶液中之約25 g DEAE Sephadex樹脂懸浮液之管柱並用TEAB (0.1 M直至1 M之濃度梯度)洗滌。收集有色部分並蒸發然後再與水共蒸發以去除更多的TEAB並真空下降至乾燥。然後將殘餘物再溶解於0.1 M TEAB中。經由0.2 nm孔徑注射器式過濾器將此溶液過濾至corning 20燒瓶中。使用C18反相管柱與乙腈-0.1 M TEAB藉由HPLC純化產物。產率48% (基於使用估計之消光係數之溶液之光密度)。
圖 1 在改進之Illumina HiseqX定序系統上測試以AF670POPO及其類似物標記之FFA以及ffA-NR650C5，其中分別在循環101及251之讀取1及2佈署將兩種雷射(紅色及綠色)之激發功率增加約33%(參見圖1上之信號)。圖 2 出乎意料地，在ffA-NR650C5之情形下(圖2)，觀察到紅色信號對紅色雷射之功率變化之反應不成比例。因此，鹼基分離散點圖之形狀在循環101改變。右上圓圈更靠近左上圓圈，此意味著各別標記之間更難以區分。所發生之現象指示NR650C5在HiSeqX上所使用之最大功率密度下可能係光飽和的或接近光飽和的。此散點圖變化負面地影響定序品質。有趣的是，對於AF670POPO及其類似物，觀察到顯著之改良。其信號隨雷射功率密度變化成比例地增加。當佈署最大功率時，散點圖自循環100至循環101維持其分離及形狀(圖2)。圖2中之右上圓圈較圖1中之右上圓圈距左上圓圈更遠。因此，在圖2中標記分離更佳。圖 3 對於550 nm類似物，有趣地觀察到苯基環上羥基之存在對螢光強度具有不良影響(圖3)。無酚OH之AF550POPS0之螢光較具有OH之AF550POPOS0強3倍。圖 4 該等新穎類似物提供調變並最佳化定序應用之散點圖分佈之機會。舉例而言，當T以AF550POPOS0標記且A以AF670POPO與NR550S0之混合物標記時，達成良好的正方形散點圖(圖4a)。對於綠色A進一步以AF550POPS0代替NR550S0顯示良好正方形散點圖(圖4b)。圖 5 基於該等新穎性質，在改進之HiSeqX上採用ffT-LN3- AF550POPOS0及ffA-LN3-AF670POPO定序人類模板。達成高品質2×150 bp定序，讀數1之錯誤率＜ 1%且讀數2之錯誤率＜ 1.5% (主要定序度量顯示於圖5上)。使用先前技術標記獲得之散點圖意味著不能完成2×150bp讀取。
Figure 01_image002

Claims (15)

  1. 一種式(I)化合物或其共振(mesomeric)形式：
    Figure 105131115-A0305-02-0065-16
     其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；p係1至2之整數；q係1至5之整數；alk係視情況含有一或多個雙鍵或三鍵之1至5個碳原子之鏈；Y係O；Z係OH；n係1；X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；Ra1及Ra2各自獨立地係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；且Rc1及Rc2各自獨立地係烷基或經取代之烷基，其中Ra1或Ra2之至少一者係SO3 -，或Ra1或Ra2係稠合至毗鄰碳原子之另一環，該另一環具有SO3 -，或Rc1或Rc2係烷基磺酸基。
  2. 如請求項1之化合物，其中(alk)係(CH2)3。
  3. 如請求項1或2之化合物，其中Ra1係H或SO3 -。
  4. 如請求項1或2之化合物，其中Ra2係H或SO3 -。
  5. 如請求項1或2之化合物，其中Ra1或Ra2係稠合至毗鄰碳原子之另一環。
  6. 如請求項1或2化合物，其中Rc1或Rc2係甲基、乙基、丙基或-(CH2)tSO3 -，其中t係1至6。
  7. 如請求項1或2之化合物，其中OH基，Z，係在4位。
  8. 如請求項1或2之化合物，其中任一吲哚係以下結構之一部分：
    Figure 105131115-A0305-02-0066-17
     其中Rd可係H、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、鹵素、羧基、磺醯胺或磺酸，其中Rc1係烷基或經取代之烷基。
  9. 如請求項1之化合物，其係由式(VIIIa)或式(VIId)表示：
    Figure 105131115-A0305-02-0067-18
     其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且m係0至3之整數；q係1至5之整數；r係1至5之整數；且X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物；
    Figure 105131115-A0305-02-0067-19
     其中，mCat+或mAn-係有機或無機之帶正/負電荷之相對離子且 m係0至3之整數；q係1至5之整數；r係1至5之整數；t係1至6之整數；且X係OH或O-或其醯胺或酯偶聯物。
  10. 一種經如請求項1至9之化合物標記之核苷酸或寡核苷酸。
  11. 如請求項10之經標記之核苷酸或寡核苷酸，其中該標記係經由自C(=O)-X部分形成之醯胺鍵附接。
  12. 如請求項10或11之經標記之核苷酸或寡核苷酸，其中該標記係透過連接體部分附接至嘧啶鹼基之C5位置或7-去氮嘌呤鹼基之C7位置。
  13. 一種套組，其包含兩種或更多種核苷酸，其中至少一種核苷酸係如請求項10至12中任一項之經標記之核苷酸。
  14. 一種如請求項10至12中任一項之核苷酸、如請求項10至12中任一項之寡核苷酸或如請求項13之套組之用途，其係用於定序、表現分析、雜交分析、遺傳分析、RNA分析或蛋白質結合分析中。
  15. 一種合成如請求項1至9中任一項之化合物之方法，其利用以下起始材料之一者：
    Figure 105131115-A0305-02-0069-20
    Figure 105131115-A0305-02-0069-21
    Figure 105131115-A0305-02-0070-22
    Figure 105131115-A0305-02-0070-23
    Figure 105131115-A0305-02-0070-24
     或其鹽，其中，Ra1係H、SO3 -、磺醯胺、鹵素或稠合至毗鄰碳原子之另一環；Rc1係烷基或經取代之烷基；Ar係芳香族基團且R係烷基。
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